專利名稱：作為IkB激酶抑制劑的基本純凈的2－{ [2－(2－甲基氨基－嘧啶－4－基)－1H－吲哚 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及吲哚衍生物、其制備方法、含有該化合物的藥物組合物、其用途和中間產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
NF-κB是調(diào)節(jié)多種炎癥基因表達(dá)的雜二聚體轉(zhuǎn)錄因子。70多種已知蛋白的表達(dá)是通過NF-κB與這些基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列單元結(jié)合來轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的(Baeuerle和Baichwal，Advances in Immunology 65111-137，1997)。NF-κB與許多病理生理學(xué)過程，包括血管生成(Koch等人，Nature376517-519，1995)、動(dòng)脈粥樣硬化(Brand等人，J Clin Inv.971715-1722，1996)、內(nèi)毒素性休克和敗血癥(Bohrer等人，J.Clin.Inv.100972-985，1997)、炎性腸病(Panes等人，Am J Physiol.269H1955-H1964，1995)、局部缺血/再灌注損傷(Zwacka等人，Nature Medicine 4698-704，1998)和過敏性肺炎(Gosset等人，Int Arch Allergy Immunol.10669-77，1995)。鑒于NF-κB在炎癥中所扮演的中心角色，因此，通過NF-κB激活途徑中的靶向調(diào)節(jié)蛋白抑制NF-κB代表了生成抗炎治療劑的一種引人注目的手段。
IκB激酶(IKK)是協(xié)調(diào)NF-κB活化作用的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)信號(hào)分子。兩種IKK--IKK-1(IKK-α)和IKK-2(IKK-β)是結(jié)構(gòu)獨(dú)特的激酶，它們包含具有雙重絲氨酸活化環(huán)的N末端激酶結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域以及C末端螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域和絲氨酸簇。IKK酶與其它激酶的序列同源性較低，并且用已知的激酶抑制劑進(jìn)行的早期研究沒有發(fā)現(xiàn)具有顯著效力的化合物。動(dòng)力學(xué)分析顯示了IKK-2以高度和相對(duì)一致的親和性結(jié)合并磷酸化IκBα和IκBε(Heilker等人，1999)。重組IKK-2磷酸化IκBα肽26-42與磷酸化全長的IκBα具有接近一致的親合性，但是，天然IKK酶復(fù)合物磷酸化全長IκBα的效率要高25,000倍，這表明IκBα的C末端結(jié)構(gòu)域具有重要的調(diào)控序列或IκB酶復(fù)合物具有額外的調(diào)控蛋白可加速催化速率(Burke等人，Journal of Biological Chemistry 27436146-36152，1999)。IκBα的磷酸化通過隨機(jī)順序動(dòng)力學(xué)機(jī)制發(fā)生，這意味著ATP或IκBα均可以首先與IKK-2結(jié)合，但必須在兩者均結(jié)合后，IκBα磷酸化才會(huì)發(fā)生(Peet和Li，Journal of Biological Chemistry 27432655-32661，1999)。與其它絲氨酸-蘇氨酸激酶諸如p38和JNK相比，IKK-2與ATP結(jié)合的親和力特別高(Ki＝130nM)，這也許表明IKK-2帶有一個(gè)結(jié)合ATP的特殊區(qū)域，其表現(xiàn)為當(dāng)用IKK-2進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，很多特異性較寬的激酶抑制劑活性較差。至今還沒有IKK-2的晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道。但是，同源模型已鑒別出三個(gè)結(jié)構(gòu)功能區(qū)域，包括具有活化環(huán)的N末端激酶結(jié)構(gòu)域、可能介導(dǎo)IKK-1和IKK-2均/雜二聚體形成的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域以及具有富含絲氨酸的尾的C末端螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域。IKK-2的活化取決于活化環(huán)或T環(huán)中絲氨酸177和181的磷酸化。丙氨酸突變使活性消失，而谷氨酸突變則產(chǎn)生組成性活性酶(Mercurio等人，Science 278860-866，1997；Delhase等人，Science28430313，1999)。
IKK-1和IKK-2可形成雜二聚體和IKK-2均二聚體，并可與被稱作“IKK信號(hào)體”的700-900kDa的胞質(zhì)激酶復(fù)合物結(jié)合(Mercurio等人，Science 278860-866，1997)。另外一種成分IKKAP-1或NEMO/IKKγ雖然沒有明顯的催化功能但卻能夠直接結(jié)合IKK-2并且是NF-κB完全活化所必需的(Mercurio等人，Mol Cell Biol 191526-1538，1999)。已證實(shí)，許多免疫和炎性介質(zhì)，包括TNFα、脂多醣(LPS)、IL-1β、CD3/CD28(抗原呈遞)、CD40L、FasL、病毒感染和氧化應(yīng)激都可引起NF-κB的活化。盡管傳導(dǎo)各種刺激的受體復(fù)合物在它們的蛋白組成上表現(xiàn)出很大的不同，但應(yīng)當(dāng)理解，這些刺激均引起了IKK和NF-κB的活化。
IKK復(fù)合物似乎是引發(fā)IκB磷酸化的各種發(fā)炎信號(hào)的集成中心。IKK在雙絲氨酸殘基位置上被上游的激酶，包括NF-κB誘發(fā)激酶、NIK(Malinin等人，Nature 385540-544，1997)和MEKK-1(Yujiri等人，Science 2821911-1914，1998)活化。NIK和MEKK-1的活性不同，具體原因還未查明，但早期的研究數(shù)據(jù)表明，這些激酶也許選擇性地分別活化IKK-1和IKK-2?；罨腎KK可磷酸化胞質(zhì)抑制型蛋白，即結(jié)合NF-κB的IκB，從而屏蔽Rel蛋白中的核定位信號(hào)(Cramer等人，Structure 7R1-R6，1999)。IKK在絲氨酸32和36位置上磷酸化IκB，形成一個(gè)可由E3連接酶βTRcP識(shí)別的結(jié)構(gòu)基元(Yaron等人，Nature 396590-594，1998)。與βTRcP的結(jié)合引起連接酶復(fù)合物的形成，該復(fù)合物多聚遍在蛋白化IκB，從而把其作為26S蛋白體的降解靶點(diǎn)。然后，游離的NF-κB經(jīng)核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白辨識(shí)而被轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)并與基因啟動(dòng)子上的序列特異性調(diào)控單元結(jié)合。
盡管兩種激酶都可以在體外磷酸化IκB，但是用基因突變體進(jìn)行的早期研究表明，促炎刺激(諸如IL-1β和TNFα)活化NF-κB的關(guān)鍵在于IKK-2而非IKK-1。另外，只有IKK-2的無催化活性的突變體才可阻斷由NF-κB調(diào)控的基因的表達(dá)，如單細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)和細(xì)胞間粘著分子(ICAM-1)(Mercurio等人，Science 278860-866，1997)?；蛱蕹齽?dòng)物的IKK-1和IKK-2研究對(duì)這些早期發(fā)現(xiàn)予以了肯定(Hu等人，Science 284316-320，1999；Li等人，Genes & Development 131322-1328，1999；Li等人，Science 284321-324，1999；Takeda等人，Science 84313-316，1999；Tanaka等人，Immunity 10421-429，1999)。IKK-1-/-動(dòng)物在出生后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)即死。幼犬因缺陷性增生和分化而出現(xiàn)皮膚異常，但在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的NF-κB的活化中并不顯示出大的缺陷。相反，IKK-2-/-胚胎于妊娠14-16日時(shí)因肝功喪失和細(xì)胞凋亡而死亡，該情況與Rel A剔除動(dòng)物的情況極為相似(Beg等人，Nature 376167-170，1995)。此外，IKK-2-/-動(dòng)物的胚胎纖維母細(xì)胞在受到細(xì)胞因子刺激后NF-κB的活化明顯降低，IKK-1-/-動(dòng)物則無此動(dòng)向。
因此，細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)表明，IKK-2是NF-κB促炎作用的中心調(diào)節(jié)物，其中IKK-2響應(yīng)于免疫和炎性刺激以及信號(hào)傳遞途徑而被活化。許多免疫和炎性介質(zhì)，包括IL-1β、LPS、TNFα、CD3/CD28(抗原呈遞)、CD40L、FasL、病毒感染以及氧化應(yīng)激，在呼吸道疾病中具有重要作用。另外，NF-κB的遍在表達(dá)以及響應(yīng)多種刺激的特點(diǎn)意味著肺部幾乎所有類型的細(xì)胞都可以作為抗NF-κB/IKK-2治療的潛在靶點(diǎn)。這些細(xì)胞包括肺泡上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及浸潤性白細(xì)胞(包括嗜中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)。通過抑制基因例如環(huán)加氧酶-2和12-脂肪氧化酶(炎性介質(zhì)的合成)、TAP-1肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(抗原加工)、MHC I H-2K類和II類穩(wěn)定鏈(抗原呈遞)、E-選則蛋白和血管細(xì)胞粘著分子(白細(xì)胞聚集)、白細(xì)胞介素-1、2、6、8(細(xì)胞因子)、PANTES、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、GM-CSF(趨化因子)以及超氧化物歧化酶和NADPH醌氧化還原酶(活性氧物質(zhì))的表達(dá)，相信IKK-2抑制劑可以顯示出廣泛的抗炎活性。
專利申請(qǐng)WO 94/12478(其內(nèi)容并入本文作為參考)描述了抑制血小板聚集的吲哚衍生物。專利申請(qǐng)WO 01/00610和WO 01/30774(其內(nèi)容并入本文作為參考)描述了能夠調(diào)節(jié)NF-κB的吲哚衍生物和苯并咪唑衍生物。如以上描述的，NF-κB是能夠活化大量編碼促炎細(xì)胞因子例如IL-1、IL-2、TNFα或IL-6的基因的雜二聚體轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB存在于細(xì)胞溶膠中，它在其中與其天然的抑制劑IκB形成復(fù)合物。對(duì)細(xì)胞的刺激，例如細(xì)胞因子的刺激引起IκB的磷酸化以及接下來的蛋白水解。該蛋白水解引起NF-κB的活化，然后NF-κB遷移至細(xì)胞核內(nèi)并在其中活化大量的促炎基因。
在疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、鼻炎、多發(fā)性硬化、心肌梗死、阿爾茨海默病、II型糖尿病、炎性腸病或動(dòng)脈硬化中，NF-κB的活化程度超常。據(jù)報(bào)導(dǎo)，抑制NF-κB可作為獨(dú)立的手段或與細(xì)胞抑制療法聯(lián)合使用來治療癌癥。事實(shí)證明，對(duì)NF-κB活化信號(hào)鏈上的不同環(huán)節(jié)予以抑制或通過糖皮質(zhì)激素、水楊酸鹽或金鹽來直接干擾基因轉(zhuǎn)錄都可以作為風(fēng)濕病的治療措施。
上述信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一步是IκB的分解。該磷酸化過程由特定的IκB激酶調(diào)控。迄今為止，已知IκB激酶抑制劑通常存在不能夠特異性地僅抑制一種類型的激酶的缺點(diǎn)。例如，大多數(shù)的IκB激酶抑制劑可同時(shí)抑制多種不同的激酶，因?yàn)檫@些激酶的催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)彼此相似。因此，這類抑制劑以不希望的方式作用于很多種酶，包括那些具有重要功能的酶。
慢性阻塞性肺病(COPD)是一種消耗性的肺部炎性疾病，它的特征表現(xiàn)為不完全可逆的氣流阻塞的進(jìn)行性發(fā)展(Pauwels等人，2001)。氣流阻塞與肺部對(duì)有毒粒子或氣體的異常炎性反應(yīng)有關(guān)，其主要由吸煙引起。盡管COPD影響肺，但它也產(chǎn)生顯著的全身后果。術(shù)語COPD包括伴有小氣道阻塞的慢性阻塞性支氣管炎，和伴有氣體空間增大和肺部軟組織破壞、肺部彈性喪失以及小氣道關(guān)閉的肺氣腫。而慢性支氣管炎被定義為存在咳痰(由于粘液分泌過度)連續(xù)三個(gè)月以上，同時(shí)連續(xù)兩年均有發(fā)作的疾病。一些流行病學(xué)證據(jù)表明，粘液過度分泌往往伴隨氣流阻塞，原因可能在于外圍氣道受阻。大多數(shù)的慢性阻塞性肺病患者都具有三種病癥慢性阻塞性支氣管炎、肺氣腫和粘液阻塞，但是肺氣腫和阻塞性支氣管炎的嚴(yán)重程度因人而異，Vestbo等人，1996；Barnes，2004a，Barnes，2004b；Hogg，2004。
在工業(yè)化國家中，慢性阻塞性肺病的大多數(shù)病例源于吸煙；但在發(fā)展中國家，其它環(huán)境污染物(尤其是二氧化硫和顆粒物)以及某些職業(yè)性化學(xué)物質(zhì)(諸如鎘)是慢性阻塞性肺病的重要成因。被動(dòng)吸煙也是一個(gè)致病因素。
慢性阻塞性肺病患者易于惡化，即呼吸道癥狀急劇加重。惡化是慢性阻塞性肺病的自然發(fā)展過程，其特征為患者的基線呼吸困難程度、咳嗽和/或痰量的變化已超出日常變化的范圍而足以達(dá)到需要改變治療方案的程度(Rodriguez-Roisin，2000；Burge and Wedzicha，2003)。
支氣管感染被認(rèn)為是慢性阻塞性肺病惡化的通常原因，但是人們對(duì)感染源的性質(zhì)及其實(shí)際作用仍有爭議(Wedzicha，2002；White等人，2003)。另外，慢性阻塞性肺病的惡化與可吸入顆粒物和環(huán)境空氣污染物的水平密切相關(guān)，而可吸入顆粒物和環(huán)境空氣污染物的水平又與入院率有關(guān)(Rennard and Farmer，2004)。
惡化的發(fā)病率與慢性阻塞性肺病的嚴(yán)重程度有關(guān)。惡化可不利地影響這些疾病的自然進(jìn)程，也許由于它會(huì)加速肺功能退化，使病變波及全身并使患者早亡。不幸的是，人們至今還未對(duì)慢性阻塞性肺病惡化的表征做出普遍接受的定義(Rodriguez-Roisin，2000)。病情加重的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間應(yīng)為多少才可以構(gòu)成惡化很難被定義。事實(shí)上，有幾種定義同時(shí)并存，并且許多臨床試驗(yàn)采用迥然不同的標(biāo)準(zhǔn)或?qū)τ脕碓\斷惡化的定義描述的很含糊。用來表征慢性阻塞性肺病急劇惡化的最常用的臨床標(biāo)準(zhǔn)是Anthonisen等人描述的標(biāo)準(zhǔn)。在該研究中，惡化被分為三類1類惡化以呼吸困難加劇、痰液量增加以及痰液化膿和化膿加劇為特征；2類惡化包括上述癥狀的任何兩種；3類惡化包括上述癥狀的任何一種并伴隨至少一種額外癥狀，包括在前5日內(nèi)喉嚨疼痛或流鼻涕、不明原因的發(fā)燒、喘息加劇、咳嗽加劇、或呼吸速度或心率比基線水平增加20％。這些標(biāo)準(zhǔn)自建立以來就一直被用作基準(zhǔn)，并且惡化病因論的所有提案都需要與這些關(guān)鍵性特征建立聯(lián)系。
還有人提出，抑制NF-κB可作為獨(dú)立手段，或與細(xì)胞抑制療法聯(lián)用來治療增殖性疾病，諸如腫瘤和白血病。事實(shí)證明，對(duì)NF-κB活化信號(hào)鏈上的不同環(huán)節(jié)予以抑制或通過糖皮質(zhì)激素、水楊酸鹽或金鹽來直接干擾基因轉(zhuǎn)錄可用于治療風(fēng)濕病。
專利申請(qǐng)WO 01/30774公開了吲哚衍生物，美國申請(qǐng)序列號(hào)10/642,970公開了吲哚衍生物和苯并咪唑衍生物，這些衍生物可調(diào)控NF-κB并對(duì)IκB激酶顯示很強(qiáng)的抑制作用。美國申請(qǐng)序列號(hào)10/642,970特別公開了式(I)的吲哚衍生物和苯并咪唑衍生物、其制備方法、含有這些化合物的藥物組合物以及預(yù)防和治療與IκB激酶活性增加有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括施用這些化合物。

另外，美國申請(qǐng)序列號(hào)10/642,970還公開了下式(B)、(C)和(D)所示的化合物 (B)(化合物43)， (C)(化合物32)；以及 (D)(化合物48)。
然而，美國申請(qǐng)序列號(hào)10/642,970沒有具體公開M為N，R1為氫，R2為羧基(-COOH)，R3為甲基，R4為吡啶-2-基，R11為氫以及X為CH的式(I)化合物。
如上所述，需要一種通過選擇性抑制IKK而起作用的IκB激酶抑制劑，尤其是IKK-2抑制劑。該抑制劑還應(yīng)具有局部性而非全身性作用。所述抑制劑應(yīng)可用于治療IKK-2介導(dǎo)的病理學(xué)疾病或病癥，諸如哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)，使這些病癥通過抑制劑的靶向給藥而得到緩解。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種具有IκB激酶(IKK)、尤其是IKK-2抑制劑活性、優(yōu)選選擇性抑制劑活性的化合物，以及含有該化合物的藥物組合物和使用方法。
具體地講，本發(fā)明涉及基本純凈的式(A)化合物 或所述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。
此外，本發(fā)明還涉及含有藥物有效量的式(A)化合物以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
此外，本發(fā)明還涉及式(A)化合物作為IκB激酶抑制劑的用途。


圖1NF-κB-熒光素酶報(bào)道基因小鼠模型中的小鼠影像學(xué)研究的照片，其中的動(dòng)物接受如下處理載體/PBS溶液(陰性對(duì)照動(dòng)物)、用IL-1β誘導(dǎo)NF-κB活化但不施用任何化合物[載體/IL-1β]或施用劑量增加的(0.3mpk、1mpk、3mpk和10mpk)化合物(A)或化合物(B)。
圖2NF-κB-熒光素酶報(bào)道基因小鼠模型中的小鼠影像學(xué)研究的結(jié)果圖，其顯示了動(dòng)物的生物發(fā)光水平，所述動(dòng)物接受如下處理載體/PBS溶液(陰性對(duì)照動(dòng)物)、用IL-1β誘導(dǎo)NF-κB活化但不施用任何化合物[載體/IL-1β]或施用劑量增加的(0.3mpk、1mpk、3mpk和10mpk)化合物(A)或化合物(B)。
圖3左圖將劑量為0.3mg/kg的化合物(A)注入氣管后，肺和血漿組織內(nèi)化合物(A)的含量；右圖將劑量為0.3mg/kg的化合物(B)注入氣管后，肺和血漿組織內(nèi)化合物(A)和化合物(B)的含量。
圖4左圖為施用增加劑量的(0.01mpk、0.03mpk、0.10mpk和0.30mpk)化合物(A)后，肺內(nèi)化合物(A)的濃度；右圖為施用增加劑量的(0.01mpk、0.03mpk、0.10mpk和0.30mpk)化合物(A)后，血漿內(nèi)化合物(A)的濃度。
圖5左圖為施用增加劑量的(0.01mpk、0.03mpk、0.10mpk和0.30mpk)化合物(B)后，肺內(nèi)化合物(A)和(B)的濃度；右圖為施用增加劑量的(0.01mpk、0.03mpk、0.10mpk和0.30mpk)化合物(B)后，血漿內(nèi)化合物(A)和(B)的濃度。
發(fā)明詳述縮寫如不另外說明，上文提及和貫穿本說明書全文的以下縮寫應(yīng)被理解為具有如下含義Boc2O二碳酸二叔丁酯DIEA N，N-二異丙基乙胺DMAP 4-二甲基氨基吡啶DMF 二甲基甲酰胺DMSO 二甲亞砜ESI-MS電噴霧電離質(zhì)譜術(shù)FAB-MS快原子轟擊質(zhì)譜術(shù)HATU O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽HPLC 高效液相色譜PBS 磷酸鹽緩沖溶液i.n. 鼻腔內(nèi)PO口服
i.p. 腹膜內(nèi)i.t. 氣管內(nèi)Microcystin-LR由某些魚腥藻屬和顫藻屬的藍(lán)藻菌產(chǎn)生的肝臟毒素mbr 毫巴mpk mg/kgHEPES 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸DTT 二硫蘇糖醇ATP 三磷酸腺苷streptavidin-HRP 鏈霉親和素蛋白-辣根過氧化物酶結(jié)合物TMB 四甲基聯(lián)苯胺pfu 斑形成單位MDI 定劑量吸入器DPI 干粉吸入器定義如不另外說明，上文提及和貫穿本說明書全文的以下術(shù)語應(yīng)被理解為具有如下含義。
“本發(fā)明的化合物”以及類似表述是指上述式(A)的化合物，包括該化合物藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑化物，諸如水合物。依次類推，文中所提及的中間產(chǎn)物，無論是否就其本身提出權(quán)利要求，只要符合文意，也包括這些中間產(chǎn)物的鹽和溶劑化物。為了清楚起見，本文在文意許可的情況下列舉了一些具體實(shí)例，但這些實(shí)例純粹是為了引證說明而不是排除其它實(shí)例。
“治療”是指預(yù)防、部分緩解或治愈疾病。本發(fā)明的化合物和藥物組合物可用于治療以NF-κB活化和/或由NF-κB調(diào)控的細(xì)胞因子和介質(zhì)(包括但不限于TNFα和IL-1β)水平增加為特征的疾病。抑制或壓抑NF-κB和/或由NF-κB調(diào)控的基因如TNFα可在局部進(jìn)行，例如在患者的某種組織內(nèi)，或更廣泛地在疾病患者的通體內(nèi)進(jìn)行。抑制或壓抑NF-κB和/或由NF-κB調(diào)控的基因如TNFα可通過一種或多種機(jī)制發(fā)生，例如可對(duì)信號(hào)通道的任何步驟予以抑制或壓抑，諸如抑制IKK。術(shù)語“與NF-κB相關(guān)的病癥”是指以細(xì)胞質(zhì)中NF-κB的活化(例如IκB的磷酸化)為特征的疾病。術(shù)語“與TNFα相關(guān)的病癥”是指以TNFα水平上升為特征的疾病。在本說明書中，與NF-κB相關(guān)的病癥包括與TNFα相關(guān)的病癥但不限于此，因?yàn)镹F-κB還與其它促炎蛋白和基因的活性和活性上調(diào)有關(guān)。文中所用的術(shù)語“炎性或免疫疾病”包括與NF-κB相關(guān)的病癥以及與TNFα相關(guān)的病癥，例如與釋放NF-κB和/或TNFα水平上升有關(guān)的任何病癥或疾病，包括本文所述的病癥。
“患者”包括人類和其它哺乳動(dòng)物。
“藥物有效量”是指可以有效產(chǎn)生所需療效的化合物、組合物、藥物或其它活性成分的量。
“基本純凈的”是指化合物基本不含其它生物或化學(xué)成分，例如與其一起從生物或化學(xué)組合物中分離出來的生物或化學(xué)成分，該化合物的分析純度優(yōu)選至少為70％。更優(yōu)選其分析純度至少為90％，仍更優(yōu)選其分析純度至少為95％；另外，“基本純凈的”還指化合物基本不含其前體藥物，諸如化合物(B)。
本發(fā)明還涉及制備式(A)化合物的方法，如下圖所示。
該化學(xué)反應(yīng)的原料化合物是已知的或者可以用文獻(xiàn)中已知的方法方便地制得。美國申請(qǐng)序列號(hào)10/642,970描述了以上偶聯(lián)步驟(vi)中所用的吲哚羧酸中間體(化合物8)的制備。式(B)、(C)和(D)的化合物按照美國申請(qǐng)序列號(hào)10/642,970(引入本文作為參考)所公開的方法制備。
可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的肽化學(xué)中的偶聯(lián)方法(見Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie[有機(jī)化學(xué)方法]，第15/1和15/2卷，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974，其內(nèi)容引入本文作為參考)來進(jìn)行化合物的縮合反應(yīng)。適用的縮合劑或偶聯(lián)劑有羰基二咪唑、碳二亞胺(諸如二環(huán)己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺(DIC))、O-((氰基(乙氧基羰基)亞甲基)-氨基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸鹽(TOTU)或聚磷酸(PPA)。
縮合反應(yīng)可在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行。進(jìn)行縮合時(shí)，有必要使用可逆性保護(hù)基團(tuán)來保護(hù)不參與反應(yīng)的氨基基團(tuán)。對(duì)不參與反應(yīng)的羧基也應(yīng)如此，這些基團(tuán)在縮合反應(yīng)中優(yōu)選以(C1-C6)烷基酯、芐基酯或叔丁基酯的形式存在。若氨基基團(tuán)仍以前體的形式(諸如硝基或氰基)存在且在縮合反應(yīng)后才被氫化成氨基，則沒有必要對(duì)氨基進(jìn)行保護(hù)?？s合反應(yīng)后，可采用適當(dāng)?shù)姆绞綄⒈Ｗo(hù)基團(tuán)除去。例如可通過氫化方法除去NO2基(氨基酸的胍基保護(hù))、芐基酯中的芐氧基羰基和芐基。可在酸性條件下除去叔丁基類的保護(hù)基團(tuán)，用仲胺除去9-芴基甲氧基-羰基。
本發(fā)明還涉及含有藥物有效量的式(A)化合物以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
實(shí)施方式由于本發(fā)明化合物的藥理性質(zhì)，它適合于治療可以通過IκB激酶抑制劑的靶向給藥而緩解的疾病，以此給藥方式將藥物注入病發(fā)患者或可能病發(fā)患者的身體局部，因?yàn)閷?duì)于這些疾病(諸如哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD))而言，這些藥物的局部作用效果要高于全身作用效果。
在臨床實(shí)踐中，可采用局部或全身給藥的方式，包括口服、吸入、直腸給藥、鼻腔給藥、口腔含化給藥、舌下給藥、陰道給藥、結(jié)腸給藥、胃腸外給藥(包括皮下注射、肌肉內(nèi)注射、靜脈注射、皮內(nèi)注射、椎管內(nèi)注射和硬膜外注射)、腦池內(nèi)給藥以及腹膜內(nèi)給藥，將本發(fā)明化合物以藥學(xué)上可接受的劑量形式施用給人和其它動(dòng)物。應(yīng)該理解，最佳給藥途徑將根據(jù)例如患者的情況而定。
鼻腔、氣管內(nèi)或吸入給藥以及噴霧給藥是施用本發(fā)明化合物的特定方法。
藥物聯(lián)合治療與加大單一藥物劑量相比更有療效而且還可減小副作用。IKK抑制劑可與支氣管擴(kuò)張劑聯(lián)用，所述支氣管擴(kuò)張劑包括但不限于短效β2激動(dòng)劑；長效β2激動(dòng)劑，諸如沙美特羅和福莫特羅；抗膽堿能藥劑，諸如溴丙阿托品和噻托溴銨。IKK抑制劑還可以與甲基黃嘌呤諸如茶堿聯(lián)用。
IKK2抑制劑可與幾種抗炎療法(包括但不限于針對(duì)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的各個(gè)階段的免疫調(diào)節(jié)劑以及用于緩解炎癥病程的免疫調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合。這些療法包括但不限于(A)細(xì)胞聚集和毒性炎性介質(zhì)的抑制劑，包括但不限于磷酸二酯酶-4抑制劑；由p38促分裂原活化的蛋白激酶的抑制劑；生物藥劑，諸如抗腫瘤壞死因子α、抗白細(xì)胞介素-8以及抗單核細(xì)胞趨化蛋白-1；粘著分子和趨化因子抑制劑；以及干擾細(xì)胞生存、清除/細(xì)胞凋亡的分子；(B)蛋白水解酶抑制劑，包括但不限于嗜中性白細(xì)胞衍生的絲氨酸蛋白酶(諸如嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶)的抑制劑；以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP，諸如MMP-2、MMP-9和MMP-12)的抑制劑；(C)抗氧劑，包括但不限于N-乙酰半胱氨酸以及活性氧物質(zhì)的抑制劑或清除劑；以及毒性肽諸如可直接損傷細(xì)胞的防衛(wèi)素；(D)粘液分泌抑制劑，包括但不限于粘膜基因抑制劑；以及粘液清除劑諸如祛痰劑、痰液溶解劑和痰液動(dòng)化劑；以及(E)抗生素治療，諸如使用酮內(nèi)酯，例如Ketek。
可將本發(fā)明的藥物組合施用給細(xì)胞或細(xì)胞群或人類患者，可采用藥學(xué)上可接受的單成分配方形式同時(shí)或依次施用各化合物，或采用多成分配方形式或單成分配方和多種藥劑配方的組合形式予以施用。無論給藥方式如何，藥物組合后應(yīng)具有藥物有效量。
在治療過程中，可以合理地改變治療方案/劑量安排，使得在聯(lián)合使用時(shí)可顯示令人滿意藥效的每種藥物有效量的化合物的用量為最低，并使得這類聯(lián)合使用的藥物有效量的化合物的持續(xù)使用時(shí)間盡量縮短為成功地治愈該患者所必需的時(shí)間。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選以劑量單位的形式制備和施用，每個(gè)劑量單位包含特定劑量的化合物(有效成分)。式(A)化合物的藥學(xué)上可接受的鹽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。術(shù)語“鹽”是指與酸或堿形成的酸或堿加成鹽。另外，“鹽”還包括兩性離子鹽(內(nèi)鹽)，即式(A)化合物同時(shí)含有一個(gè)堿性基團(tuán)，諸如胺、吡啶或咪唑環(huán)，以及一個(gè)酸性基團(tuán)，諸如羧酸。優(yōu)選藥學(xué)上可接受的鹽(即無毒、生理上可接受的鹽)，例如其陽離子不會(huì)顯著影響該鹽的毒性和生物活性的金屬鹽和胺鹽。然而，其它鹽可用于例如制備過程的分離和提純步驟，這些鹽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。式(A)化合物的鹽可通過例如將式(A)化合物和一定量(例如等當(dāng)量的)的酸或堿在可使鹽形成沉淀的介質(zhì)中反應(yīng)或在水介質(zhì)中反應(yīng)然后冷凍干燥而形成。
酸加成鹽由帶有堿性基團(tuán)(諸如亞胺基氮、氨基或單或二取代的基團(tuán))的本發(fā)明化合物生成。具體的酸加成鹽應(yīng)是藥學(xué)上可接受的酸加成鹽，即，在該鹽的藥物劑量下其陰離子對(duì)患者無毒的鹽，從而游離形式的化合物所固有的有益作用不會(huì)由于陰離子的副作用而受到改變。所選擇的鹽應(yīng)該與常規(guī)的藥用載體兼容并適合于相應(yīng)的給藥方式。本發(fā)明化合物的酸加成鹽可由帶堿性基團(tuán)的游離分子與適當(dāng)?shù)乃嵬ㄟ^已知的適當(dāng)方式反應(yīng)而生成。例如，本發(fā)明化合物的酸加成鹽可按如下方式生成將帶堿性基團(tuán)的游離分子溶解于含有適當(dāng)酸的水或含水醇溶液或其它適當(dāng)?shù)娜軇?，然后蒸發(fā)溶液將鹽分離出來；或?qū)A性基團(tuán)的游離分子和酸在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，在這種情況下，鹽可直接分離出來或經(jīng)濃縮溶液而得到。適于制備本發(fā)明酸加成鹽的酸有鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、各種有機(jī)羧酸和磺酸(諸如乙酸、檸檬酸、丙酸、琥珀酸、苯甲酸、酒石酸、富馬酸、扁桃酸、抗壞血酸、蘋果酸、甲磺酸、甲苯磺酸、脂肪酸、己二酸、海藻酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、環(huán)戊烷丙酸、二葡萄糖酸、十二烷基硫酸、硫酸氫鹽、丁酸、乳酸、月桂酸、月桂基硫酸、馬來酸、氫碘酸、2-羥基-乙磺酸、甘油磷酸、苦味酸、三甲基乙酸、棕櫚酸、果膠酸、過硫酸、3-苯基丙酸、硫氰酸、2-萘磺酸、十一酸、煙酸、半硫酸、庚酸、己酸、樟腦酸、樟腦磺酸)等等。
可采用已知方法或經(jīng)修改的方法將本發(fā)明化合物的酸加成鹽還原成本發(fā)明的母體化合物。例如，可用堿(例如碳酸氫鈉水溶液或氨水)處理酸加成鹽而生成本發(fā)明的母體化合物。
堿加成鹽由帶有羧基的本發(fā)明化合物生成。具體的堿加成鹽是藥學(xué)上可接受的堿加成鹽，即，在該鹽的藥物劑量下其陽離子對(duì)患者無毒的鹽，從而游離形式的化合物所固有的有益作用不會(huì)由于陽離子的副作用而受到改變。所選擇的鹽應(yīng)該與常規(guī)的藥用載體兼容并適合于相應(yīng)的給藥方式。本發(fā)明化合物的堿加成鹽可由帶酸性基團(tuán)的游離分子與適當(dāng)?shù)膲A通過已知的適當(dāng)方式反應(yīng)而生成。例如，本發(fā)明化合物的堿加成鹽可按如下方式生成將帶酸性基團(tuán)的游離分子溶解于含有適當(dāng)堿的水或含水醇溶液或其它適當(dāng)?shù)娜軇?，然后蒸發(fā)溶液將鹽分離出來；或?qū)嵝曰鶊F(tuán)的游離分子和酸在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，在這種情況下，鹽可直接分離出來或經(jīng)濃縮溶液而得到。適于制備堿加成鹽的堿有源自堿金屬和堿土金屬的堿或胺，諸如氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鋅、氨、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、膽堿、N，N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-芐基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羥基甲基)-氨基甲烷、氫氧化四甲銨等等。
可采用已知方法或經(jīng)修改的方法將本發(fā)明的堿加成鹽還原成本發(fā)明的母體化合物。例如，可用酸(例如鹽酸)處理堿加成鹽而生成本發(fā)明的母體化合物。
在實(shí)踐中，將本發(fā)明化合物以適當(dāng)?shù)闹苿┦┯媒o患者以使其作用局部化。應(yīng)該理解，優(yōu)選的給藥方式應(yīng)根據(jù)給藥所針對(duì)的病癥的部位而定。
藥學(xué)上可接受的劑型是指本發(fā)明化合物的劑型，包括，例如粉劑、混懸劑、噴劑、吸入劑、片劑、乳劑或溶液劑，尤其是適于吸入的劑型。制藥工藝和配方可參考最新版本的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA。
若需要更加有效地輸送藥劑，還可以將本發(fā)明的化合物微囊化于或附著在緩慢釋放或靶向給藥系統(tǒng)中，諸如生物兼容的、生物可降解的聚合物基質(zhì)(例如聚(d，l-丙交酯/乙交酯共聚物)、脂質(zhì)體和微球，以所謂的皮下或肌肉內(nèi)存積法注入皮下或肌肉內(nèi)，使化合物在兩周或更長的一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)緩慢地釋放出來。
還可以對(duì)本發(fā)明的化合物進(jìn)行滅菌處理，例如，用除菌過濾器來過濾這些化合物，或在無菌固體組合物中摻入滅菌劑，所述固體組合物可以在臨用前溶于無菌水或其它無菌介質(zhì)中。
適于鼻腔或氣管給藥的制劑是指適于以鼻腔或吸入方式向患者給藥的制劑。該制劑可含有粉狀載體，其粒徑在例如1至500微米之間(包括在20至500微米之間以5微米遞增的粒徑，例如30微米、35微米等)。用于以鼻腔噴劑或鼻藥水的形式給藥的載體為液體的適當(dāng)制劑包括活性成分的水或油溶液。適于噴霧給藥的制劑可按照常規(guī)方法制備，并可與其它治療劑一起給藥。MDI和DPI是通過吸入將一定劑量的本發(fā)明化合物施予患者的可行方法。
可改變本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際含量，以獲得對(duì)于特定的組合物和給藥方法而言可以獲得所需治療響應(yīng)的該活性成分的藥物有效量。因此，對(duì)于任何具體患者，所選擇的劑量大小取決于各種因素，包括期望的療效、給藥途徑、療程、疾病的病因和嚴(yán)重程度、患者的身體狀況、體重、性別、飲食和年齡、各活性成分的類型和效用、吸收、代謝和/或排泄率以及其它因素。
本發(fā)明化合物的每日總劑量(一次或分幾次服用)為約1000mg左右，在特定的情況下為50mg至300mg，在更特定的情況下為10mg至100mg。然而，高于或低于該日劑量的劑量也可適用。日劑量可以一個(gè)劑量單位或幾個(gè)較小劑量單位的形式一次服用，或被分成幾份按照預(yù)定的時(shí)間間隔服用。藥物組合物中活性成分的百分比可以改變，只要能夠提供適當(dāng)?shù)膭┝考纯?。顯而易見，可在幾乎同一時(shí)間施用多個(gè)單位劑量形式。用藥頻率根據(jù)需要而定，以達(dá)到希望的療效。某些患者也許會(huì)對(duì)較高或較低的劑量迅速地產(chǎn)生反應(yīng)，而且所需要的維持劑量也較低。對(duì)另外一些患者，根據(jù)其生理需要，也許有必要進(jìn)行長期治療，給藥頻率為每日1至4劑。當(dāng)然，對(duì)于有些患者，每日用藥不應(yīng)超過1或2劑。
可采用藥學(xué)領(lǐng)域的任何已知方法將藥物配方制成單位劑量形式。這些方法包括將活性成分和構(gòu)成一種或多種附加成分的載體結(jié)合在一起的步驟。一般而言，制劑通過如下方式制備使活性成分與液體載體和/或研得很細(xì)的固態(tài)載體均勻并緊密地結(jié)合在一起，然后，如有必要，使該產(chǎn)品成形。
實(shí)驗(yàn)分析采用質(zhì)譜分析法(FAB-MS，ESI-MS)。溫度單位為攝氏度；RT是指室溫(從22℃至26℃)。文中所用的縮寫已得到說明，或者是依照本技術(shù)領(lǐng)域的慣例。
通過以下實(shí)施例舉例說明本發(fā)明。
實(shí)施例制備例1(3-(N-苯基-N-2-吡啶基)氨基)-2-(二叔丁氧基羰基氨基)丙酸甲酯的合成(圖解1，化合物3)圖解1 2-(二叔丁氧基羰基氨基)丙烯酸甲酯(圖解1，化合物2)將50g(0.228mol)的(叔丁氧基羰基)絲氨酸(1)溶解在300mL的乙腈中。加入107g(0.493mol)的二碳酸二叔丁酯和2.64g(22mmol)的4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)。在室溫下將該混合物攪拌過夜，減壓除去溶劑，然后用500mL的乙酸乙酯提取殘余物。有機(jī)相經(jīng)500mL 1N的HCl洗滌后，用硫酸鎂干燥，然后減壓除去有機(jī)溶劑。將殘余物溶于200mL的庚烷中，于-30℃下結(jié)晶并抽濾，得到23g的丙烯酸酯2。濃縮母液并將殘余物溶于140mL的乙腈中。加入31g(0.142mol)的二碳酸二叔丁酯和1.26g(10mmol)的DMAP。將該混合物于50℃下加熱8小時(shí)，真空除去溶劑，殘余物用500mL的乙酸乙酯提取。有機(jī)相經(jīng)400mL 1N HCl洗滌后用硫酸鎂干燥。真空除去溶劑后，用庚烷結(jié)晶，另外得到31.5g的丙烯酸酯2。得到產(chǎn)物54.5g(0.181mol)，產(chǎn)率79％。實(shí)驗(yàn)式為C14H23NO6；M.W.＝301.34；MS((2M*)+Na+)625.7。1H NMR(DMSO-d6)1.40(s，18H)，3.74(s，3H)，5.85(s，1H)，6.28(s，1H)。
(3-(N-苯基-N-2-吡啶基)氨基)-2-(二叔丁氧基羰基氨基)丙酸甲酯(圖解1，化合物3)將4.96g(16.5mmol)的丙烯酸酯2與5.6g(33mmol)的2-苯胺基吡啶和32.16g(98.7mmol)的碳酸銫混合。加入50mL的乙腈并于45℃下將該混合物攪拌2天。將該混合液抽濾通過硅藻土以濾出固體物質(zhì)，然后用乙腈洗滌3次，每次100mL。合并有機(jī)相并蒸發(fā)溶劑，殘余物用1∶1的庚烷/二乙醚進(jìn)行硅膠色譜，得到5.66g(73％)的酯3。實(shí)驗(yàn)式為C25H33N33O6；分子量＝471.56；MS(M+H)472.2。
分離對(duì)映異構(gòu)體(圖解1，化合物3(S)和化合物3(R))外消旋氨基酯3由相應(yīng)的丙烯酸酯2制備，然后采用手性固定相的制備型HPLC(例如Chiralpak AD(Daicel)100×380、室溫、流速300mL/min)拆分成對(duì)映異構(gòu)體3(S)和3(R)。對(duì)映異構(gòu)體的純度由分析級(jí)HPLC(例如Chiralpak-AD-H(Daicel)4.6×250、30℃、流速1mL/min、室溫)確定。
制備例22-(2-甲基氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酸(8)的合成(圖解2，化合物8)
圖解2 1-二甲基氨基-4，4-二甲氧基戊-1-烯-3-酮(圖解2，化合物6)將100g(0.76mol)的3，3-二甲氧基-2-丁酮(4)與90.2g(0.76mol)的N，N-二甲基甲酰胺二甲縮醛(5)混合并在120℃下攪拌48小時(shí)。以蒸餾的方式不斷地從反應(yīng)溶液中除去反應(yīng)所生成的甲醇。在溶液冷卻時(shí)自發(fā)地形成結(jié)晶，加入少量的庚烷以使結(jié)晶完全。得到128.24g的粗品6(產(chǎn)率為90％)，該產(chǎn)物在未經(jīng)提純的情況下用于下一步反應(yīng)。產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)式為C9H17NO3；分子量＝187.24；MS(M+H)188.2。1H NMR(DMSO-d6)1.22(s，3H)，2.80(s，3H)，3.10(s，9H)，5.39(d，J＝15Hz，1H)，7.59(d，J＝15Hz，1H)。
甲基胺(圖解2，化合物7)將1.22g(53mmol)的鈉溶于100mL的無水乙醇中。向該溶液中加入5.8g(53mmol)的甲基胍鹽酸鹽和10g(53mmol)的1-二甲基氨基-4，4-二甲氧基戊-1-烯-3-酮(6)，將該混合液在攪拌的同時(shí)加熱回流4小時(shí)。蒸發(fā)除去乙醇以終止反應(yīng)。得到產(chǎn)物7，該產(chǎn)物在未經(jīng)提純的情況下用于下一步反應(yīng)。產(chǎn)率11.5g(58mmol，定量)；實(shí)驗(yàn)式為C9H15N3O2；分子量＝197.24；MS(M+H)198.2。1H NMR(DMSO-d6)1.45(s，3H)，2.78(s，3H)，3.10(s，6H)，6.75(d，J＝3Hz，1H)，7.0-7.1(s(b)，1H)，8.30(d，J＝3Hz，1H)。
2-(2-甲基氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酸(圖2，化合物8)
邊攪拌邊將5g(25mmol)的[4-(1，1-二甲氧基乙基)嘧啶-2-基]甲基胺(7)和3.85g的4-肼基苯甲酸加入到150mL的50％硫酸中，將該混合物在130℃下加熱4小時(shí)。以蒸餾的方式不斷地從反應(yīng)溶液中除去反應(yīng)所生成的甲醇。待混合物冷卻至10℃，將其倒入200mL冰中，然后用氫氧化鈉濃溶液將pH調(diào)至5.5左右。濾出硫酸鈉和產(chǎn)物的沉淀混合物，然后用甲醇萃取殘余物幾次。將合并的甲醇萃取液濃縮得到產(chǎn)物8，將其通過快速色譜法(二氯甲烷/甲醇9∶1)純化。得產(chǎn)物0.76g(11％)；實(shí)驗(yàn)式為C14H12N4O2；分子量＝268.28；MS(M+H)269.1。1H NMR(DMSO-d6)2.95(s，3H)，6.90-7.10(s(b)，1H)，7.18(d，J＝3Hz，1H)，7.4(s，1H)，7.58(d，J＝4.5Hz，1H)，7.80(d，J＝4.5Hz，1H)，8.30(s，1H)，8.38(d，J＝3Hz，1H)，11.85(s，1H)，12.40-12.60(s(b)，1H)。
實(shí)施例12-{[2-(2-甲基氨基-嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-氨基}-3-(苯基-吡啶-2-基-氨基)-丙酸(A)的合成圖解3 2-{[2-(2-甲基氨基-嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-氨基}-3-(苯基-吡啶-2-基-氨基)-丙酸甲酯(圖解3，化合物10)將2.9g的3的S對(duì)映異構(gòu)體(3(S))溶于30mL的二烷中，將該溶液冷卻至0℃。加入30mL 4N HCl的二烷溶液，將該混合物升溫至室溫，然后攪拌12小時(shí)。真空除去溶劑。用30mL的DMF萃取殘余物(溶液A)。將2.47g(9.2mmol)的酸8溶于50mL的DMF，然后將該混合液冷卻至0℃。加入4.21g的HATU和6.4mL的DIEA。在0℃下將該混合物攪拌45分鐘，使其升溫至室溫，然后加入溶液A。將該混合物在室溫下攪拌12小時(shí)。真空除去溶劑，殘余物在300mL飽和NaHCO3溶液和300mL乙酸乙酯之間進(jìn)行分配。水相用乙酸乙酯萃取3次，每次100mL，有機(jī)相經(jīng)合并后用400mL飽和NaCl溶液洗滌。有機(jī)相經(jīng)硫酸鎂干燥，然后減壓除去溶劑，所得殘余物經(jīng)硅膠色譜法(1∶3庚烷/乙酸乙酯)純化。得到1.78g(55％)的酯10。實(shí)驗(yàn)式為C29H27N7O3；；分子量＝521.58；MS(M+H)522.2。
2-{[2-(2-甲基氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-氨基}-3-(苯基吡啶-2-基-氨基)-丙酸(圖解3，化合物A)將2.0g(3.8mmol)的甲酯10溶于200mL的甲醇中。加入1mL 2N的NaOH水溶液，將該混合物于室溫下攪拌12小時(shí)。蒸除溶劑后，將殘余物溶于水中并用飽和NaH2PO4溶液將pH調(diào)至5左右。濾出所生成的沉淀物并用水洗滌。于40℃下減壓(約1mbar)干燥，得到1.95g(定量收率)的酸A。實(shí)驗(yàn)式為C28H25N7O3；分子量＝507.56；MS(M+H)508.3。1H NMR(DMSO-d6)2.95(s，3H)，4.22-4.50(m，2H)，4.65-4.72(m，1H)，6.29-6.36(d，1H)，6.70-6.79(m，1H)，6.90-7.10(sb，1H)，7.13-7.19(m，1H)，7.22-7.38(m，5H)，7.40-7.48(m，3H)，7.50-7.55(m，1H)，7.57-7.60(m，1H)，7.96(bs，1H)，8.34-8.40(m，2H)，8.80-8.90(d，1H)，11.80(s，1H)。
體外測(cè)試方法IKK酶ELISA試驗(yàn)緩沖液的組成如下50mM的HEPES、10mM的MgCl2、10mM的β-甘油磷酸酯、2μM的Microcystin-LR、0.01％NP-40以及5mM的DTT。
將IKK酶制品稀釋50倍(自備品)，將待試化合物溶于DMSO(孔中的最終濃度為2％)。
試驗(yàn)程序如下培育酶和化合物30分鐘；加入1mM的ATP或50μM的ATP；pSer36-IkB肽(底物)40μM；培育45分鐘，然后加入抗pSer32-pSer36-IkB肽抗體；培育45分鐘后，轉(zhuǎn)入覆有G蛋白涂層的板中；培育90分鐘后清洗3次；加入streptavidin-HRP，培育45分鐘后清洗6次；加入TMB并培育15分鐘；然后終止反應(yīng)并讀取光度計(jì)的讀數(shù)。
體外測(cè)試結(jié)果如表1所示。
表I

在上述的IKK酶ELISA中，當(dāng)ATP為1mM時(shí)，式(A)化合物的IκB激酶IC50分別是式(B)、(C)和(D)化合物的705、4725和47.5倍。該數(shù)據(jù)表明，式(A)化合物的活性出乎意料地遠(yuǎn)高于化合物(B)、(C)和(D)。
化合物A和化合物B的體內(nèi)測(cè)試對(duì)比由NF-κB誘發(fā)的基因表達(dá)與炎癥疾病諸如哮喘和關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)。IκB激酶(IKK)是各種炎性激動(dòng)劑活化NF-κB的中樞。
IKK是一種含有許多子單元的復(fù)合物，其中包括兩個(gè)催化子單元IKK-1(也稱作IKK-α)和IKK-2(也稱作IKK-β)以及調(diào)控子單元IKK-γ。基因剔除研究已清楚地表明IKK復(fù)合物的IKK-2或IKK-β子單元是所有已知促炎刺激(包括脂多糖(LPS)和IL-1β)活化NF-κB所必需的。因此，IKK-β缺陷型細(xì)胞不能響應(yīng)腫瘤壞死因子α(TNFα)或白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)而活化IKK和NF-κB。
據(jù)內(nèi)部的生物造影數(shù)據(jù)表明，施用顯性失活的IKKβ(Adv-IKK-2DN)可抑制肺內(nèi)IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB活性。因此選擇性IKK-β抑制劑不僅可作為一種潛在的抗炎藥物，而且還可幫助我們理解這些炎性激動(dòng)劑調(diào)控NF-κB活化的機(jī)制。
A.小鼠的NF-κB-熒光素酶報(bào)道基因模型用來研究化合物A和B的小鼠造影法。
概述將納米級(jí)的化合物顆粒在0.2％Tween-80的PBS溶液中的懸浮液通過鼻內(nèi)途徑進(jìn)行給藥。
鼻內(nèi)藥物和發(fā)炎刺激物的施用用含4％異氟烷的氧氣麻醉小鼠。將25μl的藥劑注入各鼻孔并令小鼠吸入懸浮液。
受試小鼠為6-8周大的Balb/c雌性小鼠，其肺部注有AdV-NFκB熒光素酶報(bào)道基因。造影時(shí)，用4％異氟烷/氧氣麻醉小鼠。將劑量為150mg/kg的熒光素注入腹腔。注射熒光素10分鐘后，采用IVIS200系統(tǒng)(Xenogen)對(duì)小鼠造影，生物熒光曝光為1分鐘。另外一種方法是在注入熒光素10-15分鐘后，將小鼠迅速無痛致死，然后切除內(nèi)部組織進(jìn)行體外造影。
B.劑量響應(yīng)在用炎性刺激物(IL-1β或LPS)進(jìn)行刺激(鼻腔內(nèi))的前3-5天，將1-2×108pfu的腺病毒-NFκB-熒光素酶注入鼻腔。在用0.5μg LPS或50ng IL-1β攻擊之前30分鐘至1小時(shí)，將0.3-10mg/kg的化合物注入鼻腔。在施用炎性刺激物后1至24小時(shí)期間造影1至幾次。
體內(nèi)測(cè)試結(jié)果如下所示。
化合物(A)和化合物(B)對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB活化的影響如圖1和圖2所示。雖然兩種化合物均以劑量依賴性的方式抑制了NF-κB的活性，但化合物(A)的效力更強(qiáng)，其ED50的估計(jì)值為約1mg/kg。
C.藥物動(dòng)力學(xué)研究方法采用預(yù)先用卵清蛋白敏化的雄性哈特雷豚鼠(體重450-550g)來確定化合物在肺和血漿中的含量。以0.01、0.03、0.1和0.3mg/kg的劑量將化合物(A)和化合物(B)的納米級(jí)顆粒懸浮液通過氣管內(nèi)灌注進(jìn)行給藥。給藥1小時(shí)后，無痛致死動(dòng)物(Euthasol)，用覆有肝素涂層的注射針管穿刺心臟，取血樣1mL。離心分離血漿和血細(xì)胞，然后將血漿儲(chǔ)藏在-80℃的溫度下以備分析。切除豚鼠的肺，將其蘸干、稱重并于-80℃下單獨(dú)存放在20-25mL的玻璃瓶中以備化合物含量分析。
化合物(A)和化合物(B)在藥物動(dòng)力學(xué)上的主要區(qū)別見圖3(最高劑量組的結(jié)果，即劑量為0.3mg/kg)。
如圖3所示，將化合物(A)或化合物(B)注入氣管之后，化合物(B)在肺部的含量相對(duì)低于化合物(A)的含量，這表示化合物(B)可迅速從肺部吸收。
如圖3至圖5所示，化合物(B)作為候選吸入性藥物的優(yōu)勢(shì)欠佳，因?yàn)?)在氣管內(nèi)給藥后，很快向全身疏散；2)化合物(B)是化合物(A)的前體藥物，后者的存留情況不同；并且3)化合物(B)可減小化合物(A)在肺部的含量(相對(duì)直接給藥化合物(A)而言)。
相對(duì)化合物(B)而言，化合物(A)作為候選吸入性藥物的優(yōu)勢(shì)較強(qiáng)，因?yàn)?)在氣管內(nèi)和口服給藥后，化合物(A)的全身含量較低；并且2)化合物(A)在肺內(nèi)的留置時(shí)間較長。
另外，據(jù)有關(guān)證據(jù)表明，化合物(B)在口服后全身疏散性很高。
化合物(A)在肺和血漿中的含量比為143至284(取決于劑量)，而化合物(B)在肺部和血漿中的含量比為13至44(取決于劑量)。這些比值是通過將化合物在肺部的含量除以相同劑量下其在血漿中的相應(yīng)含量得到的。
權(quán)利要求
1.基本純凈的式(A)的化合物 或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。
2.一種含有藥物有效量的式(A)化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
3.對(duì)患有可通過抑制IKK-2而緩解的病癥的患者進(jìn)行治療的方法，其包括向所述患者施用藥物有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中的給藥方法是為了產(chǎn)生局部的活性而進(jìn)行的。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中的病癥為哮喘、鼻炎、慢性阻塞性肺病或慢性阻塞性肺病惡化。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其中的給藥方法為氣管內(nèi)給藥、鼻腔內(nèi)給藥、吸入法或噴霧法。
7.一種對(duì)患有哮喘的患者進(jìn)行治療的方法，包括向所述患者施用藥物有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
8.一種對(duì)患有鼻炎的患者進(jìn)行治療的方法，包括向所述患者施用藥物有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
9.一種對(duì)患有慢性阻塞性肺病的患者進(jìn)行治療的方法，包括向所述患者施用藥物有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
10.一種對(duì)患有慢性阻塞性肺病惡化癥的患者進(jìn)行治療的方法，包括向所述患者施用藥物有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
11.權(quán)利要求2所述的藥物組合物，還包含一種與藥學(xué)上可接受的載體混合的藥物有效量的選自下列的化合物支氣管擴(kuò)張劑、長效β2激動(dòng)劑、抗膽堿能藥劑、甲基黃嘌呤和抗炎藥物。
12.權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中的支氣管擴(kuò)張劑為短效β2激動(dòng)劑；長效β2激動(dòng)劑選自沙美特羅和福莫特羅；抗膽堿能藥劑選自溴丙阿托品和噻托溴銨；甲基黃嘌呤是茶堿；抗炎藥物選自細(xì)胞聚集和毒性炎性介質(zhì)的抑制劑、蛋白水解酶抑制劑、抗氧劑、粘液分泌抑制劑和抗生素。
13.權(quán)利要求3所述的治療方法，還包括施用一種與藥學(xué)上可接受的載體混合的藥物有效量的選自下列的化合物支氣管擴(kuò)張劑、長效β2激動(dòng)劑、抗膽堿能藥劑、甲基黃嘌呤和抗炎藥物。
14.權(quán)利要求13所述的治療方法，其中的支氣管擴(kuò)張劑為短效β2激動(dòng)劑；長效β2激動(dòng)劑選自沙美特羅和福莫特羅；抗膽堿能藥劑選自溴丙阿托品和噻托溴銨；甲基黃嘌呤是茶堿；抗炎藥物選自細(xì)胞聚集和毒性炎性介質(zhì)的抑制劑、蛋白水解酶抑制劑、抗氧劑、粘液分泌抑制劑和抗生素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基本純凈的式(A)化合物或所述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物；含有藥物有效量的式(A)化合物以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物；以及具有活性的式(A)化合物作為IκB激酶(IKK)、尤其是IKK－2的抑制劑，優(yōu)選選擇性抑制劑的用途以及相關(guān)的使用方法。
文檔編號(hào)A61P11/06GK1950359SQ200580015046
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月12日
發(fā)明者E－B·哈達(dá)德, O·里策爾埃, D·J·奧爾德斯, P·J·考克斯 申請(qǐng)人:安萬特藥物公司