專利名稱：含有單乙?；；视脱苌锏拿庖哒{(diào)節(jié)劑、抗癌劑和健康食品的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及從鹿角中提取的含有單乙?；；视脱苌镒鳛橛行С煞值拿庖哒{(diào)節(jié)劑、醫(yī)療用品和健康食品的使用。
鹿角(在拉丁文中為Cervi parvum cornu)是從任意鹿科動(dòng)物收集和干燥得到的未鈣化的角。在韓國(guó)的傳統(tǒng)東方醫(yī)學(xué)中，鹿角和人參都由于其多種良好的醫(yī)療效果而得到廣泛地使用。鹿角被傳統(tǒng)使用的鹿科動(dòng)物僅限于Cervus Nippon Temminick var.mantchuricus Swinhoe(以下稱為C.N.)和Cervus elaphus L.。鹿角被認(rèn)為具有眾多醫(yī)療效果。公知其可用作滋補(bǔ)劑，在促進(jìn)生長(zhǎng)和發(fā)育、促進(jìn)造血功能、治療神經(jīng)崩潰、治療心臟供血不足，并一般性地改善五臟六腑的功能(Dong-euibogam，韓國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)療文獻(xiàn))。在涉及鹿角效用的其他傳統(tǒng)醫(yī)藥文獻(xiàn)中，也報(bào)道了其滋補(bǔ)效果，營(yíng)養(yǎng)效果，增強(qiáng)體力效果，包括改善心臟功能、緩解虛弱和增強(qiáng)免疫力。已進(jìn)行了諸多嘗試來闡明令人好奇的鹿角的化學(xué)組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含有諸多活性成分，例如游離氨基酸、痕量(金屬)元素、己糖、戊糖、己糖胺、糖醛酸、唾液酸、粘多糖(例如，透明質(zhì)酸，軟骨素A)、多種脂肪酸和前列腺素。據(jù)報(bào)道在鹿角的提取物中檢測(cè)到了糖脂、磷脂、膽固醇、次黃嘌呤、膽甾-5-烯-3β，7α-二醇、膽固醇脂和多胺。其他人報(bào)道了雌素酮和雌二醇受體的存在(report ofNIH Korea，Vol.22，p359，1985；Korean Biochem.J，Vol.9，No.3，p153，1976；Korean Biochem.J.Vol.9，No.4；p215，1976；Korean Biochem.J，Vol.10，No.1，p1，1977；Shoykugaku Zasshi，43(2)，p173，1989)。
免疫力是保護(hù)活體免于各種病原體侵襲的防御機(jī)制。免疫缺陷是由于免疫系統(tǒng)的組分缺陷而導(dǎo)致，說明該免疫系統(tǒng)不能對(duì)各種抗原產(chǎn)生應(yīng)答。免疫缺陷主要分成先天的或原發(fā)性免疫缺陷以及獲得性或繼發(fā)性免疫缺陷。在先天性免疫缺陷的情況中，B-細(xì)胞或T-細(xì)胞并非天然存在，所以可僅通過基因治療、抗體插入和骨髓移植來進(jìn)行治療。在另一方面，在獲得性免疫缺陷的情況下，所有免疫相關(guān)因子都是天然存在的，但卻在免疫應(yīng)答中機(jī)能不良，所以可通過促進(jìn)免疫因子的功能來對(duì)其進(jìn)行改善。近來諸如關(guān)節(jié)炎、遺傳性過敏癥、癡呆和敗血癥的自身免疫性疾病的發(fā)作有所上升。自身免疫性疾病是由于免疫功能的過度增強(qiáng)而引起?？墒褂妹庖咭种苿﹣碇委熥陨砻庖咝约膊?，但免疫抑制劑也經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致免疫力下降。根據(jù)對(duì)免疫機(jī)理的了解，已進(jìn)行了諸多嘗試來開發(fā)對(duì)免疫力進(jìn)行控制的免疫調(diào)節(jié)劑。這些嘗試的目的在于通過以能夠非特異性地刺激免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)物控制免疫功能的促進(jìn)或抑制來提高活體對(duì)病原體的防御能力和最小化副作用。免疫調(diào)節(jié)劑可以治療大多數(shù)活體疾病，例如癌癥、敗血癥、退行性關(guān)節(jié)炎、感染、癡呆、衰老、糖尿病、貧血、皮膚疾病、哮喘、遺傳性過敏癥、應(yīng)激、神經(jīng)崩潰、怠墮、慢性疲勞綜合征以及骨質(zhì)疏松。到目前為止，化合物、微生物組合物、生物制品等等已被用作免疫調(diào)節(jié)劑。由于其大多都只有一種效果(要么免疫促進(jìn)要么免疫抑制)，所以大多數(shù)這些免疫調(diào)節(jié)物的使用都是具有局限性的。因此，它們可引起副作用且其本身就具有毒性。為了克服上述問題，無毒食品、提取自天然來源的有效成分和傳統(tǒng)草藥是開發(fā)免疫調(diào)節(jié)劑的主要對(duì)象，而檢驗(yàn)其作為藥物的效果的實(shí)驗(yàn)也已進(jìn)行。但是這些免疫調(diào)節(jié)物依然是要么具有免疫促進(jìn)效果要么具有免疫抑制效果。
在韓國(guó)，癌癥是首要死亡原因，并且逐年增加。對(duì)癌癥進(jìn)行的化療或放療在殺死癌癥細(xì)胞的同時(shí)也破壞了正常的骨髓細(xì)胞，尤其是調(diào)節(jié)免疫和造血作用的造血細(xì)胞，從而導(dǎo)致了免疫系統(tǒng)和造血器官的機(jī)能不良(Korean J.BRM.，1，p23，1993；Korean J.BRM.，4，p47，1994；Crit Rev Oncol Hematol.1，p227，1984)。敗血癥是由導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重系統(tǒng)感染引起的嚴(yán)重疾病，致死率超過45％。其通常發(fā)生在受感染的宿主對(duì)來自革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素產(chǎn)生過度反應(yīng)時(shí)。然而，盡管抗生素、類固醇或Xigris(Eli Lilly公司)已被用作敗血癥性休克的治療劑，但由于抗生素、類固醇或Xigris對(duì)于敗血癥效果不明顯，所以敗血癥性休克的致死率依然居高不下。
因此，本發(fā)明人從可作為民間驗(yàn)方的具有極佳藥效的C.N.鹿角中分離了多種成分，并進(jìn)一步觀察到C.N.鹿角的這些有效成分中的一種，單乙?；；视?，在體內(nèi)表現(xiàn)出了明顯的免疫調(diào)節(jié)活性。作為免疫調(diào)節(jié)效果的結(jié)果，C.N.鹿角有可能被用作敗血癥性休克的治療劑和抗癌劑而不會(huì)在體內(nèi)引起毒性。由此，本發(fā)明人通過確認(rèn)本發(fā)明的單乙?；；视涂捎米靼踩拿庖咴鰪?qiáng)劑、免疫調(diào)節(jié)劑、敗血癥性休克治療劑和抗癌劑而完成了本發(fā)明。
發(fā)明的公開技術(shù)問題因此，本發(fā)明的目的在于提供含有單乙?；；视脱苌镒鳛橛行С煞值拿庖哒{(diào)節(jié)劑、敗血癥性休克治療劑、抗癌劑和健康食品。健康食品用于調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防或治療敗血癥性休克和癌癥。
技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了含有單乙酰基二?；视脱苌镒鳛橛行С煞值拿庖哒{(diào)節(jié)劑，其中所述單乙?；；视脱苌锶缡?所示，式1
其中，R1/R2是9-十八碳烯?；?油?；?/十六?；?棕櫚?；?、十六?；?棕櫚?；?/9-十八碳烯?；?油?；?、十六?；?棕櫚酰基)/9，12-十八碳二烯酰基(亞油?；?、十六?；?棕櫚?；?/9，12，15-十八碳三烯?；?亞麻?；?或十六酰基(棕櫚?；?/5，8，11，14-二十碳四烯酰基(花生四烯?；?。
此時(shí)，由式2表示的上述單乙?；；视脱苌锸莾?yōu)選的。
式2

本發(fā)明還提供了含有式1的單乙?；；视脱苌镒鳛橛行С煞值腁IDS治療劑、敗血癥治療劑和抗癌劑。本發(fā)明還提供了含有式1的單乙酰基二?；视脱苌镒鳛橛行С煞钟糜诿庖哒{(diào)節(jié)或預(yù)防癌癥的健康食品。


圖1為一組照片，顯示對(duì)照組、IL-2處理組(20ng/ml)和化合物3處理組(1μg/ml)的T-細(xì)胞(T-4和T-8)活性。每一數(shù)字表示俘獲了IL-2特異性抗體的點(diǎn)的數(shù)量。
圖2顯示當(dāng)用化合物3激活T淋巴細(xì)胞時(shí)細(xì)胞因子的釋放，(1)對(duì)照組抗-CD3，抗-CD28處理，(2)實(shí)驗(yàn)組抗-CD3，抗-CD28和化合物3(0.1、1μg/ml)處理。
圖3為一組照片，顯示用GM-CSF(20ng/ml)、IL-4(20ng/ml)和TNF-α(5ng/ml)處理后，來自小鼠骨髓細(xì)胞的小鼠樹突狀細(xì)胞的形態(tài)。
A以1×106細(xì)胞/ml的密度接種小鼠骨髓細(xì)胞后立即拍攝的顯微鏡照片(×100)。
B顯示培養(yǎng)三天后的圓形骨髓干細(xì)胞的顯微鏡照片。這些細(xì)胞成串，生長(zhǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)板小孔的底部(×400)。
C培養(yǎng)第6天或第7天時(shí)成串的生長(zhǎng)的成熟樹突狀細(xì)胞的顯微鏡照片(×400)，小照片是特定細(xì)胞的放大照片(×2)。
D培養(yǎng)第9天時(shí)形成了特異的小且長(zhǎng)的突出的樹突狀細(xì)胞的顯微鏡照片(×1000)，小照片是特定細(xì)胞的放大照片(×2)。
圖4為顯示在分離自Balb/c AnN小鼠的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)第11天時(shí)，對(duì)樹突狀細(xì)胞特異性標(biāo)記物、單核細(xì)胞特異性標(biāo)記物和顆粒細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)行FACS分析的結(jié)果的一組圖。(在這里，對(duì)針對(duì)倉(cāng)鼠IgG和大鼠IgG2a的異構(gòu)體對(duì)照的染色用于設(shè)定標(biāo)記物線(直線))。
使用了以下的標(biāo)記物作為共刺激特異性標(biāo)記物的CD80和CD86，作為樹突狀細(xì)胞特異性標(biāo)記物的CD11c和DEC-205，作為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物的CD14和F4/80，作為顆粒細(xì)胞特異性標(biāo)記物的Gr-1。
圖5為顯示化合物3對(duì)樹突狀細(xì)胞在粘附分子表達(dá)方面的影響的電泳圖。
泳道1Vcam-1 泳道2Icam-1 泳道3Icam-2泳道4VLA-4 泳道5VLA-5 泳道6LFA-1泳道7GAPDH(+)化合物3處理組(-)對(duì)照組圖6為一組照片，顯示在腫瘤(KIGB-5)i.v.注射和用不同的條件處理4周后，在注射位點(diǎn)附近腫瘤形成的結(jié)果。
ARPMI對(duì)照組 BBMSC處理組CBMSC+Ad/ΔE1處理組圖7為一組照片，顯示在腫瘤(KIGB-5)i.v.注射和用不同的條件處理8周后，在注射位點(diǎn)附近腫瘤形成的結(jié)果。
ARPMI對(duì)照組BBMSC(2.5×106細(xì)胞/天)處理組CBMSC(2.5×106細(xì)胞/天)+Ad/ΔE1(50MOI)處理組D樹突狀細(xì)胞(5×106細(xì)胞/天)+腫瘤裂解物處理組EBMSC(2.5×106細(xì)胞/天)+Ad/IL-2(50MOI)處理組F化合物3(50mg/kg/天)處理組。
圖8和圖9各為一組照片，顯示i.v.注射腫瘤(KIGB-5)8周后，對(duì)各組轉(zhuǎn)移性肺損傷的總的情況和顯微觀察結(jié)果。
在圖8中，ARPMI對(duì)照組BBMSC(2.5×106細(xì)胞/天)處理組CBMSC(2.5×106細(xì)胞/天)+Ad/ΔE1(50MOI)處理組
DBMSC(2.5×106細(xì)胞/天)+Ad/IL-2(50MOI)處理組。
在圖9中，ARPMI對(duì)照組B樹突狀細(xì)胞(5×106細(xì)胞/天)+腫瘤裂解物處理組C化合物3(25mg/kg/天)處理組。
圖10為一組照片，顯示s.c(皮下)注射腫瘤(KIGB-5)12周后，各組肺腫瘤及其大小的照片。
ARPMI對(duì)照組BBMSC(2.5×106細(xì)胞/天)+Ad/ΔE1(50MOI)處理組CBMSC(2.5×106細(xì)胞/天)處理組DDC(5×106細(xì)胞/天)+腫瘤裂解物處理組EBMSC(2.5×106細(xì)胞/天)+Ad/IL-2(50MOI)處理組FBMSC(2.5×106細(xì)胞/天)+Ad/IL-2(50MOI)+化合物3(25mg/kg/天)處理組G化合物3(25mg/kg/天)處理組。
圖11為一組照片，顯示在膽管癌細(xì)胞(5×105細(xì)胞)注射8周后，用不同劑量化合物3處理的各組敘利亞金倉(cāng)鼠的轉(zhuǎn)移性肺損傷的肉眼觀察結(jié)果。
APBS對(duì)照組B化合物3(10mg/kg/天)處理組C化合物3(25mg/kg/天)處理組D化合物3(50mg/kg/天)處理組。
圖12為一組照片，顯示在膽管癌細(xì)胞(5×105細(xì)胞)注射8周后，用不同劑量化合物3處理的各組敘利亞金倉(cāng)鼠的轉(zhuǎn)移性肺損傷的顯微觀察結(jié)果。
APBS對(duì)照組B化合物3(10mg/kg/天)處理組C化合物3(25mg/kg/天)處理組D化合物3(50mg/kg/天)處理組。
圖13為一組照片，顯示黑素瘤細(xì)胞(2×104細(xì)胞)i.v.注射4周后，接受各種處理的各個(gè)C57B1/6小鼠轉(zhuǎn)移性肺損傷的肉眼觀察結(jié)果。
APBS對(duì)照組B樹突狀細(xì)胞(4×105細(xì)胞/天)+腫瘤裂解物處理組C化合物3(50mg/kg/天)處理組。
圖14為一組照片，顯示黑素瘤細(xì)胞(2×104細(xì)胞)i.v.注射4周后，接受各種處理的各個(gè)C57B1/6小鼠轉(zhuǎn)移性肺損傷的顯微觀察結(jié)果。
APBS對(duì)照組B樹突狀細(xì)胞(4×105細(xì)胞/天)+腫瘤裂解物處理組C化合物3(50mg/kg/天)處理組。
圖15為黑素瘤細(xì)胞(2×104細(xì)胞)i.v.注射后6周內(nèi)各處理組存活率的示意圖。
(1)RPMI對(duì)照組(2)樹突狀細(xì)胞(5×105細(xì)胞/天)+腫瘤裂解物處理組(3)化合物3(50mg/kg/天)處理組。
圖16為化合物3激活的T淋巴細(xì)胞對(duì)黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的示意圖(1)對(duì)照1抗-CD3，抗-CD28處理組(2)對(duì)照2抗-CD3，抗-CD28和IL-2(20ng/ml)處理組(3)實(shí)驗(yàn)組抗-CD3，抗-CD28和化合物3(1μg/ml)處理組。
發(fā)明實(shí)施方式下文將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明提供了含有如式1所示的單乙?；；视脱苌镒鳛橛行С煞值拿庖哒{(diào)節(jié)劑、AIDS治療劑、敗血癥治療劑和抗癌劑。由式1所示的本發(fā)明化合物是下列5種化合物中的一種1)1-油酰-2-棕櫚酰-3-乙酰甘油(R1/R2＝9-十八碳烯酰基/十六?；挛闹蟹Q為“化合物1”)2)1-棕櫚酰-2-油酰-3-乙酰甘油(R1/R2＝十六?；?9-十八碳烯?；?，下文中稱為“化合物2”)3)1-棕櫚酰-2-亞油酰-3-乙酰甘油(R1/R2＝十六?；?9，12-十八碳二烯?；?，下文中稱為“化合物3”)4)1-棕櫚酰-2-亞麻酰-3-乙酰甘油(R1/R2＝十六酰基/9，12，15-十八碳三烯?；?，下文中稱為“化合物4”)5)1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-3-乙酰甘油(R1/R2＝十六?；?5，8，11，14-二十碳四烯?；?，下文中稱為“化合物5”)。
由式2所示的任何單乙?；；视脱苌锒际强衫玫模貏e地，優(yōu)選化合物3。本發(fā)明的化合物是從C.N.鹿角提取出來或通過常規(guī)有機(jī)合成方法制備。示例性的提取方法具有以下步驟。具體地，先用己烷對(duì)C.N.鹿角進(jìn)行提取，然后再用氯仿對(duì)己烷提取的剩余物進(jìn)行提取，以得到C.N.鹿角的氯仿提取物。用于這一提取過程中的己烷和氯仿的量是足以浸透鹿角。一般地，所使用的己烷和氯仿的比例為4～5L/1kg C.N.鹿角。通過一系列的硅膠柱層析和TLC(薄層層析)對(duì)從這一提取過程獲得的C.N.鹿角的氯仿提取物進(jìn)行分離和純化。隨后提取步驟中的洗脫液選自氯仿/甲醇，己烷/乙酸乙酯。為了化學(xué)地合成單乙酰基二?；视脱苌?，例如，可從甘油與棕櫚酸反應(yīng)的產(chǎn)物中分離出1-棕櫚酰甘油?？赏ㄟ^以諸如乙酸和亞油酸的羧酸化合物酯化1-棕櫚酰甘油，并在必要時(shí)進(jìn)行純化來合成目標(biāo)單乙?；；视?。另一合成單乙?；；视脱苌锏姆椒ㄊ橇字Ｄ憠A的乙酰解。
本發(fā)明的單乙?；；视突衔锟捎糜诿庖哒{(diào)節(jié)劑。免疫調(diào)節(jié)包括增強(qiáng)不正常地惡化的免疫力或保持不正常地增加的免疫力的平衡。因此，本發(fā)明中單乙酰基二?；视突衔锊粌H具有預(yù)防和治療由惡化的免疫系統(tǒng)和癌癥引起的各種疾病的作用，還能夠抑制、預(yù)防和治療由自身免疫反應(yīng)引起的諸如關(guān)節(jié)炎、遺傳性過敏癥、癡呆和敗血癥的自身免疫性疾病。
在免疫功能的調(diào)節(jié)中，最重要的不是增加負(fù)責(zé)免疫力的T細(xì)胞，而是T細(xì)胞活化的程度、T4與T8細(xì)胞的比例以及T4與T8細(xì)胞所分泌細(xì)胞因子的種類。本發(fā)明人使用單乙?；；视脱苌锾幚鞹-4和T-8淋巴細(xì)胞，來研究本發(fā)明單乙?；；视脱苌锏拿庖哒{(diào)節(jié)作用。結(jié)果證實(shí)了在這些細(xì)胞中，有一種細(xì)胞因子，即IL-2的分泌有所升高(參見圖1)。在使用本發(fā)明的化合物3處理細(xì)胞之后，通過用在同一時(shí)間能夠測(cè)定大量細(xì)胞因子的Bio-plex，對(duì)T-細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果是IL-2、IL-4和IL-5在化合物3處理組中的分泌遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在對(duì)照組中的分泌(參見圖2)。升高最明顯的細(xì)胞因子IL-4，是稱為抗炎癥細(xì)胞因子的多功能細(xì)胞因子，其是從由T4細(xì)胞分化的Th2中分泌出來。因?yàn)橐种屏薚4向Th1的分化，通過對(duì)于抗癌作用和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用，IL-4可以抑制由于自身免疫反應(yīng)而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷(Annu.Rev.Immunol.1999.17701～738)。本發(fā)明的化合物不僅具有通過刺激IL-2分泌而獲得的免疫力增強(qiáng)作用，還具有通過刺激IL-4分泌而獲得的免疫力調(diào)節(jié)作用。與此同時(shí)，本發(fā)明的所述化合物還能夠通過增加和激活T4和T8細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞來維持正常的T4與T8的比例。因此，可有效地處理副作用和治療由于免疫系統(tǒng)的異常升高或降低所產(chǎn)生的疾病。在敗血癥性休克模型中，這些免疫增強(qiáng)效果可直接刺激IL-4分泌和抑制細(xì)胞調(diào)亡。其結(jié)果是敗血癥的致死率明顯降低。因?yàn)檫@些化合物增加了IL-4分泌，因此，本發(fā)明的單乙?；；视脱苌锟捎行У刂委熥陨砻庖咝约膊。珙A(yù)防和治療敗血癥。
公知在刺激多種造血細(xì)胞的細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用，尤其是樹突狀細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中是相當(dāng)重要的。本發(fā)明人研究了單乙酰基二?；视脱苌飳?duì)分離和誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞以及TCR(T-細(xì)胞受體)之間相互作用的作用。為了進(jìn)行該研究，對(duì)化合物3處理的DC(樹突狀細(xì)胞)進(jìn)行了RT-PCR，來測(cè)定介導(dǎo)DC和TCR間相互作用的粘附分子的表達(dá)。結(jié)果是，與對(duì)照相比，諸如Vcam-1、Icam-1、Icam-2、VLA-4、VLA-5和LFA-1的粘附分子的表達(dá)都有所升高(參見圖5)。根據(jù)以上結(jié)果，證實(shí)了本發(fā)明的單乙?；；视脱苌锊粌H對(duì)T-細(xì)胞的活化效果有作用，而且還通過激活使得T-細(xì)胞能夠識(shí)別癌癥細(xì)胞抗原的樹突狀細(xì)胞而具有特異的抗癌作用。
根據(jù)以上結(jié)果，通過激活T-細(xì)胞來增加細(xì)胞因子的分泌以及通過增加細(xì)胞內(nèi)粘附分子的表達(dá)促進(jìn)造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的增殖和刺激，證實(shí)了本發(fā)明的單乙酰基二?；视脱苌锞哂忻庖咴鰪?qiáng)作用。結(jié)果，證實(shí)了這些化合物有可能被用作針對(duì)多種疾病的免疫治療劑。例如，本發(fā)明的單乙?；；视脱苌锟捎捎谄鋵?duì)于T4和T8細(xì)胞的增殖作用而被用作治療劑或健康食品，以在人類AIDS患者中增強(qiáng)免疫力。在AIDS患者的早期，T4有所減少但并未出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)作。在另一方面，在AIDS患者的晚期，T8有所減少并出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)作。因此，T4與T8的比率是一個(gè)重要的因子，且T4和T8的絕對(duì)數(shù)量也是一個(gè)重要的因子。進(jìn)而，本發(fā)明確證了通過增加IL-4的分泌對(duì)免疫功能進(jìn)行的調(diào)節(jié)對(duì)多種自身免疫性疾病是行之有效的。為了檢測(cè)本發(fā)明所述化合物在敗血癥性休克的預(yù)防和治療中的用途，進(jìn)行了小鼠的CLP(盲腸結(jié)扎和穿刺)檢測(cè)。結(jié)果是所有被測(cè)小鼠都存活至120小時(shí)。因此，證實(shí)了本發(fā)明的單乙?；；视脱苌飳?duì)敗血癥的預(yù)防和治療是行之有效的。根據(jù)以上結(jié)果，確證了本發(fā)明的單乙?；；视脱苌锸蔷哂忻庖咴鰪?qiáng)作用和具有免疫功能調(diào)節(jié)作用的理想的免疫調(diào)節(jié)劑。
進(jìn)而，為了研究本發(fā)明所述化合物在癌癥的預(yù)防和治療中的用途，本發(fā)明人了研究了所述化合物對(duì)已知為不可治愈的癌癥膽管癌和惡性黑素瘤的抗癌作用。首先，本發(fā)明人通過對(duì)倉(cāng)鼠靜脈內(nèi)或皮下注射膽管癌細(xì)胞系KING-5來誘導(dǎo)癌癥。然后向倉(cāng)鼠注射RPMI、BMSC、腺病毒/ΔE1、樹突狀細(xì)胞+腫瘤裂解物、化合物3、腺病毒/IL-2及其混合物。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4周后觀察結(jié)果。其結(jié)果是，當(dāng)用裸眼或顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)，樹突狀細(xì)胞+腫瘤裂解物、化合物3和腺病毒/IL-2處理組未形成腫瘤(參見圖6)。進(jìn)而，靜脈內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞并在實(shí)驗(yàn)8周后觀察結(jié)果。其結(jié)果是，在除了BMSC+腺病毒/IL-2處理組之外的所有組中都形成了轉(zhuǎn)移性肺損傷。根據(jù)活體解剖，在樹突狀細(xì)胞+腫瘤裂解物處理組和化合物3處理組中僅觀察到了少量的損傷(參見圖7、圖8和圖9)。再進(jìn)而，靜脈內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞并在實(shí)驗(yàn)12周后觀察結(jié)果。其結(jié)果是，在除了BMSC+腺病毒/hIL-2處理組和BMSC+Ad/hIL-2+化合物3之外的所有組中都形成了腫瘤(參見圖10)。腫瘤的形成被化合物3劑量依賴性地抑制(參見圖11和圖12)。正如在之前所闡述的，本發(fā)明人通過注射膽管癌細(xì)胞(KIBG)在倉(cāng)鼠中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性癌癥，并用本發(fā)明的單乙?；；视脱苌飳?duì)所述倉(cāng)鼠進(jìn)行治療。其結(jié)果證實(shí)了癌癥發(fā)展由于本發(fā)明的這些化合物的處理而得到了明顯地抑制。
對(duì)小鼠的尾巴靜脈注射惡性黑素瘤細(xì)胞來誘導(dǎo)癌癥。然后，用單獨(dú)的RPMI、樹突狀細(xì)胞(DC)、腫瘤裂解物和化合物3或其混合物進(jìn)行處理。其結(jié)果是在用RPMI處理的對(duì)照組中形成了轉(zhuǎn)移性肺損傷，而在用化合物3以及樹突狀細(xì)胞+腫瘤裂解物處理的組中則未觀察到損傷(參見圖13和圖14)。此外，在腫瘤注射后6周對(duì)化合物3處理組和以及樹突狀細(xì)胞+腫瘤裂解物處理組進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其具有90％的存活率(參見圖15)。根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明人證實(shí)了化合物3激活了T-細(xì)胞(T4和T8)，這意味著其具有抗癌作用。因此，本發(fā)明人在體外進(jìn)行了由化合物3激活的T-細(xì)胞對(duì)于惡性黑素瘤的細(xì)胞毒性檢測(cè)。其結(jié)果是當(dāng)用化合物3處理T-細(xì)胞時(shí)比不用化合物3處理T-細(xì)胞時(shí)細(xì)胞毒性大大增加，且細(xì)胞毒性也隨著T-細(xì)胞數(shù)量的增加而增加(參見圖16)。正如以上所解釋的，證實(shí)了本發(fā)明的單乙酰基二?；视脱苌锿ㄟ^激活T-細(xì)胞抑制了癌癥發(fā)展并對(duì)癌癥細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，說明本發(fā)明的所述化合物可有效地用作抗癌劑。用本發(fā)明的產(chǎn)物作為抗癌劑對(duì)膽道癌、腎癌和黑素瘤進(jìn)行治療是有前途的，而對(duì)其他形式惡性疾病的治療還有待探索。
此后，本發(fā)明人通過制備含有單乙?；；视脱苌镒鳛橛行С煞值脑囼?yàn)性膠囊和片劑完成了本發(fā)明。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑、AIDS治療劑、敗血癥治療劑和抗癌劑優(yōu)選包括20-100％總化合物重量比的單乙?；；视脱苌?，優(yōu)選為30-100％重量比。如果單乙?；；视脱苌锪窟^高或過低，則服藥困難且不具有優(yōu)勢(shì)。對(duì)敗血癥治療劑、抗癌劑和免疫調(diào)節(jié)劑而言，優(yōu)選是以50mg/kg的劑量口服給藥，每天1-3次或每天1-4次。除有效成分之外，本發(fā)明的所述化合物可在所配置的藥物形式中另外地包括一種或多種藥物可接收的載體。所述載體可選自鹽水、緩沖的鹽水、水、甘油和乙醇，且不僅局限于此。本領(lǐng)域中公知的任意可接收的藥物制劑都是可利用的(Remingtons Pharmaceutical Science(最新版)，Mack Publishing Company，Easton PA)。本發(fā)明的組合物可口服給藥并可以制藥制劑的通用形式使用?？赏ㄟ^與常規(guī)使用的填充劑、膨脹劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、諸如表面活性劑的稀釋劑或賦型劑混合，以使本發(fā)明所述組合物制備成用于口服給藥?？筛鶕?jù)年齡、性別、健康狀況、活性成分的吸收、失活速率、排泄以及其他共同使用的藥物來確定本發(fā)明所述組合物的有效劑量。例如，口服給藥的劑量可以是0.2-9.0g/天，但不僅限于此。本發(fā)明還包括了劑量單位的藥物制劑。這意味著所述制劑可以單個(gè)部分的形式呈現(xiàn)，例如，片劑、有包衣的片劑、膠囊、藥丸、栓劑和安瓿，其中的活性化合物含量對(duì)應(yīng)于個(gè)人劑量的一部分或其倍數(shù)。劑量單位例如可包含1、2、3或4倍的個(gè)人劑量或1/2、1/3或1/4的個(gè)人劑量。個(gè)人劑量?jī)?yōu)選地含有一次給藥中使用的活性化合物量，其通常對(duì)應(yīng)于每日劑量的全部、1/2、1/31/4?？诜o藥的固體制劑是片劑、藥丸、撲粉和膠囊，用于口服給藥的液體制劑是混懸液、溶液、乳劑和糖漿，上述制劑在諸如水和液體石蠟的簡(jiǎn)單稀釋劑之外，還可包括各種賦型劑，例如濕潤(rùn)劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑。本發(fā)明的所述化合物不僅可應(yīng)用于口服給藥的制劑中，還可應(yīng)用于注射的制劑中。例如，可使用分散劑、濕潤(rùn)劑或乳劑根據(jù)已知的方法制備用于無菌注射的水性或油性混懸液。任意可接收的藥物溶劑包括水、林格氏溶液或等滲的NaCl溶液。無菌的硬化油(fixing oil)可用作溶劑或分散介質(zhì)并可包括非刺激性硬化油，包括甘油單酯、甘油二酯和聚丙二醇以及諸如油酸的脂肪酸。
本發(fā)明還提供了含有單乙酰基二?；视脱苌镒鳛橛行С煞值拿庖哒{(diào)節(jié)性和抗癌健康食品。在本發(fā)明中，“健康食品”包括用于治療或預(yù)防多種疾病以及維持機(jī)體功能平衡的食品、營(yíng)養(yǎng)品和健康增補(bǔ)劑。在本發(fā)明中制備的健康食品包含0.02-100％重量比的單乙?；；视?。在將本發(fā)明所述化合物用作健康食品時(shí)，可根據(jù)常規(guī)方法使用所述化合物，例如，使用原樣的化合物或使用與其他食品或食品成分混合的化合物。所述化合物混合物的有效量隨其使用目的不同(預(yù)防，保健或治療性處理)而改變。在用作預(yù)防的情況下，優(yōu)選的單乙?；；视脱苌锏牧繛榭偨】凳称妨康?.02-2％重量比，優(yōu)選為0.2-0.6％重量比。如果單乙?；；视偷牧窟^高或過低，健康食品都難以食用且不具有優(yōu)勢(shì)。由細(xì)胞毒性檢測(cè)所支持，所述有效成分對(duì)旨在控制或保持健康的長(zhǎng)期食用而言也是安全的。可制成含有本發(fā)明組合物的任意種類的食品而沒有限制。例如，肉香腸、面包、湯、飲料、茶、酒、酒精飲料和維生素復(fù)合物是可被制成含有本發(fā)明所述組合物的健康食品的食品。出于治療或預(yù)防疾病的目的，在所述健康食品被用作營(yíng)養(yǎng)成分或健康增補(bǔ)劑時(shí)，優(yōu)選的單乙?；；视脱苌锏牧繛榭偨】凳称妨康?0-100％重量比，優(yōu)選為30-100％重量比，更有選為35-95％重量比。攝入量可為0.18-9.0g/天，但不僅限于此。制劑包括片劑和膠囊。
如上所解釋的那樣，本發(fā)明的單乙?；；视脱苌锟杉せ頣-細(xì)胞從而促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，增加細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)從而刺激造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞，以至于不僅改善免疫力而且還可預(yù)防和治療自身免疫性疾病和癌癥。
為了更好地理解本發(fā)明，以下提供了的優(yōu)選實(shí)施例。然而，本發(fā)明并不僅限于以下實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例。
單乙酰基二?；视脱苌飳?duì)T-細(xì)胞和單核細(xì)胞增殖的作用[實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例1-1]單乙?；；视脱苌飳?duì)T-細(xì)胞增殖的作用從C57BL/6小鼠(由韓國(guó)首爾的生命科學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室Asan研究所(Asan Institute for Life Sciences Animal Lab.)提供)的脾臟采集脾細(xì)胞。然后通過反復(fù)吸取和沖洗獲得單細(xì)胞懸液。使用氯化銨去除紅細(xì)胞，并通過尼龍棉(nylon wool)去除碎屑和團(tuán)塊。使用含有抗山羊IgG(MACS小珠，Miltenyi Biotec，bergich gladbach，Germany)或抗小鼠CD4(MACS小珠，Miltenyi Biotec，bergich gladbach，Germany)或抗鼠CD8抗體(MACS小珠，Miltenyi Biotec，bergich gladbach，Germany)的磁珠(MACS小珠，Miltenyi Biotec，bergich gladbach，Germany)來純化T-細(xì)胞(Turner和Dockrell(1996)Immunology，87339-342)。
將T細(xì)胞懸液懸浮于添加了10％胎牛血清(下文中稱為“FBS”)(Gibco，Grand Island，NY)的Isocove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM，Gibco，Grand Island，NY)中。在含有1μg/ml化合物1、化合物2、化合物4和化合物5，0.01、0.1、1μg/ml化合物3(由韓國(guó)首爾Ewha女子大學(xué)化學(xué)系合成并提供)或20ng/ml IL-2的96孔板中，以每孔5×104活性細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在第6天，用1μCi3H-胸腺嘧啶核苷/孔將細(xì)胞孵育24小時(shí)。在第7天，收獲細(xì)胞，采用數(shù)學(xué)公式1計(jì)算整合系數(shù)(下文中稱為“SI”)。
SI＝實(shí)驗(yàn)組小孔吸收的3H-胸腺嘧啶核苷(樣品中的CPM)/對(duì)照組小孔吸收的3H-胸腺嘧啶核苷(對(duì)照中的CPM)結(jié)果是，單乙?；；视脱苌锾幚斫M在T-細(xì)胞吸收胸腺嘧啶核苷方面具有升高的SI，2.05，其類似于IL-2處理組的情況(表1)。
表1


*P＜0.05，**P＜0.005。所有檢測(cè)都一式三份并重復(fù)三次。
單乙?；；视脱苌飳?duì)單核細(xì)胞增殖的作用使用Histopaque 1077從人的全血中分離出單核細(xì)胞。隨后，在5％CO2培養(yǎng)箱中使單核細(xì)胞(5×106細(xì)胞/ml)對(duì)組織培養(yǎng)瓶進(jìn)行3小時(shí)吸附。3小時(shí)之后，去除未吸附的細(xì)胞，并將吸附的細(xì)胞放置于含有添加了10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY)的96孔板中。在含有1μg/ml化合物1～5的96孔板中，以每孔5×104活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在第6天，用1μCi3H-胸腺嘧啶核苷/孔將細(xì)胞孵育24小時(shí)。在第7天，收獲細(xì)胞并計(jì)算3H-胸腺嘧啶核苷的整合。采用上述的公式1計(jì)算SI。其結(jié)果是與對(duì)照相比，化合物1～5處理組具有升高的單核細(xì)胞SI 10.68，說明所述化合物刺激了單核細(xì)胞的增殖(表2)。
表2


*P＜0.001。所有檢測(cè)都一式三份并重復(fù)兩次。
化合物3對(duì)T細(xì)胞活性的作用[實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例2-1]通過Elispot測(cè)定細(xì)胞因子因?yàn)橛糜谠摲治鲋械腅lispot板的每一小孔底部都預(yù)先包被了細(xì)胞因子特異性的抗體，所以Elispot生物分析(ESAT-6酶聯(lián)免疫點(diǎn)分析)是檢測(cè)與膜結(jié)合的細(xì)胞因子的非常靈敏的定量分析法。因此可使用Elispot分析來測(cè)定T細(xì)胞活性。以2×106細(xì)胞向無菌的組織培養(yǎng)板(Nunc，Denmark)的每一孔中接種T細(xì)胞，然后用0.01、0.1、1μg/ml濃度的化合物3或IL-2(20ng/ml)對(duì)其進(jìn)行處理。在第7天，收獲細(xì)胞并將該細(xì)胞以5×105細(xì)胞/ml接種于包被有不同初級(jí)抗體(小鼠IL-2)的多重-檢測(cè)板(Elispot系統(tǒng)試劑盒，AID，Straberg，Germany)中。將所述培養(yǎng)板在5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)之后，所述細(xì)胞開始分泌細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子為初級(jí)抗體(小鼠IL-2)所俘獲，這通過使用可購(gòu)得的小鼠IL-2 Elispot試劑盒根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行Elispot而測(cè)定。每個(gè)樣品測(cè)定兩次。使用Elispot讀數(shù)器(AID Elispot Reader System)完成通過Elispot對(duì)產(chǎn)生IL-2細(xì)胞的計(jì)數(shù)。其結(jié)果說明，與對(duì)照組相比，化合物3處理組具有1.52倍升高的T-4活性，以及1.46倍升高的T-8活性(圖1)。
通過Bio-plex測(cè)定細(xì)胞因子Bio-plex可在小孔中同時(shí)對(duì)大量的細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定。因此，Bio-plex試劑盒用來對(duì)Th1/Th2途徑的8種細(xì)胞因子進(jìn)行定量，這些細(xì)胞因子是在T-細(xì)胞被激活是分泌的。用抗-CD3和抗-CD28處理無菌的24孔組織培養(yǎng)板(Nunc，Denmark)進(jìn)行。然后，以2×106細(xì)胞/ml在該培養(yǎng)板上接種T細(xì)胞。為了激活T-細(xì)胞，向其中加入0.1、1μg/ml化合物3進(jìn)行處理，隨后培養(yǎng)5天。在第5天，將不同階段的培養(yǎng)液回收，然后進(jìn)行離心。收集上清液，然后按照制造商的說明書(Bio-rad)使用Bio-plex試劑盒對(duì)其中分泌出的細(xì)胞因子進(jìn)行定量。其結(jié)果是在使用化合物3處理組中，分泌出了8種細(xì)胞因子(IL-2，IL-4和IL-5，IL-10，IL-12，INF-γ，GM-CSF，TNF-α)中的3種(IL-2，IL-4和IL-5)，且其數(shù)量也比未使用化合物3進(jìn)行處理的對(duì)照組的數(shù)量要高(圖2)。
T細(xì)胞增殖分析進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)化合物3對(duì)AIDS患者免疫細(xì)胞的作用。首先，通過Hisopaque 1077從AIDS患者的外周血中獲得人單核細(xì)胞。使用氯化銨去除紅細(xì)胞，并隨后通過尼龍棉去除碎屑和團(tuán)塊。使用磁珠(抗人CD3)(MACS小珠，Miltenyi Biotec，bergich gladbach，Germany)來純化T-細(xì)胞。將T細(xì)胞懸液懸浮于添加了10％胎牛血清(下文中稱為“FBS”)(Gibco，Grand Island，NY)的Isocove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM，Gibco，Grand Island，NY)中。在含有0.01、0.1、1μg/ml濃度的化合物3或IL-2(20ng/ml)的96孔板中，以每孔5×104活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)(一式三份)。在第6天，用1μCi3H-胸腺嘧啶核苷/孔將細(xì)胞孵育24小時(shí)。在第7天，收獲細(xì)胞，計(jì)算3H-胸腺嘧啶核苷的整合。根據(jù)上述公式1計(jì)算SI(刺激系數(shù))。結(jié)果是，在AIDS患者中，T細(xì)胞增殖分析說明，與對(duì)照相比，化合物3處理組在全部患者(4個(gè)中的4個(gè))的胸腺嘧啶核苷攝入方面具有1.5-3.9倍升高的T-細(xì)胞刺激系數(shù)，如表3所示?；衔?刺激的結(jié)果與IL-2刺激的結(jié)果總體上相當(dāng)。
表3

化合物3對(duì)樹突狀細(xì)胞粘附分子表達(dá)的作用[實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例4-1]樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)物從Balb/c AnN小鼠的大腿骨和脛骨獲得骨髓細(xì)胞(Park，J.et al.(2003)J.Korean Med.Sci.，18372-380)。將細(xì)胞在RPMI中洗滌3次，收集單個(gè)核細(xì)胞。然后使這些單個(gè)核細(xì)胞在RPMI和10％FBS中對(duì)組織培養(yǎng)瓶吸附3小時(shí)。孵育后，去除吸附的細(xì)胞(單核細(xì)胞)，將未吸附的細(xì)胞以1×105細(xì)胞/ml的濃度置于含有添加有20ng/ml鼠rGM-CSF(R & D Systems，Minneapolis，MN，USA)，10ng/ml鼠IL-4(R & D Systems)和2.5ng/ml鼠TNF-α(R & D Systems)的RPMI加10％FBS培養(yǎng)基的100mm組織培養(yǎng)皿中。每3天向培養(yǎng)皿中添加一次培養(yǎng)液。在培養(yǎng)的第6天加入鼠TNF-α(R& D Systems)。之后每3天加入一次鼠TNF-α(R & D Systems)，直到第11天。收集成熟的樹突狀細(xì)胞用于對(duì)粘附分子進(jìn)行RT-PCR研究。結(jié)果是，圓形的顆粒細(xì)胞在培養(yǎng)三天之后，這些細(xì)胞形成串，在細(xì)胞培養(yǎng)板小孔的底部生長(zhǎng)，而在培養(yǎng)的第6或第7天成熟的樹突狀細(xì)胞成簇出現(xiàn)。在培養(yǎng)的第9天，樹突狀細(xì)胞形成了小但是具有特異性長(zhǎng)突出(圖3)。
樹突狀細(xì)胞表型的確定對(duì)那些個(gè)體較大且對(duì)臺(tái)盼藍(lán)染色呈陰性的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對(duì)其中的每一個(gè)的形態(tài)都進(jìn)行研究。以1×106細(xì)胞/ml進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)然后洗滌，再用1％多聚甲醛溶液固定。使用FACScan(Beckton Dickinson，MountainView，CA，U.S.A)對(duì)固定的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析，使用針對(duì)如下標(biāo)記物的抗體確定其表型；這些標(biāo)記物有針對(duì)倉(cāng)鼠IgG，大鼠IgG2a的同種型對(duì)照，DC標(biāo)記物DEC205(NLDC-145)和CD 11C，共刺激/粘附分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)，巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD14和F4/80，顆粒細(xì)胞標(biāo)記物Gr-1(Pharmingen，Hamburg，Germany)。其結(jié)果是共刺激特異性分子標(biāo)記物CD80和C86以及樹突狀細(xì)胞特異性標(biāo)記CD11C和DEC-205的水平較高。相反，單核細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD14和F4/80以及顆粒細(xì)胞特異性標(biāo)記物Gr-1的水平較低。該結(jié)果說明本發(fā)明中分離的樹突狀細(xì)胞具有樹突狀細(xì)胞的確切表型且純度為97-98％(圖4)。
粘附分子的處理和表達(dá)公知在對(duì)各種造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞進(jìn)行的刺激都涉及到了細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互作用。因此，本發(fā)明人試圖確認(rèn)化合物3是否影響了所涉及細(xì)胞的各種粘附分子。具體地，用1μg/ml化合物3對(duì)培養(yǎng)于上述實(shí)施例中的樹突狀細(xì)胞進(jìn)行處理，然后進(jìn)行RT-PCR分析。
使用以下引物進(jìn)行了RT-PCR分析，這些引物是Icam-1(SEQ.ID.No1和No 2)，Icam-2(SEQ.ID.No 3和No 4)，Vcam-1(SEQ.ID.No 5和No6)，VLA-4(SEQ.ID.No 7和No 8)，VLA-5(SEQ.ID.No 9和No 10)，LFA-1(SEQ.ID.No 11和No 12)和GAPDH(SEQ.ID.No 13和No 14)。在此使用的反應(yīng)組合是2μl DNA、10x緩沖溶液、1.5μl MgCl2、2μl dNTPs，0.5μl正向引物、0.5μl反向引物、0.2μl聚合酶以及15.8μl蒸餾水的混合溶液。
對(duì)從樹突狀細(xì)胞和MS-5、低密度細(xì)胞中分離的總RNA使用寡聚(dT)引物培養(yǎng)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在94℃30秒，65℃30秒和72℃50秒進(jìn)行PCR。PCR總共重復(fù)34次，且每次PCR產(chǎn)物都加倍。通過RT-PCR驗(yàn)證了諸如Vcam-1、Icam-1、Icam-2、VLA-4、VLA-5和LFA-1的粘附分子的表達(dá)。為了定量，使用GAPDH進(jìn)行PCR來確認(rèn)對(duì)應(yīng)的cDNA。其結(jié)果說明，與對(duì)照相比，化合物3處理的樹突狀細(xì)胞對(duì)粘附分子Icam-2、VLA-5、LFA-1的表達(dá)具有明顯的增加(圖5)。
通過皮下注射(局部模型)和靜脈注射(系統(tǒng)模型)對(duì)化合物3的抗癌作用進(jìn)行研究[實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例5-1]膽管癌的倉(cāng)鼠模型將6周齡的雌性敘利亞金色倉(cāng)鼠(Harlan，Indianapolis，India，USA)飼養(yǎng)于無特定病原菌的環(huán)境中。通過股靜脈靜脈注射懸浮于100μl RPMI1640無血清培養(yǎng)基中的5×105KIBG-5細(xì)胞(Molecular therapy，Vol.3，No.4，pp431-437)。并將懸浮于100μl無血清RPMI培養(yǎng)基中的5×105KIBG-5細(xì)胞皮下注射入倉(cāng)鼠的側(cè)腹。將注射了KIBG-5細(xì)胞的倉(cāng)鼠分成7組；1)用RPMI培養(yǎng)基處理的對(duì)照組，2)用未修飾的BMSC細(xì)胞(2.5×106)處理的實(shí)驗(yàn)組(Leukemia &Lymphoma，Vol.44，No.11，pp1973-1978)，3)用Ad/ΔE1 50MOI修飾的BMSC細(xì)胞處理的實(shí)驗(yàn)組(Leukemia& Lymphoma，Vol.44，No.11，pp1973-1978)，4)用DC+腫瘤裂解物(5×106)處理的實(shí)驗(yàn)組，5)用Ad/hIL-250MOI修飾的BMSC細(xì)胞處理的實(shí)驗(yàn)組(Leukemia& Lymphoma，Vol.44，No.11，pp1973-1978)，6)用Ad/hIL-250MOI修飾的BMSC細(xì)胞處理的實(shí)驗(yàn)組+用化合物3(25mg/kg/天)處理的實(shí)驗(yàn)組，7)用化合物3(25mg/kg/天)處理的實(shí)驗(yàn)組。
在向倉(cāng)鼠(BMSC處理組)注射癌癥細(xì)胞一周之后，向每一只倉(cāng)鼠再次注射2.5×106BMSC細(xì)胞。對(duì)于DC+腫瘤裂解物處理組，在第1、2、3、4、6、8周向每一只倉(cāng)鼠注射(皮下注射或靜脈注射)5×106DC細(xì)胞和腫瘤裂解物，然后在12周后進(jìn)行觀察。對(duì)于化合物3處理組，在KIBG-5細(xì)胞注射前一周，通過P.O以持續(xù)2周中斷1周的方式以化合物3給藥(25mg/kg/天)，進(jìn)行8周。
結(jié)果是，在癌癥細(xì)胞注射4周后，在作為對(duì)照的RPMI處理組、BMSC處理組和BMSC+Ad/ΔE1處理組中形成了腫瘤，而在DC+腫瘤裂解物處理組、化合物3處理組和BMSC+Ad/IL-2處理組中則未形成腫瘤(圖6)。此外，在癌癥細(xì)胞注射8周之后，在作為對(duì)照的RPMI處理組、BMSC處理組和BMSC+Ad/ΔE1處理組中發(fā)現(xiàn)了多處轉(zhuǎn)移性肺損傷，而在DC+腫瘤裂解物處理組和化合物3處理組中僅發(fā)現(xiàn)有一處微小的肺損傷。但在BMSC+Ad/IL-2處理組中則未發(fā)現(xiàn)損傷(圖7，圖8，圖9)。此外，在腫瘤細(xì)胞皮下注射12周之后，在作為對(duì)照的RPMI處理組、BMSC處理組、BMSC+Ad/ΔE1處理組和DC+腫瘤裂解物處理組中形成了腫瘤，在BMSC+Ad/IL-2處理組中僅在一只小鼠中發(fā)現(xiàn)了小于5mm大小的腫瘤，而在BMSC+Ad/IL-2+化合物3處理組中未發(fā)現(xiàn)腫瘤(圖10)。
在另一方面，將6周齡的雌性敘利亞金色倉(cāng)鼠飼養(yǎng)于無特定病原菌的環(huán)境中。通過股靜脈靜脈注射懸浮于100μl RPMI 1640無血清培養(yǎng)基中的KIBG-5細(xì)胞(5×105)。將倉(cāng)鼠分成4組1)PBS對(duì)照組，2)化合物3(10mg/kg/天)處理組，3)化合物3(25mg/kg/天)處理組，4)化合物3(50mg/kg/天)處理組。在腫瘤細(xì)胞注射前一周，通過P.O以持續(xù)2周中斷1周的方式以化合物3給藥(10，25或50mg/kg/天)，進(jìn)行12周。將每組的動(dòng)物在4、8、12周處死進(jìn)行病理檢驗(yàn)。在第4周進(jìn)行肉眼檢查發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組的注射部位上有腫瘤發(fā)展，而化合物3(10、25或50mg/kg/天)處理組則沒有腫瘤出現(xiàn)的跡象。在第8周，在對(duì)照組中的雙肺中都觀察到了多處轉(zhuǎn)移性損傷。用裸眼觀察在化合物3(25或50mg/kg/天)處理組中未表現(xiàn)出任何轉(zhuǎn)移性肺損傷，而用顯微鏡觀察則在化合物3(25mg/kg/天)處理組中發(fā)現(xiàn)有一處微小損傷。在化合物3(10mg/kg/天)處理組的左肺中發(fā)現(xiàn)有腫瘤(圖11和圖12)。
黑素瘤的小鼠(C57BL/6)模型將6周齡的雌性C57BL/6小鼠(由韓國(guó)首爾生命科學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室Asan研究所提供)飼養(yǎng)于無特定病原菌的環(huán)境中。
通過尾靜脈靜脈注射懸浮于100μl RPMI 1640無血清培養(yǎng)基中的B16F10細(xì)胞(2×104)。在腫瘤注射前1周，對(duì)下面的三組進(jìn)行處理。
1)RPMI對(duì)照組2)樹突狀細(xì)胞(DC)(5×105細(xì)胞/天)+腫瘤裂解物處理組3)化合物3(50mg/kg/天)處理組。
對(duì)于DC+腫瘤裂解物處理組，在黑素瘤注射前1周，每一周都將混合有腫瘤裂解物的5×105DC細(xì)胞注射入腹腔中。對(duì)于化合物3處理組，用化合物3以50mg/kg/天處理每只小鼠。在黑素瘤(B16F10)注射前1周，通過P.O以持續(xù)2周中斷1周的方式以化合物3給藥(50mg/kg/天)，進(jìn)行6周。其結(jié)果是，在第4周進(jìn)行肉眼檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組的雙肺中均觀察到了多處轉(zhuǎn)移性損傷。在黑素瘤(B16F10)注射后6周的觀察中發(fā)現(xiàn)，化合物3處理組和DC+腫瘤裂解物處理組未表現(xiàn)出在肺中存在疾病的跡象(圖13和圖14)并表現(xiàn)出90％的存活率(圖15)。
基于化合物3的抗癌作用歸結(jié)于化合物3對(duì)T-細(xì)胞的激活這一假設(shè)，研究了由化合物3激活的T-細(xì)胞對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。其結(jié)果是，當(dāng)由化合物3激活的T-細(xì)胞與黑素瘤細(xì)胞的比率為100∶1時(shí)，細(xì)胞毒性增加了42％(圖16)。
化合物3的毒性檢測(cè)將合成的化合物3溶解于5％乙醇溶液中，其以0.1ml/20g的劑量口服給藥。飼養(yǎng)于SPF設(shè)施中的IRC小鼠用作測(cè)試動(dòng)物。對(duì)照組用5％乙醇溶液進(jìn)行處理。在給藥前使動(dòng)物禁食一天，之后自由飲水和攝食。將8-10只25-35g重的ICR小鼠分成一組。以從62.5mg/kg、125mg/kg、250mg/kg、500mg/kg、1.0g/kg至2.0g/kg逐漸升高的劑量通過口服以檢測(cè)試劑給藥一次。從給藥當(dāng)天開始，用裸眼對(duì)存活數(shù)量和任何異常體癥進(jìn)行觀察，持續(xù)14天。通過Lichfield-Wilcoxon方法計(jì)算LD50(白須、泰彥、吐山、豐秋新毒性試驗(yàn)法-方法與評(píng)價(jià)-acute toxicity test(急性毒性試驗(yàn))，Realize Inc.，Tokyo，1988)，并根據(jù)以下數(shù)學(xué)公式計(jì)算重量變化。
重量增加率(％)＝{第14天的重量-第0天的重量}÷{第0天的重量}×100結(jié)果如表4所示。使用62.5mg/kg～2g/kg的化合物3未觀察到毒性。這一觀察說明LD50高于2g/kg。使用裸眼在給藥后14天未觀察到任意異常體癥。處理組和對(duì)照組動(dòng)物的重量都穩(wěn)步增長(zhǎng)。如表5所示，未觀察到明顯的、處理特異性的重量變化(增加或減少)。
表4化合物3處理的死亡率(％)

表5化合物3口服給藥14天后增加的重量

對(duì)化合物3劑量為100mg/kg體重/天，通過P.O給藥持續(xù)4周的大鼠進(jìn)行了長(zhǎng)期肝毒性檢測(cè)，還觀察了肝功能測(cè)試、脂類情況和細(xì)胞色素C-450活性。在第4周末觀察了肝臟的組織學(xué)情況。沒有觀察到明顯的不良作用。
CLP(盲腸結(jié)扎和穿刺)檢測(cè)進(jìn)行CLP檢測(cè)是為了驗(yàn)證化合物3對(duì)于預(yù)防和治療敗血癥性休克的作用。將10只7-10周齡的雄性近交C3H/HeN小鼠(20-25g重)分成一組。在通過口服以50mg/kg/天以化合物3對(duì)這些小鼠給藥兩周然后中斷1周之后，用80mg/kg克他命和16mg/kg甲苯噻嗪(rompun)麻醉小鼠。在麻醉的小鼠中通過CLP模型誘導(dǎo)敗血癥性休克。在敗血癥性休克誘導(dǎo)1小時(shí)之后，用50mg/kg的化合物3進(jìn)行處理，然后，每24小時(shí)進(jìn)行相同的處理，持續(xù)3天。對(duì)照組口服給予PBS+5％乙醇溶液?；衔?處理組與對(duì)照組的存活率隨時(shí)間的變化如表6所示。甚至在120小時(shí)之后化合物3處理組依然具有100％的存活率。
表6在敗血癥性休克中的存活率
含有化合物3作為有效成分的醫(yī)療用品的制備在通過以上實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了化合物3具有極好的免疫調(diào)節(jié)和抗癌活性之后，本發(fā)明人制備了含有化合物3作為有效成分的治療劑。此外，含有化合物3作為有效成分的以下生產(chǎn)性實(shí)施例不僅可應(yīng)用于制備治療劑，還可以應(yīng)用于制備健康食品。如果沒有特別指出，在以下生產(chǎn)性實(shí)施例中符號(hào)％是指重量％。
軟明膠膠囊的制備[生產(chǎn)性實(shí)施例1-1-1]化合物3 30％維生素C 4.5％維生素D3 0.001％硫酸錳 0.1％蠟 10％棕櫚油 25％紅花油(Carthamus tinctorius) 30.399％[生產(chǎn)性實(shí)施例1-1-2]化合物3 31.25％月見草籽油 59.75％大豆油 6.7％維生素E乙酸酯(DL-α-生育酚乙酸酯)2.1％大豆卵磷脂 0.2％[生產(chǎn)性實(shí)施例1-1-3]化合物3 98.0％維生素E乙酸酯(DL-α-生育酚乙酸酯)2.0％[生產(chǎn)性實(shí)施例1-2]片劑的制備化合物3 30％
維生素C 10％維生素D3 0.001％硫酸錳0.1％結(jié)晶纖維素25.0％乳糖 32.399％硬脂酸鎂 2％[生產(chǎn)性實(shí)施例1-3]注射制劑的制備化合物3 2％丙二醇35％甘油一酯 8％乙醇 5％水50％采用上述組合物和含量通過常規(guī)方法制備注射制劑。
含有化合物1、2、4和5作為有效成分的醫(yī)療用品的制備可通過采用與以上描述的生產(chǎn)性實(shí)施例1相同的方法和組合物制備軟明膠膠囊、片劑和注射懸液，除了用化合物1、2、4和5以相同的比率來替代化合物3。
含有化合物3作為有效成分的健康食品的制備在通過以上實(shí)施例驗(yàn)證了化合物3具有極好的免疫調(diào)節(jié)、抗敗血癥性休克和抗癌活性之后，本發(fā)明人制備了含有化合物3作為有效成分的健康食品。
飲料的制備蜂蜜 522mg硫辛酰胺 5mg尼克酰胺 10mg
鹽酸核黃素鈉 3mg鹽酸吡哆醇 2mg肌醇 30mg原酸 50mg化合物30.48～1.28mg水 200ml通過常規(guī)方法根據(jù)上述組合物和含量制備飲料。
口香糖的制備口香糖基質(zhì) 20％糖 76.36～76.76％化合物30.24～0.64％水果調(diào)味劑 1％水 2％通過常規(guī)方法根據(jù)上述組合物和含量制備口香糖。
糖果的制備糖 50～60％淀粉糖漿 39.26～49.66％化合物30.24～0.64％橘調(diào)味劑 0.1％通過常規(guī)方法根據(jù)上述組合物和含量制備糖果。
餅干的制備1級(jí)強(qiáng)力面粉88kg1級(jí)制糕點(diǎn)用面粉76.4kg精制糖 16.5kg鹽 2.5kg葡萄糖 2.7kg棕櫚起酥油 40.5kg
Ammo 5.3kg發(fā)面蘇打 0.6kg硫酸氫鈉 0.55kg米粉 5.0kg維生素B1 0.003kg微生素B2 0.003kg乳調(diào)味劑 0.16kg水 71.1kg全乳粉 4kg替代乳粉(substitute milk power)1kg磷酸鈣，一元的 0.1kg噴灑用鹽 1kg噴灑用乳 25kg化合物30.2～0.5kg通過常規(guī)方法根據(jù)上述組合物和含量制備餅干。
冰淇淋的制備乳脂 10.0％無脂的乳固形物 10.8％糖 12.0％淀粉糖漿 3.0％乳化穩(wěn)定劑(范圍(span)) 0.5％調(diào)味劑(草莓) 0.15％水 63.31～62.91％化合物30.24～0.64％通過常規(guī)方法根據(jù)上述組合物和含量制備冰淇淋。
巧克力的制備糖 34.36～34.76％可可油 34％
Cocoa mat15％可可粉 15％卵磷脂 0.5％香草調(diào)味劑 0.5％化合物3 0.24～0.64％通過常規(guī)方法根據(jù)上述組合物和含量制備巧克力。
含有化合物1、2、4和5作為有效成分的健康食品的制備可通過與以上描述的生產(chǎn)性實(shí)施例3相同的方法和組合物制備飲料、口香糖、糖果、餅干、冰淇淋和巧克力，除了用化合物1、2、4和5以相同的比率來替代化合物3。
有益效果如上文所解釋的，含有化合物3的單乙?；；视脱苌锉憩F(xiàn)出了明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，包括免疫增強(qiáng)作用。對(duì)于通過注射癌癥細(xì)胞系在倉(cāng)鼠中誘導(dǎo)癌癥的情況，通過激活對(duì)于促進(jìn)免疫力具有重要作用的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞使得癌癥的發(fā)展得以延遲，而通過提升免疫細(xì)胞對(duì)癌癥細(xì)胞的細(xì)胞毒性則誘導(dǎo)了癌癥細(xì)胞的調(diào)亡。同樣，對(duì)于誘導(dǎo)敗血癥性休克的小鼠情況，通過控制免疫功能和對(duì)凋亡的抑制作用，甚至在時(shí)間120小時(shí)之后還有100％的存活率。因此，本發(fā)明的單乙酰基二?；视脱苌锟捎行У赜糜诿庖哒{(diào)節(jié)劑、敗血癥治療劑、癌癥治療劑和健康食品，用于免疫調(diào)節(jié)或預(yù)防癌癥。
序列表<110>金尚姬<120>含有單乙?；；视脱苌锏拿庖哒{(diào)節(jié)劑、抗癌劑和健康食品<130>pd5013<150>KR 10-2004-0028514<151>2004-04-24<150>KR 10-2004-0070650<151>2004-09-04<150>KR 10-2004-0109805<151>2004-12-21<160>14<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>GAPDH反向引物<400>14tccaccaccc tgttgctgta 20
權(quán)利要求
1.含有以下列式1表示的單乙?；；视脱苌镒鳛橛行С煞值拿庖哒{(diào)節(jié)劑，式1 其中，R1/R2是9-十八碳烯酰基(油?；?/十六?；?棕櫚?；?、十六酰基(棕櫚?；?/9-十八碳烯?；?油?；?、十六?；?棕櫚?；?/9，12-十八碳二烯酰基(亞油?；?、十六?；?棕櫚?；?/9，12，15-十八碳三烯酰基(亞麻?；?或十六?；?棕櫚?；?/5，8，11，14-二十碳四烯?；?花生四烯?；?。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其中以所述式1表示的所述單乙酰基二?；视脱苌锸且韵铝惺?表示的單乙酰基二?；视?，式2
3.如權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其中所述單乙?；；视脱苌锎碳みx自T細(xì)胞中的IL-2、IL-4和IL-5的細(xì)胞因子的分泌。
4.如權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其中所述單乙酰基二?；视脱苌镆种朴勺陨砻庖叻磻?yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。
5.如權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其中所述單乙?；；视脱苌锎碳L-4的分泌，并且起增殖和活化T4和T8細(xì)胞的作用。
6.如權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其中所述單乙?；；视脱苌镎妓雒庖哒{(diào)節(jié)劑的總重量的20％至100％重量比。
7.AIDS治療劑，其含有以上述式1表示的單乙酰基二?；视脱苌镒鳛橛行С煞?。
8.敗血病治療劑，其含有以上述式1表示的單乙?；；视脱苌镒鳛橛行С煞?。
9.抗癌劑，其含有以上述式1表示單乙酰基二?；视脱苌镒鳛橛行С煞?。
10.如權(quán)利要求9所述的抗癌劑，其中所述抗癌劑用于治療膽管癌、腎癌或惡性黑素瘤。
11.如權(quán)利要求9所述的抗癌劑，其中所述抗癌劑激活能使T細(xì)胞識(shí)別癌癥細(xì)胞抗原的樹突狀細(xì)胞。
12.用于免疫調(diào)節(jié)或預(yù)防癌癥的的健康食品，其含有以上述式1表示的單乙?；；视脱苌镒鳛橛行С煞帧?br> 13.如權(quán)利要求12所述的健康食品，其中所述單乙酰基二?；视脱苌镎妓鼋】凳称房傊亓浚サ?.02％至100％重量比。
全文摘要
本發(fā)明公開了從鹿角中提取的單乙?；；视脱苌镉糜诿庖哒{(diào)節(jié)劑。還公開了含有單乙酰基二?；视脱苌镒鳛橛行С煞值尼t(yī)療用品和健康食品。單乙酰基二?；视脱苌锉憩F(xiàn)出了明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，包括免疫增強(qiáng)作用。對(duì)于通過注射癌癥細(xì)胞系在倉(cāng)鼠中誘導(dǎo)癌癥的情況，通過激活對(duì)于促進(jìn)免疫力具有重要作用的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞使得癌癥的發(fā)展得以延遲，而通過提升免疫細(xì)胞對(duì)癌癥細(xì)胞的細(xì)胞毒性則誘導(dǎo)了癌癥細(xì)胞的調(diào)亡。同樣，對(duì)于誘導(dǎo)敗血癥性休克的小鼠情況，通過控制免疫功能和抑制凋亡的作用甚至在120小時(shí)之后還有100％的存活率。因此，本發(fā)明的單乙?；；视脱苌锟捎行У赜糜诿庖哒{(diào)節(jié)劑、敗血癥治療劑、癌癥治療劑和健康食品，用于免疫調(diào)節(jié)或預(yù)防癌癥。
文檔編號(hào)A61K31/22GK1946392SQ200580012914
公開日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月24日
發(fā)明者金尚姬 申請(qǐng)人:金尚姬