專利名稱：作為改善對疫苗的免疫反應(yīng)的佐劑的組合物和使用方法
背景技術(shù)：
身體對微生物的防御由先天性免疫系統(tǒng)的早期反應(yīng)和獲得性免疫系統(tǒng)的后期反應(yīng)介導(dǎo)。先天性免疫包含識別這樣的結(jié)構(gòu)的機(jī)理，該結(jié)構(gòu)例如是微生物病原體的特征，但是不存在于哺乳動物細(xì)胞上。這樣的結(jié)構(gòu)的實(shí)例包括細(xì)菌脂多糖(LPS)、病毒雙鏈RNA和未甲基化的CpG DNA核苷酸。先天性免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞包含嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)。除了先天免疫外，脊椎動物，包括哺乳動物，具有進(jìn)化的免疫學(xué)防御機(jī)制，其受向傳染物的暴露的刺激，并在每次連續(xù)暴露于特定抗原后，增加量級和效力。由于它能適應(yīng)特異性感染或抗原性損傷，已經(jīng)將該免疫防御機(jī)制描述為獲得性免疫。存在兩種類型的獲得性免疫反應(yīng)，即所謂的包含由B淋巴細(xì)胞生成的抗體的體液免疫，和由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。
已經(jīng)描述了2大類T淋巴細(xì)胞CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)和CD4+T輔助細(xì)胞(Th細(xì)胞)。CD8+T細(xì)胞是效應(yīng)細(xì)胞，其通過T細(xì)胞受體(TCR)，識別由例如病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞上的I類MHC分子呈遞的外來抗原。在識別外來抗原后，CD8+T細(xì)胞經(jīng)歷激活、成熟和增殖過程。該分化過程產(chǎn)生CTL克隆，其具有破壞展示外來抗原的靶細(xì)胞的能力。T輔助細(xì)胞另一方面參與體液的和細(xì)胞介導(dǎo)的形式的效應(yīng)物免疫反應(yīng)。關(guān)于體液的或抗體的免疫反應(yīng)，抗體由B淋巴細(xì)胞通過與Th細(xì)胞的相互作用來生成。具體地，胞外抗原，例如循環(huán)微生物，被專門化的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)攝入、加工并與II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子一起呈遞給CD4+Th細(xì)胞。這些Th細(xì)胞又激活B淋巴細(xì)胞，從而導(dǎo)致抗體生成。細(xì)胞介導(dǎo)的或細(xì)胞的免疫反應(yīng)，相反地，起中和位于細(xì)胞內(nèi)位置的微生物的作用，例如在成功感染靶細(xì)胞后。外來抗原，例如微生物抗原，在感染的細(xì)胞內(nèi)合成，并與I類MHC分子一起呈遞到這樣的細(xì)胞的表面。這樣的表位的呈遞，會導(dǎo)致上述的CD8+CTLs的刺激，即一個也由CD4+Th細(xì)胞刺激的過程。Th細(xì)胞由至少2個不同的亞群組成，稱作Th1和Th2細(xì)胞。Th1和Th2亞型代表著Th細(xì)胞的極化群體，其在暴露于抗原后從普通前體分化而來。
每種T輔助細(xì)胞亞型都能分泌細(xì)胞因子，其能促進(jìn)不同的彼此相反的免疫效應(yīng)，并交叉調(diào)節(jié)彼此的擴(kuò)增和功能。Th1細(xì)胞能分泌大量的細(xì)胞因子例如干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)和IL-12和小量的IL-4。Th1-相關(guān)的細(xì)胞因子能促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性，且最頻繁地伴有針對細(xì)胞內(nèi)的病原體的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。相反地，Th2細(xì)胞能分泌大量的細(xì)胞因子，例如IL-4、IL-13和IL-10，但是小量的IFN-γ，并促進(jìn)抗體反應(yīng)。Th2反應(yīng)與體液反應(yīng)具體相關(guān)，例如保護(hù)免受炭疽，和消除蠕蟲感染。
產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是Th1-還是Th2-驅(qū)動的，很大程度上依賴于涉及的病原體和細(xì)胞環(huán)境中的因子，例如細(xì)胞因子。不能激活T輔助反應(yīng)或正確的T輔助亞型，不但不能產(chǎn)生足夠的與特定病原體斗爭的反應(yīng)，還會導(dǎo)致較差的對再次感染的免疫。許多傳染物是細(xì)胞內(nèi)的病原體，其中預(yù)期細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，如Th1免疫所例證的，在保護(hù)和/或治療中起重要作用。而且，對于許多這樣的感染，已經(jīng)證實(shí)不適當(dāng)?shù)腡h2反應(yīng)的誘導(dǎo)，會消極地影響疾病結(jié)果。實(shí)例包括結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、曼氏血吸蟲(S.mansoni)以及利什曼蟲。未治愈形式的人和鼠利什曼病源自強(qiáng)的、但是起反作用的Th2-樣-顯性的免疫反應(yīng)。瘤型麻風(fēng)也似乎表征了一種流行的、但是不合適的Th2-樣反應(yīng)。HIV感染代表著另一個實(shí)例。在這里，已經(jīng)提出，Th1-樣細(xì)胞對其它Th細(xì)胞亞群的比率的降低，可以在向疾病癥狀的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。
作為對抗傳染物的保護(hù)措施，已經(jīng)開發(fā)了針對微生物的接種疫苗規(guī)程。針對感染性病原體的接種疫苗規(guī)程的常見障礙是較差的疫苗免疫原性，不合適的反應(yīng)類型(抗體對細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)，缺少引起長期免疫記憶的能力，和/或不能產(chǎn)生針對給定病原體的不同血清型的免疫。現(xiàn)有的接種疫苗策略靶向?qū)o定的血清型和許多普通病原體(例如，病毒血清型或病原體)特異性的抗體的引發(fā)。必須在復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)上作出努力，以監(jiān)控哪種血清型在世界上是流行的。這方面的一個實(shí)例是，每年監(jiān)控新出現(xiàn)的預(yù)期是主要的傳染品系的流感A血清型。
為了支持接種疫苗規(guī)程，已經(jīng)開發(fā)了能支持針對特定的傳染病的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生的佐劑。例如，已經(jīng)將鋁鹽用作相對安全的且有效的疫苗佐劑，以增強(qiáng)對某些病原體的抗體反應(yīng)。這樣的佐劑的一個缺點(diǎn)是，它們在刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面相對地?zé)o效，并產(chǎn)生很大程度上偏向Th2的免疫反應(yīng)。
為了增加獲得性免疫反應(yīng)的有效性，例如，在接種疫苗規(guī)程中或在微生物感染的過程中，因此重要的是，開發(fā)新的、更有效的疫苗佐劑。本發(fā)明滿足了該需要，并還提供了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了含有抗原和TIM靶向分子或試劑的組合物。本發(fā)明另外提供了使用這樣的組合物的方法。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用組合物刺激個體中的免疫反應(yīng)的方法，所述組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用抗原和TIM靶向分子刺激個體中的免疫反應(yīng)的方法，所述抗原和TIM靶向分子可以在單一組合物中一起施用，或分開施用。
附圖簡述

圖1顯示了小鼠C57BL/6TIM-1等位基因的846bp cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO1)。信號序列標(biāo)有下劃線，編碼粘蛋白結(jié)構(gòu)域的序列為斜體，跨膜結(jié)構(gòu)域標(biāo)有下劃線且為斜體。
圖2顯示了小鼠BALB/cTIM-1等位基因的915bp cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO2)。信號序列標(biāo)有下劃線，編碼粘蛋白結(jié)構(gòu)域的序列為斜體，跨膜結(jié)構(gòu)域標(biāo)有下劃線且為斜體。
圖3顯示了使用單字母氨基酸密碼的小鼠C57B1/6(B6)(SEQ IDNO3)和BALB/c(BALB)(SEQ ID NO4)TIM-1等位基因的蛋白序列對比。用三角形標(biāo)記單個的氨基酸取代，用星形標(biāo)記潛在的N-糖基化位點(diǎn)。
圖4顯示了TIM-1/Fc融合蛋白的實(shí)例，即一種稱作小鼠TIM-1 Ig Fc.nl蛋白的365氨基酸蛋白(SEQ ID NO5)。給出的實(shí)例是前體多肽，其具有人CD5前導(dǎo)序列(標(biāo)有下劃線)，隨后是TIM-1的Ig結(jié)構(gòu)域(無格式文本)和點(diǎn)突變的非-裂解性的小鼠IgG2a Fc的Fc區(qū)(鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)(斜體)。IgG2a Fc結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變的氨基酸有陰影。
圖5顯示了再次刺激后對抗原的增殖。給BALB/c小鼠注射對照(白色)，或接種單獨(dú)的Engerix-BTM(10微克(mcg))(淺灰色陰影)或單劑抗-TIM抗體(50mcg)(深灰色陰影)。在指定的時間，分析脾對乙型肝炎表面抗原的增殖(96小時測定)。
圖6顯示了用抗原再次刺激后細(xì)胞因子的生產(chǎn)。給BALB/c小鼠注射對照(白色)，或接種10mcg乙型肝炎疫苗(淺灰色陰影)，或含有抗-TIM-1抗體的10mcg疫苗(深灰色陰影)。在第7、14和21天，用乙型肝炎抗原體外地刺激脾細(xì)胞。96小時后，分別分析上清液的IFN-γ和IL-4生產(chǎn)。
圖7顯示了乙型肝炎特異性的抗體的生產(chǎn)。在免疫后第7天，通過ELISA，測試來自注射了對照(PBS+明礬白色)或用有(淺灰色陰影)或沒有(深灰色陰影)抗-TIM抗體的乙型肝炎疫苗接種(單劑；50mcg)的小鼠的血清樣品是否存在對乙型肝炎表面抗原特異性的抗體。
圖8顯示了乙型肝炎表面抗原-特異性的脾細(xì)胞的與抗原刺激劑量依賴性關(guān)系的增殖。分離來自用有或沒有100mcg TIM-1單克隆抗體(mAb)的10mcg Engerix-BTM接種一次的小鼠的脾細(xì)胞，并在有或沒有遞增的乙型肝炎表面抗原濃度的情況下培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后，使用Delfia細(xì)胞增殖測定，分析孔的增殖。與接種單獨(dú)的Engerix-BTM疫苗或同種型對照抗體的小鼠相比，接受有TIM-1 mAb的疫苗的小鼠生成了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高的針對特定抗原的增殖反應(yīng)(p＜0.05)。
圖9顯示了在用特定抗原(乙型肝炎表面抗原)刺激后IFN-γ的生產(chǎn)。取出來自上述增殖測定孔的上清液，用于通過ELISA進(jìn)行細(xì)胞因子分析。與接受單獨(dú)的疫苗或有同種型對照抗體的疫苗的小鼠相比，接受有TIM-1 mAb的疫苗的小鼠生產(chǎn)了顯著更高量的IFN-γ(p＜0.05)，作為對抗原刺激的反應(yīng)。沒有檢測到IL-4。
圖10表明，與同種型對照抗體或CpG寡核苷酸相比，用HIVp24抗原+TIM-1 mAb免疫的小鼠產(chǎn)生了顯著更高的對抗原的增殖反應(yīng)(p＜0.05，與CpG相比)。在第1和15天，給小鼠皮下接種單劑在PBS中的HIVp24抗原(25mcg)，并腹膜內(nèi)地接種50mcg TIM-1mAb、同種型對照抗體或50mcg CpG(1826)寡脫氧核苷酸。然后，在第21天，處死小鼠，并收獲脾細(xì)胞，以用于抗原增殖。
圖11顯示了脾細(xì)胞對流感抗原的增殖反應(yīng)。用30mcg流感疫苗FluvirinTM或FluvirinTM+抗-TIM-1抗體(單劑；50mcg抗體)免疫BALB/c小鼠。10天后，在96小時增殖測定中，測量對病毒(H1N1)刺激的反應(yīng)。單獨(dú)的PBS和抗-TIM-1抗體為處理對照。(n＝4)圖12顯示了流感免疫的小鼠的細(xì)胞因子生產(chǎn)。用30mcg流感疫苗FluvirinTM或FluvirinTM+抗-TIM抗體(單劑；50mcg抗體)免疫BALB/c小鼠。10天后，制備脾細(xì)胞，且在培養(yǎng)96小時后，測定用病毒(H1N1)再次刺激后Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)細(xì)胞因子的生產(chǎn)。(n＝4)(N.D.＝未測定)。作為對滅活流感的刺激的反應(yīng)，施用疫苗+TIM-1抗體的小鼠產(chǎn)生了顯著更高量的IFN-γ。沒有檢測到IL-4。
圖13證實(shí)了TIM-佐劑處理后的交叉品系反應(yīng)。培養(yǎng)96小時后，通過Delfia增殖測定，測定北京-免疫的小鼠對北京病毒(Beijingvirus)(A)或基輔病毒(Kiev virus)(B)的刺激的增殖反應(yīng)。在有或沒有100mcgTIM-1mAb或同種型對照(大鼠IgG2b)存在的情況下，用10mcg滅活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收獲脾，用于進(jìn)行體外分析。使用TIM-1mAb增強(qiáng)了增殖，且對基輔刺激的反應(yīng)證實(shí)了交叉品系免疫(p＜0.01)。
圖14顯示了北京-免疫的小鼠對北京病毒(A)或基輔病毒(B)的刺激的交叉品系細(xì)胞因子反應(yīng)。在有或沒有100mcg TIM-1mAb或同種型對照(大鼠IgG2b)存在的情況下，用10mcg滅活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收獲脾，用于進(jìn)行體外分析。分析來自增殖測定的上清液是否存在IFN-γ。小圖A表明，TIM-1mAb的加入顯著(p＜0.01)增強(qiáng)了北京病毒(H1N1)刺激引起的IFN-γ的生產(chǎn)。小圖B表明，TIM-1mAb的加入也顯著(p＜0.01)增強(qiáng)了用異源亞型(heterosubtypic)基輔品系(H3N2)刺激引起的IFN-γ的生產(chǎn)。
圖15顯示了北京-免疫的小鼠對北京病毒(A)或基輔病毒(B)的刺激的IL-4細(xì)胞因子生產(chǎn)。在有或沒有100mcg TIM-1mAb或同種型對照(大鼠IgG2b)存在的情況下，用10mcg滅活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收獲脾，用于進(jìn)行體外分析。分析來自增殖測定的上清液是否存在IL-4。小圖A表明，TIM-1mAb的加入顯著(p＜0.01)增強(qiáng)了北京病毒(H1N1)刺激引起的IL-4的生產(chǎn)。小圖B表明，TIM-1mAb的加入也顯著(p＜0.01)增強(qiáng)了用異源亞型基輔品系(H3N2)刺激引起的IL-4的生產(chǎn)。
圖16顯示了接種疫苗后的抗-rPA抗體反應(yīng)。用0.2ml AVA(炭疽疫苗吸附的)BioThraxTM或BioThraxTM+抗-TIM-1抗體免疫C57BL/6小鼠。7天后在ELISA中測量對rPA特異性的總血清抗體。單獨(dú)的BioThraxTM和BioThraxTM+同種型匹配的抗體是處理對照。
圖17顯示了炭疽接種疫苗的抗-TIM佐劑作用。用重組的保護(hù)性抗原(rPA；40mcg)或rPA+抗-TIM-3抗體(單劑；50mcg)免疫C57BL/6小鼠。10天后，在96小時增殖測定中，測量脾細(xì)胞對rPA再次刺激的反應(yīng)。PBS和rPA+同種型匹配的對照抗體是處理對照。
圖18顯示了示例性的TIM表達(dá)載體。
圖19表明，TIM-3信號傳導(dǎo)加速小鼠中的糖尿病，如Sanchez-Fueyo等，Nat.Immunol.41093-1101(2003)所述(取自Sanchez-Fueyo等的圖)。
圖20表明，用接種疫苗送遞抗-TIM-1抗體會引起完全的腫瘤排斥。
圖21表明，在用活腫瘤細(xì)胞攻擊后，補(bǔ)加了抗-TIM-1抗體的疫苗會極大地抑制腫瘤生長。
圖22表明，在用活腫瘤細(xì)胞攻擊后，補(bǔ)加了抗-TIM-1抗體的疫苗會極大地抑制腫瘤生長。
圖23表明，在活腫瘤細(xì)胞攻擊前，用抗-TIM-1抗體預(yù)處理動物會顯著抑制腫瘤生長。
圖24表明，在活腫瘤細(xì)胞攻擊前，用抗-TIM-1抗體預(yù)處理動物會顯著限制腫瘤生長。
圖25表明，抗-TIM-1抗體是有效的癌癥疫苗佐劑。在該研究中，使用γ-照射的EL4細(xì)胞作為抗原來源，和抗-TIM-1抗體或rIgG2b同種型對照，針對EL4胸腺瘤腫瘤接種C57BL/6小鼠。初次接種疫苗后，給這些動物加強(qiáng)2次，隨后用皮下注射活EL4腫瘤細(xì)胞進(jìn)行攻擊。在攻擊后的觀察階段，接受作為腫瘤疫苗佐劑的抗-TIM-1抗體的小鼠的平均腫瘤尺寸小于接受同種型對照抗體的小鼠的平均腫瘤尺寸。另外，活腫瘤攻擊后19天，8只接受抗-TIM-1抗體的動物中的4只已經(jīng)完全排斥了腫瘤，而在8只接受同種型對照抗體的小鼠中沒有觀察到腫瘤排斥。
圖26表明，用抗-TIM-1佐劑接種疫苗驅(qū)動保護(hù)性免疫的產(chǎn)生。從首先使用抗-TIM-1作為腫瘤疫苗佐劑針對EL4胸腺瘤接種的小鼠回收脾細(xì)胞，且所述脾細(xì)胞已經(jīng)完全排斥了隨后的活腫瘤攻擊。體外紅細(xì)胞去除后，將107脾細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移進(jìn)首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠受體。其它的小鼠接受從首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠或在腫瘤接種疫苗和加強(qiáng)過程中接受rIgG2a的小鼠收獲的脾細(xì)胞的過繼性轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后1天，通過皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞，攻擊所有的受體小鼠。從接受作為腫瘤疫苗佐劑的抗-TIM-1抗體的小鼠轉(zhuǎn)移的脾細(xì)胞，能在受體小鼠中賦予針對隨后的腫瘤攻擊的保護(hù)。當(dāng)從首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠或用γ-照射的EL4+rIgG2a接種的小鼠轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞時，都不能實(shí)現(xiàn)該保護(hù)。這些結(jié)果證實(shí)，當(dāng)使用抗-TIM-1抗體佐劑完成接種疫苗時，能確立持久的且可轉(zhuǎn)移的抗腫瘤的免疫。
圖27表明，抗-TIM-1治療能有效地預(yù)防腫瘤生長?？?TIM-1抗體是有效的獨(dú)立的治療劑，其能減緩以前確立的EL4胸腺瘤腫瘤的生長。在該研究中，通過皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞，攻擊首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠，然后，在6天后，通過腹膜內(nèi)注射100mcg抗-TIM-1抗體或100mcg rIgG2a對照抗體進(jìn)行處理。在開始處理后的腫瘤生長后，向抗-TIM-1處理的小鼠中送遞抗體后15天，觀察到腫瘤生長的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的抑制。結(jié)果證實(shí)了抗-TIM-1抗體在確立腫瘤后作為治療劑限制腫瘤生長的能力。
圖28表明，當(dāng)用作疫苗佐劑時，TIM-3-特異性的抗體減少腫瘤生長。為了評價TIM-3-特異性的抗體的潛在的佐劑作用，使用γ-照射的EL4細(xì)胞作為抗原來源和抗-TIM-3抗體或rIgG2a同種型對照，針對EL4胸腺瘤腫瘤接種小鼠。初次接種疫苗后，給這些動物加強(qiáng)一次，隨后通過皮下注射活EL4腫瘤細(xì)胞進(jìn)行攻擊。隨著時間的過去，接受作為腫瘤疫苗佐劑的抗-TIM-3抗體的小鼠中的攻擊腫瘤的平均尺寸小于接受同種型對照抗體的小鼠中的平均尺寸。
圖29表明，抗-TIM-3抗體是有效的獨(dú)立的治療劑，其能減緩以前確立的EL4胸腺瘤腫瘤的生長。在該研究中，通過皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞，攻擊首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠，然后，在9天后，通過3次每周一次的腹膜內(nèi)注射100mcg抗-TIM-3抗體或100mcg rIgG2a同種型對照抗體的第一次，進(jìn)行處理。在開始處理后的腫瘤生長后，在初次給藥的一周內(nèi)，在抗-TIM-3處理的小鼠中鑒別出了受抑制的進(jìn)展。該作用隨著時間的過去而繼續(xù)，在第17天發(fā)展為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的腫瘤生長的抑制。結(jié)果證實(shí)了抗-TIM-3抗體的限制預(yù)確立的腫瘤的腫瘤生長的能力。
圖30顯示了示例性的疾病，與Th1/Th2反應(yīng)的關(guān)系，和使用含有TIM靶向分子的本發(fā)明的組合物時希望的Th1和Th2的量的變化。
圖31顯示了來自BALB/c小鼠的小鼠TIM-2的cDNA序列(SEQ ID NO6)。該cDNA序列包括信號序列、Ig、粘蛋白、跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。
圖32顯示了各種小鼠和人TIM分子的核苷酸和氨基酸序列，如WO 03/002722所述。顯示的序列是小鼠TIM-1 BALB/c等位基因(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO7和8)；小鼠TIM-1 C.D2 ES-HBA和DBA/2J等位基因(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ IDNO9和10)；小鼠TIM-2BALB/c等位基因(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NOS11和12)；小鼠TIM-2 C.D2 ES-HBA和DBA/2J等位基因(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO13和14)；小鼠TIM-3 BALB/c等位基因(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ IDNO15和16)；小鼠TIM-3 C.D2 ES-HBA和DBA/2J等位基因(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO17和18)；TIM-4 BALB/c等位基因(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO19和20)；TIM-4小鼠C.D2 ES-HBA和DBA/2J(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ IDNO21和22)；人TIM-1等位基因1(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO23和24)；人TIM-1，等位基因2(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO25和26)；人TIM-1等位基因3(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO27和28)；人TIM-1等位基因4(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO29和30)；人TIM-1等位基因5(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO31和32)；人TIM-1等位基因6(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO33和34)；人TIM-3等位基因1(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO35和36)；人TIM-3等位基因2(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO37和38)；人TIM-4等位基因1(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ IDNO39和40)；人TIM-4等位基因2(分別是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO41和42)。
圖33表明，小鼠腎腺癌細(xì)胞系RAG在它的細(xì)胞表面上表達(dá)TIM-1。與未染色的對照或用對照抗體染色的細(xì)胞(空心的)相比，TIM-1抗體(實(shí)心的)特異性地結(jié)合RAG細(xì)胞。
圖34表明，人腎腺癌細(xì)胞系769-P在它的細(xì)胞表面上表達(dá)TIM-1。與未染色的對照或用對照抗體染色的細(xì)胞(空心的)相比，TIM-1抗體(實(shí)心的)特異性地結(jié)合769-P細(xì)胞。
圖35表明，小鼠腫瘤細(xì)胞系EL4(一種胸腺瘤)和11PO-1(一種轉(zhuǎn)化的肥大細(xì)胞)在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)TIM-3。與未染色的對照或用對照抗體染色的細(xì)胞(空心的)相比，TIM-3抗體(實(shí)心的)特異性地結(jié)合各腫瘤細(xì)胞。
圖36顯示了用于測試TIM-3和TIM-3配體(TIM-3L)的表達(dá)的小鼠腫瘤細(xì)胞系的總結(jié)。鑒定了表達(dá)TIM-3和TIM-3配體的腫瘤細(xì)胞系。使用TIM-3單克隆抗體，監(jiān)控了TIM-3表達(dá)。通過測量TIM-3/Fc融合蛋白與各細(xì)胞的特異性結(jié)合，證實(shí)了TIM-3配體表達(dá)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了含有抗原和TIM靶向分子的組合物，和使用這樣的組合物的方法。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用組合物刺激個體中的免疫反應(yīng)的方法，所述組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用抗原和TIM靶向分子刺激個體中的免疫反應(yīng)的方法，所述抗原和TIM靶向分子可以在單一組合物中一起施用，或分開施用。本發(fā)明的組合物和方法可以用于靶向TIM信號傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)Th1和Th2輔助細(xì)胞的水平。本發(fā)明的組合物和方法可以有利地用于調(diào)節(jié)Th1和Th2的水平，以增加合適的和更有效的免疫反應(yīng)。
針對感染性病原體的接種疫苗規(guī)程的常見障礙是較差的疫苗免疫原性，不合適的反應(yīng)類型(抗體對細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)，缺少長期記憶，和/或不能產(chǎn)生針對給定病原體的不同血清型的免疫。佐劑例如鋁鹽已經(jīng)用于疫苗制劑超過70年，并較好地確定了它們對某些適應(yīng)癥的安全性和功效(Baylor等，Vaccine 20 Suppl 3，S18-23(2002))。使用鋁鹽作為細(xì)胞內(nèi)病原體的疫苗佐劑的一個潛在的缺點(diǎn)是IgG1和IgE抗體反應(yīng)的誘導(dǎo)。而且，鋁鹽不能刺激Th1免疫，也不能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)(Newman等J.Immunol.1482357-2362(1992)；Sheikh等Vaccine 172974-2982(1999))。迄今為止，沒有佐劑或生物制劑能隨意改變Th1/Th2平衡。在美國，尚未許可含有鋁鹽之外的其它佐劑的疫苗。
近年來，已經(jīng)表征了一個新的分子家族，現(xiàn)在稱作TIM(T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白)，其在調(diào)節(jié)激活的Th1或Th2T輔助細(xì)胞的反應(yīng)中起重要作用(Monney等，Nature 415536-541(2002)；McIntire等，Nat.Immunol.21109-1116(2001))。具體地，已經(jīng)將TIM-3鑒定為在終末分化的Th1細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面分子。相反地，TIM-1在分化的Th2細(xì)胞上表達(dá)(Kuchroo等，Nat.Rev.Immunol.3454-462(2003))。本發(fā)明提供了抗-TIM抗體和TIM融合蛋白作為增強(qiáng)免疫反應(yīng)的疫苗佐劑和刺激劑的用途，例如，其由與免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域相融合的胞外TIM結(jié)構(gòu)域(TIM/Fc)組成。本發(fā)明的分子可以用作治療傳染病和治療惡性腫瘤(例如腫瘤)的疫苗佐劑。
針對傳染物的保護(hù)需要誘導(dǎo)針對病原生物的特異性的獲得性免疫反應(yīng)。獲得性免疫反應(yīng)的效應(yīng)階段受到CD4+T輔助細(xì)胞向Th1或Th2亞型的成熟的關(guān)鍵影響。每種亞型都分泌細(xì)胞因子，后者促進(jìn)不同的彼此相反的免疫作用，并交叉調(diào)節(jié)彼此的擴(kuò)增和功能。Th1細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子例如干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)和IL-12和小量的IL-4(Mosmann等，J.Immunol.1362348-2357(1986))。Th1-相關(guān)的細(xì)胞因子促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性，且在小鼠中，促進(jìn)有效地裂解感染了細(xì)胞內(nèi)病原體的細(xì)胞的IgG2a抗體(Allan等，J.Immunol.1443980-3986(1990)。相反地，Th2細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子例如IL-4、IL-13和IL-10，但是較少的IFN-γ，并促進(jìn)抗體反應(yīng)，在小鼠中，通常是IgG1非-裂解性的同種型。Th2反應(yīng)與體液反應(yīng)具體相關(guān)，例如在免受炭疽的保護(hù)中(Leppla等，J.Clin.Invest.110141-144(2002))，且與蠕蟲感染的消除具體相關(guān)(Yoshida等，Parasitol.Int.4873-79(1999))。
產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是Th1-還是Th2-驅(qū)動的很大程度上依賴于涉及的病原體和細(xì)胞環(huán)境中的因子，例如細(xì)胞因子。不能激活T輔助反應(yīng)或正確的T輔助亞型，不但不能產(chǎn)生足夠的與特定病原體斗爭的反應(yīng)，還會導(dǎo)致較差的對再次感染的免疫。許多傳染物是細(xì)胞內(nèi)的病原體，其中預(yù)期細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，如Th1免疫所例證的，在保護(hù)和/或治療中起重要作用。而且，不適當(dāng)?shù)腡h2反應(yīng)的誘導(dǎo)，會消極地影響針對細(xì)胞內(nèi)病原體的疾病結(jié)果，所述病原體例如結(jié)核分枝桿菌(Lindblad等，Infect.Immun.65623-629(1997))，或利什曼蟲，或曼氏血吸蟲(Scott等，Immunol.Rev.112161-182(1989))。未治愈形式的人和鼠利什曼病源自強(qiáng)的、但是起反作用的Th2-樣-顯性的免疫反應(yīng)。瘤型麻風(fēng)也似乎表征了一種流行的、但是不合適的Th2-樣反應(yīng)。HIV感染代表著另一個實(shí)例。在這里，已經(jīng)提出，Th1-樣細(xì)胞時其它Th細(xì)胞亞群的比率的降低，可以在向疾病癥狀的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。
許多病毒感染的清除，依賴于CD8+T細(xì)胞的功能，后者又被Th1-引發(fā)的細(xì)胞因子環(huán)境所增強(qiáng)。而且，需要針對一種病毒血清型的Th1反應(yīng)，以便能誘導(dǎo)針對不同血清型的病毒的保護(hù)性免疫，這是一種稱作異源亞型免疫的現(xiàn)象。現(xiàn)有的接種疫苗策略靶向?qū)o定的病毒血清型特異性的抗體的引發(fā)。但是，該策略的一個缺點(diǎn)是，抗體是非常特異性的，且對通過改變表面蛋白氨基酸序列產(chǎn)生的不同血清型的病毒沒有保護(hù)，所述表面蛋白氨基酸序列在流感的實(shí)例中是血凝素和神經(jīng)氨酸酶的序列。這些突變可以是次要的(抗原性漂移)或主要的(抗原性轉(zhuǎn)變)。對于許多普通的病毒病原體，必須在復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)上作出努力，以監(jiān)控哪種血清型在世界上是流行的。這方面的一個實(shí)例是，每年監(jiān)控新出現(xiàn)的預(yù)期是主要的傳染品系的流感血清型。在流感的小鼠模型中，也已經(jīng)觀察到誘導(dǎo)異源亞型免疫的失敗。在該模型中，滅活的病毒疫苗的應(yīng)用不能促進(jìn)Th1譜(profile)。這使得小鼠不能進(jìn)行有效的病毒清除，且對血清學(xué)不同的病毒的再次感染易感(Moran等，J.Infect.Dis.180579-585(1999))。相反地，在接種疫苗的過程中，用IL-12和抗-IL-4抗體與滅活的病毒聯(lián)合處理小鼠，產(chǎn)生了特征在于Th1細(xì)胞因子的生產(chǎn)的免疫反應(yīng)。這些小鼠能針對隨后的血清學(xué)不同的病毒的攻擊，啟動異源亞型細(xì)胞免疫反應(yīng)。綜合考慮關(guān)于Th1/Th2引發(fā)環(huán)境已知的方面，數(shù)據(jù)表明，T輔助刺激和/或向Th1細(xì)胞因子反應(yīng)的背離，可以產(chǎn)生針對由抗原性漂移或抗原性轉(zhuǎn)變導(dǎo)致的各種血清型的廣譜免疫。因而，TIM-介導(dǎo)的Th1反應(yīng)的誘導(dǎo)，可以是改善現(xiàn)有的疫苗和TIM靶向試劑(例如TIM蛋白或TIM抗體)的可行策略，可以用于刺激交叉品系或異源亞型免疫。
已經(jīng)將鋁鹽用作相對安全的且有效的疫苗佐劑，以增強(qiáng)對某些病原體的抗體反應(yīng)。這樣的佐劑的一個缺點(diǎn)是，它們在刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面相對地?zé)o效(Grun和Maurer，Cell Immunol.121134-145(1989))。具有低毒性和/或精確控制和刺激細(xì)胞免疫的能力的其它佐劑的開發(fā)仍然是個挑戰(zhàn)。為了增加獲得性免疫反應(yīng)的有效性，例如在接種疫苗規(guī)程中或在微生物感染過程中，本發(fā)明提供了靶向TIM-1、-2、-3或-4信號傳導(dǎo)途徑的試劑作為有效地保護(hù)宿主的佐劑的用途。
刺激免疫系統(tǒng)的反應(yīng)的接種疫苗規(guī)程可以用于預(yù)防和治療傳染病，例如由病毒、寄生物、細(xì)菌、古細(xì)菌、支原體和朊病毒造成的感染。接種疫苗規(guī)程也可以用于預(yù)防和治療增生和惡性腫瘤，例如腫瘤，和其中免疫系統(tǒng)的刺激是有益的預(yù)防或治療措施的任何其它疾病。這樣的其它疾病的實(shí)例包括自身免疫病，例如，多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、銀屑病和其它自身免疫病。自身免疫病的一個性質(zhì)是，針對自身表位的自身反應(yīng)性抗體的產(chǎn)生。這樣的自身反應(yīng)性抗體在自身免疫病的發(fā)展、進(jìn)展和長期性質(zhì)中起非常重要的作用?？梢允褂靡呙纾鲆呙缋鐚?dǎo)致中和這樣的自身反應(yīng)性抗體的抗獨(dú)特型的抗體的產(chǎn)生。
如本文所公開的，靶向TIM-1信號傳導(dǎo)途徑的試劑可以用作有效的疫苗佐劑(見實(shí)施例)。這樣的試劑包括抗TIM-1的抗體，抗TIM-1配體的抗體，重組TIM-1蛋白，包括TIM-1融合蛋白，和TIM-1配體蛋白，包括TIM-1配體融合蛋白。因而，本發(fā)明提供了能起有效的疫苗佐劑作用的TIM-1靶向分子。本發(fā)明另外提供了類似類型的分子，其能靶向其它的TIM，包括但不限于TIM-3，以及TIM-2和TIM-4。
本發(fā)明提供了能靶向TIM信號傳導(dǎo)途徑和用作有效的疫苗佐劑的試劑。如本文所使用的，當(dāng)用于提及TIM信號傳導(dǎo)途徑時，術(shù)語“試劑”指能調(diào)節(jié)由TIM介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑的分子。TIM靶向試劑在本文中也稱作TIM靶向分子或試劑。這樣的試劑包括，如關(guān)于TIM-1所示例的，抗TIM-1的抗體，抗TIM-1配體的抗體，重組TIM-1蛋白，包括TIM-1融合蛋白，和TIM-1配體蛋白，包括TIM-1配體融合蛋白。類似類型的試劑可以用于調(diào)節(jié)其它的各TIM信號傳導(dǎo)途徑，包括TIM-2、-3或-4。融合蛋白包括，例如，TIM-1或TIM-1配體與蛋白或蛋白片段的融合體，例如與免疫球蛋白的Fc區(qū)、與清蛋白、與運(yùn)鐵蛋白、與Myc標(biāo)記、與多組氨酸標(biāo)記或其它需要的蛋白或蛋白片段的融合體。本發(fā)明的試劑也包括化學(xué)修飾的試劑，例如PEG化(pegylated)的TIM或TIM配體或其它需要的化學(xué)修飾。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)提及特定的TIM時，包括該TIM的多態(tài)的和剪接變體。本發(fā)明的試劑也可以是小分子，肽，多肽，多核苷酸，包括反義和siRNA，碳水化合物，包括多糖，脂類，藥物，及其模仿物、衍生物和組合，其能刺激或抑制特定TIM(例如，TIM-1、-2、-3或-4)與它的配體的相互作用，或刺激或抑制TIM或TIM配體信號傳導(dǎo)。應(yīng)當(dāng)理解，本文中關(guān)于靶向TIM-1信號傳導(dǎo)途徑的試劑的用途的任何描述，都是示例性的，且可以類似地應(yīng)用于靶向其它TIM信號傳導(dǎo)途徑(包括TIM-2、TIM-3和TIM-4)的試劑。本發(fā)明的試劑可以用作刺激身體的免疫反應(yīng)的佐劑，例如在接種疫苗中。這些試劑作為佐劑的用途不限于任何特定類型的免疫刺激治療或接種疫苗，且可以包括，但不限于，任何上述的接種疫苗規(guī)程的實(shí)例。
本發(fā)明提供了一種組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子或試劑。如本文所使用的，“TIM靶向分子”指能結(jié)合TIM或TIM配體的分子。示例性的TIM靶向分子包括，但不限于，抗TIM的抗體，抗TIM-1配體的抗體，重組TIM蛋白，TIM融合多肽，TIM配體，包括TIM配體融合多肽。如本文所公開的，抗原和TIM靶向分子或試劑可以在單一組合物中或作為分開的組合物施用。
各種TIM是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的，包括TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。在例如WO 03/002722；WO 97/44460；1997年4月22日授權(quán)的美國專利號5,622,861；和美國公開號2003/0124114中，教導(dǎo)了各種TIM，其中的每一篇在這里引作參考。示例性的TIM序列顯示在圖31和32中。依賴于所需用途，在本發(fā)明的組合物和方法中，可以使用來自不同物種的多種TIM。來自特定物種的TIM，可以用于特定用途，例如，如果需要，人TIM可以用于人類。如果需要，也可以使用來自其它物種的TIM。
在一個實(shí)施方案中，TIM靶向分子可以是，例如具有TIM(例如，TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4)的融合蛋白，且可以包含TIM的胞外區(qū)的至少一個結(jié)構(gòu)域或其部分和免疫球蛋白的恒定重鏈或其部分。在一個具體的實(shí)施方案中，可溶性TIM融合蛋白指包含TIM的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個結(jié)構(gòu)域和另一種多肽的融合蛋白。在一個實(shí)施方案中，可溶性TIM可以是融合蛋白，其包含共價連接(例如，通過肽鍵)到免疫球蛋白例如IgG的Fc片段上的TIM的胞外區(qū)；這樣的融合蛋白一般是同型二聚體。在另一個實(shí)施方案中，可溶性TIM融合體可以是融合蛋白，其僅僅包含共價連接(例如，通過肽鍵)到免疫球蛋白例如IgG的Fc片段上的TIM的胞外區(qū)的Ig結(jié)構(gòu)域；這樣的融合蛋白一般是同型二聚體。如本領(lǐng)域眾所周知的，F(xiàn)c片段是2個部分恒定重鏈的同型二聚體。每個恒定重鏈包含至少CHI結(jié)構(gòu)域、鉸鏈和CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。這樣的Fc融合蛋白的每個單體包括連接到免疫球蛋白的恒定重鏈或其部分(例如，鉸鏈、CH2、CH3結(jié)構(gòu)域)上的TIM的胞外區(qū)。在某些實(shí)施方案中，恒定重鏈可以包括在免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的N-末端的CHI結(jié)構(gòu)域的部分或全部。在其它實(shí)施方案中，恒定重鏈可以包括鉸鏈結(jié)構(gòu)域，但不包括CH1結(jié)構(gòu)域。在另一個實(shí)施方案中，恒定重鏈排除鉸鏈和CH1結(jié)構(gòu)域，例如，它僅僅包含IgG的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
在一個實(shí)施方案中，TIM靶向分子可以是TIM抗體，例如，對TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4特異性的抗體。也可以使用對其它TIM的抗體。在另一個實(shí)施方案中，TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽，例如，與Fc融合的TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地制備與Fc或其它需要的多肽的各種TIM融合多肽，包括含有需要的結(jié)構(gòu)域的TIM多肽片段。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的TIM靶向分子或試劑可以是小分子，肽，多肽，多核苷酸，包括反義和siRNA，碳水化合物，包括多糖，脂類，藥物，及其模仿物、衍生物和組合，其能刺激或抑制特定TIM與它的配體的相互作用，或刺激或抑制TIM或TIM配體信號傳導(dǎo)。
當(dāng)試劑或TIM靶向分子以能影響TIM或TIM配體的活性的方式，直接或間接結(jié)合TIM或TIM配體或TIM或TIM配體信號傳導(dǎo)途徑的組分，或與其相互作用時，發(fā)生靶向作用。利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以評價活性(見，例如，Reith，ProteinKinase Protocols Humana Press，Totowa NJ(2001)；Hardie，ProteinPhosphorylationA Practical Approach second ed.，Oxford UniversityPress，Oxford，United Kingdom(1999)；Kendall和Hill，SignalTransduction ProtocolsMethods in Molecular Biology Vol.41，Humana Press，Totowa NJ(1995))。例如，人們可以評價信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的強(qiáng)度，或受體結(jié)合后發(fā)生或通常會發(fā)生的另一個下游生物學(xué)事件。靶向TIM或TIM配體的試劑產(chǎn)生的活性可以，但不必定，與當(dāng)天然產(chǎn)生的TIM或TIM配體結(jié)合天然產(chǎn)生的TIM或TIM配體時產(chǎn)生的活性不同。例如，如果試劑產(chǎn)生與天然產(chǎn)生的TIM-1配體結(jié)合受體時產(chǎn)生的活性基本上相同的活性，則靶向TIM-1的試劑或TIM靶向分子在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，試劑或TIM靶向分子可以是拮抗劑，其通過天然產(chǎn)生的TIM配體抑制信號傳導(dǎo)。
如上所述，本發(fā)明的試劑可以含有2個功能部分將試劑靶向攜帶TIM或TIM配體的細(xì)胞(例如TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4)的靶向部分，和例如二聚化和/或靶細(xì)胞去除部分，其例如裂解或?qū)е聰y帶TIM或TIM配體的細(xì)胞的去除，如本文所討論的。因而，試劑可以是嵌合多肽，其包括TIM多肽和異源多肽，例如IgG和IgM亞類抗體的Fc區(qū)。Fc區(qū)可以包括突變，其能抑制補(bǔ)體結(jié)合和Fc受體結(jié)合，或它可以是裂解性的或靶細(xì)胞去除性的，也就是說，能通過結(jié)合補(bǔ)體或通過另一種機(jī)理，例如抗體依賴性的補(bǔ)體裂解，破壞細(xì)胞。因此，F(xiàn)c可以是裂解性的，且可以激活補(bǔ)體和Fc受體-介導(dǎo)的活性，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解，造成表達(dá)TIM或TIM配體的所需細(xì)胞的去除。
可以從天然產(chǎn)生的來源分離、重組生產(chǎn)或使用眾所周知的肽合成方法化學(xué)合成Fc區(qū)。例如，通過用木瓜蛋白酶消化IgG，可以生產(chǎn)與IgG C末端結(jié)構(gòu)域同源的Fc區(qū)。IgG Fc具有約50kDa的分子量。本發(fā)明的多肽可以包括整個Fc區(qū)，或保留裂解細(xì)胞的能力的更小的部分。另外，全長或片段化的Fc區(qū)可以是野生型分子的變體。也就是說，它們可以含有會或不會影響多肽的功能的突變。Fc區(qū)可以源自IgG，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或類似的哺乳動物IgG，或IgM，例如人IgM或類似的哺乳動物IgM。在一個具體的實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包括人IgG1或鼠IgG2a的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
可以作為本發(fā)明的TIM靶向分子或試劑的部分的Fc區(qū)可以是“靶細(xì)胞去除性的”，在本文中也稱作裂解性的，或“非靶細(xì)胞去除性的”，在本文中也稱作非裂解性的。非靶細(xì)胞去除性的Fc區(qū)一般缺少高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)和C′1q結(jié)合位點(diǎn)。鼠IgG Fc的高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)包括在IgG Fc的位置235處的Leu殘基。因而，通過突變或缺失Leu 235，可以破壞鼠Fc受體結(jié)合位點(diǎn)。例如，用Glu取代Leu 235，會抑制Fc區(qū)結(jié)合高親和力Fc受體的能力。通過突變或缺失IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322殘基，可以在功能上破壞鼠C′1q結(jié)合位點(diǎn)。例如，用Ala殘基取代Glu 318、Lys 320和Lys 322，會使IgG1 Fc不能指導(dǎo)抗體-依賴性的補(bǔ)體裂解。相反地，靶細(xì)胞去除性的IgG Fc區(qū)具有高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)和C′1q結(jié)合位點(diǎn)，且可以減少靶細(xì)胞的量，例如，通過Fc裂解活性或其它機(jī)理，如本文所公開的。高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)包括在IgG Fc的位置235處的Leu殘基，且C′1q結(jié)合位點(diǎn)包括IgG1的Glu 318、Lys 320和Lys 322殘基。靶細(xì)胞去除性的IgG Fc在這些位點(diǎn)具有野生型殘基或保守的氨基酸取代。靶細(xì)胞去除性的IgG Fc可以將細(xì)胞靶向依賴抗體的細(xì)胞毒性或補(bǔ)體指導(dǎo)的細(xì)胞裂解(CDC)。人IgG的適當(dāng)突變也是已知的(見，例如，Morrison等，The Immunologist 2119-124(1994)；和Brekke等，The Immunologist 2125，1994)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定其它物種的Fc區(qū)的類似殘基，以產(chǎn)生靶細(xì)胞去除性的或非靶細(xì)胞去除性的與TIM靶向分子或試劑的融合體。
在本發(fā)明的組合物中可以使用多種抗原。示例性的抗原包括，但不限于，病毒、細(xì)菌、寄生物和腫瘤相關(guān)抗原?？乖梢允嵌喾N形式，包括但不限于，完整的滅活的生物，從其衍生的蛋白抗原或肽抗原，或適用于引起針對生物或細(xì)胞類型的免疫反應(yīng)的其它抗原分子。抗原也可以是能編碼抗原的核酸的形式，例如在核酸疫苗中使用的。如本文所公開的，與缺少TIM靶向分子或試劑的組合物相比，本發(fā)明的組合物在有TIM靶向分子或試劑存在下，可以用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)(見實(shí)施例)。對于乙型肝炎病毒、炭疽、流感病毒和HIV，觀察到了增強(qiáng)的免疫反應(yīng)(見實(shí)施例VI-X)。在癌癥模型中，也觀察到了增強(qiáng)的免疫反應(yīng)(見實(shí)施例XII)。
可以在本發(fā)明的組合物中使用的示例性的抗原包括，但不限于，乙型肝炎病毒，流感病毒，炭疽，利斯特氏菌(Listeria)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，結(jié)核，尤其是廣譜抗藥品系，兔熱病，大天花(天花)，病毒性出血熱，鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)(鼠疫)，HIV，和與傳染物有關(guān)的其它抗原。其它示例性的抗原包括與腫瘤細(xì)胞有關(guān)的抗原，針對與自身免疫病有關(guān)的抗原的抗原或抗體，或與變態(tài)反應(yīng)和哮喘有關(guān)的抗原。這樣的抗原可以包含在本發(fā)明的組合物中，后者含有用作針對各疾病的疫苗的TIM靶向分子或試劑。
在一個實(shí)施方案中，通過包含來自傳染物的抗原，本發(fā)明的方法和組合物可以用于治療感染或處于感染的危險(xiǎn)中的個體。感染指可歸因于在宿主中存在可在宿主中繁殖的外來生物或因子的疾病或狀況。感染一般包含傳染性生物或因子對粘膜或其它組織屏障的破壞。感染的受試者是具有存在于受試者的身體中的可客觀測量的傳染性生物或因子的受試者。處于感染的危險(xiǎn)中的受試者是易于發(fā)展感染的受試者。這樣的受試者可以包括，例如，已知或懷疑暴露于傳染性生物或因子的受試者。處于感染的危險(xiǎn)中的受試者也可以包括具有與受損的啟動對傳染性生物或因子的免疫反應(yīng)的能力有關(guān)的狀況的受試者，例如，具有先天性或獲得性免疫缺陷的受試者，經(jīng)歷放射治療或化療的受試者，具有燒傷的受試者，具有外傷性損傷的受試者，經(jīng)歷外科手術(shù)或其它侵入性醫(yī)學(xué)或牙齒手術(shù)的受試者，或類似的無免疫應(yīng)答的個體。
基于包含的傳染性生物或因子的種類，將感染概括地分為細(xì)菌、病毒、真菌或寄生物性的。本領(lǐng)域也知道其它不太常見類型的感染，包括，例如，包含立克次氏體、支原體和會造成瘙癢病、牛海綿狀腦病(BSE)和朊病毒病(例如，庫魯病和Creutzfeldt-Jacob病)的因子的感染。會造成感染的細(xì)菌、病毒、真菌和寄生物的實(shí)例是本領(lǐng)域眾所周知的。感染可以是急性的、亞急性的、慢性的或潛伏的，且它可以是局部化的或全身的。而且，在傳染性生物或因子在宿主中的生命周期的至少一個階段的過程中，感染可以主要是細(xì)胞內(nèi)的或細(xì)胞外的。
細(xì)菌包括革蘭氏陰性的和革蘭氏陽性的細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌的實(shí)例包括，但不限于巴斯德氏菌屬(Pasteurella)物種、葡萄球菌屬(Staphylococci)物種和鏈球菌屬(Streptococcus)物種。革蘭氏陰性細(xì)菌的實(shí)例包括，但不限于，大腸桿菌(Escherichia coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種和沙門氏菌屬(Salmonella)物種。傳染性細(xì)菌的具體實(shí)例包括但不限于幽門螺桿菌(Helicobacter pyloris)、布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilia)、分枝桿菌屬物種(Mycobacteria spp.)(例如，結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、鳥分枝桿菌(M.avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、戈登分枝桿菌(M.gordonae))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A組鏈球菌)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B組鏈球菌)、鏈球菌(綠色鏈球菌組(viridans group))、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)、鏈球菌(厭氧物種(anaerobic spp.))、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病的彎曲桿菌屬物種(Campylobacterspp.)、腸球菌屬物種(Enterococcus spp.)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒桿菌屬物種(Corynebacteriumspp.)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、多殺巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、擬桿菌屬物種(Bacteroides spp.)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)、蒼白密螺旋體(Treponemapallidum)、極細(xì)密螺旋體(Treponema pertenue)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、立克次氏體屬(Rickettsia)和衣氏放線菌(Actinomycesisraelii)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)會在人類中造成感染的病毒的實(shí)例包括但不限于反錄病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也稱作HTLV-III)、HIV-2、LA V或IDLV-III/LA V或HIV-III，和其它分離物，例如HIV-LP；小RNA病毒科(Picomaviridae)(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒；腸道病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒、歐可病毒)；Calciviridae(例如，會造成胃腸炎的品系)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，馬腦炎病毒、風(fēng)疹病毒)；黃病毒科(Flaviviridae)(例如，登革病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；冠狀病毒科(Coronaviridae)(例如，冠狀病毒)；彈狀病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；纖絲病毒科(Filoviridae)(例如，歐鮑拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；Bungaviridae(例如，漢坦病毒、bunga病毒、白蛉熱病毒和內(nèi)羅病毒)；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血熱病毒)；呼腸病毒科(Reoviridae)(例如，呼腸病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；Bimaviridae；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；小DNA病毒科(Parvovirdae)(小DNA病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多數(shù)腺病毒)；皰疹病毒科(Herpesviridae)(單純皰疹病毒(HSV)1和2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、皰疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲豬瘟病毒)；和未分類的病毒(例如，海綿狀腦病的病原學(xué)因子，丁型肝炎的因子(認(rèn)為是乙型肝炎病毒的缺陷衛(wèi)星病毒)，非甲型、非乙型肝炎的因子(1類＝腸傳播的；2類＝腸胃外傳播的(也就是說，丙型肝炎)；諾沃克和有關(guān)的病毒和星狀病毒)。
真菌的實(shí)例包括曲霉屬物種(Aspergillus spp.)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色假絲酵母(Candida albicans)、其它假絲酵母屬物種(Candida spp.)、粗球孢菌(Coccidioides immitis)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)、砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、諾卡氏菌屬物種(Nocardia spp.)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)。
寄生物包括但不限于血液傳播的和/或組織寄生物例如果氏巴貝蟲(Babesia microti)、分離巴貝蟲(Babesia divergens)、痢疾內(nèi)變形蟲(Entamoeba histolytica)、表吮賈第蟲(Giardia lamblia)、熱帶利什曼蟲(Leishmania tropica)、利什曼原蟲屬物種(Leishmania spp.)、巴西利什曼蟲(Leishmania braziliensis)、杜氏利什曼蟲(Leishmania donovani)、惡性瘧蟲(Plasmodium falciparum)、三日瘧蟲(Plasmodiummalariae)、卵形瘧蟲(Plasmodium ovale)、間日瘧蟲(Plasmodium vivax)和鼠弓形蟲(Toxoplasma gondii)、岡比亞錐蟲(Trypanosoma gambiense)和羅得西亞錐蟲(Trypanosoma rhodesiense)(非洲昏睡病)、克魯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)(Chagas氏病)和鼠弓形蟲、扁形動物、線蟲。
本發(fā)明另外提供了使用本發(fā)明的組合物的方法。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用組合物刺激個體中的免疫反應(yīng)的方法，所述組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子或試劑。這樣的TIM靶向分子可以是TIM抗體，例如抗TIM-1、-2、-3或-4的抗體。
如本文所公開的，本發(fā)明的組合物可以用在刺激或增強(qiáng)對抗原的免疫反應(yīng)的方法中。本發(fā)明提供了通過施用本發(fā)明的含有TIM靶向分子或試劑和抗原的組合物刺激免疫反應(yīng)的方法。與缺少TIM靶向分子或試劑的組合物相比，TIM靶向分子或試劑的包含可以起增強(qiáng)免疫反應(yīng)的佐劑的作用(見實(shí)施例)。
本發(fā)明的組合物和方法可以用于刺激免疫反應(yīng)，以預(yù)防和/或治療多種疾病。這樣的疾病包括傳染病，包括，但不限于，由下述病原體造成的疾病病毒、細(xì)菌或寄生生物，例如乙型肝炎病毒，流感病毒，炭疽，利斯特氏菌，肉毒梭菌，結(jié)核，尤其是廣譜抗藥品系，兔熱病，大天花(天花)，病毒性出血熱，鼠疫耶爾森氏菌(鼠疫)，HIV，和其它傳染物，如本文所公開的。
另外，本發(fā)明的組合物和方法可以用于治療患有癌癥或處于患癌癥危險(xiǎn)中的受試者。癌癥是妨礙身體器官和系統(tǒng)的正常功能發(fā)揮的細(xì)胞的失控生長的狀況?；加邪┌Y的受試者是具有存在于受試者身體中的可客觀地測量的癌細(xì)胞的受試者。處于患癌癥危險(xiǎn)中的受試者是易于發(fā)展為癌癥的受試者。這樣的受試者可包括，例如，具有發(fā)展為癌癥的家族史或遺傳傾向的受試者。處于患癌癥危險(xiǎn)中的受試者也可以包括已知或懷疑暴露于致癌劑的受試者。
從它們的原始位置和種子活力器官遷移的癌癥最終可以通過受影響的器官的功能惡化，導(dǎo)致受試者的死亡。造血癌癥，例如白血病，能勝過受試者中的正常的造血區(qū)室，從而導(dǎo)致造血障礙(以貧血、血小板減少癥和嗜中性白細(xì)胞減少癥的形式)，最終造成死亡。
轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞的一個區(qū)域，它與原發(fā)腫瘤位置不同，源自癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤向身體的其它部分的傳播。在診斷原發(fā)腫瘤塊時，可以監(jiān)控受試者是否存在轉(zhuǎn)移。最經(jīng)常通過單一地或組合地使用磁共振成像(MRI)掃描、計(jì)算機(jī)化斷層顯象(CT)掃描、血液和血小板計(jì)數(shù)、肝功能研究、胸部X-射線和骨掃描以及監(jiān)控特定癥狀，來檢測轉(zhuǎn)移。
通過在組合物中包含腫瘤相關(guān)抗原，本發(fā)明的組合物和方法也可以用于治療多種癌癥或處于發(fā)展為癌癥的危險(xiǎn)中的受試者。如本文所使用的，“腫瘤相關(guān)抗原”是在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的腫瘤抗原。本領(lǐng)域眾所周知，許多腫瘤相關(guān)抗原與特定的腫瘤細(xì)胞相關(guān)，其可以包含在本發(fā)明的組合物中，以治療多種癌癥，包括但不限于，乳腺癌，前列腺癌，結(jié)腸癌，和血液癌，包括白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)等。本發(fā)明的方法可以用于刺激免疫反應(yīng)，以通過抑制或減緩腫瘤的生長或減小腫瘤的大小來治療腫瘤(見實(shí)施例XII)。腫瘤相關(guān)抗原也可以是腫瘤特異性的抗原，因?yàn)樵摽乖饕?盡管不必定是排它地)在癌細(xì)胞上表達(dá)。在這樣的情況下，應(yīng)當(dāng)理解，可以有利地靶向腫瘤特異性的抗原，從而允許選擇性地靶向腫瘤細(xì)胞。
其它癌癥包括，但不限于，基層細(xì)胞癌，膽道癌；膀胱癌；骨癌；腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)癌；子宮頸癌；絨毛膜癌；結(jié)腸直腸癌；結(jié)締組織癌；消化系統(tǒng)癌；子宮內(nèi)膜癌；食管癌；眼癌；頭和頸癌；胃癌；上皮內(nèi)的腫瘤；腎癌；喉癌；肝癌；肺癌(例如，小細(xì)胞和非-小細(xì)胞)；淋巴瘤，包括何杰金氏和非-何杰金氏淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、嘴和咽)；卵巢癌；胰腺癌；成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統(tǒng)癌；肉瘤；皮膚癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮癌；泌尿系統(tǒng)癌，以及其它癌和肉瘤。
目前使用的或處于開發(fā)中的癌癥免疫療法的實(shí)例包括但不限于RituxanTM、IDEC-C2B8、抗-CD20Mab、PanorexTM、3622W94、抗-EGP40(17-1A)、腺癌上的pancarcinoma抗原、HerceptinTM、抗-Her2、抗-EGFr、BEC2、抗獨(dú)特型-GD3表位、OvarexTM、B43.13、抗獨(dú)特型CA125、4B5、抗-VEGF、RhuMAb、MDX-210、抗-HER-2、MDX-22、MDX-220、MDX-447、MDX-260、抗-GD-2、QuadrametTM、CYT-424、IDEC-Y2B8、OncolymTM、Lym-1、SMART M195、ATRAGENTM、LDP-03、抗-CAMPATH、ior t6、抗-CD6、MDX-11、OV1I03、ZenapaxTM、抗-Tac、抗-IL-2受體、MELIMMUNE-1和-2、CEACIDETM、PretargetTM、NovoMAb-G2、TNT、抗-組蛋白、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm-C、ior egf/r3、iorc5、抗-FLK-2、SMART 1D1O、SMART ABL 364和ImmuRAIT-CEA。
癌癥疫苗是用于刺激針對癌細(xì)胞的內(nèi)源免疫反應(yīng)的藥物。目前生產(chǎn)的疫苗主要激活體液免疫系統(tǒng)，即抗體依賴性的免疫系統(tǒng)。目前處于開發(fā)中的其它疫苗集中在激活細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)，包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，其能殺死腫瘤細(xì)胞。癌癥疫苗通常能增強(qiáng)癌癥抗原向抗原呈遞細(xì)胞(APC)(例如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)和/或其它免疫細(xì)胞(例如T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞)的呈遞。盡管癌癥疫苗可以采取幾種形式中的一種，如本文所討論的，但它們的目的是，將癌癥抗原和/或癌癥相關(guān)抗原送遞給APC，以促進(jìn)APC對這樣的抗原的內(nèi)源加工及最終在MHC I類分子環(huán)境中抗原在細(xì)胞表面上的呈遞。癌癥疫苗的一種形式是全細(xì)胞疫苗，它是癌細(xì)胞的制劑，所述癌細(xì)胞已經(jīng)被從受試者中取出，離體(ex vivo)處理，通常是殺死癌細(xì)胞或阻止它們增殖，然后作為全細(xì)胞重新導(dǎo)入受試者中。腫瘤細(xì)胞的裂解物也可以用作癌癥疫苗，以引起免疫反應(yīng)。癌癥疫苗的另一種形式是肽疫苗，它使用癌癥-特異性的或癌癥-相關(guān)的小蛋白，以激活T細(xì)胞。癌癥-相關(guān)蛋白是非排它地由癌細(xì)胞表達(dá)的蛋白，也就是說，其它正常的細(xì)胞也可以表達(dá)這些抗原。但是，癌癥-相關(guān)抗原的表達(dá)通常恒定地受特定類型的癌癥的上調(diào)。癌癥疫苗的另一種形式是樹突細(xì)胞疫苗，它包括已經(jīng)體外地暴露于癌癥抗原或癌癥-相關(guān)抗原的全樹突細(xì)胞。樹突細(xì)胞的裂解物或膜級分也可以用作癌癥疫苗。樹突細(xì)胞疫苗能直接激活A(yù)PC。其它癌癥疫苗包括神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗、熱激蛋白疫苗、病毒和細(xì)菌疫苗和核酸疫苗。
另外，本發(fā)明的組合物和方法可以用于治療自身免疫病，例如，多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、銀屑病或其它自身免疫性障礙。自身免疫病是一類疾病，其中受試者自己的抗體與宿主組織反應(yīng)，或其中免疫效應(yīng)T細(xì)胞能與內(nèi)源的自身肽發(fā)生自身反應(yīng)，并造成組織的破壞。因而，免疫反應(yīng)是針對受試者自身的抗原(稱作自身抗原)引發(fā)的。自身免疫病包括上述的實(shí)例，以及克羅恩病和其它炎性腸病，例如潰瘍性結(jié)腸炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性腦脊髓炎、重癥肌無力(MG)、橋本甲狀腺炎、Goodpasture氏綜合征、天皰瘡(例如，尋常天皰瘡)、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、具有抗-膠原抗體的硬皮病、混合型結(jié)締組織病、多肌炎、惡性貧血、特發(fā)性阿狄森病、自身免疫-相關(guān)的不育癥、腎小球腎炎(例如，新月體性腎小球腎炎、增生性腎小球腎炎)、大皰性類天皰瘡、Sjogren氏綜合征、銀屑病關(guān)節(jié)炎、胰島素耐受性、自身免疫性糖尿病(I型糖尿?。灰葝u素依賴性糖尿病)、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(ALPS)、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(uveoretinitis)和Guillain-Barré綜合征。近年來，已經(jīng)認(rèn)識到自身免疫病也包括動脈粥樣硬化和阿爾茨海默氏病。自身抗原指正常宿主組織的抗原。正常宿主組織不包括癌細(xì)胞。因而，在自身免疫病的情況下，針對自身抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)是不希望的免疫反應(yīng)，且會導(dǎo)致正常組織的破壞和損害，而針對癌癥抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)是希望的免疫反應(yīng)，且會導(dǎo)致腫瘤或癌癥的破壞。
如圖19所示，TIM-3信號傳導(dǎo)會加速小鼠的糖尿病(見Sanchez-Fueyo等，Nat.Immunol.41093-1101(2003))。NOD-SCID小鼠接受來自糖尿病小鼠的T細(xì)胞，并用對照Ig或抗-TIM-3處理(100μg，在實(shí)驗(yàn)持續(xù)階段每周2次)?？?TIM-3的施用加速了糖尿病發(fā)展，即一種Th1-介導(dǎo)的疾病，從而證明TIM-3在調(diào)節(jié)Th1功能中起作用。因此，使用TIM-3靶向分子干擾一種或多種TIM-3信號傳導(dǎo)途徑，可以用于治療糖尿病。
本發(fā)明的組合物和方法也可以用于治療哮喘和變態(tài)反應(yīng)。哮喘是一種呼吸系統(tǒng)障礙，其特征在于氣道的炎癥和狹窄和提高的氣道對吸入物的反應(yīng)性。哮喘經(jīng)常(盡管非排它地)伴有特應(yīng)性的或變應(yīng)性的癥狀。變態(tài)反應(yīng)是獲得的對物質(zhì)(變應(yīng)原)的超敏反應(yīng)。變應(yīng)性的狀況包括濕疹、變應(yīng)性鼻炎或鼻炎、枯草熱、支氣管哮喘、蕁麻疹(蕁麻疹)和食物變態(tài)反應(yīng)和其它特應(yīng)性的狀況。“患有變態(tài)反應(yīng)的受試者”是患有或處于發(fā)展為對變應(yīng)原的反應(yīng)的變態(tài)反應(yīng)的危險(xiǎn)中的受試者。“變應(yīng)原”指可以在易感受試者中誘導(dǎo)變應(yīng)性的或哮喘性的反應(yīng)的物質(zhì)。存在許多變應(yīng)原，包括花粉、昆蟲毒液、動物頭皮屑、粉塵、真菌孢子和藥物(例如，青霉素)。
天然的動物和植物變應(yīng)原的實(shí)例包括對下述屬特異性的蛋白犬的(狗(Canisfamiliaris))；嗜皮螨屬(Dermatophagoides)(例如，粉塵螨(Dermatophagoides farinae))；貓屬(Felis)(貓(Felis domesticus))；豚草屬(Ambrosia)(豚草(Ambrosia artemiisfolia)；Lotium(例如，Lotiumperenne或Lotium multiflorum)；柳杉屬(Cryptomeria)(日本柳杉(Cryptomeria japonica))；鏈格孢屬(Alternaria)(互格鏈格孢(Alternariaalternata))；Alder；榿木屬(Alnus)(歐洲榿木(Alnus gultinosa))；樺木屬(Betula)(Betula verrucosa)；櫟屬(Quercus)(Quercus alba)；木犀欖屬(Olea)(油橄欖(Olea europa))；蒿屬(Artemisia)(艾蒿(Artemisiavulgaris))；車前草屬(Plantago)(例如，長葉車前(Plantagolanceolata))；墻草屬(Parietaria)(例如，Parietaria officinalis或Parietaria judaica)；姬蠊屬(例如，德國姬蠊(Blattella gennanica))；蜜蜂屬(Apis)(例如，Apis multiflornm)；柏木屬(Cupressus)(例如，地中海柏木(Cupressus sempervirens)、綠干柏(Cupressus arizonica)和大果柏木(Cupressus macrocarpa))；刺柏屬(Juniperus)(例如，Juniperussabinoides、Juniperus virginiana、歐洲刺柏(Juniperus communis)和阿希刺柏(Juniperus ashei))；Thuya(例如，Thuya orientalis)；扁柏屬(Chamaecyparis)(例如，日本扁柏(Chamaecyparis obtusa))；大蠊屬(Periplaneta)(例如，美洲大蠊(Periplaneta americana))；冰草屬(Agropyron)(例如，偃麥草(Agropyron repens))；黑麥屬(Secale)(例如，黑麥(Secale cereale))；小麥屬(例如，普通小麥(Triticum aestivum))；鴨茅屬(Dactylis)(例如，鴨茅(Dactylis glomerata))；羊茅屬(Festuca)(例如，牛尾草(Festuca elatior))；早熟禾屬(Poa)(例如，草地早熟禾(Poapratensis)或加拿大早熟禾(Poa compressa))；燕麥屬(Avena)(例如，燕麥(Avena sativa))；絨毛草屬(Holcus)(例如，絨毛草(Holcus lanatus))；黃花茅屬(Anthoxanthum)(例如，黃花茅(Anthoxanthum odoratum))；燕麥草屬(Arrhenatherum)(例如，燕麥草(Arrhenatherum elatius))；小糠草屬(Agrostis)(例如，小糠草(Agrostis alba))；梯牧草屬(Phleum)(例如，梯牧草(Phleum pratense))； 草屬(Phalaris)(例如， 草(Phalarisarundinacea))；雀稗屬(Paspalum)(例如，Paspalum notatum)；蜀黍?qū)?Sorghum)(例如，石茅高粱(Sorghum halepensis))；和雀麥屬(Bromus)(例如，無芒雀麥(Bromus inermis))。
而且，通過影響炎性細(xì)胞因子，本發(fā)明的組合物和方法可以用于移植以抑制器官排斥和用于心臟病。在圖19和實(shí)施例VI-XII中闡述了各種TIM靶向分子在各種疾病模型中的作用。用TIM或抗-TIM抗體處理，會促進(jìn)更強(qiáng)的接種疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的方法可以用于增加Th1或Th2，作為特定適應(yīng)癥的優(yōu)點(diǎn)。例如，Th1細(xì)胞因子適用于細(xì)胞內(nèi)的病原體例如細(xì)菌或病毒、癌癥和遲發(fā)型超敏反應(yīng)。Th2細(xì)胞因子適用于細(xì)胞外的蠕蟲寄生物例如絳蟲和線蟲，和抗體反應(yīng)的形成，以中和循環(huán)病毒和細(xì)菌。相反地，不適當(dāng)?shù)腡h1反應(yīng)會導(dǎo)致自身免疫性障礙，例如，多發(fā)性硬化、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和I型糖尿病和移植體排斥；Th1細(xì)胞因子的缺乏會導(dǎo)致不能與細(xì)胞內(nèi)的病原體例如病毒和細(xì)菌斗爭。不適當(dāng)?shù)腡h2反應(yīng)會導(dǎo)致哮喘、變應(yīng)性的障礙、不能清除細(xì)胞內(nèi)的感染和對HIV易感；Th2細(xì)胞因子的缺乏會導(dǎo)致不能中和侵入的病毒和細(xì)菌。
本發(fā)明的方法是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢愿鶕?jù)需要，用于增加Th1或Th2反應(yīng)。在免疫反應(yīng)進(jìn)展時，TIM分子被表達(dá)，并輔助指導(dǎo)適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子信使的分泌。TIM-1在刺激Th2中起作用，而TIM-3在刺激Th1中起作用。因而，可以使用具體的TIM靶向分子調(diào)節(jié)Th1或Th2的相對量，如對于特定的希望的免疫反應(yīng)有用的。在圖30中，描述了示例性的疾病和TIM靶向分子的所需作用如何可以用于增強(qiáng)治療各種疾病的免疫反應(yīng)。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的組合物和方法可以與治療特定狀況的其它療法相組合。例如，本發(fā)明的組合物作為癌癥疫苗的用途，可以任選地與其它癌癥療法(例如眾所周知的化療或放療)組合使用。類似地，本發(fā)明的組合物在治療自身免疫病中的用途，可以任選地與用于治療特定自身免疫病的療法相組合。同樣地，用于治療哮喘或變應(yīng)性的狀況的本發(fā)明的組合物可以任選地與用于治療各狀況的療法相組合。
本發(fā)明的組合物和方法可以用于治療和/或診斷目的，其可以用于人類或獸醫(yī)應(yīng)用。例如，本發(fā)明的組合物可以用于靶向治療或診斷部分。在治療性部分的情況下，該部分可以是藥物，例如化療劑、細(xì)胞毒性的試劑、毒素等。例如，細(xì)胞毒性的試劑可以是放射性核素或化合物。示例性的用作治療劑的放射性核素包括，例如，X-射線或γ-射線發(fā)射體。另外，部分可以是藥物送遞載體，例如分室的微型裝置(microdevice)、細(xì)胞、脂質(zhì)體或病毒，其可以含有試劑例如藥物或核酸。
示例性的治療劑包括，例如，已經(jīng)連接到抗體上的蒽環(huán)霉素阿霉素，且抗體/阿霉素綴合物已經(jīng)治療上有效地用于治療腫瘤(Sivam等，Cancer Res.552352-2356(1995)；Lau等，Bioorg.Med.Chem.31299-1304(1995)；Shih等，Cancer Immunol.Immunother.3892-98(1994))。類似地，其它蒽環(huán)霉素，包括伊達(dá)比星和柔紅霉素，已經(jīng)被化學(xué)地綴合到抗體上，其已經(jīng)給腫瘤送遞有效劑量的試劑(Rowland等，Cancer Immunol.Immunother.37195-202(1993)；Aboud-Pirak等，Biochem.Pharmacol.38641-648(1989))。
除了蒽環(huán)霉素外，烷化劑例如美法侖和苯丁酸氮芥已經(jīng)被連接到抗體上，以生產(chǎn)治療上有效的綴合物(Rowland等，Cancer Immunol.Immunother.37195-202(1993)；Smyth等，Immunol.Cell Biol.65315-321(1987))，長春花生物堿例如長春地辛和長春堿也這樣(Aboud-Pirak等，同上，1989；Starling等，Bioconj.Chem.3315-322(1992))。類似地，抗體和抗代謝物(例如5-氟尿嘧啶、5-氟尿苷和其衍生物)的綴合物已經(jīng)有效地用于治療腫瘤(Krauer等，Cancer Res.52132-137(1992)；Henn等，J.Med.Chem.361570-1579(1993))。當(dāng)作為與各種不同抗體的綴合物施用時，其它化療劑，包括順鉑(Schechter等，Iht.J.Cancer 48167-172(1991))、甲氨蝶呤(Shawler等，J.Biol.Resp.Mod.7608-618(1988)；Fitzpatrick和Garnett，Anticancer Drug Des.1011-24(1995))和絲裂霉素-C(Dillman等，Mol.Biother.1250-255(1989))也是治療上有效的。治療劑也可以是毒素，例如蓖麻毒蛋白。
治療劑也可以是物理的、化學(xué)的或生物的材料，例如脂質(zhì)體、微囊、微泵(micropump)或其它分室的微型裝置，其可以用作例如藥物送遞系統(tǒng)。通常，這樣的微型裝置應(yīng)當(dāng)是無毒性的，且如果需要，是可生物降解的。各種部分，包括微囊，其可以含有試劑，和用于將部分(包括分室的微型裝置)連接到本發(fā)明的TIM靶向分子或試劑上的方法，是本領(lǐng)域眾所周知的和可商業(yè)上得到的(見，例如，“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第18版(Mack PublishingCo.1990)，第89-91章；Harlow和Lane，AntibodiesA laboratorymanual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988；Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996))。
對于診斷目的，TIM靶向分子或試劑還可以包含檢測部分。檢測部分可以是，例如，放射性核素、熒光的、磁的、比色的部分等。對于體內(nèi)診斷目的，可以將部分，例如發(fā)射γ射線的放射性核素，例如，銦-111或technitium-99，連接到本發(fā)明的抗體上，并在施用給受試者后，可以使用固體閃爍檢測器檢測到。類似地，可以將能發(fā)射正電子的放射性核素例如碳-11或順磁的自旋標(biāo)記例如碳-13連接到分子上，并在施用給受試者后，可以分別使用正電子發(fā)射軸向斷層顯象或磁共振成像，檢測該部分的定位。這樣的方法可以鑒定原發(fā)腫瘤以及轉(zhuǎn)移病灶。
對于診斷目的，TIM靶向分子或試劑可以用于體內(nèi)診斷，或用于從個體得到的組織樣品的體外診斷，例如，通過組織活組織檢查。示例性的體液包括，但不限于，血清、血漿、尿、滑液等。
通過許多眾所周知的偶聯(lián)或綴合部分的方法中的任一種，可以將治療或檢測部分偶聯(lián)到TIM靶向分子或試劑上。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的偶聯(lián)方法允許附著治療或檢測部分，而不干擾或抑制TIM靶向分子或試劑的結(jié)合活性。將部分綴合到本發(fā)明的TIM靶向分子或試劑上的方法，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的(見，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996))。還應(yīng)當(dāng)理解，可以將治療或檢測部分非共價地綴合到TIM靶向分子或試劑上，只要非共價地結(jié)合的綴合物具有對于希望的目的足夠的結(jié)合親和力。例如，通過將生物素或抗生物素蛋白綴合到各部分和TIM靶向分子上，和使用生物素-抗生物素蛋白來非-共價地綴合部分和TIM靶向分子，可以將治療或檢測部分綴合到TIM靶向分子上?？梢灶愃频厥褂闷渌愋偷谋娝苤慕Y(jié)合分子對，包括，例如，麥芽糖結(jié)合蛋白/麥芽糖、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶/谷胱甘肽等。
因而，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，TIM靶向分子或試劑，例如，抗-TIM抗體或TIM蛋白，可以用作將毒性的放射性同位素或毒素特異性地靶向癌細(xì)胞或在細(xì)胞表面上表達(dá)適當(dāng)?shù)腡IM分子(由抗-TIM抗體靶向)或TIM配體分子(由TIM蛋白靶向)的自身反應(yīng)性B和T細(xì)胞的送遞系統(tǒng)?？梢詫⒖贵w或重組蛋白，例如TIM蛋白，例如，具有Fc尾巴的TIM蛋白，綴合到植物毒素如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素、gelonin等，或細(xì)菌毒素如假單胞菌外毒素、白喉毒素，或化學(xué)毒素例如加利車霉素和esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法侖、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶或阿糖胞苷(ARA-C)、長春地辛、順鉑、依托泊苷、博來霉素、絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶；或放射性同位素如碘-131或釔-90。
在一個實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的組合物共價地或非共價地綴合到毒性分子上，包括化學(xué)、細(xì)菌或植物毒素和放射性同位素。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療癌癥或自身免疫病的方法，其中將TIM靶向分子或試劑，例如，抗-TIM抗體或TIM蛋白，共價地或非共價地綴合到治療部分，例如毒性分子，包括用作治療模態(tài)的化學(xué)、細(xì)菌或植物毒素和放射性同位素。也可以將各種毒素的組合偶聯(lián)到一個抗體分子上。其它化療劑是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，如本文所公開的。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物在生產(chǎn)用于治療受試者中的自身免疫性障礙的藥物中的用途，該組合物包含綴合到治療部分例如免疫毒素上的TIM靶向分子或試劑。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了綴合到治療部分上的TIM靶向分子或試劑的用途，其中自身免疫性障礙是選自下述的障礙類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、自身免疫性糖尿病、全身性紅斑狼瘡、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(ALPS)等。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了TIM靶向分子或試劑在治療受試者中的癌癥的用途。例如，癌癥可以是癌、肉瘤或淋巴瘤或其它癌癥類型。TIM靶向分子或試劑可以用于治療表達(dá)適當(dāng)?shù)腡IM或TIM配體的腫瘤。在腫瘤活組織檢查樣品中，可以鑒定TIM或TIM配體。如本文所公開的，已經(jīng)顯示各種細(xì)胞系會表達(dá)TIM或TIM配體，包括腎腺癌、胸腺瘤和淋巴瘤(見實(shí)施例XV和圖33-36)。如果腫瘤活組織檢查樣品是TIM表達(dá)陽性的，那么綴合了細(xì)胞毒性的試劑的TIM靶向分子例如抗-TIM抗體可以用于靶向腫瘤細(xì)胞。另一方面，如果腫瘤表達(dá)TIM分子的適當(dāng)配體，那么適當(dāng)?shù)腡IM分子自身或作為綴合到細(xì)胞毒性的試劑上的融合蛋白，可以用于靶向表達(dá)TIM配體的腫瘤。類似地，TIM靶向分子或試劑或其與治療或診斷部分的綴合物，可以用于靶向表達(dá)TIM或TIM配體的各種細(xì)胞類型或組織。
本發(fā)明提供了一種組合物，其包含綴合到治療或診斷部分上的TIM靶向分子。治療部分可以是化療劑、細(xì)胞毒性的試劑或毒素。細(xì)胞毒性的試劑可以是，例如，放射性核素或化合物，包括但不限于化合物加利車霉素、esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法侖、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶、長春地辛、順鉑、依托泊苷、博來霉素、絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶或放射性核素碘-131或釔-90。在一個具體的實(shí)施方案中，毒素可以是植物或細(xì)菌毒素，包括但不限于植物毒素蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素或gelonin或細(xì)菌毒素假單胞菌外毒素或白喉毒素。
制備和施用作為疫苗的組合物的方法，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的?？梢砸越?jīng)驗(yàn)為主地，但是可基于例如在動物模型中的免疫有效量，確定組分的免疫有效量。要考慮的因素包括抗原性，制劑，施用途徑，要施用的免疫劑量的次數(shù)，個體的身體狀況、體重和年齡等。這樣的因素是本領(lǐng)域眾所周知的，且可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定(見，例如，Paoletti和McInnes，編，Vaccines，from Concept toClinicA Guide to the Development and Clinical Testing of Vaccinesfor Human Use CRC Press(1999)。如本文所公開的，TIM靶向分子或試劑可以用作佐劑(見實(shí)施例)。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的TIM靶向分子或試劑可以單獨(dú)用作佐劑，或者如果需要，可以與其它眾所周知的佐劑相組合。
通過任意的本領(lǐng)域已知的方法，包括，但不限于，肌內(nèi)的、皮內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、皮下的、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的、經(jīng)口的或其它粘膜途徑，可以局部地或全身地施用本發(fā)明的組合物。其它途徑包括顱內(nèi)的(例如，腦池內(nèi)的或心室內(nèi)的)、眶內(nèi)的、眼的、囊內(nèi)的、椎管內(nèi)的和局部的施用。本發(fā)明的組合物可以在合適的、無毒性的藥物載體中施用，或可以配制在微囊中，或配制成持續(xù)釋放的植入物。如果需要，可以多次施用本發(fā)明的免疫原性組合物，以維持需要的免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定合適的途徑、劑型和免疫接種方案。
在本發(fā)明的一種方法中，可以施用本發(fā)明的組合物，從而使得抗原和TIM靶向分子處于施用的單一組合物中，以便共同施用抗原和TIM靶向分子。或者，可以執(zhí)行本發(fā)明的一種方法，從而使得抗原和TIM靶向分子作為分開的組合物施用，例如，分開的藥物組合物?？梢酝瑫r地，通過將組合物混合到一起或?qū)⑺鼈冊谙嗤课蛔⑸?，施用這樣的分開的含有抗原和TIM靶向分子的組合物，或可以在相同的或不同的位置，分開地施用組合物。可以在與抗原相同的部位或不同的部位，施用TIM靶向分子，且可以同時或先后經(jīng)歷幾分鐘或幾天的時間施用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定為所需作用施用抗原和TIM靶向分子的所需方案。在已有抗原存在的情況下，例如，對于發(fā)展中的感染或疾病，其中疾病-相關(guān)的抗原被暴露于免疫系統(tǒng)，可以施用TIM靶向分子，以刺激針對已經(jīng)在個體中表達(dá)的抗原的免疫反應(yīng)。
可以以一種或多種不同的形式施用TIM靶向分子。如果TIM靶向分子是肽或多肽，例如抗-TIM抗體或TIM融合蛋白，則施用模式包括，但不限于，施用純化的肽或多肽，施用表達(dá)肽或多肽的細(xì)胞，或施用編碼肽或多肽的核酸。
本發(fā)明的方法和用于實(shí)現(xiàn)它們的治療組合物，含有“基本上純的”試劑。例如，在TIM靶向分子或試劑是多肽的情況下，相對于多肽的原始來源中的其它多肽或不需要的組分，該多肽可以是至少約60％純的。例如，如果多肽純化自天然來源、重組表達(dá)或化學(xué)合成，則純度是相對于原始來源、重組來源或合成反應(yīng)中的其它組分的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的多肽試劑或其它試劑的適當(dāng)?shù)谋娝苤募兓椒ā＞唧w地，試劑可以是至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％純度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定適用于特定所需應(yīng)用的純度。通過任意的合適的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如柱色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳、HPLC分析，且可以基于需要的定量標(biāo)準(zhǔn)，例如紫外吸光度、染色或類似的依賴于試劑的化學(xué)性質(zhì)測量量的方法，可以測量純度。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)本發(fā)明的試劑與作為佐劑的其它組分相組合時，例如在疫苗中，可以以特定的純度，例如95％純度，但是不需要占疫苗中的組分(例如抗原、緩沖劑等)的95％，施用TIM靶向分子或試劑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定TIM靶向分子或試劑相對于本發(fā)明的組合物中的其它需要的組分的合適的純度和合適的量。
盡管可以從天然產(chǎn)生的來源得到在本發(fā)明的方法中使用的試劑，但也可以合成它們，或通過例如表達(dá)編碼TIM靶向分子或試劑的重組核酸分子來生產(chǎn)它們。重組表達(dá)多肽的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的(Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 56)，John Wiley & Sons，New York(2001)；Sambrook和Russel，Molecular CloningA Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor(2001))。肽合成方法也是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149(1964)；Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis Springer-Verlag(1984))?？梢詫奶烊粊碓?例如，從真核生物)純化的多肽，純化成基本上沒有它們的天然伴隨組分。類似地，可以將在真核或原核細(xì)胞(例如，大腸桿菌或其它原核生物)中重組表達(dá)的或化學(xué)合成的多肽，純化至需要的純度水平。在多肽是嵌合體的情況下，它可以由雜合核酸分子編碼，該雜合核酸分子含有一個編碼該試劑的全部或部分的序列，例如，編碼TIM多肽的序列和編碼IgG的Fc區(qū)的序列。
可以將本發(fā)明的試劑，具體地，重組表達(dá)的多肽，融合到親和標(biāo)記上，以促進(jìn)該多肽的純化。在一個實(shí)施方案中，親和標(biāo)記可以是相對較小的分子，其不會妨礙多肽的功能，例如，TIM靶向分子或試劑的結(jié)合?；蛘?，可以利用允許從重組表達(dá)的多肽上去除親和標(biāo)記的蛋白酶切割位點(diǎn)，將親和標(biāo)記融合到多肽上。如果親和標(biāo)記相對較大，且會潛在地妨礙多肽的功能，則蛋白酶切割位點(diǎn)的包含是特別有用的。示例性的親和標(biāo)記包括多組氨酸標(biāo)記，其通常含有約5-約10個組氨酸，或血凝素標(biāo)記，其可以用于促進(jìn)重組表達(dá)的多肽從原核或真核細(xì)胞的純化。其它示例性的親和標(biāo)記包括麥芽糖結(jié)合蛋白或凝集素，二者都結(jié)合糖、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶、抗生物素蛋白等。其它合適的親和標(biāo)記包括可以得到它的特異性抗體的表位。表位可以是，例如，約3-5個或更多個氨基酸的短肽、碳水化合物、小有機(jī)分子等。表位標(biāo)記已經(jīng)被用于親和純化重組蛋白，且可以在商業(yè)上得到。例如，抗表位標(biāo)記的抗體，包括myc、FLAG、血凝素(HA)、綠色熒光蛋白(GFP)、polyHis等，可以在商業(yè)上得到(見，例如，Sigma，St.LouisMO；PerkinElmer Life Sciences，Boston MA)。
在治療應(yīng)用中，本發(fā)明的試劑可以與生理上可接受的載體例如生理鹽水一起施用。本發(fā)明的治療組合物也可以含有載體或賦形劑，其中的許多是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的?？梢允褂玫馁x形劑包括緩沖劑，例如，檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑和碳酸氫鹽緩沖劑；氨基酸；脲；醇；抗壞血酸；磷脂；蛋白，例如，血清清蛋白；乙二胺四乙酸(EDTA)；氯化鈉或其它鹽；脂質(zhì)體；甘露糖醇、山梨糖醇、甘油等。根據(jù)對應(yīng)的施用途徑，可以以多種方式配制本發(fā)明的試劑。例如，可以制備液體溶液用于攝食或注射；可以制備凝膠或粉末用于攝食、吸入或局部應(yīng)用。制備這樣的制劑的方法是眾所周知的，且可以參見，例如，“Remington′s PharmaceuticalSciences，”第18版，Mack Publishing Company，Easton PA(1990)。
如上所述，通過在合適的真核或原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)一種或多種核酸分子，并隨后純化多肽試劑，可以得到本發(fā)明的多肽試劑，包括是融合蛋白的那些。另外，借助于合適的能體內(nèi)或離體編碼一種或多種核酸分子的治療表達(dá)載體，也可以將本發(fā)明的多肽試劑施用給患者。而且，在移植物的移植之前，可以將核酸導(dǎo)入移植物的細(xì)胞中。因而，編碼上述試劑的核酸分子也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
正如可以根據(jù)它們與野生型多肽的同一性來描述本發(fā)明的多肽，編碼它們的核酸分子會與編碼對應(yīng)的野生型多肽的那些具有某種同一性。例如，編碼TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4的核酸分子可以與編碼天然的或野生型TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4的核酸具有至少約50％、至少約65％、至少約75％、至少85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％同一性。類似地，TIM多肽可以與天然的或野生型TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4多肽具有至少約50％、至少約65％、至少約75％、至少85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％同一性。應(yīng)當(dāng)理解，與對應(yīng)的野生型分子具有小于100％同一性的多肽或編碼核酸，仍然保留需要的TIM多肽的功能。
編碼本發(fā)明的試劑的核酸分子可以含有天然產(chǎn)生的序列，或與天然產(chǎn)生的那些不同、但是由于遺傳密碼的簡并性而編碼相同多肽的序列。這些核酸分子可以由RNA或DNA組成，例如，基因組DNA、cDNA或合成的DNA，例如通過基于亞磷酰胺的合成生產(chǎn)的那些，或在這些核酸類型內(nèi)的核苷酸的組合或修飾。另外，核酸分子可以是雙鏈的或單鏈的，有義鏈或反義鏈。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，基于所需用途，例如，使用單鏈的或雙鏈的和有義或反義的病毒載體進(jìn)行表達(dá)，可以選擇合適形式的核酸。
在本發(fā)明的天然產(chǎn)生的核酸分子的情況下，可以從生物的天然產(chǎn)生的基因組“分離”核酸分子，因?yàn)榭梢詫⑺鼈兣c它們在基因組中緊密鄰接的5′或3′編碼序列分離。因而，核酸分子包括編碼多肽的序列，且可以包括位于編碼序列的上游或下游的非編碼序列。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知分離核酸分子的常規(guī)操作(見，例如，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Press，Plainview，New York(1989)；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology(Supplement 56)，John Wiley & Sons，New York(2001)；和Sambrook和Russel，Molecular CloningALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor(2001))。例如，通過用限制性內(nèi)切核酸酶處理基因組DNA，或使用眾所周知的方法，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來擴(kuò)增基因組DNA或cDNA的所需區(qū)域，可以產(chǎn)生核酸(見，例如，Dieffenbach和Dveksler，PCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress(1995))。在核酸分子是糖核酸(RNA)的情況下，可以通過體外轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)分子。
本發(fā)明的分離的核酸分子可以包含在天然狀態(tài)中不會發(fā)現(xiàn)的片段。因而，本發(fā)明包括重組分子，例如這樣的重組分子，其中核酸序列，例如，編碼TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4的序列，整合進(jìn)載體中，例如，質(zhì)?；虿《据d體，或整合進(jìn)異源細(xì)胞的基因組或同源細(xì)胞的基因組中，在天然的染色體位置以外的位置處。
如上所述，本發(fā)明的試劑可以是融合蛋白。除了上述的異源多肽之外，或作為替代，編碼本發(fā)明的試劑的核酸分子可以含有編碼“標(biāo)記”或“報(bào)道分子”的序列。標(biāo)記或報(bào)道分子基因的實(shí)施例包括β內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、腺苷脫氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neor、G418r)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、潮霉素B-磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(編碼β半乳糖苷酶)和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)。關(guān)于與實(shí)踐本發(fā)明有關(guān)的許多標(biāo)準(zhǔn)操作，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠認(rèn)識到，其它有用的試劑，例如其它序列，可以起標(biāo)記或報(bào)道分子的功能。
通過將突變導(dǎo)入從任何生物細(xì)胞(例如哺乳動物細(xì)胞)得到的或通過常規(guī)克隆方法生產(chǎn)的本發(fā)明的試劑，例如，TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4分子，可以得到本發(fā)明的核酸分子。因而，本發(fā)明的核酸可以是小鼠、大鼠、豚鼠、母牛、羊、馬、豬、兔、猴、狒狒、狗或貓的。在一個具體的實(shí)施方案中，核酸分子可以編碼人TIM。
本文所述的本發(fā)明的核酸分子可以包含在載體中，后者能指導(dǎo)它的表達(dá)，例如，在已經(jīng)用該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中。因此，除了多肽試劑外，還提供了含有編碼這些試劑的核酸分子的表達(dá)載體和用這些載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
適用于本發(fā)明的載體包括在細(xì)菌中使用的基于T7的載體(見，例如，Rosenberg等，Gene 56125-135(1987)，在哺乳動物細(xì)胞中使用的pMSXND表達(dá)載體(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.2633521-3527(1988)，酵母表達(dá)系統(tǒng)，例如巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)，例如PICZ家族的表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)和桿狀病毒衍生的載體，例如在昆蟲細(xì)胞中使用的表達(dá)載體pBacPAK9(Clontech，Palo Alto，CA)。可以將在這樣的載體中編碼目標(biāo)多肽的核酸插入序列可操作地連接到基于例如該核酸要在其中表達(dá)的細(xì)胞類型選擇的啟動子上。例如，T7啟動子可以用于細(xì)菌中，多角體蛋白啟動子可以用于昆蟲細(xì)胞中，且巨細(xì)胞病毒或金屬硫蛋白啟動子可以用于哺乳動物細(xì)胞中。同樣，在高等真核生物的情況下，可以廣泛地得到組織特異性的和細(xì)胞類型特異性的啟動子。這些啟動子是根據(jù)它們指導(dǎo)核酸分子在身體內(nèi)的給定組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)的能力而命名的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地確定合適的啟動子和/或可以用于指導(dǎo)核酸在所需細(xì)胞或生物中的表達(dá)的其它調(diào)節(jié)元件。
除了能促進(jìn)插入的核酸分子轉(zhuǎn)錄的序列外，載體可以含有復(fù)制起點(diǎn)，和編碼選擇標(biāo)記的其它基因。例如，新霉素-抗性(neor)基因?qū)418抗性賦予它在其中表達(dá)的細(xì)胞，并從而允許轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的表型選擇。允許細(xì)胞的表型選擇的其它可行的選擇標(biāo)記基因包括各種熒光蛋白，例如，綠色熒光蛋白(GFP)和其變體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定給定的調(diào)控元件或選擇標(biāo)記是否適用于特定用途。在圖18中顯示了示例性的載體。
可以在本發(fā)明中使用的病毒載體包括，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、和腺伴隨載體、皰疹病毒、猴病毒40(SV40)和牛乳頭瘤病毒載體(見，例如，Gluzman(Ed.)，Eukaryotic Viral Vectors，CSHLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。
還提供了含有編碼本發(fā)明的試劑的核酸分子且表達(dá)由核酸分子編碼的蛋白的原核或真核細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞是轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，即其中已經(jīng)通過重組DNA技術(shù)導(dǎo)入了一種或多種核酸分子，例如編碼TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4多肽的核酸分子，或例如編碼抗-TIM抗體的重鏈和輕鏈的核酸。認(rèn)為這樣的細(xì)胞的后代也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢允褂枚喾N表達(dá)系統(tǒng)。例如，可以在原核宿主，例如細(xì)菌大腸桿菌，或真核宿主例如昆蟲細(xì)胞(例如，Sf21細(xì)胞)或哺乳動物細(xì)胞(例如，COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、HeLa細(xì)胞等)中生產(chǎn)TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4或抗-TIM多肽。這些細(xì)胞可以從許多來源得到，包括美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地選擇適用于特定表達(dá)系統(tǒng)的組分，包括適用于所需細(xì)胞或生物的如上所述的表達(dá)載體、啟動子、選擇標(biāo)記等。各種表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用的選擇可參見例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology.JohnWiley and Sons，New York，NY(1993)；和Pouwels等，CloningVectorsA Laboratory Manual，1985 Suppl.1987)。還提供了真核細(xì)胞，其含有編碼本發(fā)明的試劑的核酸分子，且表達(dá)由這樣的核酸分子編碼的蛋白。
而且，本發(fā)明的真核細(xì)胞可以是作為細(xì)胞移植物、組織或器官移植物的部分的細(xì)胞。這樣的移植物可以包含從供體生物取出的原代細(xì)胞或在移植到受體生物之前體外培養(yǎng)、修飾和/或選擇的細(xì)胞，例如，真核細(xì)胞系，包括干細(xì)胞或祖細(xì)胞。如果在移植進(jìn)受體生物后，發(fā)生細(xì)胞增殖，則認(rèn)為這樣的細(xì)胞的后代也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢杂镁幋aTIM或抗-TIM多肽的核酸轉(zhuǎn)染作為細(xì)胞、組織或器官移植物的部分的細(xì)胞，且隨后將所述細(xì)胞移植進(jìn)受體生物，在其中進(jìn)行多肽的表達(dá)。而且，這樣的細(xì)胞可以含有一種或多種其它的核酸構(gòu)建體，從而允許在移植進(jìn)受體生物之前應(yīng)用例如特定的細(xì)胞譜系或細(xì)胞類型的選擇操作。這樣的移植的細(xì)胞可以用于治療應(yīng)用。例如，如果TIM靶向分子或試劑是多肽，則可以使用眾所周知的基因送遞方法和合適的載體(見，例如，Kaplitt和Loewy，Viral VectorsGene Therapy andNeuroscience Applications Academic Press，San Diego(1995))，移植表達(dá)TIM靶向分子的細(xì)胞，以提供TIM靶向分子的來源。
在細(xì)胞移植物的情況下，可以通過植入操作，或穿過血管壁的導(dǎo)管-介導(dǎo)的注射操作，施用細(xì)胞。在有些情況下，可以通過釋放進(jìn)脈管系統(tǒng)來施用細(xì)胞，細(xì)胞隨后從該脈管系統(tǒng)被血流分布，和/或遷移進(jìn)周圍組織。
在另一個實(shí)施方案中，通過基因送遞方法，可以將起免疫抑制劑作用的TIM靶向分子導(dǎo)入器官的細(xì)胞。在這樣的情況下，供體器官自身會提供免疫抑制劑，以促進(jìn)器官移植和抑制移植物排斥。
本發(fā)明另外提供了一種試劑盒，其含有包含抗原和TIM靶向分子或試劑的組合物。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其含有包含抗原的組合物和包含TIM靶向分子或試劑的組合物。如上面關(guān)于施用本發(fā)明的組合物所討論的，可以在相同位置或不同位置，共同地施用或分開地施用含有抗原和TIM靶向分子的分開的組合物的試劑盒。如本文所公開的，可以同時或在不同的時間，施用含有分開的抗原和TIM靶向分子組合物的試劑盒。
如本文所使用的，以最廣泛的含義使用術(shù)語“抗體”，以包括多克隆和單克隆抗體，以及這樣的抗體的抗原結(jié)合片段。對抗原特異性的抗體或這樣的抗體的抗原結(jié)合片段的特征在于，具有至少約1×105M-1的對抗原或其表位的特異性結(jié)合活性。因而，保留對抗原的特異性的結(jié)合活性的對抗原特異性的抗體的Fab、F(ab′)2、Fd和Fv片段，包含在抗體的定義內(nèi)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定對抗原(例如TIM)的特異性的結(jié)合活性，例如，通過對比抗體對它各自的抗原和非-抗原對照分子相對的結(jié)合活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地理解具有對特定抗原(例如TIM)的特異性的結(jié)合活性的抗體的含義?？贵w可以是多克隆或單克隆抗體。制備多克隆或單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的(見，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1988))。當(dāng)使用多克隆抗體時，可以使用抗原親和純化多克隆血清，以產(chǎn)生單-特異性的抗體，其具有減小的背景結(jié)合和更高比例的抗原-特異性的抗體。
另外，如本文使用的術(shù)語“抗體”包括天然產(chǎn)生的抗體以及非-天然產(chǎn)生的抗體，包括，例如，單鏈抗體、嵌合的、雙功能的和人源化的抗體及其抗原-結(jié)合片段。人源化的抗體意在包括通過使人免疫球蛋白序列(例如，人構(gòu)架序列)與源自提供抗原特異性的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的非-人免疫球蛋白序列相組合產(chǎn)生的重組抗體。從適用于抗體生產(chǎn)的各種非-人生物，包括但不限于大鼠、小鼠、兔子、山羊等，可以得到非-人免疫球蛋白序列。人源化的抗體也意在包括完全人抗體。得到完全人抗體的方法，例如使用例如噬菌體展示文庫系統(tǒng)或人MHC基因座轉(zhuǎn)基因小鼠，是本領(lǐng)域眾所周知的(見，例如，美國專利號5,585,089；5,530,101；5,693,762；6,180,370；6,300,064；6,696,248；6,706,484；6,828,422；5,565,332；5,837,243；6,500,931；6,075,181；6,150,584；6,657,103；6,162,963)。這樣的非-天然產(chǎn)生的抗體可使用固相肽合成構(gòu)建，可以重組生產(chǎn)，或可以如Huse等(Science 2461275-1281(1989))所述，通過例如篩選由可變重鏈和可變輕鏈組成的組合文庫來得到。這些和其它的制備例如嵌合的、人源化的、CDR-移植的、單鏈和雙功能的抗體的方法，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的(Winter和Harris，Immunol.Today 14243-246(1993)；Ward等，Nature 341544-546(1989)；Harlow和Lane，同上，1988；Hilyard等，Protein EngineeringA practical approach(IRLPress 1992)；Borrabeck，Antibody Engineering，第2版(OxfordUniversity Press 1995))。
使用免疫原，例如分離的TIM多肽或其片段，其可以從天然來源制備或重組生產(chǎn)，或能起表位作用的抗原的抗原性部分，可以得到對抗原特異性的抗體。如果表位可以用于產(chǎn)生對抗原特異性的抗體，則這樣的表位是功能性的抗原片段。通過將半抗原偶聯(lián)到載體分子例如牛血清清蛋白(BSA)或匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，可以將非-免疫原性的或弱免疫原性的抗原或其部分變成免疫原性的。各種其它的載體分子和將半抗原偶聯(lián)到載體分子上的方法，是本領(lǐng)域眾所周知的(見，例如，Harlow和Lane，同上，1988)。通過將肽部分表達(dá)為融合蛋白，例如，與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、polyHis等的融合蛋白，也可以產(chǎn)生抗原的免疫原性的肽片段。表達(dá)肽融合體的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的(Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 47)，John Wiley & Sons，New York(1999))。
如本文所公開的，可以將TIM靶向分子重組地表達(dá)為多肽，具有需要的活性的多肽的功能片段，或融合多肽。制備和表達(dá)重組形式的TIM靶向分子的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的，如在例如，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Plainview，New York(1989)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 56)，JohnWiley & Sons，New York(2001)；和Sambrook和Russel，MolecularCloningA Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor(2001)中所教導(dǎo)的。這樣的方法示例在實(shí)施例中，且圖18顯示了TIM靶向分子構(gòu)建體的示例性的表達(dá)載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定需要的片段，例如，具有需要的功能的TIM的功能片段，例如，用作TIM靶向分子的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，例如Ig結(jié)構(gòu)域和/或粘蛋白結(jié)構(gòu)域。
如上所述，TIM靶向分子或試劑可以是小分子，肽，多肽，多核苷酸，包括反義和siRNA，碳水化合物，包括多糖，脂類，藥物，以及模仿物，等。產(chǎn)生這樣的分子的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的(Huse，美國專利號5,264,563；Francis等，Curr.Opin.Chem.Biol.2422-428(1998)；Tietze等，Curr.Biol.，2363-371(1998)；Sofia，Mol.Divers.375-94(1998)；Eichler等，Med.Res.Rev.15481-496(1995)；Gordon等，J.Med.Chem.371233-1251(1994)；Gordon等，J.Med.Chem.371385-1401(1994)；Gordon等，Acc.Chem.Res.29144-154(1996)；Wilson和Czarnik，編，Combinatorial ChemistrySynthesis and Application，John Wiley &Sons，New York(1997))。選擇和制備反義核酸分子的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括硅片上(in silico)方法(Patzel等，Nucl.Acids Res.274328-4334(1999)；Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938502-8507(1996)；Lebedeva和Stein，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.41403-419(2001)；Juliano和Yoo，Curr.Opin.Mol.Ther.2297-303(2000)；和Cho-Chung，Pharmacol.Ther.82437-449(1999))。以前已經(jīng)描述了生產(chǎn)siRNA和使用RNA干擾的方法(Fire等，Nature391806-811(1998)；Hammond等Nature Rev.Gen.2110-119(2001)；Sharp，Genes Dev.15485-490(2001)；和Hutvagner和Zamore，Curr.Opin.Genetics & Development 12225-232(2002)；Hutvagner和Zamore，Curr.Opin.Genetics & Development 12225-232(2002)；Bernstein等，Nature 409363-366(2001)；(Nykanen等，Cell 107309-321(2001))。
本發(fā)明還提供了通過給個體施用組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子或試劑，預(yù)防性治療疾病的方法。因而，本發(fā)明的組合物可以用作疫苗，以預(yù)防疾病的發(fā)作，或降低疾病的嚴(yán)重性。該方法可以用于多種疾病，包括但不限于傳染病或癌癥。
本發(fā)明另外提供了通過給個體施用組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子或試劑，改善與疾病有關(guān)的病征或癥狀的方法。該方法可以用于降低疾病的嚴(yán)重性。因而，本發(fā)明的組合物可以在治療上用于治療疾病。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定與特定疾病有關(guān)的病征或癥狀和有關(guān)的病征或癥狀的改善。該方法可以用于多種疾病，包括但不限于傳染病或癌癥。在傳染病的情況下，該方法可以用于減少感染的個體中傳染物的量。
本發(fā)明另外提供了靶向腫瘤的方法。該方法可以包括向受試者施用TIM靶向分子的步驟，其中所述腫瘤表達(dá)TIM或TIM配體。腫瘤可以是，例如，癌、肉瘤和淋巴瘤。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過向受試者施用TIM靶向分子抑制腫瘤生長的方法，其中所述腫瘤表達(dá)TIM或TIM配體。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給受試者施用綴合到診斷部分上的TIM靶向分子，檢測腫瘤的方法，其中所述腫瘤表達(dá)TIM或TIM配體。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給受試者施用TIM靶向分子，改善與自身免疫病有關(guān)的病征或癥狀的方法，如本文所公開的。自身免疫病可以是，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、自身免疫性糖尿病、全身性紅斑狼瘡、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、重癥肌無力和自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(ALPS)以及動脈粥樣硬化和阿爾茨海默氏病，或如本文所公開的其它自身免疫病。自身免疫性障礙由細(xì)胞效應(yīng)物介導(dǎo)，例如，T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和它們生產(chǎn)的抗體，和其它細(xì)胞。這些細(xì)胞會表達(dá)如本文所公開的一種或多種TIM或TIM配體。通過消除參與自身免疫反應(yīng)的細(xì)胞，例如，使用抗體或融合蛋白中的裂解性的Fc，或通過使用毒性的綴合物，可以在這樣的自身免疫性障礙中實(shí)現(xiàn)治療益處。
在本發(fā)明的方法中，可以單獨(dú)施用TIM靶向分子，或任選地與抗原一起施用。在本發(fā)明的刺激免疫反應(yīng)的方法中，TIM靶向分子可以增強(qiáng)針對一種或多種內(nèi)源性抗原或針對一種或多種與TIM靶向分子一起施用的外源性抗原的免疫反應(yīng)，如本文所公開的。例如，在靶向腫瘤的方法中，抗原可以是腫瘤抗原。類似地，如果需要，可以與TIM靶向分子或其綴合物一起施用與介導(dǎo)自身免疫病的細(xì)胞有關(guān)的抗原。也可以使TIM靶向分子綴合治療部分。另外，TIM靶向分子或TIM靶向分子綴合物可以是TIM-Fc融合多肽。這樣的TIM-Fc融合多肽可以是靶細(xì)胞去除性的(裂解性的)或非-靶細(xì)胞去除性的(非-裂解性的)。
應(yīng)當(dāng)理解，在本文提供的本發(fā)明的定義內(nèi)，也提供了基本上不會影響本發(fā)明的各種實(shí)施方案的活性的改進(jìn)。因此，下面的實(shí)施例意在解釋而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例I抗-TIM-1抗體的純化在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，初始培養(yǎng)分泌小鼠抗-人TIM-1抗體或大鼠抗-小鼠TIM-1抗體的雜交瘤，并隨后轉(zhuǎn)移到Bioperm細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器。每隔48小時，收獲含有分泌的抗體的培養(yǎng)物上清液，澄清，并在4℃保藏。合并收集的上清液，通過G蛋白瓊脂糖親和色譜，從上清液純化抗-TIM-1抗體，并使用甘氨酸pH 2.5-3.5從柱洗脫。對洗脫物進(jìn)行pH中和，并對磷酸緩沖鹽水(PBS)進(jìn)行滲析。將純化的抗體在-80℃保藏，直到進(jìn)一步使用。
實(shí)施例II用于鼠和人TIM-1/Fc融合蛋白表達(dá)的DNA載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)并構(gòu)建了用于克隆TIM-1/Fc融合蛋白基因片段的穿梭質(zhì)粒載體(pTPL-1)?；A(chǔ)載體pTPL-1攜帶細(xì)菌和真核抗性基因以及側(cè)接CMV增強(qiáng)子和β-珠蛋白聚腺苷酸位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)(也見圖18，TIM-3融合體)。通過寡核苷酸定點(diǎn)誘變，產(chǎn)生了小鼠非-裂解性的IgG2a/Fc片段(鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)，以替代C1q結(jié)合基序和滅活FcγR1結(jié)合位點(diǎn)(Zheng等，J.Immunol.1545590-5600(1995))。
可以作為本發(fā)明的試劑的部分的Fc區(qū)，可以是“裂解性的”或“非-裂解性的”。非-裂解性的Fc區(qū)一般缺少高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)和C′1q結(jié)合位點(diǎn)。鼠IgG Fc的高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)包括在IgG Fc的位置235處的Leu殘基。因而，通過突變或缺失Leu235，可以破壞鼠Fc受體結(jié)合位點(diǎn)。例如，用Glu取代Leu 235，會抑制Fc區(qū)結(jié)合高親和力Fc受體的能力。通過突變或缺失IgG的Glu318、Lys 320和Lys 322殘基，可以在功能上破壞鼠C′1q結(jié)合位點(diǎn)。例如，用Ala殘基取代Glu 318、Lys 320和Lys 322，會使IgG Fc不能指導(dǎo)抗體-依賴性的補(bǔ)體裂解。相反地，裂解性的IgG Fc區(qū)具有高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)和C′1q結(jié)合位點(diǎn)。高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)包括在IgG Fc的位置235處的Leu殘基，而C′1q結(jié)合位點(diǎn)包括IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322殘基。裂解性的IgG Fc在這些位點(diǎn)具有野生型殘基或保守的氨基酸取代。裂解性的IgG Fc可以將細(xì)胞靶向依賴抗體的細(xì)胞毒性或補(bǔ)體指導(dǎo)的細(xì)胞裂解(CDC)。人IgG的適當(dāng)突變也是已知的(見，例如，Morrison等，TheImmunologist 2119-124(1994)；和Brekke等，The Immunologist2125，1994))。
通過PCR分別擴(kuò)增野生型和點(diǎn)突變的IgG2a Fc片段，并克隆進(jìn)pTPL-1，以產(chǎn)生pTPL-1/mFc2a和pTPL-1/mFc2a/nl(nl，非裂解性的)。隨后，使用下面的兩個寡核苷酸(基因座NM_014207，正向寡核苷酸5′-TGGCACCGGTGCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGG -3′，SEQ IDNO43；和反向寡核苷酸5′-TAGGAGATCTCCTAGGCAGGAAGCGACCAGCATCCCCAGCAGGTACAAGGTGGCCAGCGG-3′，SEQ IDNO44)，通過退火和補(bǔ)平反應(yīng)，合成人CD5信號序列基因片段。正向寡核苷酸含有在CD5信號序列的起始ATG(標(biāo)有下劃線)之前的合適的限制位點(diǎn)和Kozac共有序列和該序列的5′末端。反向寡核苷酸由源自CD5信號序列的3′末端的序列和合適的限制位點(diǎn)組成。消化合成的基因片段，并克隆進(jìn)pTPL-1/Fc載體。這會生成質(zhì)粒pTPL-1/CD5/mFc2a和pTPL-1/CD5/mFc2a/nl。最后，PCR-擴(kuò)增小鼠TIM-1的各胞外結(jié)構(gòu)域，并克隆進(jìn)pTPL-1/CD5/mFc2a和pTPL-1/CD5/mFc2a/nl載體，在人CD5信號序列和Ig Fc區(qū)之間。該克隆步驟產(chǎn)生最終的表達(dá)質(zhì)粒pTPL-1/TIM-1Fc和pTPL-1/TIM-1Fc/nl。通過DNA測序，證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建體的準(zhǔn)確度。構(gòu)建了下面的小鼠TIM-1/Fc表達(dá)載體(1)單獨(dú)融合到非-裂解性的和裂解性的小鼠IgG2a Fc上的TIM-1的免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域。圖1和2給出了Ig結(jié)構(gòu)域的各核苷酸序列。(2)融合到非-裂解性的和裂解性的小鼠IgG2a Fc上的小鼠TIM-1(BALB/c或C57B1/6等位基因)的全長胞外結(jié)構(gòu)域。圖1和2給出了胞外結(jié)構(gòu)域(Ig結(jié)構(gòu)域+粘蛋白結(jié)構(gòu)域)的序列。圖2給出了蛋白序列。圖4給出了示例性的TIM-1/Fc融合蛋白的蛋白序列。
以類似于上述的小鼠TIM-1/Fc表達(dá)載體的方式，還生成了表達(dá)人TIM-1/Fc的載體。為此，通過PCR擴(kuò)增了人IgG1 Fc或人IgG4Fc(各免疫球蛋白的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)，并克隆進(jìn)pTPL-1。然后，如上所述插入CD5前導(dǎo)序列，并且最后，如美國專利申請20030124114所述，將不同的TIM-1等位基因克隆進(jìn)表達(dá)載體。另外，使用只含有TIM-1的Ig結(jié)構(gòu)域或含有TIM-1的Ig和粘蛋白結(jié)構(gòu)域的載體來生成TIM-1/Fc表達(dá)載體。為TIM-3和TIM-4以及小鼠TIM-2，制備類似的構(gòu)建體。
實(shí)施例IIITIM/Fc融合蛋白在293細(xì)胞中的瞬時表達(dá)為了測試產(chǎn)生的表達(dá)載體的功能性，在293細(xì)胞中進(jìn)行了瞬時轉(zhuǎn)染。簡而言之，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(InvitroGen，Carlsbad，CA)，使用Lipofectamine 2000系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染了無血清的生長培養(yǎng)基(293-SFMII；InvitroGen，Carlsbad，CA)中的80-90％匯合的293細(xì)胞。常規(guī)地，使用1μg質(zhì)粒DNA/105細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后1天，將生長培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基，且培養(yǎng)細(xì)胞至最多7天。通過離心，澄清細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，并通過G蛋白瓊脂糖親和色譜，純化TIM-1/Fc或TIM-3/Fc融合蛋白。從G蛋白珠子低pH洗脫后，對PBS滲析純化的蛋白，并在-80℃保藏。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)和銀或考馬斯染色、蛋白印跡和ELISA，分析生產(chǎn)的蛋白的同一性、純度和完整性。
實(shí)施例IV穩(wěn)定表達(dá)TIM-1/Fc、TIM-3/Fc和TIM-4/Fc的CHO細(xì)胞系的生成如下生成了穩(wěn)定表達(dá)各種TIM-1/Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞系使用可商業(yè)上得到的試劑盒(Lipofectamine 2000，InvitroGen，Carlsbad，CA)并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書或通過電穿孔，用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒(pTPL-l；TIM-1/Fc系列)轉(zhuǎn)染了貼壁的(CHO-K1)或懸浮-生長CHO-S細(xì)胞(InvitroGen，Carlsbad，CA)。使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在生長培養(yǎng)基(CHO-SFM II；InvitroGen，Carlsbad，CA；或DMEM，10％胎牛血清)中恢復(fù)1天，然后轉(zhuǎn)移進(jìn)含有抗生素G418(0.5mg/ml至1mg/ml)的選擇培養(yǎng)基中。通過單細(xì)胞有限稀釋克隆(懸浮系)或“克隆挑取(clone picking)”(貼壁細(xì)胞系)，生成單個的克隆，并進(jìn)一步繁殖。使用ELISA測定培養(yǎng)基上清液是否存在分泌的TIM-1/Fc蛋白。進(jìn)一步亞克隆高產(chǎn)克隆，并擴(kuò)增以用于蛋白生產(chǎn)。使用基本上相同的規(guī)程，生成穩(wěn)定表達(dá)TIM-3/Fc和TIM-4/Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞系。
實(shí)施例V小鼠TIM/Fc融合蛋白的生產(chǎn)和純化在無血清的生長培養(yǎng)基(CHO-SFM II；InvitroGen，Carlsbad，CA)或DMEM，5％胎牛血清中，擴(kuò)增表達(dá)TIM-1/Fc融合蛋白的穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系。收集培養(yǎng)基，通過離心和/或過濾進(jìn)行澄清，通過超濾(Pall UltrasetteTM，Ann Arbor，MI)進(jìn)行濃縮，并通過A或G蛋白固定化。洗滌蛋白-結(jié)合的樹脂，并通過低pH洗脫TIM-1/Fc融合蛋白。收集級分，并調(diào)節(jié)至中性pH。如果需要，通過離子交換色譜和大小排阻色譜，進(jìn)一步純化洗脫的TIM-1/Fc蛋白。對合適的生理緩沖液例如PBS滲析純化的蛋白，并在-80℃保藏等分試樣。使用基本上相同的規(guī)程，生產(chǎn)和純化TIM-3/Fc和TIM-4/Fc融合蛋白。
實(shí)施例VI作為乙型肝炎疫苗的佐劑的抗-TIM-1給BALB/c小鼠接種單劑(10微克，“mcg”)的有或沒有50mcg/ml抗-TIM-1抗體的Engerix-BTM疫苗(Glaxo SmithKline)。在注射前，將抗體與疫苗(疫苗含有作為佐劑的0.5mg/ml氫氧化鋁)相混合。用溶于PBS中的氫氧化鋁、單獨(dú)的PBS或含有同種型匹配的抗體對照的載體，處理對照小鼠。在免疫接種后第7、14和21天，從每組取出小鼠進(jìn)行分析。簡而言之，收獲脾和血清，處理成在補(bǔ)加了β-巰基乙醇、10％胎牛血清(FBS)和抗生素(青霉素、鏈霉素、兩性霉素)的RPMI培養(yǎng)基中的單細(xì)胞懸浮液。在有純化的乙型肝炎表面抗原(5mcg/ml，Research Diagnostics，Inc.，F(xiàn)landers，NewJersey)存在下，培養(yǎng)處理的脾細(xì)胞(3×105細(xì)胞)。在37℃、5％CO2培養(yǎng)96小時后，通過WST-細(xì)胞增殖試劑盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)分析總的活細(xì)胞。另外，在96小時后，從這些實(shí)驗(yàn)孔收獲上清液，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用商業(yè)的細(xì)胞因子ELISA試劑盒(R&D Systems；Minneapolis MN)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。將血清樣品稀釋至1∶200，并在能檢測對乙型肝炎表面抗原特異性的抗體的ELISA中分析。
在其它實(shí)驗(yàn)中，以上述的方式，使從接種疫苗的動物分離的脾細(xì)胞與0.3、1.0或3.0mcg/ml乙型肝炎表面抗原溫育。使用Delfia增殖測定試劑盒(Perkin Elmer，Boston，MA)，測量抗原引起的細(xì)胞增殖。簡而言之，給BALB/c小鼠(每組6只小鼠)接種用明礬和100mcgTIM-1抗體佐劑化的Engerix-BTM。在總體積為0.2ml的完全培養(yǎng)基(RPMI 10％胎牛血清、青霉素-鏈霉素、β-巰基乙醇)中，在有或沒有抗原存在的情況下，通過溫育淋巴細(xì)胞制劑4天，測量乙型肝炎表面抗原-特異性的脾細(xì)胞的增殖。在每個增殖時間點(diǎn)結(jié)束之前的24小時，用0.02ml 5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記溶液標(biāo)記在96-孔平底組織培養(yǎng)平板中的細(xì)胞。24小時后，離心平板，并取出培養(yǎng)基。將孔中的核酸內(nèi)容物固定到塑料上，并加入用銪標(biāo)記的抗-BrdU抗體，以結(jié)合整合的BrdU。洗滌孔并加入熒光誘導(dǎo)物后，使用Wallac Victor 2多標(biāo)記分析儀分析銪熒光，并表達(dá)為相對熒光單位(RFU)。測定對照包括沒有細(xì)胞的孔，沒有BrdU的細(xì)胞，和沒有抗原刺激的細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，商業(yè)的乙型肝炎疫苗(Engerix-BTM，GlaxoSmithKline)的施用，在小鼠中僅僅是較差免疫原性的。該疫苗不能在小鼠中引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，且僅僅在免疫接種后3周，檢測到針對乙型肝炎抗原的抗體。在接種乙型肝炎疫苗時施用作為佐劑的抗-TIM-1抗體，會在接種疫苗后7天內(nèi)，導(dǎo)致針對乙型肝炎抗原的抗原-特異性的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。通過監(jiān)控再次暴露于抗原的免疫細(xì)胞增殖，并通過測量T輔助細(xì)胞因子的生產(chǎn)，已經(jīng)測定了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。在接種疫苗時施用作為佐劑的抗-TIM-1抗體，還會在接種疫苗后7天內(nèi)，導(dǎo)致針對乙型肝炎抗原的抗體的產(chǎn)生。
圖5顯示了再次刺激后抗原的增殖。給BALB/c小鼠接種單獨(dú)的Engerix-BTM(10mcg)或單劑的抗-TIM抗體(50mcg)。在指定的時間，分析脾對乙型肝炎表面抗原的增殖(96小時測定)。盡管單獨(dú)的疫苗刺激較少的抗原引起的脾細(xì)胞和T細(xì)胞增殖，但抗-TIM-1抗體極大地增強(qiáng)了對抗原的細(xì)胞增殖反應(yīng)，從而表明增加了細(xì)胞免疫。這些結(jié)果表明，抗-TIM-1抗體改善了對乙型肝炎疫苗的反應(yīng)。
圖6顯示了用抗原再次刺激后細(xì)胞因子的生產(chǎn)。用10mcg乙型肝炎疫苗，或用10mcg含有抗-TIM抗體的疫苗，免疫BALB/c小鼠。在第7、14和21天，用乙型肝炎抗原體外刺激脾細(xì)胞。96小時后，分別分析上清液中的IFN-γ和IL-4。盡管單獨(dú)的疫苗刺激較少的抗原引起的IFN-γ生產(chǎn)(一種Th1細(xì)胞因子)，但抗-TIM-1抗體極大地增強(qiáng)了該細(xì)胞因子的生產(chǎn)，從而表明增加了Th1反應(yīng)。相反地，IL-4(一種Th2細(xì)胞因子)的表達(dá)，在所有的時間點(diǎn)都是在背景水平。這些結(jié)果表明抗-TIM-1抗體佐劑對干擾素-γ生產(chǎn)起作用。
圖7顯示了乙型肝炎特異性的抗體的生產(chǎn)。在免疫接種后第7天，測試來自用含有或沒有抗-TIM抗體的乙型肝炎疫苗(單劑；50mcg)接種的小鼠的血清樣品是否存在對乙型肝炎表面抗原特異性的抗體。盡管在免疫接種后早期，單獨(dú)的疫苗刺激較少的針對乙型肝炎抗原的抗體反應(yīng)，但抗-TIM-1抗體會刺激強(qiáng)的抗體反應(yīng)。這些結(jié)果表明，與乙型肝炎疫苗一起使用抗-TIM-1抗體的處理，會誘導(dǎo)針對乙型肝炎抗原的抗體。
圖8顯示了乙型肝炎表面抗原-特異性的脾細(xì)胞的與抗原刺激的劑量依賴性關(guān)系的增殖。從用10mcg Engerix-BTM(含有或沒有100mcg TIM-1mAb)接種一次的小鼠分離脾細(xì)胞，并在有或沒有遞增的乙型肝炎表面抗原濃度的情況下培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后，使用Delfia細(xì)胞增殖測定，分析各孔的增殖。與接種單獨(dú)的Engerix-BTM疫苗或同種型對照抗體相比，接受含有TIM-1mAb的疫苗的小鼠產(chǎn)生了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的針對特定抗原的反應(yīng)(p＜0.05)。這些結(jié)果表明，抗-TIM-1能增強(qiáng)針對乙型肝炎表面抗原的脾細(xì)胞的增殖。
圖9顯示了用特定抗原刺激后IFN-γ的生產(chǎn)。在針對乙型肝炎表面抗原(HepBsAg)的完整脾細(xì)胞中測量了干擾素-γ表達(dá)。從上述的增殖測定孔中取出上清液，用于通過ELISA進(jìn)行的細(xì)胞因子分析。與接受單獨(dú)的疫苗或含有同種型對照抗體的疫苗的小鼠相比，抗原刺激使接受含有TIM-1 mAb的疫苗的小鼠產(chǎn)生了顯著更高量的IFN-γ(p＜0.05)。沒有檢測到IL-4。這些結(jié)果表明，作為對乙型肝炎表面抗原的反應(yīng)，抗-TIM-1能增強(qiáng)IFN-γ表達(dá)。
實(shí)施例VII作為HIV抗原的佐劑的抗-TIM-1在第1和15天，給6-8周齡的C57BL/6小鼠(每組4只)皮下接種單劑的溶于PBS中的HIV p24抗原(25或50mcg)，并腹膜內(nèi)接種50或100mcg TIM-1mAb、同種型對照抗體或50或100mcg CpG1826(由Invitrogen Corporation；Carlsbad CA合成)寡脫氧核苷酸。CpG 1826寡核苷酸(oligo)是TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO45)ZOOFZEFOEZZOOZEFOEZT第一行是以標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫命名法表示的核苷酸序列。所有的堿基，除了最后的T以外，都被硫代磷酸化修飾。第二行是使用硫代磷酸化的堿基的單字母縮寫的序列。代碼是F＝A-硫代磷酸化，O＝c-硫代磷酸化，E＝g-硫代磷酸化，Z＝T-硫代磷酸化。然后，在第21天處死小鼠，并收獲脾細(xì)胞，以測量對抗原的增殖。簡而言之，通過在有或沒有HIV p24抗原存在的情況下，在總體積為0.2ml的完全培養(yǎng)基(RPMI 10％胎牛血清、青霉素-鏈霉素、β-巰基乙醇)中培養(yǎng)淋巴細(xì)胞制劑4天，測量脾細(xì)胞。使用Delfia細(xì)胞增殖測定(PerkinElmer)，測定細(xì)胞增殖。在培養(yǎng)階段結(jié)束之前24小時，用0.02ml BrdU標(biāo)記溶液，標(biāo)記96-孔圓底組織培養(yǎng)平板中的細(xì)胞。24小時后，離心平板，并取出培養(yǎng)基。將孔中的核酸內(nèi)容物固定到塑料上，并加入用銪標(biāo)記的抗-BrdU抗體，以結(jié)合整合的BrdU。使用熒光分析儀，將BrdU的整合表達(dá)為銪的相對熒光單位(RFU)。測定對照包括沒有細(xì)胞的孔、沒有BrdU的細(xì)胞和單獨(dú)的載體(磷酸緩沖鹽水，PBS)。
圖10表明，與同種型對照抗體或CpG寡核苷酸相比，用HIV p24抗原+TIM-1mAb免疫的小鼠產(chǎn)生了顯著更高的對抗原的增殖反應(yīng)(與CpG相比，p＜0.05)。在第1和15天，給小鼠皮下接種單劑的溶于PBS中的HIV p24抗原(50mcg)，并腹膜內(nèi)地接種100mcg TIM-1mAb、同種型對照抗體或100mcg CpG(1826)寡脫氧核苷酸。然后，在第24天處死小鼠，并收獲脾細(xì)胞，以測定對抗原的增殖。這些結(jié)果表明，抗-TIM-1會增強(qiáng)對HIV p24抗原的增殖反應(yīng)。
實(shí)施例VIII作為流感接種疫苗的佐劑的抗-TIM-1給BALB/c小鼠接種含有或沒有50mcg/ml抗-TIM-1抗體的單劑(30mcg)的FluvirinTM疫苗(Evans Vaccines，Ltd)。在即將注射之前，將抗體與疫苗相混合。用單獨(dú)的PBS或含有同種型匹配的抗體對照的PBS，處理對照小鼠。在免疫接種后第10天，從每組取小鼠進(jìn)行分析。簡而言之，收獲脾和血清，并處理成在補(bǔ)加了β-巰基乙醇、10％FBS和抗生素(青霉素、鏈霉素、兩性霉素)的RPMI培養(yǎng)基中的單細(xì)胞懸浮液。在有滅活的完整的流感(1mcg/ml，北京品系，H1N1；Research Diagnostics，Inc.，F(xiàn)landers，New Jersey)存在下，培養(yǎng)處理的脾細(xì)胞(3×105細(xì)胞)。在37℃、5％CO2培養(yǎng)96小時后，通過WST-細(xì)胞增殖試劑盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)，分析活細(xì)胞。在96小時后，從這些實(shí)驗(yàn)孔收獲上清液，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用商業(yè)的細(xì)胞因子ELISA試劑盒(R&D Systems)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。將血清樣品稀釋至1∶200，并在能檢測對流感病毒特異性的抗體的ELISA中分析。
圖11顯示了脾細(xì)胞對流感抗原的增殖反應(yīng)。用流感疫苗FluvirinTM或FluvirinTM+抗-TIM-1抗體(單劑；50mcg)免疫了BALB/c小鼠。10天后，在96小時增殖測定中，測量對病毒(H1N1)刺激的反應(yīng)。單獨(dú)的PBS和抗-TIM-1抗體是處理對照。盡管作為對抗原的反應(yīng)，單獨(dú)的疫苗刺激較少的脾細(xì)胞和T細(xì)胞增殖，但抗-TIM-1抗體極大地增強(qiáng)了對抗原的細(xì)胞增殖反應(yīng)，從而表明增加了細(xì)胞免疫。這些結(jié)果顯示了抗-TIM-1抗體對流感疫苗接種的佐劑作用。
圖12顯示了流感免疫的小鼠的細(xì)胞因子生產(chǎn)。用30mcg流感疫苗FluvirinTM或FluvirinTM+抗-TIM抗體(單劑；50mcg)免疫BALB/c小鼠。10天后，制備脾細(xì)胞，且在培養(yǎng)(在圖12中，從左向右顯示了PBS、FluvirinTM、抗-TIM-1和FluvirinTM+抗-TIM-1)96小時后，測定用病毒(H1N1)再次刺激后Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)細(xì)胞因子的生產(chǎn)。盡管作為對抗原的反應(yīng)，單獨(dú)的疫苗刺激較少的IFN-γ生產(chǎn)(一種Th1細(xì)胞因子)，但抗-TIM-1抗體極大地增強(qiáng)了該細(xì)胞因子的生產(chǎn)，從而表明增加了Th1反應(yīng)。IL-4生產(chǎn)處于或低于背景。因而，與IFN-γ相反，IL-4(一種Th2細(xì)胞因子)的表達(dá)處于背景水平。這些結(jié)果表明，抗-TIM-1佐劑會引起流感-特異性的Th1細(xì)胞因子反應(yīng)。
實(shí)施例IX抗-TIM-1作為佐劑以產(chǎn)生針對不同流感品系的異源亞型免疫反應(yīng)用含有或沒有100mcg/ml抗-TIM-1抗體的單劑(10mcg)的北京流感病毒(A/北京/262/95，H1N1)，接種BALB/c小鼠(每組3只)。在即將注射之前，將抗體與抗原相混合。用單獨(dú)的PBS或含有同種型匹配的(大鼠IgG2b)抗體對照的抗原，處理對照小鼠。在免疫接種后第21天，從每組取小鼠進(jìn)行分析。簡而言之，收獲脾和血清，并處理成在補(bǔ)加了β-巰基乙醇、10％FBS和抗生素(青霉素、鏈霉素、兩性霉素)的RPMI培養(yǎng)基中的單細(xì)胞懸浮液。在有滅活的完整的流感(1mcg/ml、北京品系、H1N1或A/基輔-樣301/94-約翰內(nèi)斯堡/33/94、H3N2；Research Diagnostics，Inc.，F(xiàn)landers，New Jersey)存在下，培養(yǎng)處理的脾細(xì)胞(3×105細(xì)胞)。在37℃、5％CO2培養(yǎng)96小時后，通過Delfia增殖試劑盒(PerkinElmer)，分析活細(xì)胞。在培養(yǎng)階段結(jié)束之前24小時，用20μl BrdU標(biāo)記溶液標(biāo)記96-孔圓底組織培養(yǎng)平板中的細(xì)胞。24小時后，離心平板，并取出培養(yǎng)基。將孔中的核酸內(nèi)容物固定到塑料上，并加入用銪標(biāo)記的抗-BrdU抗體，以結(jié)合整合的BrdU。使用熒光分析儀，將BrdU的整合表達(dá)為銪的相對熒光單位(RFU)。測定對照包括沒有細(xì)胞的孔、沒有BrdU的細(xì)胞和沒有抗原性刺激的細(xì)胞。在96小時后，從這些實(shí)驗(yàn)孔收獲上清液，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用商業(yè)的細(xì)胞因子ELISA試劑盒(R&DSystems)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。
圖13顯示了針對北京病毒(A)或基輔病毒(B)的刺激的北京-免疫的小鼠的增殖反應(yīng)。在有或沒有100mcg TIM-1mAb或同種型對照(大鼠IgG2b)存在的情況下，用10mcg滅活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收獲脾，以進(jìn)行體外分析。使用TIM-1mAb增強(qiáng)了增殖，且對基輔刺激作出的響應(yīng)證實(shí)了交叉品系免疫(p＜0.01)。這些結(jié)果表明，抗-TIM-1會增強(qiáng)針對流感A的脾細(xì)胞增殖，并刺激交叉品系免疫。
圖14顯示了北京-免疫的小鼠針對北京病毒(A)或基輔病毒(B)的刺激的細(xì)胞因子反應(yīng)。在有或沒有100mcg TIM-1mAb或同種型對照(大鼠IgG2b)存在的情況下，用10mcg滅活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收獲脾，用于進(jìn)行體外分析。分析來自增殖測定的上清液是否存在IFN-γ。小圖A表明，TIM-1mAb的加入顯著(p＜0.01)增強(qiáng)了北京病毒(H1N1)刺激引起的IFN-γ的生產(chǎn)。小圖B表明，TIM-1mAb的加入也顯著(p＜0.01)增強(qiáng)了用異源亞型基輔品系(H3N2)刺激引起的IFN-γ的生產(chǎn)。這些結(jié)果表明，抗-TIM-1會增強(qiáng)交叉品系免疫。
圖15顯示了北京-免疫的小鼠針對北京病毒(A)或基輔病毒(B)的刺激的IL-4細(xì)胞因子生產(chǎn)。在有或沒有100mcg TIM-1mAb或同種型對照(大鼠IgG2b)存在的情況下，用10mcg滅活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收獲脾，用于進(jìn)行體外分析。分析來自增殖測定的上清液是否存在IL-4。小圖A表明，TIM-1mAb的加入顯著(p＜0.01)增強(qiáng)了北京病毒(H1N1)刺激引起的IL-4的生產(chǎn)。小圖B表明，TIM-1mAb的加入也顯著(p＜0.01)增強(qiáng)了用異源亞型基輔品系(H3N2)刺激引起的IL-4的生產(chǎn)。這些結(jié)果表明，在流感A刺激的脾細(xì)胞中，抗-TIM-1增強(qiáng)了IL-4表達(dá)。
實(shí)施例X作為炭疽接種疫苗的佐劑的抗-TIM-1和抗-TIM-3給C57BL/6小鼠接種單劑(40mcg)的含有或沒有50mcg/ml抗-TIM-3抗體的重組保護(hù)性抗原(rPA，List Biological Laboratories；Campbell CA)。在即將注射前，將抗體和抗原和作為佐劑的1.2mg/ml氫氧化鋁相混合。用溶于PBS中的氫氧化鋁或含有同種型匹配的抗體對照的介質(zhì)處理對照小鼠。在免疫接種后第10天，從每組取小鼠進(jìn)行分析。簡而言之，收獲脾和血清，并處理成在補(bǔ)加了β-巰基乙醇、10％FBS和抗生素(青霉素、鏈霉素、兩性霉素)的RPMI培養(yǎng)基中的單細(xì)胞懸浮液。在有rPA(1mcg/ml，Research Diagnostics，Inc.，F(xiàn)landers，New Jersey)存在下，培養(yǎng)處理的脾細(xì)胞(3×105細(xì)胞)。在37℃、5％CO2培養(yǎng)96小時后，通過WST-細(xì)胞增殖試劑盒(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)，分析活細(xì)胞。另外，在96小時后，從這些實(shí)驗(yàn)孔收獲上清液，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用商業(yè)的細(xì)胞因子ELISA試劑盒(R&D Systems)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。將血清樣品稀釋至1∶200，并在能檢測對rPA抗原特異性的抗體的ELISA中分析。
或者，給C57BL/6小鼠接種單劑(0.2ml)的含有或沒有50mcg/ml抗-TIM-1抗體的BioThraxTM(AVA；Bioport，Lansing，MI)。在即將注射前，將抗體和抗原和作為佐劑的1.2mg/ml氫氧化鋁相混合。用單獨(dú)的BioThraxTM疫苗或含有同種型匹配的抗體對照的BioThraxTM疫苗處理對照小鼠。在免疫接種后第7天，從每組取小鼠進(jìn)行分析，并收集血清樣品。將血清樣品稀釋至1∶200，并在能檢測對rPA抗原特異性的抗體的ELISA中分析。另外，在第15天收獲脾，處理成在補(bǔ)加了β-巰基乙醇、10％FBS和抗生素(青霉素、鏈霉素、兩性霉素)的RPMI培養(yǎng)基中的單細(xì)胞懸浮液。在有rPA(1mcg/ml，Research Diagnostics，Inc.，F(xiàn)landers，New Jersey)存在下，培養(yǎng)處理的脾細(xì)胞(3×105細(xì)胞)。在37℃、5％CO2培養(yǎng)96小時后，通過WST-細(xì)胞增殖試劑盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)，分析活細(xì)胞。另外，在96小時后，從這些實(shí)驗(yàn)孔收獲上清液，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用商業(yè)的細(xì)胞因子ELISA試劑盒(R&D Systems)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。
圖16顯示了接種疫苗后的抗-rPA抗體反應(yīng)。用0.2ml AVA(炭疽疫苗吸附的)BioThraxTM或BioThraxTM+抗-TIM-1抗體免疫C57BL/6小鼠。7天后，在ELISA中，測量對rPA特異性的總血清抗體。單獨(dú)的BioThraxTM和BioThraxTM+同種型匹配的抗體是處理對照。盡管單獨(dú)的疫苗刺激較少的針對炭疽抗原的抗體反應(yīng)，但抗-TIM-1抗體刺激了顯著升高的抗體反應(yīng)。這些結(jié)果表明，BioThraxTM+抗-TIM-1會增加抗體生產(chǎn)。
圖17顯示了炭疽接種疫苗的抗-TIM佐劑作用。用重組的保護(hù)性抗原(rPA；40mcg)或rPA+抗-TIM-3抗體(單劑；50mcg)免疫C57BL/6小鼠。10天后，在96小時增殖測定中，測量脾細(xì)胞對rPA再次刺激的反應(yīng)。PBS和rPA+同種型匹配的對照抗體是處理對照。這些結(jié)果顯示了對炭疽接種疫苗的抗-TIM-3佐劑作用。
實(shí)施例XI作為利斯特氏菌接種疫苗的佐劑的抗-TIM-1給C57BL/6小鼠接種單劑的含有或沒有50mcg/ml抗-TIM-1抗體的熱殺死的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(HKLM)。在注射前，將抗體與抗原和氫氧化鋁(作為佐劑)相混合。用溶于PBS中的氫氧化鋁、單獨(dú)的PBS或含有同種型匹配的抗體對照的載體處理對照小鼠。在免疫接種后第10天，從每組取小鼠進(jìn)行分析。簡而言之，收獲脾和血清，處理成在補(bǔ)加了β-巰基乙醇、10％FBS和抗生素(青霉素、鏈霉素、兩性霉素)的RPMI培養(yǎng)基中的單細(xì)胞懸浮液。在有1mcg/mlHKLM存在下，培養(yǎng)處理的脾細(xì)胞(3×105細(xì)胞)。在37℃、5％CO2培養(yǎng)96小時后，通過WST-細(xì)胞增殖試劑盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)，分析活細(xì)胞。在96小時后，從這些實(shí)驗(yàn)孔收獲上清液，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用商業(yè)的細(xì)胞因子ELISA試劑盒(R&D Systems)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。將血清樣品稀釋至1∶200，并在能檢測對HKLM特異性的抗體的ELISA中分析。
實(shí)施例XII作為癌癥疫苗的佐劑且作為治療腫瘤的治療劑的TIM-1/Fc、TIM-4/Fc和抗-TIM-1給C57BL/6或BALB/c小鼠皮下注射106γ-照射的或絲裂霉素-處理的B16.F10(黑素瘤)、EL4(胸腺瘤)或p815(肥大細(xì)胞瘤)細(xì)胞。在用滅活的腫瘤細(xì)胞接種疫苗時，還用0.1mg大鼠抗-小鼠TIM-1或TIM-l/Fc皮下地或腹膜內(nèi)地處理動物。用等量的大鼠或小鼠IgG2a處理對照小鼠。14天后，重復(fù)該接種疫苗規(guī)程。在第20天，用105-106活腫瘤細(xì)胞(為每種腫瘤類型進(jìn)行滴定，以在沒有處理時產(chǎn)生100％腫瘤發(fā)病率B16.F105×105細(xì)胞；P815和EL4106細(xì)胞)攻擊小鼠，并每2天一次監(jiān)控腫瘤發(fā)病率和大小。
在實(shí)驗(yàn)中采用的小鼠和細(xì)胞系是在送遞時8-10周齡的C57BL/6、DBA/2或BALB/c雌性小鼠。EL4胸腺瘤、B16F10黑素瘤和P815肥大細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并如ATCC所推薦的，在補(bǔ)加了10％(v/v)熱滅活的胎牛血清(Gemini Bio-Products，Woodland，CA)和1000mcg/ml青霉素G鈉、1000mcg/ml硫酸鏈霉素和2.5mcg/ml兩性霉素B(抗生素-抗真菌劑，Gibco Invitrogen Corp.)的DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)中培養(yǎng)。當(dāng)標(biāo)明時，用Model C-188鈷-60源(MDS-Nordion，Ottawa，ON，加拿大)發(fā)射的20,000拉德γ-放射線照射腫瘤細(xì)胞。
對于動物處理，首先剪掉小鼠右側(cè)皮膚上的毛，然后注射單獨(dú)的磷酸緩沖鹽水(PBS，Sigma，St.Louis，MO)、100mcg克隆1或克隆2抗-TIM-1抗體或106γ-照射的EL4、B16F10或P815細(xì)胞+100mcg溶于PBS載體中的克隆1或克隆2抗體。在給動物注射各自數(shù)目的從對數(shù)生長期的培養(yǎng)物新鮮制備的活腫瘤細(xì)胞(見上)前10、17和32天，進(jìn)行這些注射。在剪毛的左側(cè)皮膚施用腫瘤攻擊注射。通過皮下途徑，在100μl體積中，使用26-號、5/8-英寸皮下斜角皮下注射針(BD Medical Systems，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)完成送遞所有攻擊和攻擊前(pre-challenge)注射。
對于腫瘤測量和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，皮下送遞腫瘤攻擊細(xì)胞后10、13、17、23和26天，用數(shù)字測徑器(Mitutoyo America Corp.，Aurora，IL)測量在腫瘤-攻擊的小鼠的左側(cè)皮膚下生長的腫瘤。在3個大致垂直的軸上，收集以毫米為單位的腫瘤測量值，代表腫瘤長度(L)、寬度(W)和距離周圍身體輪廓的高度(H)。使用式體積＝[(4/3)·π·(L/2)·(W/2)·(H/2)]，計(jì)算腫瘤體積。使用Microsoft Excel軟件，確定平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)和斯氏t檢驗(yàn)概率(p)值。
如圖20所示，用接種疫苗送遞抗-TIM-1抗體，會引起完全的腫瘤排斥。在腫瘤攻擊前10、17和32天，給小鼠注射標(biāo)示的材料。以每次注射106細(xì)胞，送遞γ-照射的(20,000拉德)EL4腫瘤細(xì)胞。以每次注射100mcg，送遞抗-TIM-1抗體。通過皮下送遞100μl體積到C57BL/6雌性小鼠的剪毛的右側(cè)皮膚，完成所有注射。在第0天，在100μl體積的PBS中送遞，皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞到剪毛的左側(cè)皮膚攻擊小鼠。顯示了攻擊后第26天的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果表明，用接種疫苗送遞抗-TIM-1抗體，會引起完全的腫瘤排斥。
如圖21所示，在用活腫瘤細(xì)胞攻擊后，補(bǔ)加了抗-TIM-1抗體的疫苗會極大地抑制腫瘤生長。在用標(biāo)示的材料進(jìn)行腫瘤攻擊前10、17和32天，注射小鼠。以每次注射106細(xì)胞，送遞γ-照射的(20,000拉德)EL4腫瘤細(xì)胞。以每次注射100mcg，送遞抗-TIM-1抗體。通過皮下送遞100μl體積到C57BL/6雌性小鼠的剪毛的右側(cè)皮膚，完成所有注射。在第0天，在100μl體積的PBS中送遞，皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞到剪毛的左側(cè)皮膚攻擊小鼠。經(jīng)26天后，測量腫瘤體積，并使用不配對的、雙尾斯氏t檢驗(yàn)(unpaired，two-tailedStudent’s t test)計(jì)算，確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。這些結(jié)果表明，在用活腫瘤細(xì)胞攻擊后，補(bǔ)加了抗-TIM-1抗體的疫苗會極大地抑制腫瘤生長。
如圖22所示，在用活腫瘤細(xì)胞攻擊后，補(bǔ)加了抗-TIM-1抗體的疫苗會極大地抑制腫瘤生長。在用標(biāo)示的材料進(jìn)行腫瘤攻擊前10、17和32天，注射小鼠。以每次注射106細(xì)胞，送遞γ-照射的(20,000拉德)EL4腫瘤細(xì)胞。以每次注射100mcg，送遞抗-TIM-1抗體。通過皮下送遞100μl體積到C57BL/6雌性小鼠的剪毛的右側(cè)皮膚，完成所有注射。在第0天，在100μl體積的PBS中送遞，皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞到剪毛的左側(cè)皮膚攻擊小鼠。26天后，測量腫瘤體積，并使用不配對的、雙尾斯氏t檢驗(yàn)計(jì)算，確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。顯示了攻擊后第26天的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果表明，在用活腫瘤細(xì)胞攻擊后，補(bǔ)加了抗-TIM-1抗體的疫苗會極大地抑制腫瘤生長。
如圖23所示，在活腫瘤細(xì)胞攻擊前，用抗-TIM-1抗體預(yù)處理動物，會顯著抑制腫瘤生長。在腫瘤攻擊前10、17和32天，注射小鼠，每次注射100mcg抗-TIM-1抗體。通過皮下送遞100μl體積到C57BL/6雌性小鼠的剪毛的右側(cè)皮膚，完成所有注射。在第0天，在100μl體積的PBS中送遞，皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞到剪毛的左側(cè)皮膚攻擊小鼠。經(jīng)26天后，測量腫瘤體積，并使用不配對的、雙尾斯氏t檢驗(yàn)計(jì)算，確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。這些結(jié)果表明，在活腫瘤細(xì)胞攻擊前，用抗-TIM-1抗體預(yù)處理動物，會顯著抑制腫瘤生長。
如圖24所示，在活腫瘤細(xì)胞攻擊前，用抗-TIM-1抗體預(yù)處理動物，會顯著限制腫瘤生長。在腫瘤攻擊前10、17和32天，給小鼠注射100mcg抗-TIM-1抗體。以每次注射106細(xì)胞，送遞γ-照射的(20,000拉德)EL4腫瘤細(xì)胞。通過皮下送遞100μl體積到C57BL/6雌性小鼠的剪毛的右側(cè)皮膚，完成所有注射。在第0天，在100μl體積的PBS中送遞，皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞到剪毛的左側(cè)皮膚攻擊小鼠。26天后，測量腫瘤體積，并使用不配對的、雙尾斯氏t檢驗(yàn)計(jì)算，確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。顯示了攻擊后第26天的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果表明，在活腫瘤細(xì)胞攻擊前，用抗-TIM-1抗體預(yù)處理動物，會顯著限制腫瘤生長。
如圖25所示，抗-TIM-1會增強(qiáng)腫瘤疫苗有效性。C57BL/6小鼠接受通過皮下注射送遞的含有106γ-照射的(20,000拉德)EL4腫瘤細(xì)胞的初次接種疫苗。同時，腹膜內(nèi)地送遞100μl磷酸緩沖鹽水(PBS)載體對照或溶于100μl PBS載體中的100mcg抗-TIM-1抗體或100mcg rIgG2b同種型對照抗體。初次接種疫苗后3周，小鼠接受用相同制劑的首次加強(qiáng)。2周后，進(jìn)行第二次相同加強(qiáng)。第二次加強(qiáng)后11天，通過皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞，送遞到接種疫苗和加強(qiáng)給藥的對側(cè)位點(diǎn)，來攻擊小鼠。在所有情況下，在攻擊后10天，接受活腫瘤細(xì)胞的小鼠發(fā)展了可測量的腫瘤塊。在活腫瘤細(xì)胞攻擊后19天期間，使用數(shù)字測徑器在幾個點(diǎn)測量腫瘤直徑。在每個時間點(diǎn)，記錄每個腫瘤的3個大致垂直的軸的直徑長度(L)、寬度(W)和高度(H)。使用式體積(V)＝(4/3)·π·(L/2)·(W/2)·(H/2)，計(jì)算腫瘤體積。使用Microsoft Excel，計(jì)算治療組平均腫瘤體積。通過斯氏t檢驗(yàn)確定P值，其使用Microsoft Excel計(jì)算?？?TIM-1單克隆抗體購自R&D Systems Inc.(Minneapolis MN)(mAb AF1817)。這些結(jié)果表明，抗-TIM-1會增強(qiáng)腫瘤疫苗有效性。
如圖26所示，接種抗-TIM-1佐劑會驅(qū)動保護(hù)性免疫的產(chǎn)生。通過皮下注射送遞，給首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠接種單獨(dú)溶于100μl磷酸緩沖鹽水(PBS)中的106γ-照射的(20,000拉德)EL4腫瘤細(xì)胞，或與溶于100μl PBS中的100mcg抗-TIM-1抗體或100mcgrIgG2a同種型對照抗體的混合物。15天后，使用相同的方法進(jìn)行加強(qiáng)。在第一次之后7天，通過相同方法進(jìn)行第二次加強(qiáng)。該第二次加強(qiáng)后10天，用皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞，送遞到接種疫苗和加強(qiáng)給藥的對側(cè)位點(diǎn)，來攻擊小鼠。在用活腫瘤細(xì)胞攻擊后31天，從排斥EL4腫瘤攻擊的小鼠回收脾細(xì)胞。類似地，還從rIgG2a對照組小鼠和年齡匹配的首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠，回收脾細(xì)胞。體外紅細(xì)胞去除后，通過尾靜脈注射，將來自抗-TIM-1、rIgG2a或首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠的107脾細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移進(jìn)首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6受體動物。轉(zhuǎn)移后1天，通過皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞攻擊受體小鼠。過繼性轉(zhuǎn)移后18天，評價小鼠在以前的皮下活腫瘤攻擊位點(diǎn)的皮膚下是否存在可觸知的腫瘤塊。將沒有呈現(xiàn)可檢測的腫瘤塊的動物視作沒有腫瘤，并表示為接受相同的過繼性轉(zhuǎn)移處理的全部動物的百分比。這些結(jié)果表明，過繼性轉(zhuǎn)移會誘導(dǎo)腫瘤排斥。
如圖27所示，抗-TIM-1治療會減緩腫瘤生長。通過皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞，來攻擊首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠，然后在6天后，用腹膜內(nèi)注射一次100mcg抗-TIM-1抗體，或100mcgrIgG2a對照抗體，進(jìn)行處理。送遞抗-TIM-1或?qū)φ湛贵w處理后15天，測量各動物腫瘤。為每個腫瘤的3個大致垂直的軸，記錄腫瘤直徑長度(L)、寬度(W)和高度(H)。使用式體積(V)＝(4/3)·π·(L/2)·(W/2)·(H/2)，計(jì)算腫瘤體積。使用MicrosoftExcel軟件，計(jì)算組平均腫瘤體積和每個計(jì)算的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。通過斯氏t檢驗(yàn)確定P值，其使用Microsoft Excel計(jì)算。這些結(jié)果表明，抗-TIM-1治療會減緩腫瘤生長。
已經(jīng)證實(shí)，抗-TIM-1和TIM-4/Fc二者都能增強(qiáng)Th1免疫(見實(shí)施例XIV)。因此，TIM-4/Fc能起腫瘤疫苗佐劑和治療腫瘤的治療劑的作用，如實(shí)施例XII所示的實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)的。
實(shí)施例XIII作為癌癥疫苗的佐劑且作為治療腫瘤的治療劑的TIM-3/Fc和抗-TIM-3本實(shí)施例描述了TIM-3/Fc和抗-TIM-3對于癌癥疫苗和腫瘤的治療性治療的佐劑活性。
如圖28所示，當(dāng)用作疫苗佐劑時，TIM-3-特異性的抗體會減少腫瘤生長。首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠接受用單獨(dú)溶于100μl磷酸緩沖鹽水(PBS)載體中的106γ-照射的(20,000拉德)EL4腫瘤細(xì)胞，或與溶于PBS中的100mcg抗-TIM-3抗體或100mcg rIgG2a同種型對照抗體的混合物的初次接種。初次接種后2周，小鼠接受與初次接種相同的加強(qiáng)注射。該加強(qiáng)后10天，通過皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞，送遞到接種疫苗和加強(qiáng)給藥的對側(cè)位點(diǎn)，來攻擊小鼠。在所有情況下，在攻擊后10天，接受活腫瘤細(xì)胞的小鼠發(fā)展了可測量的腫瘤塊。在腫瘤攻擊后36天期間，使用數(shù)字測徑器測量腫瘤直徑。在幾個時間點(diǎn)，記錄每個腫瘤的3個大致垂直的軸的腫瘤直徑長度(L)、寬度(W)和高度(H)。使用式體積(V)＝(4/3)·π·(L/2)·(W/2)·(H/2)，計(jì)算腫瘤體積。使用MicrosoftExcel，計(jì)算治療組平均腫瘤體積。這些結(jié)果表明，在有抗-TIM-3存在下，腫瘤接種疫苗會抑制腫瘤生長。
如圖29所示，抗-TIM-3治療會限制腫瘤生長。通過皮下注射106活EL4腫瘤細(xì)胞，來攻擊首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠，然后在9天后，通過腹膜內(nèi)注射一次100mcg抗-TIM-3抗體或100mcgrIgG2a同種型對照抗體，進(jìn)行處理。在用抗-TIM-3或?qū)φ湛贵w處理后的幾個時間點(diǎn)，使用數(shù)字測徑器，在治療時測量各動物腫瘤。記錄每個腫瘤的3個大致垂直的軸的腫瘤直徑長度(L)、寬度(W)和高度(H)。使用式體積(V)＝(4/3)·π·(L/2)·(W/2)·(H/2)，計(jì)算腫瘤體積。使用Microsoft Excel，計(jì)算治療組平均值和每個計(jì)算平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。通過雙向(two-way)ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定P值，其使用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software；San Diego CA)計(jì)算。這些結(jié)果表明，抗-TIM-3治療會限制腫瘤生長。
已經(jīng)證實(shí)，抗-TIM-3和TIM-3/Fc二者都能增強(qiáng)Th1免疫，并加劇Th1疾病模型中的疾病(Monney等，Nature 415536-541(2002)；Sabatos等，Nature Immunol.41102-1110(2003))。因此，TIM-3/Fc能起腫瘤疫苗佐劑和治療腫瘤的治療劑的作用，如圖28和29所示的實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)的。
實(shí)施例XIV抗-TIM-1和TIM-4/Fc都會刺激對小鼠中Th1驅(qū)動的免疫反應(yīng)的免疫反應(yīng)用100mcg在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化的PLP139-151肽，免疫6-8周齡的雌性SJL/J小鼠(Jackson Laboratories)的右側(cè)和左側(cè)，以刺激針對該肽的Th1免疫反應(yīng)。注射溶于CFA中的PLP139-151后，靜脈內(nèi)地(i.v.)(尾靜脈)注射100ng百日咳毒素。48小時后，施用100ng百日咳毒素的第二次給藥。用PLP免疫接種后，腹膜內(nèi)地(i.p.)施用IgG2a同種型對照抗體(100mcg/小鼠)、TIM-1單克隆抗體(100mcg)或TIM-4/Fc。監(jiān)控動物對抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的發(fā)展。結(jié)果表明，TIM-1抗體和TIM-4/Fc都會刺激針對PLP肽的免疫反應(yīng)，如通過測量再次暴露于PLP肽引起的T細(xì)胞增殖和通過IL-4和IFN-γ細(xì)胞因子ELISA所監(jiān)控到的。
這些結(jié)果表明，TIM靶向分子，例如抗-TIM-1抗體，可以用于抑制腫瘤生長。
實(shí)施例XV表達(dá)TIM-1和TIM-3以及TIM配體的小鼠和人腫瘤細(xì)胞系通過熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)分析，分析了小鼠和人腫瘤細(xì)胞系的TIM-1和TIM-3表達(dá)。在有對照、TIM-1或TIM-3單克隆抗體存在下，溫育培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系，并通過使用熒光標(biāo)記直接綴合TIM抗體或通過使用熒光標(biāo)記的第二抗體，檢測TIM-特異性的抗體的結(jié)合。在人腎腺癌細(xì)胞系769-P(圖33)以及人肝細(xì)胞癌HepG2上，檢測到TIM-1表達(dá)。還在小鼠腎腺癌RAG上檢測到TIM-1表達(dá)。在幾種不同的腫瘤，包括胸腺瘤和淋巴瘤上，檢測到TIM-3表達(dá)，如圖35所示，并總結(jié)在圖36中。使用TIM-3/Fc，還分析了腫瘤細(xì)胞系上的TIM-3配體的表達(dá)。如圖36所總結(jié)的，鑒定了表達(dá)TIM-3配體(TIM-3L)的各種腫瘤，包括胸腺瘤、淋巴瘤和肥大細(xì)胞瘤。
貫穿本申請中，已經(jīng)參考了各種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容，在本申請中整體引作參考，以更完整地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。盡管已經(jīng)參考上面提供的實(shí)施例描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，可以進(jìn)行各種修改，而不脫離本發(fā)明的精神。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶細(xì)胞去除性的。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶細(xì)胞去除性的。
7.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原選自病毒、細(xì)菌、寄生物和腫瘤相關(guān)抗原。
9.一種組合物，其包含綴合到治療或診斷部分上的TIM靶向分子。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述治療部分選自化療劑、細(xì)胞毒性的試劑和毒素。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述細(xì)胞毒性的試劑是放射性核素或化合物。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述化合物選自加利車霉素、esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法侖、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶、長春地辛、順鉑、依托泊苷、博來霉素、絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶。
13.權(quán)利要求11的組合物，其中所述放射性核素是碘-131或釔-90。
14.權(quán)利要求10的組合物，其中所述毒素是植物或細(xì)菌毒素。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述植物毒素選自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素和gelonin。
16.權(quán)利要求14的組合物，其中所述細(xì)菌毒素選自假單胞菌外毒素和白喉毒素。
17.權(quán)利要求9的組合物，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
19.權(quán)利要求9的組合物，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶細(xì)胞去除性的。
21.權(quán)利要求19的組合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶細(xì)胞去除性的。
22.權(quán)利要求19的組合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
23.刺激個體中的免疫反應(yīng)的方法，其包含施用一種組合物，所述組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
28.權(quán)利要求23的方法，其中所述抗原選自病毒、細(xì)菌、寄生物和腫瘤相關(guān)抗原。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗原是肽。
30.預(yù)防性治療疾病的方法，其包含給個體施用組合物，所述組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所述疾病是傳染病。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述抗原選自病毒、細(xì)菌和寄生物抗原。
37.權(quán)利要求30的方法，其中所述疾病是癌癥。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述抗原是腫瘤相關(guān)抗原。
39.改善與疾病有關(guān)的病征或癥狀的方法，其包含給個體施用組合物，所述組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
44.權(quán)利要求39的方法，其中所述疾病是傳染病。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述抗原選自病毒、細(xì)菌和寄生物抗原。
46.權(quán)利要求39的方法，其中所述疾病是癌癥。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述抗原是腫瘤相關(guān)抗原。
48.靶向腫瘤的方法，其包含給受試者施用TIM靶向分子，其中所述腫瘤表達(dá)TIM或TIM配體。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述的TIM靶向分子與抗原一起施用。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述抗原是腫瘤相關(guān)抗原。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
53.權(quán)利要求48的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶細(xì)胞去除性的。
55.權(quán)利要求53的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶細(xì)胞去除性的。
56.權(quán)利要求53的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
57.權(quán)利要求48的方法，其中所述腫瘤選自癌、肉瘤和淋巴瘤。
58.權(quán)利要求48的方法，其中所述的TIM靶向分子綴合到治療部分上。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述治療部分選自化療劑、細(xì)胞毒性的試劑和毒素。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述細(xì)胞毒性的試劑是放射性核素或化合物。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述化合物選自加利車霉素、esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法侖、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶、長春地辛、順鉑、依托泊苷、博來霉素、絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶。
62.權(quán)利要求60的方法，其中所述放射性核素是碘-131或釔-90。
63.權(quán)利要求59的方法，其中所述毒素是植物或細(xì)菌毒素。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述植物毒素選自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素和gelonin。
65.權(quán)利要求63的方法，其中所述細(xì)菌毒素選自假單胞菌外毒素和白喉毒素。
66.權(quán)利要求58的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
68.權(quán)利要求58的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶細(xì)胞去除性的。
70.權(quán)利要求68的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶細(xì)胞去除性的。
71.權(quán)利要求68的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
72.抑制腫瘤生長的方法，其包含給受試者施用TIM靶向分子，其中所述腫瘤表達(dá)TIM或TIM配體。
73.權(quán)利要求72的方法，其中所述的TIM靶向分子與抗原一起施用。
74.權(quán)利要求72的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
76.權(quán)利要求72的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶細(xì)胞去除性的。
78.權(quán)利要求76的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶細(xì)胞去除性的。
79.權(quán)利要求76的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
80.權(quán)利要求72的方法，其中所述腫瘤選自癌、肉瘤和淋巴瘤。
81.權(quán)利要求72的方法，其中所述的TIM靶向分子綴合到治療部分上。
82.權(quán)利要求81的方法，其中所述治療部分選自化療劑、細(xì)胞毒性的試劑和毒素。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述細(xì)胞毒性的試劑是放射性核素或化合物。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述化合物選自加利車霉素、esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法侖、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶、長春地辛、順鉑、依托泊苷、博來霉素、絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶。
85.權(quán)利要求83的方法，其中所述放射性核素是碘-131或釔-90。
86.權(quán)利要求82的方法，其中所述毒素是植物或細(xì)菌毒素。
87.權(quán)利要求86的方法，其中所述植物毒素選自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素和gelonin。
88.權(quán)利要求86的方法，其中所述細(xì)菌毒素選自假單胞菌外毒素和白喉毒素。
89.權(quán)利要求81的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
90.權(quán)利要求89的方法，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
91.權(quán)利要求81的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶細(xì)胞去除性的。
93.權(quán)利要求91的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶細(xì)胞去除性的。
94.權(quán)利要求91的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
95.檢測腫瘤的方法，其包含給受試者施用綴合到診斷部分上的TIM靶向分子，其中所述腫瘤表達(dá)TIM或TIM配體。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
97.權(quán)利要求96的方法，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
98.權(quán)利要求95的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
100.改善與自身免疫病有關(guān)的病征或癥狀的方法，其包含給受試者施用TIM靶向分子。
101.權(quán)利要求100的方法，其中所述的自身免疫病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、自身免疫性糖尿病、全身性紅斑狼瘡和自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(ALPS)。
102.權(quán)利要求100的方法，其中所述的TIM靶向分子與抗原一起施用。
103.權(quán)利要求100的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
104.權(quán)利要求103的方法，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
105.權(quán)利要求100的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
106.權(quán)利要求105的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶細(xì)胞去除性的。
107.權(quán)利要求105的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶細(xì)胞去除性的。
108.權(quán)利要求105的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
109.權(quán)利要求100的方法，其中所述的TIM靶向分子綴合到治療部分上。
110.權(quán)利要求109的方法，其中所述治療部分選自化療劑、細(xì)胞毒性的試劑和毒素。
111.權(quán)利要求110的方法，其中所述細(xì)胞毒性的試劑是放射性核素或化合物。
112.權(quán)利要求111的方法，其中所述化合物選自加利車霉素、esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法侖、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶、長春地辛、順鉑、依托泊苷、博來霉素、絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶。
113.權(quán)利要求111的方法，其中所述放射性核素是碘-131或釔-90。
114.權(quán)利要求110的方法，其中所述毒素是植物或細(xì)菌毒素。
115.權(quán)利要求114的方法，其中所述植物毒素選自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素和gelonin。
116.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)菌毒素選自假單胞菌外毒素和白喉毒素。
117.權(quán)利要求109的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗體。
118.權(quán)利要求117的方法，其中所述的TIM抗體對選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特異性的。
119.權(quán)利要求109的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。
120.權(quán)利要求119的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶細(xì)胞去除性的。
121.權(quán)利要求119的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分非靶細(xì)胞去除性的。
122.權(quán)利要求119的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有抗原和TIM靶向分子的組合物。本發(fā)明另外提供了TIM靶向分子綴合物，例如，靶向治療或診斷部分的TIM靶向分子。本發(fā)明另外提供了使用這樣的組合物的方法。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用組合物刺激個體中的免疫反應(yīng)的方法，所述組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的抗原和TIM靶向分子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過施用抗原和TIM靶向分子刺激個體中的免疫反應(yīng)的方法，所述抗原和TIM靶向分子可以在單一組合物中一起施用，或分開施用。
文檔編號A61K39/40GK101035561SQ200580016599
公開日2007年9月12日 申請日期2005年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者W·索霍, E·R·詹森, T·莫爾, D·J·卡洛, B·K·赫爾米奇, S·葉, J·塔特 申請人:特羅斯藥品公司