專利名稱：使用氧載體組合物增強(qiáng)血液動力穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強(qiáng)接受手術(shù)的個(gè)體的血液動力穩(wěn)定性的方法，該方法為向個(gè)體施用一種包括以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體的組合物。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及使用聚烯烴氧化物修飾的血紅蛋白用于減少協(xié)同效應(yīng)和高度的氧親和力以增加氧氣的卸載量，以此作為避免手術(shù)期間引起血液動力穩(wěn)定性相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防措施。
背景技術(shù)：
血液是運(yùn)輸氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)以及從組織清除廢物的途徑。血液由血漿組成，在血漿中混懸有紅細(xì)胞(RBCs或紅血球)、白細(xì)胞(WBCs)和血小板。紅細(xì)胞占血液細(xì)胞總數(shù)的大約99％，其主要功能是將氧氣運(yùn)輸?shù)浇M織中并從組織中移除二氧化碳。
心臟的左心室將血液泵出至循環(huán)系統(tǒng)的動脈和小動脈。然后血液進(jìn)入毛細(xì)血管，在那里完成了大部分的氧氣遞送、營養(yǎng)物質(zhì)交換以及取出細(xì)胞廢物(例如參見A.C.Guyton，″Human Physiology AndMechanisms Of Disease″(3rd.ed.；W.B.Saunders Co.，Philadelphia.Pa.)，pp.228-229(1982))。此后，血液流經(jīng)小靜脈和靜脈直至流回心臟的右心房。雖然和從心臟泵出的血液相比，流回心臟的血液的含氧量較少，但是當(dāng)處于休息狀態(tài)時(shí)，流回的血液中仍然包含75％的原始氧含量。
RBCs的可逆氧合作用(即運(yùn)輸氧)是通過血紅蛋白完成的。在哺乳動物中，血紅蛋白的分子量(MW)約為64,000道爾頓，由大約6％的亞鐵血紅素和94％的球蛋白組成。在其天然形式中，它包括兩對亞單元(即，它是一個(gè)四聚物)，每一對包含一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)和一個(gè)球蛋白多肽鏈。在水溶液中，血紅蛋白處于四聚物(MW 64,000道爾頓)和二聚物(MW 32,000道爾頓)形式的平衡狀態(tài)。在RBC之外，二聚物由腎(血漿半衰期大約為2-4小時(shí))過早地分泌。和血紅蛋白一致，RBCs包含紅細(xì)胞基質(zhì)(RBC膜)，其包括蛋白質(zhì)、膽固醇和磷脂。
由于醫(yī)院和其他機(jī)構(gòu)對于血液制品的需要，很多研究者都已進(jìn)行了血液代用品的開發(fā)研究。“血液代用品”是一種血液制品，其能夠向組織運(yùn)輸和供應(yīng)氧氣。以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體(HBOCs)是包含血紅蛋白的血液代用品。HBOCs具有很多用途，包括在手術(shù)過程中以及急性出血中替代損耗的血液，還可用于挫傷后的蘇醒過程?；旧希琀BOCs可應(yīng)用于任何目的，其中積聚的血液可以立刻對患者使用(例如參見Bonson等人的U.S.Pat.Nos.4,001,401和Morris等人的4,061,736)。
基于目前人類血液供給受限的事實(shí)，HBOCs的發(fā)展特別重要。出于這個(gè)原因，人類血液通常只能在醫(yī)學(xué)需要的情況下才能被使用。這通常意味著人類血液不能夠用于預(yù)防性應(yīng)用，例如“血液麻醉”(即為了通過增加血液攜氧能力增強(qiáng)效果的目的給予全血)。因此，無論是全血還是HBOCs都不能廣泛地用于預(yù)防疾病，而且在大多數(shù)情況下也被認(rèn)為不能用于存在不可靠性的實(shí)驗(yàn)。
以前曾提出過在手術(shù)前，如有需要，或在手術(shù)后，與從患者(即急性血量正常性血液稀釋或“ANH”)身上移除血液相結(jié)合地對患者使用HBOCs，所述取出的血液可以在手術(shù)后再返回患者體內(nèi)。例如參見，PCT WO 98/37909。在本文中，這類患者在手術(shù)時(shí)不被認(rèn)為是“血量正常的”。然而，這一步驟不是避免外科手術(shù)的損害性初級作用例如血液動力穩(wěn)定性的預(yù)防措施，但只是與外科手術(shù)相關(guān)性失血的副作用的預(yù)防措施。
基于下面兩個(gè)基本原因，在需要全身麻醉的外科手術(shù)期間增強(qiáng)血液動力穩(wěn)定性是很重要的。首先，由失血或其他因素引起的血液動力不穩(wěn)定性會造成組織損傷，甚至是死亡。例如，出血性低血壓和過敏性休克是由顯著性失血引起的，這兩種情況會減少組織氧合。對于具有上述醫(yī)學(xué)狀況的患者而言，通過循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)定血壓和增加提供機(jī)體組織的氧數(shù)量是被期望和非常關(guān)鍵的。
其次，并且最重要的是，血液動力不穩(wěn)定性即使是較輕微和短暫性的，都有可能影響患者的術(shù)后康復(fù)。這種不穩(wěn)定性可能發(fā)生在身體的任何部位，并經(jīng)常被認(rèn)為是“低血壓狀態(tài)”，其通常為血壓下降。上述情況是全身麻醉期間局部血液動力學(xué)變化的結(jié)果，甚至是在沒有失血的情況下。這些情況可引起認(rèn)知損傷以及其他并發(fā)癥，這些會惡化手術(shù)后的康復(fù)。例如，進(jìn)行了侵入性外科手術(shù)例如髖關(guān)節(jié)置換的年長患者將從能夠在手術(shù)期間增強(qiáng)他們的血液動力穩(wěn)定性的預(yù)防措施中受益。另外，這些患者通常不是ANH的適當(dāng)候選人，增強(qiáng)其血液動力穩(wěn)定性能夠減少他們對于使用供體血液輸血的需要。
血漿增容藥和容積替換在保持血液動力穩(wěn)定性的用途是非常普遍的。然而，這些非氧載體溶液甚至在沒有ANH的情況下也只能稀釋血液的氧容量，并且事實(shí)上在某些情況下可能會造成血液動力的不穩(wěn)定性。除了血漿增容藥和容積替換以外，晶體溶液也曾被建議用于保持血液動力穩(wěn)定性。然而，使用這些溶液可能會引起過量水分保持和浮腫，其還可能造成血液動力性質(zhì)的不穩(wěn)定。
相應(yīng)地，現(xiàn)在很需要一種增強(qiáng)血液動力穩(wěn)定性的方法，其可造成暫時(shí)性的血壓過低但不會減少血液的固有攜氧能力。根據(jù)這一目標(biāo)，本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)血液動力穩(wěn)定性的方法，具體為使用包括以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體例如特定結(jié)構(gòu)的聚烯烴氧化物修飾性血紅蛋白。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及組合物在治療手術(shù)中血量正常的患者以增強(qiáng)血液動力穩(wěn)定性的用途。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及一種用于增強(qiáng)接受手術(shù)的血量正常的個(gè)體血液動力穩(wěn)定性的方法，包括a)與手術(shù)結(jié)合對個(gè)體使用包含以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體(HBOC)，所述氧載體比全血具有更高的氧親和力；和b)監(jiān)控個(gè)體的血液動力穩(wěn)定性。這種給藥可在手術(shù)之前、期間或之后，或者其任意組合。另外，在手術(shù)之前、期間或之后可以測量血液動力穩(wěn)定性，或者其任意組合。另外，監(jiān)控患者的血液動力穩(wěn)定性可有很多形式，例如監(jiān)測患者的血壓。在一種具體實(shí)施方式
中，血液動力穩(wěn)定性是通過大約90mm Hg的收縮壓來判定的。
本發(fā)明的HBOC可有很多形式，例如聚烯烴氧化物修飾的血紅蛋白，其可通過天然或合成來源，包括重組體來源獲得。另外血紅蛋白的來源可以是人類或者其他的非人類動物。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，HBOC的氧親和力是全血的兩倍多，全血可包括P50s為4-15的HBOCs。
另一方面，本發(fā)明包括以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體(HBOC)在生產(chǎn)用于增強(qiáng)血量正常的手術(shù)患者的血液動力穩(wěn)定性方面的用途，其中HBOC的氧親和力高于全血。這種用途還可進(jìn)一步包括氧卸載的增強(qiáng)以避免與手術(shù)相關(guān)的血液動力不穩(wěn)定性。例如，HBOCs的性質(zhì)以及藥物的使用如上文所述。
本發(fā)明的其他方面如說明書所述。
附圖簡述


圖1描述了MalPEG-Hb和無基質(zhì)血紅蛋白(SFH)的FPLC色譜圖。
圖2為MalPEG-Hb、SFH和全血的氧平衡曲線。
圖3描述了給予不同的試驗(yàn)溶液以后的小鼠存活率。
圖4描述了患者在接受MalPEG-Hb或林格(氏)乳酸鹽后的尿排出量。
圖5描述了患者在麻醉前接受MalPEG-Hb的生命體征。
圖6描述了接受MalPEG-Hb或安慰劑的患者在手術(shù)期間顯示出血壓過低的百分比。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及增強(qiáng)手術(shù)患者血液動力穩(wěn)定性的方法，該方法為對患者使用一種包含以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體的組合物。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及聚烯烴氧化物修飾的血紅蛋白在增強(qiáng)氧卸載量并以此作為一種避免手術(shù)期間發(fā)生與血液動力穩(wěn)定性相關(guān)的并發(fā)癥的預(yù)防措施的用途，所述聚烯烴氧化物修飾的血紅蛋白能夠降低協(xié)同效應(yīng)以及高氧親和力。
為了更容易地理解本發(fā)明的下述說明書部分，對一些術(shù)語進(jìn)行如下解釋。
定義
術(shù)語“血紅蛋白”通常是指包含在紅細(xì)胞內(nèi)能夠運(yùn)輸氧氣的蛋白質(zhì)。血紅蛋白的每個(gè)分子有4個(gè)亞單元，2個(gè)α鏈和2個(gè)β鏈，其分布于一個(gè)四聚體結(jié)構(gòu)中。每一個(gè)亞單元還包括一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，其是連接氧的含鐵中心。因此，每一個(gè)血紅蛋白分子可以連接4個(gè)氧原子。
術(shù)語“修飾的血紅蛋白”包括但不限于被化學(xué)反應(yīng)改變的血紅蛋白，所述化學(xué)反應(yīng)例如分子內(nèi)或分子間交聯(lián)、基因操作、聚合作用、和/或與其他化學(xué)基團(tuán)軛合(例如聚烯烴氧化物，例如聚乙二醇、或其他的加合物如蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、合成聚合物等等)。基本上，如果血紅蛋白的結(jié)構(gòu)或功能相對于其原始狀態(tài)有任何改變，則其就是“修飾的”。在本文中，術(shù)語“血紅蛋白”本身既包括天然未修飾的血紅蛋白，也包括修飾的血紅蛋白。
術(shù)語“表面修飾的血紅蛋白”是指上文所述的血紅蛋白，其連接有化學(xué)基團(tuán)例如葡聚糖或聚烯烴氧化物，所述化學(xué)基團(tuán)大多數(shù)是共價(jià)基團(tuán)。術(shù)語“表面修飾的氧合血紅蛋白”是指當(dāng)血紅蛋白表面被修飾時(shí)其處于“R”狀態(tài)。
術(shù)語“無基質(zhì)血紅蛋白”指的是其中所有的紅細(xì)胞膜都被移除的血紅蛋白。
術(shù)語“高鐵血紅蛋白”指的是含有三價(jià)鐵離子但不具有氧運(yùn)載能力的血紅蛋白的氧化形式。
術(shù)語“MalPEG-Hb”指的是與具有malemidyl活性的PEG相軛合的血紅蛋白。這種MalPEG還可以是指下述結(jié)構(gòu)Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m式I其中Hb指的是四聚體血紅蛋白，S是表面巰基基團(tuán)，Y是連接Hb和Mal-PEG的琥鉑酰亞胺基共價(jià)鍵，R是不存在的或者是烷基、酰胺、氨基甲酸酯或苯基基團(tuán)(取決于原材料的來源和化學(xué)合成方法)，[O-CH2-CH2]n是氧乙烯基單元組成的PEG聚合物主鏈，其中n定義了聚合物的長度(例如，MW＝5000)，O-CH3是末端甲氧基。
術(shù)語“血漿增容藥”指的是可以增加客體血漿溶劑的任何試劑。
術(shù)語血液代用品的“攜氧能力”或者只是“氧容量”指的是其運(yùn)輸氧氣的能力，但不必然和其傳遞氧氣的能力相關(guān)。因?yàn)橐阎靠搜t蛋白能夠結(jié)合1.34ml氧氣，所以包含血紅蛋白的血液代用品的攜氧能力通常根據(jù)血紅蛋白濃度計(jì)算。因此g/dl濃度的血紅蛋白乘1.34得到ml/dl的氧容量。血紅蛋白的濃度可以根據(jù)任何已知方法進(jìn)行測量，例如采用β-Hemoglobin光度計(jì)(HemoCue，Inc.，Angelholm，Sweden)。同樣地，氧容量可以根據(jù)從血紅蛋白或血液樣本中釋放出的氧氣量進(jìn)行計(jì)算，例如使用燃料電池設(shè)備(如Lex-O2-Con，LexingtonInstruments，Waltham，Massachusetts)。
術(shù)語“氧親和力”指的是氧載體例如血紅蛋白結(jié)合分子氧的親和能力。這一性質(zhì)根據(jù)氧平衡曲線進(jìn)行確定，其和血紅蛋白分子對于氧氣的飽和度(Y軸)以及氧分壓(X軸)相關(guān)。曲線上的點(diǎn)表示的是數(shù)值、P50和氧分壓，在某一點(diǎn)上氧載體對于氧氣是半飽和狀態(tài)，并且和氧親和力相反。因此P50越低，氧親和力越高。全血(以及全血的組分例如紅細(xì)胞和血紅蛋白)的氧親和力，以及任何氧載體的氧親和力，都可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的多種方法進(jìn)行測量(例如參見Winslow et at，J.Biol.Chem.252(7)2331-37(1977))。氧親和力還可以使用商業(yè)上可獲得的HEMOXTM分析器(TCS ScientificCorporation，New Hope，Pennsylvania)進(jìn)行測量(例如參見Vandegriff and Shrager in″Methods in Emzymology″(Everse et al.，Eds.)232460(1994))。
術(shù)語“氧運(yùn)輸組份”廣義上是指能夠在循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)輸氧氣并且能夠?qū)⒅辽僖徊糠盅鯕忉尫胖两M織中的物質(zhì)。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，氧運(yùn)輸組份是天然的或修飾的血紅蛋白，在本文中也指“以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體”或者“HBOC”。
術(shù)語“血液動力參數(shù)”廣義上指的是用于指示血壓、血流和血液容量狀態(tài)的測量結(jié)果，包括直接測量值例如血壓、心輸出量、右心房壓、左心室舒張末期壓，以及對于心動過速、局部缺血、心動過緩、傳導(dǎo)障礙、體液平衡、重量、ICU時(shí)間和腎功能的間接測量值。
術(shù)語“類晶體”指的是小分子(通常小于10)例如鹽、糖和緩沖液。和膠體不同的是，類晶體不包括任何膨脹的活性成分，并能夠在循環(huán)系統(tǒng)和間質(zhì)空間之間很快地達(dá)到平衡。
術(shù)語“膠體”(和“類晶體”相反)指的是較大的分子(通常大于10)，其依賴他們的大小和電荷能夠穿過生物膜保持平衡，“膠體”包括蛋白質(zhì)例如白蛋白和明膠，以及淀粉例如噴他淀粉和羥乙基淀粉。
術(shù)語“膠體滲透壓”指的是膠體穿過生物膜保持體液平衡時(shí)表現(xiàn)出的壓力。
術(shù)語“穩(wěn)定自氧化作用”是指HBOC在保持低自氧化率方面的能力。在室溫(大約24℃)下，如果高鐵血紅蛋白/總血紅蛋白的比例在10小時(shí)后增加不超過2％的話，則認(rèn)為HBOC在24℃是穩(wěn)定的。例如，如果自氧化率為0.2hr-1，那么如果高鐵血紅蛋白最初的百分率為5％并且在10小時(shí)內(nèi)未增加超過7％的話，則認(rèn)為HBOC在室溫下是穩(wěn)定的。
術(shù)語“高鐵血紅蛋白/總血紅蛋白比率”指的是氧化的血紅蛋白和總血紅蛋白的比率。
術(shù)語“混合物”指的是兩種或更多的物質(zhì)混合在一起而不發(fā)生會降低它們各自性質(zhì)的反應(yīng)；術(shù)語“溶液”指的是一種液體混合物；術(shù)語“水溶液”是指包含部分水的溶液，并且還可以包含一種或多種其它液體物質(zhì)以及水，形成多組分溶液；術(shù)語“大約”是指在某一范圍內(nèi)的實(shí)際數(shù)值，例如指示值為10％。
術(shù)語“聚乙二醇”或“PEG”指的是化學(xué)結(jié)構(gòu)H(OCH2CH2)nOH的液體或固體聚合物及其變體，其中n大于等于4，例如PEG是活性的、取代或未取代的。
術(shù)語“灌注”是指液體通過動脈和毛細(xì)血管流進(jìn)組織和器官。
術(shù)語“血液動力穩(wěn)定性”指的是在循環(huán)機(jī)械學(xué)中的穩(wěn)定功能，即任何血液動力參數(shù)在一定時(shí)間內(nèi)都是穩(wěn)定的。
術(shù)語“低血壓事件”表現(xiàn)為或者原因?yàn)榫植炕蛉硇缘牡脱獕?，即血壓下降，其在?shù)量上還被定義為收縮壓小于90mmHg或者血壓低于基線值的75％。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以簡單地理解本文中其他術(shù)語的含義。
氧運(yùn)輸和消耗的性質(zhì)
雖然本發(fā)明組合物和方法的成功應(yīng)用不需要理解氧運(yùn)輸和消耗的根本機(jī)制，但有關(guān)這些假定機(jī)理的某些基本知識可以幫助理解下文的討論。現(xiàn)有技術(shù)通常假定毛細(xì)血管是將氧氣運(yùn)送到組織的最基本單元。然而目前的研究表明，當(dāng)組織處于休息狀態(tài)時(shí)，大約有同樣數(shù)量的小動脈和毛細(xì)血管釋放氧氣。也就是說，動脈系統(tǒng)中的血紅蛋白被認(rèn)為是在小動脈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中運(yùn)輸大約三分之一的氧含量，在毛細(xì)血管中運(yùn)輸三分之一的氧含量，其余的氧氣則通過靜脈系統(tǒng)脫離微循環(huán)。
動脈和小動脈自身是氧氣利用的場所。例如，動脈壁需要能量通過收縮對抗血管阻力以調(diào)節(jié)血流。因此，動脈壁通常是氧氣從血液中擴(kuò)散出來的重要位置。然而，現(xiàn)在的氧運(yùn)輸組份(例如HBOCs)可以在動脈系統(tǒng)中釋放更多的氧氣，從而在毛細(xì)管灌注中誘導(dǎo)自動調(diào)整性減少。相應(yīng)地，如果有太多的氧氣或氧親和力過低，也可能阻礙血液代用品的氧運(yùn)輸效率。
血管壁耗氧量的比率，即機(jī)械工作需要的氧氣和生化合成需要的氧氣的和，可以通過測量血管壁的梯度加以確定。例如參見Winslow，et al.，in″Advances in Blood Substitutes″(1997)，Birkhauser，Ed.，Boston，MA，pages 167-188?，F(xiàn)有技術(shù)可以在各種血管中測量精確的氧分壓。測得的梯度和測量區(qū)域內(nèi)的組織對于氧氣利用的比率成直接比例關(guān)系。這種測量結(jié)果顯示出血管壁具有氧氣利用基線，其隨著炎癥和收縮的增加而有所增加，并且隨著舒張而有所降低。
血管壁梯度和組織氧合作用呈負(fù)性相關(guān)。血管收縮增加了氧梯度(組織新陳代謝)，血管舒張降低了梯度。較高的梯度表明有更多的氧氣被血管壁使用，而供給組織的氧氣較少。同樣的現(xiàn)象被確認(rèn)也存在于微循環(huán)中。
血管收縮和氧親和力之間的關(guān)系
發(fā)展具有高氧親和力的HBOC的理論在某些程度上建立在以前研究的基礎(chǔ)上，以前的研究是利用無細(xì)胞血紅蛋白作為紅細(xì)胞運(yùn)輸?shù)奶娲贰＿@些溶液的某些生理效應(yīng)還沒有被完全了解。其中，最有爭議的可能是引起血管收縮的自然傾向，其可以作為動物和人類高血壓的表征(Amberson，W.，″Clinical experience with血紅蛋白-saline solutions，″.Science 106117-117(1947))(Keipert，P.，A.Gonzales，C.Gomez，V.Macdonald，J.Hess，and R.Winslow，″Acute changes in systemic blood pressure and urine output ofconscious rats following exchange transfusion withdiaspirin-crosslinked hemoglobin solution，″Transfusion 33701-708，(1993))。在α鏈和二-二溴水楊?；?延胡索酸鹽(ααHb)之間交叉連接的人類血紅蛋白曾被美國軍隊(duì)研究作為紅細(xì)胞替代品的模型，但由于后來被證明會嚴(yán)重地增加肺和體循環(huán)血管阻力而被軍隊(duì)放棄(Hess，J.，V.Macdonald，A.Murray，V.Coppes，and C.Gomez，″Pulmonary and systemic hypertension after hemoglobinadministratio，″Blood 78356A(1991))。這一產(chǎn)品的商業(yè)模型在經(jīng)過令人失望的三期臨床后同樣也被放棄(Winslow，R.M.″αα-Crosslinked hemoglobinWas failure predicted bypreclinical testing？″Vox sang 791-20(2000)。
關(guān)于由無細(xì)胞血紅蛋白引起的血管收縮的最常見的先進(jìn)解釋是無細(xì)胞血紅蛋白很容易與內(nèi)皮細(xì)胞衍生舒張因子一氧化氮(NO)結(jié)合。事實(shí)上，已經(jīng)生產(chǎn)出了與NO親和力有所下降的重組體血紅蛋白，在高負(fù)荷小鼠實(shí)驗(yàn)中其顯示出較少的高血壓(Doherty，D.H.，M.P.Doyle，S.R.Curry，R.J.Vali，T.J.Fattor，J.S.Olson，andD.D.Lemon，″Rate of reaction with nitric oxide determines thehypertensive effect of cell-free hemoglobin，″NatureBiotechnology 16672-676(1998))(Lemon，D.D.，D.H.Doherty，S.R.Curry，A.J.Mathews，M.P.Doyle，T.J.Fattor，and J.S.Olson，″Control of the nitric oxide-scavenging activity ofhemoglobin，″Art Cells，Blood Subs.，and Immob.Biotech 24378(1996))。
然而，研究表明血紅蛋白與NO結(jié)合并不是其血管效應(yīng)的唯一解釋。已發(fā)現(xiàn)某些大血紅蛋白分子，例如被聚乙二醇(PEG)修飾的血紅蛋白，事實(shí)上與高血壓效應(yīng)無關(guān)，即使它們與NO的結(jié)合率和那些具有嚴(yán)重高血壓的ααHb相同(Rohlfs，R.J.，E.Bruner，A.Chiu，A.Gonzales，M.L.Gonzales，D.Magde，M.D.Magde，K.D.Vandegriff，and R.M.Winslow，″Arterial blood pressure responses tocell-free hemoglobin solutions and the reaction with nitricoxide，″J BioI Chem 27312128-12134(1998))。此外，還發(fā)現(xiàn)在出血前使用PEG-血紅蛋白作為交換輸血時(shí)，其在預(yù)防出血后果方面格外地有效(Winslow，R.M.，A.Gonzales，M.Gonzales，M.Magde，M.McCarthy，R.J.Rohlfs，and K.D.Vandegriff″Vascularresistance and the efficacy of red cell substitutes，″J ApplPhysiol 85993-1003(1998))。
保護(hù)效應(yīng)與無高血壓相關(guān)聯(lián)，迄今為止，研究表明血管收縮對于很多以血紅蛋白為基礎(chǔ)的產(chǎn)品所產(chǎn)生的令人失望的性能負(fù)有主要責(zé)任。根據(jù)上述結(jié)論，一種假說被用于解釋血管收縮，作為NO結(jié)合效應(yīng)的替代或可能補(bǔ)充。雖然不希望被任何特定理論所束縛，但仍然相信血紅蛋白血管效應(yīng)的實(shí)質(zhì)原因是無細(xì)胞區(qū)域內(nèi)血紅蛋白擴(kuò)散的相反應(yīng)答。在體外毛細(xì)管系統(tǒng)中驗(yàn)證上述假說，其被證明PEG-血紅蛋白運(yùn)輸氧氣的方式和自然紅細(xì)胞非常相似，其中PEG-血紅蛋白擴(kuò)散常數(shù)較低(McCarthy，M.R.，K.D.Vandegriff，and R.M.Winslow，″Therole of facilitated diffusion in oxygen transport by cell-freehemoglobinImplications for the design of hemoglobin-basedoxygen carriers，″Biophysical Chemistry 92103-117(2001))。由于從血紅蛋白至血管壁的飽和狀態(tài)的改變是血紅蛋白自身擴(kuò)散梯度的決定因素，因此氧親和力被期望在血漿區(qū)域內(nèi)由血紅蛋白促進(jìn)擴(kuò)散中具有一定作用。
因?yàn)镺2向小動脈血管壁的釋放會引起血管收縮，因此無細(xì)胞血紅蛋白的氧親和力在調(diào)節(jié)血管緊張度方面可能具有一定的作用(Lindbom，L.，R.Tuma，and K.Arfors，″Influence of oxygen onperfusion capillary density and capillary red cell velocity inrabbit skeletal muscle，″Microvasc Res 19197-208(1980))。在地鼠皮膚皺褶中，血管中的PO2為20-40托，正常紅細(xì)胞氧平衡曲線坡度很陡(Intaglietta，M.，P.Johnson，and R.Winslow，″Microvascular and tissue oxygen distribution，″Cardiovasc Res32632-643(1996))。因此從理論上說，為了預(yù)防O2在小動脈中的釋放會調(diào)節(jié)血管，無細(xì)胞血紅蛋白的P50比紅細(xì)胞(即氧親合力較高)的低是很重要的。
氧氣卸載
除了氧親和力以外，氧氣結(jié)合性質(zhì)本身，即協(xié)同效應(yīng)和別構(gòu)效應(yīng)，在HBOCs的氧卸載能力中也具有決定性作用。已經(jīng)觀察到和血紅蛋白結(jié)合的聚烯烴氧化物引起了珠蛋白結(jié)構(gòu)廣泛性“緊固”。這對于具有親水外殼包圍的血紅蛋白而言有助于其滲透效應(yīng)，并且還可能取決于用于和聚烯烴氧化物相連接的連接基團(tuán)的性質(zhì)以及位置。常規(guī)知識為HBOCs的設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)模仿天然血紅蛋白的性質(zhì)。然而，出乎意料地發(fā)現(xiàn)對血紅蛋白四元結(jié)構(gòu)的改造是有益的，特別是在氧卸載方面。
如果一個(gè)蛋白質(zhì)和一種效應(yīng)分子即一個(gè)配體在其變構(gòu)部位結(jié)合并帶來了其性質(zhì)的改變，那么這個(gè)蛋白質(zhì)則被認(rèn)為是“變構(gòu)”的。如果是血紅蛋白，配體則是氧。血紅蛋白四聚體的每一個(gè)亞單元都能夠和一個(gè)氧分子結(jié)合。每一個(gè)亞單元也可以有兩種構(gòu)象——緊張的(T)或松弛的(R)。在R狀態(tài)下，其能夠比在T狀態(tài)時(shí)更容易地與氧結(jié)合。
在結(jié)合氧的單個(gè)亞單元之中，血紅蛋白顯示出了協(xié)同效應(yīng)或者協(xié)同性。氧對于一個(gè)亞單元的結(jié)合導(dǎo)致亞單元結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成剩余的活性位點(diǎn)顯示出增強(qiáng)的氧親和力。相應(yīng)地，每一個(gè)連續(xù)的氧分子和血紅蛋白分子的結(jié)合都比前一個(gè)更容易，直到血紅蛋白分子完成R或者“配體”狀態(tài)，連接有四個(gè)氧分子。
相反，天然血紅蛋白以其釋放氧的效率顯示出預(yù)期效果。第一個(gè)分子較為牢固地連接并且?guī)ё咻^多能量以“卸載”，然后是下一個(gè)分子，等等。相應(yīng)地，一旦與氧結(jié)合，對于血液代用品設(shè)計(jì)的常規(guī)教導(dǎo)對于其釋放氧的能力可能會有不利的影響，所述常規(guī)教導(dǎo)為模仿天然血紅蛋白的協(xié)同效應(yīng)。
本發(fā)明涉及HBOCs在應(yīng)用包括氧卸載方面出乎意料地更加有用的發(fā)現(xiàn)，所述HBOCs比天然血紅蛋白具有更少、不會更多的協(xié)同效應(yīng)。相應(yīng)地，用于增強(qiáng)血液動力穩(wěn)定性的組合物一旦到達(dá)其靶位點(diǎn)時(shí)，必須能夠容易地釋放氧氣，但不必具有過多的氧氣釋放能力以避免血管收縮效應(yīng)。簡單地說，理想組合物是和手術(shù)操作相結(jié)合用于預(yù)防處理以達(dá)到必然增強(qiáng)血液動力穩(wěn)定性的目的，其包括修飾的血紅蛋白，相對于天然血紅蛋白具有更少的協(xié)同效應(yīng)，但與全血相比，其在組合物中具有更高的氧親和力(少于P50的一半)氧運(yùn)輸組份
在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，氧載體(即氧運(yùn)輸組份)是以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體，或HBOC。血紅蛋白可以是天然的(未修飾)；隨后通過化學(xué)反應(yīng)例如分子內(nèi)或分子間交聯(lián)、聚合作用或附加化學(xué)基團(tuán)(例如聚烯烴氧化物或其他加成物)修飾的；或者其可以是重組體。人類α-和β-珠蛋白基因均被克隆并排序。Liebhaber，et al，P.N.A.S.777054-7058(1980)；Marotta，et al，J.Biol.Chem.3535040-5053(1977)(β-珠蛋白cDNA)。另外，很多重組產(chǎn)生的經(jīng)修飾的血紅蛋白現(xiàn)在利用定向誘變方法進(jìn)行生產(chǎn)，雖然這些“突變體”血紅蛋白種類被報(bào)道具有高氧親和力。例如參見，Nagai，et al，P.N.A.S.，827252-7255(1985)。
本發(fā)明應(yīng)用的HBOCs比常規(guī)的全血具有更高的氧親和力(來源于相同的動物體，并不一定是人類)，其P50值也比全血低。通常認(rèn)為全血的P50為大約28托。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明HBOCs額P50比全血的一般還要低，其被認(rèn)為是具有“高氧親和力”。這種高氧親和力的HBOCs的P50為4-15，例如10、7等等。
本發(fā)明并不限制血紅蛋白的來源。例如，血紅蛋白可以是從動物和人類獲得的。用于特定用途的血紅蛋白優(yōu)選來源于人類、牛和豬，以及非哺乳動物例如環(huán)節(jié)動物、爬行類動物等等。另外，血紅蛋白可以通過其他方法生產(chǎn)，包括化學(xué)合成和重組技術(shù)。可以將血紅蛋白以游離形式加入到血產(chǎn)品組合物中，或者將其包裹在小囊中例如合成微粒、微球或脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的氧運(yùn)輸組份沒有基質(zhì)和內(nèi)毒素。很多美國專利都公開了氧運(yùn)輸組份的代表性例子，包括Hsia的美國專利4,857,636，Walder的美國專利4,600,531，Morris等人的美國專利4,061,736，Mazur的美國專利3,925,344，Tye的美國專利4,529,719，Scannon的美國專利4,473,496，Bocci等人的4,584,130，Kluger等人的美國專利5,250,665，Hoffman等人的美國專利5,028,588以及Sehgal等人的美國專利4,826,811和美國專利5,194,590。
除了上述血紅蛋白的來源以外，最近還發(fā)現(xiàn)了馬血紅蛋白作為本發(fā)明組合物中的氧運(yùn)輸組份具有特定的優(yōu)點(diǎn)。一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是從商業(yè)上能夠容易地獲得大量的馬血，其中可以純化馬血紅蛋白。另一個(gè)預(yù)料不到的優(yōu)點(diǎn)是馬血紅蛋白顯示出可以增強(qiáng)其在本發(fā)明血液代用品中的用途的化學(xué)性質(zhì)。
以前的報(bào)道表明馬血紅蛋白對高鐵血紅蛋白的自氧化作用快于人血紅蛋白，其導(dǎo)致不太適用于作為血液代用品組份。例如參見，J.G.McLean and I.M.Lewis，Research in Vet.Sci，19259-262(1975)。為了使自氧化作用降至最低，McLean和Lewis在紅細(xì)胞溶解后使用了一種還原劑谷胱甘肽。然而，用于制備本發(fā)明組合物的血紅蛋白，無論其來源是否是人類或馬，都不需要使用還原劑以預(yù)防紅細(xì)胞溶解后的自氧化作用。
最近，有報(bào)道稱馬血紅蛋白和人類血紅蛋白的氧親和力有所不同，例如參見M.Mellegrini，et al.Eur.J.Biochem.，2683313-3320(2001)。這種差別使得不可選擇馬血紅蛋白用于制備可模仿人類血紅蛋白的血液代用品。然而，當(dāng)和本發(fā)明組合物混合時(shí)，在包含人類血紅蛋白的共軛物和馬血紅蛋白的共軛物之間沒有觀察到關(guān)于氧親和力的顯著性差別(小于10％)。相應(yīng)地，與這些表面上不被期望的性質(zhì)相反，在本發(fā)明組合物種，馬血紅蛋白和人類血紅蛋白可能是相當(dāng)?shù)摹?br> 在本發(fā)明中，當(dāng)在相同條件下測量時(shí)，HBOC的氧親和力高于全血，優(yōu)選為全血的兩倍，或者擇一地，HBOC的氧親和力高于無基質(zhì)血紅蛋白(SFH)。大多數(shù)情況下，這意味著血液代用品中HBOC的P50小于10，優(yōu)選小于7。在游離狀態(tài)下，SFH的P50為大約15托，然而全血的P50大約為28托。以前曾有建議稱，提高氧親和力，因而降低P50，可以提高氧氣向組織的傳遞，雖然其隱含了P50不得低于SFH的P50的條件，參見Winslow，et al.，in″Advances in BloodSubstitutes″(1997)，Birkhauser，ed.，Boston，MA，at page 167，and U.S.Patent No.6,054,427。這一建議否決了廣泛存在的一種認(rèn)知，即用作血液代用品的修飾的血紅蛋白應(yīng)當(dāng)具有較低的氧親和力，并且P50應(yīng)當(dāng)與全血相當(dāng)。由于吡啶氧基修飾的血紅蛋白與SFH結(jié)合時(shí)更容易釋放氧氣，因此很多研究者使用吡啶氧基磷酸鹽將SFH的P50由10提高至約20-22。
有很多不同的科學(xué)方法用于生產(chǎn)具有高氧親和力的HBOCs(即它們的P50小于SFH)。例如，已有研究表明氨基酸殘基在氧親和力方面具有一定作用，例如β-93半胱氨酸，因此現(xiàn)在可容易地采用定向誘變使氧親和力達(dá)到理想水平。例如參見美國專利5,661,124。美國專利6,054,427也公開了很多其他的方法。
血紅蛋白的毒性
已知當(dāng)血紅蛋白可逆地從亞鐵(Fe2+)變?yōu)楦哞F(Fe3+)或高鐵血紅蛋白形式時(shí)，其顯示出自氧化作用。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，分子氧從氧血紅蛋白中分離為超氧負(fù)離子形式(O2-)。它還造成了亞鐵血紅素-珠蛋白復(fù)合物的脫穩(wěn)定化作用，并最終導(dǎo)致珠蛋白鏈變性。氧自由基的生成和蛋白質(zhì)變性均被認(rèn)為是在HBOCs的體內(nèi)毒性中具有一定作用(Vandegriff，K.D，Blood Substitutes，Physiological Basis ofEfficacy，pages 105-130，Winslow et al.，ed.，Birkhauser，Boston，MA(1995).)。
對于大多數(shù)HBOCs而言，氧親和力和血紅蛋白氧化作用之間呈負(fù)性相關(guān)，即氧親和力越高，自氧化率越低。然而，不同血紅蛋白變體對于氧親和力的作用以及自氧化率并不總是可預(yù)測的。另外，氧親和力和自氧化率之間的最佳平衡還沒有被清楚地了解。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明組合物包括聚烯烴氧化物-Hb共軛物，例如聚乙二醇-Hb共軛物在室溫下顯示出非常低的自氧化率。當(dāng)測量自氧化率時(shí)，數(shù)值應(yīng)當(dāng)盡可能地低(即，室溫下在至少3小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選至少10小時(shí)，每小時(shí)0.2％總血紅蛋白，優(yōu)選每小時(shí)0.1％總血紅蛋白)。因此，室溫下本發(fā)明HBOCs在給藥和/或儲藏期間能夠保持穩(wěn)定。
氧運(yùn)輸組份的變體
在一個(gè)可模仿的具體實(shí)施方式
中，氧運(yùn)輸組份是聚烯烴氧化物(PAO)修飾的血紅蛋白。適當(dāng)?shù)腜AOs包括，尤其是，聚氧化乙烯((CH2CH2O)n)、聚氧化丙烯((CH(CH3)CH2O)n)或聚氧乙烯/聚氧化丙烯共聚物((CH2CH2O)n-(CH(CH3)CH2O)n)。適于本發(fā)明應(yīng)用的其他直鏈、支鏈及任選的取代合成聚合物在醫(yī)藥領(lǐng)域都是已知的。
最常規(guī)地，連接到血紅蛋白上的化學(xué)基團(tuán)是聚乙二醇(PEG)，這是因?yàn)樗撬帉W(xué)可接受并且是商業(yè)上可獲得的。PEGs是化學(xué)式H(OCH2CH2)nOH的聚合物，其中n通常大于等于4。PEG化學(xué)式后面通常有一個(gè)數(shù)字，與其平均分子量相應(yīng)。例如PEG-200的平均分子量為200，其分子量范圍是190-210。PEGs在商業(yè)上可以以很多不同的形式獲得，在很多情況下其具有預(yù)活性并且可以和蛋白質(zhì)連接。
本發(fā)明可模仿的具體實(shí)施方式
的一個(gè)重要方面是當(dāng)血紅蛋白在氧合或“R”狀態(tài)時(shí)，其可發(fā)生表面修飾。血紅蛋白和大氣在結(jié)合反應(yīng)前進(jìn)行平衡(或者，任選地，進(jìn)行活性氧合作用)可以很容易完成表面修飾。通過完成氧合血紅蛋白的軛合過程，得到的血紅蛋白的氧親和力有所增強(qiáng)。因?yàn)楹芏嘌芯空呙枋鲈跍p小氧親和力的結(jié)合過程之前會發(fā)生脫氧，因此這一步驟通常被認(rèn)為是有所禁忌的。例如參見美國專利5,234.903。
雖然PAO修飾的血紅蛋白的性質(zhì)在很多方面都不依賴于血紅蛋白和修飾物(例如PEG)的連接，但與具有不同的連接鍵例如變性性更強(qiáng)的連接模式相比，仍然相信連接物的類型例如更堅(jiān)硬的不飽和脂肪族或芳香族C1至C6連接取代基可以改變共軛物的產(chǎn)生和/或性質(zhì)。
根據(jù)PEG的大小，連接到血紅蛋白分子上的PEGs的數(shù)量是可變化的。然而，合成的修飾血紅蛋白的分子大小必須足夠大以避免被腎清除，從而達(dá)到理想的半衰期。Blumenstein等人確定的大小為分子量大于84,000道爾頓(Blumenstein，et al.，in″BloodSubstitutes and Plasma Expanders，″Alan R.Liss，editors，NewYork，New York，pages 205-212(1978).)。因此，作者將血紅蛋白和不同分子量的葡聚糖相軛合。他們報(bào)道稱血紅蛋白(分子量為64,000道爾頓)和葡聚糖(分子量為20,000道爾頓)的共軛物“從腎循環(huán)中被清除的速度很慢并且可以忽略不計(jì)”，但是增加分子量超過84,000道爾頓不會改變清除曲線。相應(yīng)地，如Blumenstein等人所述，HBOC的優(yōu)選分子量為至少84,000道爾頓。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，HBOC是″MalPEG-Hb″，其含義是和malemidyl活性的PEG相連接的血紅蛋白。這種MalPEG-Hb還指下述結(jié)構(gòu)式Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m式I其中Hb指的是四聚體血紅蛋白，S是表面巰基，Y是連接Hb和Mal-PEG的琥鉑酰亞胺基共價(jià)鍵，R是不存在的或者是烷基、酰胺、氨基甲酸酯或苯基基團(tuán)(取決于原材料的來源和化學(xué)合成方法)，[O-CH2-CH2]n是氧乙烯基單元組成的PEG聚合物主鏈，其中n定義了聚合物的長度(例如，MW＝5000)，O-CH3是末端甲氧基。
制劑
本發(fā)明HBOCs可通過混合HBOC和其他任選的輔料以及適當(dāng)?shù)乃芤夯颉跋♂寗?即適于靜脈注射的藥學(xué)可接受物質(zhì))制備成制劑。根據(jù)應(yīng)用情況氧載體在稀釋劑中的濃度會有所變化，尤其是根據(jù)期望的給藥后稀釋度變化，在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，由于本發(fā)明組合物的其他特征可用于增強(qiáng)氧運(yùn)輸和治療效果，因此通常HBOC中血紅蛋白的濃度無需高于6g/dl可以為0.1-4g/dl。
適當(dāng)?shù)南♂寗┌?，尤其是，蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖和其他膠體。所述的具體實(shí)施方式
并不限制于任何特定的稀釋劑。因此，稀釋劑包括白蛋白、其他膠體、或其他非氧載體組分的無細(xì)胞水性溶液。在某些具體實(shí)施方式
中，水性溶液的粘度為至少2.5cP。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，水性溶液的粘度為2.5-4cP。
本文所述的組合物可以在“和手術(shù)相關(guān)”的任何時(shí)間使用，包括手術(shù)前、手術(shù)期間或手術(shù)后。
臨床應(yīng)用
本發(fā)明涉及HBOCs例如PAO修飾的血紅蛋白共軛物，其相對于天然血紅蛋白具有較小的協(xié)同效應(yīng)，被制備成P50小于全血的組合物，在某些具體實(shí)施方式
中，其P50小于全血的一半。這些組合物用于在手術(shù)期間增強(qiáng)血量正?；颊叩难簞恿Ψ€(wěn)定性，它們可以使用與本領(lǐng)域已知的血漿增容藥、溶劑增強(qiáng)劑等相同的給藥參數(shù)進(jìn)行給藥。在手術(shù)前、期間或之后，或者將這幾個(gè)時(shí)期相結(jié)合，監(jiān)測血液動力穩(wěn)定性。因此，血液動力穩(wěn)定性的增強(qiáng)并不限于在手術(shù)操作期間測量患者的血液動力性質(zhì)，可以在給藥后的任何時(shí)間進(jìn)行觀察。
能夠從本發(fā)明方法得到最大獲益的患者人群是“進(jìn)行手術(shù)的血量正?；颊摺薄Ｒ虼耍谝粋€(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明方法涉及對患者使用組合物，所述患者尚未在急性等容性血液稀釋(ANH)處理期間失血。本發(fā)明建立在一個(gè)發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，所述發(fā)現(xiàn)為個(gè)體在手術(shù)操作中結(jié)合上述組合物較可能不會在手術(shù)期間或手術(shù)后需要進(jìn)行輸血。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明方法是ANH的備選方案。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明方法還會對接受手術(shù)的血量正常患者產(chǎn)生在手術(shù)期間使用較少的升壓藥物以提高血壓的間接效應(yīng)，這是因?yàn)樗麄冊谑中g(shù)時(shí)預(yù)防性使用的HBOC能夠在手術(shù)期間有效地穩(wěn)定血壓。
實(shí)施例
美國專利申請2003/0162693公開了和下述三個(gè)實(shí)施例相似的看法，該美國專利申請公開于2003年8月28日。對于所有的實(shí)施例，MalPEG-Hb被用作HBOC的模型。其他HBOCs的生產(chǎn)和有效性在科學(xué)文獻(xiàn)中已知，然而應(yīng)當(dāng)仔細(xì)規(guī)定其在人類患者中進(jìn)行臨床試驗(yàn)的能力，并且不可能使用HBOCs的多種形式進(jìn)行試驗(yàn)。因此，基于本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于MalPEG-Hb的應(yīng)用，具有相似性質(zhì)的HBOCs(例如比天然血紅蛋白的氧親和力高，特別是PAO修飾的血紅蛋白)也適于應(yīng)用。
實(shí)施例1無基質(zhì)血紅蛋白的生產(chǎn)步驟1獲得過時(shí)的紅細(xì)胞
從商業(yè)途徑獲得過時(shí)的袋裝紅細(xì)胞，例如圣地亞哥血庫或美國紅十字會。優(yōu)選，過時(shí)的材料不要超過采集時(shí)間45天。在4±2℃條件下儲藏袋裝紅細(xì)胞(pRBCs)，直至進(jìn)行下一步處理(1-7天)。在使用前隔離所有的物質(zhì)以防止病毒感染，并且進(jìn)行核苷酸測試。
步驟2混合過時(shí)的血液
在干凈的設(shè)備中將袋裝紅細(xì)胞在無菌容器中混合。記錄袋裝紅細(xì)胞體積，使用商業(yè)可獲得的血氧計(jì)或其他本領(lǐng)域已知的方法測定血紅蛋白濃度。
步驟3白細(xì)胞過濾
使用膜過濾裝置進(jìn)行白細(xì)胞過濾(即移除白細(xì)胞)。在開始和結(jié)束時(shí)計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)以監(jiān)控這一操作的效率。
步驟4細(xì)胞分離和細(xì)胞洗滌
使用6體積的0.9％氯化鈉溶液洗滌紅細(xì)胞，該操作在4±2℃條件下完成。用分光光度計(jì)分析細(xì)胞清洗以檢測血漿成分白蛋白的去除情況。
步驟5紅細(xì)胞溶解和細(xì)胞碎片的移除
4±2℃條件下，經(jīng)洗滌的紅細(xì)胞在6體積水的攪拌下溶解至少4小時(shí)或者過夜。低溫下處理溶胞產(chǎn)物以純化血紅蛋白。使用0.16μm的薄膜處理溶胞產(chǎn)物。將純化的血紅蛋白收集到無菌、去熱源容器中。這一過程中的所有步驟都在4±2℃下進(jìn)行。
步驟6除菌
4±2℃條件下，使用超濾法進(jìn)行除菌。
步驟7濃縮和溶劑交換
由溶胞和超濾法純化得到的血紅蛋白利用10ID薄膜交換進(jìn)入林格(氏)乳酸鹽(RL)或磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS，pH7.4)。然后使用相同的薄膜濃縮血紅蛋白達(dá)到最終濃度為1.1-1.5mM(四聚體)。10-12體積的RL或PBS用于溶劑交換。上述操作在4±2℃下進(jìn)行，RL溶液的pH調(diào)節(jié)至7.0-7.6。
步驟8過濾除菌
使用0.45-或0.2-μm的一次性濾膜對PBS或林格(氏)乳酸鹽(RL)中的血紅蛋白過濾除菌，在進(jìn)行化學(xué)修飾反應(yīng)前于4±2℃條件下儲存。
用于純化血紅蛋白的其他方法在本領(lǐng)域都是已知的。另外，通常不需要使用還原劑(例如谷胱甘肽或其他包含巰氫基的還原劑)以在細(xì)胞溶解后預(yù)防自氧化作用。
實(shí)施例2無基質(zhì)血紅蛋白的修飾步驟1硫醇化作用
在4±2℃溫度下，使用多過血紅蛋白10倍摩爾量的亞胺巰烷連續(xù)攪拌4小時(shí)，完成硫醇化反應(yīng)。
反應(yīng)條件●RL(pH7.0-7.5)或PBS(pH7.4)中的1mM血紅蛋白(四聚體)●RL(pH7.0-7.5)或PBS(pH7.4)中的10mM亞胺巰烷
將SFH亞胺巰烷比例定為1∶10并選擇最佳反應(yīng)時(shí)間，以使PEG酯化的巰基基團(tuán)最大化，使異質(zhì)性產(chǎn)物最小化。
步驟2硫醇血紅蛋白的PEG酯化
以多于起始四聚體血紅蛋白濃度20倍摩爾量的Mal PEG(具有烷基或苯基連接物)對硫醇血紅蛋白進(jìn)行PEG酯化反應(yīng)。首先使血紅蛋白與大氣平衡以氧化血紅蛋白，反應(yīng)在4±2℃溫度連續(xù)攪拌2小時(shí)條件下進(jìn)行。
反應(yīng)條件●RL或PBS(pH7.4)中的1m硫醇化血紅蛋白●RL或PBS(pH7.4)中的20mM Mal-PEG步驟3移除未反應(yīng)試劑
使用70-kD薄膜處理PEG酯化的Hb，移除過量的未反應(yīng)試劑或者血紅蛋白。進(jìn)行20體積的過濾以確保移除所有的未反應(yīng)試劑，這一過程采用分子篩析色譜儀在540nm和280nm處進(jìn)行監(jiān)控，蛋白質(zhì)濃度被稀釋至4g/dl。使用1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3±0.3。
步驟4過濾除菌
使用0.2μm無菌一次性被膜對MalPEG-Hb的終產(chǎn)品進(jìn)行無菌過濾，并在4±2℃條件下將其收集至無菌去熱原容器中。
步驟5MalPEG-Hb的制劑 將PEG酯化的Hb稀釋至4g/dl RI，pH調(diào)節(jié)至7.4±0.2
步驟6無菌填充 無菌過濾(0.2μm)最終的血液代用品組合物，將其按重量等分放入無菌玻璃瓶中，用具有波紋的無菌橡皮塞密封，放入層流通風(fēng)櫥中，在-80℃下儲藏直至使用。
實(shí)施例3MalPEG-Hb的物理化學(xué)分析物理化學(xué)分析的方法論 使用液相色譜法(LC)確定MalPEG-Hb血液代用品的同質(zhì)性和分子大小。分析用LC被用于評價(jià)PEG酯化的血紅蛋白的同質(zhì)性，并且確定移除的未反應(yīng)Mal-PEG的范圍。根據(jù)在540nm處的吸光度評價(jià)血紅蛋白，利用峰位將PEG酯化的血紅蛋白從未反應(yīng)血紅蛋白中分辨出來。由于MalPEG中存在的環(huán)狀結(jié)構(gòu)在紫外線(UV)光譜中能夠吸收，因此根據(jù)280nm處的吸光度將PEG酯化的血紅蛋白從游離Mal-PEG中分辨出來。
利用快速掃描光電二極管陣列分光光度計(jì)(Milton Roy 2000或者Hewlett Packard Model 8453)在Soret和可見光區(qū)收集光譜用于血紅蛋白濃度和高鐵血紅蛋白百分比的分析，所述分析采用的是多組分分析法(Vandegriff K.D.，and R.E.，Shrager.Evaluation ofoxygen equilibrium binding to Hemoglobin by rapid-scanningspcetrophotometry and singular value decomposition.Meth.Enzymol.232460-485(1994)。
利用共-血氧計(jì)確定MalPEG-Hb的濃度和高鐵血紅蛋白的百分比，利用流變儀確定粘度，利用膠體滲透壓計(jì)測定膠體滲透壓。根據(jù)氧氣平衡曲線確定氧氣結(jié)合參數(shù)。
表1列舉了血液代用品組合物的示范性規(guī)格
表1

MalPEG-Hb上PEG酯化位點(diǎn)的數(shù)目 對于表面修飾而言，式I中的數(shù)字“m”是定義連接至血紅蛋白表面的PEG聚合物的數(shù)目參數(shù)。
Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m式I 為了確定這一數(shù)字，利用二硫代吡啶比色測定法(AmpulskiR.，V.Ayers，and S.Morell.Determination of the reactivesulfhydryl groups in heme proteins with 4，4′-dipyridinesdisulde.Biocheim.Biophys.Acta 163-169，1969)測定硫醇化作用之前和之后Hb四聚體表面上有效的巰基基團(tuán)數(shù)目，在Hb進(jìn)行PEG酯化之后再測量一遍。人類血紅蛋白在β93Cys殘基處包含2個(gè)內(nèi)在的活性巰基基團(tuán)，利用二硫代吡啶反應(yīng)對其加以確認(rèn)。以SFH亞胺巰烷為1∶10的比例進(jìn)行SFH的硫醇化反應(yīng)以后，在二硫代吡啶反應(yīng)的基礎(chǔ)上活性巰基基團(tuán)的數(shù)目由2增加到6。PEG酯化反應(yīng)以后，活性巰基基團(tuán)的數(shù)目下降為1.3。這表明在MaLPEG-Hb上有4-5個(gè)PEG酯化反應(yīng)位點(diǎn)。
MalPEG-Hb和SFH的Size-excluson色譜分析比較 FPLC用于分析最終的MaLPEG-Hb產(chǎn)品。具有代表性的色譜圖如圖1所示，是MaLPEG-Hb和未修飾性SFH的對比。SFH的滯留時(shí)間為約57mm，MaLPEG-Hb的滯留時(shí)間為約44分鐘。
MalPEG-Hb的物理和化學(xué)性質(zhì) MalPEG-Hb的物理性質(zhì)與血液和未修飾性人類血紅蛋白(SFH)相比較如表2所示表2

1在15g/dl全血和大約4g/dl血紅蛋白溶液中測定2利用COP測量方法和FPLC測定氧親和力 在酶的氧耗量期間測定血紅蛋白-氧平衡結(jié)合曲線(AnalBiochem.256107-116，1998)。MalPEG-Hb顯示出高氧親和力(P50＝5mmHg)和低協(xié)同效應(yīng)(n50＝1.0-1.4)。圖2是無基質(zhì)血紅蛋白(SFH)、MalPEG-Hb和血液相比較的代表性曲線。
粘度 MalPEG-Hb的溶液性質(zhì)是由聚乙二醇鏈和溶劑水分子之間的強(qiáng)相互作用產(chǎn)生的。有兩點(diǎn)原因認(rèn)為這是MalPEG-Hb血液代用品一種重要的屬性1)較高的粘度降低了PEG-Hb分子和氣體配體分子在溶劑中的擴(kuò)散常數(shù)；2)較高的粘度增加了溶液對內(nèi)皮壁的剪切應(yīng)力，誘導(dǎo)血管擴(kuò)張成分釋放以抵抗血管收縮。如表2所示，MalPEG-Hb溶液的粘度是2.5cPs。
膠體滲透壓(COP) 已經(jīng)測量了包含未修飾、分子內(nèi)和分子間交聯(lián)的血紅蛋白或PEG-表面共軛的血紅蛋白的COP，以確定它們的大分子溶液性質(zhì)(Vandegriff，K.D.，R.J.Rohlfs，and R.M.Wislow.膠體osmoticeffects of hemoglobin-based oxygen carriers.In Winslow，R.M.，K.D.Vandegriff and M.Intaglia，eds，Advances in BloodSubstitutes Industrial Opportunities and Medical Challenges.Boston，Birkhauser，pp.207-232(1997)。四聚體血紅蛋白顯示了近乎完美的溶液性質(zhì)，然而和PEG共軛的血紅蛋白具有顯著的高膠體滲透活性，為不甚理想的溶液(Vandegriff，K.D.，M.Mcarthy，R.J.Rohls and R.M.Winslow.Colloid osmotic properties of modifiedhemoglobinschemically cross-linked versus polyethyleneglycol surface conjugated.Biophys.Chem.6923-30(1997)。如表2所示，MalPEG-Hb溶液的COP為50。
穩(wěn)定性 通過測定自氧化作用的比例來考察含有PEG-血紅蛋白的血紅蛋白溶液的穩(wěn)定性。在室溫下，10小時(shí)內(nèi)MalPEG-Hb的自氧化從大約5％MetHb增加到5.5％MetHb。因此MalPEG-Hb的自氧化速率為0.05％每小時(shí)。
實(shí)施例4MalPEG-Hb的穩(wěn)定性 此項(xiàng)研究的目的是為了確定MalPEG-Hb在模擬儲藏和處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性。對三個(gè)處理階段期間的穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)。第一階段是指從生產(chǎn)設(shè)備中的冷凍儲藏狀態(tài)到移送到臨床場所期間的溫度條件的變化(冷凍儲藏研究)；第二階段是將MalPEG-Hb融化24小時(shí)至+4℃，然后在+4℃下儲存5天(冷卻研究)；第三階段是將MalPEG-Hb融化24小時(shí)至+4℃，然后在患者用藥之前將MalPEG-Hb在室溫下儲存幾天(室溫研究)。
試驗(yàn)方法 根據(jù)MalPEG-Hb試驗(yàn)材料氧化的比率可以確定其穩(wěn)定性。利用共-血氧定量法測量樣品中高鐵血紅蛋白的百分比(IL Co-Oximeter 682，GMI，Inc.，Ramsey，Minnesota.)。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行兩次測量。
使用溫度計(jì)或溫度圖標(biāo)記錄器監(jiān)測溫度。冷凍儲藏研究的溫度范圍為-21.0±3.0℃。冷卻研究的溫度范圍為+4.0±0.2℃。室溫研究的溫度范圍為+21.0±1.0℃。
在每一個(gè)指示性時(shí)間點(diǎn)記錄溫度、總血紅蛋白和高鐵血紅蛋白的百分比。在冷凍和冷卻研究中，在0時(shí)(完全融化)、1小時(shí)后、接下來五天內(nèi)的每24小時(shí)對上述參數(shù)進(jìn)行測定。在室溫研究中，在0時(shí)(完全融化)和接下來10小時(shí)內(nèi)的每1小時(shí)進(jìn)行測定。
結(jié)果 -20℃條件下，在6天的儲藏期間MalPEG-Hb在高鐵血紅蛋白百分比方面沒有顯著性變化。類似地，MalPEG-Hb在+4℃的5天儲藏期間也沒有可察覺的高鐵血紅蛋白百分比變化。在室溫下的儲藏期間，MalPEG-Hb在10小時(shí)內(nèi)高鐵血紅蛋白增加不足1％。
實(shí)施例5Mal-PEG用于促進(jìn)血液動力穩(wěn)定的用途 如上文所述制備MalPEG-Hb。在對患者進(jìn)行脊椎麻醉前，將與1000mL林格(氏)乳酸鹽平衡的0(只有林格(氏)乳酸鹽)、200(″A″)、400(″B″)或600mL(″C″)的MalPEG-Hb給予接受選擇的矯形外科手術(shù)的患者。結(jié)果如圖4所示。
圖5描述了接受600mL MalPEG Hb的患者的生命體征。如圖所示，與基線測量結(jié)果相比，沒有觀察到血壓升高。相反，在接受200或400ml MalPEG-Hb的患者中，觀察到可察覺但非常小的血壓升高。
在患者中還監(jiān)測到了血壓過低情況，結(jié)果如表3所示表3
如上所示，證明了接受MalPEG-Hb的患者的低血壓情況少于接受安慰劑的患者。
實(shí)施例6MalPEG-Hb在手術(shù)期間用于增強(qiáng)血液動力穩(wěn)定性的用途的擴(kuò)展性臨床研究 曾經(jīng)在健康志愿受試者中對MalPEG-Hb進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)，結(jié)果是MalPEG-Hb無顯著性危害，并且與非臨床研究相一致，所述非臨床研究表明MalPEG-Hb與無基質(zhì)Hb相比具有降低的血管活性。以低血壓來測量的血液動力不穩(wěn)定性(例如心血管疾病)，特別是在患有心血管疾病的老年患者中，是接受手術(shù)的上述患者很關(guān)心的問題。大量的文獻(xiàn)支持一種假說，該假說認(rèn)為低血壓會產(chǎn)生腦、心臟和腎局部缺血，進(jìn)而導(dǎo)致顯著的術(shù)后發(fā)病率。以Hb為基礎(chǔ)的氧載體(HBOCs)的發(fā)展是本實(shí)驗(yàn)關(guān)注的焦點(diǎn)，所述HBOCs用于保護(hù)上述手術(shù)患者免于這些不良狀況的影響。
在6家不同的醫(yī)院進(jìn)行MalPEG-Hb(250或500mL)隨機(jī)雙盲試驗(yàn)，對照組中只有林格(氏)乳酸鹽，每組為30名患者。參加試驗(yàn)的患者為接受大的侵入性外科手術(shù)，大部分是髖關(guān)節(jié)置換術(shù)。在進(jìn)行脊椎麻醉前對患者給藥，安全評價(jià)包括生命體征和動態(tài)心電圖監(jiān)護(hù)儀(從輸注至24小時(shí))，以及臨床化學(xué)、凝固作用、血液和體葉平衡。低血壓的發(fā)病率是主要的效能檢驗(yàn)點(diǎn)，在數(shù)量上定義為收縮壓小于90mmHg或低于基線值的75％。效能的其他測量值對于穩(wěn)定血壓和體液平衡的藥理介入而言是必需的，詳細(xì)說明見下文。
研究人群 參與本試驗(yàn)研究的患者為正在接受外科手術(shù)的人，所述手術(shù)是對于骨關(guān)節(jié)炎患者的可選擇性初期髖置換術(shù)。然而，對很多急性骨折以及一些二次置換也進(jìn)行了研究。選擇標(biāo)準(zhǔn)和淘汰標(biāo)準(zhǔn)列于表4。
表4

隨機(jī)化和盲法 對于每部分患者的治療都由計(jì)算機(jī)確定，有序數(shù)隨機(jī)化碼表。治療組分為A，250mL MalPEG-Hb；B，500mL MalPEG-Hb；(A和B代表“試驗(yàn)組”)以及C，林格(氏)乳酸鹽(代表“安慰劑組”)，在給藥前所有組的給藥體積都調(diào)至相同。由于MalPEG-Hb是紅色的而安慰劑是透明的，因此要做一些工作以防止患者和“不知情(盲)”工作人員看到輸注的溶液，即研究以“雙盲”狀態(tài)進(jìn)行。
材料 MalPEG-Hb基本上根據(jù)實(shí)施例1-3所述的方法進(jìn)行制備，僅有某些小的變化。在給藥前約24小時(shí)，從冰箱(-20℃)中取出MalPEG-Hb的瓶子，將其放置在室溫下逐漸融化。林格(氏)乳酸鹽可以從商業(yè)途徑購得(Fressenius Kabi AB，Uppsala，Sweden.)。
給藥 通過一種標(biāo)刻度體積的輸液泵對MalPEG-Hb或安慰劑進(jìn)行靜脈注射給藥。為了進(jìn)行雙盲試驗(yàn)，在誘導(dǎo)麻醉前注射總體積為1000mL的MalPEG-Hb和/或林格(氏)乳酸鹽，注射后30分鐘內(nèi)產(chǎn)生麻醉效果。
試驗(yàn)組合物或安慰劑溶液的輸注并不會影響患者的正常護(hù)理。接受試驗(yàn)或安慰劑溶液的患者也可以接受任何對于患者健康必須的其他治療。所有的醫(yī)學(xué)操作和處理都根據(jù)臨床標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。在研究起始對所有連續(xù)性藥物的給藥以及研究過程中使用的藥物都記錄下來，用于解釋結(jié)論。
藥物代謝動力學(xué)測量結(jié)果和變量 在輸注前、輸注結(jié)束時(shí)、輸注后6小時(shí)、輸注后1、2和3和7-10天根據(jù)血漿血紅蛋白和高鐵血紅蛋白水平確定MalPEG-Hb的血管內(nèi)保留和血管內(nèi)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。這些研究的結(jié)果未脫離普通教導(dǎo)，在本文中也不予以報(bào)道。
樣品收集和分析 采用常規(guī)方法采集血液樣品以使抽樣期間溶血最小化，對于血液樣品的處理要確保血液樣品和血漿完全分離。由于血液樣品中包含MalPEG-Hb的血漿部分是紅色的，因此對于樣品處理需要在“非盲”技術(shù)操作。樣品分析要在“代碼破壞”前進(jìn)行。因此，進(jìn)行分析的實(shí)驗(yàn)室可適當(dāng)?shù)倪M(jìn)行“盲”分析。
效能測量和變量 利用下述終點(diǎn)對用于增強(qiáng)血液動力穩(wěn)定性的MalPEG-Hb的效果進(jìn)行研究，所述MalPEG-Hb可作為HBOC的代表性例子A.低血壓 注射MalPEG-Hb/安慰劑后產(chǎn)生的低血壓定義為收縮壓(SBP)＜90mmHg，或者與注射前相比SBP下降≥25％。將符合上述定義的每一次SBP都記錄下來，認(rèn)為產(chǎn)生了低血壓。
B.全部液體入量和出量(體液平衡) 在手術(shù)當(dāng)天(從開始注射到開始注射后24小時(shí))和手術(shù)后第1、2和3天進(jìn)行測量，入量包括注射液體(MalPEG-Hb/安慰劑，膠體和類晶體)、輸血和口服液體。出量包括手術(shù)期間的小便和估計(jì)失血量。
記錄靜脈內(nèi)液的種類和數(shù)量(數(shù)據(jù)未給出)。在整個(gè)入院期間，類晶體和膠體輸注的總量在三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。然而，手術(shù)期間確實(shí)具有了區(qū)別。與B(1299±183mL)、C(1281±144mL)組相比，A組接受的類晶體(913±106mL)量明顯很少(P＜0.05)。另外，當(dāng)MalPEG-Hb被包括在使用的膠體數(shù)量中時(shí)，B組(1389±169mL)與A(850±66mL)、C(666±69mL)組相比接受了顯著多量的總膠體。B和C以及A和B的區(qū)別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。研究的余下部分使用的類晶體、膠體或總靜脈注射液體無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
C.心臟紊亂 作為血液動力不穩(wěn)定性測量結(jié)果的心臟紊亂的數(shù)量和種類(心動過速、局部缺血、心動過緩和傳導(dǎo)障礙)由不知情的心臟病學(xué)家進(jìn)行評價(jià)。使用連續(xù)性動態(tài)心電圖監(jiān)護(hù)儀和ECG記錄心律失常。
D.藥物介入 從開始麻醉到輸注開始后12個(gè)小時(shí)，也對支持心血管的藥物(例如血壓藥物，利尿劑)介入數(shù)量和劑量進(jìn)行記錄。
E.輸血 同樣對手術(shù)期間(從開始麻醉到手術(shù)結(jié)束或以后)的輸血(紅細(xì)胞壓積)進(jìn)行記錄。
F.氧氣利用 手術(shù)當(dāng)天和其后幾天的輸后附注供氧也進(jìn)行記錄。
結(jié)論 表現(xiàn)為不良狀況的血壓過低不穩(wěn)定性例如低血壓，以及給予加壓的必要性如表5所示。從壓力過低的百分比中得到的結(jié)論也在圖6中進(jìn)行了描述。
表5
上述實(shí)施例用于對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員做到充分公開，并教導(dǎo)了如何制備和使用組合物的優(yōu)選實(shí)施方案，但并不限于本發(fā)明實(shí)施例的范圍。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言任何顯而易見的對于上述例子的改變(用于實(shí)施本發(fā)明)都在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請都作為本文的一部分用于參考，就象是每篇出版物、專利或?qū)＠暾埗际翘貏e地且單獨(dú)地為本文的一部分以用作參考。
權(quán)利要求
1.一種用于增強(qiáng)接受手術(shù)的血量正常的個(gè)體血液動力穩(wěn)定性的方法，包括a)與手術(shù)結(jié)合對個(gè)體使用包含以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體(HBOC)的組合物，所述氧載體比全血具有更高的氧親和力；和b)監(jiān)控個(gè)體的血液動力穩(wěn)定性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中組合物在手術(shù)前使用。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中組合物在手術(shù)期間使用。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中組合物在手術(shù)后使用。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)在手術(shù)前進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)在手術(shù)期間進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)在手術(shù)后進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中HBOC還包括聚烯烴氧化物修飾的天然血紅蛋白。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中HBOC還包括聚烯烴氧化物修飾的合成血紅蛋白。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中HBOC還包括重組體血紅蛋白。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中HBOC還包括人類血紅蛋白。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中HBOC還包括從非人類動物中獲得的人類血紅蛋白。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中HBOC的氧親和力是全血的兩倍多。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中HBOC具有4-15的P50。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中HBOC還包括通過以共價(jià)鍵與malemidyl活化的聚乙二醇相連接而修飾的血紅蛋白。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)還包括監(jiān)測個(gè)體的血壓。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中血液動力穩(wěn)定為患者保持收縮壓大于90mmHg。
18.以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體(HBOC)在生產(chǎn)用于增強(qiáng)接受手術(shù)的血量正常個(gè)體血液動力穩(wěn)定性的藥物中的用途，其中HBOC的氧親和力高于全血。
19.如權(quán)利要求18所述的用途，還包括氧卸載的增強(qiáng)，以作為避免與手術(shù)相關(guān)的血液動力不穩(wěn)定的預(yù)防措施。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)手術(shù)患者血液動力穩(wěn)定性的方法，該方法為向患者施用一種包括以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體的組合物。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及使用聚烯烴氧化物修飾的血紅蛋白用于減少協(xié)同效應(yīng)和高度的氧親和力以增加氧氣的卸載量，以此作為避免手術(shù)期間引起血液動力穩(wěn)定性相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防措施。
文檔編號A61K38/00GK101039684SQ200580034546
公開日2007年9月19日 申請日期2005年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月31日
發(fā)明者R·M·溫斯洛, K·D·范德格里夫 申請人:桑格特公司