專利名稱：來源于缺乏任何功能性α1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的組織產(chǎn)品的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了來源于缺乏任何功能性α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α1，3GT)表達的動物的組織。所述組織可以用于異種移植領域，如整形外科重建和修復、皮膚修復和內(nèi)部組織修復，或用作醫(yī)學設備。
背景技術：
反芻動物，如豬、羊和牛被認為很可能是異種移植器官和組織的來源。豬異種移植物得到了最多的關注，因為豬的供應是充足的，繁殖程序已經(jīng)確立，并且它們的大小和生理與人類相容。其它反芻動物來源，如牛或羊也已經(jīng)被建議作為硬和軟組織異種移植物的來源。但是，必須克服一些障礙，才能將這些器官或組織成功轉(zhuǎn)移到人體中。最重要的是免疫排斥。第一種免疫障礙是“超急性排斥”(HAR)。HAR是由高滴度的預先形成的與外來組織結(jié)合的天然抗體的普遍存在而確定的。認為這些天然抗體與供體組織內(nèi)皮上靶表位的結(jié)合是HAR的起始事件。在受體血灌注到供體組織的數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生該結(jié)合，隨后是補體激活、血小板和纖維蛋白沉積，最后是間質(zhì)水腫和供體器官內(nèi)出血，所有這些都導致受體中組織的排斥(Strahan et al.(1996)Frontiers inBioscience 1，e34-41)。
最常移植到人體中的組織是骨(J.M.Lane et al. CurrentApproaches to Experimental Bone Grafting，18 Orthopedic Clinics ofNorth America(2)213(1987))。僅僅在美國，每年進行超過100,000次骨移植或植入程序，以修復或替代創(chuàng)傷、感染、先天畸形或惡性腫瘤導致的骨缺損。人類的骨是硬結(jié)締組織，由包埋在礦質(zhì)化的基質(zhì)和膠原纖維中的細胞組成(Stedman′s Medical Dictionary，Williams&Wilkins，Baltimore，Md.(1995))。
骨移植物和植入物通常由自體骨形成。但是，通常不能提供用于大的缺損的可移植自體骨組織，特別在兒童中更是如此。此外，自體骨移植可能導致術后疾病，如供體部位的疼痛、出血、傷口問題、美觀問題、感染或神經(jīng)破壞。此外，從移植的自體骨組織制造需要的功能形狀是困難的，會導致骨缺損的填充不能達到最佳效果。
也常常將軟組織，如腱、韌帶、軟骨、皮膚、心臟組織和瓣膜、以及粘膜下組織移植到人體中。通過使用異種移植材料，最初組織的許多結(jié)構和許多特性可以保留在移植物中。如果可以經(jīng)過加工而安全移植到人體，異種移植物組織代表了可獲得的材料的無限供應。
一旦植入到個體中，異種移植物激發(fā)了免疫反應，如異種移植物的慢性和超急性排斥。由于該排斥，骨異種移植物表現(xiàn)出骨折、重吸收和不愈合的比例增加。采用動物組織，如豬、?；蜓蚪M織作為人類植入物的主要免疫障礙是天然的抗半乳糖α1，3-半乳糖抗體，其包含大約1％的人和猴抗體。
除了古代猴、猿和人，大多數(shù)哺乳動物在它們的細胞表面攜帶含有半乳糖α1，3-半乳糖表位的糖蛋白(Galili et al.，J.Biol.Chem.26317755-17762，1988)。相反，在其它哺乳動物，如豬的細胞上發(fā)現(xiàn)含有半乳糖α1，3-半乳糖的糖蛋白。人、猿和古代猴不具有半乳糖α1，3-半乳糖，并且具有大量產(chǎn)生的天然存在的抗半乳糖α1，3-半乳糖抗體(Cooper et al.，Lancet 342682-683，1993)。它與攜帶α1，3-半乳糖的糖蛋白和糖脂特異性結(jié)合。
哺乳動物中″α-1，3 GT表位″和抗Gal抗體(即與攜帶半乳糖α1，3-半乳糖的糖蛋白和糖脂結(jié)合的抗體)的不同分布是進化過程的結(jié)果，該進化過程在祖先的古代靈長類動物和人類中選擇具有滅活的(即，突變的)α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的物種。因此，人類是α-1，3-GT“天然敲除體”。該事件的直接結(jié)果是異種移植物的排斥，如最初通過HAR導致的移植到人體中的豬器官的排斥。
已經(jīng)實施了多種策略來去除或調(diào)節(jié)豬異種移植導致的抗Gal體液應答，包括具有α-半乳糖苷酶的表位的酶促去除(Stone et al.，Transplantation 63640-645，1997)、特異性抗gal抗體去除(Ye et al.，Transplantation 58330-337，1994)、用其它碳水化合物部分給表位加帽，這些策略沒能去除α-1，3-GT表達(Tanemura et al.，J.Biol.Chem.2732116421-16425，1998和Koike et al.，Xenotransplantation 4147-153，1997)，所述策略還包括補體抑制蛋白的導入(Dalmasso et al.，Clin.Exp.Immunol.8631-35，1991，Dalmasso et al. Transplantation 52530-533(1991))。Costa等人(FASEB J 13，1762(1999))報道了H-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)基因豬中α-1，3-GT的競爭性抑制僅僅導致了表位數(shù)目的部分減少。類似地，Miyagawa等人(J Biol.Chem 276，39310(2001))報道了嘗試阻斷N-乙酰基葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III轉(zhuǎn)基因豬的gal表位表達也僅僅導致了gal表位數(shù)目的部分減少，并且不能顯著延長靈長類受體中的移植物存活。
Badylak等開發(fā)了從豬小腸分離粘膜下組織的方法，用于多種組織移植物，包括結(jié)締組織移植物，以修復關節(jié)韌帶(前交叉韌帶)和修復肩轉(zhuǎn)子套(rotator cuff)。用化學和酶促步驟處理小腸粘膜下(SIS)材料，以剝離存活細胞的組織，留下促進宿主細胞向內(nèi)生長和組織再生的無細胞的細胞外基質(zhì)(參見，例如，美國專利Nos.4,902,508，4,956,178和5,372,821)。該方法目前用于人類組織移植。但是，盡管采用了化學處理步驟，半乳糖α1，3半乳糖殘基保持包膜在移植物中，并且導致人類患者中的免疫激活和炎癥(Allman et al. 2001，Transplantation 71，1631-1640；Mcpherson et al.，2000，TissueEngineering 6(3)，233-239)。
Stone等開發(fā)了在移植前處理豬軟組織和骨組織以去除細胞材料，然后用α半乳糖基酶處理以去除半乳糖α1，3-半乳糖的方法(Stoneet al.Transplantation 199763646-651；Stone et al. Transplantation1998651577-83)。該方法是許多患者應用的目標，其討論了將所述組織用于多種應用，如前交叉韌帶修復、半月板修復、關節(jié)軟骨異種移植物、粘膜下異種移植物和骨基質(zhì)異種移植物、心臟瓣膜置換和軟組織異種移植物，參見例如美國專利Nos.5,865,849，5,913,900，5,984,858，6,093,204，6,267,786，6,455,309，6,683,732，5,944,755，6,110,206，6,402,783和5,902,338；美國專利申請Nos.2002/0087211，2001/0051828，2001/0039459，2003/0039678，2003/0023304和2003/0097179；以及PCT公開Nos.WO 00/47131，WO 00/47132，WO 99/44533，WO 02/076337，WO 99/51170，WO 99/47080，WO 03/097809，WO 02/089711，WO 01/91671和WO 03/105737。
因此，本領域需要提供不導致對人類的有害作用的組織移植物。
Costa等人(FASEB(2003)17109-111)報道了通過軟骨中α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因表達(HT轉(zhuǎn)基因)減少了移植到野生型和α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶敲除小鼠中的豬軟骨的遲發(fā)排斥。
已經(jīng)報道了豬細胞和活動物中α-1，3-GT基因座的單等位基因敲除。Denning等人(Nature Biotechnology 19559-562，2001)報道了綿羊中α-1，3-GT基因的一個等位基因的靶定的基因缺失。Harrison等人(Transgenics Research 11143-150，2002)報道了雜合的α-1，3-GT敲除的豬胚胎成纖維細胞體細胞的產(chǎn)生。在2002年，Lai等人(Science 2951089-1092，2002)和Dai等人(Nature Biotechnology 20251-255，2002)報道了α-1，3-GT基因的一個等位基因被成功滅活的豬的產(chǎn)生。Ramsoondar等人(Biol of Reproduc 69，437-445(2003))報道了雜合的α-1，3-GT敲除的豬的產(chǎn)生，該豬表達HT和α-1，3-GT表位，也表達人類α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(HT)。
Austin研究所的PCT公開No.WO 94/21799和美國專利No.5,821,117；Bresatec的PCT公開No.WO95/20661；以及BioTransplant，Inc和The General Hospital Corporation的PCT公開No.WO95/28412，美國專利No.6,153,428，美國專利No.6,413,769和美國公開No.2003/0014770提供了基于α-1，3-GT基因的cDNA的了解(不了解基因組組構或序列)而產(chǎn)生α-1，3-GT陰性豬細胞的討論。但是，在這些申請的申請日之前沒有證據(jù)表明所述細胞確實產(chǎn)生，并且實施例都是預言性的。
成功產(chǎn)生雜合的α-1，3-GT陰性豬細胞的第一次公開發(fā)生在1999年7月的Lake Tahoe轉(zhuǎn)基因動物會議上(David Ayares，PPL Therapeutics，Inc.，″Gene Targeting in Livestock″，Transgenic Animal ResearchConference，July 1999，Abstract，pg.20；Ayares，IBS News Report，Nov.19995-6)。直到最近，還沒有發(fā)表或公開雜合的α1，3 GT陰性豬細胞的產(chǎn)生。此外，由于目前還不能獲得豬胚胎干細胞，目前仍然不能使用α-1，3-GT雜合胚胎干細胞來試圖制備活的純合α1，3GT敲除豬。
在2003年2月27日，Sharma等人(Transplantation 75430-436(2003)發(fā)表了一篇報道，其中證明了成功產(chǎn)生了純合的α-1，3-GT基因敲除的豬胚胎成纖維細胞。
PPL Therapeutics的PCT公開No.WO 00/51424描述了用于核轉(zhuǎn)移的體細胞的遺傳修飾。該專利申請公開了豬體細胞中α-1，3-GT基因的遺傳破壞，以及隨后用這些缺乏至少一個拷貝的α-1，3-GT基因的細胞的核進行核轉(zhuǎn)移。
Cooper&Koren的美國專利No.6,331,658要求保護表達唾液酸轉(zhuǎn)移酶或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白的遺傳工程化的哺乳動物，但其中并沒有證實該動物的實際產(chǎn)生。該專利指出該遺傳工程化的哺乳動物將表現(xiàn)出哺乳動物細胞表面上的半乳糖基化蛋白的減少。
密蘇里大學校產(chǎn)管理董事的PCT公開No.WO03/055302證實了產(chǎn)生用于異種移植的雜合α1，3 GT敲除幼豬。該申請廣泛涉及包含破壞的α-1，3-GT基因的敲除豬，其中與野生型相比，敲除豬中功能性α-1，3-GT的表達減少。該申請沒有提供關于使得豬能夠用于異種移植時α-1，3-GT必須減少的程度。此外，該申請并未提供任何關于產(chǎn)生的雜合豬表現(xiàn)出功能性α1，3 GT的表達減少的證據(jù)。此外，盡管該申請?zhí)岬搅思兒系摩?，3GT敲除豬，在該申請中沒有證據(jù)表明所述豬是實際產(chǎn)生或可以產(chǎn)生的，更沒有提及得到的后代是否可以存活或表型上可以用于異種移植。
很明顯，包含半乳糖α1，3-半乳糖的糖蛋白的完全去除是產(chǎn)生用于異種移植的豬的最佳方法。理論上可能的是可以通過兩種方法產(chǎn)生雙敲除體或兩個拷貝的α1，3GT基因被都破壞1)使兩只單等位基因敲除動物雜交以產(chǎn)生后代，在此情況下，可以基于孟德爾遺傳學預測，四分之一是雙敲除體，或2)在具有預先存在的單敲除的細胞中進行第二個等位基因的遺傳修飾。實際上，通過以下事實證明了這是非常困難的，即，盡管在1993年提交了關于敲除豬細胞的第一個專利申請，直到2002年7月才產(chǎn)生第一只純合的α1，3GT敲除豬(本文中描述)。
從經(jīng)驗上說，轉(zhuǎn)基因小鼠(不是豬)是研究對哺乳動物生理的遺傳修飾效果的優(yōu)選模型，這是因為一些原因，尤其是因為可以得到小鼠胚胎干細胞，而得不到豬胚胎干細胞。小鼠是用于基礎研究應用的理想動物，因為它們相對容易操作，它們繁殖迅速，并且它們可以在分子水平進行遺傳操作。科學家用小鼠模型研究從結(jié)腸癌到智力遲鈍的多種基于遺傳學的疾病的分子生理。迄今為止已經(jīng)建立了成千上萬的遺傳修飾的小鼠。BioMedNet建立了“小鼠敲除和突變數(shù)據(jù)庫”，以提供關于小鼠敲除和經(jīng)典突變的表型和基因型信息的全面數(shù)據(jù)庫(http://research.bmn.com/mkmd；Brandon et al Current Biology 5[7]758-765(1995)；；Brandon et al Current Biology 5[8]873-881(1995))，迄今為止該數(shù)據(jù)庫提供了關于超過3000個獨特基因的信息，所述基因靶定于小鼠基因組。
根據(jù)用小鼠獲得的廣泛經(jīng)驗，已經(jīng)了解到轉(zhuǎn)基因技術具有一些顯著的限制。由于發(fā)育缺陷，很多遺傳修飾的小鼠，特別是通過基因敲除基礎建立的裸小鼠在胚胎期就死亡，使得研究者沒有機會將該模型用于研究。即使小鼠存活，它們會產(chǎn)生顯著改變的表型，這會使得它們嚴重殘疾、畸形或虛弱(Pray，Leslie，The Scientist 16[13]34(2002)；Smith，The Scientist 14[15]32，(2000)；Brandon et al Current Biology 5[6]625-634(1995)；Brandon et al Current Biology 5[7]758-765(1995)；Brandon et al Current Biology 5[8]873-881(1995)；http://research.bmn.com/mkmd)。此外，已經(jīng)了解到不能預測特定的基因是否在生物體發(fā)育中起關鍵作用，因此，不能預測基因的去除是否會導致致死或改變的表型，除非成功建立敲除體，并且產(chǎn)生存活的后代。
已經(jīng)對小鼠進行了遺傳修飾以去除功能性α-1，3-GT表達。已經(jīng)制備了雙敲除α-1，3-GT小鼠。它們可發(fā)育存活，并且具有正常器官(Thallet al.J Biol Chem 27021437-40(1995)；Tearle et al.Transplantation 6113-19(1996)，也參見美國專利No.5,849,991)。但是，這些小鼠中的兩種表型異常是明顯的。首先，所有小鼠發(fā)生致密的皮質(zhì)性白內(nèi)障。其次，α-1，3-GT基因的兩個等位基因的去除顯著影響小鼠的發(fā)育。α-1，3-GT基因雜合的小鼠的交配產(chǎn)生的基因型比例顯著偏離預測的孟德爾的1∶2∶1比例(Tearle et al.Transplantation 6113-19(1996))。
豬的含有半乳糖α1，3-半乳糖的細胞表面糖蛋白的水平比小鼠中的水平高100-1000倍(Sharma et al.Transplantation 75430-436(2003)；Galili et al.Transplantation 69187-190(2000))。因此，α1，3-GT活性在豬中比在小鼠中更關鍵和更充足。
盡管已經(jīng)進行了預測和預言，沒有人知道破壞α-1，3-GT基因的兩個等位基因是否會致死或是否會影響豬發(fā)育或?qū)е卤硇透淖?Ayares etal.Graft 4(1)80-85(2001)；Sharma et al.Transplantation 75430-436(2003)；Porter&Dallman Transplantation 641227-1235(1997)；Galili，U.Biochimie 83557-563(2001))。實際上，本領域的很多專家對純合的α-1，3-GT敲除豬是否會存活表示了懷疑，更不用說正常發(fā)育。因此，除非產(chǎn)生了存活的雙α-1，3-GT敲除豬，根據(jù)當時本領域技術人員的理解，不可能確定(i)后代是否將存活，或(ii)后代是否將展示允許將器官移植到人體中的表型。
一直存在所述憂慮，直到產(chǎn)生了雙敲除豬。在2003年，Phelps等人(Science 299411-414(2003))報道了缺乏α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的任何功能性表達的第一頭存活的豬的產(chǎn)生，其代表了異種移植中的主要突破。
Revivicor，Inc提交的PCT公開No.WO 04/028243描述了缺乏任何功能性α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的存活的豬以及來源于其的器官、細胞和組織的成功產(chǎn)生。Immerge Biotherapeutics，Inc.提交的PCT公開No.WO 04/016742也描述了α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶敲除豬的產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供可以移植到人，而不導致顯著排斥的組織產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于人的整形外科重建和修復、皮膚修復和內(nèi)部組織修復的來自動物的組織。
發(fā)明概述本發(fā)明是來自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物、用作異種移植物的組織產(chǎn)品。該組織可以是硬組織，如骨，或軟組織，如皮膚。該硬組織和軟組織可以用作修復物，例如，用于整形外科重建和修復、皮膚修復和/或內(nèi)部組織修復。動物可以是反芻動物或有蹄動物，如牛、豬或羊。在一種特定實施方案中，動物是豬。來自缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物的組織可以獲自出生前、新生、不成熟、或完全成熟的動物，如豬、?；蜓??？梢愿鶕?jù)此處描述的方法制備用于動物，如人組織修復的組織。
在本發(fā)明的實施方案中，提供了這樣的組織，其中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都被滅活，使得得到的α-1，3-GT酶不能在細胞表面產(chǎn)生半乳糖α1，3-半乳糖。在一種實施方案中，α-1，3-GT基因可以轉(zhuǎn)錄為RNA，但不翻譯為蛋白。在另一種實施方案中，α-1，3-GT基因可以轉(zhuǎn)錄為無活性的截短形式。這種截短的RNA可能不翻譯，或可以翻譯為非功能性蛋白。在另一種實施方案中，可以以不發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄的方式滅活α-1，3-GT。
在本發(fā)明的一個方面，提供了這樣的組織，其中通過基因靶定事件滅活了α-1，3-GT基因的至少一個等位基因。在本發(fā)明的另一方面，提供了來自動物的組織，其中通過基因靶定事件滅活了α-1，3-GT基因的兩個等位基因?？梢酝ㄟ^同源重組靶定基因。在另一個實施方案中，可以破壞基因，即，可以改變遺傳密碼的一部分，從而影響基因該片段的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，通過取代、缺失(“敲除”)或插入(“敲入”)技術，可以發(fā)生基因的破壞。也可以插入調(diào)節(jié)存在的序列轉(zhuǎn)錄的所需蛋白或調(diào)節(jié)序列的其它基因。
作為本發(fā)明的一方面，提供了來自動物的組織，其在α-1，3-GT基因中攜帶至少一個點突變。所述動物不含抗生素抗性基因，因此具有制造用于人類的更安全產(chǎn)品的可能。因此，本發(fā)明的另一方面是來自純合α-1，3-GT敲除的組織，其不具有抗生素抗性或其它選擇標記基因，如新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、hisD或殺稻瘟菌素。在一種實施方案中，該點突變可以通過基因靶定事件發(fā)生。在另一種實施方案中，該點突變可以是天然存在的。在進一步的實施方案中，可以通過誘變劑在α-1，3-GT基因中誘導突變。在一種特定實施方案中，點突變可以是發(fā)生在α-1，3-GT基因的外顯子9的第二個堿基的T到G的突變(參見Phelps et al.Science 299411-414(2003)的圖2)。在其它實施方案中，可以存在至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少10個或至少20個點突變，使得α-1，3-GT基因無活性。在其它實施方案中，提供這樣的組織，其中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都含有防止任何功能性α-1，3-GT表達的點突變。在一種特定實施方案中，提供了這樣的組織，其在α-1，3-GT基因的兩個等位基因都含有發(fā)生在外顯子9的第二個堿基的T到G的突變。在進一步的實施方案中，通過基因靶定事件滅活一個等位基因，由于在α-1，3-GT基因的外顯子9的第二個堿基存在T到G的點突變滅活了另一個等位基因。在一種特定的實施方案中，提供了來自動物的組織，其中通過針對外顯子9的靶定構建體滅活了一個等位基因，由于在α-1，3-GT基因的外顯子9的第二個堿基存在T到G的點突變滅活了另一個等位基因(參見Phelps etal.Science 299411-414(2003)的圖2)。
在進一步的實施方案中，可以從缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物獲得硬或軟組織，其也可以含有其它的遺傳修飾。所述遺傳修飾可以包括其它基因的添加和/或缺失，以防止排斥，促進傷口愈合，和/或減少或消除有害的病原體(如，例如，朊病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)。
在一種實施方案中，組織可以以其“天然”形式(直接從動物中取出)使用?；蛘撸梢詫M織進行進一步處理或修飾。在本發(fā)明的具體實施方案中，提供了來源于此處描述的動物或組織的去細胞的組織。其它實施方案提供了從缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物制備和獲得組織的方法和過程。
在某些實施方案中，制備組織的方法可以包括以下步驟剝離或殺死所有存活的細胞(去細胞)，僅僅留下無細胞的基質(zhì)或支架，用于組織修復和重塑，以及任選進行交聯(lián)和消毒處理。在具體實施方案中，提供了任何去細胞的硬或軟組織，其來源于此處公開的動物。在一種實施方案中，提供了去細胞的軟組織，即皮膚組織。在另一種實施方案中，提供了去細胞的粘膜下組織。在其它實施方案中，所述去細胞的材料免疫原性較低。在進一步的實施方案中，所述去細胞的組織可以用作支架或基質(zhì)，以修復和/或重建特定的人體部分。在一種實施方案中，去細胞的組織可以用于修復以下部位，包括，但不限于，疝、腹壁、轉(zhuǎn)子套、美容手術或任何本領域技術人員公知或此處公開的其它軟組織缺損。在具體實施方案中，提供了粘膜下和/或皮膚去細胞材料。
可以進一步修飾或處理組織和組織的動物來源；減少或清除有害的病原體，如傳染性疾病的傳播(如朊病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)；加入生長因子以促進組織重塑、穩(wěn)定組織，和/或改進組織的生物機械或物理特性。所述處理可以是化學處理，如醇或過氧化物處理、機械或物理處理，如酶處理和/或暴露于氣體、紫外線輻射或γ射線輻射。
在另一實施方案中，來自于缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物的組織可以與其它惰性材料，如塑料、金屬(包括但不限于不銹鋼和鈦)組合，以便給受體患者提供額外的機械強度或其它益處。
在另一實施方案中，來自于缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物的組織可以用作支架，其將受體的細胞募集到移植的材料的部位。該支架也可以含有細胞外基質(zhì)(ECM)成分，如可以任選來源于缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物的ECM成分?；蛘撸摻M織可以用作完整的組織置換物，例如，使得移植的組織與其替代或修復的組織起相同的生物機械功能。在進一步的實施方案中，可以在移植前對組織進行預調(diào)節(jié)(化學和/或機械調(diào)節(jié))以使得移植后組織可以有最佳的活動范圍，或使得對于受體是“適于客戶的”，或提供最優(yōu)的生物或生物機械特性。
在本發(fā)明的一種實施方案中，來自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的硬和軟組織可以用于整形外科重建和修復。所述組織包括結(jié)締組織、腱、韌帶、肌肉、軟骨、骨和骨衍生物。在一種實施方案中，組織可以用于關節(jié)修復，如前交叉韌帶(ACL)或后交叉韌帶(PCL)置換。在另一實施方案中，組織可以用于骨-腱-骨移植物、轉(zhuǎn)子套修復或作為縫合栓。骨組織可以用作完整或部分的骨置換物、骨栓、骨螺絲或骨片(包括這樣的制備物，其中骨片可以制備為糊)。骨組織也可以用于牙周應用或作為脊椎間隔物。
在進一步的實施方案中，來自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的硬和軟組織可以用于皮膚修復，例如，修復皮膚的深度組織燒傷。皮膚組織包括，但不限于，真皮或表皮組織或其衍生物。
在本發(fā)明的另一方面，來自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的硬和軟組織可以用于內(nèi)部組織修復，如腹壁修復、疝修復、心臟瓣膜修復或置換、美容手術/修復、頜面修復、婦產(chǎn)或泌尿組織修復和硬腦膜修復。內(nèi)部組織包括心包組織、心臟瓣膜和粘膜下組織。在一種實施方案中，粘膜下組織可以用于修復或置換結(jié)締組織。
附圖簡述

圖1描述了來自胎680B1-4的細胞上補體的相對裂解作用。
圖2描述了α-1，3-GT基因(參見GenBank Acc.No.L36152)的編碼區(qū)的短片段，其中通過毒素A選擇點突變。上面的序列存在于野生型中，下面的序列顯示了由于第二個等位基因中的點突變導致的改變。
圖3是牛α1，3 GT的UDP結(jié)合位點的3維模型的示意圖?？梢园l(fā)現(xiàn)酪氨酸殘基的芳香環(huán)(最顯著的位置，白色)緊鄰UDP的尿嘧啶堿基(灰色標尺)。
圖4是通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的、出生于2002年7月25日的純合的α-1，3-GT缺陷的克隆豬的照片。
圖5描述了在α-1，3-GT KO小鼠中注射小豬胰島樣細胞簇(ICC)之前和之后的抗α-1，3-gal IgM水平。每只小鼠在4天中接受連續(xù)3次ICC腹膜內(nèi)注射(每次注射200-500 ICC)。野生型(WT)小豬ICC的3個受體均表現(xiàn)出抗α1，3Gal IgM滴度的顯著升高，隨后在ICC植入后4周返回基線。在35天的觀察期中，注射了α-1，3-GT DKO小豬ICC的所有3只小鼠的抗α-1，3-gal IgM滴度都維持在低基線水平(Phelps etal.，Science 299411-414，2003，圖S4)。
圖6是豬α-1，3-GT基因座的圖示，該基因座相當于可以在α-1，3-GT敲除載體中用作5′和3′臂的α-1，3-GT基因組序列，也示出了同源重組后靶定的基因座的結(jié)構。用于3′PCR和長距離PCR的引物的名稱和位置用箭頭表示。短柱表示用于α-1，3-GT Southern印跡的探針。也示出了內(nèi)源性α-1，3-GT基因座和α-1，3-GT靶定的基因座的BstEII消化的Southern條帶的預測大小。
圖7提供了關節(jié)的解剖的概括圖。其顯現(xiàn)彎曲位的右膝的正面觀。
發(fā)明詳述本發(fā)明是來自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物、用作異種移植物的組織產(chǎn)品。該組織可以是硬組織，如骨，或軟組織，如皮膚。該硬組織和軟組織可以用作異種移植物，例如，用于整形外科重建和修復、皮膚修復和內(nèi)部組織修復。動物可以是反芻動物或有蹄動物，如牛、豬或羊。在特定實施方案中，動物是豬。來自缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物的組織可以獲自出生前、新生、不成熟、或完全成熟的動物，如豬、牛或羊。
在本發(fā)明的實施方案中，使α-1，3-GT基因的等位基因無活性，使得得到的α-1，3-GT酶不能在細胞表面產(chǎn)生半乳糖-α1，3-半乳糖。
來自缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物的組織可以獲自出生前、新生、不成熟、或完全成熟的動物，如豬、?；蜓?。在一種實施方案中，組織可以以其“天然”形式(直接從動物取出)使用。或者，組織可以進行進一步處理或修飾。
在本發(fā)明的一種實施方案中，來自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的硬組織和軟組織可以用于整形外科重建和修復。在進一步的實施方案中，來自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的硬組織和軟組織可以用于皮膚修復。在進一步的實施方案中，來自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的硬組織和軟組織可以用于內(nèi)部組織修復。
定義此處用到(如“遺傳修飾的(或改變的)動物”中用到)的術語“動物”包括任何非人動物，特別是任何非人哺乳動物，包括但不限于豬、綿羊、山羊、牛、鹿、騾、馬、猴、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動物、魚和昆蟲。在本發(fā)明的一種實施方案中，提供了遺傳改變的豬及其制備方法。
此處用到的“器官”是有組織的結(jié)構，其可以由一種或多種組織構成?！捌鞴佟毙惺挂环N或多種特定的生物功能。器官包括，但不限于，心臟、肝、腎、胰、肺、甲狀腺和皮膚。
此處用到的“組織”是有組織的結(jié)構，包括細胞和圍繞它們的細胞內(nèi)物質(zhì)。單獨的或與其它細胞或組織組合的“組織”可以行使一種或多種生物功能。組織可以是硬組織或軟組織。“組織產(chǎn)品”包括此處描述的組織和/或組織碎片或組織衍生物。“組織產(chǎn)品”可以用于置換或修復人組織。可以根據(jù)此處描述的方法對所述“組織”進行修飾，例如，但不限于去細胞。
此處用到的術語“豬”是上位術語，是指相同類型的動物，而不論其性別、體型或品種。
此處用到的術語修復物或修復裝置是指制成合適的形狀用于身體修復的硬組織或軟組織。在一種實施方案中，修復的身體可以是人體。在其它實施方案中，可以修復哺乳動物的身體部分，如馬、狗、貓或其它家養(yǎng)動物。
I.組織的類型和制備來自缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物的組織可以獲自出生前、新生、不成熟、或完全成熟的動物，如豬、?；蜓颉?br> 在一種實施方案中，組織可以以其“天然”形式(直接從動物中取出)使用。在替代的實施方案中，可以對組織進行進一步處理或修飾?？梢詫M織和組織的動物來源進行進一步修飾或處理，以促進傷口愈合；減少或消除有害的病原體，如傳染性疾病的傳播(例如，朊病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)；加入生長因子以促進組織重塑、穩(wěn)定組織，和/或改進組織的生物機械或物理特性。
在一種實施方案中，處理的類型可以是化學、機械或物理處理，如酶處理和/或暴露于氣體、環(huán)氧乙烷處理、環(huán)氧乙丙烷處理、等離子體氣體消毒、過乙酸消毒、紫外線輻射或γ射線輻射。本發(fā)明的方法包括單獨或組合的輻射處理、一個或多個周期的凍融、化學交聯(lián)劑處理、醇或臭氧處理。當將一種以上的所述處理用于異種移植物時，這些處理可以以任何順序進行。
在一種實施方案中，可以通過暴露于紫外線輻射，例如，暴露于紫外線輻射大約15分鐘而處理異種移植物組織。在另一種實施方案中，組織可以暴露于γ射線輻射。組織可以暴露于0.5，1.0， 1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.0，10，15或20兆拉德的γ射線輻射。在進一步的實施方案中，異種移植物可以進行臭氧處理。在另一種實施方案中，可以根據(jù)接受的消毒標準進行處理，例如，參見American NationalStandard，ANSI/AAMI/ISO 11137-1994，Sterilization of health careproducts-Requirements for validation and routine control-Radiationsterilization，1994，American National Standard，ANSI/AAMI ST32-1991，Guidelines for Gamma Radiation Sterilization，1991，Scholla，M.H.and Wells，M.E.″Tracking Trends in Industrial Sterilization.″Medical Device and Diagnostic Industry，September 1997，pp.92-95，AAMI Recommended Practice-″Process Control Guidelines for GammaRadiation Sterilization of Medical Devices，″ISBN No.0-91027538-6，pp.7-21，1984，American National Standard，ANSI/AAMT/ISO 11137-1994，Sterilization of health care products-Requirements for validationand routine control-Radiation sterilization，1994，American NationalStandard，ANSI/AAMI ST32-1991，Guideline for Gamma RadiationSterilization，1991，American National Standard，ANSI/AAMI ST31-1990，Guideline for Electron Beam Radiation Sterilization of MedicalDevices，1990，Genova，Hollis，Crowell and Schady，″A Procedure forValidating the Sterility of an Individual Gamma Radiation SterilizedProduction Batch，″Journal of Parenteral Science and Technology，Volume.41，No.1，pp.33-36，Jan 1987，和Gaughran and Morrissey，″Sterilization of Medical Products，″Volume 2，ISBN-0-919868-14-2，pp35-39，1980。
在另一種實施方案中，可以在醇溶液中浸泡處理異種移植物組織。可以用任何醇溶液進行該處理，包括，但不限于，一元醇、二元醇、三元醇、多元醇、高級醇、芳香醇，如苯酚、雜芳香醇、乙醇、甲醇、丙醇、甲基丙醇、異丙醇、2-丙醇、環(huán)丁醇、1，2乙二醇、4，4-二甲基-2-戊醇、4-戊-2-醇、4-氨基-3-異丙基己醇、5-巰基-2，4-環(huán)己二烯醇。醇溶液可以是10，20，30，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，96，97，98或99％的醇。例如，70％的異丙醇溶液?？梢栽谑覝叵?例如，約20-30℃或25℃)或低溫下(例如約0-20℃)使用醇溶液。
在進一步的實施方案中，可以通過凍/融循環(huán)處理異種移植物組織。例如，可以用任何冷凍方法對異種移植物組織進行冷凍。在一種實施方案中，組織是完全冷凍的，使得不保留含有未冷凍組織的內(nèi)部暖點。在一種實施方案中，異種移植物組織可以浸泡在液氮中一段時間?？梢詫⒔M織浸泡大約至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或15分鐘。在另一實施方案中，異種移植物可以是冷凍的。例如，組織可以放置在冷凍裝置中，或?qū)⒔M織暴露于0℃或0℃以下的溫度。然后，在接下來的凍/融循環(huán)處理中，可以通過浸泡在合適的溶液，例如等滲鹽水浴中而使異種移植物組織解凍。水浴的溫度可以是大約在室溫，例如，約25℃?？梢詫⒔M織浸泡在鹽水浴中一段時間，使得其解凍，例如，浸泡至少5分鐘、至少10分鐘或至少15分鐘。在其它實施方案中，可以在凍-融處理前或過程中用冷凍保護劑處理組織。
在進一步的實施方案中，可以將異種移植物暴露于化學試劑以進行鞣制，或使細胞外基質(zhì)內(nèi)的蛋白交聯(lián)?？梢詫⑷魏西分苹蚪宦?lián)試劑用于該處理，可以進行一個以上交聯(lián)步驟，或可以用一種以上的交聯(lián)劑獲得高度交聯(lián)。交聯(lián)劑可以通過例如以下途徑起作用將一個生物分子上的胺基團與第二個生物分子上的硫醇基團偶聯(lián)，在生物聚合物的胺之間形成交聯(lián)、使胺和硫醇交聯(lián)，在胺和羧酸或硫醇和羧酸之間形成交聯(lián)。
在一種實施方案中，可以用醛，如戊二醛、甲醛、低聚甲醛、福爾馬林、醛、己二醛、在酸性pH下鞣制等來交聯(lián)組織的細胞外基質(zhì)內(nèi)的膠原。在另一種實施方案中，可以將脂族和芳香二胺、碳二亞胺、二異硫氰酸酯和其它本領域公知的材料用作交聯(lián)劑。在一種實施方案中，可以用戊二醛處理異種移植物組織。例如，可以將組織放置于緩沖的溶液中，該溶液中含有至少0.25，0.5，1，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，7，8，9，10，15或20％或約0.05-約5.0％；約1-3％或約2-7％戊二醛。該溶液的pH可以是大約7.4、7.5或7.6.可以使用任何合適的緩沖液，如磷酸緩沖液或三羥基甲基氨基甲烷。在替代的實施方案中，可以用蒸氣形式的交聯(lián)劑處理異種移植物組織。在一種實施方案中，交聯(lián)劑可以是汽化的醛交聯(lián)劑，例如，汽化的甲醛。在一種實施方案中，組織可以暴露于濃度為至少0.25，0.5，1，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，7，8，9，10，15或20％或約0.05-約5.0％；約1-3％或約2-7％的汽化的交聯(lián)劑。在另一種實施方案中，汽化的交聯(lián)劑的pH可以是大約7.4、7.5或7.6。在另一種實施方案中，可以用交聯(lián)劑處理組織至少1，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15或至少16天。在特定的實施方案中，可以用交聯(lián)劑處理組織3、4或5天。
交聯(lián)劑也可以選自包括但不限于以下交聯(lián)劑的組二硫蘇糖醇(DTT，D-1532)、三-(2-羧乙基)膦(TCEP，T-2556)、三-(2-氰乙基)膦(T-6052)、3-(2-吡啶基二硫)丙酸琥珀酯(SPDP，S-1531)、乙?；虼宜徵牾?SATA，S-1553)、巰基色氨酸、組合的SPDP/DTT、組合的SPDP/TCEP、dibromobimane(D-1379)、BODIPY FL二-(亞甲基碘乙酰胺)(D-10620)、二-((N-碘乙?；?哌嗪基)砜羅丹明(B-10621)、二(亞氨酯)、二(琥珀酰酯)、二異硫氰酸酯、二酸式氯化物、二-(4-羧基哌啶基)砜羅丹明、二(琥珀酰酯)(B-10622)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDAC，E-2247)、6-((丙烯酰)氨基)己酸(丙烯酰-X，SE；A-20770)的琥珀酰酯，以及鏈親和素丙烯酰胺(S-21379，Section7.5)。
在另一種實施方案中，來自缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物的組織可以與其它惰性材料，如塑料、生物聚合物和金屬(包括但不限于不銹鋼和鈦)組合，以便提供額外的機械強度或給受體患者提供其它應用益處。生物聚合物包括，但不限于纖維素、藻酸、脫乙酰殼多糖、膠原、彈性蛋白和網(wǎng)硬蛋白，及其類似物和混合物。
在其它實施方案中，修復物可以進一步包括合成材料，如聚合物和陶瓷。合適的陶瓷包括，例如，羥磷灰石、氧化鋁、石墨和熱解碳。合適的合成材料包括水凝膠和其它不能承受嚴重脫水的合成材料。異種移植物也可以包含合成聚合物和純化的生物聚合物。這些合成聚合物可以編織或編結(jié)成網(wǎng)，以形成基質(zhì)或相似結(jié)構?；蛘?，合成聚合物材料可以模塑或鑄造成合適的形狀。
合適的合成聚合物包括，但不限于，聚酰胺(如尼龍)、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、乙烯基聚合物(如聚乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯和聚氯乙烯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚二甲基硅氧烷、乙酸纖維素、聚甲基丙烯酸甲酯、乙烯乙酸乙烯酯、聚砜、硝基纖維素和相似的共聚物。也可以使用可生物重吸收的聚合物，如右旋糖苷、羥乙基淀粉、明膠、明膠衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺]、聚(羥酸)、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(二甲基乙醇酸)、poly(hydroxy buterate)和相似的共聚物。這些合成聚合物材料可以編織或編結(jié)成網(wǎng)，以形成基質(zhì)或相似結(jié)構。或者，合成聚合物材料可以模塑或鑄造成合適的形狀。
生物聚合物可以是天然存在的或者通過發(fā)酵等或通過重組基因工程而體外制備。可以用重組DNA技術對幾乎任意的多肽序列進行工程化，然后在細菌或哺乳動物細胞中擴增和表達蛋白。通過諸如編織、編結(jié)、鑄造、模塑、擠壓、細胞排列和磁排列的技術，可以使純化的生物聚合物合適地形成基質(zhì)。合適的生物聚合物包括，但不限于，膠原、彈性蛋白、絲、角蛋白、明膠、多氨基酸、多糖(如纖維素和淀粉)及其共聚物。
在一種實施方案中，該組織可以用作完整的組織置換物，例如，使得移植的組織與其置換或修復的組織起相同的生物機械功能。在進一步的實施方案中，可以在移植前對組織進行預調(diào)節(jié)(化學和/或機械調(diào)節(jié))以使得移植后組織可以有最佳的活動范圍，或使得對于受體是“適于客戶的”。在進一步的實施方案中，可以按照上文所述進一步處理和/或加工組織，以形成去細胞的產(chǎn)品，例如，一旦植入，可以將其用作支架。
A.組織重建、修復和/或置換在本發(fā)明的一種實施方案中，來自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的硬和軟組織可以用于手術應用。在一種實施方案中，組織可以用于整形外科重建和修復。所述組織包括軟組織，如結(jié)締組織、腱、韌帶、肌肉和軟骨，以及硬組織，如骨和骨衍生物。在一種實施方案中，組織可以用于關節(jié)修復，如前交叉韌帶(ACL)或后交叉韌帶(PCL)置換。在另一實施方案中，組織可以用于骨-腱-骨移植物、轉(zhuǎn)子套修復或作為縫合栓。骨組織可以用作完整或部分的骨置換物、骨栓、骨螺絲或骨片(包括這樣的制備物，其中骨片可以制備為糊)。骨組織也可以用于牙周應用、美容和/或頜面修復。該組織也可以用作脊柱修復中使用的脊椎間隔物。該組織也可以用于置換耳組織，如聽小骨、鼓膜、連接了錘骨的鼓膜、耳骨栓、顳骨、肋軟骨和硬腦膜)，其可以任選用于內(nèi)耳重建。
1.骨組織在一種實施方案中，本發(fā)明提供了制備用于植入或移植到人的骨異種移植物的方法，該方法包括從動物取出骨的至少一部分或整片的骨，以提供異種移植物。
可以從任何非人動物獲得骨，以制備本發(fā)明的異種移植物。在一種實施方案中，可以從牛、羊或豬獲得骨。在另一種實施方案中，從未成熟的豬、?；蛐⊙颢@得骨。幼年動物的骨具有更多的松質(zhì)骨，通常沒有老年動物的骨易碎。在另一種實施方案中，從6-18月齡的動物獲得骨。
可以從動物的骨取出完整的骨部分?？梢詮男绿幩赖膭游锸占恰；蛘?，可以從活動物手術取出骨。取出的骨可以包括，但不限于顱骨，如前、側(cè)或后顱骨；脊椎，如頸椎(寰椎、樞椎、典型頸椎)、胸椎(上、下)、腰椎(上、下、側(cè))、骶骨、骨盆、胸廓、胸骨、肋骨、上肢骨、肩胛骨、腹骨、背骨、鎖骨、肱骨(前或后)、橈-尺骨(前或后)、手骨(背側(cè)或掌側(cè))、股骨(前或后)、脛-腓骨(前或后)和/或足(背側(cè)或外側(cè))。在一種實施方案中，取出后，可以將骨放置于合適的無菌等滲溶液或其它組織保存液中。屠宰后對骨部分的獲取可以在屠宰后盡早進行，并且可以在低溫下進行。例如，約5℃-約20℃，約0℃-約20℃，約0℃-約10℃或約0℃-約25℃。
然后可以在無菌的、任選冷的水中清洗，以除去殘留的血液蛋白和水溶性材料。在一種實施方案中，隨后可以在例如上文所述的條件下將異種移植物組織浸泡在醇中。異種移植物可以進行如上文所述的化學、機械或生物處理。
在一種實施方案中，可以將獲得的骨部分切割成條或塊。在另一種實施方案中，獲得的骨可以制成任何有用的骨移植物構型，包括，但不限于骨銷、脊椎間隔物、骨栓、骨片、骨螺絲、骨水泥、D形間隔物和皮質(zhì)環(huán)。可以制備條、塊或其它骨移植物，使得松質(zhì)骨附著于皮質(zhì)骨。或者，可以制備條、塊或其它骨移植物，使得松質(zhì)骨不附著于皮質(zhì)骨。
骨水泥和骨栓在本發(fā)明的其它實施方案中，提供了來自缺乏任何功能性α-1，3-GT表達的骨水泥和骨栓。
骨水泥組合物可以用于植入材料的粘結(jié)或固定，以及加強破壞的天然骨。所述應用在例如整形外科、牙科和相關醫(yī)學學科的領域中有用。整形外科領域處理由于骨折、骨腫瘤和骨的其它疾病導致的骨缺損。處理可能需要手術切除骨的全部或部分。在牙科應用中，可能由于拔牙、癌癥或其它疾病導致顎骨缺損。植入材料在修復或重建所述骨缺損的切除后保留的骨中有用。在所述程序中使用的植入材料可以是金屬、陶瓷和聚合物。骨水泥可以和其它植入材料一起使用，用于將植入物粘結(jié)和固定到保留的存活骨。例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)已經(jīng)廣泛地與硬件一起用于整形外科中。
盡管常規(guī)PMMA骨水泥在整形外科手術中的應用已經(jīng)超過了40年，它還遠遠不是理想的，因為1)它不促進骨向內(nèi)生長，2)它是比骨皮質(zhì)弱的工具，和3)它具有高的放熱曲線和單體毒性。因此，本發(fā)明提供了基質(zhì)材料，如此處描述的那些，其可以配制為骨水泥。所述骨水泥可以表現(xiàn)出迅速的硬化時間和/或化學粘結(jié)，以固定人工生物材料(如植入材料)。該水泥可以表現(xiàn)出體內(nèi)生物活性，保持機械強度，特征在于足夠的硬度和模數(shù)，和/或通過其物理和化學作用改進骨量。骨水泥可以包括粉末和液體成分。在一種實施方案中，在包含粉末相材料和液相材料的粉末-液相中提供生物活性骨水泥。在另一種實施方案中，在包含兩種分離的糊材料的糊-糊相中提供生物活性骨水泥。此外，此處提供的骨水泥材料可以與其它類型的骨水泥成分，如PMMA骨水泥混合?？梢杂萌魏纬Ｒ?guī)方式使用骨水泥，如經(jīng)注射器注射。本發(fā)明的骨水泥可以用于，例如通過注射器注射而進行的脊柱手術中。注射器注射通過注射器和大孔針頭的使用，提供了侵入性最小的送遞技術。其也允許水泥精確適合放置其的部位。此外，可以將骨水泥或糊與生長因子或細胞因子混合，包括，但不限于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)。
骨栓可以用于長期或暫時阻塞長骨中的管道。為了固定內(nèi)修復物或人工關節(jié)，例如骨內(nèi)的人工髖關節(jié)修復物，將修復物的莖插入填充了骨水泥的長骨中的骨髓內(nèi)管道。為了防止骨水泥在管道中的突出超過固定莖所必須的程度，并且為了保證骨水泥僅僅存在于莖和骨的內(nèi)壁之間，并且為了防止骨水泥進一步滲漏到骨髓內(nèi)管道，用骨栓阻塞莖下的管道(參見，例如，美國專利6,669,733，6,494,883)。
可以將骨栓模塑為各種大小，并且具有多種高與直徑的比例，以便適合多種軟骨置換情況。骨栓的橫切面可以是多邊形或圓形。例如，骨栓可以是具有從平片到圓柱形狀的圓形裝置。對于每種應用，可以考慮多種因素，如要植入骨置換栓的位置、要修復的骨缺損的大小和要植入軟骨置換栓的空腔的大小和形狀，所述空腔是最初通過切除缺損形成的，或通過隨后對腔進行的手術造型而形成的。
也可以使用骨水泥栓，這種裝置是本領域公知的。骨水泥栓可以與骨水泥分配器一起使用，以便在將修復裝置固定在骨管道之前將骨水泥壓實到骨管道中。舉例說明，骨水泥栓可以與骨水泥分配器一起使用，以便在將人工髖的股骨莖固定在管道中之前，將骨水泥壓實到股骨的骨髓內(nèi)管道中。更具體地，在全關節(jié)置換手術中，如髖和肩置換手術中，可以用骨水泥將修復裝置的莖固定到關節(jié)骨的骨髓管道中。在此方面，通常發(fā)現(xiàn)如果在修復裝置的莖放置到骨管道中之前將骨水泥很好地裝填到骨管道中，則修復裝置將更牢固地固定在骨管道中。在一個實例中，在最初準備和清潔骨管道后，通常用栓阻塞管道的遠端部分。骨水泥栓可以限制骨水泥不受控制地流入骨管道的遠端部分。在一種特定實施方案中，骨水泥栓可以限制骨水泥柱在超過修復物莖的遠端尖大約1-2cm的范圍內(nèi)。栓設置在骨管道的遠端部分后，可以用具有長噴嘴的骨水泥分配器將骨水泥注入鄰近栓的阻塞的骨管道的最遠端部分。然后可以以倒退方式用骨水泥填充骨管道，這是通過將骨水泥分配器的噴嘴從骨管道的遠端拉到骨管道的近端，此時從噴嘴釋放出水泥。這種倒退填充有助于避免將空氣包裹在骨管道的最遠端部分。用骨水泥填充骨管道后，可以將骨管道加壓器連接于骨水泥分配器。加壓器對骨的開口端施加壓力，以便阻塞骨管道的近端。然后可以通過加壓器，在壓力下將更多的水泥注入骨管道中。在所述加壓條件下，骨管道中的水泥突出到限定骨管道的骨壁內(nèi)表面的空隙中。當此后骨水泥固定后，可以在水泥和骨壁內(nèi)表面的不規(guī)則物之間建立微聯(lián)鎖。這可以顯著增強修復裝置在骨管道中的固定。
在一種實施方案中，骨水泥栓可以很容易在骨管道中需要的深度放置，有效關閉該骨管道，并且，在骨水泥栓隨后需要取出的情況下，容易從骨管道的遠端取回。
多種骨水泥栓都是本領域公知的。參見，例如，美國專利Nos.4,245,359；4,276,659；4,293,962；4,302,855；4,344,190；4,447,915；4,627,434；4,686,973；4,697,584；4,745,914；4,936,859；4,950,295；4,994,085；5,061,287；5,078,746；5,092,891；5,376,120；4,011,602；4,523,587；4,904,267，6,299,642，6,306,142和5,383,932，以及WO94/15544。
用于移植骨栓的手術技術可以包括通過在破壞部位鉆或切割一個孔而取出破壞的骨組織，用骨栓栓塞該孔。可以用手術器具從缺乏任何功能性α-1，3-GT的動物獲取或拔取骨栓。然后可以在受體部位將骨栓植入預先形成的孔。常規(guī)的獲取器具可以包括在遠端具有切割緣的管。為了拔取栓，可以將儀器伸入供體部位的骨中，然后取出，其上帶有骨組織栓。
骨螺絲在另一實施方案中，提供了來源于缺乏任何功能性α-1，3-GT表達的動物的骨螺絲。
減少骨折的一種方法可以使用外部固定裝置，其允許骨折加固為高度臨界的區(qū)域，特別是接近于關節(jié)的那些，或者允許處理涉及皮膚組織嚴重破壞的骨折，這種骨折用傳統(tǒng)的打石膏法可能是不合適或不可行的。這種裝置通常具有復雜的構造并且以多種構型提供，以便適于最不可預測的偶然狀況，這種裝置具有相對的兩端，扣緊在破裂骨各自的未破壞的部分，這種扣緊是通過使用牢固設置在這些部分的骨材料中的螺絲而實現(xiàn)的。因此，例如在脛骨骨折的情況下，跨骨折區(qū)固定相應(脛骨)固定裝置的相對末端。在其它情況下，當骨折涉及關節(jié)如踝關節(jié)時，相應外部固定裝置的骨螺絲設置在脛骨和距骨中。
用于扣緊外部固定裝置，并因此確保裝置有效的骨螺絲可以包括設計用于由合適的驅(qū)動裝置嚙合的螺絲頭，和具有螺紋部分的螺絲桿，其通常朝著所述頭相對端的螺絲尖逐漸變細。螺絲頭可以由平行于螺絲軸延伸的平面形成，磨銑在螺絲桿的一側(cè)上。骨螺絲可以是各種長度，使得螺絲適合其可以插入的骨的特定大小和形狀。
脊椎間隔物在本發(fā)明的其它實施方案中，提供了來自缺乏任何功能性α-1，3-GT表達的動物的脊椎骨的任何部分。所述成分包括，但不限于脊椎間隔物、椎間盤、髓核和/或纖維環(huán)。
脊椎融合適于為脊椎運動疼痛和諸如結(jié)構畸形、創(chuàng)傷性不穩(wěn)定、退化性不穩(wěn)定和切除術后因治療而引起的不穩(wěn)定的病癥提供脊柱的穩(wěn)定化。融合或關節(jié)固定術是通過在相鄰的運動區(qū)段之間形成骨橋而實現(xiàn)的。這可以在椎間盤間隙、前部在連續(xù)的椎體之間或后部在連續(xù)的橫突、椎板或其它在后的部位之間實現(xiàn)。成功的融合需要成骨細胞或有成骨潛能的細胞、重組的血液供應、足夠的炎癥反應和合適的局部骨準備的存在。
可以進行融合或關節(jié)成形術來治療涉及椎間盤的畸形。位于相鄰椎骨的終板之間的椎間盤使脊柱穩(wěn)定，在椎骨間分布力，并且襯墊椎體。正常的椎間盤包括半凝膠狀成分即髓核，其由更外部的纖維狀的環(huán)圍繞和限制，所述環(huán)稱作纖維環(huán)。在健康的、未受破壞的脊柱中，纖維環(huán)防止髓核突出到椎間盤間隙外。
椎間盤可以由于創(chuàng)傷、疾病或衰老而易位或破壞。纖維環(huán)的破壞使得髓核突出到椎管中，這種狀況通常稱作椎間盤突出或椎間盤破裂。突出的髓核可以壓迫脊神經(jīng)，導致神經(jīng)破壞、疼痛、麻木、肌肉萎縮和癱瘓。椎間盤也可以由于正常衰老過程或疾病而破壞。隨著椎間盤脫水和硬化，椎間盤間隙高度將減少，導致脊柱不穩(wěn)定，運動性降低和疼痛。這些狀況的一種治療方法是椎間盤切除術，或手術去除椎間盤的一部分或全部，然后融合相鄰的椎骨。破壞的或不健康的椎間盤的去除可以使得椎間盤間隙塌陷。椎間盤間隙塌陷會導致脊柱不穩(wěn)定、關節(jié)力學異常、關節(jié)或神經(jīng)破壞的過早發(fā)生、以及嚴重疼痛。通過椎間盤切除術和關節(jié)固定術緩解疼痛，需要保留椎間盤間隙，并且最終融合受影響的運動區(qū)段。
可以用骨移植物或脊椎間隔物填充椎間隙，以防止椎間盤間隙塌陷，并且促進相鄰椎骨跨椎間盤間隙的融合。很多在除去椎間盤后恢復椎間盤間隙的嘗試都依賴于金屬裝置(參見，例如，美國專利4,878,915，5,044,104；5,026,373，4,961,740；5,015,247，5,147,402和5,192,327)。
可以根據(jù)常規(guī)方法制備來自缺乏功能性α-1，3-GT表達的動物的脊椎成分?？梢詮膭游铽@得骨，然后進行清潔以除去組織和血液?？梢杂弥T如醇和過氧化物的試劑或上文描述的其它試劑處理骨，以除去細胞物質(zhì)、脂肪和非膠原蛋白。可以處理骨材料以除去游離膠原，留下結(jié)合的或結(jié)構膠原。用于除去游離膠原和任何殘留脂肪的一種試劑是十二烷基硫酸鈉(SDS)。
2.軟組織軟組織連接、支持或圍繞身體的其它結(jié)構和器官。軟組織包括，例如，肌肉、腱、脂肪、血管、淋巴管、神經(jīng)、圍繞關節(jié)的組織、皮膚或除骨之外的任何其它組織。
可以從動物的關節(jié)提取軟組織，如結(jié)締組織、腱、半月板、韌帶、肌肉和軟骨?？梢詮男绿幩赖膭游锸占M織來源。或者，可以從活動物手術取出組織。任何關節(jié)都可以作為軟組織來源。在本發(fā)明的實施方案中，來自相應供體關節(jié)的組織可以用于制備異種移植物組織。例如，來自股骨-脛骨關節(jié)的軟骨可以用于制備植入關節(jié)的軟骨異種移植物。在另一實例中，來自供體動物髖關節(jié)的軟骨可以用于制備人髖關節(jié)的軟骨異種移植物。
在一種實施方案中，可以從膝關節(jié)提取軟骨組織。關節(jié)是含有空間上相關的骨、韌帶和軟骨結(jié)構的復雜關節(jié)，骨、韌帶和軟骨結(jié)構相互作用，產(chǎn)生多種運動。具體地，股骨髁與脛骨的平臺通過軟骨性的內(nèi)側(cè)和外側(cè)半月板形成關節(jié)，所有這些成分都由多個韌帶保持位置?；旧嫌兴臈l獨立的韌帶穩(wěn)定膝關節(jié)(參見，例如，圖7)。關節(jié)的兩側(cè)是內(nèi)側(cè)副韌帶(MCL)和外側(cè)副韌帶(LCL)，其作為關節(jié)的側(cè)向穩(wěn)定的穩(wěn)定物。MCL是較寬的韌帶，其實際上由兩個韌帶結(jié)構組成，即，深和淺成分，而LDL是獨特的索樣結(jié)構。在關節(jié)中心的前部是前交叉韌帶(ACL)。該韌帶是脛骨上的股骨的非常重要的穩(wěn)定物，并且防止脛骨在迅速運動、跳和減速活動中旋轉(zhuǎn)和向前滑。ACL后面緊接是其相對的后交叉韌帶(PCL)。PCL防止脛骨滑到后面。
內(nèi)側(cè)和外側(cè)半月板是包含稱作纖維軟骨細胞的細胞、蛋白膠原的纖維形成的間隙基質(zhì)和蛋白聚糖形成的基質(zhì)的結(jié)構。未受破壞的半月板通過確保膝關節(jié)內(nèi)相互作用的骨面的合適的力分布、穩(wěn)定和潤滑而提供震蕩緩沖，其通常暴露于正常運動期間重復的壓迫負荷。內(nèi)側(cè)和外側(cè)半月板的許多震蕩緩沖功能來源于軟骨固有的彈性特征。當半月板由于損傷、疾病或炎癥而受到破壞時，膝關節(jié)中發(fā)生關節(jié)改變，隨后喪失功能。
關節(jié)的前交叉韌帶(ACL)的功能是防止所有彎曲位時脛骨從股骨向前易位。ACL也防止伸展過度，并且在脛骨內(nèi)旋和外旋過程中有助于完全伸展的膝關節(jié)的旋轉(zhuǎn)穩(wěn)定性。ACL可能在本體感受中起作用。ACL由包含細胞、水、膠原、蛋白聚糖、纖連蛋白、彈性蛋白和其它糖蛋白的結(jié)締組織結(jié)構組成(參見，例如，Cyril Frank，M.D.et al.，Normal LigamentStructure，F(xiàn)unction，and Composition.Injury andRepair of the Musculoskeletal Soft Tissues，245-101)。結(jié)構上，ACL連接于脛骨髁間隆突前面的凹陷，向后向上延伸到外側(cè)股骨髁的內(nèi)側(cè)壁。ACL的部分或完全撕裂是非常常見的，每年在美國有大約30,000次門診。
關節(jié)軟骨覆蓋了形成人和動物關節(jié)的所有骨的末端。軟骨由稱作纖維軟骨細胞的細胞和膠原纖維形成的細胞外基質(zhì)以及多種蛋白聚糖組成。軟骨在關節(jié)中作為力分布的機制并且作為骨接觸區(qū)中的潤滑劑。沒有關節(jié)軟骨，壓力聚集和摩擦將發(fā)生到使關節(jié)不易運動的程度。失去關節(jié)軟骨通常導致疼痛性關節(jié)炎和關節(jié)運動減少。由于成人中的關節(jié)軟骨在破壞時不天然變性到顯著的程度，已經(jīng)通過包括修復、置換或切除的多種手術干預治療了受到破壞的成人關節(jié)軟骨。
在一種實施方案中，可以通過首先切斷膝腱而從關節(jié)提取半月板軟組織，然后可以解剖出不含粘連組織的半月板。任選地，小量的骨可以保持與角連接，所述角例如骨的基本為圓柱形的栓，例如骨栓。在一個特定實例中，骨栓的直徑可以是大約5毫米，深度是大約5毫米。在一種實施方案中，隨后可以鑒定半月板滑膜連接處，并且與半月板組織分離，以形成基質(zhì)材料。在另一種實施方案中，可以將完整的半月板軟組織用于移植。
在另一種實施方案中，可以從關節(jié)提取關節(jié)軟骨軟組織。在一種實施方案中，可以鑒定帶有一小層軟骨下骨的一薄層關節(jié)軟骨，并且從供體關節(jié)刮下，這可以形成基質(zhì)材料。在另一實施方案中，可以將完整的關節(jié)軟骨軟組織用于移植。
在進一步的實施方案中，可以從關節(jié)提取韌帶軟組織，如前交叉韌帶、后交叉韌帶、外側(cè)副韌帶或內(nèi)側(cè)副韌帶。為了取出韌帶，可以用標準手術技術打開關節(jié)。在一種實施方案中，可以獲取帶有連接于一端或兩端的一塊骨的韌帶。在一個實例中，可以提取帶有韌帶的代表基本上為圓柱形的栓的一塊骨，骨栓可以是直徑大約9-10mm，長度大約20-40mm。在另一種實施方案中，獲取不帶有骨的韌帶。在進一步的實施方案中，可以獲得不帶有骨的韌帶，然后解剖出來，使其不帶有粘連的組織，以獲得基質(zhì)材料。在另一種實施方案中，可以將完整的韌帶軟組織用于移植。
取出后，可以將組織放置于合適的無菌等滲溶液或其它組織保存溶液中。屠宰動物后對組織的獲取可以在屠宰后盡早進行，并且可以在低溫下進行。例如，約5℃-約20℃，約0℃-約20℃，約0℃-約10℃或約0℃-約25℃。
膠原在另一實施方案中，本發(fā)明的膠原組織可以用于治療膠原病。由膠原蛋白的異?；蚧虍惓＜庸е碌哪z原結(jié)構改變導致了多種疾病，如Larsen綜合征、壞血病、成骨不全和Ehlers-Danlos綜合征。Ehlers-Danlos綜合征實際上是與至少10種不同的病癥相關的名稱，所述病癥在生化和臨床上是不同的，但都表現(xiàn)出由于膠原結(jié)構的缺陷導致的結(jié)締組織結(jié)構缺陷。成骨不全也包括不止一種病癥。已經(jīng)鑒定了至少4種生化和臨床上可區(qū)分的病癥，它們的特征都在于多發(fā)性骨折和導致的骨畸形。馬凡氏綜合征自身表現(xiàn)為結(jié)締組織的病癥，并且認為是異常膠原的結(jié)果。但是，最近的證據(jù)表明馬凡氏綜合征是由細胞外蛋白即肌原纖蛋白的突變導致的，該肌原纖蛋白是細胞外基質(zhì)的非膠原性微纖維的組成部分。
表3膠原病
軟骨栓在其它實施方案中，提供了從缺乏任何功能性α-1，3-GT表達的動物獲得的軟骨栓。軟骨栓可以用于填充天然軟骨中的空缺。天然軟骨中的空缺可能是由于創(chuàng)傷或慢性疾病?；蛘?，軟骨栓可以用于將可流動的聚合物錨定到軟骨下骨?？梢詫④浌撬ㄖ瞥蛇m于需要的移植物的任何大小、形狀和輪廓?？梢允褂脝蝹€或多個軟骨栓來填充用于任何應用的任何大小的空缺。軟骨栓可以由分層的結(jié)構形成，或者包含分層的結(jié)構，以便匹配修復位點的生理需要。此外，可以在每個栓的周圍形成脊，以促進其錨定到圍繞的軟骨、骨和/或鄰近的栓(參見，例如美國專利No.6,632,246)。
軟骨栓的橫切面可以是多邊形或圓形。多邊形或圓形橫切面可以包括約小于1∶1到約20∶1、約30∶1或約40∶1的高與直徑的比例?？梢詫⑺Ｋ転槎喾N大小以及具有多種高與直徑的比例，以適合多種軟骨置換狀況。例如，栓可以是圓形裝置，具有從平片到圓柱形狀的圓形裝置。對于每種應用，可以考慮多種因素，如要植入軟骨置換栓的位置、要修復的軟骨缺損的大小和要植入軟骨置換栓的空腔的大小和形狀，所述空腔是最初通過切除缺損形成的，或通過隨后對腔進行的手術造型而形成的。例如，具有平坦的圓片形狀的軟骨置換栓裝置最適用于較廣泛但是淺的缺損，而高與直徑的比例大的裝置適于具有小的表面積，但是在軟骨和/或軟骨下骨層中延伸得更深的缺損。
可以處理本發(fā)明的軟骨栓的表面，以暴露多孔或粗糙的表面。通過處理栓的表面使其粗糙或具有紋理，可以增強細胞附著并且允許細胞遷移和組織層的過度生長。具有了合適的表面粗糙度，得到的細胞可以通過向上和向內(nèi)生長到栓的表面而附著，從而增強固定。所述細胞向內(nèi)生長可以最終轉(zhuǎn)化為與栓形成的骨界面，并且認為是需要的特征。該轉(zhuǎn)化的重要性是負荷物如何從裝置轉(zhuǎn)移到周圍的組織。栓和周圍組織之間的畸形中的大的錯配，會導致栓周圍的纖維組織層盡管是柔性的，但不能提供需要的固定。當考慮生物固定時，孔隙度與粗造度一樣，可以是重要和有益的。
縫合錨本發(fā)明中提供的軟組織可以用于形成縫合錨，所述縫合錨可以用于固定關節(jié)重建手術和關節(jié)鏡手術程序過程中在骨內(nèi)形成的開口內(nèi)的縫線?？梢詫⒃撳^放置在骨中，并且連接于原本不能固定于致密的骨材料的縫線。所述縫合錨可以用于例如在膝、肩和肘重建和修復手術中將韌帶或腱錨定到骨。骨錨的重要特性在于它們?nèi)菀撞迦?，并且提供了牢固的錨。手術后錨的無意脫落具有嚴重的不良后果，因此錨抵抗連接的縫線施加的牽引力或拉力的能力非常重要(參見，例如，美國專利4,738,255，4,013,071，4,409,974，4,454,875和5,236,445)。
本發(fā)明還提供了將縫線錨定于骨的方法。首先，可以在骨中鉆一個孔。然后可以插入骨錨，首先插入其遠端?？梢酝ㄟ^錨的開口的近端將擴展工具，如具有長方形或橢圓形橫切面的桿插入擴展室。然后旋轉(zhuǎn)該工具，隨著工具旋轉(zhuǎn)，使工具與壁接觸，從而擴展骨錨的槽式近端。工具的長方形或橢圓形橫切面允許其在接觸壁之前通過至少一部分回轉(zhuǎn)而旋轉(zhuǎn)，使得骨錨不容易隨著工具旋而轉(zhuǎn)。在一種實施方案中，工具的遠端尖安裝在擴增室遠端的相應凹槽中。凹槽提供了固定的支點，桿可以圍繞該支點旋轉(zhuǎn)以擴展錨。
3.支架在某些實施方案中，準備組織的方法可以包括以下步驟剝離或殺死所有存活的細胞(去細胞)，僅僅留下無細胞的基質(zhì)或支架，用于組織修復和重塑，以及任選進行交聯(lián)和消毒處理。在具體實施方案中，提供了任何去細胞的硬或軟組織，其來源于此處公開的動物。在一種實施方案中，提供了去細胞的軟組織，即皮膚組織。在另一種實施方案中，提供了去細胞的粘膜下組織。在其它實施方案中，所述去細胞的材料免疫原性較低。在進一步的實施方案中，所述去細胞的組織可以用作支架或基質(zhì)，以修復和/或重建特定的人體部分。在一種實施方案中，去細胞的組織可以用于修復以下部位，包括，但不限于，疝、腹壁、轉(zhuǎn)子套、美容手術或任何本領域技術人員公知或此處公開的其它軟組織缺損。在具體實施方案中，提供了粘膜下和/或皮膚去細胞材料。
在本發(fā)明的一方面中，可以取得(獲取)來源于這些α1，3GT動物的組織，然后進一步加工以形成去細胞的組織，例如，用作支架。在一種實施方案中，組織可以進行多步加工，包括，但不限于用穩(wěn)定溶液處理組織、除去細胞和任何殘留的抗原性組織成分的去細胞加工、酶處理、交聯(lián)以改進組織的結(jié)構完整性或除去任何殘留的抗原組織成分、消毒以除去和/或滅活天然病毒，和/或長期保存方法。在一種實施方案中，穩(wěn)定溶液可以含有合適的緩沖液、一種或多種抗氧化劑、一種或多種滲透壓調(diào)節(jié)劑(oncotic agent)、抗生素，并且可以包含一種或多種蛋白酶抑制劑。
在其它實施方案中，加工組織以產(chǎn)生去細胞的組織可以包括，例如，除去可以導致組織排斥和移植失敗的細胞，而不破壞基質(zhì)。去細胞過程具有以下優(yōu)點使得組織與合成物的強度一樣，但更柔韌，保留張力和功能性特征，有助于防止粘附、減少感染和移植物排斥，并且促進周圍宿主組織的重塑。在其它實施方案中，可以用許多化學處理完成去細胞，包括在某些鹽、去污劑或酶中溫育，和/或真空/壓力處理。在一種實施方案中，去污劑可以是Triton X-100(Rohm and HaasCompany of Philadelphia，Pa.)。在某些實施方案中，Triton X-100除去細胞膜，參見，例如，美國專利4,801,299。其它去細胞的去污劑包括，但不限于，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇一油酸酯和聚氧乙烯(80)失水山梨糖醇一油酸酯(Tween 20和80)、脫氧膽酸鈉、3-[(3-氯酰氨基丙基)-二甲基氨基1-1-丙烷-磺酸酯、辛基-葡糖苷和/或十二烷基硫酸鈉或本領域技術人員公知的任何其它去污劑。在另一種實施方案中，可以用酶完成去細胞。在某些實施方案中，酶可以選自包括但不限于以下酶的組分散酶II、胰蛋白酶和/或嗜熱菌蛋白酶或任何其它本領域技術人員公知的酶。這些酶可以與膠原和細胞間連接的不同成分反應。例如，分散酶II可以攻擊IV型膠原，IV型膠原是基底膜的致密層和錨定原纖維的成分。在另一實施方案中，嗜熱菌蛋白酶可以攻擊角質(zhì)形成細胞的基底層的半橋粒中的bulbous phemphigoid抗原。在進一步實施方案中，胰蛋白酶可以攻擊細胞之間的橋粒復合體。
在額外或替代的實施方案中，去細胞的異種移植物可以暴露于化學試劑以進行鞣制，或使細胞外蛋白內(nèi)的蛋白交聯(lián)，以便進一步消除或減少異種移植物中存在的免疫原性決定簇?？梢詫⑷魏西分苹蚪宦?lián)試劑用于該處理，可以進行一個以上交聯(lián)步驟，或可以用一種以上的交聯(lián)劑，以便確保完全交聯(lián)，因此，最佳地減少異種移植物的免疫原性。例如，可以用醛，如戊二醛、甲醛、己二醛等來交聯(lián)細胞外膠原。其它合適的交聯(lián)劑包括脂族和芳香二胺、碳二亞胺、二異硫氰酸酯等?；蛘?，可以將異種移植物暴露于蒸氣形式的交聯(lián)劑，包括，但不限于汽化的醛交聯(lián)劑，例如，汽化的甲醛。交聯(lián)反應應當持續(xù)，直到免疫原性決定簇基本從異種移植物組織除去，但反應應當在異種移植物的機械特性顯著改變之前終止。交聯(lián)劑可以是本領域技術人員公知的或此處描述的任何試劑。
在某些實施方案中，可以用來源于所述軟組織的基質(zhì)材料形成支架或修復裝置。可以將基質(zhì)材料轉(zhuǎn)化為干燥的多孔基質(zhì)，可以任選對其一部分進行交聯(lián)。修復裝置的多孔基質(zhì)促進細胞的向內(nèi)生長，所述細胞如半月板纖維軟骨細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和正常占據(jù)細胞外基質(zhì)并且合成和沉積細胞外基質(zhì)成分的其它細胞?？梢詫⒓毎饣|(zhì)纖維如膠原、彈性蛋白、網(wǎng)硬蛋白、其類似物及其混合物加入基質(zhì)材料。也可以從缺乏任何功能性α-1，3-gal表達的動物獲得這些纖維。在一種實施方案中，纖維可以在基質(zhì)中隨機定向?；蛘?，纖維可以基本向四周延伸，或基本通過在基質(zhì)中放射狀延伸定向?；|(zhì)的纖維密度可以是均勻或非均勻的。在非均勻構型中，可以在預期的高壓力點建立相對高密度的纖維。
基質(zhì)材料可以含有其它類型的材料，如上文所述的生物聚合物?；|(zhì)材料可以含有糖胺聚糖分子(GAGs)，例如，但不限于4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸皮膚素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸及其混合物，它們可以作為基質(zhì)材料的成分。此外，基質(zhì)材料可以含有在纖維中散布的GAGs。GAGs可以在纖維中作為各個分子均勻散布，或它們可以在裝置的不同區(qū)域以不同的量存在。
在另一種實施方案中，上文所述的從缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物形成的支架也可以含有細胞外基質(zhì)(ECM)成分。在一種實施方案中，所述ECM成分可以來源于缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達的動物。細胞外基質(zhì)材料可以來源于任何組織，包括，但不限于皮膚、泌尿組織、膀胱或器官粘膜下組織。支架可以作為修復裝置。可以從斷裂的ECM成分合成支架，或者，在優(yōu)選實施方案中，支架是通過天然組織的去細胞或加工而得到的，由此除去活細胞并且留下ECM作為預先形成的具有與天然組織相似的三維結(jié)構和纖維構型的支架。支架或裝置可以來源于從缺乏任何功能性α-1，3-Gal表達的動物的軟組織獲得的基質(zhì)材料。軟組織可以包括，但不限于真皮、器官粘膜下層(即，小腸粘膜下層(SIS))、從膝關節(jié)取出的外側(cè)半月板、從任何關節(jié)取出的關節(jié)軟骨、韌帶和/或腱，如跟腱?？梢园凑障挛乃鰧M織進行加工，以獲得基質(zhì)材料，如生物相容和可生物重吸收的纖維。
細胞外基質(zhì)(ECM)是圍繞和支持存在于哺乳動物組織內(nèi)的細胞的復雜結(jié)構實體。ECM也可以稱作結(jié)締組織。ECM包含結(jié)構蛋白，如膠原和彈性蛋白、特化的蛋白，如原纖蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白，以及蛋白聚糖。糖胺聚糖(GAGs)是形成ECM的非常復雜的高分子量成分的重復二糖單位的長鏈。這些二糖單位含有N-乙?；募禾前罚⑶姨峁櫥徒宦?lián)。GAGs的實例包括但不限于4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸皮膚素、硫酸肝素和透明質(zhì)酸。
表1由脊椎動物細胞產(chǎn)生的代表性基質(zhì)類型
膠原是動物界中最充足的蛋白。它是包含ECM的主要蛋白。存在至少12型膠原。I、II和III型是最充足的，并且形成具有相似結(jié)構的原纖維。IV型膠原形成二維的網(wǎng)狀物，并且是基底層的主要成分。膠原主要由成纖維細胞合成，但上皮細胞也合成這些蛋白。膠原的基本的更高級結(jié)構是長和細直徑的桿狀蛋白。例如，I型膠原的長度是大約300nm，直徑是1.5nm，由3個包含兩個α1(I)鏈和一個α2(I)鏈的卷曲的亞基組成。每條鏈由1050個以特征性右旋三螺旋彼此盤繞的氨基酸組成。每圈螺旋有3個氨基酸，第3個氨基酸是鳥嘌呤。膠原也富含脯氨酸和羥脯氨酸。三螺旋的外側(cè)存在脯氨酸的大pyrollidone環(huán)。膠原的三螺旋的外側(cè)相互作用導致直徑大約50nm的原纖維的形成。膠原的包裝使得相鄰的分子代替它們長度的大約四分之一(67nm)。這種交錯的陣列產(chǎn)生了可以在電子顯微機下觀察到的條紋狀效果。
膠原是作為稱作原膠原的更長的前體蛋白合成的。I型原膠原在N末端含有額外的150個氨基酸，在C末端含有額外的250個氨基酸。這些原結(jié)構域是球形的，并且形成多個鏈內(nèi)二硫鍵。二硫鍵穩(wěn)定蛋白原，使得形成三螺旋切面。膠原纖維開始在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基復合體組裝。除去信號序列，在膠原鏈中發(fā)生許多修飾。特定的脯氨酸殘基可以被脯氨酰4-羥化酶和脯氨酰3-羥化酶羥化。特定的賴氨酸殘基也可以被賴氨酰羥化酶羥化。脯氨酰羥化酶依賴于維生素C作為輔因子。O-連接的類型的糖基化也在高爾基體轉(zhuǎn)運過程中發(fā)生。在完成加工后，原膠原被分泌到細胞外空間中，由細胞外酶在此除去原結(jié)構域。然后，膠原分子聚合形成膠原原纖維。伴隨原纖維形成的是由細胞外酶-賴氨酰氧化酶對某些賴氨酸殘基的氧化，形成活性醛。這些活性醛在兩條鏈之間形成特異性交聯(lián)，從而穩(wěn)定原纖維中膠原的交錯陣列。
表2膠原的類型
纖連蛋白的作用是將細胞連接于多種細胞外基質(zhì)。纖連蛋白將細胞連接于除IV型膠原之外的所有基質(zhì)，IV膠原將層粘連蛋白作為粘附分子。纖連蛋白是兩個相似肽的二聚體。每條鏈的長度是大約60-70nm，厚度是2-3nm。已經(jīng)鑒定出至少20種不同的纖連蛋白鏈，它們由來自于單個纖連蛋白基因的一級轉(zhuǎn)錄物的可變RNA剪接產(chǎn)生。纖連蛋白含有至少6個緊密折疊的結(jié)構域，每個結(jié)構域具有對不同底物，如硫酸肝素、膠原(I、II和III型的獨立結(jié)構域)、纖維蛋白和細胞表面受體的高親和力。細胞表面受體結(jié)合域含有共有的氨基酸序列RGDS。
所有的基底層含有共同的一組蛋白和GAGs。這些是IV型膠原、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白和層粘連蛋白?；讓油ǔ７Q作IV型基質(zhì)?；讓拥拿糠N成分由存在于其上的細胞合成。層粘連蛋白將細胞表面錨定于基底層。
在一種實施方案中，上文描述的任何ECM成分或其組合都可以用于形成支架，該支架可以任選用作修復裝置。來源于ECM的支架可以替代地由來自于α1，3 gal敲除豬的組織的機械、化學或酶處理產(chǎn)生，使得所有細胞和碎片都被除去，留下非常適于宿主細胞募集和組織再生的纖維模式的ECM。由生物相容和可生物重吸收的纖維制造的支架或修復裝置可以手術植入位于受試者的兩個骨之間并且連接所述骨的區(qū)域，以便提供正常的運動和強度(對于手術植入，參見，例如，美國專利6,042,610，5,735,903，5,479,033，5,624,463，5,306,311，5,108,438，5,007,934和4,880,429)。修復裝置可以作為組織再生的支架，因為支架的物理特征促進新組織的向內(nèi)生長。這可以得到受試者宿主身體區(qū)域的復合材料，并且得到具有與天然身體區(qū)域基本相同的體內(nèi)外表面輪廓的修復裝置。
可以將該裝置植入位于受試者的兩個骨之間并且/或者連接所述骨的區(qū)域，由受試者身體區(qū)域形成的復合材料和裝置可以具有與受處理的天然區(qū)域基本相同的體內(nèi)外表面輪廓。該裝置可以建立適于纖維軟骨細胞、成纖維細胞或軟骨細胞(如半月板纖維軟骨細胞、脊椎動物纖維軟骨細胞等)向內(nèi)生長的生物相容和部分可生物重吸收的支架。支架與向內(nèi)生長的細胞一起可以支持區(qū)域中的天然負荷力。
在另一種實施方案中，提供了制造在體內(nèi)具有需要的形狀(如半月板的區(qū)段性缺損)的修復裝置的方法。該方法包括從缺乏任何功能性α-1，3-gal表達的動物的組織獲得纖維基質(zhì)材料，并且將該生物相容和部分可生物重吸收的纖維基質(zhì)置于限定需要的形狀的模具中(該模具限定裝置的外表面以補充需要的身體區(qū)域)。然后可以凍干纖維和/或與化學交聯(lián)劑接觸，使得纖維具有模具的形狀?；蛘?，在模塑完成后，可以切下在模具中形成的結(jié)構或基質(zhì)，使得其外表面與區(qū)段性缺損互補。該方法可以產(chǎn)生適于具有與半月板中的區(qū)段性缺損的外表面輪廓互補的外表面輪廓的基質(zhì)。該類型的基質(zhì)可以植入，以校正半月板的區(qū)段性缺損，或作為半月板擴大裝置，該基質(zhì)可以建立生物相容和至少部分可生物重吸收的支架，用于半月板纖維軟骨細胞的向內(nèi)生長，并且用于支持天然半月板負荷力。
4.硬和軟組織移植物在本發(fā)明的另一方面，提供了可以用于整形外科手術的骨腱骨移植物。骨腱骨移植物可以含有一個或多個骨塊和連接于骨決的腱。骨塊可以切割以提供足夠容納固定螺絲的溝。或者，提供含有一個或多個骨塊和連接于骨塊的腱的骨腱骨移植物，其中骨塊預先成形為銷釘。也提供了獲得骨腱骨移植物的方法，由此首先切下連接了腱或韌帶的第一個骨栓，然后切下連接了腱或韌帶的第二個骨栓；使得第一個骨栓和第二個骨栓來源于連續(xù)的骨材料，并且重疊，這樣第一個骨栓或第二個骨栓的切割在隨后切割的骨栓中形成了一個溝。
在其它實施方案中，提供了含有腱和一個骨塊的骨腱骨移植物。腱可以環(huán)繞骨，以建立可以與縫線保持在一起的腱、骨、腱層。其也可以含有腱的兩個拖曳部分，用于固定移植物。該類型的移植物可以增加組織強度，同時減少可能導致組織衰竭的剪切力，這是通過利用與腱運動相關的天然環(huán)狀滑動從而以滑輪型方式平衡相對力而實現(xiàn)的。
5.皮膚修復在本發(fā)明的進一步的方面，來自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的動物的硬和軟組織可以用于皮膚修復。
皮膚可以分為三層表皮、真皮和皮下層。表皮分為四層，從底到頂是基底細胞層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層。
表皮的基底細胞層含有分裂并分化為表皮中其它細胞的基底細胞和產(chǎn)生使皮膚帶有顏色的黑色素的黑色素細胞。棘層位于基底細胞層上，由角質(zhì)形成細胞，即產(chǎn)生一種蛋白-角蛋白的細胞組成。角蛋白是角質(zhì)層以及毛發(fā)和甲的重要成分。顆粒層中的細胞是扁平的，并且含有暗顆粒，該顆粒被排出，并且提供將細胞一起保持在覆蓋其的角質(zhì)層中的“水泥”。表皮的該最上層實際上是由填充了角蛋白的緊密包裝的死細胞層組成，其形成皮膚的主要物理屏障。角質(zhì)層在諸如承受每日的摩擦和撕扯的手掌和足底的區(qū)域中比身體其它部分中厚。表皮也含有朗格罕細胞，其作為皮膚抗感染防御的一部分。真皮-表皮連接處是表皮與真皮接觸的部位。基底膜區(qū)作為這兩層之間的“膠水”。
真皮分為上層的乳頭狀真皮和下層的網(wǎng)狀真皮。真皮的結(jié)構成分包括膠原、彈性纖維和基質(zhì)。神經(jīng)和血管也穿透真皮。皮膚附屬物是外泌汗腺和頂泌汗腺、毛囊、皮脂腺和甲。除甲外，所有的皮膚附屬物都位于真皮中。
汗液從外泌汗腺的釋放是身體冷卻的過程。汗液在真皮中的卷曲小管中產(chǎn)生，并且由汗液導管轉(zhuǎn)運通過真皮以便分泌。整個體表具有大約2百萬-3百萬個外泌汗腺，每天可以產(chǎn)生最多達10L汗液。
在人類中，頂泌汗腺沒有已知的功能，由于對我們的祖先有用，將其稱作痕跡汗腺。它們主要位于前臂和生殖區(qū)。同外泌汗腺類似，頂泌汗腺也在真皮中的卷曲小管中產(chǎn)生，但頂泌導管將汗液引流到毛囊中，在此處到達皮膚表面。
毛發(fā)由角蛋白組成，角蛋白也形成甲和真皮的頂層(角質(zhì)層)。位于毛發(fā)根的不同細胞產(chǎn)生角蛋白和使得毛發(fā)帶有顏色的黑色素。人類有兩類毛發(fā)絨毛(輕和細)和終毛(暗和厚)。皮脂腺分泌一種油性物質(zhì)，稱作皮質(zhì)，引流到毛囊的管道中到達皮膚表面?？傮w上，毛囊及其相關的皮脂腺稱作毛皮脂單位。毛囊在身體各處分布，手掌和足底除外。在人類中，毛發(fā)主要是裝飾作用，但也起保護作用。眉毛和睫毛保護眼睛防止灰塵和日光，而鼻毛阻斷外來物質(zhì)進入鼻子。頭發(fā)提供一些溫度絕緣。
皮脂腺產(chǎn)生一種油性物質(zhì)，稱作皮脂。它們在頭皮、面部和上軀干的皮膚中最明顯，而在手掌和足底則不存在。作為毛皮脂單位的一部分，皮脂腺分泌引流到毛囊管道中的皮脂，最終引流到皮膚表面。皮脂腺反應于青春期激素水平，特別是雄酮的升高而增大并產(chǎn)生更多的皮脂。它們在粉刺的產(chǎn)生中起重要作用。
皮下層位于真皮和下面的覆蓋肌肉的筋膜之間。該層由多組由纖維隔膜隔開的脂肪細胞組成。它起著三種主要作用使身體與寒冷隔絕，吸收創(chuàng)傷和緩沖更深層的組織，以及作為身體保留燃料的儲存庫。
甲是唯一不位于真皮而是位于手指和腳趾末端的皮膚附屬物。甲板由死的角蛋白組成，其形成大約0.3-0.65mm厚的保護結(jié)構。角蛋白通過表皮細胞的分裂在甲基質(zhì)中形成。甲床是緊密連接于甲板底部的上皮層。甲床的血管使得甲表現(xiàn)為粉紅色。近端的甲襞或外皮保護甲的基底部免受致微感染生物的感染。甲的平均生長速度是每天0.1mm，趾甲比指甲生長慢。
在進一步的實施方案中，可以將來自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的硬和軟組織用于皮膚修復。來源于所述動物的任何成分或皮膚成分的組合可以用于包括，但不限于，表皮組織、基底細胞層、棘層、顆粒層、角質(zhì)層、真皮組織、上乳頭狀真皮組織、下網(wǎng)狀真皮組織、膠原、彈性纖維、基質(zhì)、外泌汗腺、頂泌汗腺、毛囊、皮脂腺、甲、毛發(fā)和皮下組織。所述組織可以用于修復人類皮膚，例如，修復皮膚的深層組織燒傷。
皮膚組織包括，但不限于真皮或表皮組織或其衍生物。皮膚下是脂肪性的皮下組織。在一種實施方案中，皮膚異種移植物可以包括表皮。在另一種實施方案中，皮膚異種移植物可以包括表皮和真皮。真皮可以以多種厚度提供，如1、5、10或20mm。此外，提供了包含表皮、真皮和皮下組織的皮膚移植物。在一種實施方案中，包含表皮、真皮和皮下組織的皮膚移植物可以用于置換覆蓋骨區(qū)或覆蓋腱的皮膚。
在另一種實施方案中，以天然形式或去細胞的形式使用皮膚組織，作為轉(zhuǎn)子套修復或置換、腹內(nèi)壁修復、婦產(chǎn)或泌尿組織修復的支架、作為修復或置換韌帶或腱的過程的一部分或用于其它軟組織應用(例如表6中的描述)。皮膚組織異種移植物可以是永久的置換物或作為臨時置換物，直到患者可以再次長出新的皮膚。在一種實施方案中，皮膚移植物可以用作臨時替代物。臨時皮膚替代物可以愈合部分厚度的燒傷，促進傷口愈合和防止感染，并且可以在患者不夠健康因此不能進行重建手術時使用。在另一種實施方案中，提供了永久皮膚移植物。
在進一步的實施方案中，提供了不同類型的皮膚異種移植物。在一種實施方案中，移植物是部分厚度的移植物。部分厚度的移植物可以僅僅包括真皮，帶有一部分表皮，并且可以在燒傷或大傷口上使用。在另一種實施方案中，移植物是完整厚度的移植物。完整厚度的移植物可以包括表皮和真皮，并且可以用于覆蓋小區(qū)域。在進一步的實施方案中，移植物可以是帶蒂皮瓣或移植物。帶蒂皮瓣或移植物可以包括表皮、真皮和皮下組織。帶蒂皮瓣或移植物可以用于覆蓋需要額外手術來修復骨、腱或神經(jīng)組織的傷口或其它區(qū)域。
6.內(nèi)部組織修復在本發(fā)明的另一方面，來自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的硬和軟組織可以用于內(nèi)部組織修復，如疝修復、腱滑輪、滑動表面、血管吻合、心臟瓣膜修復或置換和硬腦膜修復。內(nèi)部組織包括心包組織、心臟瓣膜和粘膜下組織。在一種實施方案中，粘膜下組織可以用于修復或置換結(jié)締組織。
在另一種實施方案中，從來源于動物器官粘膜下層，優(yōu)選來自α1，3GT敲除豬的器官粘膜下層的分層剝離的區(qū)段制備異種移植物組織。在一種優(yōu)選實施方案中，粘膜下層來源于動物的腸組織。區(qū)段可以包括粘膜下層和粘膜的基底組織，通常包括粘膜肌層和致密層。粘膜下層和基底粘膜組織可以從腸組織段的粘膜肌層和粘膜的腔部分分層剝離。該加工可以得到三層的腸組織區(qū)段，其是管狀的、非常堅韌的、纖維狀的膠原材料(參見，例如，美國專利Nos.4,902,508和4,956,178)。在另一實施方案中，從成熟動物，如重量是400-600磅的母豬提取該組織。三層的腸區(qū)段可以用于形成異種移植物或可以對其進行縱切或側(cè)切以形成長的組織區(qū)段。以任意形式，所述區(qū)段具有中間部分和相對末端部分以及相對外側(cè)部分，可以形成這些部分，以便用手術可接受的技術與存在的生理結(jié)構手術連接(也參見美國專利No.5,372,821)。在相關的實施方案中，軟組織來源于真皮或皮膚組織，其也可以形成或切割，并且用于與存在的生理結(jié)構進行手術連接。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了制備或加工用于移植到人的軟組織的方法?？梢詮膭游锏娜魏谓M織取出組織的完整部分。在一種實施方案中，可以從動物取出完整的心臟，然后可以切除心臟瓣膜組織，或可以獲得心包。在其它實施方案中，組織可以包括，但不限于，上皮、結(jié)締組織、血液、骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)、腺樣組織、脂肪、網(wǎng)形組織、骨、褐色脂肪、骨松質(zhì)、肌肉、cartaginous、海綿組織、軟骨樣組織、嗜鉻組織、肉膜組織、彈性組織、上皮組織、脂肪組織、透明纖維組織、纖維組織、Gamgee組織、凝膠狀組織、顆粒組織、腸道相關淋巴樣組織、Haller氏血管、硬造血組織、未分化組織、間質(zhì)組織、包被組織、胰島、淋巴組織、淋巴樣組織、間充質(zhì)組織、中腎組織、粘液結(jié)締組織、多腔脂肪組織、骨髓組織、鼻根點組織、生腎組織、結(jié)節(jié)組織、骨組織、成骨組織、骨樣組織、頂體周圍組織、網(wǎng)狀組織、網(wǎng)形組織、橡皮組織、骨骼肌、平滑肌和皮下組織。
在一種實施方案中，可以從新處死的動物收集組織?；蛘?，可以從活動物手術取出組織。在一種實施方案中，取出組織后，可以將其置于合適的無菌等滲溶液或其它組織保存溶液中。屠宰動物后對組織的獲取可以在屠宰后盡早進行，并且可以在低溫下進行。例如，約5℃-約20℃，約0℃-約20℃，約0℃-約10℃或約0℃-約25℃?？梢越馄食霁@取的組織和瓣膜，使其不帶有周圍的組織。在一種實施方案中，可以解剖出組織或心臟瓣膜或其部分，使其不帶有粘附的組織、斑塊、鈣化等?；蛘?，可以解剖出帶有部分周圍組織的組織或瓣膜。
在一種特定實施方案中，可以切下作為獨立小葉的三尖瓣。在另一種實施方案中，可以切下作為完整瓣膜的三尖瓣，其包括圍繞房室孔的纖維環(huán)和腱索。在另一種實施方案中，在解剖瓣膜后，可以用支架、環(huán)等支持瓣膜或瓣膜部分。在另一種實施方案中，可以根據(jù)本領域技術人員熟知的程序獲取腹膜或心包，以形成心臟瓣膜異種移植物或基質(zhì)材料(例如，參見Lauren的美國專利No.4,755,593)。
可以將軟組織異種移植物用于多種應用中，用于修復或重建人體部分，例如，表6中描述的那些。
心臟瓣膜在一種實施方案中，從缺乏任何α-1，3-Gal表達的動物提取心臟瓣膜。來自缺乏任何功能性α-1，3-Gal表達的動物的牛、羊或豬心臟，特別是豬心臟可以作為心臟瓣膜的來源。心臟瓣膜包含纖維軟骨細胞和膠原、彈性纖維以及多種蛋白聚糖組成的細胞外基質(zhì)。心臟瓣膜的類型包括，但不限于二尖瓣、心房瓣、主動脈瓣、三尖瓣、肺動脈瓣、肺動脈斑(plumonic patch)、胸主動脈降支、主動脈非瓣膜導管、具有LPA和RPA的肺動脈非瓣膜導管、具有或不具有完整尖端的右或左肺半動脈、隱靜脈、髂動脈、股靜脈、股動脈和/或半月瓣。在某些實施方案中，可以用工具將心臟瓣膜修復物固定于動脈壁。工具可以包括扣件和/或加強物。在特定實施方案中，心臟瓣膜修復物可以具有柔性小葉。在一種實施方案中，可以從天然材料如組織、合成材料如聚合物或其組合構建心臟瓣膜修復物。在另一種實施方案中，瓣膜修復物可以是組織瓣膜，并且可以額外包括支架，或不含支架，并且可以是豬、牛或其它動物組織來源的。根據(jù)本發(fā)明制備的心臟瓣膜異種移植物可以具有天然心臟瓣膜異種移植物的普通外觀。心臟瓣膜異種移植物也可以是瓣膜區(qū)段，如各個小葉，每個小葉可以植入受體心臟?；蛘撸梢杂秘i心包形成本發(fā)明的心臟瓣膜異種移植物。
心臟是中空的肌肉器官，其通過有節(jié)律的收縮使血液循環(huán)通過動物身體。在哺乳動物中，心臟具有四個室，其定位使得右心房和心室與左心房和心室完全分開。正常情況下，血液從體靜脈流入右心房，然后流入右心室，從右心室經(jīng)肺動脈驅(qū)動到肺。當從肺返回時，血液進入左心房，然后流入左心室，從左心室驅(qū)動到體動脈中。
四個主要的心臟瓣膜防止節(jié)律收縮時血液倒流三尖瓣、肺動脈瓣、二尖瓣和主動脈瓣。三尖瓣分隔右心房和右心室，肺動脈瓣分隔右心房和肺動脈，二尖瓣分隔左心房和左心室，主動脈瓣分隔左心室和主動脈。通常，具有心臟瓣膜異常的患者的特征在于具有瓣膜性心臟病。
由于不能正常打開(狹窄)或滲漏(反流)，心臟瓣膜可以出現(xiàn)功能障礙。例如，具有主動脈瓣功能障礙的患者可以診斷為具有主動脈瓣狹窄或主動脈瓣反流。在任何一種情況下，通過手術方法進行的瓣膜置換是可能的治療。置換瓣可以是自體移植物、同種異體移植物或異種移植物，以及機械瓣或部分由豬瓣膜制造的瓣。有趣的是，冷凍保存的同種異體移植物在移植后多年中在受體患者內(nèi)保持存活。不幸的是，置換瓣容易出現(xiàn)諸如變性、血栓形成和鈣化的問題。
本發(fā)明的心臟瓣膜異種移植物或其區(qū)段可以由本領域技術人員采用公知的手術技術，如通過打開心臟的手術，或最小介入的技術，如內(nèi)窺鏡手術和經(jīng)腔植入而植入受損的人或動物心臟。進行所述手術技術的特定儀器是本領域公知的，其確保心臟瓣膜植入物的準確和可重復的植入。
在特定實施方案中，作為修復物的心臟瓣膜可以用于具有多種形式的心臟和/或瓣膜疾病的患者?？梢詮目沙鍪壑亓康呢i(例如，超過120kg的豬)獲得豬心臟。在無菌磷酸緩沖液中清洗后，可以現(xiàn)場解剖心臟(除去心尖)并且于4℃在無菌PBS中運輸。所有心臟可以到達加工中心，例如，在動物屠宰后24小時內(nèi)到達?？梢越馄手鲃用}和肺動脈瓣的根部。在特定實施方案中，這些組織可以進行減少生物負載的步驟，包括48℃下在抗生素和抗真菌藥的混合物中溫育大約48小時。去感染的組織可以冷凍保存(例如在10％(v/v)DMSO和10％(v/v)胎牛血清中，-1℃/分鐘)或可以通過包括用低滲培養(yǎng)基處理，然后用脫氧核糖核酸酶I和核糖核酸酶A的混合物消化的程序去細胞。12天后，可以冷凍保存或化學固定去細胞的瓣膜，例如，在磷酸緩沖液(pH7.4)中2mmHg的0.35％(w/v)戊二醛中總共固定7天(低壓固定確保維持膠原基質(zhì)天然皺褶的維持)。在一種實施方案中，固定的組織不進行冷凍保存，但可以儲存在交聯(lián)固定溶液中，如戊二醛溶液(如0.35％的戊二醛)中。
基于組織的瓣膜修復物可以保持其天然形式的結(jié)構元件，如小葉，和/或通過不同片組織的組裝，結(jié)構元件可以摻入修復物。例如，瓣膜修復物可以從豬心臟瓣膜、從牛心包或從其組合組裝。可以用此處描述的工具將豬組織瓣膜，例如St.Jude Medical，Inc.St.Paul，Minn.出售的Toronto SPVTM瓣膜植入患者。Toronto SPV.RTM瓣膜設計用于植入主動脈瓣位置，例如，參見David et al.，J.Heart Valve Dis.1244-248(1992)。本發(fā)明的工具適用于任何瓣膜，特別是適于植入患者的任何組織瓣膜修復物。
心臟瓣膜修復物包括獲取的組織瓣膜，如交聯(lián)的豬瓣膜。修復物可以進一步包括縫合覆蓋物。瓣膜可以具有三個小葉，其通常包括圓柱形底和三個支持小葉的合縫處。
在進一步的實施方案中，可以用扣件將心臟瓣膜，如主動脈瓣修復物固定到血管壁?？奂ǔＴ谛呐K瓣膜修復物的植入程序中固定到血管壁?？奂梢跃哂信c針頭或釘子相似的形狀，但也可以具有多個鋒利的尖端。此外，扣件可以具有一個或多個位于扣件尖端附近的倒鉤?？奂梢园ㄉ扉L的具有尖端的部分?？奂部梢栽谂c尖端相對的末端具有任選的頭。在其它實施方案中，倒鉤可以位于尖端處或附近?？奂梢园▋蓚€或更多個從扣件的相同或不同側(cè)延伸的倒鉤?？梢杂蒙锵嗳菪圆牧闲纬煽奂？奂膬?yōu)選生物相容性材料產(chǎn)生例如耐久性、機械強度和柔性/剛性方面的需要的機械特性。扣件可以具有足夠的剛性，以便當醫(yī)生施加壓力插入扣件時保持其形狀。當施加壓力插入時，不具有足夠剛性的扣件可能彎曲。只要扣件能夠穿透材料，一定程度的彎曲是可以忍受的。不具有足夠剛性的扣件可能不能正確插入，從而使得修復物受損、主動脈壁受損、修復物的不適當連接和/或交叉夾緊次數(shù)增加的傾向增加。植入后，扣件可以保留在患者中，以便在修復物的壽命期內(nèi)固定瓣膜修復物，或如果將可生物重吸收的材料用于扣件，至少保留到愈合過程通過細胞生長將瓣膜固定到血管上?？梢杂美缃饘?、陶瓷、聚合物或其組合制造扣件。合適的金屬包括，例如，鈦和不銹鋼。合適的陶瓷包括，例如，羥磷灰石，如骨碎片、碳材料，如石墨，以及礬土。合適的聚合物包括具有足夠剛性的聚合物，如聚醚醚酮(PEEK)?？奂部梢杂芍T如上文描述的可生物重吸收的聚合物制成，使得在足夠的組織再生以便在沒有扣件的情況下固定瓣膜修復物后，扣件隨時間被重吸收。
扣件的長度可以是大約2毫米(mm)-大約8mm，例如，大約4mm-大約7mm。在一種實施方案中，扣件的伸長的部分的直徑可以小于大約2mm，例如，大約0.2mm-大約1.5mm，或大約0.2mm-大約1mm。
在其它實施方案中，將心臟瓣膜修復物連接于血管壁的方法可以基于扣件和上文描述的加強物。加強物自身可以用扣件或其它裝置固定?？梢耘渲每奂员阃瑫r固定所有元件，或在最后配置扣件之前，一種或多種成分可以彼此連接，或與瓣膜修復物連接。
在一種實施方案中，可以在例如打開心臟的程序中將心臟瓣膜插入心臟。在一種實施方案中，可以通過給受試者，如人患者或靈長類動物或其它大動物模型如羊提供合適的生命支持和通過打開胸腔使得可以接近心臟而起始該過程。然后，可以進行主動脈橫切術，使得能夠通過血管如主動脈接近天然瓣膜。在一種實施方案中，血管是主動脈，打開主動脈的位置可以取決于修復物的精確結(jié)構。對于典型的修復物，通?？梢栽诰嚯x竇管(sinotubular)連接處大約1cm的部位切割主動脈。切除受損或病變的天然瓣膜，優(yōu)選一起切除所有的鈣和鈣化碎片。主動脈瓣修復物可以置于主動脈環(huán)(即主動脈連接心臟的略微縮窄處)和竇管連接處(即緊接冠狀動脈下游的主動脈的略微縮窄處)之間。但是，修復物可以延伸超過主動脈環(huán)和/或竇管連接處。對于在主動脈環(huán)處的放置，修復物可以沿切斷的主動脈呈降落傘狀向下。
在額外的實施方案中，心臟瓣膜修復物可以位于植入的部位，鄰近合適的脈管系統(tǒng)，例如，主動脈。在一種實施方案中，可以縫合瓣膜的流入緣或在用此處描述的扣件固定流出緣之前進行固定，但流入緣也可以在流出緣之后固定。此外，可能需要在施加此處描述的扣件之前釘住合縫處。在特定實施方案中，扣件、加強物(如果有)和修復物在植入程序起始時可以是分開的?；蛘?，可以預先組裝各元件。在另一種實施方案中，一旦正確排列了修復物，可以將加強物放置到位，并且可以通過修復物和通過主動脈壁，依次將扣件插入加強物的孔中。當通過一個加強物將所有扣件插入時，用扣件相似地固定任何額外的加強物。可以用指壓、鉗子、推進工具、錘等插入扣件?？梢允褂锰貏e地與扣件的頭吻合的特定的鉗子。如果沒有加強物，將扣件置于需要的位置，類似地，通過修復物和主動脈壁插入。
在一些實施方案中，可以在植入程序開始之前將扣件插入加強物?？梢詫⒓訌娢锾峁┙o外科醫(yī)生，通過或部分通過加強物中的孔插入扣件。在這些實施方案中，扣件的頭或鈍端可以從加強物的表面伸出。這樣，相對于在程序開始前所有的成分都分開的程序來說，該程序可以在某種程度上簡化。在這些實施方案中，一旦修復物在血管中正確定位，可以在需要的位置排列具有扣件的加強物，可以推動扣件通過修復物和通過主動脈壁，從而直接配置扣件。可以依次插入扣件，以此方法固定多個加強物。
在替代的實施方案中，可以在植入程序開始前將一個或多個加強物連接于修復物?？梢杂芍圃焐虒⒓訌娢锕潭ㄓ谛迯臀??？梢杂每p線、生物相容性粘合劑或其它合適的扣件將加強物固定到修復物。合適的生物相容性粘合劑包括，例如，纖維蛋白膠和其它手術膠。一旦將修復物正確定位，可以依次或同時將扣件放置在加強物中的孔內(nèi)，并且通過修復物和主動脈的壁插入。可以持續(xù)進行該步驟直到配置了所有的扣件。
在其它實施方案中，可以提供修復物，其中在合適的位置具有加強物，并且在加強物中插入了扣件?？梢圆捎媒?jīng)過加強物和至少部分經(jīng)過修復物插入的扣件將加強物固定于修復物?；蛘?，可以用縫線、粘合劑或其它扣件將加強物固定于修復物。一旦修復物位于動物或患者中的合適位置，每個扣件可以被推動通過血管壁，以便固定修復物。在其它實施方案中，可以將有效而簡單的常規(guī)縫線作為扣件。
7.異種移植物的其它應用在本發(fā)明的進一步的方面，來源于缺乏功能性α-1，3-GT表達的動物的組織產(chǎn)品可以用于重建人類的身體部分。在某些實施方案中，可以按照例如表6的描述使用去細胞的或有細胞的皮膚組織、骨、韌帶、腱、心臟瓣膜、髓核、軟骨、半月板、血管、心包或此處描述的其它組織。在特定實施方案中，可以將組織用于人類整形外科重建或修復，如轉(zhuǎn)子套修復、人類皮膚修復和/或人類軟組織修復。可以在多種動物模型中檢驗異種移植物，如靈長類或非靈長類動物，如羊模型。
可以用通常用于組織移植物應用的常規(guī)手術程序應用異種移植物。在一種實施方案中，例如，用于非血管組織移植物應用時，管狀移植物材料可以縱切并且鋪開，以形成組織“斑片”。在另一種實施方案中，可以在組織，如腸組織的“斑片”上進行組織分層，所述斑片是通過縱切腸段，并且將其“鋪開”以形成移植前斑片而制備的。制備的移植物組織斑片例如可以用作皮膚移植物材料，用于硬腦膜修復或用于修復其它身體組織缺損，所述缺損導致其自身需要具有該移植物組合物的物理和功能特征的組織移植物斑片的手術應用。
II.缺乏任何功能性α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物提供了來自缺乏任何功能性α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的組織。在一種實施方案中，動物是豬。在另一種實施方案中，動物是?；蜓?。在其它實施方案中，提供了這樣的動物，其中通過基因靶定事件滅活了α-1，3-GT基因的一個等位基因。在本發(fā)明的另一方面，提供了這樣的動物，其中通過基因靶定事件滅活了α-1，3-GT基因的兩個等位基因。在一種實施方案中，可以通過同源重組靶定基因。在其它實施方案中，可以破壞基因，即，可以改變遺傳密碼的一部分，從而影響基因該片段的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，通過取代、缺失(“敲除”)或插入(“敲入”)技術，可以發(fā)生基因的破壞。也可以插入調(diào)節(jié)存在的序列轉(zhuǎn)錄的所需蛋白或調(diào)節(jié)序列的其它基因。
除了古代猴和人，具有α-1，3-GT基因的兩個無活性等位基因的動物，如豬，不是天然存在的。出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在試圖通過基因靶定事件敲除α-1，3-GT基因的第二個等位基因時，鑒定了使第二個等位基因無活性的點突變。
因此，在本發(fā)明的另一方面，可以通過至少一個點突變使α-1，3-GT基因無活性。在一種實施方案中，可以通過至少一個點突變使α-1，3-GT基因的一個等位基因無活性。在另一實施方案中，可以通過至少一個點突變使α-1，3-GT基因的兩個等位基因都無活性。在一種實施方案中，可以通過基因靶定事件發(fā)生該點突變。在另一種實施方案中，該點突變可以是天然存在的。在一種特定實施方案中，點突變可以是位于α-1，3-GT基因的外顯子9的第二個堿基的T到G的突變。攜帶α-1，3-GT基因中天然存在的點突變的豬能夠產(chǎn)生不具有抗生素抗性基因的α1，3 GT缺陷的豬，因此具有制備用于人類的更安全產(chǎn)品的潛能。在其它實施方案中，可以存在至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少10個或至少20個點突變，使得α-1，3-GT基因無活性。在其它實施方案中，提供這樣的豬，其中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都含有防止任何功能性α-1，3-GT表達的點突變。在一種特定實施方案中，提供了這樣的豬，其在α-1，3-GT基因的兩個等位基因都含有發(fā)生在外顯子9的第二個堿基的T到G的突變。
本發(fā)明的另一方面提供了這樣的動物，其中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都被滅活，從而通過基因靶定事件滅活了一個等位基因，通過天然存在的點突變滅活了另一個等位基因。在一種實施方案中，提供了豬動物，其中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都被滅活，從而通過基因靶定事件滅活了一個等位基因，由于在外顯子9的第二個堿基存在T到G的點突變滅活了另一個等位基因。在一個特定實施方案中，提供了豬動物，其中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都被滅活，從而通過針對外顯子9的靶定構建體滅活了一個等位基因，由于在外顯子9的第二個堿基存在T到G的點突變滅活了另一個等位基因。
α-1，3-GT基因的基因靶定可以進行遺傳修飾的動物細胞可以獲自多種不同的器官和組織，例如，但不限于皮膚、間充質(zhì)、肺、胰腺、心臟、腸、胃、膀胱、血管、腎、尿道、生殖器官和完整或部分胚、胎或成年動物的解聚的制備物。在本發(fā)明的一種實施方案中，細胞可以選自，但不限于上皮細胞、成纖維細胞、神經(jīng)細胞、角質(zhì)形成細胞、造血細胞、黑色素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞(B和T)、巨噬細胞、單核細胞(monocytes、mononuclear cells)、心肌細胞、其它肌細胞、顆粒細胞、卵丘細胞、表皮細胞、內(nèi)皮細胞、胰島細胞、血細胞、血前體細胞、骨細胞、骨前體細胞、神經(jīng)元干細胞、原始干細胞、肝細胞、角質(zhì)形成細胞、臍靜脈內(nèi)皮細胞、主動脈內(nèi)皮細胞、微血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、肝星形細胞、主動脈平滑肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)元、庫否氏細胞、平滑肌細胞、施旺細胞和上皮細胞、紅細胞、血小板、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性細胞、嗜堿性細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、胰島細胞、甲狀腺細胞、甲狀旁腺細胞、腮腺細胞、腫瘤細胞、膠質(zhì)細胞、星形細胞、紅細胞、白細胞、巨噬細胞、上皮細胞、體細胞、垂體細胞、腎上腺細胞、毛細胞、膀胱細胞、腎細胞、視網(wǎng)膜細胞、視桿細胞、視錐細胞、心臟細胞、起搏細胞、脾細胞、抗原呈遞細胞、記憶細胞、T細胞、B細胞、漿細胞、肌細胞、卵巢細胞、子宮細胞、前列腺細胞、陰道上皮細胞、精細胞、睪丸細胞、生殖細胞、卵細胞、睪丸間質(zhì)細胞、管周細胞、足細胞、黃體細胞、宮頸細胞、子宮內(nèi)膜細胞、乳腺細胞、卵泡細胞、粘液細胞、纖毛細胞、未角化的上皮細胞、角化的上皮細胞、肺細胞、杯細胞、柱狀上皮細胞、鱗狀上皮細胞、骨細胞、成骨細胞和破骨細胞。
在一種替代的實施方案中，可以使用胚胎干細胞?？梢允褂门咛ジ杉毎祷蛘呖梢詮闹T如豬動物的宿主新鮮獲得胚胎干細胞。細胞可以在合適的成纖維細胞飼養(yǎng)層上生長或者在白血病抑制因子(LIF)存在下生長。在一種優(yōu)選實施方案中，細胞可以是成纖維細胞；在一種特定實施方案中，細胞可以是胎成纖維細胞。成纖維細胞是優(yōu)選的體細胞類型，因為它們可以從發(fā)育中的胚胎和成年動物中大量獲得。這些細胞在體外容易繁殖，具有迅速的加倍時間，并且可以無性繁殖，用于基因靶定程序中。
靶定構建體同源重組同源重組允許內(nèi)源基因中的定點修飾，因此，可以將這種新的改變工程化到基因組中。在同源重組中，進入的DNA與基因組中含有基本同源的DNA序列的位點相互作用，并且整合到該位點。在非同源(“隨機”或“非慣例”)整合中，進入的DNA不存在于基因組中同源序列的位置，而是整合到其它位置，位于許多可能的位置之一。概言之，用高級紅細胞進行的研究發(fā)現(xiàn)同源重組的頻率遠遠低于隨機整合的頻率。這些頻率的比值直接表明了依賴于通過同源重組進行的整合的“基因靶定”(即外源“靶定DNA”和基因組中相應的“靶DNA”之間的重組)。
許多文章描述了在哺乳動物細胞中使用同源重組。這些文章的示例是Kucherlapati et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813153-3157，1984；Kucherlapati et al.，Mol. Cell.Bio.5714-720，1985；Smithies et al，Nature 317230-234，1985；Wake et al.，Mol.Cell. Bio.82080-2089，1985；Ayares et al.，Genetics 111375-388，1985；Ayares etal.，Mol.Cell.Bio.71656-1662，1986；Song et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846820-6824，1987；Thomas et al. Cell 44419-428，1986；Thomasand Capecchi，Cell 51503-512，1987；Nandi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853845-3849，1988；和Mansour et al.，Nature 336348-352，1988.Evans and Kaufman，Nature 294146-154，1981；Doetschmanet al.，Nature 330576-578，1987；Thoma and Capecchi，Cell 51503-512，4987；Thompson et al.，Cell 56316-321，1989。
本發(fā)明的一方面使用同源重組來滅活細胞，如上文描述的細胞中的α-1，3-GT基因。DNA可以包含特定基因座上的至少一部分基因，其中在天然基因的至少一個拷貝，任選兩個拷貝中導入了改變，以防止功能性α1，3 GT的表達。改變可以是插入、缺失、取代或其組合。當將改變導入僅僅一個拷貝的被滅活基因時，擴增具有單個突變拷貝的靶基因的細胞，并且可以進行第二個靶定步驟，其中改變可以與第一個改變相同或不同，通常是不同的，并且其中涉及缺失或取代，可以與最初導入的改變的至少一部分重疊。在第二個靶定步驟中，可以使用具有相同同源臂，但含有不同哺乳動物選擇標記的靶定載體。篩選得到的轉(zhuǎn)化體中不存在功能性靶抗原的那些，并且可以進一步篩選細胞的DNA，以確保不存在野生型靶基因?；蛘?，通過對突變而言是雜合的宿主進行配種，可以獲得表型方面的純合性。
靶定載體可以通過將DNA導入細胞而產(chǎn)生細胞中被靶定的基因座的修飾，其中所述DNA與靶基因座具有同源性，并且包括標記基因，使得能夠選擇包含整合的構建體的細胞。靶載體中的同源DNA將與靶基因座上的染色體DNA重組。標記基因兩側(cè)的側(cè)翼可以是同源DNA序列、3’重組臂和5’重組臂。本領域描述了構架靶定載體的方法，例如，Dai etal.，Nature Biotechnology 20251-255，2002；WO 00/51424。
可以制備多種用于靶基因座的同源重組的構建體。構建體可以包括與靶基因座同源的至少50bp，100bp，500bp，1kbp，2kbp，4kbp，5kbp，10kbp，15kbp，20kbp或50kbp的序列。該序列可以包括豬α-1，3-GT基因的任何連續(xù)的序列(參見，例如，GenBank Acc.No.L36152，University of Pittsburgh of the Commonwealth System of HigherEducation的W0 0130992；Alexion，Inc.的WO 01/123541)。
在確定靶DNA序列的同源性程度中涉及多種考慮，例如，靶基因座的大小、序列的可接近性、靶基因座上雙交換事件的相對頻率和靶序列與其它序列的相似性。
靶定DNA可以包括這樣的序列，其中基本上等基因的DNA位于用要修飾的基因組中相應的靶序列進行的需要的序列修飾側(cè)翼?；旧系然虻男蛄锌梢耘c相應的靶序列(除了需要的序列修飾)具有至少大約95％，97-98％，99.0-99.5％，99.6-99.9％或100％的同一性。靶定基因和靶基因優(yōu)選可以共有至少約75、150或500個堿基對的具有100％同一性的DNA段。因此，靶定DNA可以來源于與被靶定的細胞系密切相關的細胞；或靶定DNA可以來源于與被靶定的細胞相同的細胞系或動物的細胞。
可以設計DNA構建體來修飾內(nèi)源的靶α1，3GT。用于靶定該構建體的同源序列可以具有一個或多個缺失、插入、取代或其組合。改變可以是插入符合讀框地與靶基因的上游序列融合的選擇標記基因。
合適的選擇標記基因包括，但不限于賦予在某些培養(yǎng)基底物上生長的能力的基因，如tk基因(胸苷激酶)或賦予在HAT培養(yǎng)基(次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)上生長的能力的hprt基因(次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)；使得能夠在MAX培養(yǎng)基(霉酚酸、腺嘌呤和黃嘌呤)上生長的細菌gpt基因(鳥嘌呤/黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)。參見例如Song，K-Y.，et al.Proc.Nat′1 Acad.Sci.U.S.A.846820-6824(1987)；Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，Chapter16。選擇標記的其它實例包括賦予對諸如抗生素的化合物的抗性的基因、賦予在選擇的底物上生長的能力的基因、編碼產(chǎn)生可檢測的信號如熒光的蛋白，如綠色熒光蛋白、增強的綠色熒光蛋白(eGFP)的基因。多種這樣的標記是公知并且可獲得的，包括，例如，抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因(neo)(Southern，P.，and P.Berg，J.Mol.Appl.Genet. 1327-341(1982))和潮霉素抗性基因(hyg)(Nucleic AcidsResearch 116895-6911(1983)，和Te Riele，H.，et al.，Nature 348649-651(1990))。其它選擇標記基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、辣根過氧化物酶(HRP)、熒光素酶(Luc)、胭脂堿合酶(NOS)、章魚堿合酶(OCS)及其衍生物。存在多種選擇標記，其賦予對氨芐青霉素、博萊霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲喋呤、phosphinothricin、嘌呤霉素和四環(huán)素的抗性。
用于摻入抗生素抗性基因和負選擇因子的方法是本領域技術人員熟悉的(參見，例如，WO 99/15650；美國專利No.6,080,576；美國專利No.6,136,566；Niwa et al.，J.Biochem。113343-349(1993)；和Yoshida et al.，Transgenic Research 4277-287(1995))。
也可以使用選擇標記的組合。例如，對于靶α1，3GT，可以將neo基因(有或沒有其自身的啟動子，如上文的討論)克隆到與α-1，3-GT基因同源的DNA序列中。為了使用標記的組合，可以克隆HSV-tk基因，使得它位于靶定DNA外(如果需要，可見將另一選擇標記置于對側(cè))。將DNA構建體導入要靶定的細胞后，可以用合適的抗生素選擇細胞。在該特定實例中，抗G418和更昔洛韋的細胞最容易通過同源重組而出現(xiàn)，在所述同源重組中，neo基因被重組到α-1，3-GT基因中，但丟失了tk基因，因為它位于雙交換區(qū)外。
缺失可以是至少約50bp，更通常是至少約100bp，通常不超過約20kbp，其中正常情況下缺失可以包括編碼區(qū)的至少一部分，其包括一個或多個外顯子的一部分、一個或多個內(nèi)含子的一部分，并且可以包括或不包括側(cè)翼的非編碼區(qū)，特別是5’非編碼區(qū)(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū))的一部分。因此，同源區(qū)可以延伸超過編碼區(qū)進入到5’非編碼區(qū)或進入3’非編碼區(qū)。插入通常不超過10kbp，一般不超過5kbp，通常是至少50bp，更常見是至少200bp。
同源區(qū)可以包括突變，其中突變可以通過提供移碼或改變關鍵氨基酸而進一步滅活靶基因，或者突變可以校正功能異常的等位基因等。突變可以是微小改變，不超過同源側(cè)翼序列的約5％。當需要基因突變時，標記物基因可以被插入內(nèi)含子或外顯子。
可以根據(jù)本領域公知的方法制備構建體，可以將多個片段一起導入合適的載體，進行克隆、分析，然后進一步操作，直到獲得需要的構建體。可以對序列進行多種修飾，以便進行限制分析、切割、鑒定探針等。可以按照需要導入沉默突變。在多個階段，可以采用限制分析、測序、用聚合酶鏈反應擴增、引物修復、體外誘變等。
可以用包括原核復制系統(tǒng)，如大腸桿菌可識別的起點的細菌載體制備構建體，在每個階段可以克隆和分析該構建體?？梢圆捎门c用于插入的標記相同或不同的標記，該標記可以在導入靶細胞之前除去。一旦完成了含有構建體的載體，可以對其進行進一步操作，如去除細菌序列、線性化、在同源序列中導入短的缺失。在最終操作后，可以將構建體導入細胞。
本發(fā)明進一步包括含有α-1，3-GT基因的序列的重組構建體。構建體包含載體，如質(zhì)粒或病毒載體，其中以正向或反向插入了本發(fā)明的序列。構建體也可以包含調(diào)節(jié)序列，包括，例如與序列可操作性連接的啟動子。大量合適的載體和啟動子是本領域技術人員公知的，并且是可以商購的。舉例提供了以下載體。細菌載體pBs，pQE-9(Qiagen)，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，pBsKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核載體pWLneo，pSv2cat，pOG44，pXTl，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPv，pMSG，pSVL(Pharmiacia)，病毒來源的載體(M13載體、噬菌體1載體、腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)，高、低和可調(diào)節(jié)拷貝數(shù)的載體、與單個宿主(pACYC184和pBR322)和真核附加型復制載體(pCDM8)組合的具有相容性復制子的載體。其它載體包括原核表達載體，如pcDNA II，pSL301，pSE280，pSE380，pSE420，pTrcHisA，B和C，pRSET A，B和C(Invitrogen，Corp.)，pGEMEX-1和pGEMEX-2(Promega，Inc.)，pET載體(Novagen，Inc.)，pTrc99A，pKK223-3，pGEX載體，pEZZ18，pRIT2T和pMC1871(Pharmacia，Inc.)，pKK233-2和pKK388-1(Clontech，Inc.)，以及pProEx-HT(Invitrogen，Corp.)及其變體和衍生物。其它載體包括真核表達載體，如pFastBac，pFastBacHT，pFastBacDUAL，pSFV和pTet-Splice(Invitrogen)，pEUK-C1，pPUR，pMAM，pMAMneo，pBI101，pBI121，pDR2，pCMVEBNA和pYACneo(Clontech)，pSVK3，pSVL，pMSG，pCH110和pKK232-8(Pharmacia，Inc.)，p3′SS，pXT1，pSG5，pPbac，pMbac，pMC1neo和pOG44(Stratagene，Inc.)，以及pYES2，pAC360，pBlueBacHis A，B和C，pVL1392，pBlueBacIII，pCDM8，pcDNA1，pZeoSV，pcDNA3 pREP4，pCEP4和pEBVHis(Invitrogen，Corp.)及其變體或衍生物。其它可以使用的載體包括pUC18，pUC19，pBlueScript，pSPORT，粘粒，噬菌粒，YAC′s(酵母人工染色體)，BAC′s(細菌人工染色體)，P1(大腸桿菌噬菌體)，pQE70，pQE60，pQE9(quagan)，pBS載體，PhageScript載體，BlueScript載體，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，pcDNA3(Invitrogen)，pGEX，pTrsfus，pTrc99A，pET-5，pET-9，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pSPORT1，pSPORT2，pCMVSPORT2.0和pSV-SPORT1(Invitrogen)，來自Invitrogen的pTrxFus，pThioHis，pLEX，pTrcHis，pTrcHis2，pRSET，pBlueBacHis2，pcDNA3.1/His，pcDNA3.1(-)/Myc-His，pSecTag，pEBVHis，pPIC9K，pPIC3.5K，pAO815，pPICZ，pPICZ□，pGAPZ，pGAPZ□，pBlueBac4.5，pBlueBacHis2，pMelBac，pSinRep5，pSinHis，pIND，pIND(SP1)，pVgRXR，pcDNA2.1，pYES2，pZErO1.1，pZErO-2.1，pCR-Blunt，pSE280，pSE380，pSE420，pVL1392，pVL1393，pCDM8，pcDNA1.1，pcDNA1.1/Amp，pcDNA3.1，pcDNA3.1/Zeo，pSe，SV2，pRc/CMV2，pRc/RSV，pREP4，pREP7，pREP8，pREP9，pREP10，pCEP4，pEBVHis，pCR3.1，pCR2.1，pCR3.1-Uni和pCRBac；來自Pharmacia的□ExCell，□gtll，pTrc99A，pKK223-3，PGEX-1□T，pGEX-2T，pGEX-2TK，pGEX-4T-1，pGEX-4T-2，pGEX-4T-3，pGEX-3X，PGEX-5X-1，pGEX-5X-2，pGEX-5X-3，pEZZ18，pRIT2T，pMC1871，pSVK3，pSVL，pMSG，pCH110，pKK232-8，pSL1180，pNEO和pUC4K；來自Novagen的pSCREEN-1b(+)，pT7Blue(R)，pT7Blue-2，pCITE-4abc(+)，pOCUS-2，pTAg，pET-32LIC，pET-30LIC，pBAC-2cp LIC，pBACgus-2cp LIC，pT7Blue-2 LIC，pT7Blue-2，□SCREEN-1，□BlueSTAR，pET-3abcd，pET-7abc，pET9abcd，pET11abcd，pET12abc，pET-14b，pET-15b，pET-16b，pET-17b-pET-17xb，pET-19b，pET-20b(+)，pET-21abcd(+)，pET-22b(+)，PET-23abcd(+)，pET-24abcd(+)，PET-25b(+)，pET-26b(+)，pET-27b(+)，pET-28abc(+)，pET-29abc(+)，pET-30abc(+)，pET-31b(+)，pET-32abc(+)，pET-33b(+)，pBAC-1，pBACgus-1，pBAC4x-1，pBACgus4x-1，pBAC-3cp，pBACgus-2cp，pBACsurf-1，plg，Signal plg，pYX，Selecta Vecta-Neo，Selecta Vecta-Hyg和Selecta Vecta-Gpt；來自Clontech的pLexA，pB42AD，pGBT9，pAS2-1，pGAD424，pACT2，pGADGL，pGAD GH，pGAD10，pGilda，pEZM3，pEGFP，pEGFP-1，pEGFP-N，pEGFP-C，pEBFP，pGFPuv，pGFP，p6xHis-GFP，pSEAP2-Basic，pSEAP2-Contral，pSEAP2-Promoter，pSEAP2-Enhancer，p□gal-Basic，p□gal-Control，p□gal-Promoter，p□gal-Enhancer，pCMV□，pTet-Off，pTet-On，pTK-Hyg，pRetro-Off，pRetro-On，plRES1neo，pIRES1hyg，pLXSN，pLNCX，pLAPSN，pMAMneo，pMAMneo-CAT，pMAMneo-LUC，pPUR，pSV2neo，pYEX4T-1/2/3，pYEX-S1，pBacPAK-His，pBacPAK8/9，pAcUW31，BacPAK6，pTrip1Ex，□gt10，□gt11，pWE15和□Trip1Ex；來自Stratagene的Lambda ZAP II，pBK-CMV，pBK-RSV，pBluescript II KS+/-，pBluescript II SK+/-，pAD-GAL4，pBD-GAL4 Cam，pSurfscript，Lambda FIX II，Lambda DASH，LambdaEMBL3，Lambda EMBL4，SuperCos，pCR-Scrigt Amp，pCR-ScriptCam，pCR-Script Direct，pBS+/-，pBC KS+/-，pBC SK+/-，Phagescript，pCAL-n-EK，pCAL-n，pCAL-c，pCAL-kc，pET-3abcd，pET-11abcd，pSPUTK，pESP-1，pCMVLacI，pOPRSVI/MCS，pOPI3 CAT，pXT1，pSG5，pPbac，pMbac，pMC1neo，pMC1neo Poly A，pOG44，pOG45，pFRT□GAL，pNEO□GAL，pRS403，pRS404，pRS405，pRS406，pRS413，pRS414，pRS415和pRS416及其變體或衍生物。雙雜合體和反向雙雜合載體也可以使用，例如，pPC86 pDBLeu，pDBTrp，pPC97，p2.5，pGAD1-3，pGAD10，pACt，pACT2，pGADGL，pGADGH，pAS2-1，pGAD424，pGBT8，pGBT9，pGAD-GALA，pLexA，pBD-GAL4，pHISi，pHISi-1，placZi，pB42AD，pDG2O2，pJK202，pJG4-5，pNLexA，pYESTrp及其變體和衍生物。只要可以在宿主中復制和存活，可以使用任何其它質(zhì)粒和載體。
可以用于使DNA構建體進入宿主細胞的技術包括磷酸鈣/DNA共沉淀、DNA微注射到細胞核中、電穿孔、細菌原生質(zhì)體與完整細胞的融合、轉(zhuǎn)染或本領域公知的任何其它技術。DNA可以是單鏈或雙鏈、線性或環(huán)狀、放松的或超螺旋的DNA。對于轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的多種技術，參見，例如Keown et al.，Methods in Enzymology Vol.185，pp.527-537(1990)。
在一種特定實施方案中，可以通過用含有從等基因的DNA分離的α-1，3-GT序列的敲除載體轉(zhuǎn)染原代胎成纖維細胞而產(chǎn)生雜合的敲除細胞。如Dai等(Nature Biotchnology，20451-455)的描述，5’臂可以是4.9kb，并且可以包含內(nèi)含子8的大片段和外顯子9的5’末端。3’臂可以是并且可以包含外顯子9序列?？梢杂美鏘RES(內(nèi)部核糖體進入位點)在載體中摻入啟動子包載策略，以起始Neor基因的翻譯。
同源重組細胞的選擇然后，可以在合適選擇的培養(yǎng)基中生長細胞，以鑒定提供合適整合的細胞。插入α-1，3-GT基因中的選擇標記基因的存在確立了靶構建體在宿主基因組中的整合。然后可以通過限制分析、電泳、Southern分析、聚合酶鏈反應等進一步分析需要的表型，以便分析DNA，從而確定發(fā)生了同源重組還是非同源重組。這可以通過以下方法確定使用插入片段的探針，然后對側(cè)翼于插入片段的5’和3’區(qū)域進行測序，分析延伸超過構建體的側(cè)翼區(qū)的α-1，3-GT基因的存在，或在導入缺失時鑒定所述缺失的存在。也可以使用與構建體內(nèi)的序列互補并且與構建體外并且位于靶基因座上的序列互補的引物。以此方式，如果發(fā)生了同源重組，僅僅可以獲得具有存在于互補鏈中的全部兩個引物的DNA雙鏈體。通過證明引物序列或預期大小的序列的存在，支持了同源重組的發(fā)生。
用于篩選同源重組事件的聚合酶鏈反應是本領域公知的，參見，例如Kim and Smithies，Nucleic Acids Res.168887-8903，1988；和Joyner et al.，Nature 338153-156，1989.已經(jīng)由Thomas and Capecchi，supra，1987；Nicholas and Berg(1983)in Teratocarcinoma Stem Cell，eds.Super，Martin and Strikland(Cold Spring Harbor Lab.，ColdSpring Harbor，N.Y.(pp.469-497)；和Linney and Donerly，Cell 35693-699，1983表明突變多瘤病毒增強子和驅(qū)動新霉素基因的胸苷激酶啟動子在胚胎干細胞和EC細胞中都是有活性的。
從第一輪靶定獲得的細胞系很可能對于靶定的等位基因是雜合的?？梢酝ㄟ^多種途徑獲得兩個等位基因都被修飾的純合性。一種方法是生長許多細胞，其中一個拷貝進行了修飾，然后用不同的選擇標記對這些細胞進行另一輪靶定?；蛘撸梢愿鶕?jù)傳統(tǒng)孟德爾遺傳學對修飾的等位基因是雜合的動物配種而獲得純合子。在一些情況下，需要具有兩個不同的修飾的等位基因。這可以通過連續(xù)輪的基因靶定或通過雜合子的配種而實現(xiàn)，所述雜合子的每一個攜帶需要的修飾等位基因之一。
α-1，3-GT基因座中誘導的突變在某些其它實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過誘變劑有意導入突變。本領域公知并且適用于本發(fā)明的誘變劑的實例包括，但不限于化學誘變劑(如DNA嵌入化學物質(zhì)或DNA結(jié)合化學物質(zhì)，如N-乙基-N-硝基脲(ENU)、甲磺酸乙酯(EMS)、芥子氣、ICR191等；參見，例如，E.C.Friedberg，G.C.Walker，W.Siede，DNA Repair andMutagenesis，ASM Press，Washington DC(1995)、物理誘變劑(如UV放射、放射、X線)、生物化學誘變劑(如限制酶、DNA修復誘變劑、DNA修復抑制劑和易錯DNA聚合酶和復制蛋白)、以及轉(zhuǎn)座子插入。根據(jù)本發(fā)明的方法，培養(yǎng)中的細胞可以暴露于這些試劑之一，例如可以通過暴露于毒素A而選擇導致細胞表面的半乳糖α1，3-半乳糖缺失的任何突變。
用于在細胞中誘導突變的化學誘變劑的優(yōu)選劑量是本領域公知的，或者可以由普通技術人員采用本領域公知的誘變測定容易地確定。通過用多種劑量的誘變劑處理細胞和/或控制暴露于試劑的時間，可以完成細胞的體外化學誘變。通過滴定誘變劑暴露和/或劑量，可以為預定的目的進行最優(yōu)程度的誘變，從而使每個靶細胞中需要數(shù)目的基因突變。例如，ENU的有用劑量可以是0.1-0.4mg/ml，大約1-2小時。在另一實例中，有用的EMS劑量可以是0.1-1mg/ml，大約10-30小時。此外，也可以用更低和更高的劑量以及暴露時間來達到需要的突變頻率。
不表達功能性α-1，3-GT的細胞的鑒定在一種實施方案中，選擇程序可以基于細菌毒素，以選擇缺乏功能性α1，3 GT表達的細胞。在另一種實施方案中，可以用細菌毒素，即艱難梭菌產(chǎn)生的毒素A選擇缺乏細胞表面表位，即半乳糖1，3-半乳糖的細胞。暴露于艱難梭菌毒素可以導致在細胞表面具有該表位的細胞聚攏，將細胞從板基質(zhì)釋放出來。可以用該選擇方法檢測被靶定的基因敲除體和使酶不具有功能或表達的突變。然后可以用缺乏細胞表面半乳糖1，3-半乳糖表位表達的細胞產(chǎn)生α1，3 GT的兩個等位基因都無活性的動物，其中所述細胞是用描述的毒素A介導的選擇鑒定的，或用包括基因靶定的標準基因滅活方法產(chǎn)生的。
在一種實施方案中，選擇方法可以直接檢測α1，3 GT表位的缺失，該缺失是由于同源重組導致的α1，3 GT基因的靶定的敲除或由于基因中導致酶無功能或不表達的突變。通過抗生素抗性進行的選擇最常用于篩選(參見上文)。該方法可以檢測靶定載體上抗性基因的存在，但不能直接表明整合是被靶定的重組事件還是隨機整合。某些技術，如聚腺苷酸和啟動子包載技術，增加被靶定的事件的可能性，但不產(chǎn)生獲得了需要的表型的直接證據(jù)，所述需要的表型是細胞表面galα1，3gal表位缺陷的細胞。此外，可以用陰性形式的選擇來選擇被靶定的整合；在這些情況下，對細胞致死的因子的基因被插入，插入的方式使得只有被靶定的事件才導致細胞避免死亡。然后可以測定由這些方法選擇的細胞中的基因破壞、載體整合、以及最終檢測α1，3 gal表位缺失。在這些情況下，由于選擇是基于靶定載體整合的檢測而不是改變的表型，僅僅可以檢測被靶定的敲除體，而不是點突變、基因重排或截短或其它修飾。
在另一種實施方案中，可以用含有補體因子和galα1，3 gal表位的天然抗體的血清進行選擇程序(參見，例如，Koike et al.，Xenotransplantation 4147-153，1997)。暴露于含有抗Gal抗體的人或非人靈長類動物的血清會導致細胞裂解，這是由于展示galα1，3 gal表位的細胞中的特異性抗體結(jié)合和補體激活。因此，α-1，3-GT缺陷的細胞將保持存活，因此可以被選擇。
可以進一步鑒定認為缺乏功能性α-1，3-GT表達的動物細胞。所述鑒定可以通過以下技術完成，包括，但不限于PCR分析、Southern印跡分析、Northern印跡分析、特異性凝集素結(jié)合測定和/或測序分析。
可以用本領域描述的PCR分析(參見，例如Dai et al.NatureBiotechnology 20431-455)確定靶定載體的整合。在一種實施方案中，可以在抗生素抗性基因中起始擴增引物，并且延伸到載體序列外的區(qū)域中。也可以用Southern分析(參見，例如，Dai et al.NatureBiotechnology 20431-455)鑒定基因座中的總體修飾，如靶定載體在α1，3GT基因座中的整合?？梢杂肗orthern分析鑒定由每個等位基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物。
用來自Griffonia(Bandeiraea)simplicifolia的GSL IB4凝集素(Vector Labs)，即特異性結(jié)合碳水化合物部分galα1，3 gal的凝集素進行的特異性凝集素結(jié)合和結(jié)合的FACS(熒光抗體細胞分選)分析，可以確定細胞上是否存在α1，3 gal表位。這種類型的分析包括在細胞中添加熒光素標記的GSL-IB4凝集素和隨后的細胞分選。
此外，也可以采用由RNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的cDNA的測序分析確定α1，3GT等位基因中任何突變的精確位置。
另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)活動物如豬的方法，所述動物中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都被滅活。在一種實施方案中，用來自α-1，3-GT基因的兩個等位基因都被滅活的細胞的供體核，通過克隆生產(chǎn)動物。在一種實施方案中，通過基因靶定事件滅活了α-1，3-GT基因的兩個等位基因。在另一種實施方案中，由于點突變的存在滅活了α-1，3-GT基因的兩個等位基因。在另一種實施方案中，通過基因靶定事件滅活了一個等位基因，通過點突變滅活了另一個等位基因。在進一步的實施方案中，通過基因靶定事件滅活了一個等位基因，由于在α-1，3-GT基因的外顯子9的第二個堿基存在T到G的點突變滅活了另一個等位基因。在一種特定實施方案中，通過針對外顯子9的靶定構建體滅活了一個等位基因，由于在α-1，3-GT基因的外顯子9的第二個堿基存在T到G的點突變滅活了另一個等位基因。在另一種實施方案中，克隆諸如豬的所述動物的方法包括給卵細胞去核，將卵母細胞與來自α-1，3-GT基因的兩個等位基因都被滅活的細胞的供體核融合，并且將來源于核轉(zhuǎn)移的胚植入代孕母親。
或者，提供了通過滅活胚胎干細胞中α-1，3-GT基因的兩個等位基因而生產(chǎn)缺乏任何功能性α-1，3-GT表達的活動物的方法，然后可以用所述動物產(chǎn)生后代。
通常，可以通過直接修飾合子而制備改變的動物。對于動物，隨后可以將修飾的合子導入能夠攜帶動物到足月的假孕雌性動物的子宮中。例如，如果需要完整的缺乏α-1，3-GT基因表達的動物，則可以靶定來源于該動物的胚胎干細胞，隨后導入胚泡，以便使修飾的細胞生長為嵌合動物。對于胚胎干細胞，可以使用胚胎干細胞系或新獲得的干細胞。
在本發(fā)明的合適的實施方案中，全能細胞是胚胎干(ES)細胞。從胚泡分離ES細胞、建立ES細胞系和它們隨后的培養(yǎng)是按照例如由以下文獻描述的常規(guī)方法進行Doetchmann et al.，J.Embryol.Exp.Morph.8727-45(1985)；Li et al.，Cell 69915-926(1992)；Robertson，E.J.″Tetracarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach，″ed.E.J.Robertson，IRL Press，Oxford，England(1987)；Wurst andJoyner，″Gene TargetingA Practical Approach，″ed.A.L.Joyner，IRLPress，Oxford，England(1993)；Hogen et al.，″Manipulating the MouseEmbryoA Laboratory Manual，″eds.Hogan，Beddington，Costantiniand Lacy，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1994)；和Wang et al.，Nature 336741-744(1992)。在本發(fā)明的另一個合適的實施方案中，全能細胞是胚胎生殖(EG)細胞。胚胎生殖細胞是功能上與ES細胞等同的未分化細胞，也就是說，它們可以在體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，然后得到嵌合體的體細胞和生殖細胞系(Stewart et al.，Dev.Biol.161626-628(1994))。EG細胞是通過以下方法得到的培養(yǎng)原始生殖細胞，即配子的祖細胞，培養(yǎng)中組合了生長因子白血病抑制因子、青灰因子和堿性成纖維細胞生長因子(Matsui et al.，Cell 70841-847(1992)；Resnick et al.，Nature 359550-551(1992))。EG細胞的培養(yǎng)可用本領域技術人員公知的方法來進行，所述方法例如描述于Donovan etal.，″Transgenic Animals，Generation and Use，″Ed.L.M.Houdebine，Harwood Academic Publishers(1997)及其中引用的原始文獻。
用于本發(fā)明的四倍體胚泡可通過天然合子生產(chǎn)和發(fā)育來獲得，或者通過公知方法，由二細胞胚的電融合和隨后進行培養(yǎng)來獲得，所述公知方法例如由以下文獻描述James et al.，Genet.Res.Camb.60185-194(1992)；Nagy and Rossant，″Gene TargetingA PracticalApproach，″ed.A.L.Joyner，IRL Press，Oxford，England(1993)；或Kubiak and Tarkowski，Exp.Cell Res.157561-566(1985)。
ES細胞或EG細胞導入到胚泡中可通過本領域公知的任何方法來進行。用于本發(fā)明目的的合適的方法是Wang et al.，EMBO J.102437-2450(1991)描述的微注射方法。
或者，可以由修飾的胚胎干細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物?？梢詫⑦z傳修飾的胚胎干細胞注射到胚泡中，然后根據(jù)常規(guī)技術在雌性宿主哺乳動物中生長到足月。然后可以用諸如PCR或Southern印跡的技術篩選雜合后代中靶基因座的位點中改變的存在。與相同物種的野生型宿主交配后，隨后可以雜交得到的嵌合后代，以得到純合宿主。
用靶定載體轉(zhuǎn)化胚胎干細胞以改變α-1，3-GT基因后，可以將細胞鋪到合適的培養(yǎng)基，如胎牛血清增強的DMEM中的飼養(yǎng)層上。通過采用選擇培養(yǎng)基可以檢測含有構建體的細胞，在足夠集落生長的時間后，可以挑選集落，并且分析同源重組的存在。可以用構建體序列內(nèi)或構建體序列外但位于靶基因座的引物進行聚合酶鏈反應。然后可以用表現(xiàn)出同源重組的那些集落進行胚胎操作和胚泡注射?？梢詮某瑪?shù)排卵的雌性獲得胚泡。然后可以用胰蛋白酶消化胚胎干細胞，將修飾的細胞加入含有胚泡的小滴中?？梢詫⒅辽僖粋€修飾的胚胎干細胞注射到胚泡的囊胚腔中。注射后，可以將至少一個胚泡返回到假孕雌性的每個子宮角。然后使雌性到足月，篩選得到的同窩動物中具有構建體的突變細胞。選擇胚泡，得到來自轉(zhuǎn)化的ES細胞的不同親本。通過提供胚泡和ES細胞的不同表型，可以容易檢測嵌合后代，然后可以進行基因型分析，以探測修飾的α-1，3-GT基因的存在。
體細胞核轉(zhuǎn)移，以生產(chǎn)克隆的轉(zhuǎn)基因后代本發(fā)明提供了通過體細胞核轉(zhuǎn)移克隆缺乏功能性α-1，3-GT基因的動物，如豬。概言之，可以通過包括以下步驟的核轉(zhuǎn)移過程生產(chǎn)動物獲得需要的分化細胞作為供體核的來源；從動物獲得卵母細胞；對所述卵母細胞去核；通過融合或注射將需要的分化細胞或細胞核轉(zhuǎn)移到去核的卵母細胞以形成NT蛋白；活化得到的NT單位；將所述培養(yǎng)的NT單位轉(zhuǎn)移到宿主動物中，使得NT單位發(fā)育成胎兒。
核轉(zhuǎn)移技術或核移植技術是本領域公知的(Dai et al. NatureBiotechnology 20251-255；Polejaeva et al Nature 40786-90(2000)；Campbell et al，Theriogenology，43181(1995)；Collas et al，Mol.Report Dev.，38264-267(1994)；Keefer et al，Biol.Reprod.，50935-939(1994)；Sims et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，906143-6147(1993)；WO 94/26884；WO 94/24274和WO 90/03432，美國專利Nos.4,944,384和5,057,420)。
將經(jīng)過修飾以改變α-1，3-GT基因的供體細胞核轉(zhuǎn)移到受體卵母細胞。該方法的使用不限于特定的供體細胞類型。供體細胞可以是例如以下文獻中描述的那些Wilmut et al Nature 385 810(1997)；Campbellet al Nature 380 64-66(1996)；Dai et al.，Nature Biotechnology 20251-255，2002或Cibelli et al Science 280 1256-1258(1998)?？梢允褂媚軌虺晒τ糜诤宿D(zhuǎn)移的所有正常核型的細胞，包括胚、胎和成年體細胞。胎成纖維細胞是特別有用的一類供體細胞。通常合適的核轉(zhuǎn)移方法描述于Campbell et al Theriogenology 43 181(1995)，Dai et al.NatureBiotechnology 20251-255，Polejaeva et al Nature 40786-90(2000)，Collas et al Mol.Reprod.Dev.38 264-267(1994)，Keefer et al Biol.Reprod.50 935-939(1994)，Sims et al Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 906143-6147(1993)，WO-A-9426884，WO-A-9424274，WO-A-9807841，WO-A-9003432，美國專利No.4,994,384和美國專利No.5,057,420。也可以使用分化的或至少部分分化的供體細胞。供體細胞也可以是，但不一定是培養(yǎng)中的細胞，可以是靜止的。靜止的核供體細胞是可以經(jīng)過誘導進入靜止或在體內(nèi)以靜止狀態(tài)存在的細胞?，F(xiàn)有技術的方法也將胚胎細胞類型用于克隆程序中(Campbell et al(Nature，38064-68，1996)和Stice et al(Biol.Reprod.，20 54100-110，1996)。
可以從多種不同的器官和組織獲得核供體體細胞，所述器官和組織例如，但不限于皮膚、間充質(zhì)、肺、胰腺、心臟、腸、胃、膀胱、血管、腎、尿道、生殖器官和完整或部分胚、胎或成年動物的解聚的制備物。在本發(fā)明的合適的實施方案中，核供體細胞選自上皮細胞、成纖維細胞、神經(jīng)細胞、角質(zhì)形成細胞、造血細胞、黑色素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞(B和T)、巨噬細胞、單核細胞(monocytes、mononuclear cells)、心肌細胞、其它肌細胞、顆粒細胞、卵丘細胞、表皮細胞或內(nèi)皮細胞。在另一種實施方案中，核供體細胞是胚胎干細胞。在一種優(yōu)選實施方案中，可以將成纖維細胞用作供體細胞。
在本發(fā)明的另一種實施方案中，本發(fā)明的核供體細胞是動物的生殖細胞。胚、胎或成年階段的動物物種的任何生殖細胞都可以用作核供體細胞。在合適的實施方案中，核供體細胞是胚胎生殖細胞。
核供體細胞可以停滯在細胞周期的任何階段(G0，G1，G2，S，M)，以確保與受體細胞協(xié)調(diào)。本領域公知的任何方法都可以用于操作細胞周期階段。控制細胞周期階段的方法包括，但不限于，培養(yǎng)的細胞的接觸抑制誘導的靜止，除去血清或其它必須營養(yǎng)物誘導的G0靜止，衰老誘導的G0靜止，添加特定生長因子誘導的G0靜止；物理或化學方法，如熱激、高壓或用化學物質(zhì)、激素、生長因子或其它物質(zhì)進行的其它處理誘導的G0或G1靜止；通過用干擾復制程序的任何點的化學試劑處理進行的S期控制；用熒光活化的細胞分選進行選擇以進行M期控制、有絲分裂擺脫、用微管破壞劑處理或破壞有絲分裂進展的任何化學物質(zhì)進行處理(也參見Freshney，R.I，.″Culture of Animal CellsAManual of Basic Technique，″Alan R.Liss，Inc，New York(1983)。
分離卵母細胞的方法是本領域公知的。基本上，該方法可以包括從動物的卵巢或生殖道分離卵母細胞。容易獲得的卵母細胞來源是屠宰場材料。對于諸如基因工程、核轉(zhuǎn)移和克隆的技術的組合，在卵母細胞可以用作核轉(zhuǎn)移的受體細胞之前，并且在它們由精細胞受精以發(fā)育成胚胎之前，通常必須使這些細胞在體外成熟。該過程通常需要從哺乳動物卵巢，如在屠宰場獲得的牛卵巢收集未成熟(I期前)卵母細胞，在受精或去核前在成熟培養(yǎng)基中使卵母細胞成熟，直到卵母細胞達到中期II階段，在牛卵母細胞的情況下通常在抽吸后大約18-24小時發(fā)生。該階段稱作“成熟階段”。在某些實施方案中，從小母豬獲得卵母細胞?！靶∧肛i”是從未生育過的母豬。在其它實施方案中，從大母豬獲得卵母細胞?！按竽肛i”是以前生育過的母豬。
中期II階段卵母細胞可以是受體卵母細胞，在此階段，認為卵母細胞可以是或者是足夠“活化的”，以便像處理受精的精子那樣處理導入的細胞核。已經(jīng)將體內(nèi)成熟的中期II階段卵母細胞成功用于核轉(zhuǎn)移技術。基本上，可以在動情期開始后或注射人類絨毛膜促性腺激素(hCG)或類似激素后35-48或39-41小時從非超數(shù)排卵或超數(shù)排卵的動物手術收集成熟的中期II卵母細胞?？梢詫⒙涯讣毎糜诤线m的培養(yǎng)基，如透明質(zhì)酸酶溶液中。
在一般為大約10-40小時，大約16-18小時，大約40-42小時或大約39-41小時的固定的成熟時間后，可以對卵母細胞去核。在去核前可以取出卵母細胞，置于合適的培養(yǎng)基，如含有1毫克/毫升透明質(zhì)酸酶的HECM中，然后除去卵丘細胞。然后可以篩選剝離的卵母細胞的極體，然后將通過極體的存在確定的選擇的中期II卵母細胞用于核轉(zhuǎn)移。隨后去核。
可以通過例如美國專利No.4,994,384中描述的公知方法進行去核。例如，可以將中期II卵母細胞置于任選含有7.5毫克/毫升細胞松弛素B的HECM中用于立即去核，或置于合適的培養(yǎng)基，例如諸如添加了10％動情期牛血清的CR1aa的胚胎培養(yǎng)基中，然后在稍后去核，優(yōu)選不超過24小時后，更優(yōu)選16-18小時后。
可以用微量滴定板通過顯微手術完成去核，以除去極體核鄰近的細胞質(zhì)。然后可以篩選卵母細胞，以鑒定成功去核的那些。篩選卵母細胞的一種途徑是用HECM中的1毫克/毫升33342 Hoechst染料對卵母細胞染色，然后在紫外線下觀察卵母細胞不超過10秒。然后可以將成功去核的卵母細胞置于合適的培養(yǎng)基，如添加了10％血清的CR1aa中。
然后可以將與去核卵母細胞相同物種的單個哺乳動物細胞轉(zhuǎn)移到使用的去核卵母細胞的卵周隙中，以產(chǎn)生UT單位。可以根據(jù)本領域公知的方法，用哺乳動物細胞和去核的卵母細胞制備UT單位。例如，可以通過電融合對細胞進行融合。電融合是通過提供足夠?qū)е录毎|(zhì)膜瞬時破裂的電脈沖而實現(xiàn)的。細胞質(zhì)膜的該破裂是非常短暫的，因為膜迅速重新形成。因此，如果兩個鄰近的膜被誘導破裂，并且在重新形成時脂雙層混合，可以在兩個細胞之間打開小通道。由于所述小開口的熱動力學不穩(wěn)定性，它不斷擴大直到兩個細胞成為一個。例如，參見Prather等的美國專利No.4,997,384?？梢允褂枚喾N電穿孔介質(zhì)，包括，例如葡萄糖、甘露糖、山梨糖醇和磷酸緩沖液。也可以用仙臺病毒作為致融合劑來完成融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。同樣，可以將細胞核直接注射到卵母細胞中，而不是使用電穿孔融合。參見，例如，Collas and Barnes，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)。融合后，將得到的融合的NT單位置于合適的培養(yǎng)基中直到活化，例如，CR1aa培養(yǎng)基。通?？梢栽谌诤虾蟮亩虝r間進行活化，例如，融合后不超過24小時，或約4-9，或最佳是1-2小時。在一種優(yōu)選的實施方案中，在融合后至少1小時并且在成熟后40-41小時發(fā)生活化。
可以通過公知方法活化NT單位。所述方法包括，例如，在低于生理溫度下(大體上通過施加冷，或?qū)嶋H上涼的溫度刺激)培養(yǎng)NT單位。通過在室溫下培養(yǎng)NT單位可以方便地進行該方法，室溫相對于胚胎在正常情況下暴露的生理溫度條件是低溫?；蛘?，可以通過施用公知的活化劑獲得活化。例如，已經(jīng)表明受精過程中精子對卵母細胞的穿透活化了預先融合的卵母細胞，在核轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生更大數(shù)目的存活的妊娠和多個遺傳上相同的小牛。同樣，可以用諸如電和化學刺激的處理在融合后活化NT胚胎。參見，例如Susko-Parrish等的美國專利No.5,496,720?？梢酝ㄟ^以下方法誘導融合和活化施加5V的AC脈沖5秒，然后施加兩個1.5kV/cm的DC脈沖60微秒，每個脈沖都是用ECM2001 Electrocell Manipulator(BTX Inc.，San Diego，CA)產(chǎn)生的。此外，可以通過增加卵母細胞中的二價陽離子水平和減少卵母細胞中細胞蛋白的磷酸化而同時或依次實現(xiàn)活化。這通?？梢酝ㄟ^以例如離子載體的形式將二價陽離子，如鎂、鍶、鋇、鈣導入卵母細胞的細胞質(zhì)而實現(xiàn)。增加二價陽離子水平的其它方法包括使用電休克、用乙醇處理和用籠式螯合劑處理?？梢酝ㄟ^公知方法減少磷酸化，例如通過添加激酶抑制劑，如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，如6-二甲基-氨基嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。或者，通過將磷酸酶如磷酸酶2A和磷酸酶2B導入卵母細胞，可以抑制細胞蛋白的磷酸化。
然后，可將活化的NT單位或“融合的胚胎”在合適的體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)至產(chǎn)生細胞集落。適合于胚胎的培養(yǎng)和成熟的培養(yǎng)基是本領域公知的。可用于胚胎培養(yǎng)和維持的公知培養(yǎng)基的實例包括Ham′s F-10+10％胎牛血清(FCS)、組織培養(yǎng)基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、蒂羅德-清蛋白-乳酸-丙酮酸(TALP)、Dulbecco磷酸緩沖液PBS)、Eagle′s和Whitten′s培養(yǎng)基。在一個特定實例中，可以在5％CO2的潮濕氣氛下，在38.6℃將活化的NT單位在NCSU-23培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-4小時。
之后，可清洗一個或多個培養(yǎng)的NT單位，然后置于裝在孔板中的合適培養(yǎng)基中，所述板優(yōu)選還含有合適的鋪滿飼養(yǎng)層。合適的飼養(yǎng)層舉例說包括成纖維細胞和上皮細胞。將NT單位在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，直到NT單位的大小達到適合轉(zhuǎn)移到雌性受體中，或者適合獲得可用來產(chǎn)生細胞集落的細胞。這些NT單位優(yōu)選可培養(yǎng)直到至少約2-400個細胞，約4-128個細胞，或至少約50個細胞。
然后可將活化的NT單位轉(zhuǎn)移(胚胎轉(zhuǎn)移)到母豬的輸卵管中。在一個實施方案中，母豬可以是動情期同步的受體小母豬?？墒褂秒s交小母豬(大白豬/Duroc/Landrace)(280-400磅)?？赏ㄟ^口服給予混合在飼料中的18-20mg Regu-Mate(Altrenogest，Hoechst，Warren，NJ)，使小母豬同步為受體動物。Regu-Mate可連續(xù)喂飼14天。然后在最后一次Regu-Mate處理后約105小時，可肌內(nèi)給予一千單位的人絨毛膜促性腺激素(hCG，Intervet America，Millsboro，DE)。hCG注射后約22-26小時，則可進行胚胎轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，妊娠可進行到足月，生出活后代。在另一個實施方案中，妊娠可提前5天結(jié)束，收獲胚胎細胞。
需要的雜合敲除動物的配種另一方面，本發(fā)明提供了通過將α-1，3-GT基因雜合的雄性與α-1，3-GT基因雜合的雌性配種而生產(chǎn)缺乏任何功能性α-1，3-GT表達的活動物的方法。在一種實施方案中，由于α-1，3-GT基因的一個等位基因的遺傳修飾以防止該等位基因的表達，動物是雜合的。在另一種實施方案中，由于α-1，3-GT基因的一個等位基因存在點突變，動物是雜合的。在另一種實施方案中，點突變可以是α-1，3-G基因的外顯子9的第二個堿基上的T到G的突變。在一種特定實施方案中，提供了生產(chǎn)缺乏任何功能性α-1，3-GT表達的動物的方法，其中在α-1，3-G基因的外顯子9的第二個堿基上含有T到G的突變的公豬與在α-1，3-G基因的外顯子9的第二個堿基上含有T到G的突變的母豬配種。
在一種實施方案中，可以將從α-1，3-GT基因中攜帶雙敲除的供體細胞進行核轉(zhuǎn)移生產(chǎn)的性成熟動物進行交配，檢測它們的后代的純合敲除。然后可以將這些純合敲除動物配種，生產(chǎn)更多的動物。
在另一種實施方案中，可以用來自兩個遺傳上不同的豬品系的野生型精于對來自性成熟的雙敲除動物的卵母細胞進行體外受精，將胚胎植入合適的代孕母親?？梢詸z測這些交配的后代中敲除的存在，例如，可以通過cDNA測序、毒素A敏感性和/或凝集素結(jié)合對其進行檢測。然后，可以在性成熟期對這些同窩動物進行交配。
在本發(fā)明這方面的某些方法中，可以提前終止妊娠，使得可以分離胎成纖維細胞，并且進一步進行表型和/或基因型鑒定。然后，可以根據(jù)此處描述的方法(也參見Dai et al.)將缺乏α-1，3-GT基因表達的成纖維細胞用于核轉(zhuǎn)移，以生產(chǎn)攜帶需要的雙敲除的多個胚胎和后代。
III.遺傳修飾的動物的類型/額外的遺傳修飾在本發(fā)明的一方面，提供了通過基因靶定事件滅活了α-1，3-GT基因的一個等位基因的動物。在本發(fā)明的另一方面，提供了豬動物，其中通過基因靶定事件滅活了α-1，3-GT基因的兩個等位基因。在一種實施方案中，可以通過同源重組靶定基因。在另一種實施方案中，可以破壞基因，即，可以改變遺傳編碼的一部分，從而影響基因的該片段的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，通過取代、缺失(“敲除”)或插入(“敲入”)技術，可以發(fā)生基因的破壞。也可以插入調(diào)節(jié)存在的序列轉(zhuǎn)錄的所需蛋白或調(diào)節(jié)序列的其它基因。
因此，在本發(fā)明的另一方面，可以通過至少一個點突變使α-1，3-GT基因無活性。在一種實施方案中，可以通過至少一個點突變使α-1，3-GT基因的一個等位基因無活性。在另一實施方案中，可以通過至少一個點突變使α-1，3-GT基因的兩個等位基因都無活性。在一種實施方案中，可以通過基因靶定事件發(fā)生該點突變。在另一種實施方案中，該點突變可以是天然存在的。在一種特定實施方案中，點突變可以是位于α-1，3-GT基因的外顯子9的第二個堿基的T到G的突變(圖1)。攜帶α-1，3-GT基因中天然存在的點突變的豬能夠產(chǎn)生不具有抗生素抗性基因的α1，3 GT缺陷的豬，因此具有制備用于人類的更安全產(chǎn)品的潛能。在其它實施方案中，可以存在至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少10個或至少20個點突變，使得α-1，3-GT基因無活性。在其它實施方案中，提供這樣的豬，其中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都含有防止任何功能性α-1，3-GT表達的點突變。在一種特定實施方案中，提供了這樣的豬，其在α-1，3-GT基因的兩個等位基因都含有發(fā)生在外顯子9的第二個堿基的T到G的突變(圖1)。
本發(fā)明的另一方面提供了這樣的動物，其中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都被滅活，從而通過基因靶定事件滅活了一個等位基因，通過天然存在的點突變滅活了另一個等位基因。在一種實施方案中，提供了豬動物，其中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都被滅活，從而通過基因靶定事件滅活了一個等位基因，由于在外顯子9的第二個堿基存在T到G的點突變滅活了另一個等位基因。在一個特定實施方案中，提供了豬動物，其中α-1，3-GT基因的兩個等位基因都被滅活，從而通過針對外顯子9的靶定構建體(圖6)滅活了一個等位基因，由于在外顯子9的第二個堿基存在T到G的點突變滅活了另一個等位基因。
在進一步的實施方案中，可以從缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表達并且也含有其它遺傳修飾的動物獲得組織。所述遺傳修飾可以包括其它基因的添加和/或缺失，以防止排斥、促進傷口愈合和/或減少或消除有害的病原體(如朊病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)。
PERV是指一種逆轉(zhuǎn)錄病毒家族，目前已經(jīng)鑒定了其具有三種主要的類型PERV-A(Genbank登記號AF038601)，PERV-B(EMBL登記號PERY17013)和PERV-C(Genbank登記號AF038600)(Patience et al1997，Akiyoshi et al 1998)。PERV-A、B和C的gag和pol基因是高度同源的，在不同類型的PERV(如PERV-A，PERV-B，PERV-C)之間不同的是env基因。最近也鑒定了PERV-D(參見，例如，美國專利No 6,261,806)。
在本發(fā)明的一方面，可以通過干擾RNA分子(iRNA)的表達調(diào)節(jié)豬內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)基因。例如，可以使用至少兩個iRNA分子，使得PERV病毒的表達被功能性消除或低于檢測水平(參見例如USSN 60/523,938)。在進一步的實施方案中，通過同源重組或使用抑制性RNA(RNAi)方法滅活或下調(diào)其它病毒，包括，但不限于豬呼吸和生殖綜合征(PRRS)病毒。在用RNAi下調(diào)的情況下，編碼小的抑制性RNAs的基因序列作為轉(zhuǎn)基因表達，并且通過微注射、ICSI、核轉(zhuǎn)移或用精子介導的核轉(zhuǎn)移導入豬。
在另一種實施方案中，可以消除或減少負責異種移植物排斥的其它基因的表達。所述基因包括但不限于CMP-NEUAc羥化酶基因、isoGloboside 3核酶基因和Forssman合酶基因。此外，負責阻抑補體介導的裂解的補體相關蛋白的編碼基因或cDNA也可以在本發(fā)明的動物和組織中表達。所述基因包括但不限于CD59，DAF，MCP和CD46(參見例如WO 99/53042；Chen et al.Xenotransplantation，Volume 6 Issue 3Page 194-August 1999，其描述了表達CD59/DAF轉(zhuǎn)基因的豬；Costa Cet al，Xenotransplantation.2002 Jan；9(1)45-57，其描述了表達人CD59和H-轉(zhuǎn)移酶的豬；Zhao L et al.，；Diamond LE et al.Transplantation.2001 Jan 15；71(1)132-42，其描述了人CD46轉(zhuǎn)基因豬。
其它修飾可以包括以下物質(zhì)的表達組織因子途徑抑制劑(TFPI)、肝素、抗凝血酶、水蛭素、TFPI、蜱抗凝肽或蛇毒因子，如標題為“錨定于細胞膜的抗凝融合蛋白”的WO 98/42850和美國專利No.6,423,316中的描述；或通過細胞下調(diào)細胞粘附分子表達的化合物，如抗體，如標題為“通過下調(diào)細胞粘附分子抑制異種移植物排斥”的WO 00/31126中的描述，和例如通過給來自異種移植供體生物的可溶形式的CTLA-4的器官受體施用而防止信號2的共刺激的化合物，如標題為“通過阻斷T細胞共刺激信號2(B7/CD28)而進行的免疫抑制”的WO 99/57266中的描述。
在下文的非限制性實施例中更詳細描述了本發(fā)明的某些方面。
實施例實施例1產(chǎn)生α-1，3-GT基因雜合的豬細胞原代豬胎成纖維細胞的分離和轉(zhuǎn)染在妊娠第33天從同一次妊娠的10個胎分離胎成纖維細胞(PCFF4-1到PCFF4-10)。除去頭和內(nèi)臟后，用Hanks平衡鹽溶液(HBSS；Gibco-BRL，Rockville，MD)清洗胎，置于20ml HBSS中，并且用小手術剪剪碎。沉淀組織，重懸于裝有40ml DMEM和每胎100 U/ml膠原酶(Gibco-BRL)的50ml試管中。在37℃的振蕩水浴中將試管溫育40分鐘。使消化的組織沉降3-4分鐘，將富含細胞的上清液轉(zhuǎn)移到新的50ml試管中并且沉淀。然后將細胞重懸于40ml含有10％胎牛血清(FCS)、1X非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和2ng/ml bFGF的DMEM中，并且接種到10cm的平皿中。在達到鋪滿時對所有的細胞進行冷凍保存。在妊娠第28天從10個胎分離SLA-1到SLA-10細胞。用彎曲的手術鉗搗碎胎，緩慢通過60目的金屬篩，以便不產(chǎn)生過多的熱。然后沉淀細胞懸浮液，重懸于30ml含有10％FCS、1X非必需氨基酸、2ng/mlbFGF和10μg/ml慶大霉素的DMEM中。將細胞接種到10cm的平皿中，培養(yǎng)1-3天，并且冷凍保存。對于轉(zhuǎn)染，通過電穿孔將10μg線性化的載體DNA導入2百萬個細胞中。在轉(zhuǎn)染后48小時，將轉(zhuǎn)染的細胞以每孔2000個細胞的密度接種到48孔板中，用250μg/ml G418進行選擇。
敲除載體構建從兩種原代豬胎成纖維細胞SLA1-10和PCFF4-2細胞的等基因DNA構建兩個α-1，3-GT敲除載體pPL654和pPL657。通過PCR分別從SLA1-10細胞和PCFF4-2細胞的純化DNA制備包含大部分內(nèi)含子8和外顯子9的6.8kb的α-1，3-GT基因組片段。將位于外顯子9的5’末端的獨特EcoRV位點轉(zhuǎn)化為SalI位點，將1.8kb的IRES-neo-poly A片段插入SalI位點。IRES(內(nèi)部核糖體進入位點)作為neo蛋白的翻譯起始位點。因此，兩種載體都具有4.9kb的5’重組臂和1.9kb的3’重組臂(圖6)。
3’PCR和長程PCR將大約1000個細胞重懸于5μl胚胎裂解緩沖液(ELB)(40mMTris，pH 8.9，0.9％Triton X-100，0.9％NP40，0.4mg/ml蛋白酶K)，在65℃溫育15分鐘以裂解細胞，在95℃加熱10分鐘以滅活蛋白酶K。對于3’PCR分析，用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)(Roche MolecularBiochemicals)在25μl反應體積中擴增片段，采用以下參數(shù)35個循環(huán)的94℃下1分鐘，60℃下1分鐘和72℃下2分鐘。對于LR-PCR，用AKARA LA系統(tǒng)(Panvera/Takara)在50μl反應體積中擴增片段，采用以下參數(shù)30個循環(huán)的94℃下10秒，65℃下30秒，68℃下10分鐘+20秒增加/循環(huán)，然后是一個68℃下7分鐘的最終循環(huán)。純化的DNA的3′PCR和LR-PCR條件與細胞相同，只是將1μl純化的DNA(30μg/ml)與4μl ELB混合。
細胞樣品的Southern印跡分析60℃下在裂解緩沖液(10mM Tris，pH7.5，10mM EDTA，10mMNaCl，0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸鈉，1mg/ml蛋白酶K)中將大約106個細胞裂解過夜。然后用BstEII消化DNA，在1％瓊脂糖凝膠上分離。電泳后，將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用3’末端洋地黃毒苷標記的探針進行探測。用化學發(fā)光的底物系統(tǒng)(Roche Molecular Biochemicals)檢測條帶。
結(jié)果用neo442S和αGTE9A2作為正向和反向引物，通過3’PCR篩選抗生素(G418)抗性集落。Neo442S位于neo基因的3’末端，αGTE9A2位于3’重組臂外的序列中外顯子9的3’末端(圖6)。因此，僅僅通過成功靶定α1，3GT基因座，才能獲得預期的2.4kb的PCR產(chǎn)物。從4個不同細胞系的總共7次轉(zhuǎn)染中挑選出1105個G418抗性集落，其中100個(9％)在最初的3’PCR篩選中是α1，3 GT基因破壞陽性的(范圍是2.5-12％)。集落657A-A8，657A-I6和657A-I11表現(xiàn)出了預期的2.4kb條帶，而對照PCFF4-6細胞和另一個G418抗性集落，即657A-P6是陰性的。隨后立即將每個3’PCR陽性集落的一部分作為幾個小等分物進行冷凍，以便以后用于NT實驗，而擴增其余細胞用于長程PCR(LR-PCR)和Southern分析。
由于檢測重組連接的PCR分析或mRNA分析(RT-PCR)會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，進行了包括完整被靶定區(qū)的長程PCR。LR-PCR覆蓋了從外顯子8到外顯子9末端的7.4kb的α1，3GT基因組序列，兩個引物(αGTE8S和αGTE9A2)都位于重組區(qū)外(圖2)。對照PCFF4-6細胞和3’PCR陰性集落657A-P6僅僅表現(xiàn)出來自野生型α1，3GT基因座的內(nèi)源性7.4kb片段。相反，3′PCR陽性集落中的三個，即，657A-A8，657A-I6和657A-I11，表現(xiàn)出7.4kb的內(nèi)源性條帶和新的9.2kb的條帶，其大小是預期的1.8kb IRES-neo盒在α1，3GT基因座中的靶定的插入。
成功擴增了大約一半(17/30)的LR-PCR陽性集落，以產(chǎn)生足夠的細胞數(shù)目(1×106個細胞)用于Southern分析。預期集落對于α1，3 GT基因座上的敲除是雜合的，因此它們應該具有α1，3 GT基因的一個正常的經(jīng)過修飾的基因拷貝和一個破壞的拷貝。采用BstEII消化，α1，3GT敲除細胞應該具有兩個條帶一個7kb條帶，其大小是預期的內(nèi)源α1，3 GT等位基因的大小，以及一個9kb條帶，其是在α1，3 GT基因座中插入IRES-neo序列的特征性條帶(圖2)。通過敲除體的Southern分析證實了所有17個LR-PCR陽性集落。用neo的特異性序列重新探測相同的膜，用neo探針檢測9kb條帶，從而證實了IRES-neo盒在α1，3GT基因座中的靶定的插入。
實施例2制備α-1，3-GT基因雜合的豬細胞按照上文所述從妊娠第32天的胎分離雜合α-1，3-GT敲除的胎成纖維細胞(657A-I11 1-6)細胞(也參見Dai et al.Nature Biotechnology 20451(2002))。除去頭和內(nèi)臟后，用Hanks平衡鹽溶液(HBSS；Gibco-BRL，Rockville，MD)清洗一些胎，置于20ml HBSS中，并且用小手術剪剪碎。沉淀組織，重懸于裝有40ml DMEM和每胎100U/ml膠原酶(Gibco-BRL)的50ml試管中。在37℃的振蕩水浴中將試管溫育40分鐘。使消化的組織沉降3-4分鐘，將富含細胞的上清液轉(zhuǎn)移到新的50ml試管中并且沉淀。然后將細胞重懸于40ml含有10％胎牛血清(FCS)、1X非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉(Gibco-BRL)和2ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF；Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)的DMEM中，并且接種到10cm的平皿中。在達到鋪滿時對所有的細胞進行冷凍保存。除去頭和內(nèi)臟后，用Hanks平衡鹽溶液(HBSS；Gibco-BRL，Rockville，MD)清洗一些胎，置于20ml HBSS中，并且用小手術剪剪碎。用彎曲的手術鉗搗碎胎，緩慢通過60目的金屬篩(Sigma，St.Louis，MO)，以便不產(chǎn)生過多的熱。然后沉淀細胞懸浮液，重懸于30ml含有10％FCS、1X非必需氨基酸、2ng/ml bFGF和10μg/ml慶大霉素的DMEM中。將細胞接種到10cm的平皿中，培養(yǎng)1-3天，并且冷凍保存。對于轉(zhuǎn)染，通過電穿孔將10μg線性化的載體DNA導入2百萬個細胞中。在轉(zhuǎn)染后48小時，將轉(zhuǎn)染的細胞以每孔2000個細胞的密度接種到48孔板中，用250μg/ml G418(Gibco-BRL)進行選擇。構建靶定ATG(起始密碼子)的α-1，3-GT敲除載體(pPL680)，其也含有neo基因，以敲除α-1，3-GT基因的第二個等位基因。通過電穿孔用pPL680轉(zhuǎn)染這細胞，并且用純化的艱難梭菌毒素A選擇α1，3Gal陰性表型(描述于下文)。
實施例3用艱難梭菌毒素A選擇α-1，3-GT基因純合的豬細胞毒素A細胞毒性曲線將豬細胞(PCFF4-6)在毒素A的10倍系列稀釋液(0.00001μg/ml-10μg/ml)中暴露1小時或過夜。在24孔板中培養(yǎng)細胞，在37℃下用毒素溫育1小時或過夜。該暴露的結(jié)果詳述于表2。明顯地，暴露于1μg/ml毒素A1小時，導致對＞90％的細胞的細胞毒性作用。因此，選擇1μg/ml或略高于1μg/ml的毒素A濃度來選擇遺傳改變的細胞。
表2.暴露1小時和暴露過夜的毒素A毒性
通過電穿孔，用10μg/ml線性化的載體DNA(啟動子包載)轉(zhuǎn)染來自豬胚胎的解聚的細胞(I-111-6)，該細胞在galα-1，3-GT基因的一個等位基因含有以前鑒定的被靶定的敲除(Dai et al.)。48小時后，將細胞以每孔2000個細胞的密度接種到48孔板中，用250μg/ml G418進行選擇。轉(zhuǎn)染后5天，從孔取出培養(yǎng)基，更換為含有2μg/ml毒素A的培養(yǎng)基(高葡萄糖的DMEM，其中含有2.8ng/ml bFGF和20％FCS)。37℃下將細胞暴露于毒素A的選擇作用，持續(xù)2小時。取出含有毒素A的培養(yǎng)基以及任何從板釋放出來的受影響的細胞，用新鮮培養(yǎng)基清洗剩余的細胞，更換了不含毒素A的培養(yǎng)基。10天后，再次將細胞暴露于培養(yǎng)基中的1.3μg/ml的毒素A。除去培養(yǎng)基、毒素A和溶液中的任何細胞，清洗剩余的細胞，更換培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)染后16天，收獲表現(xiàn)出毒素A不敏感的單集落，稱作680B1，將其一部分用于DNA分析和凝集素染色。DNA分析表明毒素A不敏感不是由于第二靶載體的整合，但是，細胞沒有被GSL IB-4凝集素染色，表明發(fā)生了基因座的功能性敲除。將680B1雙敲除細胞用于核轉(zhuǎn)移到5個受體中，得到三個妊娠。這些妊娠中的兩個在第一個月同時流產(chǎn)；在妊娠第39天從剩余的妊娠收獲4個胎，將細胞解聚，接種到組織培養(yǎng)物中。在37℃下將這些胎細胞(680B1-1，680B1-2，680B1-3，680B1-4)暴露于1μg/ml的毒素A1小時，然后取出培養(yǎng)基，清洗細胞，更換不含毒素A的培養(yǎng)基。第1、2和4個胎不受毒素A的影響，而大多數(shù)來自第3個胎的細胞聚攏，表明該胚胎對毒素A的細胞毒性作用敏感。
FACS分析表明，第1、2和4個胎不結(jié)合GS IB4凝集素(參見表3)，而第3個胎不結(jié)合凝集素。這表明第1、2和4個胎不攜帶該特定凝集素特異的表位α1，3 gal.
表3.用GS-IB4凝集素進行的680B1-1至680B1-4細胞的FACS結(jié)果GS IB4凝集素陽性細胞(％)
在來自所有4個胎的細胞上進行補體固定測定。補體裂解測定開發(fā)為缺乏αgal表達的生物測定。人血清含有高水平的預先形成的抗αgal抗體和全部的補體調(diào)節(jié)蛋白(C3途徑)?？功羐al抗體結(jié)合時細胞表面αgal的存在激活了補體級聯(lián)，導致補體介導的細胞裂解。αgal陰性細胞將抗補體介導的裂解。在三個獨立的測定中，將B1和對照豬細胞暴露于含補體的人血清，進行測定以評估對α-gal引起的補體介導的細胞裂解的敏感性或抗性。用B1-1、B1-2和B1-4細胞以及雜合GTKO細胞(B1-3，gal陽性)進行測定，用野生型α-gal(+)PCFF4-6豬細胞作為對照。將細胞暴露于三種處理之一；兩個陰性對照，即牛血清白蛋白(BSA)和熱滅活的人血清(HIA-HS)不含有任何功能性補體蛋白，因此預期不會導致任何顯著的細胞裂解；第三種處理，即未進行熱滅活的人血清(NHS)含有功能性人補體以及抗gal特異性抗體，因此預期將裂解細胞表面含有半乳糖α1，3半乳糖的細胞。
圖1所示結(jié)果明確證明了B1-1，B-2和B1-4細胞抗人補體介導的裂解，而α1，3 Gal陽性的B1-3細胞與野生型PCFF4-6細胞一樣，對人血漿仍然是敏感的。
來自所有胎的cDNA的測序結(jié)果表明，第1、2和4個胎在第二個α1，3 GT等位基因含有點突變，即可以產(chǎn)生功能障礙酶的改變(參見圖2)。該突變發(fā)生在編碼區(qū)的bp424，具體地，發(fā)生在α-1，3-GT(GGTA1)基因(GenBank登記號L36152)的外顯子9的第二個堿基對，其胸腺嘧啶殘基轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤殘基，導致在第142位的氨基酸由酪氨酸取代為天冬氨酸。
這是一個顯著的轉(zhuǎn)變，因為親水氨基酸酪氨酸是α1，3GT的UDP結(jié)合位點的關鍵成分(參見圖3)。牛α-1，3-GT蛋白的晶體結(jié)構的分析表明，該酪氨酸是酶的催化結(jié)構域的中心，參與UDP-Gal結(jié)合(Gastinel et.al.，EMBO Journal 20(4)638-649，2001)。因此，預期從酪氨酸(疏水氨基酸)改變?yōu)樘於彼?親水氨基酸)將導致αGT功能的破壞(如所觀察到的)。
為了證實突變的cDNA不會產(chǎn)生功能性αGT蛋白，將來自所有4個細胞的第二個等位基因的cDNA克隆到表達載體中，將該GT表達載體轉(zhuǎn)移到人成纖維細胞(HeLa細胞)中，以及轉(zhuǎn)移到原代獼猴細胞中。由于人和古代猴缺乏功能性α1，3 GT基因，HeLa細胞在細胞表面將不具有α1，3半乳糖(如通過凝集素結(jié)合實驗所測定的)。結(jié)果表明，當用獲自B1-1，B1-2和B1-4細胞的cDNA轉(zhuǎn)染時，通過IB4-凝集素染色測定出仍然是α1，3 Gal陰性的，而用來自B1-3的cDNA轉(zhuǎn)染的獼猴細胞產(chǎn)生了功能性α1，3 GT轉(zhuǎn)錄物，并且因此是α1，3 Gal陽性的。明顯地，具有天冬氨酸突變(代替酪氨酸)的細胞不能產(chǎn)生功能性α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。
實施例4用純合α1，3 GT缺陷的胎成纖維細胞作為核供體產(chǎn)生克隆豬制備用于核轉(zhuǎn)移的細胞按照上文的普遍描述，對供體細胞進行遺傳操作，產(chǎn)生對于α1，3GT缺陷是純合的細胞。通過本領域公知的方法進行核轉(zhuǎn)移(參見，例如Dai et al.，Nature Biotechnology 20251-255，2002；和Polejaeva etal.，Nature 40786-90，2000)。
在hCG注射后46-54小時，通過用預熱的含有牛血清白蛋白(BSA；4g/l)的Dulbecco′s磷酸緩沖液(PBS)對輸卵管反向沖洗，收集卵母細胞(如Polejaeva，I.A.，et al.(Nature 407，86-90(2000)的描述)。按照Polejaeva，I.A.，et al.(Nature 407，86-90(2000))的描述，在成熟后40-42小時開始進行體外成熟的卵母細胞(BioMed，Madison，WI)的去核。38℃下在含有4g/l的BSA的PBS中清洗回收的卵母細胞，38℃下轉(zhuǎn)移到不含鈣的磷酸鹽緩沖的NCSU-23培養(yǎng)基中，用于轉(zhuǎn)移到實驗室。為了去核，我們將卵母細胞在含有5μg/ml細胞松弛素(Sigma)和7.5μg/ml Hoechst 33342(Sigma)的不含鈣的磷酸鹽緩沖的NCSU-23培養(yǎng)基中38℃下溫育20分鐘。然后用18μM玻璃移液管(Humagen，Charlottesville，Virginia)吸出直接位于第一極體下的少量細胞質(zhì)。我們將吸出的核體暴露于紫外光，以證實赤道板的存在。
為了核轉(zhuǎn)移，將單個成纖維細胞置于透明帶下與每個去核的卵母細胞接觸。通過施加5V的AC脈沖5秒，然后施加兩個1.5kV/cm的DC脈沖60微秒誘導融合的活化，每個脈沖都是用ECM2001Electrocell Manipulator(BTX Inc.，San Diego，CA)產(chǎn)生的。38.6℃下在潮濕的5％CO2氣氛下在NCSU-23培養(yǎng)基中將融合的胚培養(yǎng)1-4小時，然后轉(zhuǎn)移到動情期同步的受體小母豬的輸卵管中。通過口服給予混合在飼料中的18-20mg Regu-Mate(Altrenogest，Hoechst，Warren，NJ)，使雜交小母豬(大白豬/Duroc/Landrace)(280-400磅)同步為受體。Regu-Mate連續(xù)喂飼14天。在最后一次Regu-Mate處理后約105小時，肌內(nèi)給予一千單位的人絨毛膜促性腺激素(hCG，Intervet America，Millsboro，DE)。hCG注射后22-26小時，則進行胚胎轉(zhuǎn)移。
然后將毒素A用于選擇作為核供體的豬成纖維細胞，其是通過上文詳細描述的方法產(chǎn)生的。
胚胎轉(zhuǎn)移和得到存活的出生在通過核轉(zhuǎn)移生產(chǎn)活的α-1，3-GT dKO豬的最初嘗試中，用遺傳操作的供體細胞進行總共16個胚胎的轉(zhuǎn)移。建立了9個最初的妊娠，但是僅有兩個超過了妊娠第75天。5只小豬出生于2002年7月25日。一只小豬在出生后立即死亡，另外4只在出生后存活，并且是正常的(圖4)。
實施例5純合α-1，3-GT敲除豬的分析從所有5只雙敲除的小豬獲得尾成纖維細胞和臍組織區(qū)段，按照上文所述用GS-IB4凝集素染色。沒有觀察到染色，表明這些動物完全缺乏組織表面上的半乳糖α1，3半乳糖表位(數(shù)據(jù)未示出)。從死亡小豬(761-1)分離的主動脈內(nèi)皮細胞和肌肉和尾成纖維細胞是GS-IB4凝集素染色陰性的。小豬761-1的肌肉成纖維細胞的FACS分析也表現(xiàn)出GS-IB4結(jié)合的陰性結(jié)果。獲自小豬761-1的肝臟、腎、脾、皮膚、腸、肌肉、腦、心臟、胰腺、肺、主動脈、舌、臍和尾的組織區(qū)段都是GS-IB4染色陰性的，表明完全缺乏可檢測的細胞表面α1，3Gal表位(Phelps etal.，Science 299411-414，2003，包括圖S3)。
我們用α1，3GT敲除小鼠進行了體內(nèi)免疫原性檢測。我們將分離自小豬761-1的胰腺的胰島樣細胞簇(ICCs)腹膜內(nèi)注射到α1，3GT敲除小鼠中。我們用來自新生野生型小豬的ICCs作為對照。如圖5所示，在注射來自α1，3GT DKO小豬的ICCs后，在α1，3GT敲除小鼠中沒有觀察到針對α1，3Gal的免疫球蛋白M(IgM)的滴度增加，相反的是，在注射了野生型小豬ICCs的小鼠中觀察到了IgM滴度的顯著增加(Phelps et al.，Science 299411-414，2003，包括圖S4)。該結(jié)果明確證明了DKO小豬細胞不產(chǎn)生任何α1，3Gal表位。
如在用于克隆這些動物的680B1-2細胞中所觀察到的，從所有5只小豬獲得的DNA的測序證明了在GGTA1基因的bp424存在突變(圖2)。
由于這是第一次成功產(chǎn)生了一窩α-GT dKO豬，通過核轉(zhuǎn)移又產(chǎn)生了隨后的兩窩dKO小豬，一種情況下(窩662)采用dKO胎成纖維細胞作為核供體細胞。用來自窩761的一個成員的尾成纖維細胞作為核供體，通過核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了窩660。這些出生概括于表4。
表4通過核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的α-GT雙敲除體出生的概括
*PM＝通過點突變進行的GT等位基因敲除；Neo＝通過同源重組和Neo選擇標記基因的插入進行的GT等位基因敲除。該表中列出的所有豬都是純合的GT敲除體。
實施例6對雜合α1，3 GT單敲除(SKO)公豬和母豬進行配種，建立雙敲除(DKO)豬的小群體Southern印跡證實產(chǎn)生了克隆的GT-SKO母豬和克隆的公豬。通過天然配種和人工受精(AI)對雜合(單基因α1，3GT敲除豬)公豬和母豬進行配種，產(chǎn)生用于臨床前研究和人類臨床試驗的DKO豬群體。
實施例7來自雙敲除動物的皮膚組織的去細胞要加工的生物組織首先從上文描述的功能性α1，3GT被滅活的動物供體如豬獲得或獲取。用皮刀或本領域技術人員公知的其它裝置從供體動物切下皮膚組織。將組織置于穩(wěn)定轉(zhuǎn)運溶液中，所述溶液阻止和防止?jié)B透壓、缺氧、自溶和蛋白水解引起的降解、防止細菌污染和減少可能發(fā)生的機械損害。穩(wěn)定溶液通常包含此處描述或本領域技術人員公知的合適的緩沖液、一種或多種抗氧化劑、一種或多種滲透壓調(diào)節(jié)劑、抗生素、一種或多種蛋白酶抑制劑。
然后在加工溶液中溫育組織，以便從結(jié)構基質(zhì)除去活的抗原性細胞(包括上皮細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞)而不破壞基底膜復合體或膠原基質(zhì)的結(jié)構完整性。加工溶液通常含有此處描述或本領域技術人員公知的合適的緩沖液、鹽、抗生素、一種或多種去污劑、一種或多種蛋白酶抑制劑和/或一種或多種酶。用該加工溶液處理組織是在一定的濃度下進行一定時間段，從而避免基底膜復合體的降解并且保持包含膠原纖維和彈性蛋白的基質(zhì)的結(jié)構完整性，以產(chǎn)生去細胞的組織。
對組織去細胞后，將其溫育在冷凍保存溶液中。該溶液通常包含一種或多種冷凍保護劑，使得冷凍過程中可能發(fā)生的對結(jié)構基質(zhì)的冰晶損害最小，還包含一種或多種干燥保護成分，使得干燥過程中的結(jié)構破壞改變最小，并且可以包含在冷凍過程中不膨脹也不收縮的有機溶液和水的組合。在該冷凍保存溶液中溫育后，將組織包裝到無菌容器中。作為附加或替代的方法，用諸如戊二醛的交聯(lián)劑固定去細胞的組織，并且在移植前儲存。
實施例8從雙敲除動物獲取異種移植物的韌帶要加工的生物組織首先從上文描述的功能性α1，3GT被滅活的動物供體如豬獲得或獲取。用合適的手術技術從供體動物切下韌帶組織。在第一步中，從非人動物的關節(jié)取出完整的韌帶。從新處死的動物收集作為韌帶來源的關節(jié)，立即置于合適的無菌等滲或其它組織保存溶液中。在屠宰動物后盡快獲取關節(jié)，并且在低溫下進行，即，在大約5℃-大約20℃的大致范圍進行，使得韌帶組織的酶降解最少?？梢垣@取單獨的韌帶或獲取帶有連接于一端或兩端的一塊骨的韌帶。一塊骨代表基本上為圓柱形的骨栓，骨栓可以是直徑大約9-10mm，長度大約20-40mm，其連接于韌帶。仔細鑒定韌帶，并且進行解剖，使其不帶有粘附的組織。然后在大約10倍體積的無菌冷水中清洗，除去殘留的血液蛋白和水溶性材料。然后在室溫下將異種移植物浸入乙醇中大約5分鐘，以便對組織消毒并且除去非膠原材料。
浸過乙醇后，將異種移植物植入關節(jié)?；蛘?，對異種移植物進行至少一種以下處理放射處理、用乙醇或臭氧處理、一個或多個冷凍和融化的循環(huán)，和/或用化學交聯(lián)劑處理。在凍/融循環(huán)處理中，通過在室溫下(大約25℃)將融化的異種移植物浸入等滲鹽水浴大約10分鐘而使異種移植物融化。沒有使用外部熱或放射源，以使纖維降解最少。
此外或者替代地，對異種移植物進行細胞破壞處理，以便在用糖苷酶體外消化異種移植物之前殺死韌帶的細胞。從有核細胞和細胞外成分除去表面碳水化合物部分后，有核細胞，即活細胞，重新表達表面碳水化合物部分。
此外或者替代地，在殺死韌帶細胞之前或之后，用糖苷酶體外消化異種移植物，酶促消除抗原性表面碳水化合物部分。也可以使用其它酶，以便除去任何殘留的非-αgal碳水化合物部分。
在植入前，用諸如無花果蛋白酶或胰蛋白酶的蛋白水解酶消化處理本發(fā)明的韌帶異種移植物，以便增加組織柔性，或用抗鈣化劑、抗血栓形成包衣、抗生素、生長因子或本領域公知的其它藥物包被，以便增強異種移植物摻入到受體關節(jié)中。此外或者替代地，用公知的方法，如額外的戊二醛或甲醛處理、環(huán)氧乙烷消毒、環(huán)氧丙烷消毒等進一步對韌帶異種移植物進行消毒。冷凍儲存異種移植物，直到需要使用。
采用公知的關節(jié)鏡手術技術，由本領域技術人員將韌帶異種移植物或其區(qū)段植入到受損的人膝關節(jié)中。用于進行關節(jié)鏡技術的特殊儀器是本領域技術人員公知的，其確保準確和可重復地放置韌帶植入物。最初，用公知的方法完成膝關節(jié)的完整診斷性關節(jié)鏡檢查。用手術刮刀除去不能恢復地破壞的韌帶。確定韌帶的解剖插入部位，鉆孔以容納骨栓。骨栓的大小是大約9-10mm寬，大約9-10mm深，大約20-40mm長。將異種移植韌帶通過鉆孔放入，用干涉螺絲固定。進行常規(guī)關閉。
實施例9來源于純合α1，3 Gal敲除豬的小腸粘膜下層(SIS)的組織移植物組織移植物材料來源于缺乏任何功能性α1，3 GT表達的動物，如豬，并且包含粘膜下組織和基底粘膜組織，所述組織是從小腸的一段，如空腸分層剝離的，空腸是在十二指腸和回腸之間延伸的小腸的一部分。
通過首先切除一段自生的近端空腸，然后進行中線開腹手術切口，制備獲自α1，3 gal缺陷豬的小腸的SIS移植物。然后將切除的空腸段包裹在生理鹽水中浸漬過的手術紗布中。完成腸吻合后，通過摩擦腸組織以除去包括漿膜和粘膜肌層的外層和至少包括粘膜的腔部分的內(nèi)層而制備切下的腸段。在輕摩擦的條件下在致密層和固有層之間分層剝離粘膜。更具體地，在利用Adson-Brown鉗和Metzenbaum剪從腸段除去腸系膜組織后，通過用解剖刀柄和濕紗布進行縱向擦拭運動，從腸段分層剝離漿膜和粘膜肌層(外組織層)。翻轉(zhuǎn)腸段后，用相同的擦拭運動從下面的組織分層剝離粘膜的腔部分。小心防止粘膜下層穿孔。也除去保留在移植物表面的來自分層剝離的各層的組織“標志”。任選地，可以首先翻轉(zhuǎn)腸段，然后剝離腔層，然后重新插入到最初的方向，以便除去漿膜和粘膜肌層。移植物材料是發(fā)白的、半透明的組織管，大約0.1mm厚，通常由粘膜和附著的粘膜肌層和致密層組成。對于血管移植物制備，使制備的移植物翻轉(zhuǎn)到其最初的方向，使得致密層作為移植物的腔面。
通常用鹽水清洗制備的移植物材料，并且置于10％的硫酸新霉素溶液中大約20分鐘，此后移植物材料可以進行使用。用通常用于組織移植物應用的常規(guī)手術程序施用移植物。用于非血管組織移植物應用時，管狀移植物材料可以縱切并且鋪開，以形成組織“斑片”?？梢栽谀c組織的“斑片”上進行上述完整的組織分層程序，所述斑片是通過縱切腸段，并且將其“鋪開”以形成移植前斑片而制備的。制備的移植物組織斑片例如可以用作皮膚移植物材料，用于硬腦膜修復或用于修復其它身體組織缺損，所述缺損導致其自身需要具有該移植物組合物的物理和功能特征的組織移植物斑片的手術應用。Gal KO SIS斑片的其它應用包括用于轉(zhuǎn)子套修復、疝氣、腹壁修復、治療尿失禁的吊帶、燒傷、皮膚置換、美容手術，包括乳腺重建、面部缺陷、唇重建、眼瞼間隔物移植物、凹陷的斑痕的修復、粘膜移植物、鼻唇溝、口表面重修、腮腺切除術、鼻中隔穿孔修復、鼻整形術臨時的傷口敷料、傷口覆蓋物、鼓膜成形術、前庭成形術和其它軟組織缺損。
對用于血管移植物，移植物的直徑大約與受體血管的直徑相同。這是通過以下步驟實現(xiàn)的操作組織移植物以確定具有與受體血管大約相同的直徑的圓柱形，并且縫合或以其它方式將組織移植物縱向固定，形成所述血管移植物。因此，例如，血管移植物是通過以下方法制備的選擇具有與受體血管相同的外徑的無菌玻璃桿，并且將玻璃桿插入移植物腔。然后聚集冗余的組織，通過沿移植物的長度縫合(例如，用兩根連續(xù)的縫線或單根中斷的縫線)或通過采用其它本領域公知的組織固定技術獲得需要的腔直徑(也參見美國專利No 4,956,178)。
本文描述的本發(fā)明可在不存在本文中沒有明確公開的任何要素或限制條件下實施。已采用的術語和表達用作描述性用語而不是限制性用語，且并非意圖使用這種術語和表達來排除所顯示和描述的特征或其部分的任何等同方案，不過應認識到，在要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)可能有各種修改方案。因此，應當理解，盡管本發(fā)明已在本文中明確地公開，本領域技術人員可采用本文公開概念的任選特征、修改或變化，并且這種修改或變化被認為落入后附權利要求書所定義的本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，在本發(fā)明特征或方面以馬庫什組方式描述的情況下，本領域技術人員將認識到，本發(fā)明也因此以馬庫什組的任何單個成員或成員子集的方式來描述。
權利要求
1.一種修復物，包含來源于缺乏任何α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的組織產(chǎn)品。
2.權利要求1的修復物，其中所述組織是硬組織。
3.權利要求1的修復物，其中所述組織是軟組織。
4.權利要求1的動物，其中所述動物是有蹄動物。
5.權利要求4的動物，其中所述有蹄動物是豬。
6.權利要求2的修復物，其中所述硬組織是骨或其片段或衍生物。
7.權利要求3的修復物，其中所述軟組織選自皮膚、真皮、粘膜下層、韌帶、腱和軟骨或其片段或衍生物。
8.權利要求1的修復物，其中所述組織是硬組織和軟組織的組合。
9.權利要求8的組織，其中所述組織是骨-腱-骨移植物。
10.來源于缺乏任何α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的去細胞的組織產(chǎn)品。
11.權利要求9的組織，其中所述動物是有蹄動物。
12.權利要求10的組織，其中所述有蹄動物是豬。
13.權利要求9的去細胞的組織，其中所述組織是軟組織。
14.權利要求9的組織，其中所述軟組織是皮膚組織。
15.權利要求9的組織，其中所述軟組織是粘膜下組織。
16.權利要求11的組織，其中所述粘膜下組織來源于小腸。
17.權利要求9的組織用作支架的用途。
18.來源于缺乏任何α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達的動物的組織產(chǎn)品用于重建或修復人體部分的用途。
19.權利要求18的組織，其中所述動物是有蹄動物。
20.權利要求18的組織，其中所述有蹄動物是豬。
21.權利要求18的組織的用途，其中所述組織用于人類整形外科重建或修復。
22.權利要求21的組織用于轉(zhuǎn)子套修復的用途。
23.權利要求21的組織用于修復或重建選自骨、腱、韌帶和軟骨的組織的用途。
24.權利要求21的組織的用途，其中所述組織是骨-腱-骨移植物。
25.權利要求18的組織的用途，其中所述組織用于人類皮膚修復。
26.權利要求18的組織的用途，其中所述組織用于人類軟組織修復。
27.權利要求18的組織的用途，其中所述組織是去細胞的。
28.權利要求27的去細胞的組織的用途，其中所述組織用作支架以重建或修復人體部分。
全文摘要
本發(fā)明提供了來源于動物的組織，所述動物缺乏任何功能性α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α－1，3.GT)表達。所述組織可以用于異種移植領域，如整形外科重建和修復、皮膚修復和內(nèi)部組織修復，或用作醫(yī)學設備。
文檔編號A61F2/02GK1953657SQ200580015470
公開日2007年4月25日 申請日期2005年3月17日 優(yōu)先權日2004年3月17日
發(fā)明者D·阿亞里斯, P·羅里克 申請人:雷維維科公司