專利名稱：一種呈現(xiàn)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中的呈現(xiàn)載體及其應(yīng)用，特別是由人源腸毒素性大腸桿菌菌毛蛋白的優(yōu)勢血清型抗原蛋白CS3改造成的呈現(xiàn)載體及其應(yīng)用。
菌毛是細(xì)菌表面的一種附屬結(jié)構(gòu)，呈毛發(fā)狀，每個細(xì)菌表面有很多根菌毛，每根菌毛由500-1000個拷貝的菌毛蛋白組成。研究發(fā)現(xiàn)，菌毛蛋白種類繁多，而且許多種類的菌毛蛋白可作為外源表位的表面呈現(xiàn)載體。CS3是人源腸毒素性大腸桿菌(ETEC)菌毛蛋白的優(yōu)勢血清型抗原蛋白，它由一個60Md的大質(zhì)粒編碼，完整的CS3操縱子存在于一個4.7kb的Hind III酶切片段上，包括一個CS3結(jié)構(gòu)基因和至少三個輔助蛋白基因。CS3結(jié)構(gòu)基因編碼168個氨基酸殘基，其氨基端為信號肽。CS3具有較強(qiáng)的免疫原性，是一種保護(hù)性抗原，含有CS3的死菌疫苗已用于臨床，具有免疫保護(hù)作用。因此，CS3是一種有應(yīng)用前景的呈現(xiàn)載體，而國內(nèi)外對此研究卻很少。
本發(fā)明的目的是提供一種由CS3改造的表達(dá)效率較高的呈現(xiàn)載體。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計方案一種呈現(xiàn)載體，它是將人源腸毒素性大腸桿菌菌毛蛋白CS3編碼基因突變成或插入至少一個酶切位點(diǎn)。
本發(fā)明以在CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第49、50，第72、73，第101、102位氨基酸殘基一組、或兩組、或三組對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)為優(yōu)選。
本發(fā)明的呈現(xiàn)載體在基因工程中的應(yīng)用，特別是它在構(gòu)建活菌疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護(hù)目的。
本發(fā)明的呈現(xiàn)載體-～突變后的CS3，其表達(dá)效率與野生型CS3相比基本沒有差別，表明在所選定位置進(jìn)行的突變對CS3本身的表達(dá)及抗原性影響甚微，仍能形成菌毛；與在野生CS3的82-83位氨基酸殘基間進(jìn)行的插入突變及在第136-137位氨基酸殘基間進(jìn)行的插入突變相比，表達(dá)效率要高2～3倍。在72、73位點(diǎn)突變了的CS3呈現(xiàn)載體酶切位點(diǎn)處插入外源表位如口蹄疫病毒VP1的9肽、脊髓灰質(zhì)炎病毒的C3表位(11肽)、C-myc的10肽表位等后，雜合蛋白仍能得到表達(dá)并形成菌毛，表達(dá)效率為原來的一半左右，外源表位在細(xì)菌表面也能得到呈現(xiàn)。插入15肽的CTP3表位和19肽的ST全基因后，依然能檢測到CS3的表達(dá)。由此可以證明，本發(fā)明的呈現(xiàn)載體--突變的CS3可以用于外源表位的表面呈現(xiàn)，而且具有較高的效率，在基因工程領(lǐng)域?qū)⒌玫綇V泛的應(yīng)用，特別是為構(gòu)建基因工程活菌疫苗及肽庫的建立奠定了基礎(chǔ)。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1為本發(fā)明pCSX72的序列測定結(jié)果圖2為本發(fā)明DH5α(pCSX72F)的電鏡照片圖3為本發(fā)明DH5α(pCSX72F)的免疫熒光檢測圖4為本發(fā)明DH5α(pCSX72F)的免疫電鏡照片圖5為本發(fā)明DH5α(pCSX72P)的電鏡照片實施例1野生的CS3(含信號肽在內(nèi))第72、73位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變所形成的呈現(xiàn)載體一、呈現(xiàn)載體的獲得1、通過對168個氨基酸殘基的野生CS3(包括信號肽在內(nèi))的親水性、抗原表位、二級結(jié)構(gòu)、柔韌性等性質(zhì)進(jìn)行計算機(jī)的預(yù)測分析，確定突變位點(diǎn)為第72-73位氨基酸殘基處。
2、化學(xué)合成一對突變引物正鏈引物為5＇-CTTTCAAATTCTAGAATTGATACAGTTAGC-3＇反鏈引物為5＇-TGTATCAATTCTAGAATTTGAAAGAGTCAAAC-3＇3、為方便操作，合成一對兩端引物，上游引物為5＇-GTTGTCGACTACATAGTAGG-3＇，從CS3中的HincII位點(diǎn)處開始；下游引物為5＇-GGGGTACCAAGCTTGACTATTTAATG-3＇，在CS3末端HincIII酶切位點(diǎn)后加了一個KpnI酶切位點(diǎn)。
4、采用重疊延伸PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，首先以上游引物和反鏈引物配對以及以下游引物和正鏈引物配對分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序為94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，進(jìn)行30個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保溫。
5、將兩段擴(kuò)增產(chǎn)物分別回收，取等分子數(shù)混合，95℃變性5min，50℃退火3min，72℃延伸3min，再以上、下游引物配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物即含有突變位點(diǎn)，完成CS3基因的定點(diǎn)突變。
6、用Hinc II和Kpn I雙酶消化后，替代原野生CS3中包括ACCAGT在內(nèi)的相應(yīng)片段，即構(gòu)建成表面呈現(xiàn)載體pCSX72，該呈現(xiàn)載體的第72、73位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列為TCTAGA，是XbaI酶切位點(diǎn)。
二、本發(fā)明上述呈現(xiàn)載體的驗證1、序列測定采用Qingen公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pCSX72，用自動測序儀測定其核苷酸序列，從CS3的反端測入，結(jié)果如
圖1所示，說明突變位點(diǎn)正確。
2、酶切鑒定用Xba I酶切pCSX72成7.4kb線狀DNA片段；用Hinc II加Xba I雙酶消化pCSX72，電泳可見1.1kb和7.3kb兩條帶。結(jié)果表明突變正確引入了Xba I酶切位點(diǎn)。
3、本發(fā)明呈現(xiàn)載體--CS3突變體表達(dá)水平的檢測采用全菌ELISA方法進(jìn)行測定。挑取DH5a(pCSX72)單菌落接種5ml LB Amp+，37℃振蕩培養(yǎng)過液。取適量接種CFA瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18-20h，收獲細(xì)菌，用0.2mol/L PBS pH7.4洗兩遍，重懸。用0.05mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至OD 600＝1，以100μl/孔包被酶聯(lián)板，4℃過液；PBS洗一遍，3％BSA37℃封閉1h；適度稀釋的抗CS3單抗，37℃ 1h；含0.05％Tween-20的PBS洗三遍，適度稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃ 1h；如上洗三遍；OPD顯色，2mol/L的H2SO4終止后，測定OD490。以空載體pUC19作為陰性對照，同時測定pUCS3及pMGD293的表達(dá)，結(jié)果見下表DH5α(pCSX72) DH5α(pUCS3)DH5α(pMGD293)DH5α(pUC19)OD490 2.232.31 0.98 0.16結(jié)果顯示DH5α(pCSX72)的表達(dá)水平與野生的CS3基本沒有差別，比CS3的82-83位氨基酸殘基基因突變體高2-3倍。
三、外源表位的插入及表面呈現(xiàn)1、FMDV VP1部分片段的表面呈現(xiàn)化學(xué)合成FMDV VP1的9肽基因片段及其互補(bǔ)鏈，基因片段為5＇-CTAGATATAAACAGAAAATCATCGCTCCGGCTT-3＇，其互補(bǔ)鏈為5＇-CTAGAAGCCGGAGCGATGATTTTCTGTTTATAT-3＇，退火后插入到pCSX72的Xba I位點(diǎn)間，以上游引物和互補(bǔ)鏈為引物，菌落PCR方法篩選正向插入的重組子DH5α(pCSX72F)。如上所述的全菌ELISA法測定雜和CS3的表達(dá)水平和FMDV VP1的表達(dá)水平，檢測VP1時以抗FMDV單抗取代抗CS3單抗即可。結(jié)果CS3仍然得到了表達(dá)，表達(dá)水平為空載體對照的一半左右；VP1也獲得了表達(dá)，全菌ELISA呈陽性，說明FMDV VP1在細(xì)菌表面得到了呈現(xiàn)。如圖2所示，對重組菌株的電鏡觀察顯示，雜和CS3仍能形成菌毛1，說明重組蛋白仍能裝配成菌毛。采用免疫熒光檢測法檢測雜和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)用抗CS3單抗和抗FMDV單抗(如圖3所示)都能使菌體著染，說明FMDV VP1在細(xì)菌表面得到了呈現(xiàn)。如圖4所示，用抗FMDV單抗對重組菌進(jìn)行免疫電鏡檢測，發(fā)現(xiàn)FMDV VP1在細(xì)菌表面得到了呈現(xiàn)。
2、脊髓灰質(zhì)炎病毒C3表位的表面呈現(xiàn)化學(xué)合成脊髓灰質(zhì)炎病毒C3表位的基因序列及其互補(bǔ)序列，基因序列為5＇-CTAGAGATAACCCGGCGTCGACCACCAACAAAGATAAAT-3＇，其互補(bǔ)鏈為5＇-CTAGATTTATCTTTGTTGGTGGTCGACGCCGGGTTATCT-3＇，退火后插入到pCSX72的Xba I位點(diǎn)間，同上采用菌落PCR方法篩選正向插入的重組子DH5α(pCSX72P)，并檢測雜和蛋白CS3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示CS3的表達(dá)量為插入前的一半左右。如圖5所示，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，重組菌也能形成菌毛2，說明重組蛋白仍能裝配成菌毛，脊髓灰質(zhì)炎病毒C3表位得到呈現(xiàn)。
3、霍亂毒素B亞單位CTP3表位、C-myc十肽表位以及ST全基因在細(xì)菌表面的呈現(xiàn)同上化學(xué)合成霍亂毒素B亞單位CTP3表位、C-myc十肽表位以及ST全基因的核苷酸序列及其互補(bǔ)序列，退火后插入到pCSX72的Xba I位點(diǎn)間，經(jīng)菌落PCR方法篩選到正向插入的重組子后，全菌ELISA法檢測雜和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果CS3仍然得到了表達(dá)。
四、動物免疫實驗以插入FMDV VP1的重組菌DH5α(pCSX72F)為例，同上制備細(xì)菌，以108個細(xì)菌/只腹腔注射免疫Balb/c小鼠，一周后加強(qiáng)免疫一次，間一周后第二次加強(qiáng)免疫。兩周后取血，ELISA法檢測抗體產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示，機(jī)體產(chǎn)生了針對CS3和FMDV VP1的抗體，說明該重組菌可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對CS3和外源表位的雙重免疫應(yīng)答反應(yīng)。
在上述實施例中，可以用相同的方法將72-73位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變?yōu)锽am HI酶切位點(diǎn)GGATCC；SacI酶切位點(diǎn)GAGCTC或SmaI酶切位點(diǎn)CCCGGG等。同時，上述酶切位點(diǎn)還可以插入到72-73位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列中。
在上述實施例中，可以用相同的方法將第71-74位氨基酸殘基中兩個相鄰的氨基酸殘基，如71、72；73、74對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)。突變或插入的酶切位點(diǎn)除了可以是上述列舉的酶切位點(diǎn)外，還可以是其它酶的切點(diǎn)。
實施例2野生的CS3第48-51位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變所形成的呈現(xiàn)載體應(yīng)用實施例1的重疊延伸PCR方法，在設(shè)計的突變引物中加入目的序列，即可以將野生CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第48-51位氨基酸殘基中兩個相鄰的氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)，如將第49、50位的CAGGAT，突變成Sac I酶切位點(diǎn)GAGCTC。
實施例3野生的CS3第100-103位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變所形成的呈現(xiàn)載體應(yīng)用實施例1的重疊延伸PCR方法，在設(shè)計的突變引物中加入目的序列，即可以將野生CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第100-103位氨基酸殘基中兩個相鄰的氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)，如將第101、102位的AACTCT，突變成XbaI酶切位點(diǎn)TCTAGA。
應(yīng)用上述方法，還可以將野生CS3編碼基因其它位點(diǎn)的核苷酸序列突變或插入一個酶切位點(diǎn)，如第27-30位，57-60位，112-114位，146-148位及155-158位。
實施例4野生的CS3編碼基因中突變或插入兩個酶切位點(diǎn)呈現(xiàn)載體是將CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第49、50，第72、73，第101、102位氨基酸殘基中的任意兩組對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)。
在該實施例中，突變或插入酶切位點(diǎn)也可以是其它位置。
實施例5野生的CS3編碼基因中突變或插入三個酶切位點(diǎn)呈現(xiàn)載體是將CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第49、50，第72、73，第101、102位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)。
在該實施例中，突變或插入酶切位點(diǎn)也可以是其它位置。
權(quán)利要求
1.一種呈現(xiàn)載體，其特征在于它是將人源腸毒素性大腸桿菌菌毛蛋白CS3編碼基因突變成或插入至少一個酶切位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呈現(xiàn)載體，其特征在于該呈現(xiàn)載體是將CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第71-74位氨基酸殘基中兩個相鄰的氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的呈現(xiàn)載體，其特征在于該呈現(xiàn)載體是將CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第72、73位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呈現(xiàn)載體，其特征在于該呈現(xiàn)載體是將CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第48-51位氨基酸殘基中兩個相鄰的氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呈現(xiàn)載體，其特征在于該呈現(xiàn)載體是將CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第49、50位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呈現(xiàn)載體，其特征在于該呈現(xiàn)載體是將CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第100-103位氨基酸殘基中兩個相鄰的氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的呈現(xiàn)載體，其特征在于該呈現(xiàn)載體是將CS3編碼基因包括信號肽在內(nèi)的第101、102位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入一個酶切位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呈現(xiàn)載體，其特征在于該呈現(xiàn)載體是將CS3編碼基因突變成或插入兩個或三個酶切位點(diǎn)。
9.權(quán)利要求1的呈現(xiàn)載體在基因工程中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的權(quán)利要求1的呈現(xiàn)載體在基因工程中的應(yīng)用，它在構(gòu)建活菌疫苗及肽庫的建立中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種呈現(xiàn)載體,它是將人源腸毒素性大腸桿菌菌毛蛋白CS3編碼基因突變成或插入至少一個酶切位點(diǎn),其中優(yōu)選的是將野生CS3編碼基因在包括信號肽在內(nèi)的第72、73位、第49、50位、101、102位氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸序列突變成或插入酶切位點(diǎn),本發(fā)明的呈現(xiàn)載體——突變的CS3可以用于外源表位的表面呈現(xiàn),而且具有較高的效率,為構(gòu)建基因工程活菌疫苗奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/70GK1263948SQ0010287
公開日2000年8月23日 申請日期2000年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月6日
發(fā)明者高榮凱, 張兆山, 李淑琴, 董自正 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所