一種產(chǎn)γ-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是設(shè)及一種重組大腸桿菌及其在產(chǎn)丫 -環(huán)糊 精糖基轉(zhuǎn)移酶方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)糊精（簡(jiǎn)稱CD)是環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶通過環(huán)化反應(yīng)作用淀粉或者其衍生物后生 成的a-1，4-糖巧鍵連結(jié)而成的低聚糖化合物，一般由六個(gè)W上D-化喃葡萄糖單元構(gòu)成。 最常見的CD是由六個(gè)、屯個(gè)或八個(gè)葡萄糖單元構(gòu)成，分別被命名為a-、0-和丫-CD。在 S中常見的CD中，丫-CD具有更好的應(yīng)用前景。與a-、P-CD相比，丫-CD具有更高的溶 解度（233g?kl，25°C)和更大的空腔，能夠包合更大分子量的化合物，并改善運(yùn)些化合物 的性質(zhì)；此外，Y-CD安全性高，適合用做食品添加劑和胃腸外投藥，因此它具有廣闊的應(yīng) 用空間。但是在現(xiàn)有的條件下，T-CD轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)物特異性較差，導(dǎo)致成本太高，限制其大 規(guī)模應(yīng)用。
[0003] 近年，為了克服天然菌株的丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶低生產(chǎn)能力，丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn) 移酶基因在基因工程菌中過量表達(dá)被認(rèn)為是最有效途徑之一。目前，一些丫-環(huán)糊精糖基 轉(zhuǎn)移酶在枯草芽抱桿菌中實(shí)現(xiàn)了胞外表達(dá)，但表達(dá)量不是太大。而在大腸桿菌中雖然表達(dá) 量較大，但重組酶大多是W不溶性包涵體形式存在，即使一些策略能將其定位于周質(zhì)空間， 周質(zhì)中的酶液在工業(yè)上也很難大規(guī)模回收，運(yùn)些都限制了重組丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的工 業(yè)應(yīng)用。因此，構(gòu)建用于大腸桿菌胞外分泌信號(hào)膚，提高丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶胞外酶活， 對(duì)于丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶工業(yè)化生產(chǎn)需求和降低成本有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請(qǐng)人提供了一種產(chǎn)丫 -環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的 重組大腸桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的化CD信號(hào)膚與常用的化IB信號(hào)膚相比，丫-環(huán)糊精糖 基轉(zhuǎn)移酶酶活更高，解決了T-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶胞外分泌量低的問題；應(yīng)用本發(fā)明方法 生產(chǎn)丫 -環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，產(chǎn)量高、工藝簡(jiǎn)化、便于工業(yè)化應(yīng)用。 陽(yáng)0化]本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種產(chǎn)丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌，在丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因與 T7啟動(dòng)子之間加入信號(hào)膚形成重組基因，將重組基因在宿主大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)得到的重 組大腸桿菌；所述丫 -環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的核巧酸序列是SEQIDNO. 5 ;所述信號(hào)膚的核巧 酸序列是沈QIDNO. 4。所述重組大腸桿菌的出發(fā)宿主菌是E.COliBL2UDE3)。
[0007] 所述信號(hào)膚的核巧酸序列沈QIDNO. 4可W由沈QIDNO. 2或沈QIDNO. 3所代 替。所述將重組基因在宿主大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)得到的重組大腸桿菌是指：將所述重組基 因連接到表達(dá)質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌中得到重組大腸桿菌。所述表 達(dá)質(zhì)粒是：pET-20b(+)。
[0008] 所述的重組大腸桿菌的具體制備方法為：
[0009] (I)在SEQIDNO. 5所示核巧酸序列的丫 -環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因與T7啟動(dòng)子 之間加入SEQIDNO. 1所示核巧酸序列的化IB信號(hào)膚，形成的重組基因（pET-2化(+)/ PelB-CGT)，W其為模板，用序列是SEQIDNO. 6所示引物對(duì)整個(gè)表達(dá)載體進(jìn)行PCR;
[0010] 似將PCR產(chǎn)物用EcoRV、NdeI雙酶切得到不含信號(hào)膚的重組基因 (pET-20b(+)/CGT);
[0011] (3)根據(jù)SEQIDNO. 4所示序列的信號(hào)膚設(shè)計(jì)引物為SEQIDNO. 9所示的核巧酸 序列，進(jìn)行PCR，所得產(chǎn)物用EcoRV、NdeI雙酶切，得到SEQIDNO. 4所示核巧酸序列的信 號(hào)膚；
[0012] (4)用連接酶連接步驟（2)的重組基因和步驟（3)的SEQIDNO. 4所示序列核巧 酸的信號(hào)膚得到重組質(zhì)粒（pET-20b(+VDacD-CGT);
[001引 妨將步驟4得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.COli化21觸如中，即得到重組大腸桿菌。
[0014] 所述的的重組大腸桿菌的應(yīng)用為生產(chǎn)丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0015] 所述重組菌的構(gòu)建方法具體如下：依據(jù)合成的核巧酸序列如SEQIDNO. 5所示的 來源于A化ali地ilicBacillussp.G-825-6的丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因、核巧酸序列如 沈QIDNO. 1至沈QIDNO. 4所示的4種信號(hào)膚（分別命名為化1B，SufI,OmpA,DacD)設(shè) 計(jì)引物，采用PCR分別將信號(hào)膚添加到丫 -環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因與T7啟動(dòng)子之間獲得重 組基因（PelB-CGT，SufI-CGT,OmpA-CGT,DacD-CGT);將所述的重組基因連接到祀T-20b(+) 表達(dá)載體，得到重組質(zhì)粒；將所述的重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.COli化21 0E3)，獲得重組 大腸桿菌工程菌株。
[0016] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0017] 本發(fā)明通過構(gòu)建含有胞外分泌信號(hào)膚的丫 -環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶重組基因，實(shí)現(xiàn)了 丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶大腸桿菌高效分泌表達(dá)，解決了 丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)量低的問 題。核糖體合成的蛋白前體依賴SecB的途徑跨內(nèi)膜，定位到周質(zhì)空間，最后成熟蛋白再分 泌到胞外。當(dāng)成熟蛋白質(zhì)N端前14位氨基酸為不折疊氨基酸時(shí)，才能被分泌到細(xì)胞外，而 不同信號(hào)膚引導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌的效率不同，一方面，可能是由于信號(hào)膚抑制蛋白質(zhì)折疊的能 力不同，即維持胞內(nèi)蛋白質(zhì)處于分泌狀態(tài)的能力不同；另一方面，由于成熟蛋白質(zhì)與信號(hào)膚 N端帶相反電荷，也許它們之間的靜電相互作用有利于發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成，有利于疏水性區(qū)域插 入至細(xì)胞膜中，從而有利于分泌蛋白的有效分泌表達(dá)?；疌D信號(hào)膚與化IB信號(hào)膚相比， 化CD信號(hào)膚抑制蛋白質(zhì)折疊的能力更強(qiáng)，分泌表達(dá)效果更好。
【附圖說明】 陽(yáng)01引圖1為實(shí)施例1~3克隆表達(dá)載體構(gòu)建圖；
[0019] 圖2為實(shí)施例1~3重組大腸桿菌工程菌的丫 -環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶酶活；
[0020] 圖3為實(shí)施例3的化CD信號(hào)膚序列分析。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。所述表達(dá)載體購(gòu)自和宿主菌購(gòu) 自TransGen公司。
[0022] 實(shí)施例1 :祀T-20b(+)/SufI-CGT重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0023]A化aliphilicBacillussp.G-825-6 丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因全長(zhǎng) 2097bp。根 據(jù)SEQIDNO. 2信號(hào)膚的核巧酸序列設(shè)計(jì)引物。如圖1所示，經(jīng)過PCR將信號(hào)膚序列與SEQ IDNO. 5所示的基因序列進(jìn)行連接，獲得重組基因片段，（1)WSEQIDNO. 5所示核巧酸序 列的丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因與T7啟動(dòng)子之間加入了SEQIDNO. 1所示核巧酸序列的 化18信號(hào)膚形成的重組基因（口61'-2化(+)/化18-〔61')為模板，用序列是56〇10^.6所示 引物對(duì)整個(gè)表達(dá)載體進(jìn)行PCR;(2)PCR產(chǎn)物回收后用EcoRV、NdeI雙酶切，得到不含信號(hào) 膚的的重組基因（pET-2化(+)/CGT) ;(3)根據(jù)SEQIDN0.2所示序列的信號(hào)膚設(shè)計(jì)引物為 SEQIDNO. 7所示的核巧酸序列，進(jìn)行PCR，產(chǎn)物回收后用EcoRV、NdeI雙酶切，得到SEQ IDNO. 2所示核巧酸序列的信號(hào)膚；(4)用連接酶連接步驟（2)的重組基因和步驟（3)的 SEQIDNO. 2所示核巧酸序列的信號(hào)膚得到重組質(zhì)粒（pET-2化(+VSufI-CGT);(5)將步驟 4得到的重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化E.COliBL2UDE3)感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布含氨節(jié)（lOOug/mL) LB平板，提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒。測(cè)序工作由上海生工完成。
[0024]祀T-20b(+)/SufI-CGT重組菌的構(gòu)建
[00巧]將含有丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因前添加了信號(hào)膚的重組基因的重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn) 化E.COliBL2UDE3)感受態(tài)細(xì)胞，具體方法如下：
[0026] 1)現(xiàn)將空2血離屯、管放入冰中預(yù)冷2min，然后從-70°C取出E.COliBL21值盼）感 受態(tài)細(xì)胞分裝到2個(gè)離屯、管中，每管裝45JiL;
[0027]。取預(yù)冷質(zhì)粒10yL，2yL，與感受態(tài)細(xì)胞混合，注意操作輕柔，冰上放30min; 陽(yáng)02引扣取1血的LB到離屯、管，42°C預(yù)熱；
[0029] 4)將預(yù)冷的感受態(tài)+質(zhì)粒的細(xì)胞迅速放入42°C水浴熱擊60s，迅速取出放入冰浴 Smin;
[0030] 5)向熱擊處理后的細(xì)胞里加LB培養(yǎng)基（42°C)500化，37°C，200巧m，l.化；
[0031] 6)將經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞5000r/min離屯、5min，棄掉400yL上清液；
[0032] 用槍頭將泡在離屯、管底的菌重新懸浮，涂布在含氨節(jié)的LB培養(yǎng)基中，37°C，過夜。
[0033] 祀T-20b(+)/SufI-CGT重組大腸桿菌的搖瓶培養(yǎng)
[0034] 將本發(fā)明構(gòu)建的工程菌作為生產(chǎn)菌株。種子培養(yǎng)液，接種10mL/50mL種子培養(yǎng)基， 37°C，200r/min培養(yǎng)她。發(fā)酵培養(yǎng)液，接種100mL/500mL發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C，200r/min培養(yǎng)， 當(dāng)菌體培養(yǎng)0D600 = 0. 6時(shí)，加入0.OlmMIPTG，并迅速轉(zhuǎn)至18°C，200r/min，誘導(dǎo)表達(dá)16h。 測(cè)定丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶酶活。種子培養(yǎng)基/發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):膜蛋白腺lOg/l，^Cl lOg/l，酵母粉 5g/L，pH7.0
[0035] 實(shí)施例2 :pET-20b(+) /OmpA-CGT重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0036]A化aliphilicBacillussp.G-825-6 丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因全長(zhǎng) 2097bp。如 圖1所示，根據(jù)SEQIDN0.3信號(hào)膚的核巧酸序列設(shè)計(jì)引物。經(jīng)過PCR將信號(hào)膚序列與SEQ IDNO. 5所示的基因序列進(jìn)行連接，獲得重組基因片段，（1)WSEQIDNO. 5所示核巧酸序 列的丫-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因與T7啟動(dòng)子之間加入了SEQIDNO. 1所示核巧酸序列的 化IB信號(hào)膚形成的重組基因（pET-2化(+)/化1B-CGT)為模板，用序列是SEQIDNO. 6所示 引物對(duì)整個(gè)表達(dá)載體進(jìn)行PCR;(2)PCR產(chǎn)物回收后用EcoRV、NdeI雙酶切，得到不含信號(hào) 膚的的重組基因（pET-2化(+)/CGT) ;(3)根據(jù)SEQIDN0.3所示序列的信號(hào)膚設(shè)計(jì)引物為 SEQIDNO. 8所示的核巧酸序列，進(jìn)行PCR，產(chǎn)物回收后用EcoRV、NdeI雙酶切，得到SEQ IDNO. 3所示核巧酸序列的信號(hào)膚；(4)用連接酶連接步驟（2)的重組基因和步驟（3)的SEQIDNO. 3所示核巧酸序列的信號(hào)膚