專利名稱：通過光化學內(nèi)化(pci)將綴合帶正電肽的pna分子導入胞質(zhì)溶膠和/或細胞核的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種使用光敏劑并用可有效激活該光敏劑的波長的光照射細胞，將與帶正電肽相綴合的肽核酸分子(PNA)導入細胞中、優(yōu)選導入胞質(zhì)溶膠和/或細胞核中的方法，還涉及這種方法用于評估或改變基因活性的用途，例如反義或反基因(antigene)策略和下游應用如用于篩選下游調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物作用的高通量系統(tǒng)。
背景技術：
PNA是合成DNA類似物，其中DNA骨架中發(fā)現(xiàn)的正常磷酸二酯鍵被替換為2-氨乙基-甘氨酸連接。核苷酸堿基通過甲基羰基連接子連接至骨架的不帶電重復單元上。
由于這種連接，PNA是不帶電的。它們也是化學穩(wěn)定的并抗水解切割，與天然核酸相比以更高親合力與互補性核酸鏈(DNA或RNA)結合。
盡管PNA與互補DNA和RNA鏈的雜交遵守沃森-克里克氫鍵作用，但它有可能形成平行和反平行雙鏈。而且，其雜交復合物表現(xiàn)優(yōu)異的熱穩(wěn)定性并顯示獨特的離子強度性質(zhì)?？紤]到這些優(yōu)點以及PNA抗核酸酶和蛋白酶的事實，PNA已經(jīng)用于體外反義(干擾mRNA翻譯)或反基因(干擾基因復制或轉錄)應用中。PNA-RNA雙鏈不是RNase H的底物，因此可能基于立體封閉RNA翻譯或加工而誘導反義作用。PNA與DNA的結合產(chǎn)生了三鏈體，其可阻礙復制或轉錄，產(chǎn)生反基因作用。尚未觀察到PNA有任何一般毒性的跡象。
因此，通過與靶核酸分子結合，PNA對復制、轉錄和翻譯過程具有顯著作用。用于反基因或反叉應用的PNA已經(jīng)顯示可阻礙DNA和RNA聚合酶、逆轉錄酶、端粒酶和核糖體的活性。
為了成功介導這些作用，PNA分子有必要進入細胞，并且對于多數(shù)應用而言，有必要進入含一些RNA和除線粒體DNA以外的所有DNA的細胞核。然而，細胞和核攝入非常緩慢，并且不是自發(fā)發(fā)生的。因此，在將其開發(fā)為治療藥物或治療可具有任何實際前景之前，或者為了廣泛應用，改進PNA的細胞和核攝入是不得不克服的主要挑戰(zhàn)。
將PNA遞送入細胞的一種途徑是使用微注射(綜述見Ray andNorden，(2000)，F(xiàn)ASEB J.14，1041-1060)。然而微注射是費力且耗時的。而且必須單個注射每個細胞，因此這最適合細胞數(shù)少的情況而不適用于很多體內(nèi)應用。細胞損傷也是一個問題。
遞送也已經(jīng)通過電穿孔實現(xiàn)(Shammas et al.，(1999)，Oncogene18，6191-6200)，它有一些缺點，例如不適于體內(nèi)應用。
已經(jīng)試驗了膜破壞性方法，如用鏈球菌溶血素O(streptolysin O)暫時透化(Faruqi et al.(1997)，P.N.A.S.USA95，1398-1403)、用lysolectin(Boffa et al.(1996)，J.Biol.Chem271，13228-13233)或去污劑如Tween(Norton et al.(1996)，Nat.Biotech14，625-620)透化細胞膜。這些方法也不適用于體內(nèi)使用并可能引起細胞破壞。
即使有可能迫使PNA分子進入細胞，核攝入也可能不發(fā)生。體外已經(jīng)迫使PNA以高濃度攝入細胞，然而要實現(xiàn)這需要非常高的濃度(10-20μM)(Folini et al.(2003)，Cancer Research63，3490-3494)。因此可以看到需要將PNA施加到細胞的改進方法。
當以復合物形式與陽離子脂質(zhì)一起施用時也已經(jīng)顯示PNA的體外細胞遞送。在這種特定技術中，連接至功能肽的PNA分子與重疊的寡核苷酸雜交并且復合物與陽離子脂質(zhì)混合。然后陽離子脂質(zhì)-DNA-PNA復合物被內(nèi)化，PNA作為被動載荷被帶入(Hamilton et al.(1999)，Chem.Biol.6，343-351)。
PNA缺乏與陽離子脂質(zhì)體通過靜電相互作用而凝縮和復合必需的多陰離子電荷。然而，PNA-DNA雜合體具有由DNA貢獻的分散負電荷。從PNA-DNA雜合體與陽離子脂質(zhì)的相互作用可以形成凝縮顆粒，這些脂質(zhì)復合物(lipoplex)被迅速摻入培養(yǎng)哺乳動物細胞中(Borgatti et al.(2003)，Oncol.Res.13(5)，279-287；Borgatti et al.(2002)，Biochem.Pharmacol.64(4)，609-616；Nastruzzi et al.(2000)，J.Control Release68(2)，237-249)。也可以通過共價連接至脂質(zhì)將PNA轉入細胞(Muratovska et al.(2001)，Nucleic Acids Res.29(9)，1852-1863；Ljungstrom et al.(1999)，Bioconjug.Chem.10(6)，965-972；Filipovska et al.(2004)，F(xiàn)EBS Lett.556(1-3)，180-186)。
也已經(jīng)嘗試制備肽-PNA構建體，它們可以被細胞以更高效方式攝入。Branden和Smith(2002，Methods in Enzymology346，106-124)使用所謂的Bioplex系統(tǒng)，其中PNA被用于將功能肽連接至DNA以增加DNA的遞送。也可以加入聚乙烯亞胺(PEI)來提高核酸凝縮。
本系統(tǒng)目的是將核酸提供至細胞和利用PNA作為將待遞送DNA連接至肽的工具，其被設計為提高DNA遞送。
已知某些肽可介導分子跨細胞膜遞送。也嘗試了將PNA綴合至這些細胞運輸肽或細胞侵入性肽，以試圖提高PNA進入細胞的能力。已經(jīng)設計了多種不同的運輸肽，目標是將PNA運輸入細胞中。
設計作為抗端粒酶藥劑的PNA已經(jīng)被綴合至HIV-tat內(nèi)化肽(SEQID NO1RKKRRQRRR)和綴合至觸角足細胞侵入性肽(Antennapedia cellpenetrating peptide)(SEQ ID NO2RQIKIWFQNRRMKWKK)，并顯示具有作為反義分子的適當作用，可降低端粒酶活性。然而這些試驗僅顯示端粒酶活性的中度降低；48小時后綴合Tat的PNA僅將端粒酶活性降低至對照水平的73％，綴合觸角足的PNA僅在＞30μM的非常高濃度實現(xiàn)了50％抑制(Folini et al.，2003，同上)。
已經(jīng)描述了能介導PNA運輸至細胞核的肽。已經(jīng)表明，新合成的核蛋白需要特定氨基酸序列以到達核并跨過核膜。當這些核定位信號存在于并非內(nèi)源性存在于核內(nèi)的蛋白質(zhì)中時，也可以指導這些蛋白質(zhì)進入核。
也已經(jīng)將PNA綴合至核定位信號(NLS)(SEQ ID NO3PKKKRKV)上，以試圖指導PNA至細胞核。已經(jīng)表明該NLS介導SV40大T抗原跨核膜的轉移。當將10μM的PNA-NLS施用給細胞時，24小時后顯示其存在于核中。已顯示這種效果不依賴于PNA序列，而是高度依賴于NLS序列；綴合至PNA的混雜NLS序列(SEQ ID NO4KKVKPKR)僅顯示最小量的PNA在核中(Cutrona et al.，(2000)，Nature Biotechnology18，300-303)。這些結果與功能測試平行，在所述功能測試中顯示了PNA-NLS(wt)(其中PNA是myc的反基因)抑制細胞生長，而綴合至混雜NLS序列的PNA具有與對照PNA作用明顯更相似的作用。
Branden et al.(1999，Nature Niotechnology17，784-787)相似地表明，盡管將PNA綴合至肽能增加PNA以NLS序列依賴方式的核運輸，但在NLS序列倒置時不能看到核定位。
進一步的研究也提示，為了將PNA成功運輸至核，有必要將細胞膜運輸肽和NLS都綴合至PNA分子(Braun et al.(2002)，J.Mol.Biol.318，237-243)。細胞膜運輸肽被認為將PNA輸入，而NLS被認為隨后進一步將PNA帶入核。在這些試驗中，NLS顯示對核運輸是關鍵的，因為包含僅具有肽序列賴氨酸-賴氨酸的細胞侵入性肽的構建體保持在胞質(zhì)溶膠中。
Richard等人(J.Biol.Chem.，(2003)，278(1)，585-590)已經(jīng)證明，即使在溫和固定條件下固定細胞也能在這些試驗中引起假象，甚至在溫和固定條件下核中缺少PNA時也看到核染色，這些事實使得對上述結果的解釋更為復雜化。
因此，盡管已經(jīng)顯示在某些條件下，PNA或綴合至細胞侵入性肽的PNA可以進入細胞，或者如最近顯示進入內(nèi)體(Richard et al.，2003，同上)，但在多數(shù)情況下，對于待介導的PNA的生物作用而言，PNA有必要轉位至細胞核。
可以看到，仍然需要可靠和可重復的方法施用PNA分子，使得可實現(xiàn)細胞的攝入，如攝入胞質(zhì)溶膠，優(yōu)選攝入細胞核，而無需應用高濃度PNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人令人驚奇地顯示，與帶正電肽綴合的PNA分子可以被細胞內(nèi)吞，并且在用光化學內(nèi)化技術(PCI)從內(nèi)體釋放時，這些分子被輸送至細胞核。
因此，在本發(fā)明第一方面，提供將PNA分子導入胞質(zhì)溶膠、優(yōu)選導入細胞核的方法，包含使所述細胞與PNA分子和光敏劑接觸，并用具有可有效激活光敏劑的波長的光照射細胞，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽。
PCI是一種技術，其使用光敏劑，并組合激活該光敏劑的照射步驟，實現(xiàn)向細胞共施用的分子的內(nèi)化。這種技術允許在照射以后，被細胞攝入細胞器如內(nèi)體的分子從這些細胞器釋放入胞質(zhì)溶膠。
光化學內(nèi)化(PCI)的基本方法描述于WO96/07432和WO00/54802，其被引入本文作為參考。如上所述，使待內(nèi)化的分子(根據(jù)本發(fā)明的應用其將是PNA-肽綴合物)和光敏劑與細胞接觸。光敏劑和待內(nèi)化分子被攝入細胞內(nèi)的具有膜邊界的亞區(qū)室。細胞暴露于適當波長的光時，光敏劑被激活，這直接或間接生成破壞細胞內(nèi)區(qū)室膜的毒性物質(zhì)。這就使得內(nèi)化分子被釋放進入胞質(zhì)溶膠。
這些方法使用光化學作用作為將膜不滲透性分子以一定方式導入細胞的胞質(zhì)溶膠的機制，如果適當調(diào)節(jié)該方法以避免過量產(chǎn)生毒性物質(zhì)，例如通過降低光照時間或光敏劑劑量，這種方式不會導致廣泛的細胞破壞。
特別令人驚奇的是，當使用PCI方法將PNA釋放入細胞時，既不需要特異性細胞侵入性序列也不需要NLS序列即可使PNA進入細胞并隨后轉位至細胞核。只需要將PNA分子綴合至具有至少單凈正電荷的肽。
因此，不希望受理論約束，似乎在使用PCI時，帶正電的肽的存在可以促進PNA分子攝入細胞、攝入細胞區(qū)室室如內(nèi)體區(qū)室室，另外在PNA分子釋放或內(nèi)化入胞質(zhì)溶膠以后，帶電荷的肽還介導PNA分子向細胞核的靶向。作為此結果，為了使PNA分子靶向期望位置，只需要對其進行最小程度的修飾，而不必要將長氨基酸序列或多種氨基酸序列綴合至PNA分子。
還令人驚奇的是，為實現(xiàn)這兩種作用，即指導PNA分子攝入細胞以及當PNA-肽分子已經(jīng)釋放或內(nèi)化入胞質(zhì)溶膠時促進其轉入細胞核，只需要單個肽。
已經(jīng)對核定位信號進行了一些詳細研究，已經(jīng)表明，為實現(xiàn)高效核靶向，需要存在某些氨基酸共有序列。具體地說，已經(jīng)鑒定輸入蛋白(importin)途徑可作為將分子導入核中的手段?！敖?jīng)典的”、富含精氨酸/賴氨酸的NLS，如SV40大T抗原序列，可以與輸入蛋白α+β相互作用。所述復合物通過核孔復合體的中央通道被轉位并在核中解離。結合和解離步驟是能量依賴的機制(綜述見Cartier et al.(2002)，Gene Therapy9，157-167)。據(jù)信還存在核輸入的其他途徑，盡管它們尚未如此良好表征。
因此，令人驚奇的是，當使用本發(fā)明的PCI方法時，不僅不需要經(jīng)典NLS序列，而且任何具有一或多個凈正電荷的序列均能介導核定位。這由以下事實得到證明，即序列SEQ ID NO5GHHHHHG與SEQ IDNO3PKKKRKV有同樣功能，而且僅具有單個正電荷的三肽(SEQ ID NO6AKL)有能力指導PNA首先進入內(nèi)體，并隨后進入核(見實施例)。
還令人驚奇地觀察到，原來通過其將蛋白質(zhì)靶向細胞器如過氧化物酶體和線粒體的能力而被鑒定的序列，當與PNA分子綴合時，也能指導PNA分子首先進入內(nèi)體，并隨后進入核(見實施例)。
本發(fā)明方法中PCI的確切作用未知，但很明確其對該方法的成功是關鍵的，因為沒有PCI，攜帶正電荷肽的PNA分子將不以任何顯著程度進入胞質(zhì)溶膠或核。
該作用似乎還不依賴于綴合肽的總長度，長3個氨基酸的帶正電肽與29個氨基酸的肽同樣發(fā)揮功能。該作用也不依賴于帶正電肽的電荷/長度比，還不依賴于序列中所包括的具體帶電氨基酸。
如本文所稱，“PNA”表示起DNA類似物作用并基于假肽骨架的肽核酸分子，其中核苷酸堿基連接至假肽骨架上。PNA可以是自由的線性形式或者可以是雙鏈或自連接形式，如雙-PNA(bis-PNA)。
標準形式PNA的衍生物也包括在內(nèi)，例如構成聚合物的一或多個假肽單體可以被修飾或衍生化，以便例如提供改變的性質(zhì)，例如通過使用賴氨酸或其他氨基酸類似物達到這樣的目的。與之相似，如果需要，可以修飾一或多個所用堿基，例如通過使用非天然變體。因此PNA包括標準形式的衍生物，只要這些衍生物保持相關的功能特性，即能與DNA和/或RNA形成序列依賴性復合物。換句話說，在電荷和結構方面，該PNA衍生物是適當?shù)模軌蛟试S與DNA或RNA序列互補。
PNA分子可以是任何序列或長度。優(yōu)選PNA分子長度小于25，例如小于20個堿基。優(yōu)選PNA分子長度超過6個堿基。例如可以使用6-20個堿基的分子。長12-17個單元的PNA寡聚物是最適的。序列長度主要取決于所用方法需要的特異性。需要超過25個堿基的DNA應用常規(guī)可用短得多的PNA探針進行。根據(jù)序列，長PNA寡聚物趨向于聚集并且難以純化和表征。然而，序列越短，就越特異。因此，錯配對短序列的影響更大。然而，具有20個單元的PNA寡聚物已經(jīng)被使用而沒有任何聚集問題。
這些分子，其化學性質(zhì)和合成方法在本領域是公知的(Ray andNorden，2000，同上)并且它們可以用任何方便的方法制備。
PNA分子可以是反義PNA分子或與基因互補的PNA分子(反基因分子)，其可以形成特征性三體結構。PNA分子也可以是探針，即它可以結合至靶核酸序列并可以方便地攜帶標記。
本發(fā)明方法實現(xiàn)了PNA-肽綴合物向胞質(zhì)溶膠、優(yōu)選細胞核內(nèi)的轉位。然而可以理解，攝入每一個與細胞接觸的分子是不可實現(xiàn)的。然而，相對于不使用PCI的背景水平而言顯著和改進的攝入是可實現(xiàn)的。本發(fā)明方法優(yōu)選允許在充分水平攝入PNA分子，使得在那些細胞的表達產(chǎn)物中它們對復制、轉錄或翻譯的作用是顯著的?？梢哉{(diào)節(jié)待與細胞接觸的PNA-肽綴合物至適當濃度以實現(xiàn)此目的，例如實現(xiàn)在與細胞一起孵育例如24、48、72或96小時(例如24-48/小時)后靶基因的表達減少超過10％，例如減少超過20、30、40或50％(例如見圖9)。蛋白質(zhì)減少的水平依賴于蛋白質(zhì)的半衰期，即已有的蛋白質(zhì)將根據(jù)其半衰期被去除。因此相對于在相同時間點無PNA的表達，實現(xiàn)了表達減少超過10、20、30、40或50％，使得半衰期被考慮在內(nèi)。
在本文中使用術語“細胞”以包括所有真核細胞(包括昆蟲細胞和真菌細胞)。因而代表性“細胞”包括所有類型的哺乳動物和非哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞和原生動物。然而，細胞優(yōu)選是哺乳動物細胞，例如來自貓、狗、馬、驢、綿羊、豬、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔、豚鼠，但最優(yōu)選來自人。
本文所用“接觸”表示在適于內(nèi)化入細胞的條件下，例如優(yōu)選在適當營養(yǎng)介質(zhì)中在37℃下，使細胞和光敏劑和/或PNA-肽綴合物互相物理接觸。
光敏劑是經(jīng)適當波長和強度的光照被激活從而生產(chǎn)活化物質(zhì)的試劑。方便地，這種試劑可以是定位于細胞內(nèi)區(qū)室、尤其是內(nèi)體或溶酶體內(nèi)的類型。很多這種光敏劑在本領域內(nèi)是已知的并描述于文獻中，包括WO96/07432，其經(jīng)引用并入本文。就此來說可以提到二-和四磺化鋁酞菁(例如AlPcS2a)、磺化四苯基卟吩(TPPSn)、尼羅藍、綠素e6衍生物、尿卟啉I、葉紅素、血卟啉和亞甲基藍，它們已經(jīng)顯示位于培養(yǎng)細胞的內(nèi)體和溶酶體中。這在多數(shù)情況下是由于內(nèi)吞攝入光敏劑所致。因此，光敏劑優(yōu)選是被攝入溶酶體或內(nèi)體的內(nèi)部區(qū)室的藥劑。另外的適用于本發(fā)明的光敏劑描述于WO03/020309，其也經(jīng)引入并入本文，即磺化間-四苯基綠素，優(yōu)選TPCS2a。
然而，定位于其它細胞內(nèi)區(qū)室例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基器的其它光敏劑也可以使用。也可以設想光化學處理對細胞其他區(qū)室組分(即膜限制區(qū)室以外的組分)起作用的機制也可能有效。因此，例如，一種可能可以是光化學處理破壞對細胞內(nèi)運輸或小泡融合重要的分子。這些分子可以不必位于膜限制性區(qū)室內(nèi)，但這些分子的光化學破壞卻可以導致轉移分子的光化學內(nèi)化，例如通過這樣一種機制，其中對這些分子的光化學作用導致待內(nèi)化至降解小泡如溶酶體的分子(即PNA分子)的運輸降低、從而待內(nèi)化的分子可以在被降解之前逃脫至胞質(zhì)溶膠。
不必要位于膜限制性區(qū)室內(nèi)的分子的實例是微管運輸系統(tǒng)的幾種分子，如動力蛋白(dynein)和dynactin的組分；以及例如rab5、rab7、N-乙基馬來酰亞胺敏感因子(NSF)、可溶性NSF附著蛋白(SNAP)等。
可提到的合適光敏劑類型因此包括卟啉類、酞菁類、紅紫素類、二氫卟酚類(chlorins)、苯并卟啉類、萘酞菁類(naphthalocyanines)、陽離子染料、四環(huán)素類和lysomotropic弱堿或其衍生物(Berg et al.，J.Photochemistryand Photobiology，1997，65，403-409)。其它合適的光敏劑包括texaphyrins、脫鎂葉綠酸類(pheophorbides)、porphycenes、菌綠素類、酮綠素類(ketochlorins)、血卟啉衍生物、及其衍生物、5-氨基乙酰丙酸誘導的內(nèi)源性光敏劑及其衍生物、光敏劑之間的二聚體或其它綴合物。
優(yōu)選的光敏劑包括TPPS4、TPPS2a、AlPcS2a、TPCS2a和其它雙親性光敏劑。其它合適的光敏劑包括化合物5-氨基乙酰丙酸或5-氨基乙酰丙酸的酯或者其藥物可接受的鹽。
“照射”細胞以激活光敏劑表示如本文下述直接或間接施加光。因此可以用光源照射細胞，例如直接照射(例如體外照射單個細胞)或間接照射，例如當細胞在皮膚表面以下或以細胞層的形式體內(nèi)照射，其中并非直接照射所有這些細胞，即不屏蔽其它細胞。
本文定義的“肽”包括含任何數(shù)目氨基酸、即一或多個氨基酸的任何分子。然而優(yōu)選肽是連續(xù)氨基酸的聚合物。
優(yōu)選帶正電的肽長度為3(或4、5或6)-30個氨基酸，更優(yōu)選長度為3(或4、5或6)-25、3(或4、5或6)-20或3(或4、5或6)-15個氨基酸。在高度優(yōu)選的實施方案中，肽長度少于10個氨基酸，例如3、4、5或6個。
肽可以用任何方便的手段制備，例如直接化學合成，或者通過重組手段在細胞中表達適當序列的核酸分子而制備。
帶正電的分子能將它所偶聯(lián)的PNA分子轉位入細胞中然后進入胞質(zhì)溶膠中，并且優(yōu)選也進入細胞核中。
如本文所用，“帶正電”表示在生理pH即pH7.2時，肽的整體、或凈電荷是+1或更高。若氨基酸的主要類型存在于肽中時在生理pH下是帶正電的，則該氨基酸被認為是+1。肽中各種這樣的氨基酸進一步貢獻正電荷，由此計算肽的最終電荷。肽可以含有一或多個帶負電的氨基酸殘基、以及中性殘基，只要肽的凈電荷(通過將每個氨基酸貢獻的電荷加在一起來計算)是正的即可。PNA分子不帶電，因此對分子的總體電荷沒有貢獻。然而應該理解，在確定帶正電肽的存在時重要的并被評價的是肽部分的電荷。
因此肽的電荷依賴于其氨基酸組成。某些氨基酸在正常生理pH處帶電。帶正電氨基酸是賴氨酸(K)、精氨酸(R)和組氨酸(H)，并且在上述量表上被認為是+1價。天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)在多數(shù)生理pH處攜帶負電荷，并且在上述量表上被認為是-1價。其他天然氨基酸被認為不帶電荷?？梢源嬖谌魏螖?shù)目的帶正電或負電的氨基酸，只要肽的總電荷是+1或以上即可。
本發(fā)明所用肽中使用的氨基酸不必是天然氨基酸。肽中一或多個氨基酸可以替換為非天然氨基酸，如衍生化氨基酸。這些氨基酸類似地基于它們對肽電荷的貢獻來評價。因此，當用天然氨基酸時，如果其主要類型在生理pH帶正電，則電荷到底源自衍生部分(如引入的氨基)或天然氨基酸中也存在的部分是無關的，只要總電荷是+1或以上即可。
肽可以作為雜合分子的一部分存在，例如連接至非蛋白質(zhì)分子如有機聚合物，其例如能用作連接基團。肽還可以連接至分離的組分，其在性質(zhì)上可以是蛋白質(zhì)但其有效地不依賴于肽，例如不帶電或在分離的結構構型中。在這些情況下，肽將構成暴露的、優(yōu)選外周部分，并且作為相關肽，該部分的電荷將被評價。
帶正電的肽可以綴合至PNA分子的或者N端或者C端，并可以在有或無連接基團，如8-氨基-3，6-二氧雜辛酸、2-氨基乙氧基-2-乙氧基乙酸(AEEA)或二硫化物連接子的情形下連接。然而優(yōu)選地所述肽直接通過共價鍵合綴合。特別優(yōu)選地在綴合物中除PNA和所述肽以外沒有其他組分。
先前的研究已經(jīng)表明，只有經(jīng)典的核定位信號將綴合分子運輸至核。然而如上所述，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當用PCI進行內(nèi)化方法時，肽的核定位能力僅依賴于電荷而不是序列。具有+5凈電荷的肽顯示最高攝入，并發(fā)現(xiàn)這不依賴于貢獻該電荷的序列。肽的電荷是＞1，優(yōu)選+1至+10，例如+2至+8，如+3至+6，例如+4或+5。
優(yōu)選地連接至PNA的肽富含K、R和/或H殘基。特別優(yōu)選地使用一系列連續(xù)帶電殘基。優(yōu)選肽中所用其他殘基是中性的。因此，例如，肽可以具有或含有序列Xn-(Y)m-Xo，其中X是中性殘基，Y是帶正電殘基，在它們出現(xiàn)的每個位置其可以相同或不同，n、m和o是≥1的整數(shù)，例如1-10，n和o優(yōu)選是1或2且m優(yōu)選是2-5。特別優(yōu)選地Y在每個位置相同并且是K、R或H。
特別優(yōu)選的肽是SEQ ID NO7MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL、SEQ ID NO6AKL和SEQ ID NO5GHHHHHG。SEQ ID NO7MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL和SEQ ID NO6AKL分別是線粒體和過氧化物酶體靶向序列，然而已經(jīng)證明其能用本文所述PCI方法靶向至核。這種令人驚奇的發(fā)現(xiàn)舉例說明了本發(fā)明所用肽的電荷而非序列依賴性。
帶正電肽優(yōu)選不是NLS，如SEQ ID NO3PKKKRKV或混雜的NLS，SEQ ID NO4KKVKPKR或者逆NLS，SEQ ID NO8VKRKKKP，或者典型的細胞侵入性肽，如HIV Tat SEQ ID NO1RKKRRQRRR，或觸角足細胞侵入性肽SEQ ID NO2RQIKIWFQNRRMKWKK。這可以通過例如確定無PCI時核轉移或細胞侵入的程度而加以評估。在這些情況下能顯著核轉移或細胞侵入的肽將被認為是NLS或細胞侵入性肽。所述肽也優(yōu)選不是聚賴氨酸。另外，PNA或肽可以含有進一步的修飾，如標簽上的熒光標記。
如上所述的PNA-肽綴合物形成本發(fā)明的另一方面。
如本文所用“綴合”表示將肽和PNA分子連在一起在生理條件下形成單個實體。PNA和肽優(yōu)選通過共價鍵連接。
PNA分子和肽可以分別合成或純化，然后連在一起，例如用間隔分子如Fmoc-NC603H11-OH(Branden et al.，1999，同上)，或者它們可以化學合成為單個分子，例如通過(Btoc)策略。在此方法中，使用標準肽合成方法，將PNA單體合成為長20個堿基的寡聚物。PNA單體使用芴甲氧羰基(Fmoc)保護N端單體的氨基，用二苯甲氧羰基(Bhoc)保護A、C和G的環(huán)外氨基。Bhoc基團與XAL合成柄相偶聯(lián)允許PNA寡聚物的快速脫保護和從樹脂上切割下來。典型的偶聯(lián)產(chǎn)率是＞95％。通過從樹脂上TFMSA切割寡聚物完成合成。經(jīng)反相HPLC純化寡聚物(Viirre et al.(2003)，J.Org.Chem.68(4)，1630-1632；Neuner et al.(2002)，Bioconjug.Chem.13(3)，676-678)。
因此，帶正電的肽似乎負責將PNA帶入細胞，以及當其已從細胞內(nèi)區(qū)室釋放時負責其核攝入。
可以同時施用或導入超過一種類型的PNA分子，即不同序列的PNA分子。與之相似，可以同時施用或導入攜帶超過一種類型的帶正電肽的PNA分子。
任選地，光敏劑和待導入細胞的綴合PNA分子中一種或另一種或兩種可以連接至或結合于或綴合至一或多種載體分子或靶向分子，其可以輔助或增加光敏劑或綴合PNA分子的攝入，或者可以將這些實體靶向或遞送至特定細胞類型、組織或細胞內(nèi)區(qū)室。對于綴合PNA分子，靶向至核還可以通過根據(jù)本發(fā)明的綴合物物的肽組分來實現(xiàn)。
載體系統(tǒng)的實例包括聚賴氨酸或其他聚陽離子、硫酸葡聚糖、不同的陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、重構的LDL-顆?；蛘吡Ⅲw穩(wěn)定化的脂質(zhì)體。這些載體系統(tǒng)一般可改善藥物動力學并增加綴合PNA分子和/或光敏劑的細胞攝入，并且還可以將PNA分子和/或光敏劑導向至特別有利于獲得光化學內(nèi)化的細胞內(nèi)區(qū)室，但它們一般不具有將PNA分子和/或光敏劑靶向至特定細胞(如癌細胞)或組織的能力。然而，為了實現(xiàn)這種特異性或選擇性靶向，載體分子、PNA分子和/或光敏劑可以與特異性靶向分子結合或綴合，這些靶向分子將促進PNA分子向期望的細胞或組織內(nèi)的特異性細胞攝入。這些靶向分子還可以將PNA分子導向特別有利于獲得光化學內(nèi)化的細胞內(nèi)區(qū)室。
可以利用很多不同的靶向分子，其被描述于例如Curiel(1999)，Ann.New York Acad.Sci.886，158-171；Bilbao et al.，(1998)，in Gene Therapy ofCancer(Walden et al.，eds.，Plenum Press，New York)；Peng and Russel(1999)，Curr.Opin.Biotechnol.10，454-457；Wickham(2000)，Gene Ther.7，110-114。
載體分子和/或靶向分子可以連接、結合或綴合至PNA分子、光敏劑或這兩種分子上，并可以使用相同或不同的載體或靶向分子。如上所述，可以同時使用超過一種載體和/或靶向分子。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的載體包括聚陽離子，如聚賴氨酸(例如聚-L-賴氨酸或聚-D-賴氨酸)、聚乙烯亞胺或樹形聚合物(dendrimer)(例如陽離子樹形聚合物如SuperFect)；陽離子脂質(zhì)，如DOTAP或脂質(zhì)轉染劑(Lipofectin)和肽。
本發(fā)明方法可以如下實施。在本發(fā)明方法中，將待內(nèi)化分子和光敏化合物同時或依序施加至細胞，由此光敏化合物和分子被細胞內(nèi)吞或以其他方式轉位入內(nèi)體、溶酶體或其他細胞內(nèi)膜限制的區(qū)室中。
PNA-肽綴合物和光敏化合物可以一起或依次施加至細胞。它們可以被細胞攝入相同或不同的細胞內(nèi)區(qū)室(例如它們可以被共轉位)。然后通過將細胞暴露于適當波長的光以激活光敏化合物并進而導致細胞內(nèi)區(qū)室膜被破壞以及隨后釋放分子入胞質(zhì)溶膠，從而釋放PNA-肽綴合物，其中所述分子可以位于與光敏劑相同的區(qū)室。因此，在這些方法中，最后的細胞光照步驟導致所關注的分子從與光敏劑相同的細胞內(nèi)區(qū)室中釋放并存在于胞質(zhì)溶膠中。
更近以來，WO02/44396(經(jīng)引用并入本文)描述了一種方法，其中可以改變步驟的順序，使得例如在待內(nèi)化和遞送至細胞的分子與細胞接觸之前，將光敏劑與細胞接觸并通過光照激活。這種適應性修改的方法利用了以下事實，即待內(nèi)化分子不必要存在于與光敏劑相同的細胞亞區(qū)室內(nèi)。
因此，在一個優(yōu)選實施方案中，所述光敏劑和所述PNA分子一起或依次施加至細胞。由此它們可以被細胞攝入相同的細胞內(nèi)區(qū)室，然后可以進行所述照射。
在一個替代實施方案中，所述方法可以這樣進行，即使所述細胞與光敏劑接觸，使所述細胞與待導入的PNA分子接觸，并用具有可有效激活該光敏劑的波長的光照射所述細胞，其中在所述PNA分子被細胞性攝入含所述光敏劑的細胞內(nèi)區(qū)室之前，優(yōu)選在所述分子被細胞性攝入任何細胞內(nèi)區(qū)室之前，進行所述照射。
可以在所述分子被細胞性攝入細胞內(nèi)區(qū)室之后進行所述照射，光照時無論所述PNA分子和光敏劑是否位于相同細胞內(nèi)區(qū)室都可以。然而，在一個優(yōu)選實施方案中，在待內(nèi)化分子被細胞性攝入之前進行照射。
如本文所用，“內(nèi)化”表示分子的胞質(zhì)溶膠遞送。因此，在本發(fā)明中，“內(nèi)化”包括分子從細胞內(nèi)/膜界定的區(qū)室中釋放入細胞的胞質(zhì)溶膠中。
如本文所用，“細胞性攝入”或“轉位”表示內(nèi)化步驟之一，其中細胞膜外的分子被帶入細胞、使得它們存在于外層細胞膜以內(nèi)，例如通過細胞內(nèi)吞或其他適當?shù)臄z入機制，例如進入細胞內(nèi)膜限制區(qū)室例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、內(nèi)體等或與之結合。
使細胞與光敏劑和與PNA-肽綴合物接觸的步驟可以任何方便或期望的方式進行。因此，如果在體外實施接觸步驟，則細胞可以方便地維持在水性介質(zhì)中例如適當?shù)募毎囵B(yǎng)基中，并在適當時間點可以在適當條件下(例如在適當濃度和適當長度時間的條件下)將光敏劑和/或PNA-肽綴合物簡單的加入所述介質(zhì)中。
在適當濃度和適當時間長度下使光敏劑與細胞接觸，這些條件可以由技術人員用常規(guī)技術容易地確定，并且它們將依賴于所用具體光敏劑和靶細胞類型和位置等因素。光敏劑的濃度必須能夠使得其一旦被攝入細胞、例如被攝入一或多種細胞內(nèi)區(qū)室或與之結合以及被光照激活時，一種或多種細胞結構會被破壞，例如一或多種細胞內(nèi)區(qū)室被裂解或破壞。例如本文實施例中所用光敏劑可以使用例如10-50μg/ml的濃度。對于體外使用，范圍可以更寬，例如0.05-500μg/ml。對于人體內(nèi)治療，當系統(tǒng)性給藥時光敏劑使用范圍可以是0.05-20mg/kg體重或者對于局部施用可以是溶劑中0.1-20％。在更小的動物中，濃度范圍可以不同并可以相應調(diào)節(jié)。
細胞與光敏劑孵育的時間(即“接觸”時間)可以從幾分鐘至幾小時變化，例如甚至可達48小時或更長，例如12-20小時。孵育時間應該使得光敏劑被適當細胞攝入，例如被攝入所述細胞中的細胞內(nèi)區(qū)室內(nèi)。
在細胞光照或者添加PNA分子之前，在細胞與光敏劑的孵育之后任選地用無光敏劑介質(zhì)孵育一段時間，例如10分鐘至8小時，尤其是1-4小時。
PNA分子與細胞在適當濃度下接觸適當長度時間。
確定本發(fā)明方法所用的PNA分子的適當劑量對于本領域技術人員是常規(guī)操作。對于體外應用，PNA分子的劑量實例是約0.1-500μg/ml PNA，對于體內(nèi)應用，人每次注射約10-6-1g PNA。例如，PNA-肽綴合物可以在少于50μM的水平施用，例如少于30μM，特別優(yōu)選少于10μM，例如0.1-1μM、或5-30μM，其中所示濃度反映了與細胞接觸的水平。
如上所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，甚至可以在已經(jīng)添加光敏劑和進行照射以后幾小時開始接觸。
適當?shù)臐舛瓤梢愿鶕?jù)所關注PNA分子被攝入所關注細胞的效率和期望在細胞中達到的最終濃度來確定。因此，“轉染時間”或“細胞攝入時間”，即分子與細胞接觸的時間，可以是幾分鐘或可達幾小時，例如可以使用從10分鐘直到24小時的轉染時間，例如30分鐘直至10小時或者例如30分鐘直至2小時或6小時。還可以使用更長的孵育時間，例如24-96小時或更長，例如5-10天。
轉染時間的增加通常導致所述分子的攝入增加。然而，更短的孵育時間，例如30分鐘至1小時，似乎導致分子攝入的特異性提高。因此，在選擇用于任何方法的轉染時間時，必須考慮在獲得足夠的分子攝入和維持PCI處理的足夠特異性之間的適當平衡。
使PNA分子和光敏劑與靶細胞接觸的適當體內(nèi)方法和孵育時間取決于施用模式以及PNA分子和光敏劑的類型。例如，如果PNA分子被注射入待治療的腫瘤、組織或器官，與位于離注射點更遠距離的細胞相比，臨近注射點的細胞將與之接觸并因此趨向于更迅速攝入PNA分子，該更遠距離的細胞可能在更晚時間與更低濃度的PNA分子接觸。
此外，通過靜脈注射施用的PNA分子可能需要一段時間到達靶細胞，因此為了有足夠或最適量的PNA分子積累在靶細胞或組織中，可能在施用后需要更長時間，例如幾天。相同的考慮當然適用于光敏劑在細胞內(nèi)的攝入所需要的施用時間。體內(nèi)單個細胞需要的施用時間因此可能根據(jù)這些和其它參數(shù)而變化。
然而，盡管體內(nèi)情況比體外更復雜，本發(fā)明的基本概念仍相同，即分子與靶細胞接觸的時間必須使得在發(fā)生照射之前靶細胞已經(jīng)攝入了適當量的光敏劑，以及或者(1)照射之前或期間，PNA分子或者已經(jīng)被攝入，或者將在與靶細胞充分接觸后被攝入相同或不同的細胞內(nèi)區(qū)室，或者(2)照射之后，PNA分子與細胞接觸足以允許其被攝入細胞的一段時間。只要PNA分子被攝入受光敏劑激活影響的細胞內(nèi)區(qū)室(例如光敏劑所在的區(qū)室)，PNA分子可以在照射之前或之后被攝入。
激活光敏劑的光照步驟可以根據(jù)本領域公知的技術和方法進行。例如，光波長和強度可以根據(jù)所用光敏劑進行選擇。合適的光源在本領域是公知的。
本發(fā)明方法中細胞光照的時間可以變化。PNA分子被內(nèi)化入胞質(zhì)溶膠的效率隨光照增加至最大值而增加，超過此值細胞破壞及相應地細胞死亡增加。
照射步驟的優(yōu)選時間長度取決于靶標、光敏劑、光敏劑在靶細胞或組織中積累的量以及光敏劑吸收光譜與光源發(fā)射光譜之間的重疊等因素。一般來說，照射步驟的時間長度在幾分鐘至幾小時的量級，例如優(yōu)選可長達60分鐘，例如0.5或1-30分鐘，例如0.5-3分鐘或者1-5分鐘或者1-10分鐘，例如3-7分鐘，優(yōu)選約3分鐘，例如2.5-3.5分鐘。
適當?shù)墓鈩┝靠梢杂杀绢I域技術人員選擇，并且還依賴于光敏劑以及光敏劑在靶細胞或組織中積累的量。例如，用光敏劑Photofrin和原卟啉前體5-氨基乙酰丙酸進行光動力學癌癥治療中典型的光劑量是在50-150J/cm2范圍，影響范圍小于200mW/cm2，以避免過熱。當使用在可見光譜的紅區(qū)具有較高消光系數(shù)的光敏劑時，光劑量通常較低。然而，對于用積累較少的光敏劑治療非癌性組織，所需總光量可以實質(zhì)上比癌癥治療更高。而且，如果需要維持細胞活力，要避免產(chǎn)生過量水平的毒性物質(zhì)，因而可以調(diào)節(jié)相關參數(shù)。
由于光化學處理，即通過在光敏劑激活時產(chǎn)生毒性物質(zhì)，本發(fā)明方法不可避免地會殺死一些細胞。根據(jù)使用目的，這種細胞死亡可以沒有什么影響，并且實際上可以對一些應用是有利的(例如癌癥治療)。然而優(yōu)選避免細胞死亡?？梢孕薷谋景l(fā)明方法，使得通過選擇與光敏劑濃度相關的光劑量來調(diào)節(jié)存活細胞的分數(shù)或比例。這些技術也是本領域已知的。
在期望活細胞的應用中，基本所有細胞，或者明顯大多數(shù)細胞(例如，至少50％，更優(yōu)選至少60、70、80或90％的細胞)不被殺死。
無論由光敏劑激活所誘導的細胞死亡量如何，為使PNA在細胞中有作用，調(diào)節(jié)光劑量以使得一些顯示PCI影響的個體細胞不被單獨光敏劑處理殺死是重要的(盡管如果導入細胞中的分子有毒性作用，它們可能隨后被這些分子殺死)。
通過使用例如基因治療可以實現(xiàn)細胞毒作用，其中反義PNA分子被本發(fā)明方法內(nèi)化入腫瘤細胞的核內(nèi)，以便例如下調(diào)基因。
本發(fā)明方法可以體內(nèi)或體外使用，例如用于或者原位治療或者離體治療，隨后將處理后的細胞施加至身體，這可以用于不同的目的，包括(i)通過與mRNA或剪接中間體結合而抑制特定基因產(chǎn)物的表達；(ii)通過直接干擾基因(例如抑制轉錄因子結合)而干擾特定基因轉錄；(iii)作為原位雜交的探針；(iv)用于篩選試驗；和(v)用于在靶細胞內(nèi)實現(xiàn)缺陷基因的位點特異性突變或修復。
因此，本發(fā)明提供一種通過本文前述方法將PNA分子導入含靶基因的細胞中從而抑制所述靶基因的轉錄或表達的方法，其中所述PNA分子特異性結合所述靶基因或其復制或轉錄產(chǎn)物。因此，例如，所述PNA可以結合DNA和/或RNA。
“特異性結合”表示PNA與RNA或DNA靶分子的序列依賴性結合。“靶基因”表示PNA能結合并且是研究靶標的基因或其片段。
本發(fā)明還提供一種鑒定或評價靶基因或其復制或轉錄產(chǎn)物的水平的方法，所述方法包括通過本文前述方法將PNA分子導入含所述靶基因或其復制或轉錄產(chǎn)物的細胞中，其中所述PNA分子特異性結合所述靶基因或其復制或轉錄產(chǎn)物，和評估結合PNA的水平以確定所述靶基因或其復制或轉錄產(chǎn)物的存在或水平。對于該方法，方便地，PNA分子可以攜帶在評價中可被鑒定的報告分子，例如放射性標記或產(chǎn)生信號的工具。評價可以是定性和/或定量的。
本發(fā)明還提供一種在細胞中實現(xiàn)靶基因、優(yōu)選缺陷基因的位點特異性突變或修復的方法，所述方法包含通過本文前述方法將PNA分子和含期望序列的寡核苷酸分子導入含所述靶基因的細胞中，其中所述PNA分子特異性結合所述靶基因而形成PNA鉗。在靶向位點發(fā)生正常核酸的這種形成三體的變形，并促進在該特定位點的修復或重組。供體核酸含有期望核苷酸序列，其可以連接至PNA或者簡單地與PNA同時施用。因此PNA起促進修復/重組的作用。
這些方法可以用于探索性例如診斷性目的，或者用于改變細胞的表達譜，例如以產(chǎn)生期望產(chǎn)物，用于分離或治療目的。
本發(fā)明方法因此可用于診斷目的，其中特定基因或其復制或轉錄產(chǎn)物的存在可提供疾病、病況或障礙的存在、階段或預后的信息。因此本發(fā)明還提供一種診斷疾病、病況或障礙的方法，其包括通過本文前述方法將PNA分子導入細胞(其可以是體外、體內(nèi)或離體)，其中所述PNA分子特異性結合靶基因或其復制或轉錄產(chǎn)物，這指示所述疾病、病況或障礙的存在，和評價結合PNA的水平以確定所述疾病、病況或障礙的存在。
本發(fā)明方法還可用于治療可從一或多種基因的下調(diào)、修復或突變中受益的任何疾病。例如，在癌癥中過表達的基因可以通過施用適當?shù)腜NA分子被下調(diào)。
抑制突變、致病基因表達的PNA也可以與替代基因組合一起施用(即，涉及基因的治療性轉移或修飾患者細胞中已有基因的基因治療)，例如用于治療囊性纖維化、癌癥、心血管疾病、病毒感染和糖尿病。其治療將從一或多種基因的下調(diào)中受益的其他疾病包括白血病和胰腺癌(Cogoiet al.(2003)Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids22(5-8)，1615-1618)、肌營養(yǎng)不良性側索硬化癥(AMS)(Turner et al.(2003)，Neurochem.87(3)，752-763)、亨亭頓氏病(Lee et al.(2002)J.Nucl.Med.43(7)，948-956)和阿爾茨海默病(McMahon et al.(2002)J.Mol.Neurosci.19(1-2)，71-76)。
如上所述，PNA還可以用于改變已有基因，因而可用于修復缺陷基因，從而例如治療疾病，所述疾病病因涉及該缺陷基因的表達或該基因正常形式的不表達(Rogers et al.(2002)，PNAS U.S.A.99(26)，16695-16700；Faruqi et al.(1998)，PNAS U.S.A.5(4).1398-1403)。
因此，本發(fā)明進一步的方面提供一種組合物，其含有本文所述PNA分子和任選地分離地還含光敏劑，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽。在本發(fā)明的另一方面，還提供所述組合物用于治療。
作為替代，本發(fā)明提供本文所述PNA分子在制備用于通過改變所述患者中一或多種靶基因的表達而治療或預防疾病、障礙或感染的藥物中的用途。優(yōu)選地所述藥物用于基因治療，即用于治療以異?；虮磉_為特點的疾病或障礙。所述改變可以包括所述表達的下調(diào)或者所述基因的修飾形式的上調(diào)。
根據(jù)上述的不同實施方案，所述光敏劑和所述PNA分子同時或依次與患者的細胞或組織接觸，和用光照射所述細胞，所述光的波長可有效激活光敏劑，并且在所述PNA分子被細胞性攝入至含所述光敏劑的細胞內(nèi)區(qū)室之前、期間或之后進行照射，優(yōu)選在所述轉移分子被細胞性攝入任何細胞內(nèi)區(qū)室之前進行。因此，在一個替代性方面，本發(fā)明提供一種治療或預防患者中疾病、障礙或感染的方法，其包括根據(jù)本文前述方法將PNA分子體外、體內(nèi)或離體導入一或多種細胞，和如果必要(即，當在體外或離體進行轉染時)將所述細胞施用至所述患者，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽。
如本文所述，“治療”表示相對于治療之前的癥狀，降低、緩解或消除所治療疾病、障礙或感染的一或多種癥狀。
“預防”表示延遲或防止疾病、障礙或感染的癥狀的發(fā)生。
本發(fā)明的組合物還可以包含細胞，所述細胞含有通過本發(fā)明方法已經(jīng)內(nèi)化入所述細胞的胞質(zhì)溶膠或細胞核的PNA分子，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽。本發(fā)明還延及這些組合物在治療，尤其是癌癥或基因治療中的應用。
因此，本發(fā)明另一方面提供細胞或細胞群體，所述細胞含有已經(jīng)被內(nèi)化入該細胞的胞質(zhì)溶膠或核中的PNA分子，該細胞通過本發(fā)明方法可以獲得，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽。
本發(fā)明另一方面提供這些細胞或細胞群體用于制備用于本文前述治療、優(yōu)選癌癥或基因治療的組合物或藥物的用途，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽。
本發(fā)明還提供一種治療患者的方法，其包括向所述患者施用本發(fā)明的細胞或組合物，即該方法包括以下步驟，將一種分子導入本文前述的細胞和將由此制備的所述細胞施用給所述患者。優(yōu)選將所述方法用于治療癌癥或基因治療。
體內(nèi)可使用本領域常見或標準的任何施用模式，例如注射、輸注、局部施用至內(nèi)部和外部體表面等。對于體內(nèi)使用，本發(fā)明可使用于含其中光敏劑和PNA分子定位于內(nèi)的細胞的任何組織，包括體液以及實體組織。只要光敏劑能夠被靶細胞攝入并且可以適當給予光，所有組織都可以治療。
因此，本發(fā)明的組合物可以根據(jù)制藥領域已知的技術和方法以任何方便的方式配制，例如使用一或多種藥物接受的載體或賦形劑。本文所述“藥物接受的”表示與組合物中其他成分兼容并且接受者在生理上可接受的成分。組合物和載體或賦形劑材料的本性、劑量等可以根據(jù)給藥的選擇和期望途徑、治療目的等以常規(guī)方式選擇。劑量可以類似地以常規(guī)方式確定并可以取決于分子本性、治療目的、患者年齡、給藥模式等。在光敏劑方面，經(jīng)照射破壞膜的潛力/能力也應該考慮。
上述方法另外可用于產(chǎn)生用于高通量篩選方法的篩選工具，尤其是用于分析沉默特定基因的效果?？梢援a(chǎn)生針對一或多種特定基因的PNA并用于上述本發(fā)明方法。因此PNA可用于降低細胞群體中基因的表達。然后所得細胞群體可用作經(jīng)標準技術鑒定基因沉默下游效果的篩選工具。因此，例如可以鑒定也受靶基因沉默影響的基因。任選地這些鑒定的基因可以在進一步的篩選輪次中用PNA靶向，例如以確定與特定信號傳遞事件有關的分子。
因此，本發(fā)明也涉及一種具有被修飾的基因表達模式的細胞的篩選方法，其包括a)分析細胞或細胞群體中靶基因或者一或多種另外基因的表達，所述細胞或細胞群體是根據(jù)本發(fā)明方法通過導入PNA分子獲得的，其中所述PNA特異性結合所述靶基因或其復制或轉錄產(chǎn)物并修飾所述一種或多種另外基因的表達；和b)將所述靶基因和/或一或多種另外基因的表達與參考細胞、優(yōu)選野生型細胞中所述基因的表達作比較。
可用本領域已知的任何合適技術確定表達模式，例如采用攜帶可結合mRNA(或cDNA)分子并可用于評價每種轉錄本的量的探針的微陣列。參考細胞表示相對其比較表達的任何細胞。優(yōu)選這些細胞是未導入PNA的對照細胞。特別優(yōu)選所述細胞是野生型細胞，例如未通過使用例如PNA等進行遺傳操作的細胞。
用正常和化學修飾的反義寡核苷酸降低基因表達的先前嘗試已經(jīng)受很多問題限制，包括反義寡核苷酸的核酸酶降解、出現(xiàn)非特異性作用和/或靶親合力不足。通過使用本發(fā)明方法施用PNA，可以克服這些問題。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種修飾細胞(例如細胞群體)的基因表達模式以制備用作篩選工具(例如用于高通量篩選)的細胞的方法，其包括使能抑制或降低基因表達的PNA分子和光敏劑與細胞(例如細胞群體)接觸，并用一定波長的光照射細胞，所述波長可有效激活該光敏劑，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽上。本發(fā)明還延及這些細胞和篩選這些細胞的方法，其中對這些細胞的特定性質(zhì)、例如這些細胞中mRNA表達水平進行檢查，例如在微陣列中檢查。
“修飾的基因表達模式”意思是指由于細胞核中存在所述PNA分子，它所針對的基因的轉錄和翻譯受到影響。
由于基因表達的這種變化，其他基因的表達可以受影響。因此，通過影響所研究基因的正常表達，有可能確定其他基因的表達模式的變化。這些基因的鑒定、以及所研究基因的表達對其影響的鑒定允許研究人員得出關于該基因的功能的結論，例如其下游功能。受所研究基因正常表達的改變影響的基因可以被上調(diào)或下調(diào)，但表達模式的整體變化可指示該基因在正常細胞功能中的作用以及其調(diào)節(jié)異常的后果。
使用本領域公知的標準技術，有可能研究所關注基因的表達下調(diào)或消除的影響。例如這可以通過尋找細胞(或細胞群體)中的功能變化，如細胞粘附變化、蛋白質(zhì)分泌變化或形態(tài)變化而實現(xiàn)。作為替代，可以通過分析mRNA模式和/或蛋白質(zhì)表達，同樣使用本領域公知的標準技術，直接研究基因表達模式。
通過抑制或降低基因表達，可以理解的是，與未接受該方法的細胞即野生型或正常細胞相比，所關注基因的表達被降低。基因表達水平的變化可通過本領域已知的標準技術來確定。
可以完全抑制表達，使得沒有可檢測的該基因表達，即不可檢測到mRNA或蛋白質(zhì)，或者可以部分抑制表達，即降低表達，由此基因表達量比野生型或正常細胞中更低。通過比較具有特異性序列的PNA以及具有混雜序列的PNA的效果，可以對此進行評價和控制，所述混雜序列即核苷酸組成相同但序列順序不同。優(yōu)選地，為了這種技術可用，表達降低至對照水平的小于80％，例如對照水平的＜50％，優(yōu)選＜20、10或5％。所用細胞優(yōu)選是細胞群體，其中各細胞是遺傳一致的。所述細胞可以是以上討論的任何細胞。
在開發(fā)這種新PNA遞送技術之前，還不可能將PNA用于這樣的系統(tǒng)。在這種系統(tǒng)中使用PNA的能力有幾個優(yōu)點。將分子施加至細胞的已知技術，如轉染劑的使用，經(jīng)常干擾大規(guī)模篩選系統(tǒng)中所用的細胞測試，使得難以確證哪些效果是由基因表達的破壞而引起的以及哪些是由轉染技術本身引起的。PCI介導的遞送很少具有這些效果，并且還有可能通過使用適當?shù)膶φ斩鴮崿F(xiàn)這樣的目的。
用于將分子遞送至細胞的一些其他物質(zhì)也可以對篩選測試引起非特異性作用。例如，已經(jīng)報道用于基因沉默技術的短干擾RNA(siRNA)會影響干擾素基因的表達(Sledz et al.(2003)，Natl.Cell Biol.5(9)，834-839)。PNA的穩(wěn)定性很高，因此其對基因表達的影響得到延長，甚至在單次使用之后也是如此。
PNA的功效不依賴于特定酶系統(tǒng)，因為其抑制作用依賴于與核苷酸分子的化學相互作用。因此，抑制程度在不同細胞類型中是恒定的。對于例如siRNA來說則不是如此，其依賴于特異性酶。
已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，PCI技術不會引起對基因表達產(chǎn)生非特異性作用的預期問題。
根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞或細胞群體可用于制備文庫，其形成本發(fā)明的另一方面。


本發(fā)明將在以下非限制性實施例中參考以下附圖更詳細描述。
圖1顯示電荷對PNA內(nèi)化的影響，其中使用流式細胞術分析FITC-PNA在OHS、HeLa和FEMXIII細胞中的攝入。將細胞與1000nM各種FITC-PNA在37℃一起孵育24小時，并如試驗方案部分所述用流式細胞術分析?！?1”PNA383，“0”PNA385，“+1”PNA384，“+5”PNA381。結果表示為平均熒光強度對不同PNA分子的凈電荷的關系。柱條顯示三個獨立實驗，每個有6個平行。誤差條顯示平均值的標準偏差。
圖2顯示用PCI處理、用PNA200在OHS細胞中，F(xiàn)ITC-PNA-NLS從內(nèi)吞小泡重新定位入核。(A)PCI處理之前和之后(3小時)，(B)PCI處理之前，(i)在相差顯微鏡下，(ii)用FITC-PNA染色，(iii)用LysoTracker染色，(iv)用Hoechst染色和(v)顯示組合染色，和(C)PCI處理之后，染色同B。
圖3用熒光顯微術顯示使用不同PNA分子和PCI之后不同細胞類型中的核定位。使細胞與1000nM各種FITC-PNA一起孵育24小時，并通過試驗方案部分所述熒光顯微術分析。(A)OHS-PNA-NLS(PNA381)，(B)OHS-PNA-MITO(PNA382)，(C)OHS-PNA-GHHHHHG(PNA457)，(D)HeLa-PNA-NLS(PNA381)，(E)FEMXIII-PNA-NLS(PNA381)，結果從左向右，相差圖象、FITC-PNA、Hoechst、LysoTracker染色。
圖4顯示PNA向核的遞送不依賴于所用熒光團的定位。使OHS細胞與在C或N末端具有FITC的PNA(1000nM)一起孵育24小時，并通過試驗方案部分所述經(jīng)熒光顯微術分析。結果從左向右顯示FITC連接至C端或N端。
圖5顯示在PCI之后PNA200被攝入不同細胞的核，(A)PCI之前，(B)PCI之后，監(jiān)測FITC-PNA染色；細胞分別是FEMX1、FEMX5、HeLa、OHS、SW620、HCT116、WiDr、293和SaOs。
圖6顯示PNA的攝入依賴于溫度，使OHS細胞暴露于1000nM PNA200在(A)4℃持續(xù)5小時和(B)37℃維持5小時。結果從左向右表示相差圖象、FITC/PNA、組合圖象；上圖中放大10倍，下圖中放大32倍。
圖7顯示PNA向核分遞送不依賴于所用熒光團的類型。細胞與綴合至羅丹明的PNA455(1000nM)一起孵育，并通過試驗方案部分所述熒光顯微術分析。結果從左向右表示相差圖象、羅丹明圖象和組合圖象。
圖8顯示帶不同電荷的PNA分子對PCI后核輸入的影響。使OHS細胞與PNA(1000nM)如試驗方案部分所述一起孵育(A)383，(B)385，(C)456，(D)384，(E)381，(F)455。結果從左向右表示相差圖象、FITC圖象和組合圖象。
圖9顯示用Western印跡分析在OHS細胞中不同PNA(1000nM)對S100A4表達的抑制(A)PNA200的劑量依賴的抑制，(B)不同PNA的時間依賴的抑制。結果表示為對照細胞的百分比，柱條是3次獨立試驗的平均值。誤差條顯示平均值的標準偏差。相應試驗的代表性Western印跡顯示于C至E，(C)和(D)加樣對照(α-微管蛋白)，(E)96小時后抑制——從左向右，對照、混雜的PNA(PNA201)、PNA200、PNA381，(F)96小時后用PNA200的劑量依賴的抑制——從左向右為對照、100nM、500nM、1000nM、2000nM。
圖10顯示PCI處理OHS細胞后MTS結果。結果指示單獨PNAS無毒性。
圖11顯示W(wǎng)estern印跡結果，指示對于靶向S100A4編碼區(qū)的PNA(PNA452)未看到對OHS細胞中蛋白質(zhì)水平的影響，(A)上部條帶-α-微管蛋白作為加樣對照，下部條帶-S100A4，泳道1無光敏劑且無光處理的對照，泳道2有光敏劑但無光處理，泳道3無光敏劑但有光處理，泳道4有光敏劑且有光處理，(B)上部條帶-α-微管蛋白作為加樣對照，下部條帶-S100A4，泳道1對照，泳道2混雜的PNA(PNA202)，泳道3(PNA452)1000nM，泳道4(PNA452)2000nM。
圖12顯示在PNA/PCI處理的OHS細胞中與對照相比S100A4mRNA的相對表達。A)用PNA-AUG、PNA-5’UTR和PNA-混雜進行PNA/PCI處理之后從OHS細胞分離總RNA。除了混雜的PNA以外，還選用PCI處理的OHS細胞作對照。所有樣品被逆轉錄，并對稀釋cDNA進行實時PCR分析，使用SYBR Green I作為檢測試劑。從不同樣品獲得的CT值顯示在基因表達中有很少差異。B)溶解曲線分析僅顯示感興趣產(chǎn)物。
圖13顯示用Western免疫印跡分析72小時后的TYR蛋白水平。泳道加樣如下1.對照(無PNA)，2.PNA TYR混雜(1mM)，3.PNA TYR混雜(10mM)，4.PNATYR UTR(1mM)，5.PNA TYR UTR(10mM)，6.PNA TYR AUG(1mM)，7.PNA TYR AUG(10mM)。還顯示了α-微管蛋白作為加樣對照。
實施例試驗方案細胞系和培養(yǎng)條件人細胞系HeLa(宮頸腺癌)、WiDr(結腸癌)和293(胚腎)從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA，USA)獲得。人OHS(骨肉瘤)和FEMXIII(黑素瘤)在挪威鐳醫(yī)院(Norwegian Radium Hospital)建立(Fodstad et al，(1986)，Int.J。Cancer38(1)，33-40；Fodstad et al.，(1988)，Cancer Res.48(15)，4382-8)。所有細胞系培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(BioWhittaker，Verviers，Belgium)中，但293細胞系除外，其被培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(Bio Whittaker，Verviers，Belgium)中。兩種培養(yǎng)基使用時都不用抗生素，但添加10％胎牛血清(FCS；PAA Laboratories，Linz，Austra)和2mM L-谷氨酰胺(Bio Whittaker，Verviers，Belgium)。細胞系在含5％CO2的加濕氣氛中于37℃生長和培養(yǎng)。檢驗所有細胞系，發(fā)現(xiàn)對支原體感染都是陰性。
PNA設計對S100A4特異的PNA，包括混雜PNA，均從Oswell DNA Service(Southampton，UK)獲得。在一或兩端進行修飾(見表1)。針對5’UTR(GeneBank登記號NM_002961，2-15)、AUG起始區(qū)(63-82)和第二個外顯子編碼區(qū)(98-118)的靶標基于以前的PNA抑制研究(Doyle et al.，(2001)，Biochem.40，53-64；Mologni et al.，(1999)，Biochem.Biophys.Res.Comm.264，537-543)和用核酶沉默S100A4基因(Hovig et al.，(2001)，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.Apr11(2)，67-75)來選擇。將序列與人基因組數(shù)據(jù)庫在BLAST搜索中進行比對，以消除與其他基因具有顯著同源性的那些序列。通過將PNA溶解于10％三氟乙酸中制備儲存溶液(1mM)，使用前加熱至50℃以確保PNA完全溶解。使用前，在無菌水中進一步將PNA稀釋成工作溶液(10μM)并保存于-20℃。
siRNA設計和退火基于Elbashir等人建議的規(guī)則(Elbashir et al.，(2001)，Genes Dev.15，188-200)，對S100A4基因的編碼區(qū)篩選兩個靶標。第一個靶標針對于AA(N)19序列(GeneBank登記號NM_002961，343-361)，而第二個靶標是AA(N19)TT序列(264-282)。此外，還獲得混雜的對照siRNA和熒光標記的siRNA。所有siRNA從Eurogentec(Seraing，Belgium)定購。在兩條鏈都進行標記，在反義鏈的5’端采用FITC，在正義鏈的3’端采用羅丹明。雙鏈的GC含量保持在40-70％范圍內(nèi)，并且所有siRNA合成時都在其3’端帶dTdT突出以使siRNA雙鏈有最佳穩(wěn)定性。兩個靶序列也在BLAST搜索中與人基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，以消除與其他基因具有顯著同源性的那些序列。將干燥的siRNA寡核苷酸在經(jīng)DEPC處理過的水中重懸至100μM并保存于-20℃。通過分別等分并稀釋各種RNA寡聚物至50μM濃度進行siRNA退火。然后合并30μl每種RNA寡聚物溶液和15μl5X退火緩沖液，終濃度為DEPC處理水中50mM Tris，pH7.5，100mM NaCl。然后將溶液在95℃水浴中孵育2分鐘，隨后在工作臺上逐漸冷卻45分鐘。通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳確認退火成功。
siRNA轉染和PNA電穿孔OHS細胞如上述培養(yǎng)，在6孔板中培養(yǎng)24小時，轉染前達到30-60％匯合。轉染在含不同濃度siRNA的無血清OPTI-MEM I培養(yǎng)基(Invitrogen Corp，Paisley，UK)中進行，根據(jù)制造商說明使用來自LifeTechnologies Inc.(Gaithersburg，MD，USA)的Lipofectin試劑、來自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)的Lipofectamine試劑、BoehringerMannheim(Mannheim，Germany)的(N-(1-(2，3-二油酰氧基氧)丙基)-N，N，N-三甲基銨-甲基-硫酸鹽，DOTAP)、來自Roche Diagnostics(Mannheim，Germany)的FuGene、來自Ambion(Austin，TX，USA)的siPORT脂質(zhì)轉染劑和來自Sigma(St.Louis，MO，USA)的聚-L-賴氨酸氫溴化物(MW15.000-30.000)。在電穿孔中，收獲培養(yǎng)的OHS細胞并重懸于新鮮培養(yǎng)基中。將約4×106細胞與PNA(1-10μM)在300μl培養(yǎng)基中混合并在冰上孵育10分鐘。在0.4cm杯中對細胞進行電穿孔，設置參數(shù)為950μF/250V(ECM399，BTX，A Division of Genetronics，CA)。電穿孔以后，將細胞在冰上孵育30分鐘，稀釋入T25培養(yǎng)瓶中并在37℃用5％CO2培養(yǎng)24小時，用熒光顯微鏡分析。
PCI技術和處理光敏劑二磺化四苯基卟吩(TPPS2a)購買自Porphyrin Products(Logan，UT，USA)。首先將TPPS2a溶于0.1M NaOH，隨后稀釋于磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7.5中至濃度5mg/ml和終濃度0.002M NaOH。對光敏劑進行光保護并保存于-20℃直到使用。照射時，將經(jīng)TPPS2a處理的細胞暴露于LumiSource prototype(PCI Biotech AS，Oslo，Norway)的藍光，其中含四個熒光管的庫(Osram18W/67)，最高熒光約420nm。
使用前將細胞在6孔板中在37℃5％CO2下培養(yǎng)24小時。然后使細胞與不同PNA和光敏劑TPPS2a(1μg/ml)一起培養(yǎng)18小時。攝入以后，用新鮮培養(yǎng)基洗滌細胞三次，并在無光敏劑培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時。最后，使細胞暴露于藍光30秒并再培養(yǎng)24、48和96小時。試驗期間用鋁箔對細胞進行光保護。
熒光顯微術用Zeiss倒置顯微鏡Axiovert200分析細胞，該顯微鏡配備了FITC濾光片(450-490nm BP激發(fā)濾光片、510nm FT分光器、和515-565nm LP發(fā)射濾光片)、羅丹明濾光片(546/12nm BP激發(fā)濾光片、580nm FT分光器、和590nm LP發(fā)射濾光片)、和DAPI濾光片(365/12nm BP激發(fā)濾光片、395nm FT分光器、和397nm LP發(fā)射濾光片)。用Carl ZeissAxioCam HR，Version5.05.10和AxioVision3.1.2.1軟件合成圖象。使用細胞器特異性標志物確認細胞內(nèi)PNA定位。用熒光顯微鏡和LysoTrackerRed DND-99(Molecular Probes，Eugene OR)確定溶酶體定位。用HoechstH33342(Molecular Probes，Eugene OR)確定核定位。
流式細胞術分析細胞用胰酶處理，離心，重懸于400μl培養(yǎng)基中，用50μm尼龍網(wǎng)濾器過濾，隨后用FACS-Calibur(Becton Dickinson)流式細胞儀分析。對于每個樣品收集10.000次事件。用氬激光器(15mW，488nm)激發(fā)后通過510-至530-nm濾光片測量FITC標記的PNA。通過在前向散射對側向散射門控將死細胞與單個活細胞區(qū)分開。數(shù)據(jù)用CELLQuest軟件(Becton Dickinson)分析。
Western印跡，在含150mM NaCI和0.1％NP-40以及2g/ml胃蛋白酶抑制劑(pepstatin)、抑蛋白酶肽(aprotinin)il；(Sigma Chemical company，St.Louis，MO)和亮抑酶肽(leupeptin，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)的50mM Tris-HCI(pH7.5)中制備蛋白質(zhì)裂解物。每種樣品的總蛋白裂解物用12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并根據(jù)制造商說明轉移到lmmobilon-P膜(Millipore，Bedford，MA)上。作為加樣和轉移對照，用0.1％酰胺黑對膜染色。隨后將膜在20mM Tris-HCl(7.5)(其中含0.5M NaCl和0.25％Tween20(TBST)以及10％干奶粉(封閉液))中孵育，然后在含5％干奶粉的TBST中與兔多克隆抗S100A4(1∶300稀釋，DAKO，Glostrup，Denmark)和小鼠單克隆抗α-微管蛋白(1∶250稀釋，Amersham Life Science，Buckinghamshire，England)一起孵育。洗滌后，使用綴合了辣根過氧化物酶的二抗(1∶5000稀釋，DAKO，Glostrup，Denmark)核加強的化學發(fā)光系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)觀察免疫反應性蛋白質(zhì)。S100A4蛋白質(zhì)水平以對照樣品的百分比形式報告，α-微管蛋白用作加樣對照。
用MTS測試測量細胞活力將100μl細胞置于96孔板中并在37℃生長24小時。也包括不含細胞的陰性對照。每孔每100μl加20μl MTS試劑(四唑鹽)，在暗處在37℃培養(yǎng)2-4小時。然后在490nm讀吸光度。
實時逆轉錄酶PCR如上所述培養(yǎng)和處理細胞。光化學處理以后，將細胞與不同的PNA一起孵育96小時，然后收獲細胞用于分離RNA。根據(jù)制造商說明用GenElute哺乳動物總RNA小量制備試劑盒(Sigma-Aldrich，Steinheim，GER)分離細胞總RNA。為進行cDNA合成，對每個樣品制備引物混合物，其中含50pmol oligo-dT、3μg總RNA、和dH2O至12μl?；旌衔镌?5℃變性5分鐘，然后迅速在冰上冷卻并與18μl反應混合物混合至終濃度1X第一鏈緩沖液(Invitrogen)、10mM DTT、0.3mM dNTP、6.5ng/μl酵母tRNA和200U(6.6U/μl)Superscript II酶。在42℃進行cDNA合成50分鐘，隨后在72℃滅活15分鐘。
為進行PCR分析，從每個cDNA樣品制備三個十倍稀釋液，并且所有反應一式三份進行，使得每個cDNA樣品準備共9個PCR管。PCR在總體積25μl中進行，其中使用終濃度3mM MgCl2、200μM dNTP、1X PCR緩沖液、0.5U Platinum Taq、2μl cDNA、和300nM S100A4基因特異性引物(正向引物5′-AAGTTCAAGCTCAACAAGTCAGAAC-3′(SEQ ID NO9)和反向引物5 ′-CATCTGTCCTTTTCCCCAAGA-3′(SEQ ID NO10))。此外，按iCycler需要向所有反應中摻入1nM熒光素。用最終稀釋度1∶100000的SYBRGreen I(Molecular Probes，Eugene OR)作為檢測試劑獲得實時結果。擴增循環(huán)如下95℃初步變性5分鐘，隨后40個產(chǎn)物擴增循環(huán)的95℃15秒/60℃30秒。用光學96孔板和iCycler iQ檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，CA制造)實現(xiàn)PCR產(chǎn)物的實時檢測。每個樣品一式三份進行。為了檢測假產(chǎn)物或引物二聚體(其同樣被SYBRGreen摻入標記并因而將影響熒光閱讀)的擴增，在PCR擴增操作結束時包括熔鏈曲線即變性時熒光損失。將每個樣品的熔鏈特性譜與對標準樣品獲得的熔鏈特性譜進行比較。
cDNA陣列用于本文中的微陣列是用Micro Grid II機器人打印機(Bio Robotics，Cambridge，UK)內(nèi)部制造。這些15k人cDNA陣列打印在氨基硅烷包被的玻片(CMT GAPS，Corning Life Science，Corning，NY)上。有關陣列內(nèi)容的詳情請參考http://www.med.uio.no/dnr/microarray/index，html。
RNA純化和標記如上述分離用PCI和不同PNA處理的培養(yǎng)細胞的總RNA。為了分析因S100A4基因沉默所致的可能的下游影響，每單個陣列與來自用活性PNA(PNA382或453)和混雜或對照PNA(PNA452(對照)或454(混雜))處理的細胞的cDNA雜交。從來自每種所述細胞培養(yǎng)物的50μg總RNA產(chǎn)生cDNA，并在逆轉錄期間用Cy3-或Cy5-dCTP(Amersham PharmaciaBiotech AB)進行差異標記。反應混合物含錨定的oligo-dT20聚體(20-mer)引物(4μg)、40U RNAsin(Promega，Madison，WI)、第一鏈緩沖液、0.01M DTT、0.5mM dATP、dCTP、dGTP和0.2mM dTTP。混合物在65℃水浴中孵育5分鐘。然后將管轉移至42℃加熱塊中，除了400USuperscript II(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)以外還向各管中加入4μl(4nmol)任一熒光團。60分鐘后，用5μl 0.5M EDTA(pH8.0)滅活反應。為了水解殘留的RNA，加入10μl 1M NaOH，并在65℃加熱管子60分鐘。加入25μl 1M Tris-HCl(pH7.5)以中和混合物。用0.5x TE緩沖液(pH7.5)稀釋標記的Cy3-和Cy5-cDNA，隨后用Microcon YM柱(Ambion，Millipore Corporation，Bedford，MA)除去未摻入的染料并濃縮樣品。
玻片預雜交玻片在150kJ紫外交聯(lián)60秒。使用前即刻，將玻片預雜交以滅活玻片表面上的活性基團并洗除未結合的DNA。將充滿預雜交溶液的小玻片容器在50℃預熱30分鐘。雜交溶液含1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)第五組分(Sigma-Mdrich)、3.5x SSC和0.1％SDS。將玻片在50℃預熱的溶液中孵育25分鐘；之后立即將玻片轉移至潔凈的玻片架并在室溫超純水中攪拌漂洗兩次。為了將DNA變性為單鏈形式，將玻片在剛煮沸的水中攪拌2分鐘，然后迅速浸入2-丙醇并攪拌30秒。離心干燥玻片。
雜交和掃描45μl雜交混合物由15μl各種標記探針、16μg poly(A)(AmershamPharmacia Biotech AB)、4μg酵母tRNA、1.25x Denhart’s溶液、5μg BSA、3.5x SSC(pH7.5)和0.3％SDS組成。最終混合物在100℃加熱2分鐘并在13k離心10分鐘，隨后施加到在LifterSlip(Erie Scientific Company，Portsmouth，NH)之下的微陣列玻片上。然后將玻片置于ArraylT雜交室(Telechem，Sunnyvale，CA)中并在65℃水浴中孵育過夜。掃描之前，在0.5x SSC和0.1％SDS溶液中除去蓋玻片。然后在室溫下相同溶液中洗滌玻片兩次，每次5分鐘，隨后在0.06x SSC洗滌溶液中洗滌兩次，每次5分鐘。最后離心干燥玻片。用ScanARRAY4000(Packard Biosciences，Biochip Technologies LLC，Meriden，CT)掃描儀進行掃描，用GenePix Pro4.0軟件(Axon Instruments Inc.，Union City，CA)從圖象獲取數(shù)據(jù)。用BASE(Lao H et al BioArray Software EnvironmentA Platform forComprehensive Management and Analysis of Microarray Data GenomeBiology3(8)software0003.1-0003.6(2002))保存、分析和處理數(shù)據(jù)，通過從點中像素的平均值中減去局部背景中象素的中值來計算每個點的針對背景校正過的強度。
實施例1PNA分子的細胞攝入第一組實驗關注細胞攝入問題，即連接至具有不同凈電荷的短肽上的PNA是否侵入不同人癌細胞系的細胞膜。為檢測細胞內(nèi)的化合物，用FITC在N或C端標記PNA。表1詳細列出了研究中所用的PNA，包括它們的靶序列、化學修飾和電荷。
通過流式細胞術測量細胞攝入。連接至帶凈負電荷的肽上的PNA(PNA383)不侵入OHS細胞(圖1，-1凈電荷)因為即使24小時后仍幾乎沒有攝入帶負電分子，我們研究了通過電穿孔轉染細胞的可能性。在此情況下，PNA攝入仍非常差。與帶負電的PNA相比較，不帶電和沒有任何連接肽的中性PNA(PNA456)以及連接至具有中性凈電荷的肽上的PNA(PNA385)被低水平內(nèi)化(圖1，PNA385為0凈電荷，PNA456未示出)。
接下來我們研究了帶正電的PNA。當PNA連接至帶+1凈電荷的肽時(PNA384)觀察到明顯攝入(圖1，+1凈電荷)。然而，當我們將凈電荷增加至+5時(PNA381)，與+1PNA相比，我們觀察到細胞攝入幾乎增加5倍(圖1，+5凈電荷)。
在OHS、FEMXII和HeLa細胞中進行的以上實驗的結果總結于表2。
用染色來鑒定PNA分子的定位。利用連接至PNA分子的標記的熒光來鑒定PNA分子在細胞內(nèi)的位置。Hoechst染色和LysoTracker染色分別用于鑒定核和溶酶體區(qū)室。圖2A顯示，PCI之后，PNA分子在細胞內(nèi)分布。圖2B和C顯示PCI之后PNA分子分布至核中(即其分布與Hoechst染色一致)。
為了研究細胞攝入是否依賴于NLS肽的構象或僅僅依賴于電荷，我們將PNA連接至29個氨基酸長的具有+5凈電荷的線粒體輸入信號(PNA382)(圖3B)。作為PNA381(圖3A)的第二個對照，我們用替代性GHHHHHG(+5)序列(SEQ ID NO5，PNA457)替換原始NLS氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO3)(圖3C)。這三種不同PNA構建體的細胞攝入的相對水平與顯微觀察結果相同。所有情況下，PCI之后PNA都定位于核。當在HeLa和FEMXIII細胞中進行試驗時也是如此(圖3D和E)。
為了研究可能與NLS的定向相關的細胞攝入方面的任何可能差異，我們將肽連接至N-(PNA453)和C-端(PNA381)。不能觀察到細胞攝入水平的差異(圖4)。我們還測試了不同PNA及其在不同細胞系中的細胞攝入(HeLa、WiDr、293、OHS、FEMX5、SW620、HCT116、SaOs)，但沒有觀察到明顯差異(圖5)。
我們的數(shù)據(jù)表明，嵌合體PNA的攝入強烈依賴于肽分子的凈電荷，而不是其氨基酸構象。我們在此已經(jīng)表明，PNA分子的攝入隨綴合肽上凈正電荷變高而增加。
實施例2PNA攝入機制和定位為評價修飾PNA的攝入過程，我們首先研究其在不同溫度下的攝入。我們的結果顯示，盡管在37℃觀察到攝入，但在4℃未觀察到內(nèi)化(圖6)。而且，我們的熒光顯微數(shù)據(jù)顯示，在剛好核膜附近的顯著區(qū)域有類似熒光點的顆粒(圖6B)。最后，我們觀察到PNA構建體和內(nèi)體/溶酶體標志物(LysoTracker Red DND)的細胞內(nèi)定位之間的完全重疊(數(shù)據(jù)未示出)。
我們的結果表明這涉及到細胞內(nèi)吞。這可能是由通過包被小泡的內(nèi)化而引起。在我們的試驗中，我們的PNA的攝入在4℃被阻斷。我們的結果得到Kuismanen和Saraste的發(fā)現(xiàn)(Kuismanen E et al.(1989)Methods.Cell.Biol.32，257-274)的支持，其中已經(jīng)表明細胞內(nèi)吞可在低溫下被阻斷。溫度依賴性進一步得到PNA和LysoTracker的重疊定位的支持。
細胞內(nèi)吞可以分為幾種主要類型網(wǎng)格蛋白依賴性受體介導的，非網(wǎng)格蛋白依賴性，和細胞吞噬作用。然而，要發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)吞的具體類型必須進行進一步研究。一種推測是我們的PNA分子通過非網(wǎng)格蛋白依賴性細胞內(nèi)吞被攝入，因為沒有網(wǎng)格蛋白依賴性受體介導的細胞內(nèi)吞的證據(jù)。PNA已經(jīng)被連接至具有相同電荷的不同肽信號上；結果是相同的，這指示攝入不依賴于特定受體。其結論是與帶負電的PNA分子相比，帶正電的PNA分子更可能與細胞膜緊密結合，這進而將增加細胞內(nèi)吞性攝入。
實施例3PCI處理的效果我們的顯微數(shù)據(jù)表明具有中性/正凈電荷的PNA定位于內(nèi)體/溶酶體中。我們的顯微數(shù)據(jù)清楚表明，PCI處理之后，PNA構建體從內(nèi)體/溶酶體被轉位至核(圖2和3)。為了證實PNA的重定位，我們也使用了Hoechst核染料，如上所述，見圖2和3。
實施例4PNA分子的核輸入對于基于核的PNA靶向，必須克服主要障礙最重要的一些是細胞膜、細胞內(nèi)吞膜和核膜。PNA從內(nèi)體/溶酶體釋放以后，我們希望研究NLS肽的定位能力以及NLS肽的定向對核定位是否重要。為了解決這些問題，我們將NLS肽偶聯(lián)至PNA的N端和C端。我們的顯微數(shù)據(jù)表明，在N或C端連接至NLS肽的PNA都被轉位至核(圖4)。通過增加曝光時間和FITC/PNA構建體的濃度，我們觀察到熒光信號增加。為了分析不同類型熒光團之間的任何可能不一致性，我們將PNA的熒光團從FITC改變?yōu)榱_丹明(Rho)。然而這沒有引起定位的可觀察的變化(圖7)。我們還將FITC連接至PNA的N端或C端，同樣位置或效率也沒有變化(圖4)。
接下來我們研究了PKKKRKV(SEQ ID NO3)的核定位能力僅僅是由于PNA電荷的變化，還是由于特定氨基酸序列。為了控制NLS肽的核定位能力，我們測試了具有替代性肽的PNA，所述替代性肽具有相同凈電荷(+5)但具有替換氨基酸(PNA457，圖3C)。我們還研究了中性PNA的核輸入能力(PNA456和385，分別是圖8C和B)，以及連接至靶向線粒體和過氧化物酶體的輸入肽信號的PNA(PNA382、PNA384，分別是圖3B和8D)。令人驚奇地，我們的數(shù)據(jù)證明，測試的所有中性和帶正電的PNA在PCI處理之后轉位入核中。
總而言之，我們的結果證明，具有中性/正凈電荷的PNA不僅自發(fā)以高水平從培養(yǎng)基轉位至溶酶體，而且還在光化學處理之后從胞質(zhì)溶膠轉位至細胞核。中性和帶正電的PNA之間的效率有變化，這可能是細胞攝入的變化而非核攝入的變化的直接結果。
實施例5用PNA/PCI抑制S100A4表達為了評價PNA作為抑制劑的能力，我們合成了針對S100A4基因上三種不同靶位點的PNA。我們選擇靶向5’-UTR末端的嵌合體14bp全嘌呤PNA(PNA381)，靶向起始密碼子(PNA200)和第二個外顯子內(nèi)編碼區(qū)(PNA452)的兩個20bp混合堿基PNA。我們希望研究S100A4是否能以劑量依賴性方式下調(diào)。因此我們將OHS細胞暴露于不同濃度(100-2000nM)的PNA200持續(xù)96小時，并通過Western印跡檢查S100A4蛋白的活性和存在情況(圖9A和F)。我們的數(shù)據(jù)清楚證明了S100A4活性的劑量依賴性抑制，用PNA200從100nM濃度開始信號減弱。相關的代表性對照顯示于圖9D。而且，我們的結果顯示1000nM PNA200會引起S100A4表達的最大抑制。根據(jù)測量線粒體完整性作為細胞活力量度的MTS數(shù)據(jù)(詳細見實驗操作部分)，當使用低于2000nM的PNA濃度時，沒有可觀察到的毒性(圖10，第5和6行)。因此，1000nM PNA濃度被選用于所有后面的試驗。
為了評價S100A4蛋白水平是否以時間依賴性方式下調(diào)，我們將細胞與PNA一起孵育24、48和96小時(圖9B)。24小時后，S100A4蛋白水平降低45％(PNA200)和35％(PNA381)。暴露更長時間(48小時)后，與對照水平相比表達分別降低至25％(PNA200)和35％(PNA381)。最后，PCI之后與PNA一起孵育96小時的細胞中，與對照相比，S100A4表達降低至10％(PNA200)和20％(PNA381)(圖9B、C和E)。我們的數(shù)據(jù)指出，靶向至AUG起始位點(PNA200)和5’UTR末端(PNA381)的PNA均抑制S100A4表達，并且針對AUG起始位點的PNA是最有效的抑制劑。相比較而言，經(jīng)Western印跡測定，我們未檢測到靶向第二個外顯子的PNA(PNA452)對S100A4表達的任何抑制(圖11)。
也測定了S100A4mRNA的相對表達。用PNA-AUG、PNA-5’-UTR和PNA-混雜進行PNA/PCI處理以后從OHS細胞分離總RNA。除了混雜PNA以外，還選用經(jīng)PCI處理的OHS細胞作對照。所有樣品被逆轉錄，用SYBRGreen I作為檢測試劑對cDNA稀釋物進行實時PCR分析。從相同稀釋物獲得的CT值顯示基因表達的差異很小。結果表示于表3。
實施例6用siRNA抑制S100A4表達我們將PNA抑制S100A4表達的能力與siRNA的相應能力進行比較。為分析siRNA轉染效率和分布，我們用羅丹明和FITC標記四種siRNA之一。接著我們測試了不同轉染試劑和濃度。我們的顯微數(shù)據(jù)顯示用FuGene、Lipofectamin、siPORT或Lipofectin無攝入(數(shù)據(jù)未示出)。然而已經(jīng)證明用DOTAP和聚-L-賴氨酸有攝入，其中聚-L-賴氨酸最有效。因此我們在隨后所有試驗中使用聚-L-賴氨酸。
在我們的試驗中，根據(jù)Elbashir等人((2001)，Genes Dev.15，188-200)設計siRNA。除了針對選定的靶基因所設計的siRNA以外，通過制造混雜siRNA來設計對照siRNA并且在GenBank中進行BLAST搜索以消除假雜交。OHS細胞與siRNA一起孵育不同時間和濃度，隨后用Western印跡測量S100A4蛋白質(zhì)水平。然而，在用20、50、100 nM靶向S100A4基因內(nèi)兩個區(qū)域的siRNA 24、48和96小時后，我們未觀察到S100A4表達的任何下調(diào)(數(shù)據(jù)未示出)。
由于其與DNA形成穩(wěn)定三鏈結構、鏈侵入或鏈置換復合物的能力，PNA可通過抑制轉錄過程來發(fā)揮作用。這種復合物可產(chǎn)生結構阻礙，阻斷RNA聚合酶的穩(wěn)定功能，并因此可作為反基因劑發(fā)揮作用。在翻譯水平，PNA反義作用是基于立體阻斷或者RNA加工、或者向胞質(zhì)溶膠的運輸、或者翻譯。PNA不能激活RNase H消除了非靶標mRNA的非意向降解的可能性。另外，缺少帶負電的骨架防止了PNA與細胞內(nèi)外的很多蛋白質(zhì)的結合，所述蛋白質(zhì)通常結合帶負電的大分子。PNA381的抑制作用與Doyle等人(2001，同上)一致，他們證明了靶向至5’-UTR末端的PNA是熒光素酶mRNA的高效抑制劑。而且，在無細胞提取物中進行的翻譯試驗表明，當靶向RNA的AUG起始密碼子附近時，PNA以劑量依賴性方式阻斷翻譯(Knudsen&Nielsen(1996)，Nucleic Acids Res.24，494-500)。當PNA靶向編碼區(qū)中序列時沒有觀察到作用。這些結果支持我們的關于PNA200和PNA452的結果，它們分別靶向S100A4的AUG起始位點和第二個外顯子(圖9和11)。暴露于混雜PNA201/202的細胞中、和無PNA但有光敏劑的對照細胞中S100A4表達的模式幾乎與未處理細胞相同。此外，我們測試了有或無光敏劑的OHS細胞中S100A4表達。同樣未觀察到蛋白質(zhì)水平的差異(圖11A)。
實施例7實時逆轉錄PCR分析為研究基因沉默的背后機制，我們在PNA/PCI處理前后用實時RT-PCR測量了S100A4mRNA相對水平。其目的是研究我們的PNA分子是在轉錄、還是在蛋白質(zhì)合成過程的一些其他水平發(fā)揮作用。從擴增圖可以看到，處理后96小時從經(jīng)PNA/PCI處理的樣品和未處理對照獲得的CT值之間沒有明顯差異(圖12)?；祀sPNA201分別用作PNA200和PNA381的內(nèi)部PNA對照。
之前，Demidov等人((1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，92，2637-2641)研究了PNA結合至雙鏈DNA的動力學和機制。結果表明，三鏈侵入復合物的形成依賴于全嘧啶PNA與全嘌呤DNA靶的結合。也可以形成第二種復合物，稱為雙鏈侵入復合物，但是用全嘌呤PNA。似乎僅與富含胞嘧啶的全嘧啶PNA才形成常規(guī)三鏈體。這些結果暗示我們已經(jīng)使用的能靶向雙鏈DNA的唯一PNA分子是靶向至5’-UTR末端的全嘌呤PNA381。然而，即使我們的全嘌呤PNA(PNA381)被設計成結合DNA和RNA二者，實時RT-PCR數(shù)據(jù)指示它在翻譯水平發(fā)揮作用。根據(jù)該理論，具有混合堿基組成的其他PNA不能形成抑制轉錄過程所必需的三鏈或雙鏈侵入復合物。這與我們的實時RT-PCR結果相一致，并且支持了混合堿基PNA(PNA200)不能抑制轉錄過程的理論。
實施例8微陣列分析為了在cDNA微陣列試驗中檢查S100A4抑制對基因轉錄的可能作用，我們比較了PNA處理細胞以及同時接受完全相同的處理但用混雜PNA處理的細胞。檢查了針對該基因上兩個靶序列的PNA分子。所有試驗一式兩份進行。僅少數(shù)基因一致性地顯示表達的相對變化超過兩倍。使用等級聚類分析，鑒定了一個類型，其在用引起S100A4水平最大降低的PNA處理時顯示一致性上調(diào)的模式，用效力較低的PNA處理導致較小上調(diào)。該類型含有9個已命名基因(GAS2、UBE4B、FREQ、SHC1、PON3、CTSD、WNT3A、SCD和RAB6A)。這些基因參與包括脅迫應答、凋亡和鈣結合等過程。用實時PCR驗證了轉錄下調(diào)的水平。為了證明所觀察到的變化是PNA對靶基因的序列特異性作用的結果，對所述過程的每一步驟分別進行的實時PCR支持了該結論(數(shù)據(jù)未示出)。
作為利用PNA/PCI/LS進行系統(tǒng)性基因沉默的能力的第一個證據(jù)，我們用cDNA微陣列檢查了全面mRNA表達水平變化。因為PNA添加劑和/或光化學處理對基因表達的影響目前仍未知，我們用經(jīng)混雜PNA處理的細胞作為參考途徑進行微陣列試驗。這是為了將處理方案的潛在的復雜影響最小化。因為仍有可能存在處理、暴露時間等的微小變化，我們對處理過程的每一步進行實時PCR，以排除所觀察到的表達變化是處理的結果而不是S100A4特異性作用。具體來說，PCI可導致涉及包括凋亡等過程的轉錄變化(Ferreira S.D.et al.，2004，Lasers Med Sci18(4)207-12)。因此，作為通用工具，PNA/PCI/LS將被認為不太適于監(jiān)測與這些過程相關的基因的基因沉默。然而，該策略有很多誘人的方面，比如易于靶序列設計、PNA穩(wěn)定性、高通量合成和施用，并且定時遞送使得該系統(tǒng)是細胞系的系統(tǒng)性體外沉默的良好選擇。也已經(jīng)證明siRNA基因沉默是高度可行的策略，但在靶序列設計和穩(wěn)定性方面有一些問題(Amarzguioui M et al.，2004Biochem.Biophys.Res.Commun.316(4)1050-8)。
S100A4調(diào)節(jié)基因表達的能力一般是未知的，但因為這是一種推測參與細胞骨架重建的蛋白質(zhì)，并且因此是細胞結構蛋白質(zhì)而非轉錄調(diào)節(jié)因子，預期影響會相對較小。因此，就所影響的基因的幅度和數(shù)量來說，所觀察到的轉錄物水平變化相對較小。在可以觀察到一致性變化的基因中間，frequenin特別受關注，它是一種具有四個EF手的鈣結合蛋白(可從www.abcam.com獲得多克隆抗體)。
實施例9用PNA/PCI基因沉默黑素瘤細胞系(FEMX V)中的酪氨酸酶基因(TYR)我們已經(jīng)設計了針對參與黑色素生物合成的不同基因的PNA；包括酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關蛋白1(TRP-1)、和小眼性轉錄因子(MITF)。我們的目的是通過用PNA/PCI方法沉默所有三種基因。TYR、TRP-1和MITF彼此連接，使得它們可作為特別有趣的模式系統(tǒng)。因為這些基因互相連接，研究當我們敲低MITF時在TYR/TRP-1蛋白質(zhì)水平的可能影響將特別有意思。
細胞系和培養(yǎng)條件FEMX V(黑素瘤)細胞在挪威鐳醫(yī)院建立。將細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(Bio Wittaker，Verviers，Belgium)中。所用培養(yǎng)基不含抗生素，但添加10％胎牛血清(FCS；PAA Laboratories，Linz，Austra)和2mM L-谷氨酰胺(Bio Whittaker，Verviers，Belgium)。細胞在含5％CO2的加濕氣氛中于37℃生長和培養(yǎng)。檢驗所有細胞，發(fā)現(xiàn)它們對支原體感染都是陰性。
PNA設計從Oswell DNA Service(Southampton，UK)獲得酪氨酸酶(TYR)基因特異性PNA，包括混雜PNA。在兩端進行修飾(用FAM和NLS序列)?；谙惹暗腜NA抑制研究選擇針對AUG起始密碼子的靶標。將序列與人基因組數(shù)據(jù)庫在BLAST搜索中進行比對，以消除與其他基因具有顯著同源性的那些序列。
使用以下PNA序列CTTTAGTTATAGCTCTCCCC(TYRSCR-SEQ ID NO11)AATGTTTGAAGAACTCAATA(TYR5UTR-SEQID NO12)CAGCCAGGAGCATTCTTCCT(TYRATG-SEQ ID NO13)每種PNA分子用FAM在N端(5’端)和用NLS肽在C端(3’端)進行標記，即FAM-L-L-PN A-L-L-PKKKRKV，其中L是連接子(2-氨基乙氧基-2-乙氧基乙酸(AEEA))。
通過將PNA溶解于0.1％三氟乙酸中制備儲存溶液(1mM)，使用前加熱至50℃以確保PNA完全溶解。使用前，進一步將PNA在無菌水中稀釋成工作溶液(100mM)并保存于-20℃。
如實施例6所述用PCI方法將PNA分子施加給FEMX V細胞，通過Western印跡確定蛋白質(zhì)水平。
圖13所示的結果表明，通過PNA/PCI方法可以沉默TYR，然而，進一步的優(yōu)化將導致更強的基因沉默作用。具體來說，第7泳道顯示在與10mM靶向起始密碼子區(qū)的PNA一起孵育后TYR蛋白質(zhì)被下調(diào)。
序列表<110>挪威鐳醫(yī)院研究基金會<120>通過光化學內(nèi)化(PCI)將綴合帶正電肽的PNA分子導入胞質(zhì)溶膠和/或細胞核的方法<130>42.1.82647/01<160>13<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>HIV tat內(nèi)化肽<400>1Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5<210>2<211>16<212>PRT
<213>果蠅屬(Drosophila sp.)<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>觸角足細胞侵入性肽<400>2Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5 10 15<210>3<211>7<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>核定位信號<400>3Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5<210>4<211>7<212>PRT<213>人工的/未知
<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>混雜的核定位信號<400>4Lys Lys Val Lys Pro Lys Arg1 5<210>5<211>7<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>帶正電的肽<400>5Gly His His His His His Gly1 5<210>6<211>3<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>帶正電的肽(靶向過氧化物酶體)<400>6Ala Lys Leu1<210>7<211>29<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>帶正電的肽(線粒體靶向序列)<400>7Met Ser Val Leu Thr Pro Leu Leu Leu Arg Gly Leu Thr Gly Ser Ala1 5 10 15Arg Arg Leu Pro Val Pro Arg Ala Lys Ile His Ser Leu20 25<210>8<211>7<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>帶正電的肽(逆NLS)<400>8Val Lys Arg Lys Lys Lys Pro1 5<210>9<211>25<212>DNA<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>S100A4基因特異性正向引物<400>9aagttcaagc tcaacaagtc agaac25<210>10<211>21<212>DNA<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()
<223>S100A4基因特異性反向引物<400>10catctgtcct tttccccaag a21<210>11<211>20<212>DNA<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>PNA分子-混雜的PNA序列<400>11ctttagttat agctctcccc20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>PNA分子-針對酪氨酸酶5′UTR的PNA序列
<400>12aatgtttgaa gaactcaata20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>PNA分子-針對酪氨酸酶起始密碼子的PNA序列<400>13cagccaggag cattcttcct20
權利要求
1.將PNA分子導入細胞的胞質(zhì)溶膠的方法，包括使所述細胞與PNA分子和光敏劑接觸，和用可有效激活所述光敏劑的波長的光照射細胞，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽上。
2.將PNA分子導入細胞的核內(nèi)的方法，包括使所述細胞與PNA分子和光敏劑接觸，和用可有效激活所述光敏劑的波長的光照射細胞，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽上。
3.權利要求1或2的方法，其中所述PNA分子長度小于25個堿基。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述PNA分子是反義分子，與基因互補或是探針。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述PNA分子的導入是在與細胞孵育24小時后引起靶基因表達降低超過10％的濃度。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中所述細胞是真核細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中所述光敏劑選自TPPS4、TPPS2a、AlPcS2aTPCS2a、5-氨基乙酰丙酸和5-氨基乙酰丙酸的酯類。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中所述帶正電的肽是連續(xù)氨基酸的聚合物。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中所述帶正電的肽長度為3-30個氨基酸。
10.權利要求1-9任一項的方法，其中所述帶正電的肽被通過共價連接直接綴合至所述PNA分子。
11.權利要求1-10任一項的方法，其中所述帶正電的肽具有+1至+10的電荷，優(yōu)選+3至+6。
12.權利要求1-11任一項的方法，其中所述帶正電的肽包含序列Xn-(Y)m-Xo，其中X是中性殘基和Y是帶正電的殘基，所述殘基在其出現(xiàn)的每個位置可以相同或不同，并且n、m和o是≥1的整數(shù)。
13.權利要求12的方法，其中Y在每個位置上相同并且是K、R或H。
14.權利要求1-13任一項的方法，其中所述帶正電的肽是SEQ ID NO7MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL、SEQ ID NO6 AKL或SEQ ID NO5GHHHHHG。
15.權利要求1-14任一項的方法，其中超過一種類型的PNA分子被同時導入，其中每種類型具有不同序列。
16.權利要求1-15任一項的方法，其中所述光敏劑和所述PNA分子之一或兩者都被連接至或結合于或綴合至一或多種載體分子或靶向分子。
17.權利要求1-16任一項的方法，其中所述載體分子或靶向分子是聚陽離子、陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)轉染劑或肽。
18.權利要求1-17任一項的方法，其中所述光敏劑和所述PNA分子被一起或依次施加至所述細胞。
19.權利要求1-17任一項的方法，其中所述方法如此實施使所述細胞與光敏劑接觸，使所述細胞與待導入的PNA分子接觸并用可有效激活所述光敏劑的波長的光照射所述細胞，其中所述照射在所述PNA分子被細胞性攝入至含所述光敏劑的細胞內(nèi)區(qū)室之前實施，優(yōu)選在所述分子被細胞性攝入至任何細胞內(nèi)區(qū)室之前實施。
20.權利要求1-19任一項的方法，其中照射可進行長達60分鐘。
21.權利要求1-20任一項的方法，其在體外或離體進行。
22.通過權利要求1-21任一項的方法將PNA分子導入含靶基因的細胞來抑制所述靶基因的轉錄或表達的方法，其中所述PNA分子特異性結合所述靶基因或者其復制或轉錄產(chǎn)物。
23.鑒定或評價靶基因或者其復制或轉錄產(chǎn)物的水平的方法，所述方法包括通過權利要求1-21任一項的方法將PNA分子導入含所述靶基因或者其復制或轉錄產(chǎn)物的細胞內(nèi)，其中所述PNA分子特異性結合所述靶基因或者其復制或轉錄產(chǎn)物，和評價結合PNA的水平以確定所述靶基因或者其復制或轉錄產(chǎn)物的存在或水平。
24.在細胞中實現(xiàn)靶基因、優(yōu)選缺陷基因的位點特異性誘變或修復的方法，所述方法包括通過根據(jù)權利要求1-21任一項的方法將PNA分子和含期望序列的寡核苷酸分子導入含所述靶基因的細胞內(nèi)，其中所述PNA分子特異性結合所述靶基因以形成PNA鉗。
25.診斷疾病、病況或障礙的方法，包括根據(jù)權利要求1-21任一項的方法將PNA分子導入細胞，其中所述PNA分子特異性結合靶基因或者其復制或轉錄產(chǎn)物，所述靶基因或者其復制或轉錄產(chǎn)物指示所述疾病、病況或障礙的存在情況，和評價結合PNA的水平以確定所述疾病、病況或障礙的存在、階段或預后。
26.從下調(diào)、修復或突變一或多種基因中受益的疾病的治療方法，包括通過權利要求1-21任一項的方法將PNA分子導入細胞，其中所述疾病優(yōu)選是癌癥、囊性纖維化、心血管疾病、病毒感染、糖尿病、肌營養(yǎng)不良性側索硬化癥、亨亭頓氏病或阿爾茨海默病。
27.含PNA分子的細胞或細胞群體，所述PNA分子已被內(nèi)化至所述細胞的胞質(zhì)溶膠或核內(nèi)，所述細胞可通過權利要求1-21任一項的方法獲得，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽上。
28.包含PNA分子和任選分開地光敏劑的組合物，其中所述PNA分子被綴合至帶正電的肽上，并優(yōu)選如權利要求3、4或8-14任一項所定義。
29.包含根據(jù)權利要求27的細胞或細胞群體的組合物。
30.權利要求28或29的組合物，用于治療，優(yōu)選癌癥或基因治療。
31.權利要求1-4或8-14任一項定義的PNA分子在制備用于通過改變患者中一或多種靶基因的表達來治療或預防疾病、障礙或感染的藥物中的用途。
32.根據(jù)權利要求27的細胞或細胞群體用于制造用于通過改變患者中一或多種靶基因的表達來治療或預防疾病、障礙或感染的組合物或藥物中的用途。
33.權利要求31或32的用途，其中所述藥物用于基因治療或癌癥治療。
34.治療或預防患者中疾病、障礙或感染的方法，包括根據(jù)權利要求1-21任一項的方法在體外、體內(nèi)或離體將PNA分子導入一或多種細胞中，和必要時將所述細胞施用給所述患者。
35.治療或預防患者中疾病、障礙或感染的方法，包括將權利要求27中定義的細胞或細胞群體施用給所述患者的步驟。
36.權利要求34或35的方法，其中所述方法用于治療癌癥或用于基因治療。
37.根據(jù)權利要求27的細胞或細胞群體作為篩選工具的用途。
38.篩選具有改變的基因表達模式的細胞的方法，包括a)分析權利要求27定義的細胞中靶基因或者一或多種其它基因的表達，其中所述PNA特異性結合所述靶基因或者其復制或轉錄產(chǎn)物并改變所述一或多種其它基因的表達；和b)將所述靶基因和/或一或多種其它基因的表達與參考細胞、優(yōu)選野生型細胞中所述基因的表達進行比較。
39.權利要求38的方法，其中所述靶基因的表達被降低至對照(野生型)水平的80％以下。
全文摘要
本申請涉及一種將PNA分子導入胞質(zhì)溶膠、優(yōu)選細胞核的方法，包括使所述細胞與PNA分子和光敏劑接觸，并用可有效激活光敏劑的波長的光照射細胞，其中所述PNA分子被綴合到帶正電的肽上。還描述了包含所述綴合PNA分子的組合物，用所述方法制造的細胞和所述方法的用途。
文檔編號A61K41/00GK101014713SQ200580022754
公開日2007年8月8日 申請日期2005年7月7日 優(yōu)先權日2004年7月7日
發(fā)明者埃溫·霍維格, 厄于斯泰因·福德斯塔德, 西古德·伯厄 申請人:挪威鐳醫(yī)院研究基金會