專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)膽固醇的酵母菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在真菌(Fungi)界的生物體中生產(chǎn)膽固醇。
膽固醇(參照

圖1)是最重要的動(dòng)物固醇。它是細(xì)胞膜的基本成分，在其中控制流動(dòng)性，并且存在于所有的動(dòng)物組織，特別是神經(jīng)組織中。
膽固醇是具有重要工業(yè)利益的產(chǎn)品。因而，它普遍用于化妝品工業(yè)。它也用于制藥工業(yè)，例如用于藥物遞送，以及用于細(xì)胞培養(yǎng)。
膽固醇也用于維生素D3的工業(yè)合成。這個(gè)維生素隨后被用于補(bǔ)充人類(lèi)食品(例如，用于乳制品)和動(dòng)物食料。膽固醇也可有利地用作動(dòng)物食料的添加劑，特別是用于飼養(yǎng)蝦的飼料。
目前，大多數(shù)市場(chǎng)化的膽固醇是從動(dòng)物組織提取的(很少量是通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)的)。2個(gè)主要的起始來(lái)源被用于提取膽固醇牛脊髓和為羊毛天然脂肪的羊毛脂。
動(dòng)物組織作為起始來(lái)源的用途產(chǎn)生了問(wèn)題。因?yàn)?，最近與對(duì)羊瘙癢病負(fù)責(zé)的朊病毒傳遞至牛(被稱(chēng)為在牛中BSE(牛海綿狀腦炎)的疾病)相關(guān)的問(wèn)題已經(jīng)使得當(dāng)使用動(dòng)物組織作為起始材料時(shí)需要格外小心。然而盡管采取了措施，傳遞病原體的風(fēng)險(xiǎn)仍然不能被完全排除。因此極為有利的是擁有不是來(lái)自動(dòng)物組織的膽固醇來(lái)源。
本發(fā)明的目的是提供就健康觀點(diǎn)來(lái)說(shuō)是安全的膽固醇的豐富來(lái)源。本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地表明，轉(zhuǎn)換真菌中天然生產(chǎn)的麥角固醇以生產(chǎn)膽固醇是有可能的。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及自主生產(chǎn)膽固醇的真菌界的生物體。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及如上定義的真菌界的生物體，其中后者是被遺傳改變的。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及如上定義的真菌界的生物體，其中后者從單一碳源生產(chǎn)膽固醇。
本發(fā)明也涉及如上定義的真菌界的生物體，其表達(dá)7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶。更特別地，本發(fā)明涉及如上定義的生物體，其中固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)失活和/或C-22固醇去飽和酶已經(jīng)失活。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及如上定義的真菌界的生物體，其中7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶的表達(dá)是通過(guò)該生物體的轉(zhuǎn)化獲得的。
本發(fā)明也涉及如上定義的真菌界的生物體，其中固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶的失活是通過(guò)基因失活進(jìn)行的和/或C-22固醇去飽和酶的失活是通過(guò)基因失活進(jìn)行的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及如上定義的真菌界的生物體，其選自子囊菌門(mén)，更特別地選自酵母(Saccharomycotina)亞門(mén)，更特別地選自酵母綱或裂殖酵母(Schizosaccharomycetes)綱，更特別地選自酵母目或裂殖酵母目，更特別地選自酵母科或裂殖酵母科，更特別地選自酵母屬或裂殖酵母屬。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及如上定義的真菌界的生物體，其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)種的酵母。
本發(fā)明也涉及用于生產(chǎn)非動(dòng)物起源的膽固醇的方法，包括培養(yǎng)如上定義的生物體。更特別地，在這個(gè)方法中，由培養(yǎng)生物體組成的步驟之后是包括提取膽固醇的步驟。優(yōu)選，膽固醇的提取是用非水溶性溶劑進(jìn)行的。
更特別地，在如上定義的方法中，皂化步驟是在膽固醇提取之前進(jìn)行的。更特別地，在如上定義的方法中，由機(jī)械研磨細(xì)胞組成的步驟是在皂化或膽固醇的提取之前進(jìn)行的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及如上定義的真菌界的生物體用于生產(chǎn)以13C或14C標(biāo)記的膽固醇、或其代謝中間物中的一種、或固醇混合物的用途。
本發(fā)明也涉及用于生產(chǎn)以13C或14C標(biāo)記的膽固醇、或其代謝中間物中的一種、或固醇混合物的方法，包括下列步驟在13C-標(biāo)記或14C-標(biāo)記的底物上培養(yǎng)如上定義的真菌界的生物體，以及提取所述的膽固醇、或其代謝中間物中的一種、或固醇混合物。
本發(fā)明也涉及用于生產(chǎn)利用同位素標(biāo)記在不同位置進(jìn)行標(biāo)記的膽固醇、膽固醇中間物或膽固醇代謝物的同位素混合物的方法，包括在標(biāo)記的底物，以及然后是未標(biāo)記的底物上培養(yǎng)如上定義的真菌界的生物體，選擇這些底物每一個(gè)上的培養(yǎng)時(shí)間以獲得明確的同位素分布圖譜。本發(fā)明也涉及利用同位素標(biāo)記在不同位置進(jìn)行標(biāo)記并且具有明確同位素分布圖譜的膽固醇、膽固醇中間物或膽固醇代謝物的、可通過(guò)這個(gè)生產(chǎn)方法獲得的分子樣品。
本發(fā)明還涉及包含利用同位素標(biāo)記在不同位置進(jìn)行標(biāo)記并且具有明確同位素分布圖譜的膽固醇、膽固醇中間物或膽固醇代謝物的同位素混合物作為可追蹤標(biāo)記的組合物。更特別地，這個(gè)組合物旨在用于人或動(dòng)物的食品或治療領(lǐng)域。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在真菌界的生物體中生產(chǎn)膽固醇。在真菌中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)的膽固醇，因后者是動(dòng)物固醇。這些生物體細(xì)胞膜中的主要固醇是麥角固醇。
本發(fā)明使得在存在單一碳源時(shí)通過(guò)真菌增殖進(jìn)行膽固醇合成成為可能。因此本發(fā)明建議的方法使得以低成本獲得大量膽固醇成為可能，因?yàn)樵摲椒ɡ谜婢缟矬w的培養(yǎng)并且添加可容易地商業(yè)獲得的單一碳源。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“單一碳源”是指可被本領(lǐng)域技術(shù)人員用于真菌，特別是酵母正常生長(zhǎng)的碳源。特別指明的是多種可同化的糖，例如葡萄糖、半乳糖或蔗糖、或糖蜜，或這些糖的副產(chǎn)品。最特別優(yōu)選的單一碳源是乙醇和甘油。
生產(chǎn)是自主進(jìn)行的事實(shí)是指不需要為了獲得膽固醇而加入底物，但該生物體能夠只從起始的單一碳源進(jìn)行生產(chǎn)。也很清楚該菌株能夠利用位于代謝途徑上游的底物生產(chǎn)膽固醇，就此而言，本發(fā)明所述生物體的菌株包含為完成膽固醇生產(chǎn)的代謝途徑所需要的全部基因。
本發(fā)明特別涉及能夠從單一碳源自主生產(chǎn)膽固醇的遺傳改變的真菌界(真菌類(lèi))生物體。
為了使麥角固醇生產(chǎn)的天然代謝途徑向膽固醇生產(chǎn)轉(zhuǎn)化，真菌的某些遺傳改變可能是有效的。本發(fā)明因此涉及表達(dá)7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶的遺傳改變的真菌界生物體。如此改變的真菌界生物體的菌株生產(chǎn)膽固醇。本申請(qǐng)人實(shí)際上已經(jīng)能夠借助獲得的結(jié)果(參考本申請(qǐng)的實(shí)施例部分)模仿導(dǎo)致產(chǎn)生麥角固醇及其一些衍生物的代謝途徑(參考圖2)。7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶在真菌釀酒酵母中的表達(dá)可容許通過(guò)轉(zhuǎn)換部分的麥角固醇生物合成途徑來(lái)生產(chǎn)膽固醇。
7-脫氫膽固醇還原酶在國(guó)際酶分類(lèi)中擔(dān)負(fù)EC號(hào)1.3.1.21。在這個(gè)文件的其余部分，它也稱(chēng)為Δ-5，7-固醇-Δ-7-還原酶、7-DHC還原酶或固醇Δ-7-還原酶，并且也稱(chēng)為Δ-7固醇還原酶、Δ-7Red、Δ7還原酶或Δ7-還原酶。植物中天然狀態(tài)的這個(gè)酶催化，例如Δ-5，7-膽甾二烯醇依賴(lài)NADPH還原為Δ-5-膽甾烯醇，或催化在7-8位具有雙鍵的固醇中間物的還原(Taton和Rahier，1991)。編碼7-脫氫膽固醇還原酶的基因最初是在植物擬南芥中分離出來(lái)的；該相應(yīng)基因的分離和這個(gè)酶在釀酒酵母中的表達(dá)在專(zhuān)利EP 727 489中有描述。這個(gè)基因和蛋白質(zhì)的序列可以下列GenBank登錄號(hào)U49398獲得(Lecain等，1996)。
這個(gè)基因的某些同源物已經(jīng)在其他的物種中有描述。這些是例如，人類(lèi)中的同源基因(核苷酸序列可以GenBank登錄號(hào)AF034544獲得，蛋白質(zhì)序列可以GenBank登錄號(hào)AAC05086獲得)(Moebius等人，1998)；褐家鼠中的同源基因(核苷酸序列可以GenBank登錄號(hào)AB016800獲得，蛋白質(zhì)序列可以GenBank登錄號(hào)BAA34306獲得)。同源基因也已經(jīng)在雞Gallus gallus，Genbank參考號(hào)BM490402；爪蟾，Genbank參考號(hào)BI315007；斑馬魚(yú)Danio rerio，Genbank參考號(hào)BQ132664中鑒定出來(lái)。編碼Δ7固醇還原酶活性的基因也在植物中被發(fā)現(xiàn)，例如水稻，Oryza sativa，Genbank參考號(hào)CA753545；或番茄，Solanum tuberosum，Genbank參考號(hào)BF342071。編碼Δ7固醇還原酶活性的這個(gè)基因也能夠在原生生物Mastigamoeba balamuthi中被發(fā)現(xiàn)，Genbank參考號(hào)BE636562。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠容易地分離在其他生物體中編碼7-脫氫膽固醇還原酶的其他同源基因。他們可特別地參考在EP 727 489的實(shí)施例1中描述的克隆方法，該專(zhuān)利公開(kāi)了用于分離編碼具有Δ-5，7-固醇-Δ-7-還原酶活性的蛋白質(zhì)的cDNA的克隆方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可特別利用也在專(zhuān)利EP 727 489的實(shí)施例1中描述的活性分析來(lái)容易地測(cè)定相應(yīng)蛋白質(zhì)的7-脫氫膽固醇還原酶活性。
7-脫氫膽固醇還原酶在本發(fā)明所述的真菌界生物體中的表達(dá)可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式來(lái)獲得。這可特別涉及用包括由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，優(yōu)選同源的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，編碼7-脫氫膽固醇還原酶的開(kāi)放閱讀框和適合的轉(zhuǎn)錄終止子組成的表達(dá)盒的構(gòu)建體，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)法則轉(zhuǎn)化生物體。作為同源啟動(dòng)子，一般使用容許異源蛋白足夠且功能性的表達(dá)的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可以例如是，PGK啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、CYC1啟動(dòng)子、GAL10/CYC1啟動(dòng)子、TDH3啟動(dòng)子或TPI啟動(dòng)子。終止子可以例如是，磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的終止子。所述表達(dá)盒可以一個(gè)或多個(gè)拷貝的形式被整合進(jìn)入宿主的核或線粒體基因組，或可被酵母人工染色體(YAC)類(lèi)型的人工結(jié)構(gòu)攜帶，或可被游離基因元件，例如質(zhì)粒攜帶。為了影響這種類(lèi)型的表達(dá)，可使用例如Yarrowia lipolitica、乳酸克魯維氏酵母、或巴斯德畢赤酵母類(lèi)型的酵母。
優(yōu)選，表達(dá)的7-脫氫膽固醇還原酶是植物擬南芥的酶(在釀酒酵母中表達(dá)這個(gè)酶的方法的實(shí)例在專(zhuān)利EP 727 489中有描述)。然而，它可以是顯示相同酶活性的任何同源或非同源、天然或人工的酶。
3β-羥基固醇Δ24-還原酶，也稱(chēng)為DHCR24或24-脫氫膽固醇還原酶，天然催化24-去氫膽甾醇(膽-5，24-二烯醇)或者在側(cè)鏈上24-25位具有雙鍵的羊毛脂醇衍生物(例如14-去甲-羊毛脂醇，酵母甾醇，或膽-7，24-二烯醇)的還原，該還原對(duì)于尤其人類(lèi)中膽固醇的生物合成而言是必需的(HR.Waterham等人，2001)。在這一文件中的其余部分，該酶也稱(chēng)為Δ24-(25)固醇還原酶，Δ24-固醇還原酶。
編碼3β-羥基固醇Δ24-還原酶的基因最初是從人類(lèi)分離的；相應(yīng)基因的分離和這個(gè)酶在釀酒酵母中的表達(dá)在出版物HR.Waterham等人，2001中有描述。這個(gè)基因和蛋白質(zhì)的序列可以下列GenBank登錄號(hào)NM_014762和NP_055577獲得。
這個(gè)基因的某些同源物已經(jīng)在其他物種中有描述。它們是例如，小鼠(小家鼠)中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank號(hào)NM_053272獲得，其蛋白質(zhì)序列可以GenBank號(hào)NP_444502獲得)。同源物已經(jīng)在蠕蟲(chóng)秀麗線蟲(chóng)中有描述，特別的，互補(bǔ)DNA Genbank參考號(hào)AF026214。同源序列也已經(jīng)在植物中有描述，例如棉花，Gossypium hirsutum，Genbank參考號(hào)AAM 47602.1；水稻，Orysasativa，Genbank參考號(hào)AAP53615；或豌豆，Pisum sativum，Genbank參考號(hào)AAK15493。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠容易地分離其他生物體中編碼3β-羥基固醇Δ24-還原酶的其他同源基因。他們可特別地參考出版物HR.Waterham等人，2001中描述的克隆方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也能夠特別利用也在出版物(Waterham等人，2001)中描述的活性分析來(lái)容易地測(cè)定相應(yīng)蛋白質(zhì)的3β-羥基固醇Δ24-還原酶活性。
3β-羥基固醇Δ24-還原酶在本發(fā)明所述真菌界生物體中的表達(dá)可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式來(lái)獲得。這可能特別涉及上文關(guān)于7-脫氫膽固醇還原酶表達(dá)所描述的方法。
優(yōu)選，表達(dá)的3β-羥基固醇Δ24-還原酶是人類(lèi)的酶。相應(yīng)基因的分離和這個(gè)酶在釀酒酵母中的表達(dá)的實(shí)施例在出版物HR.Waterham等人，2001中有描述。然而它可以是顯示相同酶活性的任何同源或非同源、天然或人工的酶。
有利地，本發(fā)明所述的真菌界生物體表達(dá)7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶，并且也顯示固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶的失活。
固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶在國(guó)際酶分類(lèi)中擔(dān)負(fù)號(hào)碼EC-2.1.1.41。它也被稱(chēng)為ERG6p、Δ(24)-甲基轉(zhuǎn)移酶、Δ(24)-固醇甲基轉(zhuǎn)移酶、酵母甾醇-24-甲基轉(zhuǎn)移酶、S-腺苷-4-甲硫氨酸固醇Δ(24)-甲基轉(zhuǎn)移酶、SMT1、24-固醇C-甲基轉(zhuǎn)移酶、S-腺苷-L-甲硫氨酸Δ(24(23))-固醇甲基轉(zhuǎn)移酶或植物甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶。這個(gè)酶天然催化酵母甾醇的C-24甲基化，導(dǎo)致形成糞甾醇(fecosterol)。
編碼固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因在釀酒酵母中被命名為Erg6。這個(gè)基因的序列可以下列GenBank登錄號(hào)NC_001145獲得。相應(yīng)蛋白質(zhì)的序列可以下列GenBank登錄號(hào)NP_013706獲得(Bowman等人，1997)，(Goffeau等人，1996)。
這個(gè)基因的某些同源物已經(jīng)在其他真菌中有描述。它們是例如，粟酒裂殖酵母中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank號(hào)Z99759獲得，其蛋白質(zhì)序列可以GenBank號(hào)CAB16897獲得)(Wood等人，2002)；粗糙鐮孢酶中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank號(hào)NCB24P7獲得，其蛋白質(zhì)序列可以GenBank號(hào)CAB97289獲得)；白色假絲酵母中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank號(hào)AF031941獲得，其蛋白質(zhì)序列可以GenBank號(hào)AAC26626獲得)(Jensen-Pergakes等人，1998)。編碼與ERG6同源的酶的基因已經(jīng)在葡萄牙假絲酵母，Genbank參考號(hào)AA021936.1，和卡氏肺囊蟲(chóng)(Kaneshiro等人，2002)或乳酸克魯維氏酵母(Ozier-Kalogeropoulos等人，1998)中有描述。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地分離在真菌界生物體中與Erg6同源的其他基因。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也能夠特別利用這些基因破裂的酵母菌株的功能互補(bǔ)作為活性分析來(lái)容易地測(cè)定相應(yīng)蛋白質(zhì)的固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶活性。然后通過(guò)形成在24-位分支的固醇，特別是在24-28位攜帶甲叉基團(tuán)的麥角類(lèi)型固醇來(lái)證明互補(bǔ)。ERG6-型固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶生物活性的存在也可通過(guò)由(MyCammon等人，1984)或由Taylor和Parks(Taylor和Parks，1978)開(kāi)發(fā)的技術(shù)方式來(lái)體外測(cè)定。此外，生產(chǎn)的固醇和用于ERG6酶的底物可通過(guò)由Nes開(kāi)發(fā)的技術(shù)所述的氣相色譜法來(lái)分離(Methods in Enzymology Steroids andIsoprenoids Volume 111 part B，1985，“A comparison of Methods for theIdentification of Sterols”，pp.3-37)。
表達(dá)7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶并且也顯示固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶失活的本發(fā)明所述的真菌界生物體菌株生產(chǎn)膽固醇。本申請(qǐng)人實(shí)際上已經(jīng)能夠令人驚訝地確定固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶的失活阻斷了麥角固醇上游的生物合成途徑，并且容許通過(guò)該真菌菌株增加膽固醇的生產(chǎn)(參考本申請(qǐng)的實(shí)施例部分)。
7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶如下表達(dá)。
固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶的失活可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式進(jìn)行。它可特別地涉及通過(guò)誘變，導(dǎo)入無(wú)義突變，導(dǎo)入導(dǎo)致編碼所述蛋白質(zhì)的基因中閱讀框變化的插入或缺失。它也可涉及表達(dá)與編碼所述蛋白的信使RNA互補(bǔ)的反義RNA，或者如果這些系統(tǒng)不是天然存在于宿主中，則表達(dá)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因沉默系統(tǒng)，如RNAi(小的干擾RNA)，和相關(guān)酶系統(tǒng)。誘變可以是在編碼序列或非編碼序列中進(jìn)行，以使得編碼的蛋白質(zhì)失活或阻止其表達(dá)或其翻譯。誘變可以通過(guò)在所考慮的基因中抑制、取代、缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)堿基，或通過(guò)基因失活而在體外或原位進(jìn)行。
這可能特別涉及將外源DNA導(dǎo)入編碼序列或啟動(dòng)子序列(例如具有同源啟動(dòng)子和/或終止子及異源編碼部分的表達(dá)盒)。該表達(dá)盒有利地容許選擇標(biāo)記的表達(dá)。也可能改變基因的啟動(dòng)子以減少表達(dá)水平。對(duì)于真菌，失活也通過(guò)用異源或同源標(biāo)記基因的編碼序列打斷編碼序列來(lái)進(jìn)行。用于打斷真菌基因的主要技術(shù)在Johnston等人，(2002)的論文(Methods in Enzymology Volume 350 Edited by ChristineGuthrie and Gerry Fink；“Gene Disruption”；M.Johnston，Riles，J.Hegemann，pp.290-315)中有描述。
有利的是，本發(fā)明所述的真菌界生物體表達(dá)7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶并且也顯示C-22固醇去飽和酶的失活。
C-22固醇去飽和酶也稱(chēng)為ERG5p、Cyp61、細(xì)胞色素p-45061或固醇Δ22-去飽和酶。這個(gè)酶天然催化通過(guò)在C22位加入雙鍵而轉(zhuǎn)化麥角甾-5，7，24(28)-三烯醇為麥角甾-5，7，22，24(28)-四烯醇(參考圖2)。
編碼C-22固醇去飽和酶的基因在釀酒酵母中被命名為Erg5。這個(gè)基因的序列可以下列GenBank登錄號(hào)U34636獲得。相應(yīng)蛋白質(zhì)的序列可以下列GenBank登錄號(hào)AAB06271(Skaggs等人，1996)或p54781(Bowman等人，1997)獲得。
這個(gè)基因的某些同源物已經(jīng)在其他真菌中有描述。它們是例如，粟酒裂殖酵母中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank號(hào)Z98974獲得，其蛋白質(zhì)序列可以GenBank號(hào)CAB11640獲得)(Wood等人，2002)，Symbiotaphrina buchneri中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank號(hào)AB086896獲得，其蛋白質(zhì)序列可以GenBank號(hào)BAC01142獲得)(Noda和Koizumi，2003)；Symbiotaphrina kochii中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank號(hào)AB086890獲得，其蛋白質(zhì)序列可以GenBank號(hào)BAC01139獲得)(Noda和Koizumi，2003)；白色假絲酵母中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank號(hào)AL033396獲得，其蛋白質(zhì)序列可以GenBank號(hào)CAA21953獲得)(Tait等人，1997)。ERG5基因也已經(jīng)在葡萄牙假絲酵母中有描述，Genbank參考號(hào)AAO48601。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠容易地分離真菌界生物體中與Erg5同源的其他基因。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也能夠特別利用由B.A.Skaggs等人，1996描述的活性分析來(lái)容易地測(cè)定相應(yīng)蛋白質(zhì)的C-22固醇去飽和酶活性。這個(gè)活性也可通過(guò)預(yù)先破裂efg5基因的釀酒酵母的功能互補(bǔ)來(lái)證實(shí)。這個(gè)互補(bǔ)將通過(guò)在互補(bǔ)菌株中存在麥角甾-5，7，22-三烯醇來(lái)證實(shí)。C22固醇去飽和酶活性可通過(guò)利用由Kelly和Baldwin等人，JBC(1997)描述的方法，在裂解酵母后來(lái)體外測(cè)量(Kelly等人，1997)。
表達(dá)7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶并且也顯示C-22固醇去飽和酶失活的本發(fā)明所述的真菌界生物體菌株生產(chǎn)膽固醇。本申請(qǐng)人實(shí)際上已經(jīng)能夠確定C-22固醇去飽和酶的失活有利地阻斷膽固醇轉(zhuǎn)化為膽甾-5，22-二烯醇并且容許穩(wěn)定膽固醇的生產(chǎn)(參考本申請(qǐng)的實(shí)施例部分)。這個(gè)阻斷也發(fā)生在膽甾-5，7-二烯醇，膽固醇的前體轉(zhuǎn)化為膽甾-5，7，22-三烯醇，膽甾-5，22-二烯醇的前體的水平。令人驚訝地，C-22固醇去飽和酶實(shí)際上接受膽固醇作為底物，并且將其轉(zhuǎn)化為膽甾-5，22-二烯醇。這個(gè)副反應(yīng)可通過(guò)如本申請(qǐng)人已經(jīng)能夠確定的，使C-22固醇去飽和酶失活而消除。
7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶的表達(dá)如上述進(jìn)行。C-22固醇去飽和酶的失活可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)進(jìn)行。它們可能特別地是上文描述的關(guān)于使固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶失活的方法。
有利的是，本發(fā)明所述的真菌界生物體表達(dá)7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶并且也顯示C-22固醇去飽和酶的失活和固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶的失活。這些菌株實(shí)際上顯示兩種失活的累加優(yōu)勢(shì)并且是生產(chǎn)膽固醇的菌株。
7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶的表達(dá)及C-22固醇去飽和酶和固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶的失活如上述進(jìn)行。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的生物體菌株中膽固醇以由本發(fā)明所述的該菌株生產(chǎn)的總固醇的大于20％，優(yōu)選35％，最優(yōu)選50％以上的比例存在(特別是合成的中間物)。
優(yōu)選，本發(fā)明所述的真菌界生物體選自子囊菌門(mén)，更優(yōu)選其選自酵母亞門(mén)，更優(yōu)選其選自酵母綱或裂殖酵母綱，更優(yōu)選其選自酵母目或裂殖酵母目，更優(yōu)選其選自酵母科或裂殖酵母科，更優(yōu)選其選自酵母屬或裂殖酵母屬，完全優(yōu)選本發(fā)明所述的真菌界生物體屬于釀酒酵母種或粟酒裂殖酵母種。
本發(fā)明也涉及用于生產(chǎn)非動(dòng)物起源的膽固醇的方法，包括下列步驟培養(yǎng)如上限定的真菌界生物體，
提取由這個(gè)生物體所生產(chǎn)的膽固醇。
提取是基于用膽固醇的溶劑，優(yōu)選非水溶性的溶劑處理真菌。這個(gè)處理可優(yōu)選與機(jī)械研磨細(xì)胞的任何方法相結(jié)合。更優(yōu)選，該真菌可在用溶劑提取前，用旨在釋放可能結(jié)合其他細(xì)胞成分，例如特別是結(jié)合脂肪酸的膽固醇的皂化混合物處理。這個(gè)皂化組合物可能由堿，例如溶于水或，更優(yōu)選溶于例如甲醇或乙醇的水溶性有機(jī)溶劑的氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀，或溶劑-水混合物組成。皂化可沒(méi)有加熱或優(yōu)選在大氣壓或在低壓下加熱至60-120℃的溫度進(jìn)行。用非水溶性溶劑提取可被疏水性樹(shù)脂上的固相提取替換。固醇提取方法由L.Parks等人，(1985)(Methods in Enzymology 111 Edited by L.Rilling，L.Parks，C.Bottema，R.Rodriquez和Thomas Lewis，pp.333-339)描述。
如此獲得的粗膽固醇可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，特別是由Boselli E，Velazco V，Caboni Mf和Lercker G J，ChromatogrA.2001 May 11；917(1-2)239-44描述的方法來(lái)純化。
也可使用其他方法，例如，描述用于從羊毛提取膽固醇的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可特別地參考美國(guó)專(zhuān)利US2 688 623或US 2 650929，或英國(guó)專(zhuān)利GB690879、 GB646227或GB613778中描述的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及本發(fā)明所述菌株的用途，以獲得膽固醇或其代謝中間物中的一種，或標(biāo)記的固醇混合物。術(shù)語(yǔ)“膽固醇的代謝中間物”特別是指圖2中指定的固醇。其特別可能是膽甾-8，24(25)-二烯醇、膽甾-7，24(25)-二烯醇、膽甾-5，7，24(25)-三烯醇、膽甾-5，24(25)-二烯醇或膽甾-5，22-二烯醇。
獲得標(biāo)記膽固醇的原理在圖10中有描述。這個(gè)操作包括首先使真菌菌株在完全標(biāo)記的底物上生長(zhǎng)。然后該細(xì)胞在未標(biāo)記的底物上培養(yǎng)。因此存在碳源同位素標(biāo)記的變化；繼之以代謝中間物和隨后包括膽固醇的固醇的重新合成，并且包括標(biāo)記的逐步變化。這因此涉及復(fù)雜但可被完全地試驗(yàn)確定的分布圖譜，并且其表示獨(dú)特的同位素標(biāo)記同時(shí)依賴(lài)于1)標(biāo)記方案，特別是使用標(biāo)記和非標(biāo)記底物的培養(yǎng)時(shí)間和條件2)所使用菌株的準(zhǔn)確遺傳結(jié)構(gòu)3)終止培養(yǎng)的準(zhǔn)確時(shí)間。
一旦培養(yǎng)已經(jīng)(例如通過(guò)細(xì)胞裂解或通過(guò)在存在亞致死濃度的細(xì)胞毒素或細(xì)胞抑制的抗真菌產(chǎn)品來(lái)終止培養(yǎng))被終止，標(biāo)記的膽固醇或其代謝產(chǎn)物中間物之一，或標(biāo)記的固醇混合物如上述被提取和純化出來(lái)。
標(biāo)記的膽固醇或其代謝產(chǎn)物之一，或標(biāo)記的固醇混合物的同位素分布圖譜，具有幾個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)1)它可通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件、使用的菌株和選擇的固醇來(lái)按需要加以調(diào)節(jié)。因此可產(chǎn)生獨(dú)特的標(biāo)記指示；2)它是“可結(jié)合的”，即相應(yīng)于具有其本身可被調(diào)節(jié)的同位素分布圖譜標(biāo)記的幾個(gè)獨(dú)特固醇的幾個(gè)同位素標(biāo)簽可被結(jié)合起來(lái)以形成“分子字母表”。
3)它是可重復(fù)的并且可容易地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定；4)它相應(yīng)于易于分離、穩(wěn)定、無(wú)色且無(wú)嗅、不揮發(fā)且無(wú)毒的分子示蹤混合物，并且其可被摻入食品、醫(yī)藥制品、添加劑或可被人類(lèi)吸收的其他產(chǎn)品；5)在沒(méi)有特定的重組菌株和非常準(zhǔn)確的標(biāo)記、培養(yǎng)和提取條件的情況下，它是不能被偽造的。此外，對(duì)同位素標(biāo)簽的了解并不能使追蹤使其可能被生產(chǎn)出來(lái)的參數(shù)成為可能。
因此，不能被偽造并且可被摻入任何類(lèi)型產(chǎn)品，包括消費(fèi)品的廣泛使用的“同位素字母表”，可借助本發(fā)明而容易地獲得。實(shí)際上存在可從使用標(biāo)記分布圖譜和各種類(lèi)型固醇的這種字母表組成的無(wú)數(shù)“同位素單詞”。因此這種標(biāo)簽進(jìn)入大多數(shù)不同產(chǎn)品的摻入構(gòu)成了不能被偽造的獨(dú)特標(biāo)記方法，其不同于例如一旦已知?jiǎng)t能被再現(xiàn)的DNA標(biāo)簽。此外該標(biāo)簽?zāi)軌蛲ㄟ^(guò)例如，激光電離和隨后的質(zhì)譜分析(MALDI-TOF等)被非破壞性地讀取。
使用13C-標(biāo)記的底物替代未標(biāo)記的碳源用于培養(yǎng)本發(fā)明所述的真菌菌株使合成極高標(biāo)記的固醇，特別是膽固醇(包括至少95％的13C碳)成為可能。通過(guò)相同的方法，14C放射性固醇和膽固醇的制備也是可行的。該方法也可摻入生產(chǎn)固醇，特別是皮質(zhì)甾醇的酵母菌株(參照專(zhuān)利申請(qǐng)WO 02/061109)以生產(chǎn)13C-標(biāo)記或14C-標(biāo)記的類(lèi)固醇，來(lái)例如用于RIA測(cè)定。
附圖簡(jiǎn)述圖1膽固醇的化學(xué)式，和一般用于編號(hào)不同碳原子的命名法以及不同環(huán)的名稱(chēng)。膽固醇分子的4個(gè)環(huán)分別被命名為A、B、C和D，而碳被編號(hào)為1至27。
圖2天然或改變的酵母中麥角甾-和膽甾-類(lèi)型固醇生物合成途徑后期部分的簡(jiǎn)化圖解。該圖解不是詳盡的，但使明確涉及本文件中提及的酶的步驟成為可能。ERG2p、ERG3p、ERG5p和ERG6p蛋白是真菌或酵母蛋白，而Δ-7Red(Δ-7固醇還原酶)和Δ24-(25)Red(Δ24-(25)固醇還原酶)蛋白是哺乳動(dòng)物起源或植物起源的異源蛋白質(zhì)。
圖3來(lái)自BMA64菌株的菌株游離固醇在206nm處UV檢測(cè)的比較性HPLC分布圖譜和這些固醇的鑒定。研究的菌株如下WGIF01(打斷erg6基因(參照實(shí)施例1)的BMA64菌株)、WGIF02(打斷erg6基因并且表達(dá)Δ24-還原酶的BMA64菌株，實(shí)施例12)、WGIF03(打斷erg6基因并且表達(dá)Δ7-還原酶的BMA64菌株，實(shí)施例13)、WGIF04(打斷erg6基因并且表達(dá)Δ7-還原酶和Δ24-還原酶的BMA64菌株，實(shí)施例14)。C5膽甾-5-烯醇(膽固醇)；C5，22膽甾-5，22-二烯醇；C5，24膽甾-5，24-二烯醇(鏈甾醇)；C8，24膽甾-8，24-二烯醇(酵母甾醇)；C5，7，22膽甾-5，7，22-三烯醇；C5，7，24膽甾-5，7，24-三烯醇；C5，22，24膽甾-5，22，24-三烯醇；C5，7，22，24膽甾-5，7，22，24-四烯醇；lan羊毛甾醇。
圖4用半乳糖誘導(dǎo)0、2、4、8和24小時(shí)后，來(lái)自WGIF04菌株(打斷erg6基因并且表達(dá)Δ7-還原酶和Δ24-還原酶的BMA64菌株，實(shí)施例14)的游離固醇在206nm處UV檢測(cè)的比較性HPLC分布圖譜。ΔWGIF01菌株(實(shí)施例1)。對(duì)于WGIF04菌株，樣品取自轉(zhuǎn)換碳源為半乳糖后的第0、2、4、8和24h。擁有erg6打斷(WGIF01)存在的BMA64菌株的分布圖譜是在轉(zhuǎn)換為半乳糖后立即獲得的。這個(gè)圖譜實(shí)際上在誘導(dǎo)期間(0-24h)保持無(wú)變化。在206nm處的吸收信號(hào)相應(yīng)于固醇相互之間可變的吸收系數(shù)。C5膽甾-5-烯醇(膽固醇)；C5，22膽甾-5，22-二烯醇；C5，24膽甾-5，24-二烯醇(鏈甾醇)；C8，24膽甾-8，24-二烯醇(酵母甾醇)；C5，7，22膽甾-5，7，22-三烯醇；C5，7，24膽甾-5，7，24-三烯醇；C5，22，24膽甾-5，22，24-三烯醇；C5，7，22，24膽甾-5，7，22，24-四烯醇；lan羊毛甾醇。
圖5用半乳糖誘導(dǎo)0、2、4、8和24小時(shí)后，來(lái)自WGIF04菌株(實(shí)施例14)的游離固醇的陽(yáng)離子化電噴射檢測(cè)(質(zhì)譜)的比較性HPLC分布圖譜。ΔWGIF01菌株。C5膽甾-5-烯醇(膽固醇)；C5，22膽甾-5，22-二烯醇；C5，24膽甾-5，24-二烯醇(鏈甾醇)；C8，24膽甾-8，24-二烯醇(酵母甾醇)。該HPLC圖譜來(lái)自與圖4相同的測(cè)定。
圖5A(左側(cè))在m/z＝367的檢測(cè)，圖5B(右側(cè))m/z＝369。
y-軸計(jì)數(shù)離子的數(shù)目/秒。x-軸洗提時(shí)間，分鐘。
圖63個(gè)菌株在m/z＝369的HPLC圖譜細(xì)節(jié)WGIF01，擁有Δ24固醇還原酶表達(dá)質(zhì)粒的CA10，并且對(duì)于WGIF04，注入膽固醇作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。注入3個(gè)菌株的總膽固醇量相應(yīng)于以通過(guò)600nm處的吸收率測(cè)量的相同量培養(yǎng)物進(jìn)行的提取。
圖7WGIF(缺失erg6)、WGIF02(缺失erg6，表達(dá)Δ24-還原酶)、WGIF03(缺失erg6，表達(dá)Δ7-還原酶)、WGIF04(缺失erg6，表達(dá)Δ24-還原酶和Δ7-還原酶)和CA10 pYES_Δ24(FY1679遺傳背景，缺失，erg5，表達(dá)Δ24還原酶、Δ7-還原酶、erg5)菌株的總固醇(游離的和酯的)通過(guò)氣相色譜的比較性圖譜。反應(yīng)比例(火焰電離電流)是任意的。圖譜只在菌株相互之間進(jìn)行定性比較。然而，滯留時(shí)間的比例對(duì)于全部菌株都是相同的(滯留時(shí)間表示為分鐘)。固醇根據(jù)本申請(qǐng)描述的標(biāo)準(zhǔn)被鑒定出來(lái)。
圖8基于UV光譜評(píng)估的酵母菌株(BMA64(圖8A)、WGIF01(圖8B)、WGIF02(圖8C)和WGIF03(圖8D))中主要游離固醇的定量分布。給出的分布是附圖中提供的總種類(lèi)的％并且它是能夠以可測(cè)量的數(shù)量被檢測(cè)到的唯一種類(lèi)。當(dāng)對(duì)于幾個(gè)中間物固醇缺乏標(biāo)準(zhǔn)物時(shí)，根據(jù)與利用下列給出的評(píng)估吸光系數(shù)(參照表1，吸光系數(shù)表示為每升和每cm的mM)的HPLC色譜的每個(gè)峰相關(guān)的UV光譜來(lái)進(jìn)行定量。為此，相應(yīng)于給定固醇結(jié)構(gòu)中存在的不飽和結(jié)構(gòu)單元的吸光系數(shù)可在表1中找到，被任選地加入(如果幾個(gè)單元存在于相同的分子中)以提供對(duì)每一類(lèi)型固醇消光系數(shù)的評(píng)估。如果存在在280nm波長(zhǎng)被吸收的至少一個(gè)單元，則利用280nm處的值進(jìn)行評(píng)估，如果沒(méi)有，則使用波長(zhǎng)235nm，并且如果在后者的波長(zhǎng)沒(méi)有吸收，使用波長(zhǎng)206nm來(lái)評(píng)估來(lái)自各個(gè)HPLC吸收信號(hào)的每種固醇的濃度。
圖9基于UV光譜評(píng)估的WGIF4酵母菌株中主要游離固醇的定量分布。定量以與圖8描述相同的方式來(lái)進(jìn)行。
圖10通過(guò)碳源取代來(lái)同位素標(biāo)記固醇的原理。
圖11誘導(dǎo)4、8和24小時(shí)后，WGIF04菌株中所生產(chǎn)膽固醇的同位素標(biāo)記圖譜的評(píng)估。游離固醇如上述通過(guò)HPLC提取和分離。在洗提期間每0.2秒獲得m/z＝300和m/z＝450值之間的質(zhì)譜。這些質(zhì)譜隨后以1.8秒的窗口被平均，再使用作為回歸基礎(chǔ)的一組代表標(biāo)記膽固醇隨機(jī)摻入的理論質(zhì)量分布的24個(gè)矢量，其中根據(jù)所考慮的矢量，標(biāo)記每個(gè)碳原子的概率在0和1之間變化，通過(guò)獨(dú)立選擇在該分子的27個(gè)位置中每一個(gè)的碳13來(lái)進(jìn)行多線性回歸。選擇用作基礎(chǔ)的不同矢量的標(biāo)記概率，以使得該基礎(chǔ)的2個(gè)連續(xù)矢量分布的交互相關(guān)系數(shù)是0.92，該基礎(chǔ)以相應(yīng)于在全部位置的碳12上100％存在的概率的矢量開(kāi)始。多線性調(diào)節(jié)是基于使Gauss法(最大數(shù)值濾波)偏導(dǎo)數(shù)結(jié)果的矩陣非對(duì)角項(xiàng)為零的最小平方統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)則作出的。分析后，質(zhì)譜隨后在優(yōu)化的基礎(chǔ)上重建。因此附圖中表示的曲線代表了在值100的最大振幅標(biāo)準(zhǔn)化后優(yōu)化過(guò)濾重建的結(jié)果。
對(duì)于每個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間，兩個(gè)曲線代表相應(yīng)于相差1.8秒洗提時(shí)間并且相應(yīng)于位于膽固醇洗提峰中心區(qū)的光譜的兩個(gè)獨(dú)立圖譜。該附圖證明了該分析是可高度重復(fù)再現(xiàn)的。
圖12不同固醇或不同誘導(dǎo)時(shí)間的各種同位素標(biāo)簽的實(shí)例。計(jì)算和表示法與圖11相同，但針對(duì)不同的固醇和不同的誘導(dǎo)時(shí)間。
RT值指示了用于計(jì)算的滯留時(shí)間的范圍(分鐘)。這個(gè)范圍的值如下圖12ART＝12.25-12.42，圖12BRT＝12.2-12.7，圖12CRT＝12.25-12.35，圖12DRT＝13.3-13.6.
誘導(dǎo)時(shí)間是8或24小時(shí)。
m/z的值指示了m/z值的左右限制。每個(gè)框m/z的最低值相應(yīng)于完全由碳12組成的固醇的m/z。
圖13YIM59/pIM303菌株(附圖的A部分)和YIM59/pIM331菌株(附圖的B部分)總固醇(游離的和酯的)的氣相色譜比較性圖譜(參照實(shí)施例18)。反應(yīng)比例是任意的。滯留時(shí)間比例對(duì)于兩個(gè)菌株是相同的(滯留時(shí)間表示為分鐘)。固醇根據(jù)本申請(qǐng)描述的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定。
本發(fā)明利用下列應(yīng)被認(rèn)為非限制性例證的實(shí)施例來(lái)舉例說(shuō)明。
所使用的分子生物學(xué)技術(shù)由Ausubel等人描述，一些酵母操作由Adams等人(Adams and Holm，1996)描述。
實(shí)施例1打斷erg6基因的釀酒酵母菌株的構(gòu)建(WGIF01菌株)其中ERG6基因被TRP1基因打斷的釀酒酵母菌株WGIF01通過(guò)用攜帶以與ERG6基因同源的極點(diǎn)為邊界的功能性TRP1基因的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BM64菌株來(lái)獲得。
BM64菌株(基因型MATa；ura3-52；trp1Δ2；leu2-3_112；his3-11；ade2-1；can1-100的)是完全缺失TRP1基因的釀酒酵母菌株W303MATα的衍生物。BMA64菌株和W303 MATα在Baudin-Baillieu等的出版物中有描述(Baudin-Baillieu等人，1997)。
為了分離TRP1基因，利用由公司Takara(PanVera LLC 501Charmany Drive，Madison，WI53719USA)提供的Z-TaqI(依賴(lài)DNA的DNA聚合酶)來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒pFL44的TRP1基因(Bonneaud等人，1991)。使用的引物對(duì)使通過(guò)DNA聚合酶擴(kuò)增以相應(yīng)于ERG6基因的序列為邊界的TRP1基因成為可能。
這些引物的序列如下OERG6trp15′(CCTAGCGACGAAAAGCATCATTGGAGTGAATAACTTGGACTTACCAttcttagcattttgacg) 3′(SEQ ID No.1).
OERG6trp2 5′ 5′(GCATAAGAGTGAAACAGAATTGAGAAAAAGACAGGCCCAATTCAaattcgggtcgaaaaaagaaaagg) 3′ (SEQ ID No.2).
如此獲得的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))產(chǎn)物通過(guò)電洗脫相應(yīng)于預(yù)期大小的片段來(lái)純化，并用于通過(guò)如(Gietz等人，1995)描述的氯化鋰技術(shù)轉(zhuǎn)化BM64菌株。
轉(zhuǎn)化后，處理的酵母菌株被接種在不含有色氨酸的基本培養(yǎng)基上(Gietz等人，1995)。如此獲得41個(gè)轉(zhuǎn)化的色氨酸原養(yǎng)型的BM64克隆。然后測(cè)試這41個(gè)克隆的3種特性對(duì)制霉菌素的敏感性、TRP1基因插入的基因組結(jié)構(gòu)、和由其生產(chǎn)的總固醇的氣相色譜的分布圖譜。
為此，41個(gè)克隆被轉(zhuǎn)移到分別含有10、20、或50μg/ml制霉菌素的基本培養(yǎng)基上；大約10個(gè)克隆能夠在含有50μg/ml制霉菌素劑量培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。選擇這些抗性克隆以驗(yàn)證其基因結(jié)構(gòu)及其固醇組成。
TRP1基因進(jìn)入ERG6基因的插入通過(guò)PCR利用覆蓋功能性TRP1基因和打斷的ERG6之間連接的寡核苷酸對(duì)來(lái)驗(yàn)證。這個(gè)寡核苷酸對(duì)如下OERG6trp3 AGGGCCGAACAAAGCCCCGATCTTC(SEQ ID No.3)和OERG6trp4GGCAAACCGAGGAACTCTTGG(SEQ ID No.4)一些菌株顯示預(yù)期的PCR圖譜，即相應(yīng)于預(yù)期TRP1插入ERG6大小的800個(gè)堿基對(duì)的片段。
為了驗(yàn)證ERG6基因在這些菌株中實(shí)際上是失活的，這些菌株的固醇組成的分析通過(guò)氣相色譜和高壓液相色譜來(lái)進(jìn)行(Duport等人，2003；Szczebara等人，2003)。
這些分析證實(shí)了打斷的菌株中與生物合成途徑的預(yù)期打斷相容的麥角固醇合成的缺乏和異常固醇的累積。
一個(gè)菌株被更特別地選擇出來(lái)，并被稱(chēng)為WGIF01。
實(shí)施例2CA10、CA14和CA23菌株的構(gòu)建CA10菌株(基因型MATα，rho+，GAL2，ura3-52，trp1-Δ63，his3-Δ200，erg5::HYGROR，ade2::GAL10/CYC1::Δ7還原酶::PGK1，LEU2::GAL10/CYC1::matADR::PGK1的)、CA14菌株(基因型MATα，rho+，GAL2，ura3-52，trp1-Δ63，his3-Δ200，erg5::HYGRORatf2::G418R，ade2::GAL10/CYC1::Δ7還原酶::PGK1，LEU2::GAL10/CYC1::matADR::PGK1的)、和CA23菌株(基因型MATα，rho+，GAL2，ura3-52，trp1-Δ63，his3-Δ200，erg5::HYGRORare1::G418R，are2::HIS3，ade2::GAL10/CYC1::Δ7還原酶::PGK1，LEU2::GAL10/CYC1::matADR::PGK1的)、及其構(gòu)建體，在參考文獻(xiàn)Duport等中有描述，其關(guān)于構(gòu)建這些菌株的技術(shù)內(nèi)容被引入本申請(qǐng)作為參考。
這些菌株生產(chǎn)且在其膜中含有非天然的固醇(如在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0727 489中所描述的)，特別是麥角甾-5-烯醇(油菜甾醇)。
這3個(gè)菌株不表達(dá)ERG5基因的產(chǎn)物，其由于在其編碼序列中插入潮霉素抗性基因而是非功能性的。此外，這些菌株表達(dá)編碼植物Δ7還原酶的cDNA(歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0727 489特別描述了植物擬南芥Δ7還原酶的克隆，其被引入本申請(qǐng)作為參考，這個(gè)序列的GenBank登錄號(hào)是ATU49398)。
CA14菌株通過(guò)打斷ATF2基因來(lái)源于CA10菌株。這個(gè)基因的產(chǎn)物導(dǎo)致的第3位上孕烯醇酮(pregnenolone)的乙?；?如在專(zhuān)利申請(qǐng)WO99/40203中所描述的)。
CA23菌株是通過(guò)缺失ARE1和ARE2基因來(lái)源于CA10菌株的菌株；兩個(gè)蛋白質(zhì)Are1p和Are2p負(fù)責(zé)麥角固醇的酯化(Sturley，2000)和膽固醇的可能酯化，因?yàn)樗鼈兣c負(fù)責(zé)哺乳動(dòng)物中膽固醇酯化的酶(ACAT)同源。
實(shí)施例3用于表達(dá)人類(lèi)起源的Δ24-25還原酶的質(zhì)粒的構(gòu)建(質(zhì)粒pYES_Δ24)這個(gè)質(zhì)粒的構(gòu)建由Waterham，2001等描述。該構(gòu)建體包括將編碼Δ24固醇還原酶的cDNA置于載體pYES2(Invitrogen SARL，CergyPontoise，F(xiàn)rance)中的pGAL1啟動(dòng)子和tCYC1終止子的控制之下。這個(gè)質(zhì)粒是大腸桿菌/釀酒酵母穿梭質(zhì)粒，且含有2微復(fù)制原點(diǎn)和URA3基因，這容許其在酵母中復(fù)制并且容易地選擇用這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母。
此外，GAL1啟動(dòng)子是半乳糖誘導(dǎo)的。
實(shí)施例4表達(dá)擬南芥表達(dá)的Δ7-還原酶的質(zhì)粒pAG1的構(gòu)建特異地構(gòu)建質(zhì)粒用于在單拷貝載體上表達(dá)擬南芥Δ7-還原酶。質(zhì)粒pAM1被用于這個(gè)構(gòu)建。其構(gòu)建在PCT申請(qǐng)WO 02/061109(參照所述申請(qǐng)的實(shí)施例9.b，其被引入本申請(qǐng)作為參考)中有描述的這個(gè)質(zhì)粒是基于自主復(fù)制序列和著絲粒(ARS CEN)的大腸桿菌/釀酒酵母穿梭質(zhì)粒。選擇標(biāo)記是ADE2基因。這個(gè)質(zhì)粒是相容的，因此作為基于2微復(fù)制原點(diǎn)的質(zhì)?？赏瑫r(shí)復(fù)制。這個(gè)質(zhì)粒特別具有獨(dú)特的NotI位點(diǎn)來(lái)用于如上述PCT申請(qǐng)中所描述的克隆表達(dá)盒。
這個(gè)位點(diǎn)被用于克隆起源自CA10菌株的擬南芥Δ7-還原酶表達(dá)盒。實(shí)際上，這個(gè)表達(dá)盒是非常有效的，且能使也被打斷ERG5的CA10菌株生產(chǎn)油菜甾醇(麥角甾-5-烯醇)作為主要固醇(Duport等人，1998)。含有Δ7-還原酶基因的CA10菌株的基因組DNA片段利用下列引物來(lái)擴(kuò)增
OSA72 5′(TATATAGCGGCCGCTTTCGCTGATTAATTACCCCAG)3′(SEQ ID No.5)OSA77 5′(TATATAGCGGCCGCGAGAAGTGACGCAAGCATCA)3′(SEQ ID No.6).
擴(kuò)增針對(duì)通過(guò)由Adams等描述的快速酚/氯仿提取技術(shù)制備的CA10菌株的基因組DNA來(lái)進(jìn)行(Adams和Holm，1996)。
50納克的CA10基因組DNA被用作利用引物OSA72和OSA77的擴(kuò)增的基底。Tag DNA聚合酶和酶促條件來(lái)自于公司Stratagene。擴(kuò)增條件如下95℃，5min的起始變性；隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其由95℃，30s的變性，50℃，30s的雜交，和隨后72℃，1min的延長(zhǎng)組成。該反應(yīng)通過(guò)72℃，10min的最終延伸來(lái)終止。
然后PCR片段用NotI酶消化并在瓊脂糖凝膠上純化，隨后被常規(guī)地克隆到質(zhì)粒pAM1唯一的NotI位點(diǎn)中。如此獲得的質(zhì)粒被命名為pAG1。
它是在酵母中表達(dá)擬南芥Δ7-還原酶的單拷貝載體，其中該Δ7-還原酶基因被置于GAL10/CYC1啟動(dòng)子的控制之下(Lecain等人，1996)。
實(shí)施例5提取酵母中游離和酯化的固醇，用于分析1)提取酵母中游離和酯化的固醇的條件(方法1)a)提取游離固醇的條件細(xì)胞顆粒在玻璃試管中用500μl去離子和過(guò)濾的水洗滌兩次。
然后細(xì)胞重懸在含有0.5mm玻璃珠的500μl水中，相應(yīng)于試管中的150μl液體。
用2ml 1，2-二氯乙烷，伴隨在渦旋器上劇烈攪拌10分鐘來(lái)提取兩次。第一次提取后，細(xì)胞、玻璃珠和溶劑的混合物在1500g離心5分鐘以分離兩相。
來(lái)自?xún)纱芜B續(xù)提取的兩個(gè)有機(jī)餾分被組合在一起并在氮?dú)饬飨赂稍锶舾尚r(shí)。
固醇提取物懸浮在100μl乙腈中以使其通過(guò)高效液相色譜(HPLC)來(lái)加以分析(Szczebara等人，2003)，或懸浮在100μl己烷中用于氣相色譜(GC)分析(Duport等人，2003)。
b)提取總固醇的條件皂化和提取酯化的固醇，定性分析方法1細(xì)胞顆粒重懸在500μl純化的水中。向這個(gè)懸浮液加入2ml在甲醇中的10％氫氧化鉀KOH。在封閉的試管中于60℃加熱該混合物1小時(shí)。孵育后，且一旦該試管已經(jīng)恢復(fù)到環(huán)境溫度，用2ml己烷提取該混合物3次。每次提取之間，通過(guò)在1500g離心5min分離兩相。每次提取后，有機(jī)相被轉(zhuǎn)移到新試管中，然后3個(gè)有機(jī)相被組合在一起，再在氮?dú)饬飨赂稍铩?br> 固醇?xì)堄辔镏貞以?00μl 100％的乙腈中以使其通過(guò)高效液相色譜(HPLC)來(lái)加以分析(Szczebara等人，2003)，或重懸在100μl己烷中用于氣相色譜(GC)分析(Duport等人，2003)。
2)提取酵母中游離和酯化的固醇的條件，用于定性分析(方法2)菌株培養(yǎng)在豐富培養(yǎng)基(每升10g細(xì)菌蛋白胨和每升10g酵母提取物)中，其中含2％的葡萄糖作為碳源以獲得500mg凍干的細(xì)胞。這些干燥的細(xì)胞被吸收在含有1g KOH和微量焦酚的3ml甲醇(100％)，然后該混合物在90℃孵育45分鐘。恢復(fù)至環(huán)境溫度后，固醇用5ml己烷提取。有機(jī)相被分為相同體積的3份樣品，并在空氣流下干燥。所提取固醇的2個(gè)樣品被吸收在100μl己烷來(lái)通過(guò)氣相色譜(GC)和氣相色譜/質(zhì)譜GC/MS加以分析，而第三個(gè)樣品被吸收在150μl甲醇用于高效液相色譜(HPLC)研究。
實(shí)施例6通過(guò)氣相色譜法(GC)分析酵母中游離和酯化的固醇1)FID(火焰電離檢測(cè))氣相色譜法(GC)懸浮在己烷中的(游離或總)固醇提取物根據(jù)方法1(參照實(shí)施例51)a)和b))來(lái)制備。注射對(duì)照被加入固醇混合物，一般膽固醇濃度為10至50ng/μl。
然后1至3μl的樣品在下列條件下被注射到氣相色譜裝置上。1至3μl被注射到Alltech SE30-型柱上(柱參照30m×0.32mm IDX 0.25μm)。氣相載體是氦。分流比是在50和80之間。柱頭壓是30psi。注射器設(shè)置在280℃。柱的起始溫度是130℃，0.5分鐘。它以40℃/min的速率升高至230℃，然后以3℃/min的速率從230℃升高至280℃。然后柱維持在290℃。檢測(cè)器的溫度是310℃。
2)與質(zhì)譜偶聯(lián)的FID(火焰電離檢測(cè))氣相色譜法(GC)(GC/MS)懸浮在己烷中的總固醇提取物根據(jù)方法2來(lái)制備。使用的GC裝備有傳統(tǒng)的“分流/非分流(split/splitless)”注射器，其具有長(zhǎng)度為30米，直徑為0.25mm的傳統(tǒng)DB5柱。
注射在230℃，以氦作為氣相載體，于2ml/min的流速來(lái)進(jìn)行。柱子以4個(gè)階段從130達(dá)到290℃。注射前，柱子維持在130℃，然后以40℃/min的線性變化增加至230℃，再以3℃/min的線性變化從230℃增加至280℃，以及再以30℃/min的線性變化從280℃增加至290℃。柱子在290℃保持5分鐘。
在氣相色譜柱出口，隨后通過(guò)在例如來(lái)自Perkin Elmer的TurboMass型裝置的離子化腔室中的噴射質(zhì)譜法來(lái)分析分子。該分子用高能量的電子流片段化。然后不同的片段在四極過(guò)濾器上分離，并在離子檢測(cè)器上檢測(cè)。包括M+離子片段化全部產(chǎn)物質(zhì)量的質(zhì)譜相應(yīng)于位于離子流圖表上的每個(gè)質(zhì)量。將在柱子上給定的滯留時(shí)間獲得的這個(gè)質(zhì)譜與片段化產(chǎn)物的文庫(kù)以及由Quail和Kelly描述的固醇質(zhì)譜(Methods inMolecular Biology Vol.53 Yeast Protocols Edited by Evans；M.Quail和S，Kelly＂The Extraction and Analysis of Sterols from Yeast＂pp.123-131(1996))進(jìn)行比較。
由此可見(jiàn)，可能證實(shí)WGIF01菌株中缺失ERG6基因，特別是缺乏麥角甾-8，24(28)-二烯醇和存在具有24(25)-位雙鍵的膽甾型固醇的效果。
實(shí)施例7通過(guò)UV檢測(cè)或質(zhì)譜檢測(cè)的高效液相色譜(HPLC)分析酵母中游離和酯化的固醇1)通過(guò)UV檢測(cè)HPLC的分析10個(gè)30μl的固醇提取物(懸浮在乙腈或甲醇中并根據(jù)方法1或2)來(lái)制備(參照實(shí)施例5)被注射到X terra RP8型4.6×100mm柱上(Waters，Milford，MA01757 USA)。
分離在由含有0.02％TFA(三氟乙酸)的水(緩沖液A)和純的乙腈(緩沖液B)組成的梯度上進(jìn)行。該柱子在分析期間維持在60℃。
使用的HPLC裝置是“Waters 600 E System Controller”型(Waters，Milford，MA01757USA)。UV檢測(cè)在覆蓋206至350nm波長(zhǎng)的二極管-陣列檢測(cè)器上進(jìn)行。該柱子用含有20％(v/v)緩沖液A(乙腈)和80％緩沖液B(含有0.02％TFA(三氟乙酸)的水)的緩沖液平衡。線性梯度從含有50％緩沖液A和50％緩沖液B的溶液形成。10min后，洗提緩沖液的組成是25％緩沖液A對(duì)75％緩沖液B。然后施加新的線性梯度，以使得在30min，該梯度達(dá)到100％緩沖液B的值。這個(gè)值保持5分鐘以清潔該柱子。
2)通過(guò)HPLC分析，通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)(HPLC/MS)在通過(guò)質(zhì)譜法分析的情況下，樣品維持在30℃并且在分析期間柱子維持在60℃。使用的HPLC裝置是“Alliance HT Waters 2790”型，其偶連有“Waters MicroMass ZQ”質(zhì)量檢測(cè)器。不同于前述的檢測(cè)方法，洗提緩沖液A不含有任何TFA，但兩種緩沖液A和B含有0.01％(v/v)甲酸。
該柱子用含有80％緩沖液A’(含有0.01％(v/v)甲酸的水)和20％緩沖液B’(含有0.01％(v/v)甲酸的乙腈)的緩沖液平衡。
注射以含有50％的這兩種緩沖液的緩沖液開(kāi)始。具有兩個(gè)線性變化的線性梯度從含有50％緩沖液A’和50％緩沖液B’的溶液形成。
10min后，洗提緩沖液的組成是25％緩沖液A’對(duì)75％緩沖液B’。然后該梯度的線性變化被改變以在分析25分鐘后達(dá)到12.5％緩沖液A’和87.5％緩沖液B’，以及在30分鐘達(dá)到100％的緩沖液B。這個(gè)值維持5分鐘以使該柱子再生。
“Waters MicroMass ZQ”質(zhì)量檢測(cè)器設(shè)置為陽(yáng)性電噴射離子化掃描。m/z的值在295和450之間。選擇“連續(xù)”采集模式用于掃描。此外，“SIR”模式的信號(hào)提取在全部的預(yù)期質(zhì)量通過(guò)待分析固醇的天然同位素豐度平行進(jìn)行。檢測(cè)器被設(shè)置為使得其能夠完全分辨而沒(méi)有來(lái)自有1個(gè)單位m/z差異的分子的干擾。所有的采集設(shè)置參數(shù)為使得相應(yīng)于掃描和采集所有SIRs的總時(shí)間的總采集時(shí)間保持小于2秒。
實(shí)施例8培養(yǎng)酵母菌株用于分析有或沒(méi)有13C標(biāo)記的其固醇含量待分析的菌株培養(yǎng)在含有2％常規(guī)D-葡萄糖或D-葡萄糖-U-13C6(關(guān)于標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，參照?qǐng)D10)的50ml體積Kappeli培養(yǎng)基中(Kappeli等人，1985)。
起始培養(yǎng)物的光密度在600nm是0.1。這個(gè)培養(yǎng)物在30℃的溫度，以200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)72小時(shí)。
然后細(xì)胞通過(guò)在600g離心培養(yǎng)基10分鐘來(lái)回收。細(xì)胞顆粒再通過(guò)實(shí)施例5中提供的分析技術(shù)來(lái)直接分析(對(duì)于該研究不需要用半乳糖誘導(dǎo))。
然而，對(duì)于Δ7-還原酶和Δ24-還原酶表達(dá)誘導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)研究(用質(zhì)粒pYES_Δ24和/或pAG1轉(zhuǎn)化的菌株)，沉淀顆粒重懸在含有2％半乳糖的50ml新鮮Kappeli培養(yǎng)基中(未用13C碳標(biāo)記)。
這個(gè)培養(yǎng)物在30℃的溫度，以200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)。
培養(yǎng)0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和24小時(shí)后回收10ml培養(yǎng)物。
這些培養(yǎng)物樣品在800g離心10分鐘，在通過(guò)實(shí)施例5中描述的方法提取固醇前，細(xì)胞沉淀顆粒被冷凍并儲(chǔ)存在-20℃。
實(shí)施例9鑒定被分析菌株中存在的固醇固醇的鑒定是基于下列原則的組合-在油菜甾醇(麥角甾-5-烯醇)、麥角固醇(麥角甾-5，7，22-三烯醇)、膽固醇(膽甾-5-烯醇)、鏈甾醇(膽甾-5，24-二烯醇)、膽甾-5，22-二烯醇和酵母甾醇(膽甾-8，24-二烯醇)的情況中，以可靠的標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)GC、HPLC、GC/MS和HPLC/MS比較性能。
-通過(guò)HPLC和二極管-陣列UV檢測(cè)分析吸收光譜(參照實(shí)施例7-1)這個(gè)方法使得在光譜基礎(chǔ)上清楚地鑒定5類(lèi)固醇成為可能1)SA1類(lèi)沒(méi)有共軛二烯系統(tǒng)；2)SA2類(lèi)存在5，7-二烯系統(tǒng)；3)SA3類(lèi)存在22，24(25)-二烯系統(tǒng)；4)SA4類(lèi)存在8，14-二烯系統(tǒng)；5)SA5類(lèi)存在22，24(28)-二烯系統(tǒng)。類(lèi)別SA3和SA5由于結(jié)構(gòu)原因不能共存。類(lèi)別SA2和SA4由于生物合成原因不能共存，SA2類(lèi)可能與SA1、SA3、SA5的結(jié)構(gòu)單位化合而形成附加的復(fù)合光譜。
-根據(jù)與各種類(lèi)型的不飽和及麥角甾或膽甾型骨架的存在相關(guān)的滯留時(shí)間遷移的近似疊加性來(lái)分析GC和HPLC中的滯留時(shí)間。由于這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)不是絕對(duì)的，其使用是為了幫助鑒定和除去不明確性，但其如果單獨(dú)使用，存在出錯(cuò)的風(fēng)險(xiǎn)。因此它只與其他標(biāo)準(zhǔn)組合使用。
-GC/MS分析(參照實(shí)施例6-2)，其提供可與光譜文庫(kù)進(jìn)行比較的分子質(zhì)量和片段化分布圖譜。
-HPLC/電噴射-MS分析(參照實(shí)施例7-2)，就3-羥基固醇而言，其提供在分子質(zhì)量-17(質(zhì)子化(+1)和水分子丟失(-18))的主要信號(hào)。
-分析在生物合成的各個(gè)點(diǎn)被打斷的不同參照酵母菌株固醇組成的上述全部系統(tǒng)。
-分析補(bǔ)充各種生物合成酶期間固醇組成的變化和導(dǎo)入這種補(bǔ)充期間這種補(bǔ)充的動(dòng)力學(xué)。
-分析用碳-13同位素標(biāo)記各種固醇的圖譜。
-分析通過(guò)HPLC在給定的滯留時(shí)間分離的固醇的UV光譜。2個(gè)5，7-共軛雙鍵顯示在265和280nm之間具有2個(gè)吸收峰的典型光譜，同時(shí)2個(gè)22，24-共軛雙鍵顯示在235nm之間有吸收峰。最后，8，14-共軛雙鍵可通過(guò)在245nm的吸收峰被鑒定出來(lái)。
實(shí)施例10鑒定BMA64菌株中存在的固醇BMA64菌株培養(yǎng)在含有2％D-葡萄糖的50ml體積的Kappeli培養(yǎng)基中用于固醇的定量和比較分析。
起始培養(yǎng)物的光密度在600nm是0.1。這個(gè)培養(yǎng)物在30℃的溫度，以200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)72小時(shí)。
然后細(xì)胞通過(guò)在600g離心培養(yǎng)基10分鐘來(lái)回收，細(xì)胞顆粒沉淀通過(guò)實(shí)施例5中提供的技術(shù)加以分析。所描述的各種分析使得鑒定由這個(gè)菌株生產(chǎn)的固醇成為可能。
因此確定這個(gè)菌株累積其80％以上的游離固醇為麥角固醇(麥角甾-5，7，22-三烯醇)的形式(參照?qǐng)D8)。兩個(gè)其他次要的可檢測(cè)固醇是由這個(gè)菌株生產(chǎn)的；它們是麥角甾-5，7-二烯醇(ERG5基因產(chǎn)物的底物)(12％)和酵母甾醇(麥角甾-8，24-二烯醇)(5％)。沒(méi)有檢測(cè)到微量的膽固醇(該方法的檢測(cè)極限是可觀測(cè)到的固醇的大約0.5％)。也可檢測(cè)到少量的羊毛甾醇(只是在總固醇的分析中)。
實(shí)施例11鑒定WGIF01菌株中存在的固醇WGIF01菌株(參照實(shí)施例1)培養(yǎng)在含有2％D-葡萄糖的50ml體積的Kappeli培養(yǎng)基中(Kappeli等人，1985)用于固醇的定量和比較分析。
起始培養(yǎng)物的光密度在600nm是0.1。這個(gè)培養(yǎng)物在30℃的溫度，以200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)72小時(shí)。
然后細(xì)胞通過(guò)在600g離心培養(yǎng)基10分鐘來(lái)回收，細(xì)胞顆粒沉淀通過(guò)實(shí)施例5中提供的技術(shù)加以分析。所描述的各種分析使得鑒定由這個(gè)菌株生產(chǎn)的固醇成為可能。
色譜中對(duì)于麥角甾-5，7，22-三烯醇(麥角固醇)或麥角甾-5，7-二烯醇在偶連質(zhì)譜法的HPLC中的搜索是陰性的(小于在BMA64中獲得的值的0.5％)。就游離的固醇而言，該菌株累積50％的總酵母固醇(膽甾-8，24-二烯醇)，ERG6基因產(chǎn)物的底物，和分別為30和20％的膽甾-5，7，24-三烯醇和膽甾-5，7，22，24-四烯醇可能由與在親本菌株中導(dǎo)致產(chǎn)生麥角甾-5，7-二烯醇和麥角甾-5，7，22-三烯醇的機(jī)制相同的合成機(jī)制產(chǎn)生(參照?qǐng)D3和8)。這清楚地顯示生物合成途徑在erg6的水平被阻斷，因?yàn)镋RG6p酶(S-腺苷甲硫氨酸Δ24固醇C-甲基-轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化膽甾-8，24(25)-二烯醇為麥角甾-8，24(28)-二烯醇(參照?qǐng)D2)。這個(gè)累積清楚地表明WGIF01菌株不具有erg6基因的功能拷貝。該結(jié)果也表明酵母中麥角甾醇的正常生物合成途徑，特別是固醇8，7-異構(gòu)酶、固醇5-去飽和酶和固醇Δ22-去飽和酶，能夠以保持相當(dāng)大的活性轉(zhuǎn)化膽甾-型底物。
實(shí)施例12構(gòu)建WGIF02菌株并且鑒定這個(gè)菌株中存在的固醇WGIF02菌株是通過(guò)用攜帶Δ24-還原酶表達(dá)盒的質(zhì)粒pYES2(pYES_Δ24，參照實(shí)施例3)轉(zhuǎn)化WGIF01菌株獲得的?？寺≡谌鄙倌蜞奏さ呐囵B(yǎng)基上被選擇出來(lái)，Δ24-還原酶cDNA的存在和表達(dá)通過(guò)利用方法1分析這些轉(zhuǎn)化子的固醇來(lái)驗(yàn)證(參照實(shí)施例5-1))。
選擇稱(chēng)為WGIF02的克隆，因?yàn)樗哂胁煌赪GIF01菌株的固醇圖譜；而且，附加的固醇具有與膽固醇相似的滯留時(shí)間(參照?qǐng)D7)。WGIF02菌株培養(yǎng)在含有2％D-葡萄糖的50ml體積的Kappeli培養(yǎng)基中(Kappeli等人，1985)，用于固醇的定量和比較分析。
起始培養(yǎng)物的光密度在600nm是0.1。這個(gè)培養(yǎng)物在30℃的溫度，以200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)72小時(shí)。
然后細(xì)胞通過(guò)在600g離心培養(yǎng)基10分鐘來(lái)回收，細(xì)胞顆粒沉淀通過(guò)實(shí)施例5中提供的技術(shù)加以分析。所描述的各種分析使得鑒定由這個(gè)菌株生產(chǎn)的固醇成為可能。
WGIF01菌株和WGIF02菌株的兩個(gè)固醇提取圖譜是相似的，除了出現(xiàn)借助其質(zhì)量、其滯留時(shí)間及其共軛雙鍵被鑒定為膽甾-5，7，22-三烯醇的新的峰(圖2，3和7)。這個(gè)化合物的存在表明膽甾-5，7，22，24(25)-四烯醇的24(25)位中雙鍵上24，25-固醇還原酶活性的預(yù)期存在。此外，膽甾-5，7，24-三烯醇的數(shù)量隨著WGIF02菌株中膽甾-5，7，22-三烯醇的出現(xiàn)而降低(圖7和8)。酶的活性通過(guò)膽甾-5，7，24-三烯醇在WGIF01菌株中表現(xiàn)為30％而在WGIF02中只表現(xiàn)為12％，其差異，即WGIF02菌株中18％完全轉(zhuǎn)化為膽甾-5，7，22-三烯醇的形式來(lái)被證實(shí)。就由Δ24-還原酶轉(zhuǎn)化膽甾-5，7，24的產(chǎn)物是在WGIF02中缺乏的膽甾-5，7，并且因此定量地被轉(zhuǎn)化為膽甾-5，7，22而言，這是出乎意料的結(jié)果。這證明了另一個(gè)出乎意料的結(jié)果，即膽甾-5，7是固醇22-去飽和酶的底物，而膽甾-5，7，24，根據(jù)WGIF01菌株的固醇圖譜，是較差的底物。
實(shí)施例13構(gòu)建WGIF03菌株并且鑒定這個(gè)菌株中存在的固醇WGIF03菌株是通過(guò)用質(zhì)粒pAG1轉(zhuǎn)化WGIF01菌株獲得的。這個(gè)在大腸桿菌和釀酒酵母之間的穿梭質(zhì)粒攜帶其相應(yīng)的cDNA在GAL10/CYC1啟動(dòng)子控制之下的Δ7-還原酶的表達(dá)盒。WGIF01菌株通過(guò)氯化鋰技術(shù)轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化子在不含有腺嘌呤的培養(yǎng)基上被選擇出來(lái)。Δ7-還原酶的表達(dá)通過(guò)在正確克隆的固醇圖譜中出現(xiàn)膽甾-5，24(25)-二烯醇來(lái)驗(yàn)證。更特定地選擇滿(mǎn)足這些標(biāo)準(zhǔn)的克隆并稱(chēng)為WGIF03。
WGIF03菌株培養(yǎng)在含有2％D-葡萄糖的50ml體積的Kappeli培養(yǎng)基中(Kappeli等人，1985)，用于固醇的定量和比較分析。
起始培養(yǎng)物的光密度在600nm是0.1。這個(gè)培養(yǎng)物在30℃的溫度，以200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)72小時(shí)。
然后細(xì)胞通過(guò)在600g離心培養(yǎng)基10分鐘來(lái)回收，細(xì)胞顆粒沉淀通過(guò)實(shí)施例5中提供的技術(shù)加以分析。所描述的各種分析使得鑒定由這個(gè)菌株生產(chǎn)的固醇成為可能。
WGIF01菌株中Δ7-固醇還原酶的表達(dá)(產(chǎn)生WGIF03菌株)，不同于Δ24-固醇還原酶的表達(dá)，導(dǎo)致該菌株固醇圖譜的深刻變化，其中幾乎完全消失膽甾-5，7，22，24-四烯醇、膽甾-7，24-二烯醇和膽甾-8，24-二烯醇。
這個(gè)活性由于出現(xiàn)如先前描述的被鑒定為膽甾-5，24-二烯醇或鏈甾醇的主峰故而也是明顯的。膽甾-8，24-二烯醇的數(shù)量從12變化至48％。對(duì)于WGIF01和WGIF03菌株分別是，檢測(cè)到的膽甾-5，7，24-三烯醇從30變化至3％，而檢測(cè)到的膽甾-5，7，22，24-四烯醇從23變化至4％。這些觀察結(jié)果出乎意料地表明，固醇Δ7-還原酶以幾乎不依賴(lài)于由固醇側(cè)鏈攜帶的不飽和狀態(tài)的方式還原膽甾-5，7-二烯醇。這個(gè)結(jié)果與用固醇Δ24-還原酶觀察到的結(jié)果相反。出乎意料地，固醇Δ7-還原酶的表達(dá)也導(dǎo)致與膽甾-5，7-二烯醇協(xié)同的分子的累積(12％)。然而，似乎是相對(duì)不可能的，盡管不是不可能的，這個(gè)分子是膽甾-5，7-二烯醇，其理論水平在這些條件下應(yīng)該降低而不是增加。出現(xiàn)少量的膽甾-5，22，24-三烯醇(8％)也是令人感興趣的。后者的固醇是固醇22-去飽和酶對(duì)膽甾-5，24-二烯醇，WGIF03菌株中的主要固醇(60％)(由固醇Δ7-還原酶還原膽甾-5，7，24-三烯醇產(chǎn)生)起作用的預(yù)期產(chǎn)物。膽甾-5，22，24-三烯醇的少量積累出乎意料地表明，膽甾-5，24-二烯醇不是固醇22-去飽和酶的優(yōu)良底物。借助在WGIF02菌株中獲得的結(jié)果(參照實(shí)施例12)，可推測(cè)在24-位存在不飽和(膽甾-5，24-二烯醇或膽甾-5，7，24-三烯醇)使固醇22-去飽和酶難以代謝該固醇。ERG6p酶轉(zhuǎn)化在24-位不飽和的膽甾為麥角甾的作用因而導(dǎo)致ERG5基因(22-去飽和酶)的較差底物轉(zhuǎn)化為優(yōu)良底物。
實(shí)施例14構(gòu)建WGIF04菌株并且鑒定這個(gè)菌株中存在的固醇WGIF04菌株是通過(guò)氯化鋰技術(shù)，用質(zhì)粒pAG1轉(zhuǎn)化WGIF02菌株獲得的，轉(zhuǎn)化子在既不含有腺嘌呤也不含有尿嘧啶的培養(yǎng)基上被選擇出來(lái)。然后正確的轉(zhuǎn)化子根據(jù)膽固醇累積的檢測(cè)來(lái)證實(shí)。滿(mǎn)足這些標(biāo)準(zhǔn)的克隆被更特定地加以選擇并稱(chēng)為WGIF04。WGIF04菌株的樣品于2004年4月22日被保藏在國(guó)家微生物保藏中心(CNCM)，InstitutPasteur，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，法國(guó)，保藏號(hào)為I-3203。
不能與WGIF04區(qū)分的菌株也可通過(guò)用pYES_Δ24轉(zhuǎn)化WGIF03菌株并應(yīng)用相同的選擇來(lái)獲得。
WGIF04菌株培養(yǎng)在含有2％D-葡萄糖的50ml體積的Kappeli培養(yǎng)基中，用于固醇的定量和比較分析。
起始培養(yǎng)物的光密度在600nm是0.1。這個(gè)培養(yǎng)物在30℃的溫度，以200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)72小時(shí)。
然后細(xì)胞通過(guò)在600g離心培養(yǎng)基10分鐘來(lái)回收，細(xì)胞顆粒沉淀通過(guò)實(shí)施例5中提供的技術(shù)加以分析。所描述的各種分析使得鑒定由這個(gè)菌株生產(chǎn)的固醇成為可能。
膽固醇表現(xiàn)為WGIF04菌株游離固醇的25％(參照?qǐng)D9)。這個(gè)菌株中膽固醇的形成是通過(guò)協(xié)同可靠的標(biāo)準(zhǔn)和通過(guò)GC/MA和HPLC/MS的驗(yàn)證在GC和HPLC中獨(dú)立證實(shí)的。膽固醇在不同時(shí)表達(dá)Δ7-還原酶和Δ24-還原酶的所有菌株中是未檢測(cè)到的(＜0.5％的總固醇)。
不具有erg6基因打斷的菌株能夠生產(chǎn)膽固醇；然而這表現(xiàn)為小于總游離固醇的5％。因此，可能構(gòu)建從用pYES_Δ24和pAG1共轉(zhuǎn)化的BMA64獲得的BMA64-pYES_Δ24-pAG1菌株。這個(gè)菌株生產(chǎn)膽固醇，后者表現(xiàn)為總固醇的一些％。
CA10菌株用質(zhì)粒pYES_Δ24轉(zhuǎn)化。這個(gè)菌株也生產(chǎn)膽固醇，后者表現(xiàn)為總固醇的一些％。
此外，可能證明膽固醇的形成明顯需要Δ7-還原酶和Δ24-還原酶啟動(dòng)子的誘導(dǎo)(參照?qǐng)D4和5)。含有這些基因的菌株在缺乏誘導(dǎo)時(shí)不生產(chǎn)膽固醇；圖5表明誘導(dǎo)大約24h后，達(dá)到膽固醇的最大水平。與膽固醇(膽甾-5-烯醇)的形成相平行，也觀察到膽甾-5，22-二烯醇的形成。圖4和圖5的分析表明誘導(dǎo)后，后者化合物的形成比膽固醇的形成更快，甚至在誘導(dǎo)前就開(kāi)始形成(參照?qǐng)D5Am/z＝367)。然而，如果菌株沒(méi)有攜帶兩個(gè)質(zhì)粒pAG1和pYES_Δ24，這個(gè)化合物是完全缺乏的。因此22-脫氫膽固醇的形成比膽固醇的形成是更快的過(guò)程，但這個(gè)過(guò)程涉及在誘導(dǎo)后快速消失，為膽固醇的形成留下空間的前體。膽固醇可借助Δ24-還原酶從膽甾-5，24或借助Δ7-還原酶從膽甾-5，7形成?，F(xiàn)在已經(jīng)顯示膽甾-5，7-二烯醇由于其立即被轉(zhuǎn)化為膽甾-5，7，22-三烯醇的事實(shí)而不累積。因此膽固醇的來(lái)源是膽甾-5，24-二烯醇，其在誘導(dǎo)的時(shí)候是缺乏的，而在誘導(dǎo)大約4至8小時(shí)的時(shí)候累積，然后在大約24h減少(圖5)。這解釋了膽固醇的晚期出現(xiàn)，因?yàn)樾枰戠?5，24-二烯醇的在先合成。反之，膽甾-5，22-二烯醇的2個(gè)可能前體是膽甾-5，7，22-三烯醇和膽甾-5，22，24-三烯醇。后者在開(kāi)始誘導(dǎo)時(shí)是缺乏的(圖4)，而前者是存在的，然后平行于膽甾-5，22-二烯醇形成的穩(wěn)定而快速減少。由此得出結(jié)論，膽固醇的來(lái)源是經(jīng)Δ24-還原酶的5，24-二烯醇的還原，而膽甾-5，22-二烯醇的形成由經(jīng)Δ7-還原酶的5，7，22-三烯醇的還原產(chǎn)生。通過(guò)Δ22-去飽和酶對(duì)膽固醇的作用形成膽甾-5，22-二烯醇不完全在討論范圍之外，但基于在動(dòng)力學(xué)的長(zhǎng)期時(shí)點(diǎn)(24h)與膽甾-5，22-二烯醇相比較的膽固醇的優(yōu)先累積，膽甾-5，22-二烯醇的形成似乎是次要的過(guò)程(圖4和5)。
實(shí)施例15Δ22-去飽和酶的作用，優(yōu)化膽固醇的生物合成途徑
對(duì)于WGIF04菌株約為24h的誘導(dǎo)時(shí)間，就游離固醇而言，膽甾-5，22-二烯醇的累積表現(xiàn)為膽固醇累積的大約50％(圖4)。Δ22-去飽和酶基因的打斷是用于優(yōu)化膽固醇生產(chǎn)的一個(gè)選擇。構(gòu)建雙重打斷Δ22-去飽和酶(erg5基因)和erg6基因，并且表達(dá)Δ7-還原酶和Δ24-還原酶的菌株是完全可以想象到的。攜帶子集打斷Δ22-去飽和酶、表達(dá)Δ7-還原酶和表達(dá)Δ24-還原酶的菌株被生產(chǎn)出來(lái)。
這個(gè)菌株是通過(guò)氯化鋰技術(shù)，用質(zhì)粒pYES_Δ24轉(zhuǎn)化CA10菌株并通過(guò)關(guān)于尿嘧啶的原養(yǎng)型來(lái)獲得的。所得到的菌株稱(chēng)為CA10/Δ24。
表達(dá)Δ24固醇還原酶的CA10菌株生產(chǎn)相對(duì)少量的膽固醇(參照?qǐng)D6和7)并且主要累積麥角甾-5-烯醇和中間量的麥角甾-5，7-二烯醇。在這個(gè)菌株中麥角甾-5，7-二烯醇的積累是極低的，表明erg6基因的打斷對(duì)于膽甾系列衍生物的大量累積是很必要的。因此Δ24還原酶的活性令人驚訝地相對(duì)很少與erg6基因產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)。由這些結(jié)果可得出結(jié)論，erg5和erg6基因的同時(shí)打斷對(duì)于優(yōu)化膽固醇生產(chǎn)的目的是很重要的。
WGIF04菌株中erg5基因的打斷使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員可能相當(dāng)大地增加膽固醇的生產(chǎn)。這個(gè)菌株的可適用性是通過(guò)WGIF04和CA10/Δ24菌株的構(gòu)建和這個(gè)菌株只是從前述兩個(gè)菌株產(chǎn)生的明顯遺傳組合的事實(shí)確立的。源自WGIF04的數(shù)據(jù)表明當(dāng)Δ24-還原酶表達(dá)時(shí)，膽甾-5，24快速消失(將用WGIF03獲得的結(jié)果與用WGIF04獲得的進(jìn)行比較)。這使得預(yù)測(cè)膽固醇將在同時(shí)打斷erg5和erg6基因并且共表達(dá)Δ7-還原酶和Δ24-還原酶，然后該膽固醇是唯一終末固醇的菌株中非常有效地被合成成為可能。
總而言之，對(duì)在閾值以上或等于總固醇20％的膽固醇生產(chǎn)的最小要求是打斷erg6基因，表達(dá)Δ7-還原酶和Δ24-還原酶。Δ22-去飽和酶的補(bǔ)充打斷使得提高膽固醇的產(chǎn)率和消除膽甾-5，22-二烯醇作為終末固醇的附加形成成為可能。
實(shí)施例16膽固醇的同位素標(biāo)記和同位素標(biāo)簽的限定生產(chǎn)標(biāo)記膽固醇的原理在圖10中有描述。這個(gè)操作首先包括使酵母生長(zhǎng)在用13C完全標(biāo)記的葡萄糖上，在30℃培養(yǎng)72小時(shí)。
然后細(xì)胞通過(guò)在600g離心培養(yǎng)基10分鐘來(lái)回收。細(xì)胞沉淀顆粒再懸浮在含有未用13C碳標(biāo)記的2％半乳糖的50ml新鮮的Kappeli培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)換為半乳糖后2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)或24小時(shí)終止培養(yǎng)，提取固醇并進(jìn)行分析(參照實(shí)施例7)。從葡萄糖轉(zhuǎn)換為半乳糖導(dǎo)致誘導(dǎo)GAL10/CYC1啟動(dòng)子控制Δ7-還原酶基因和Δ24-還原酶基因。同時(shí)存在碳源同位素標(biāo)記的變化。其確保代謝中間物以及隨后的固醇，包括膽固醇的重新合成，其包括標(biāo)記的逐步變化。標(biāo)記中的這個(gè)變化以每種中間物固醇的質(zhì)量分布圖譜為特征。實(shí)際上，每個(gè)13C原子的摻入誘導(dǎo)一個(gè)原子量單位(AMU)質(zhì)量的遷移。因此例如，膽固醇表現(xiàn)為摩爾質(zhì)量范圍根據(jù)標(biāo)記的程度為386至413道爾頓。在利用正電噴射離子化的HPLC-質(zhì)量分析中，這相應(yīng)于范圍為369至396(離子M+H+-H2O，即M+1-18＝385-17＝369)的m/z(質(zhì)量/電荷)值。HPLC中固醇的滯留時(shí)間不是可檢測(cè)地依賴(lài)于標(biāo)記的程度。相應(yīng)于單個(gè)固醇“X”的HPLC峰的質(zhì)譜相應(yīng)于標(biāo)記后在不同時(shí)間合成的固醇“X”質(zhì)量分布的疊加(總和)的質(zhì)量分布。因此它是復(fù)雜(圖11)、但完全可被實(shí)驗(yàn)確定、并且表現(xiàn)獨(dú)特同位素標(biāo)簽的分布圖譜，其同時(shí)取決于-1)標(biāo)記方案，特別是使用12C葡萄糖和13C半乳糖的培養(yǎng)時(shí)間和條件，-2)所使用菌株的精確遺傳結(jié)構(gòu)，-3)培養(yǎng)終止的精確時(shí)間。
這個(gè)同位素圖譜具有幾個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)-1)它可通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件、使用的菌株和選擇的固醇按需調(diào)節(jié)。因此獨(dú)特的標(biāo)記指示可被生產(chǎn)出來(lái)；-2)它是“可結(jié)合的”，即相應(yīng)于用其本身可被調(diào)節(jié)的同位素圖譜標(biāo)記的幾個(gè)獨(dú)特固醇的幾個(gè)同位素標(biāo)簽可結(jié)合在一起以形成“分子字母表”；-3)它是可重復(fù)的，且易于實(shí)驗(yàn)確定(參照?qǐng)D11和12)表明該圖譜的可重復(fù)性的雙重或三重曲線；-4)它相應(yīng)于易于分離、穩(wěn)定、無(wú)色且無(wú)嗅、不揮發(fā)且無(wú)毒，以及可被摻入食品、醫(yī)用制品、添加劑或可被人類(lèi)吸收的其他產(chǎn)品的分子追蹤混合物；-5)沒(méi)有特定的重組菌株和非常精確的標(biāo)記、培養(yǎng)和提取條件，它就不能被偽造。此外，對(duì)同位素標(biāo)簽的了解并不能使追蹤使其可能被生產(chǎn)出來(lái)的參數(shù)成為可能。
概括來(lái)說(shuō)，不能被偽造并且可被摻入任何類(lèi)型產(chǎn)品，包括消費(fèi)品的廣泛使用的“同位素字母表”，可借助本發(fā)明而容易地獲得。實(shí)際上存在可從使用標(biāo)記分布圖譜和各種類(lèi)型固醇的這種字母表組成的無(wú)數(shù)“同位素單詞”。因此這種標(biāo)簽進(jìn)入大多數(shù)不同產(chǎn)品的摻入構(gòu)成了不能被偽造的獨(dú)特標(biāo)記方法，其不同于例如一旦已知?jiǎng)t能被再現(xiàn)的DNA標(biāo)簽。此外該標(biāo)簽?zāi)軌蛲ㄟ^(guò)例如，激光電離和隨后的質(zhì)譜分析(MALDI-TOF等)被非破壞性地讀取。
實(shí)施例17生產(chǎn)用13C高度標(biāo)記的非動(dòng)物膽固醇使用13C半乳糖或13C乙醇和葡萄糖替代未標(biāo)記的碳源用于在上述用于固醇分析的條件下培養(yǎng)WGIF04菌株使得合成極高度標(biāo)記的固醇，特別是膽固醇(至少包括95％的13C碳)成為可能。通過(guò)相同的方法，制備14C-放射性的固醇和膽固醇也是可能的。該方法也可被引入生產(chǎn)類(lèi)固醇，特別是皮質(zhì)甾醇的酵母菌株(參照專(zhuān)利申請(qǐng)WO02/061109)，以生產(chǎn)13C-標(biāo)記或14C-標(biāo)記的類(lèi)固醇，例如用于RIA測(cè)定。
實(shí)施例18構(gòu)建主要生產(chǎn)膽固醇的菌株CDR07 Mata菌株在以編號(hào)WO 02/061109公布的專(zhuān)利申請(qǐng)中有描述，并且在CNCM根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2001年1月24日以保藏號(hào)I-2616被保藏在國(guó)家微生物保藏中心(CNCM)，rue du DocteurRoux，75724 Paris Cedex 15，法國(guó)。
CDR07 MATa菌株(相關(guān)標(biāo)記ade2::GAL10/CYC1p::Δ7；erg5::PGK1p::hygroR；ERG6)與實(shí)施例1中描述的WGIF01菌株(相關(guān)標(biāo)記ERG5；erg6::TRP1)雜交。
二倍體的孢子形成后，如實(shí)施例6中所描述的，確定孢子的固醇組成以發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)為膽固醇前體的鏈甾醇的孢子。具有功能性TRP1基因并且如通過(guò)PCR分析所表明的，攜帶擬南芥Δ7-還原酶cDNA的生產(chǎn)鏈甾醇的孢子由此被鑒定出來(lái)。此外，稱(chēng)為YIM59的這個(gè)菌株對(duì)潮霉素敏感，表明ERG5基因是功能性的。
如實(shí)施例6和9所描述的制備的固醇制品顯示這個(gè)YIM59菌株生產(chǎn)與酵母甾醇和鏈甾醇具有相同滯留時(shí)間的固醇。YIM59菌株也顯示腺嘌呤、亮氨酸、尿嘧啶和組氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。鏈甾醇的存在證明這個(gè)菌株表達(dá)固醇Δ7還原酶并且其攜帶非功能性的erg6等位基因。
為了提高人DHCR24的表達(dá)水平，改變DHCR24 cDNA的核苷酸序列；為了增加在起始ATG的翻譯，也改變控制DHCR24表達(dá)的啟動(dòng)子。選擇的新啟動(dòng)子是細(xì)胞色素c1的CYC1啟動(dòng)子，作為質(zhì)粒pYES_Δ24的GAL1誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的替代(參照實(shí)施例3)。
相應(yīng)于與CYC1啟動(dòng)子融合的DHCR24還原酶末端NH2的序列被改變?nèi)缦聇agcgtggatggccaggcaactttagtgctgacacatacaggcatatatatatgtgtgcgacgacacatgatcatatggcatgcatgtgctctgtatgtatataaaactcttgttttcttcttttctctaaatattctttccttatacattaggtcctttgtagcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaaggaattgacaagtttgtacaaaaaagcaggctaaaaaATGGAACCTGCCGTGTCGCTGGCCGTGTGCG (SEQID No. 7).
小寫(xiě)字母代表CYC1啟動(dòng)子的部分核苷酸序列，繼之以AttB1重組序列，然后是先于起始ATG的AAAA序列。最初兩個(gè)密碼子的序列也被改變(ATG起始密碼子后的序列GAA-CCT)。
攜帶在CYC1啟動(dòng)子控制之下的DHCR24 cDNA、釀酒酵母2μ復(fù)制原點(diǎn)和URA3-d選擇標(biāo)記的最終質(zhì)粒被稱(chēng)為pIM331。其沒(méi)有DHCR24 cDNA的等同物被稱(chēng)為pIM303。
YIM59菌株用質(zhì)粒pIM303和pIM331獨(dú)立轉(zhuǎn)化，攜帶質(zhì)粒pIM303(YIM59/pIM303菌株)或pIM331(YIM59/pIM331菌株)的兩個(gè)轉(zhuǎn)化子被更特定地選擇出來(lái)。
這些菌株于28℃培養(yǎng)在重新構(gòu)成的Kappeli型豐富培養(yǎng)基中72小時(shí)，以獲得在600nm為40的吸光率。YIM59/pIM303菌株(不攜帶DHCR24 cDNA)和YIM59/pIM331菌株(攜帶DHCR24 cDNA)的總固醇提取物(酯化的固醇和游離的固醇)在存在甲醇?xì)溲趸洉r(shí)(參照實(shí)施例5和6)被生產(chǎn)出來(lái)。測(cè)試這兩個(gè)菌株生產(chǎn)膽固醇的能力。一些結(jié)果(GC)在圖13中給出。呈現(xiàn)的滯留時(shí)間在兩個(gè)色譜上表示為分鐘。
如此可能顯示不攜帶表達(dá)DHCR24的載體的菌株(YIM59/pIM303菌株)不生產(chǎn)膽固醇(部分A)，而主要是鏈甾醇(部分A)。相反，攜帶DHCR24 cDNA的菌株(YIM59/pIM331菌株)生產(chǎn)具有膽固醇的滯留時(shí)間的固醇(部分B)。通過(guò)偶連有電子轟擊質(zhì)譜術(shù)的氣相色譜技術(shù)(如實(shí)施例6中所描述的)可能證明，這個(gè)固醇實(shí)際上是膽固醇。利用各個(gè)固醇峰的表面積，可能評(píng)估由YIM59/pIM331菌株生產(chǎn)的膽固醇的數(shù)量是固醇的57％。
生物材料的保藏下列生物體根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于2004年4月22日保藏在國(guó)家微生物保藏中心(CNCM)，25 rue du Docteur Roux，75724 ParisCedex 15，法國(guó)。
-WGIF04菌株以保藏號(hào)I-3203保藏。
所有提及的出版物和專(zhuān)利被引入本申請(qǐng)作為參考。
參考文獻(xiàn)-Adams，A.K.，和C.Holm.1996.Mol Cell Biol.
164614-20。
-Ausubel Fred M.，Brent Roger，Kingston Robert E.，Moore David D.，Seidman J.G.，Smith John A.，StruhlKevin (Editors). Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons Inc出版。
Current Protocols Customer Service，605 ThirdAvenue，9th Floor New York，NY 10158 USA(2002年3月出版更新)。
-Baudin-Baillieu，A.，E.Guillemet，C.Cullin，和F.
Lacroute.1997.Yeast.13353-6。
-Bonneaud，N.，O.Ozier-Kalogeropoulos，G.Y.Li，M.
Labouesse，L.Minvielle-Sebastia，和F.Lacroute.
1991.Yeast.7609-15。
-Bowman，S.等人.1997.Nature.38790-3。
-Duport，C.，B.Schoepp，E.Chatelain，R.Spagnoli，B.Dumas，和D.Pompon.2003.Eur J Biochem.
2701502-14。
-Gietz，R.D.，R.H.Schiestl，A.R.Willems，和R.A.
Woods.1995.Yeast.11355-60。
-Goffeau，A.，等人.1996.Science.274546，563-7。
-Jensen-Pergakes，K.L.，M.A.Kennedy，N.D.Lees，R.
Barbuch，C.Koegel，和M.Bard.1998.AntimicrobAgents Chemother.421160-7。
-Kaneshiro，E.S.，J.A.Rosenfeld，M.Basselin-Eiweida，J.R.Stringer，S.P.Keely，A.G.Smulian，和J.L.Giner.2002.Mol Microbiol.44989-99。
-Kappeli，O.，M.Arreguin，和M.Rieger.1985.JGen Microbiol.1311411-6。
-Kelly，S.L.，D.C.Lamb，B.C.Baldwin，A.J.Corran，和D.E.Kelly.1997.J Biol Chem.2729986-8。
-Lecain，E.，X.Chenivesse，R.Spagnoli，和D.
Pompon.1996.J Biol Chem.27110866-73。
-McCammon，M.T.，M.A.Hartmann，C.D.Bottema，和L.W.Parks.1984.J Bacteriol.157475-83。
-Moebius，F(xiàn).F.，B.U.Fitzky，J.N.Lee，Y.K.Paik，和H.Glossmann.1998.Proc Natl Acad Sci USA.
951899-902。
-Noda，H.，和Y.Koizumi.2003.Insect Biochem MolBiol.33649-58。
-Ozier-Kalogeropoulos，O.，A.Malpertuy，J.Boyer，F(xiàn).
Tekaia，和B.Dujon.1998.Nucleic Acids Res.
265511-24-Skaggs，B.A.，J.F.Alexander，C.A.Pierson，K.S.
Schweitzer，K.T.Chun，C.Koegel，R.Barbuch，和M.
Bard.1996.Gene.169105-9。
-Sturley，S.L.2000.Biochim Biophys Acta.
1529155-63。
-Szczebara，F(xiàn).M.，等人.2003.Nat Biotechnol.
21143-9。
-Tait，E.，M.C.Simon，S.King，A.J.Brown，N.A.Gow，和D.J.Shaw.1997.Fungal Genet Biol.21308-14。
-Taton，M.，和A.Rahier.1991.Biochem Biophys ResCommun.181465-73。
-Taylor，F(xiàn).R.，和L.W.Parks.1978.J Bacteriol.
136531-7。
-Waterham，H.R.，J.Koster，G.J.Romeijn，R.C.
Hennekam，P. Vreken，H.C.Andersson，D.R.
FitzPatrick，R.I.Kelley，和R.J.Wanders.2001.
Am J Hum Genet.69685-94。
-Wood，V.，等人2002.Nature.415871-80。
表1固醇不飽和度光譜分布的評(píng)估(消光系數(shù)mM-1cm-1)
序列表<110>Aventis Pharma S.A.
<120>生產(chǎn)膽固醇的酵母菌株及其用途<130>PRJ02025<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>63<212>DNA<213>人工<400>1cctagcgacg aaaagcatca ttggagtgaa taacttggac ttaccattct tagcattttg60acg 63<210>2<211>68<212>DNA<213>人工<400>2gcataagagt gaaacagaat tgagaaaaag acaggcccaa ttcaaattcg ggtcgaaaaa60agaaaagg 68<210>3<211>25<212>DNA<213>人工<400>3agggccgaac aaagccccga tcttc 25<210>4
<211>21<212>DNA<213>人工<400>4ggcaaaccga ggaactcttgg21<210>5<211>36<212>DNA<213>人工<400>5tatatagcgg ccgctttcgc tgattaatta ccccag 36<210>6<211>34<212>DNA<213>人工<400>6tatatagcgg ccgcgagaag tgacgcaagc atca 34<210>7<211>270<212>DNA<213>人工<400>7tagcgtggat ggccaggcaa ctttagtgct gacacataca ggcatatata tatgtgtgcg 60acgacacatg atcatatggc atgcatgtgc tctgtatgta tataaaactc ttgttttctt120cttttctcta aatattcttt ccttatacat taggtccttt gtagcataaa ttactatact180tctatagaca cgcaaacaca aaggaattga caagtttgta caaaaaagca ggctaaaaaa240tggaacctgc cgtgtcgctg gccgtgtgcg 270
權(quán)利要求
1.一種自主生產(chǎn)膽固醇的真菌界的生物體。
2.權(quán)利要求1所述的生物體，其特征在于它是被遺傳改變3的。
3.權(quán)利要求1或2所述的生物體，其特征在于它從單一碳源生產(chǎn)膽固醇。
4.權(quán)利要求1至3之一項(xiàng)所述的生物體，其特征在于它表達(dá)7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶。
5.權(quán)利要求4所述的生物體，其中固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)失活。
6.權(quán)利要求4或5所述的生物體，其中C-22固醇去飽和酶已經(jīng)失活。
7.權(quán)利要求4至6之一項(xiàng)所述的生物體，其特征在于7-脫氫膽固醇還原酶和3β-羥基固醇Δ24-還原酶的表達(dá)是通過(guò)該生物體的轉(zhuǎn)化獲得的。
8.權(quán)利要求5至7之一項(xiàng)所述的生物體，其特征在于固醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶的失活是通過(guò)基因失活進(jìn)行的。
9.權(quán)利要求5至8之一項(xiàng)所述的生物體，其特征在于C-22固醇去飽和酶的失活是通過(guò)基因失活進(jìn)行的。
10.前述權(quán)利要求之一項(xiàng)所述的生物體，其特征在于它選自酵母屬(Saccharomyces)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。
11.一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，其特征在于它是于2004年4月22日在國(guó)家微生物保藏中心(CNCM)保藏、保藏號(hào)為I-3203的WGIF04菌株。
12.一種用于生產(chǎn)非動(dòng)物來(lái)源的膽固醇的方法，包括培養(yǎng)如前述權(quán)利要求之一項(xiàng)所述的生物體。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于該由培養(yǎng)生物體組成的步驟之后是包括提取膽固醇的步驟。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于膽固醇的提取是用非水溶性溶劑進(jìn)行的。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于皂化步驟是在膽固醇提取之前進(jìn)行的。
16.如權(quán)利要求13、14或15所述的方法，其特征在于由機(jī)械研磨細(xì)胞組成的步驟是在皂化或膽固醇的提取之前進(jìn)行的。
17.如權(quán)利要求1至11之一項(xiàng)所述的生物體用于生產(chǎn)以13C或14C標(biāo)記的膽固醇、或其代謝中間物中的一種、或固醇混合物的用途。
18.用于生產(chǎn)以13C或14C標(biāo)記的膽固醇、或其代謝中間物中的一種、或固醇混合物的方法，包括下列步驟-在13C-標(biāo)記或14C-標(biāo)記的底物上培養(yǎng)權(quán)利要求1至11之一項(xiàng)所述的生物體，以及-提取所述的膽固醇、或其代謝中間物中的一種、或固醇混合物。
19.用于生產(chǎn)利用同位素標(biāo)記物在不同位置進(jìn)行標(biāo)記的膽固醇、膽固醇中間物或膽固醇代謝物的同位素混合物的方法，包括在標(biāo)記的底物，以及然后是未標(biāo)記的底物上培養(yǎng)權(quán)利要求1至9之一項(xiàng)所述的生物體，選擇在這些底物每一個(gè)上的培養(yǎng)時(shí)間以獲得明確的同位素分布圖譜。
20.包含利用同位素標(biāo)記物在不同位置進(jìn)行標(biāo)記并且具有明確同位素分布圖譜的膽固醇、膽固醇中間物或膽固醇代謝物的同位素混合物作為可追蹤標(biāo)記的組合物。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其特征在于它旨在用于人或動(dòng)物的食品或治療領(lǐng)域。
22.利用同位素標(biāo)記物在不同位置進(jìn)行標(biāo)記并且具有明確同位素分布圖譜的膽固醇、膽固醇中間物或膽固醇代謝物的、可通過(guò)權(quán)利要求19所述的生產(chǎn)方法獲得的分子樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌界生物體中的膽固醇生產(chǎn)。更特別地，本發(fā)明涉及從單一碳源獨(dú)立生產(chǎn)膽固醇的被遺傳改變的真菌。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的真菌用于生產(chǎn)未標(biāo)記和標(biāo)記的膽固醇的用途。
文檔編號(hào)A61K51/04GK1981029SQ200580022739
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月6日
發(fā)明者D·龐旁, B·杜馬斯, R·斯帕格諾利 申請(qǐng)人:艾文蒂斯藥品公司