檢測csf3r點(diǎn)突變的引物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，一種使用RT-PCR及sanger測序法檢測CSF3R 點(diǎn)突變的方法及引物。 技術(shù)背景
[0002] 慢性中性粒細(xì)胞白血病（chronic neutrophilic leukemia, CNL)是比較罕見的特 殊類型慢性白血病，多見于老年人，起病隱匿。WHO國際血液腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)中已將其劃為慢 性骨髓增殖性疾病的獨(dú)立分型。該病目前無明確有效的治療手段，其診斷、鑒別較為困難， 其診斷需要與類白血病，慢性髓細(xì)胞白血病、骨髓纖維化等進(jìn)行鑒別。不典型慢性髓系白血 ?。╝typical chronic myeloid leukemia，aCML)，BCR-ABL 陰性是一種初診時(shí)兼有骨髓增 生異常與骨髓增殖特點(diǎn)的白血病疾患。其特征為主要累及中性粒細(xì)胞系別，伴有形態(tài)學(xué)發(fā) 育異常的中性粒細(xì)胞及其前體細(xì)胞增多而致成的白細(xì)胞增多，其診斷、鑒別較為困難。aCML 患者預(yù)后不良，缺乏有效的治療手段。CNL和aCML，這兩種腫瘤的診斷均基于粒細(xì)胞瘤樣擴(kuò) 增并且排除已知發(fā)生于其他骨髓增生性腫瘤和骨髓增生-骨髓增生異常重疊腫瘤的遺傳 驅(qū)動的原因，這兩種血液腫瘤的分子原因尚不清楚。
[0003] 集落刺激因子 3 受體（colony stimulating factor 3receptor (granulocyte)， CSF3R)基因位于1號常染色體短臂，是細(xì)胞因子受體家族成員，控制髓系祖細(xì)胞的增殖 和分化。CSF3R突變最早發(fā)現(xiàn)于嚴(yán)重先天性中性粒細(xì)胞減少的柯文氏綜合征（Kostmann syndrome)，近期的研宄發(fā)現(xiàn)CSF3R突變常見于CNL或aCML患者，是CNL和aCML的決定性 分子異常，并代表診斷這些腫瘤的一種可能有用的標(biāo)準(zhǔn)。檢測這些突變不僅有助于診斷這 兩種罕見疾病，而且有助于評估以中性粒細(xì)胞增多為特征的病因不明的其他疾病。
[0004] CSF3R突變發(fā)生在兩個不同的區(qū)域，即近膜突變和截?cái)嗤蛔儭＝ざ送蛔儯═615A 和T618I)活化下游JAK激酶激活，該突變患者對JAK激酶抑制劑魯索替尼（ruxolitinib) 治療敏感；截?cái)嗤蛔儯≦741X和S783fs)使下游激酶信號分子SRC family-TNK2激活，該突 變患者多靶點(diǎn)藥物達(dá)沙替尼（dasatinib)治療敏感。突變檢測有助于個體化治療的實(shí)施。 已有CSF3R T618I突變CNL患者針對該靶向位點(diǎn)，使用魯索替尼（ruxolitinib)治療，病情 相著改善的成功案例。
[0005] 目前用于CSF3R突變檢測的方法主要有：Sanger測序法和NGS(Next-generation sequencingtechnology)測序。Sanger測序法目前是臨床應(yīng)用于檢測基因突變極其普遍 的一種手段，應(yīng)用靈活，但是其靈敏度不高，且每次測序長度較為有限，一般一次測序只能 測定800bp左右的基因片段。目前CSF3R測序主要是以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因?yàn)闇y 序片段限制，通常兩個熱點(diǎn)區(qū)域需要進(jìn)行分別擴(kuò)增，增加了檢測成本。NGS測序技術(shù)，即高通 量測序技術(shù)，具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，適用于沒有明確候選基 因或候選基因數(shù)量較多的大樣本病例篩查。NGS對于有致病基因位點(diǎn)明確并且數(shù)量有限的 單基因遺傳疾病的致病基因的檢測，成本太高且操作相較于Sanger更為復(fù)雜，對數(shù)據(jù)分析 的要求較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于目前CSF3R突變位點(diǎn)檢測方法的不足，本發(fā)明提供了一種以cDNA為模板使用 Sanger測序法檢測CSF3R點(diǎn)突變的引物，其特征在于所述擴(kuò)增引物的核苷酸序列包括：
[0007] CSF3R-MF 5' -CCGCCAGTCTGTATCACATC-3'
[0008] CSF3R-MR 5, -CCAAAGACACAGTCGTCCTC-3，
[0009] 所述測序引物的核苷酸序列包括：
[0010] CSF3R-MF 5' -CCGCCAGTCTGTATCACATC-3'
[0011] CSF3R-MR 5 ' -CCAAAGACACAGTCGTCCTC-3 '。
[0012] 進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增引物在如下擴(kuò)增體系中使用：10yM引物CSF3R-MF和 10 y MCSF3R-MR 各 0? 4ul ; 10 y 1 的 2 X KOD Buffer，0? 4 y 1 的 KOD 酶，2 y 1 的 d NTP ;5. 8 y 1 去離子水；1 U 1的cDNA模版。
[0013] 進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增引物在如下擴(kuò)增程序下進(jìn)行：94°C 5min ;98°C 10s，58°C 25s， 68°C 30s，共 40 個循環(huán)；68°C 2min。
[0014] 本發(fā)明還提供檢測CSF3R基因點(diǎn)突變的方法，包括以下步驟：
[0015] ⑴提取人全血樣本中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ;
[0016] ⑵利用擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述PCR擴(kuò)增條件為：94°C 5min ; 98°C 10s，58°C 25s，68°C 30s，共 40 個循環(huán)；68°C 2min ;
[0017] ⑶使用酶法純化PCR產(chǎn)物；
[0018] ⑷利用測序引物進(jìn)行sanger測序，得到不同片段長度的測序產(chǎn)物；所述PCR擴(kuò)增 條件為：95°C預(yù)變性4min ;95°C變性15s，50°C退火20s，68°C延伸2min，25個循環(huán)；
[0019] (5)測序產(chǎn)物純化及上測序儀進(jìn)行測序；
[0020] (6)對得到的測序結(jié)果進(jìn)行分析；
[0021] 所述擴(kuò)增引物的核苷酸序列包括：
[0022] CSF3R-MF 5' -CCGCCAGTCTGTATCACATC-3'
[0023] CSF3R-MR 5' -CCAAAGACACAGTCGTCCTC-3'
[0024] 所述測序引物的核苷酸序列包括：
[0025] CSF3R-MF 5' -CCGCCAGTCTGTATCACATC-3'
[0026] CSF3R-MR 5' -CCAAAGACACAGTCGTCCTC-3'。
[0027] 進(jìn)一步地，檢測CSF3R基因點(diǎn)突變的位點(diǎn)分別是T615、T618、Q741好S782。
[0028] 進(jìn)一步地，所述點(diǎn)突變的原始序列分別是：
[0029] CSF3R T615 野生型：ACC
[0030] CSF3R T618 野生型：ACC
[0031] CSF3R Q741 野生型：CAA
[0032] CSF3R S783 野生型：AGC。
[0033] 本發(fā)明的有益效果是：在現(xiàn)有的技術(shù)中，CSF3R基因突變的檢測是基于DNA為模 板，要檢測近膜突變和截?cái)嗤蛔儯托枰謩e針對近膜突變和截?cái)嗤蛔冞M(jìn)行兩個PCR擴(kuò)增， 分兩段進(jìn)行測序。而本發(fā)明所述引物和檢測方法是基于cDNA為模板，只要進(jìn)行一個PCR擴(kuò) 增和測序反應(yīng)，即可同時(shí)檢測近膜突變和截?cái)嗤蛔?，?jié)省了成本，增加了檢測通量。有助于 快速、準(zhǔn)確地診斷患者CSF3R突變位點(diǎn)基因的突變狀況和突變類型，對于臨床上慢性中性 粒細(xì)胞白血病患者的治療和用藥有極大的指導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0034] 圖1是使用本發(fā)明引物測序方法對一個待檢血液樣本進(jìn)行篩查的T615位點(diǎn)測序 圖。（框選中位置為T615位點(diǎn)）
[0035] 圖2是使用本發(fā)明引物測序方法對一個待檢血液樣本進(jìn)行篩查的T618位點(diǎn)測序 圖。（框選中位置為T618位點(diǎn)）
[0036] 圖3是使用本發(fā)明引物測序方法對一個待檢血液樣本進(jìn)行篩查的Q741位點(diǎn)測序 圖。（框選中位置為Q741位點(diǎn)）
[0037] 圖4是使用本發(fā)明引物測序方法對一個待檢血液樣本進(jìn)行篩查的S783位點(diǎn)測序 圖。（框選中位置為S783位點(diǎn)）
【具體實(shí)施方式】
[0038] 實(shí)施例1 :
[0039] 血液RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄：1. 5ml離心管中加1ml紅細(xì)胞裂解液和0. 5ml全血標(biāo) 本，顛倒混勻，室溫放置5min ;期間顛倒混勻2-3次；離心4000rpm，3min ;吸棄上清；觀察 細(xì)胞團(tuán)塊體積，達(dá)到10-30ul，加lml紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，吹打混勻（若細(xì)胞團(tuán)塊體積 未達(dá)到10ul，重復(fù)上述步驟）；離心4000rpm，3min，吸棄上清；加lml紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì) 胞，吹打混勾；離心4000rpm，3min，吸棄上清；向細(xì)胞團(tuán)塊中加入1 ml Trizol Reagent; 用移液槍反復(fù)吹打直至裂解液中無細(xì)胞團(tuán)塊；每管加入〇. 2ml氯仿，漩渦混勻30s，呈均 勾粉紅狀后冰上放置lOmin。14, 000rpm，4°C離心10min ;新取1. 5ml離心管，加入預(yù)冷 異丙醇450ul，標(biāo)記流水號；取離心后的上層水相450ul，漩渦混勻10s，冰上靜置lOmin ; 14,000rpm，4°C離心10min ;緩慢倒棄上清，在吸水紙上瀝干管口殘余液體，緩慢地加入1 ml 75 %的DEPC-乙醇（切勿觸及沉淀），輕輕顛倒洗滌離心管，使沉淀懸??；14000rpm，4°C 離心5min ;緩慢倒棄上清，在吸水紙上瀝干管口殘余液體，加入無水乙醇lml，使沉淀懸??； 14000rpm, 4°C離心5min ;倒棄上清，在吸水紙上瀝干管口殘余液體，室溫干燥5min ;加入 15-50ulRNase-free 水；取 4ul RNA 加入 lul Oligo (dT) 20 (lOpmol/ y 1)，70°C變性 5min， 冰上靜置 2min，再加入 lOul RNase Free H20,4ul 5XRT Buffer，lul ReverTra Ace (東洋 紡（上海）生物科技有限公司）。按照如下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37°C 45min ;98°C 5min。反應(yīng) 結(jié)束后，保存于-20 °C待用。
[0040] 其中，所述 10X紅細(xì)胞裂解液配方為：NH4C1 82g，NaHC038 . 4g，EDTA-Na23. 72g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0041] 實(shí)施例2:
[0042] PCR擴(kuò)增：按如下試劑及試劑量配置PCR擴(kuò)增體系，其中擴(kuò)增引物 CSF3R-MF(10yM)和 CSF3R-MR(10yM)各 0.4ul;2XK0D Buffer 10ul，K0D 酶（1U/ ul)0.4ul，d NTP(2mM)2ul(東洋紡（上海）生物科技有限公司）；加去離子水5.8ul ;最后 加 DNA 模版 lul。其擴(kuò)增程序