專利名稱：GSK－3β的調(diào)節(jié)及治療增殖性病變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及治療增殖性病變(包括癌癥)的方法，尤其是促進(jìn)增殖細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的方法。
背景技術(shù)：
通常，細(xì)胞具有控制生長和增殖的機(jī)制，使得細(xì)胞僅在特定的環(huán)境下有控制地進(jìn)行分化和生長。當(dāng)控制細(xì)胞生長和增殖的正常調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞時，細(xì)胞還具有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的機(jī)制。但是，在有的情況下，這種增殖控制和細(xì)胞凋亡機(jī)制出現(xiàn)故障，使得細(xì)胞無抑制地增殖，有可能引發(fā)生物體內(nèi)的增殖性病變或疾病。這類增殖性病變包括癌癥及其它細(xì)胞過多的病變，如牛皮癬、疣和瘢痕瘤。
細(xì)胞蛋白p53突變和失調(diào)常見于各種細(xì)胞增殖性病變(包括多種癌癥)中。在正常、健康的細(xì)胞中，p53通路可通過廣泛的傷害性刺激被激活，造成細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞凋亡。這一過程需要p53蛋白的積聚，然后通過靶基因轉(zhuǎn)錄激活引起其生理學(xué)效應(yīng)(Burns，T.F.and E1-Deiry，W.S.，J CellPhysiol，181231-239，1999；Gottlieb，T.M.and Oren，M.，Semin Cancer Biol，8359-368，1998；Levine，A.J.，Cell，88323-331，1997；Vousden，K.H.and Lu，X.，Nat Rev Cancer，2594-604，2002)。目前的證據(jù)表明細(xì)胞通過周期素依賴性蛋白激酶抑制因子p21的轉(zhuǎn)錄激活產(chǎn)生細(xì)胞周期停滯(Deng，C，et al.Cell，82675-684，1995；Chan，T.A.，et al.Genes Dev，141584-1588，2000；Brugarolas，J.，et al.Nature，377552-557，1995；el-Deiry，W.S.，et al.Cell，75817-825，1993；Bates，S.，et al.Oncogene，171691-1703，1998)或通過促細(xì)胞凋亡基因(如Puma，Noxa和Bax)的誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞凋亡(Vousden，K.H.and Lu，X.，Nat Rev Cancer，2594-604，2002；Fridman，J.S.and Lowe，Oncogene，229030-9040，2003；Kho，P.S.，et al.J Biol Chem，27921183-21192，2004)。人們對控制細(xì)胞對p53應(yīng)答的命運(yùn)的精密機(jī)制仍所知甚少，不過有人提出p53應(yīng)答最終依賴于傾向生長停滯與傾向細(xì)胞凋亡的p53靶基因之間的轉(zhuǎn)錄平衡。大多數(shù)化療藥物通過激活p53通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，p53基因的突變造成細(xì)胞凋亡通路逃避，引起更激進(jìn)的表型及對化療的抗性。
基于p53的藥理學(xué)的目的是為了將對p53生物學(xué)的理解轉(zhuǎn)換為有效的治療方案，從而促進(jìn)功能異常增殖細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)中的細(xì)胞凋亡。操控p53靶基因(Seoane，J.，et al.Nature，419729-734，2002)或p53轉(zhuǎn)錄輔因子(Iyer，N.G.，et al.Proc Natl Acad Sci U S A，1017386-7391，2004)水平的遺傳學(xué)方法已被用于不同系統(tǒng)中調(diào)節(jié)p53靶基因表達(dá)水平之間的精確平衡，最終促進(jìn)p53-依賴性細(xì)胞凋亡。這些試驗對理解p53-誘導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)的細(xì)胞控制很重要，治療結(jié)果還有待于對這些試驗的觀察。
近期研究表明p53可直接在線粒體處誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53已被證實能直接激活促細(xì)胞凋亡Bcl-2家族成員Bax或Bak(Seoane，J.，et al.Nature，419729-734，2002；Chipuk，J.E.，et al.Science，3031010-1014，2004；Mihara，M.，et al.MoI Cell，ll577-590，2003)并與抗細(xì)胞凋亡bcl-XL和Bcl-2蛋白形成抑制性復(fù)合物(Mihara，M.，et al.MoI Cell，11577-590，2003)。這些相互作用最終造成線粒體透化和細(xì)胞色素c釋放。這種選擇性p53死亡通路與細(xì)胞凋亡早期階段相互關(guān)聯(lián)，后者不依賴于p53轉(zhuǎn)錄活動獨(dú)立發(fā)生(Erster，S.，etal.MoI Cell Biol，246728-6741，2004)，并可通過p53的直接藥理學(xué)激活進(jìn)行調(diào)節(jié)(Erster，S.，et al.MoI Cell Biol，246728-6741，2004；Chipuk，J.E.，etal.Cancer Cell，4371-381，2003)。目前，人們對該通路的調(diào)節(jié)還所知甚少。但是，這種p53依賴性而非轉(zhuǎn)錄依賴性的細(xì)胞凋亡通路的藥理學(xué)激活也許能提供一種可行的治療增殖性病變(包括癌癥)的方法。
發(fā)明概要大多數(shù)化療藥物通過激活p53腫瘤抑制基因起作用來誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡。但是，p53在癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡功能常常因為p53突變或p53通路中其它成分的變更而喪失，造成含有這類突變或變更的癌細(xì)胞對化療的抵抗。由于p53細(xì)胞凋亡功能受抑制，化療藥物在這些癌細(xì)胞中只能得到有限應(yīng)答。此處描述了糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)在調(diào)節(jié)增殖細(xì)胞(如癌細(xì)胞，包括人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞)中p53功能的一種獨(dú)特作用。如此處所述，GSK-3β的藥理學(xué)調(diào)節(jié)能恢復(fù)正經(jīng)受化療的細(xì)胞的p53的細(xì)胞凋亡功能，從而促進(jìn)這類癌細(xì)胞(包括正經(jīng)受化療的人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞)發(fā)生細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步使得癌細(xì)胞(包括人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞)對化療作出有效應(yīng)答。
因此，本發(fā)明一方面提供治療細(xì)胞增殖性病變的方法，包括給有需要并正經(jīng)受化療的對象施用治療有效量的調(diào)節(jié)糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)活性的藥劑。
另一方面，本發(fā)明提供治療細(xì)胞增殖性病變的方法，包括給有需要的對象施用治療有效量的調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑，所述藥劑與化療藥物相組合。
又一方面，本發(fā)明提供誘導(dǎo)正經(jīng)受化療的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的方法，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞中糖原合酶激酶-3β的活性。
在又一方面，本發(fā)明提供誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的方法，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞中的糖原合酶激酶-3β活性，并將細(xì)胞與化療藥物相接觸。
在更多方面，本發(fā)明提供了治療有效量的調(diào)節(jié)糖原合酶激酶-3β活性的藥劑在治療正經(jīng)受化療的對象的細(xì)胞增殖性病變中的應(yīng)用，包括在制備用于治療所述病變的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了治療有效量的調(diào)節(jié)糖原GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在治療對象的細(xì)胞增殖性病變中的應(yīng)用，包括在制備用于治療所述病變的藥物中的應(yīng)用。
在更多方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑在誘導(dǎo)正經(jīng)受化療的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡中的應(yīng)用，包括在制備用于治療所述病變的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡中的應(yīng)用，包括在制備用于治療所述病變的藥物中的應(yīng)用。
在另一方面，本發(fā)明提供鑒別能用于治療細(xì)胞增殖性病變的化合物的方法，包括將糖原合酶激酶-3β與測試化合物相接觸，并測定在存在測試化合物的情況下該糖原合酶激酶-3β的活性是否被調(diào)節(jié)。
在另一方面，本發(fā)明還提供通過上述方法鑒別出的化合物。
在閱讀了以下對本發(fā)明具體實施方式
的描述及附圖之后，具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將對本發(fā)明的其它方面和特征有清楚的認(rèn)識。
圖形簡述以下圖示通過舉例的形式，對本發(fā)明的實施方式進(jìn)行了說明。


圖1A描繪了顯示經(jīng)LY2119301(5μm)或ADR(1μm)或二者共處理24小時后的HCT116和HCT116 p53-/-細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞術(shù)圖示。細(xì)胞凋亡(sub-G1)分?jǐn)?shù)如圖所示；圖1B顯示了在具有野生型或無p53表達(dá)的HCT116結(jié)腸直腸細(xì)胞中觀察到的細(xì)胞凋亡比例；圖2描繪了按圖1A處理的，并進(jìn)行活化抗caspase-3染色的HCT116細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)圖示。對活化caspase-3呈陽性的細(xì)胞比例如圖所示；圖3描繪了顯示經(jīng)依托泊甙(10μm)或喜樹堿(CPT，100nM)(使用或不使用LY2119301)處理24小時后的HCT116和HCT116 p53-/-細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞術(shù)圖示。細(xì)胞凋亡(subG1)分?jǐn)?shù)如圖所示；
圖4描繪了顯示經(jīng)阿霉素或依托泊甙(使用或不使用LY2119301)或單獨(dú)使用LY2119301處理的RKO細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞術(shù)圖示。細(xì)胞凋亡(subG1)分?jǐn)?shù)如圖所示；圖5描繪了在使用或不使用LY2119301的情況下，HCTI16細(xì)胞對不同5-FU濃度的劑量應(yīng)答。細(xì)胞凋亡分?jǐn)?shù)通過流式細(xì)胞術(shù)確定；圖6描繪了對表達(dá)p53 shRNA或所示對照載體(左面板)的HCTI16細(xì)胞中的p53水平的分析。所示細(xì)胞經(jīng)過LY2119301和ADR(1μm)或5-FU(100μm)24小時處理，并進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析。細(xì)胞凋亡(sub-G1)分?jǐn)?shù)如圖所示；圖7描繪了按圖1A處理的RKO和RKO/E6細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)圖示。細(xì)胞凋亡(sub-G1)分?jǐn)?shù)如圖所示；圖8描繪了LY2119301、SB-216763和SB-415286三種GSK-3抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖9描繪了經(jīng)鋰和DNA損傷處理的HCT116細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)圖示。細(xì)胞凋亡(sub-G1)分?jǐn)?shù)如圖所示；圖10描繪了顯示經(jīng)ADR與SB-216763或SB-415286處理的HCT116細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞術(shù)圖示。細(xì)胞凋亡(sub-G1)分?jǐn)?shù)如圖所示；圖11描繪了顯示經(jīng)LY21 19301、SB-216763和SB-415286(使用或不使用ADR)處理的細(xì)胞中p53、p21、PARP和β-肌動蛋白相對水平的免疫印跡分析。
圖12描繪了對經(jīng)鋰、LY2119301、SB-216763或SB-415286處理的HCT116細(xì)胞中的phosphor-ser9/21-GSK-3α/β、phosphor-tyr216/279-GSK-3α/β和總GSK-3α/β的免疫印跡分析；圖13描繪了在使用10μM依托泊甙進(jìn)行24小時處理前，使用GSK-3β或GSK-3α特異性siRNA和陰性對照siRNA(NC siRNA)對HCT116細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。GSK-3α/β和PARP裂解的水平通過免疫印跡進(jìn)行了分析；圖14描繪了對經(jīng)LY2119301、SB-216763或SB-415286(使用或不使用ADR)處理的細(xì)胞中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分的phosphor-ser9/21-GSK-3α/β、phosphor-tyr216/279-GSK-3α/β和總GSK-3α/β的免疫印跡分析；圖15描繪了對以規(guī)定時間和劑量經(jīng)ADR{上面板}、依托泊甙{中面板}、5-FU{底面板}(使用或不使用LY2119301)處理的HCTI16細(xì)胞中的p53、p21、puma、bax和PARP的免疫印跡分析，β-肌動蛋白被作為上樣對照；圖16描繪了對按圖15處理的RKO細(xì)胞中的p53、p21、puma、bax和PARP的免疫印跡分析；圖17描繪了對以所示藥物(使用或不使用鋰){左面板}處理，以及使用LY119301、SB-216673或SB-415286{右面板}的情況下經(jīng)ADR處理的HCTI16細(xì)胞中的p53、p21、puma、Bax和PARP的免疫印跡分析；圖18描繪了顯示經(jīng)ADR單獨(dú)處理或經(jīng)ADR和LY2119301處理的HCT116細(xì)胞中的p53應(yīng)答基因的微陣列分析。使用簇狀和樹狀觀察器聚集12種所選的之前已被鑒定為HCT116細(xì)胞中的靶基因的基因；圖19描繪了將p53-誘導(dǎo)DLD1細(xì)胞在含(tet off)或不含(tet on)20ng/ml強(qiáng)力霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。左面板在使用或不使用LY2119301情況下的流式細(xì)胞術(shù)圖示。右面板顯示p53、p21和PARP水平的蛋白質(zhì)印跡測定。
圖20描繪了使用LY2119301或DMSO對受Ad-p53或Ad-lacZ感染的HCT116細(xì)胞進(jìn)行24小時處理。對細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析{左面板}和針對p53、p21和PARP的免疫印跡分析{右面板}。NS-上樣對照；圖21描繪了顯示經(jīng)ADR或依托泊甙24小時處理(使用或不使用LY2119301)的HCTI16 Bax-/-細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞術(shù)圖示。細(xì)胞凋亡(sub-G1)分?jǐn)?shù)如圖所示；圖22描述了按圖21處理的HCT116 Puma-/-細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)圖示；圖23描述了對按所示處理的HCT116 Bax-/-細(xì)胞中的p53、p21和PARP的免疫印跡分析；
圖24描述了對按所示處理的HCT116 Puma-/-細(xì)胞中的p53、p21和PARP的免疫印跡分析；圖25描述了顯示經(jīng)所示藥物24小時處理{上面板}的HCT116細(xì)胞中的Bax激活的蛋白質(zhì)印跡測定。胞質(zhì)部分的蛋白質(zhì)印跡測定顯示了經(jīng)LY2119301和ADR或依托泊甙{下面板}共處理的HCT116細(xì)胞中的細(xì)胞色素c釋放及caspase-9的蛋白水解作用。
圖26描繪了顯示經(jīng)LY2119301處理，具p53誘導(dǎo)的DLD1細(xì)胞{左面板}和具p53過表達(dá)的HCT116細(xì)胞{右面板}中Bax激活的IP-蛋白質(zhì)印跡測定；圖27描述了顯示JC-1染色作為HCT116及HCT116 Bax-/-細(xì)胞中線粒體膜電勢指示的流式細(xì)胞術(shù)圖示。ψm喪失的細(xì)胞的百分比如圖所示；和圖28描述了在經(jīng)依托泊甙和5-FU處理(上面板)后胞質(zhì)和線粒體中p53積聚的時間過程分析。P53積聚出現(xiàn)在依托泊甙24小時處理后(使用或不使用LY2119301)。P53和線粒體標(biāo)記CoxIV的水平通過蛋白質(zhì)印跡分析確定。
發(fā)明詳述此處所描述的方法涉及通過調(diào)節(jié)GSK-3β的活性(或?qū)⑵渑c化療藥物相組合)來促進(jìn)、誘導(dǎo)或增強(qiáng)增殖細(xì)胞(包括正經(jīng)受化療的細(xì)胞)中的細(xì)胞凋亡應(yīng)答。
糖原合酶-3激酶(GSK-3)是一種組成型表達(dá)的絲氨酸-酪氨酸激酶。它具有兩種同種型(α和β)，并與多種信號通路相關(guān)(Cohen，P.and Frame，S.，Nat Rev MoI Cell Biol，2769-776，2001)。最初被描述為糖原代謝涉及的主要酶的GSK-3β現(xiàn)在被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)整多種細(xì)胞功能的作用，包括在神經(jīng)元和其它組織中起著前一細(xì)胞凋亡的作用(Watcharasit，P.，et al.，J Biol Chem，27848872-48879，2003；Herman，M.，et al.，J Neurosci，202567-2574，2000；Bijur，G.N.，et al.，J Biol Chem，2757583-7590，2000)。
本發(fā)明中的方法基于此處所述的發(fā)現(xiàn)，即GSK-3β的藥理學(xué)調(diào)節(jié)顯著損害了靶基因(包括p21和Puma)的p53-依賴轉(zhuǎn)活，但促進(jìn)了Bax的p53-依賴性構(gòu)象激活，造成細(xì)胞色素c釋放、線粒體膜電勢喪失及caspase-9加工。這些觀察結(jié)果表明p53-介導(dǎo)的損害應(yīng)答可被從細(xì)胞周期阻滯轉(zhuǎn)換為細(xì)胞凋亡，尤其是在被暴露于多種化療藥物之后。人們發(fā)現(xiàn)這種效應(yīng)似乎與GSK-3β的抑制性絲氨酸9磷酸化的調(diào)節(jié)有關(guān)，但與激活性酪氨酸磷酸化無關(guān)。人們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)似乎通過需要Bax而不是Puma的直接線粒體通路發(fā)生。
在此處描述的發(fā)現(xiàn)中，GSK-3β被發(fā)現(xiàn)參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞核和線粒體中的p53活動。與說明GSK-3β的促凋亡作用的其它研究不同，本方法基于GSK-3β的藥理學(xué)調(diào)節(jié)極大地促進(jìn)了正經(jīng)受化療的增殖細(xì)胞(包括癌細(xì)胞，如結(jié)腸直腸癌細(xì)胞)中的p53-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡這一發(fā)現(xiàn)。即使同時出現(xiàn)p53轉(zhuǎn)錄活性的損害，細(xì)胞凋亡也會發(fā)生，并且似乎通過直接線粒體p53活性(似乎需要Bax而不需要Puma)介導(dǎo)。不受任何具體理論的束縛，組成型表達(dá)的細(xì)胞激酶GSK-3β在調(diào)節(jié)p53通路方面似乎具有雙重但不同的作用促進(jìn)細(xì)胞核中的p53轉(zhuǎn)錄活性但抑制線粒體中p53的直接細(xì)胞凋亡活性。
因此，本方法涉及調(diào)節(jié)正經(jīng)受化療的不受控制的增殖細(xì)胞中的GSK-3β活性。這種調(diào)節(jié)將促進(jìn)、誘導(dǎo)或增強(qiáng)這類細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡應(yīng)答，以治療增殖性病變。
在一實施方式中，提供誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞中的糖原合酶激酶-3β活性。
此處使用的糖原合酶激酶-3β(″GSK-3β″)指的是糖原合酶激酶-3的β同種型，它在細(xì)胞凋亡應(yīng)答中起著作用，包括哺乳動物GSK-3β(包括人類GSK-3β)。該術(shù)語包括GSK-3β的同系物、片段、衍生物或具有GSK-3β的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用的GSK-3β變體，可通過調(diào)節(jié)這種活性來誘導(dǎo)增殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡應(yīng)答。
如果兩種序列在特定部位具實質(zhì)相同性并且序列保留了功能活性，那么一種多核苷酸序列或多肽序列是另一種序列的“同系物”、或與另一種序列“同源”(此處使用的術(shù)語“同源”不指進(jìn)化親緣關(guān)系)。當(dāng)最佳排列(允許存在缺口)時，如果兩種多聚核苷酸序列或多肽序列具有至少約50％的序列相同性，或序列具有特定的功能性基序，這兩種序列被視為具有實質(zhì)相同性。在選擇實施方式中，如果在特定部位具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的相同性，最佳排列的序列可被視為是實質(zhì)上相同的(即，具有實質(zhì)相同性)?！盁o關(guān)”或“非同源”序列與本發(fā)明的多肽或多核苷酸在特定同源性部位的相同性低于40％，并可能低于約35％、30％或25％。術(shù)語“相同性”和“相同”指的是兩種肽或兩種多核苷酸分子之間的序列相似性。相同性可通過比較排列序列中的各個位置進(jìn)行確定。氨基酸序列之間的相同性的程度是序列所占位置(即，特定部位)的相同或匹配氨基酸數(shù)目的函數(shù)。用于比較相同性的序列的最佳排列可使用多種算法進(jìn)行，如已知文獻(xiàn)中包括的ClustalW程序(參見http://clustalw.genome.ad.jp，the local hornology algorithm of Smith andWaterman，1981，Adv.Appl.Math 2482，the homology alignment algorithm ofNeedleman and Wunsch，1970，J MoI.Biol.48443，the search for similaritymethod of Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.ScL USA 852444，andthe computerised implementations of these algorithms(such as GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package.GeneticsComputer Group，Madison，WI，U.S.A.))。序列相同性還可通過BLAST算法進(jìn)行確定(參見Altschul et ah，1990，J.MoI.Biol.215403-10(使用公開缺省設(shè)置))。進(jìn)行BLAST分析的軟件可從國家生物技術(shù)信息中心獲得(通過網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此處所用的“同源氨基酸序列”包括任何具有全部或部分在低于臨界解鏈溫度(Tm)的25-35℃下雜交的核酸序列編碼，和任何含有哺乳動物GSK-3β(包括人GSK-3β)核酸序列編碼的多肽。
GSK-3β變體或衍生物指的是GSK-3β蛋白質(zhì)或保留有GSK-3β細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)活性的片段，或在一個或多個氨基酸發(fā)生突變(包括點(diǎn)突變、插入或缺失突變)，但仍保留有GSK-3β細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)活性的GSK-3β。變體或衍生物因此包括缺失(包括截斷和片段)；插入和添加(例如保守置換、定點(diǎn)突變和等位基因變體)；以及修飾(包括具有一種或多種與肽共價連接的非-氨基酰基(q.v.，糖、類脂等)的類肽)和翻譯后修飾。此處所用的術(shù)語“保守氨基酸置換”或“保守置換”指的是在肽指定位置一種氨基酸對另一種的置換，其中的置換可在不實質(zhì)喪失相關(guān)功能的情況下進(jìn)行。在進(jìn)行這類改變時，對相似氨基酸殘基的置換可基于側(cè)鏈置換基的相對相似性進(jìn)行，例如，它們的大小、電荷、疏水性、親水性等等，并且可通過常規(guī)測試對這類置換對肽功能的影響進(jìn)行測定。
GSK-3β的“細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)活性”或“細(xì)胞凋亡活性”指的是GSK-3β與p53細(xì)胞凋亡通路(包括細(xì)胞核中的p53轉(zhuǎn)錄激活通路和線粒體中的p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng))的相互作用或影響能力。GSK-3β的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)活性至少部分受到GSK-3β抑制性絲氨酸磷酸化的影響。例如，人GSK-3β中Ser9磷酸化增加將造成直接線粒體p53細(xì)胞凋亡通路的細(xì)胞凋亡應(yīng)答增加。GSK-3β的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)活性還可包括GSK-3β促進(jìn)p53-激活的轉(zhuǎn)錄的能力。
誘導(dǎo)細(xì)胞死亡指的是引發(fā)細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡或增強(qiáng)細(xì)胞遭受細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的能力或趨勢，或增強(qiáng)細(xì)胞對可能引發(fā)細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的事件的敏感性，此處所用的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡指的是作為對GSK-3β活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的直接或間接結(jié)果。細(xì)胞死亡或凋亡可通過標(biāo)準(zhǔn)凋亡測定法或通過檢測已知凋亡標(biāo)記(例如，細(xì)胞色素c釋放、線粒體膜電勢喪失、caspase-3激活、caspase-9加工、PARP裂解或細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞群中亞-GI數(shù)增加，本領(lǐng)域人員都知道)進(jìn)行測量。誘導(dǎo)細(xì)胞死亡可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。
當(dāng)說到將被誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的細(xì)胞，或增殖細(xì)胞(包括增殖性病變中涉及的細(xì)胞)時，除非另有說明，術(shù)語“細(xì)胞”指的是單個細(xì)胞、多個細(xì)胞或細(xì)胞群。細(xì)胞可以是任何需要在其中抑制增殖或分化的細(xì)胞，或在其中需誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的細(xì)胞(包括喪失了經(jīng)受細(xì)胞周期停滯或凋亡能力的細(xì)胞)。細(xì)胞可以是培養(yǎng)中的細(xì)胞，也可是病人體內(nèi)的細(xì)胞。此處所使用的細(xì)胞增殖指的是DNA復(fù)制、生長和分化的過程，這將引起細(xì)胞總數(shù)的增加。細(xì)胞可以來自任何表達(dá)GSK-3β同系物的生物體，在具體實施方式
中為哺乳動物細(xì)胞，包括小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、兔細(xì)胞或人細(xì)胞。
細(xì)胞可以是正在經(jīng)受化療的細(xì)胞，即細(xì)胞正在被進(jìn)行化療方案處理，包括與調(diào)節(jié)GSK-3β活性同時、與之重疊或與之順序處理，條件是化療的作用或效果與調(diào)節(jié)在細(xì)胞內(nèi)伴隨進(jìn)行。因此，“正經(jīng)受化療”包括時間長于或短于調(diào)節(jié)GSK-3β活性時間的化療?；熀突熕幬镌谖墨I(xiàn)中已知，并在此處進(jìn)行了進(jìn)一步描述。
細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞死亡通過調(diào)節(jié)該細(xì)胞中GSK-3β的活性誘導(dǎo)。“調(diào)節(jié)GSK-3β的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)活性”或“對GSK-3β的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)活性進(jìn)行調(diào)節(jié)”指的是任何上調(diào)、下調(diào)、刺激、激活、增加、破壞、中斷、減少、限制、阻斷或防止GSK-3β行使其生物功能或活性(包括調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)、實現(xiàn)p53-依賴性細(xì)胞凋亡通路或與之相互作用，因而造成誘導(dǎo)細(xì)胞死亡)的能力。調(diào)節(jié)包括增強(qiáng)或誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞凋亡、或抑制或下調(diào)p53-激活的轉(zhuǎn)錄的效應(yīng)。調(diào)節(jié)包括GSK-3β的物理變更，例如通過翻譯后修飾、必需翻譯后轉(zhuǎn)錄的喪失或缺乏、氨基酸序列突變(包括缺失、插入和置換突變)或蛋白質(zhì)消化。調(diào)節(jié)還包括穩(wěn)定、誘導(dǎo)、對抗、抑制或與GSK-3β和細(xì)胞凋亡因子之間的相互作用相競爭，細(xì)胞凋亡因子是GSK-3β的靶子，GSK-3β通常與之相互作用來影響細(xì)胞周期前進(jìn)或抑制細(xì)胞死亡。這類翻譯后修飾包括抑制性磷酸化，例如，可降低GSK-3β激酶活性的絲氨酸磷酸化，以及對激活磷酸化的抑制或下降調(diào)節(jié)，例如降低GSK-3β的酪氨酸磷酸化的水平。調(diào)節(jié)進(jìn)一步還包括藥理學(xué)調(diào)節(jié)，例如使用GSK-3β抑制劑(如小分子抑制劑或蛋白質(zhì)或肽抑制劑)進(jìn)行對抗、競爭性或非競爭性抑制。
因此，細(xì)胞完成了為對細(xì)胞中GSK-3β的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的處理。調(diào)節(jié)可通過使用調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑對細(xì)胞進(jìn)行處理來完成。藥劑可以是GSK-3β活性抑制劑，例如，抑制、干擾、競爭或中斷GSK-3β細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)活性的化合物，包括造成、刺激或增強(qiáng)GSK-3β抑制性絲氨酸磷酸化的分子或抑制或下調(diào)GSK-3β的激活性酪氨酸磷酸化的分子。
藥劑可以是小分子、肽、蛋白質(zhì)、抗體或其功能性片段，酶或激素。藥劑可以是競爭性ATP抑制劑、Mg2+的競爭性抑制劑或蛋白激酶抑制劑。
在一
具體實施例方式
中，藥劑為小分子LY2119301或其衍生物或類似物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖8中進(jìn)行了描繪。在另一實施方式中，藥劑為鋰，包括氯化鋰。
藥劑可能能通過體內(nèi)途徑運(yùn)送至細(xì)胞，如通過主動或被動運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，或通過擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。例如，如果藥劑為小分子，它可被溶于細(xì)胞膜并能穿透細(xì)胞。藥劑也可經(jīng)過修飾生成運(yùn)輸標(biāo)記物促進(jìn)其向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。可使用特定的運(yùn)輸標(biāo)記物以指引藥劑被特定靶細(xì)胞吸收。例如，藥劑可經(jīng)過修飾生成半乳糖殘基增加肝細(xì)胞對藥劑的吸收，如美國專利US6,844,319所描述那樣，該專利在此被全文引入作為參考。如果藥劑為肽，加入例如膜轉(zhuǎn)位序列這樣允許其所在的肽被運(yùn)送入細(xì)胞內(nèi)的序列(如從果蠅控制觸角基因同源結(jié)構(gòu)域蛋白穿透序列)可促進(jìn)細(xì)胞對藥劑的吸收?；蛘?，藥劑可被包含入能增加或誘導(dǎo)細(xì)胞對藥劑的吸收的生物材料中，例如，將藥劑裝入膠囊制成脂質(zhì)體制劑。肽和蛋白質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)體運(yùn)輸在文獻(xiàn)中已知，并在例如美國專利US 6,372,720及US 20030108597有描述，以上專利在此被引入作為參考。
因此，對GSK-3β細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)活性動的調(diào)節(jié)可通過將細(xì)胞暴露于藥劑下，使細(xì)胞吸收藥劑，藥劑與GSK-3β、GSK-3β的靶基因、或與p-53依賴細(xì)胞凋亡通路相互作用以調(diào)節(jié)GSK-3β的活性來完成。
調(diào)節(jié)還可進(jìn)一步與化療藥物相組合而實現(xiàn)。與化療藥物“相組合”意味著調(diào)節(jié)發(fā)生在化療藥物與細(xì)胞相接觸或被施用于細(xì)胞的時間段中。GSK-3β的調(diào)節(jié)及化療藥物的給入可同時或順序進(jìn)行，各自的時間段可連續(xù)或重疊。調(diào)節(jié)和施用可通過一次或多次分別治療完成或在要求的給定時間段內(nèi)持續(xù)進(jìn)行以達(dá)到想要的結(jié)果。
根據(jù)化療藥物的性質(zhì)，還可按與上述使用調(diào)節(jié)GSK-3β活性進(jìn)行治療類似的方式使用化療藥物對細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步處理。使用化療藥物處理細(xì)胞可在使用藥劑調(diào)節(jié)GSK-3β活性之前、之后或同時進(jìn)行。
化療藥物可以是通常被給予細(xì)胞，具有細(xì)胞毒性或抑制細(xì)胞效應(yīng)的化合物。化療藥物可以是，即使在無調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑的情況下，可誘導(dǎo)異常增殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡(如p53-依賴性細(xì)胞凋亡)或誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯(包括p53-依賴性細(xì)胞周期停滯)的藥劑。化療藥物還可以是可激活異常增殖細(xì)胞中的p53或p21，但由于異常增殖細(xì)胞的特性(如p53或p53通路中的更改或突變)不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥劑。使用化療藥物接合調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑對細(xì)胞進(jìn)行治療可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或增加對細(xì)胞死亡的敏感性，敏感性水平高于在未使用調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑時觀察到的結(jié)果。
化療藥物可以是可激活增殖細(xì)胞中p53-依賴性細(xì)胞凋亡或p53-依賴性細(xì)胞周期停滯的DNA損傷劑或具基因毒性的藥劑?；熕幬锟梢允?，不受限制地，小分子、肽或蛋白質(zhì)、蒽環(huán)類抗生素、烷化劑、烷基磺酸鹽、氮丙啶、乙烯亞胺、methylmelamine、氮芥、亞硝脲、抗生素、抗代謝劑、葉酸類似物、嘌呤類似物、嘧啶類似物、酶、鬼臼毒素、含鉑藥劑或細(xì)胞因子?；熕幬飪?yōu)選已知對特定細(xì)胞增殖性病變和細(xì)胞類型具有治療作用的藥劑。在有的實施方式中，化療藥物為阿霉素(ADR)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、依托泊甙或喜樹堿或其衍生物或類似物。
GSK-3β活性調(diào)節(jié)在體外和體內(nèi)都有用，并可被用于治療或抑制與異常增殖細(xì)胞相關(guān)的疾病或病變，起到誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用。
因此，在一實施方式中，提供治療細(xì)胞增殖性病變的方法，包括調(diào)節(jié)GSK-3β活性。該方法通過給予對象治療有效量的調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑來完成。
“增殖性病變”是一種病人體內(nèi)細(xì)胞異常增殖、造成細(xì)胞無控制地生長和分化的疾病或病變。在健康個體中細(xì)胞的生長和分化無增生或以一種有控制的方式增生。增殖性病變可以惡性或非惡性細(xì)胞群增生為特征。這種病變包括癌癥(包括結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、宮頸癌、皮膚癌、白血病)；增生性皮膚病損(包括生殖器疣、牛皮癬及瘢痕瘤)；缺血性心臟?。猾@得性免疫缺陷綜合征；血管炎；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；動脈粥樣硬化癥；腎小球腎炎導(dǎo)致的腎小球硬化癥；慢性間質(zhì)性腎炎導(dǎo)致的纖維變性；肺炎導(dǎo)致的纖維變性。增殖性病變包括還可能發(fā)生于正常創(chuàng)傷愈合過程中，潛在引起過度瘢痕化或瘢痕瘤形成的異常增殖，以及可能發(fā)生于任何炎癥狀況下引起組織損害(其中宿主免疫細(xì)胞觸發(fā)成纖維細(xì)胞增殖并加工細(xì)胞外基質(zhì)部分造成纖維化)的異常增殖。后者的例子包括對腦梗塞(中風(fēng))、心肌梗塞(心臟病發(fā)作)及急性局部缺血腎小管損害(暫時性腎衰竭)的宿主免疫應(yīng)答。在具體實施方式
中增殖性病變?yōu)榻Y(jié)腸直腸癌。
如果細(xì)胞的異常增殖造成了病人體內(nèi)病變，或如果病變以這種細(xì)胞的增殖為特征，則該細(xì)胞與增殖性病變有關(guān)。
術(shù)語對增殖性病變的“治療”指的是一種獲得有益或想要結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方法。有益或想要的臨床結(jié)果可包括但不局限于減輕或改善一種或多種癥狀或狀況、減小病變范圍、穩(wěn)定病情、防止疾病的發(fā)展、防止疾病擴(kuò)散、延遲或減緩疾病進(jìn)展、延遲或減緩疾病發(fā)作、改善或緩和疾病狀況、以及緩和(無論局部或全部)。“治療”也可意味著延長病人在不進(jìn)行治療的情況下預(yù)期的存活時間?！爸委煛边€可意味著抑制疾病的發(fā)展，暫時減緩疾病的發(fā)展，盡管更優(yōu)選地是永久地停止病情的發(fā)展。
對象為任何需要進(jìn)行增殖性病變治療的動物，包括哺乳動物，包括人，包括正經(jīng)受化療的對象。
治療效果通過給予病人調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑(包括調(diào)節(jié)GSK-3β細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)活性的分子)獲得。調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑可為任何上述可被用于影響細(xì)胞中調(diào)節(jié)的藥劑，包括增加、增強(qiáng)或促進(jìn)GSK-3β抑制絲氨酸磷酸化的藥劑。
給予病人治療有效量的調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑。此處使用的術(shù)語“有效量”指的達(dá)到想要的結(jié)果(如治療特定增殖性病變)所需劑量和時間的有效量。
使用已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對病人進(jìn)行施用。藥劑可全身性的、或直接在與增殖性病變相關(guān)的增殖細(xì)胞存在的部位定點(diǎn)給予病人。定點(diǎn)給藥方式包括局部給藥、點(diǎn)注射或手術(shù)植入，如在癌癥部位。
給予病人的調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑的濃度和量根據(jù)待治療的增殖性病變、與增殖性病變相關(guān)的細(xì)胞類型、給予病人的分子類型、給藥方式以及病人的年齡和健康狀況而改變。
調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑可按以上所述與化療藥物組合給予病人。調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑與化療藥物的“組合”可按相同劑型配制在一起或按單獨(dú)劑型配置，單獨(dú)劑型可為同一形式或不同形式，按同樣的方式或不同給藥方式給予病人。并且，當(dāng)兩種藥劑不是按相同劑型一起給予時，給予調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑與化療藥物的結(jié)合意味著調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑和化療藥物被同時給予對象，并可同時給予或按任何次序順序給予或在不同時間給予對象。因此，調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑與化療藥物可分開給藥但給藥時間應(yīng)足夠近以獲得想要的治療效果。
調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑，或這種藥劑與化療藥物的結(jié)合，可作為單獨(dú)治療給予病人或與其它療法(包括放射療法或其它抗病毒療法)相結(jié)合給予病人。例如，調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑，或該藥劑與化療藥物的結(jié)合，可在手術(shù)切除早期腫瘤之前或之后給予病人或在進(jìn)行治療(如放射性治療)之前、同時或之后給予病人。
為有助于施用，調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑可被作為一種成分配制在藥物組合物，任選地加入治療藥物，包括上述化療藥物。因此，在一進(jìn)一步的實施方式中，提供含有調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑和藥用可接受的稀釋劑的藥物組合物。因此本發(fā)明一方面還包括了這種用于治療增殖性病變的藥物組合物。該組合物可常規(guī)含有藥用可接受的濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑和各種合適的載體。對于所有形式的給藥，調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑可被制成生理鹽水溶液。當(dāng)調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為肽或蛋白質(zhì)時，由于肽在給藥時可能不穩(wěn)定，可能需要將肽或蛋白質(zhì)裝在脂質(zhì)體或其它生物材料中以保護(hù)和/或保存肽或蛋白質(zhì)直至其被輸送至靶細(xì)胞為止。
藥物組合物還可含有其它對治療特定增殖性病變有用的治療藥劑，如細(xì)胞毒素劑，如化療藥物。
藥用可接受的稀釋劑的比例及性質(zhì)通過所選的給藥途徑、與活細(xì)胞的兼容性以及標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實踐確定。通常，藥物組合物將使用對調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑的生物特性無顯著損害的成分配制而成。
藥物組合物可通過已知的制備適于對病人進(jìn)行給藥的藥用可接受的組合物的方法制備，以使有效量的調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑及任何額外的有效成分或物質(zhì)通過藥用可接受的賦形物結(jié)合為混合物。合適的賦形物在文獻(xiàn)中已有描述，如，在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)中。在此基礎(chǔ)上，藥物組合物包括(不是排他性的)調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑溶液，與一種或多種藥用可接受的賦形劑或稀釋劑相結(jié)合，并包含于具合適pH值并與生理溶液等滲的緩沖液中。
藥物組合物可根據(jù)選擇的給藥途徑，以多種形式給予病人，本領(lǐng)域人員將明白如何進(jìn)行選擇。本發(fā)明中的組合物可通過局部給藥、手術(shù)給藥或通過注射至所需部位進(jìn)行給藥。
調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑溶液可被制備為生理學(xué)上合適的緩沖液。在一般儲存及使用條件下，這些制劑含有防止微生物生長的防腐劑，可使藥劑保持調(diào)節(jié)GSK-3β活性的功能。本領(lǐng)域人員知道如何制備合適的制劑。選擇及制備合適的制劑的常規(guī)程序和原料在文獻(xiàn)中已有描述，如在Remington′sPharmaceutical Sciences and in The United States PharmacopeiaThe NationalFormulary(USP 24 NF 19)published in 1999中。
在不同實施方式中，藥物組合物通過局部或在所需部位(病人體內(nèi)不受控制的增殖細(xì)胞存在的地方)直接進(jìn)行注射(皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)，等等)給予病人。
將要使用的藥物組合物的劑量取決于治療的特定情況、情況的嚴(yán)重性、病人的個體參數(shù)(包括年齡、身體健康狀況、身高及體重)、治療持續(xù)時間、同步療法的性質(zhì)(如有)、特定的給藥途徑及其它醫(yī)生知識及技能范圍內(nèi)的類似因素。這些因素為本領(lǐng)域人員所熟知，使用時可將例行試驗減至最少。
按與上述方法一致的方式，目前還可預(yù)期使用調(diào)節(jié)GSK-3β活性來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡或使用調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑(或其與化療藥物相組合)來生產(chǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞(包括正經(jīng)受化療細(xì)胞)中細(xì)胞死亡的藥物。進(jìn)一步還預(yù)期治療有效量的調(diào)節(jié)糖原GSK-3β活性的藥劑在治療對象體內(nèi)的細(xì)胞增殖性病變中的應(yīng)用或治療有效量的調(diào)節(jié)糖原GSK-3β活性的藥劑(或其與化療藥物相組合)在生產(chǎn)治療對象(包括正經(jīng)受化療的對象)體內(nèi)細(xì)胞增殖性病變的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了鑒別或篩選能調(diào)節(jié)GSK-3β活性以及能被用于治療細(xì)胞增殖性病變的藥劑或化合物(包括小分子或肽調(diào)整基因)的方法。將測試分子暴露于或與GSK-3β相接觸或暴露于生化通路，包括受GSK-3β調(diào)節(jié)或與其相互作用的生化通路，包括具有GSK-3β表達(dá)的細(xì)胞，包括正經(jīng)受化療或與化療藥物相結(jié)合的細(xì)胞。一旦測試化合物與GSK-3β相接觸，測量GSK-3β的活性，包括GSK-3β調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡的能力。GSK-3β的活性可使用已知測定進(jìn)行測量，包括激酶測定、細(xì)胞凋亡測定，以及檢查GSK-3β內(nèi)抑制性絲氨酸磷酸化部位的磷酸化狀況和磷酸化水平。
篩選能用于治療細(xì)胞增殖性病變的藥劑和化合物的方法也適用于篩選化合物組合文庫。因此，上述方法和測定可被用于單個測試化合物或多種測試化合物。在后一種情況中，還應(yīng)確定并描述化合物組合所產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)。在有的實施方式中，本發(fā)明中的篩選/測試方法的一個或多個步驟可為自動化。這種測定系統(tǒng)可含有多種方法以實現(xiàn)并使有用的測定條件最佳化。這類方法包括但不局限于合適的緩沖液，如，用于控制pH值和離子強(qiáng)度以及用于提供任何GSK-3β活性及穩(wěn)定性所需的成分(如蛋白酶抑制劑)、使GSK-3β活性和/或穩(wěn)定性最佳化的溫度控制方法、以及檢測GSK-3β活性的檢測方法。有多種這類檢測方法可使用，包括但不局限于以下一種或多種方法的組合放射性標(biāo)記(如32P)、抗體檢測、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、光譜法(例如，生成具有改變光譜特性的產(chǎn)物)、不同報告酶或蛋白質(zhì)(如辣根過氧化酶、綠色熒光蛋白)、特定結(jié)合試劑(如生物素/鏈霉抗生物素)，等等。
目前考慮的還有通過此處所述方法確定的能調(diào)節(jié)GSK-3β活性的分子，包括小分子或GSK-3β肽調(diào)整基因。上述化合物可被用于調(diào)節(jié)GSK-3β活性，用于誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞死亡或用于治療對象體內(nèi)的細(xì)胞增殖性病變，或用于生產(chǎn)具任何上述用途的藥物。
所有此處提到的文件均被全文引入作為參考。
盡管此處公開了本發(fā)明中的不同實施方式，不過本領(lǐng)域人員根據(jù)本領(lǐng)域的常識在發(fā)明范圍內(nèi)對實施方式進(jìn)行多種調(diào)整和修改。這類修改包括將本發(fā)明任何方面的已知等同物進(jìn)行替換以按實質(zhì)相同的方式獲得同樣的結(jié)果。除另有說明，此處使用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有在本發(fā)明所屬領(lǐng)域中具普通專業(yè)知識的人員所理解的一樣的意思。
實施例實施例1材料及方法細(xì)胞培養(yǎng)及藥物治療人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116及其衍生同源p53-/-、Puma-/-，Bax-/-和p53-誘導(dǎo)型DLD細(xì)胞株，由Dr.Bert Vogelstein(JohnsHopkins University，MD)提供。RKO和RKO/E6細(xì)胞，由ATCC提供。將細(xì)胞在含有10％FBS的DMEM中進(jìn)行培育。所有培養(yǎng)試劑及培養(yǎng)基，由Invitrogen提供。5-氟尿嘧啶、阿霉素、依托泊甙吉氯化鋰，購自Sigma。GSK-3β特異性小分子抑制劑，由Eli Lilly(Indianapolis)贈送。以及SB-216763，SB-415283，由BIOMOL提供。
免疫印跡法、免疫沉淀作用及微陣列分析按先前所述刮擦、收集并溶解細(xì)胞(Yu，Q.，et al.Cancer Res，625743-5748，2002)。簡單地說，使用細(xì)胞溶解緩沖液(0.3％NP40，1mM EDTA，50mM Tris-HCl(pH7.4)，2mMEGTA，1％Triton X-100，150niM NaCl，25mM NaF，1mM Na3VO4，2mMAEBSF，5μg/ml aprotinin，1μg/ml leupeptin)在冰上溶解細(xì)胞30分鐘，在4℃，12,000X g，進(jìn)行15分鐘離心分離對溶胞產(chǎn)物進(jìn)行澄清。量化蛋白濃縮物(Bio-Rad，Hercules，CA)，通過SDS/PAGE分離蛋白質(zhì)樣品(50μg)并將其轉(zhuǎn)移至ImmobilonTM膜(Millipore，Bedford，MA)。使用抗以下蛋白的抗體p53(DO-I)、p21、PARP、GSK-α/β、α-微管蛋白和β-肌動蛋白(Santa CruzBiotechnology)、Puma(Ab-I，Oncogene)、Bax(Sigma)、phosphor-(Ser9/21)-GSK-3α/β和caspase-9(Cell Signaling Technologies)、phosphor-(Tyr216/279)-GSK-3α/β(Upstate Biotechnologies)、細(xì)胞色素c(BDPharMingen)。為檢測Bax的構(gòu)象變化，將細(xì)胞溶于1％Chaps緩沖液中，并使用抗-Bax單克隆抗體(6A7，BD，PharMingen)對可溶性分?jǐn)?shù)進(jìn)行免疫沉淀，然后使用抗-Bax多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡測定。按描述進(jìn)行微陣列分析(Kho，P.S.，et al.J Biol Chem，27921183-21192，2004)。
DNA含量FACS分析及caspase-3活性采集細(xì)胞并固定在70％的酒精中。在經(jīng)過RNase(100μg/ml)處理后使用碘化丙啶(50μg/ml)對固定細(xì)胞染色。在FACS管TM(Becton Dickinson Instrument，San Jose，CA)中通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)對染色細(xì)胞進(jìn)行DNA含量分析。使用CellQuestTM軟件(Becton Dickinson)對細(xì)胞周期分?jǐn)?shù)進(jìn)行量化。為檢測caspase-3活性，按照指導(dǎo)使用Cytofix/CytopermTM溶液(BD PharMingen)對細(xì)胞進(jìn)行固定，然后使用FITC-結(jié)合兔抗-活性caspase-3單克隆抗體(BD PharMingen)對細(xì)胞染色。通過流式細(xì)胞術(shù)量化caspase-3呈陽性的細(xì)胞。
RNA干擾為產(chǎn)生p53敲除載體(knockdown vectors)，使用以下19-核苷酸序列g(shù)actccagtggtaatctac[SEQ ID NO1]。按照生產(chǎn)商的說明，將寡聚核苷酸對克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pSIREN-RetroQTM(BD Bioscienses)中。簡單地說，使用p53 shRNA構(gòu)造對293細(xì)胞進(jìn)行48小時轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生病毒顆粒。為建立p53 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆，在使用5μg/ml聚凝胺(polybrene)的情況下使用逆轉(zhuǎn)錄病毒株對感染HCT116細(xì)胞。將感染細(xì)胞暴露于嘌呤霉素選擇中(2μg/ml)中。通過對p53表達(dá)的蛋白印跡分析進(jìn)一步擴(kuò)大和篩選穩(wěn)定克隆。SMARTpoolGSK-3β、GSK-3αsiRNAs和陰性對照siRNA購自Dharmacon，Inc。
腺病毒感染腺病毒Ad-LacZ和Ad-p53由Dr.Shibin Zhou(JohnsHopkins University，MD)提供。使細(xì)胞生長至50％融合并按描述使用重組腺病毒對其進(jìn)行感染(Yu，J.，et al.Proc Natl Acad Sd U S A，9614517-14522，1999)。感染24小時后，使用藥物對細(xì)胞進(jìn)行指定時間的治療。
亞細(xì)胞分級使用Dounce勻質(zhì)器將細(xì)胞溶于線粒體溶解緩沖液(210mM Mannitol，70mM Sucrose，10mM Hepes(pH，7.4)，ImM EDTA，proteaseinhibitor cocktail)中，并進(jìn)行1000X g的離心分離除去細(xì)胞核。對去核上清液進(jìn)行10,000X g離心分離除去富含線粒體的重膜成分，對所得上清液進(jìn)行進(jìn)一步離心分離獲取胞質(zhì)成分。對來自胞質(zhì)或線粒體成分的總蛋白(30μg)進(jìn)行免疫印跡分析。
測量線粒體透過轉(zhuǎn)變在4℃以300X g離心分離5分鐘采集細(xì)胞。按照生產(chǎn)商的說明使用JC-1(BD PharMingen)對細(xì)胞染色，確定線粒體的透過轉(zhuǎn)變。通過對紅熒光減小(即，線粒體表現(xiàn)出較低的膜電勢(Δψm)的細(xì)胞的流式細(xì)胞計量測定量化線粒體的透過轉(zhuǎn)變。數(shù)據(jù)以具有低Δψm的細(xì)胞比例的形式給出。
結(jié)果小分子GSK-3β抑制劑以p-53依賴的方式促進(jìn)了人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中的基因毒性藥劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在人結(jié)腸直腸癌HCT116細(xì)胞中，DNA損傷劑阿霉素(ADR)和DNA類似物5-氟尿嘧啶(5-FU)引起的p53激活分別造成了細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡(Bunz，F(xiàn).，et al.J Clin Invest，104263-269，1999)。為調(diào)查調(diào)節(jié)p53應(yīng)答的細(xì)胞因子，我們對一系列蛋白激酶抑制劑進(jìn)行了篩選并檢查了其對于DNA損傷應(yīng)答的影響。我們發(fā)現(xiàn)一種特定的GSK-3β小分子抑制劑(L Y2119301)有效地將ADR-誘導(dǎo)p53應(yīng)答從生長停滯轉(zhuǎn)化為了細(xì)胞死亡。圖1A和1B顯示經(jīng)過ADR24小時處理后的HCT116細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞周期停滯(在G1和G2/M階段都出現(xiàn)了停滯)，無明顯的對細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)。與單獨(dú)使用ADR或LY2119301處理細(xì)胞相比，同時使用ADR和LY2119301對細(xì)胞進(jìn)行處理造成細(xì)胞死亡明顯增加，前一種情況的亞-G1數(shù)為～3-5％，后者為～59％。相反，在同樣的條件下，在p53敲除HCT116細(xì)胞(圖1A和1B)中未見對細(xì)胞死亡的協(xié)同誘導(dǎo)，說明細(xì)胞死亡為p53-依賴。由于使用caspase-3活性測定(圖2)得出了類似結(jié)果，細(xì)胞死亡被歸因于細(xì)胞凋亡。LY2119301在其它DNA損傷劑(包括依托泊甙和喜樹堿)的作用下還觸發(fā)了p53-依賴性細(xì)胞凋亡(圖3)。在另一種p53野生型結(jié)腸癌細(xì)胞株(RKO)中也觀察到了類似結(jié)果，但在p53突變腫瘤(如SW420和HT29)中未觀察到(圖4和未顯示的數(shù)據(jù))。另外，LY2119301以嚴(yán)格p53-依賴的方式極大地增強(qiáng)了5-FU-誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性(圖5)，在無p53的HCT116細(xì)胞中未觀察到細(xì)胞凋亡增加。值得注意的是，劑量效果試驗顯示LY2119301使得5-FU(最常用的治療結(jié)腸直腸癌的化療藥物)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加了10-倍。因此，GSK-3β的藥理學(xué)抑制不僅將p53-介導(dǎo)損害應(yīng)答從生長停滯轉(zhuǎn)化為了細(xì)胞凋亡，還進(jìn)一步增強(qiáng)了p53-依賴性細(xì)胞凋亡應(yīng)答的敏感性。在兩種情況中，GSK-3β的失活引發(fā)了需要p53的細(xì)胞凋亡過程，或使其敏感化。
為證實觀察到的細(xì)胞凋亡的增加確實是p53-依賴性的，而不是作為HCT116 p53-/-細(xì)胞延長培育的結(jié)果，由表型特征引起，我們生成了一種穩(wěn)定的、其中p53的表達(dá)被p53 shRNA極大弱化的HCT116細(xì)胞株(圖6，左面板)。與表達(dá)對照載體的細(xì)胞相比，這些細(xì)胞中的p53敲除顯著降低了經(jīng)LY2119301和ADR或5FU共處理所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖6，右面板)。在另一野生結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株RKO中也觀察到了LY2119301對p53應(yīng)答的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，但在其p53-激活相似物RKO/E6細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)(圖7)。類似地，在其它p53突變結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和HT29中也未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。這些發(fā)現(xiàn)表明GSK-3β抑制劑LY2119301以嚴(yán)格需要完整p53的方式促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。
GSK-3β(而不是GSK-3α)的藥理學(xué)調(diào)節(jié)促進(jìn)了p53-依賴性細(xì)胞凋亡為證實GSK-3β調(diào)節(jié)是上述觀察結(jié)果的原因，我們檢查了三種其它在結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的小分子GSK-3抑制劑SB-216763、SB-415286和氯化鋰(LiCl)的影響(圖8)。前兩種化合物為對GSK-3具選擇性的競爭性ATP抑制劑(Coghlan，M.P.，et al.Chem Biol，7793-803，2000)，而氯化鋰通過充當(dāng)Mg2+的競爭性抑制劑抑制GSK-3β，對其它蛋白激酶無抑制效果(Watcharasit，P.，et al.，JBiol Chern，27848872-48879，2003；Ryves，W.J.and Harwood，A.J.，BiochemBiophys Res Common，280720-725，2001；Klein，P.S.and Melton，D.A.，ProcNatl Acad Sci U S A，938455-8459，1996)。與LY2119301類似，鋰處理以p53-依賴的方式，誘導(dǎo)了暴露于化療藥物的HCT116細(xì)胞中強(qiáng)烈的細(xì)胞凋亡(圖9)。令人吃驚的是，即使在高達(dá)20μM的濃度，SB-126763和SB-415286對經(jīng)ADR-處理的細(xì)胞也無任何影響(圖10)。這與LY2119301剛好相反，后者在低至250nM的濃度也能誘導(dǎo)經(jīng)ADR-處理的細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡(圖10)。為檢查SB-216763和SB-415286是否因DNA損傷阻斷了p53通路，我們進(jìn)行了免疫印跡分析并發(fā)現(xiàn)這兩種抑制劑對p53穩(wěn)定性或由DNA損害誘導(dǎo)的p53-介導(dǎo)p21無影響(圖11)。因此，LY2119301誘導(dǎo)應(yīng)激細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的能力似乎與其抑制p53-p21通路的能力密切相關(guān)。在DNA損傷后，我們的結(jié)果表明LY2119301防止了p53穩(wěn)定和p21誘導(dǎo)，而其它抑制劑對p53活動無影響。
為調(diào)查這些化合物是否對GSK-3具差別影響，我們進(jìn)行了免疫印跡分析。GSK-3含兩種同種型(α和β)，并且它們的活性可通過Tyr216/Tyr279上的激活性磷酸化或通過Ser21/Ser9上的抑制性磷酸化進(jìn)行調(diào)節(jié)(Cohen，P.and Frame，S.，Nat Rev MoI Cell Biol，2769-776，2001)。特定的GSK-3抑制劑可抑制激活性酪氨酸磷酸化或誘導(dǎo)抑制性絲氨酸的自磷酸化作用(Cohen，P.and Frame，S.，Nat Rev MoI Cell Biol，2769-776，2001；Cohen，P. andGoedert，M.，Nat Rev Drug Discov，3479-487，2004；Zhang，F(xiàn).，et al.，J BiolChem，27833067-33077，2003；Cole，A.，et al.，Biochem J，311249-255，2004)。這樣，這些特定殘基的磷酸化狀況被用來作為GSK-3α/β活性的代理標(biāo)記。使用LY2119301和鋰對HCT116細(xì)胞進(jìn)行處理造成GSK-3β上的抑制性絲氨酸磷酸化的相同增加，而在GSK-3α上的影響很小(圖12，2和5道)。相反，SB-126763和SB-415286僅誘導(dǎo)了GSK-3α上的絲氨酸21磷酸化，甚至輕微地降低了GSK-3β上的絲氨酸9磷酸化(圖12，3和4道)。并且，LY2119301幾乎完全阻斷了GSK-3α和GSK-3β上的有效絲氨酸磷酸化，而SB-126763和SB-415286僅降低了GSK-3α上的絲氨酸磷酸化(圖12，3和4道)。這些發(fā)現(xiàn)表明LY2119301和鋰抑制了GSK-3α和GSK-3β，但主要作用于GSK-3β，而盡管在前面使用肽-基體外蛋白酶測定中顯示出了對GSK-3α和GSK-3β同樣的抑制性，SB-126763和SB-415286僅對HCT116細(xì)胞中的GSK-3α具抑制作用(Coghlan，M.P.，et al.，Chem Biol，7793-803，2000)。因此，GSK-3抑制劑的細(xì)胞凋亡作用似乎與特定的GSK-3β而不是GSK-3α的失活相關(guān)。重要的是，鋰，與LY2119301相反，未阻斷GSK-3α/β的激活絲氨酸磷酸化(圖12，5道)，但仍能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡表型。因此，GSK-3β抑制劑的凋亡效果不要求對激活絲氨酸磷酸化的抑制。相反，GSK-3β抑制性絲氨酸9磷酸化的誘導(dǎo)是LY2119301和鋰的共同特征并似乎與其凋亡作用相關(guān)。由于鋰能通過GSK-3自身直接抑制(可能是通過GSK-3-依賴磷酸酯酶1的抑制)增加絲氨酸磷酸化，LY2119301和鋰對GSK-3β絲氨酸9磷酸化的誘導(dǎo)不像是激活其它上升激酶(如AKT)的結(jié)果。(Klein，P.S.andMelton，D.A.，Proc Natl Acad Sd USA，938455-8459，1996)。并且，使用抑制AKT的LY294002對細(xì)胞進(jìn)行處理未阻斷由LY2119301和鋰觸發(fā)的絲氨酸9磷酸化(數(shù)據(jù)未顯示)。
為測試RNA干擾引起的GSK-3β敲除是否也會使DNA損傷-誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡敏感化，使用GSK-3β、GSK-3α或陰性對照siRNA(NC siRNA))對HCT116細(xì)胞進(jìn)行48小時轉(zhuǎn)染，并隨后進(jìn)行依托泊甙處理。圖13顯示RNA干擾有效、明確地分別敲除了GSK-3α和GSK-3β表達(dá)。但是，GSK-3β或GSK-3α敲除未由于依托泊甙造成更多的細(xì)胞死亡，未觀察到明顯的PARP裂解。
因此，僅降低GSK-3β水平不足以觸發(fā)DNA損傷造成的細(xì)胞死亡。這個觀察結(jié)果與GSK-3β抑制性絲氨酸9磷酸化的誘導(dǎo)可能對有效誘導(dǎo)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中由于DNA損傷的造成細(xì)胞凋亡很重要這一觀點(diǎn)一致。GSK-3βsiRNA不能誘導(dǎo)絲氨酸9磷酸化，不能模仿GSK-3β抑制劑的細(xì)胞凋亡作用。
我們接下來檢查了造成GSK抑制劑對細(xì)胞凋亡和p53功能不同影響的機(jī)制。由于GSK-3在胞質(zhì)和細(xì)胞核中都存在，GSK-3α/β受Ser-21(α)或Ser-9(β)磷酸化的抑制而受Tyr-279(α)or Tyr-216(β)磷酸化激活，我們在經(jīng)過GSK抑制劑和DNA損傷處理后尋找GSK-3磷酸化狀態(tài)的變化。在經(jīng)過依托泊甙處理后，通過特定抗-Ser-9/21或抗-Tyr-216抗體評估發(fā)現(xiàn)，GSK-3α和GSK-3β的胞質(zhì)和細(xì)胞核水平和磷酸化狀態(tài)均無變化(圖14)。有趣的是，LY2119301在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均觸發(fā)了GSK-3β的絲氨酸磷酸化，并阻斷了α和β同種型的絲氨酸磷酸化。通過對比，其它兩種抑制劑觸發(fā)了細(xì)胞質(zhì)，但未觸發(fā)細(xì)胞核中的GSK-3α絲氨酸磷酸化，并且對GSK-3β上的絲氨酸磷酸化無影響。一致的是，SB-126763和SB-415286未阻斷細(xì)胞核中GSK-3β的有效絲氨酸磷酸化。這些數(shù)據(jù)表明LY2119301對GSK-3β具高度選擇性，而其它兩種抑制劑盡管在體外測定中對GSK-3β顯示出了與對GSK-3α一樣的抑制，它們主要對胞質(zhì)的GSK-3α起作用(Coghlan et al.，2000)。數(shù)據(jù)表明細(xì)胞核GSK-3β而不是GSK-3α在受到DNA損害后對p53功能起著調(diào)節(jié)作用，這與其調(diào)節(jié)細(xì)胞核對于DNA損害應(yīng)答的穩(wěn)定性高度相關(guān)。很明顯，細(xì)胞核GSK-3β的抑制足以降低p53數(shù)量的基礎(chǔ)水平，表明GSK-3β調(diào)節(jié)著正常和應(yīng)激細(xì)胞中的p53積聚。
GSK-3β的藥理學(xué)調(diào)節(jié)損害了基因毒性應(yīng)激引起的p53累積和p53靶基因的轉(zhuǎn)活為確定GSK-3β抑制劑對p53應(yīng)答的影響，我們進(jìn)行了p53和p53靶基因的免疫印跡測定。在使用或不使用LY2119301的情況下，使用ADR、依托泊甙和5-FU對HCT116(圖15)和RKO(圖16)細(xì)胞進(jìn)行處理。經(jīng)過化療藥物處理的細(xì)胞表現(xiàn)出了p53遞增積聚和其靶基因(如p21和Puma)激活，分別引起細(xì)胞生長停滯和凋亡。在使用LY2119301的情況下，化療藥物誘導(dǎo)的p53積聚受到顯著的、連續(xù)的損害，如p21和Puma誘導(dǎo)。因此，LY2119301損害了基因毒性應(yīng)激引發(fā)的p53積聚并降低了其轉(zhuǎn)錄活性。重要的是，Bax(一種被認(rèn)為對結(jié)腸癌細(xì)胞中的線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡很重要的p53靶基因)的表達(dá)(Zhang，L，et al.，Science，290989-992，2000)在p53激活后未被誘導(dǎo)。這與之前稱Bax不是結(jié)腸癌細(xì)胞中p53的強(qiáng)有力的靶基因的報道相符(Yu，J.，et al.，Proc Natl Acad Sd U S A，96145 17-14522，1999；Kokontis，J.M.，et al.，Oncogene，20659-668，2001)。因此，LY2119301處理對Bax水平無影響(圖15和16)。類似的，使用對GSK-3β具抑制作用的鋰進(jìn)行處理也同樣損害了ADR、依托泊甙和5-FU誘導(dǎo)的p53積聚，降低了p53靶基因p21的誘導(dǎo)(圖17，左面板)。與細(xì)胞凋亡表型一致，在使用LY2119301或鋰的情況下，PARP的裂解在經(jīng)過基因毒性藥劑處理后顯著增加。相反，僅對這些細(xì)胞中的GSK-3α具抑制作用的SB-126763和SB-415286對p53積聚和p21誘導(dǎo)無影響，并且不會誘導(dǎo)PARP裂解。(圖17，右面板)。
為將這些觀察擴(kuò)展至其它p53靶基因，我們使用微陣列分析進(jìn)行了球面表達(dá)剖析。我們之前已確定了HCT116細(xì)胞中p53應(yīng)答基因亞群(Kho，P.S.，et al.，J Biol Chem，27921183-21192，2004)。使用ADR和LY2119301同時治療一致減弱了這些基因的誘導(dǎo)(圖18)，表明GSK-3β在p53-依賴轉(zhuǎn)活中起著重要的作用。GSK-3β失活促進(jìn)了p53-介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而取消了p53靶基因(包括Puma)這一看似矛盾的發(fā)現(xiàn)提出了一個誘人的可能性即GSK-3β抑制劑通過不依賴p53-介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制促進(jìn)p53-依賴性細(xì)胞凋亡。
GSK-3β抑制劑LY2119301促進(jìn)了外源性p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡我們接下來調(diào)查了GSK-3β失活是否也促進(jìn)了p53外源性過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們使用了兩種p53表達(dá)系統(tǒng)具有結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞株表達(dá)的四環(huán)素-誘導(dǎo)p53(Yu，J.，et al.，Proc Natl Acad Sd USA，9614517-14522，1999)和感染了腺病毒表達(dá)p53的HCT116細(xì)胞。在兩種情況中，強(qiáng)迫p53表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在使用了LY2119301的情況下顯著增加(圖19和20)。在這些情況下，可能是由于對p53的非生理調(diào)節(jié)，LY2119301對異位表達(dá)p53蛋白水平或p21的p53依賴轉(zhuǎn)錄無影響(圖19和20，右面板)。因此，既然已有報道稱p21和p53促細(xì)胞凋亡靶基因(如Puma)之間平衡的改變可將p53應(yīng)答從細(xì)胞生長停滯轉(zhuǎn)化為細(xì)胞凋亡，這種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)不像是由于p21表達(dá)降低引起的，(Seoane，J.，et al.，Nature，419729-734，2002；Iyer，N.G.，et al.，ProcNatl Acad Sd USA，1017386-7391，2004)。
GSK-3β抑制劑促進(jìn)的細(xì)胞凋亡需要Bax而不是Puma促細(xì)胞凋亡Bcl2家族成員Bax和Puma在p53-介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中已出現(xiàn)(Yu，J.，et al.，MoI Cell，7673-682，2001；Yu，J.，et al.，Proc Natl Acad Sd USA，1001931-1936，2003)。為進(jìn)一步評估在GSK-3β失活后Bax和Puma在p53-依賴性細(xì)胞凋亡中的作用，我們使用了經(jīng)過同源重組刪除了其中一種基因的HCT116細(xì)胞(Zhang，L.，et al.，Science，290989-992，2000；Yu，J.，et al.，Proc Natl AcadSd USA，1001931-1936，2003)。當(dāng)使用LY2119301和ADR或依托泊甙共處理時，Bax-/-細(xì)胞完全抗拒細(xì)胞凋亡(圖21)。相反，Puma-/-細(xì)胞仍能進(jìn)行明顯的細(xì)胞凋亡，與親代HCT116細(xì)胞一樣(圖22)。一致的，在Bax-/-細(xì)胞中未觀察到PARP裂解(圖23)，但在Puma-/-細(xì)胞中很明顯(圖24)，盡管在這兩種細(xì)胞株中，經(jīng)ADR或依托泊甙處理后的p53積聚和p21誘導(dǎo)都類似地被LY2119301降低(圖23和24)。這些結(jié)果表明GSK-3β抑制劑促發(fā)的依賴p53但不依賴轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞凋亡通過需要Bax而不需要Puma的通路進(jìn)行。支持這一觀點(diǎn)，結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞對LY2119301受DNA損害而誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具抵抗性(數(shù)據(jù)未顯示)。LoVo細(xì)胞為p53野生型，但由于Bax基因移碼突變不具備Bax蛋白質(zhì)表達(dá)(Ionov，Y.，et al.，Proc Nail Acad Sd USA，9710872-10877，2000)。
GSK-3β抑制促進(jìn)了Bax的p53-依賴構(gòu)象激活并誘導(dǎo)了線粒體細(xì)胞死亡Bax在細(xì)胞凋亡中被認(rèn)為發(fā)生了構(gòu)象變化(Wolter，K.G.，et al.，J Cell Biol，1391281-1292，1997)。我們接下來檢查了GSK-3β抑制劑在DNA損傷后是否誘導(dǎo)了Bax的構(gòu)象激活。使用LY2119301和基因毒性藥劑ADR、依托泊甙和5-FU同時對HCT116細(xì)胞進(jìn)行處理，極大地增加了構(gòu)象激活Bax的水平(圖25)，這可通過特定的抗-Bax單克隆抗體6A7檢測出，如前所述(Suzuki，M.，et al.，Cell，103645-654，2000；Nechushtan，A.，et al.，Embo J，182330-2341，1999)。Bax激活似乎為p53-依賴，因為未發(fā)現(xiàn)處于同樣情況下的HCT116 p53-/-細(xì)胞中的Bax構(gòu)象有任何變化(圖25)。一致地，在使用LY2119301的情況下，DNA損傷后細(xì)胞色素c釋放和caspase-9加工的增加都很明顯(圖25，低面板)。在使用LY2119301的情況下，在具有合并p53過度表現(xiàn)的DLD1細(xì)胞和HCT116細(xì)胞中也見到了類似的Bax激活(圖26)。并且，通過JC-1染色和FACS測定，發(fā)現(xiàn)使用LY2119301和其它基因毒性共處理過的Bax+/+細(xì)胞中線粒體膜電勢顯著降低，而在同樣情況下的Bax-/-細(xì)胞中未見降低(圖27)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)說明GSK-3β抑制劑通過Bax-介導(dǎo)線粒體通路促進(jìn)了p53-依賴性細(xì)胞凋亡。
以上結(jié)果提出了一個可能性，即GSK-3β抑制劑可能能使p53在線粒體中積聚，因而造成了DNA損害后觀察到的細(xì)胞凋亡。為說明這個觀點(diǎn)，我們首先對經(jīng)過依托泊甙和5-FU處理后不同時間點(diǎn)的胞質(zhì)和線粒體中p53的積聚進(jìn)行了監(jiān)控。我們發(fā)現(xiàn)線粒體中的p53在經(jīng)依托泊甙和5-FU處理后2小時就開始積聚，而胞質(zhì)中的p53直到藥物處理后6小時還未積聚(圖28)。這與近期一個顯示DNA損傷觸發(fā)了小鼠胸腺內(nèi)快速p53線粒體積聚，觸發(fā)了第一輪細(xì)胞死亡的報告一致(Erster，S.，et al.，MoI Cell Biol，246728-6741，2004)。但是，依托泊甙-誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞線粒體中的p53積聚未能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這說明線粒體中的p53積聚從本質(zhì)上不足以激活HCT116細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。并且，在使用LY2119301的情況下，依托泊甙-誘導(dǎo)的p53積聚在胞質(zhì)和線粒體中出現(xiàn)了類似下降(圖28)，盡管這些情況下誘導(dǎo)了強(qiáng)大的細(xì)胞凋亡。因此，我們得出結(jié)論，結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中線粒體p53水平似乎與結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)無關(guān)，而GSK-3β抑制劑對p53應(yīng)答的細(xì)胞凋亡效應(yīng)不像是由于p53向線粒體異位增加引起的。
本領(lǐng)域人員可以理解，許多對此處所述的例證性實施方式的修改都是可能的。而本發(fā)明在于包括所有本發(fā)明范圍內(nèi)的類似修改，如權(quán)利要求書中所規(guī)定那樣。
序列表<110>新加坡科技研究局<120>GSK-3β的調(diào)節(jié)及治療增殖性病變的方法<130>93231-109<150>US 60/586,296<151>2004-07-09<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>artificial<220>
<223>synthetic oligonucleotide<400>1gactccagtg gtaatctac 19
權(quán)利要求
1.一種治療細(xì)胞增殖性病變的方法，該方法包括給有需要并正經(jīng)受化療的對象施用治療有效量的調(diào)節(jié)糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)活性的藥劑。
2.一種治療細(xì)胞增殖性病變的方法，該方法包括給有需要的對象施用治療有效量的調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑，所述藥劑與化療藥物相組合。
3.權(quán)利要求1和2的方法，其中細(xì)胞增殖性病變?yōu)榘┌Y。
4.權(quán)利要求3的方法，其中癌癥選自結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、宮頸癌、皮膚癌和白血病。
5.權(quán)利要求4的方法，其中癌癥選自結(jié)腸直腸癌。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中對象為人。
7.誘導(dǎo)正經(jīng)受化療的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的方法，該方法包括調(diào)節(jié)細(xì)胞中的糖原合酶激酶-3β活性。
8.誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的方法，該方法包括調(diào)節(jié)細(xì)胞中的糖原合酶激酶-3β活性并將細(xì)胞與化療藥物接觸。
9.權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的方法，其中所述調(diào)節(jié)誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞凋亡。
10.權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的方法，其中所述調(diào)節(jié)抑制p53-激活的轉(zhuǎn)錄。
11.權(quán)利要求7至10中任一項的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括將細(xì)胞與調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑相接觸。
12.權(quán)利要求1或7的方法，其中化療誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞凋亡。
13.權(quán)利要求1或7的方法，其中化療誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞周期停滯。
14.權(quán)利要求1或7的方法，其中化療涉及阿霉素、5-氟尿嘧啶或依托泊甙。
15.權(quán)利要求2或8的方法，其中化療藥物誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞凋亡。
16.權(quán)利要求2或8的方法，其中化療藥物誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞周期停滯。
17.權(quán)利要求2或8的方法，其中化療藥物為阿霉素、5-氟尿嘧啶或依托泊甙。
18.權(quán)利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑引起GSK-3β發(fā)生抑制性絲氨酸磷酸化。
19.權(quán)利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為競爭性ATP抑制劑。
20.權(quán)利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為Mg2+的競爭性抑制劑。
21.權(quán)利要求1至6和11至17的方法，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為蛋白激酶抑制劑。
22.權(quán)利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑抑制GSK-3β發(fā)生激活性酪氨酸磷酸化。
23.權(quán)利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為含鋰化合物。
24.權(quán)利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為LY2119301、或其功能類似物、或氯化鋰。
25.權(quán)利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中調(diào)節(jié)GSK-3β活性誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞凋亡。
26.權(quán)利要求1至6和11至17中任一項的方法，其中調(diào)節(jié)GSK-3β活性抑制p53-激活的轉(zhuǎn)錄。
27.治療有效量的調(diào)節(jié)糖原GSK-3β活性的藥劑在治療正經(jīng)受化療的對象的細(xì)胞增殖性病變中的應(yīng)用。
28.治療有效量的調(diào)節(jié)糖原GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在治療對象中的細(xì)胞增殖性病變中的應(yīng)用。
29.治療有效量的調(diào)節(jié)糖原GSK-3β活性的藥劑在生產(chǎn)用于治療正經(jīng)受化療的對象的細(xì)胞增殖性病變的藥物中的應(yīng)用。
30.治療有效量的調(diào)節(jié)糖原GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在生產(chǎn)用于治療對象的細(xì)胞增殖性病變的藥物中的應(yīng)用。
31.權(quán)利要求27至30中任一項的應(yīng)用，其中細(xì)胞增殖性病變?yōu)榘┌Y。
32.權(quán)利要求31的應(yīng)用，其中癌癥選自結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、宮頸癌、皮膚癌和白血病。
33.權(quán)利要求32的應(yīng)用，其中癌癥選自結(jié)腸直腸癌。
34.權(quán)利要求27至33中任一項的應(yīng)用，其中對象為人。
35.調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑在誘導(dǎo)正經(jīng)受化療的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡中的應(yīng)用。
36.調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡中的應(yīng)用。
37.調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑在生產(chǎn)用于誘導(dǎo)正經(jīng)受化療的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
38.調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑與化療藥物相組合在生產(chǎn)用于誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
39.權(quán)利要求27、29、35和37中任一項的應(yīng)用，其中化療誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞凋亡。
40.權(quán)利要求27、29、35和37中任一項的應(yīng)用，其中化療誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞周期停滯。
41.權(quán)利要求27、29、35和37中任一項的應(yīng)用，其中化療涉及施用阿霉素、5-氟尿嘧啶或依托泊甙。
42.權(quán)利要求28、30、36和38中任一項的應(yīng)用，其中化療藥物誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞凋亡。
43.權(quán)利要求28、30、36和38中任一項的應(yīng)用，其中化療藥物誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞周期停滯。
44.權(quán)利要求28、30、36和38中任一項的應(yīng)用，其中化療藥物為阿霉素、5-氟尿嘧啶或依托泊甙。
45.權(quán)利要求27至44中任一項的應(yīng)用，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑引起GSK-3β發(fā)生抑制性絲氨酸磷酸化。
46.權(quán)利要求27至44中任一項的應(yīng)用，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為競爭性ATP抑制劑。
47.權(quán)利要求27至44中任一項的應(yīng)用，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為Mg2+的競爭性抑制劑。
48.權(quán)利要求27至44中任一項的應(yīng)用，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為蛋白激酶抑制劑。
49.權(quán)利要求27至44中任一項的應(yīng)用，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑抑制GSK-3β發(fā)生激活性酪氨酸磷酸化。
50.權(quán)利要求27至44中任一項的應(yīng)用，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為含鋰化合物。
51.權(quán)利要求27至44中任一項的應(yīng)用，其中所述調(diào)節(jié)GSK-3β活性的藥劑為LY2119301或其功能類似物或氯化鋰。
52.權(quán)利要求27至44中任一項的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用誘導(dǎo)p53-依賴性細(xì)胞凋亡。
53.權(quán)利要求27至44中任一項的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用抑制p53-激活的轉(zhuǎn)錄。
54.一種鑒別可用于治療細(xì)胞增殖性病變的化合物的方法，包括(a)將糖原合酶激酶-3β與測試化合物相接觸；并(b)測定在存在所述測試化合物的情況下所述糖原合酶激酶-3β的活性是否被調(diào)節(jié)。
55.權(quán)利要求54的方法，其中步驟(a)包括將表達(dá)所述糖原合酶激酶-3β的細(xì)胞與所述測試化合物相接觸。
56.通過權(quán)利要求54或權(quán)利要求55的方法所鑒別的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了促進(jìn)細(xì)胞死亡的方法和應(yīng)用，當(dāng)其與化療藥物相結(jié)合時，可促進(jìn)異常增殖的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡，并提供用于治療對象的細(xì)胞增殖性病變的方法和應(yīng)用，所述方法和應(yīng)用涉及將細(xì)胞與一種藥劑相接觸或者給對象施用所述藥劑，所述藥劑是調(diào)節(jié)正經(jīng)受化療藥物治療的細(xì)胞的糖原合酶激酶－3β活性的藥劑。
文檔編號A61K31/7105GK1980681SQ200580022976
公開日2007年6月13日 申請日期2005年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月9日
發(fā)明者于強(qiáng) 申請人:新加坡科技研究局