專利名稱：多核苷酸的遞送的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及向細(xì)胞遞送多核苷酸的方法和制劑。具體來說，本發(fā)明涉及增強(qiáng)多核苷酸跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)的方法和制劑。
相關(guān)技術(shù)的描述多核苷酸的遞送生物技術(shù)領(lǐng)域的各項發(fā)展使得在治療那些從前很難治愈的各種疾病(比如癌癥和炎性疾病)方面有了長足的進(jìn)步。這些技術(shù)發(fā)展中有許多涉及到將多核苷酸，包括寡核苷酸給予受試者，尤其是人受試者。親本給予這類分子已被證實能有效地治療多種疾病和紊亂。參見例如Draper等，于1997年1月21日授權(quán)的美國專利5,595,978，該項專利公開了以玻璃體內(nèi)注射的方式將反義寡核苷酸直接遞送到哺乳動物眼睛的玻璃體液。還可參見Robertson，Nature Biotechnology，1997，15209和Genetic Engineering News，1997，151，這兩篇文章討論了通過玻璃體內(nèi)滴注反義寡核苷酸來治療克羅恩病(Crohn′s disease)。非親本途徑(比如經(jīng)皮、口服或直腸遞送或者其他粘膜的途徑)能夠允許我們更簡單、容易和安全地給予寡核苷酸。例如寡核苷酸的經(jīng)皮藥物遞送是替代注射的一種很有吸引力的無痛方法，但是由于皮膚的通透經(jīng)低，市場上只有少數(shù)經(jīng)皮產(chǎn)品供應(yīng)。為了提高藥物的經(jīng)皮流量，人們對各種化學(xué)滲透增強(qiáng)劑進(jìn)行了研究(見，例如Williams et al.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.9304-53(1992)；Finnin et al.，J.Pharm.Sci.88955-958(1999)；Karande et al.，Nature Biotech.22192-197(2004))。但是，對透皮遞送寡核苷酸來說，仍然存在的問題是這樣一個事實，即所用制劑在其濃度足以有效地增強(qiáng)滲透時，往往會引起皮膚的不適(見例如Lashmar etal.，J.Pharm.Pharmacol.41118-122(1989)。因此，人們需要這樣的局部制劑，這些制劑能夠有效提高寡核苷酸遞送的皮膚通透性，而不會引起皮膚的不適。
相應(yīng)地，還需要提供一些在以非親本途徑給予新的多核苷酸藥物時，能夠提高這些藥物的可利用率的制劑和方法。人們期望能開發(fā)出新的制劑和方法，以便簡單、方便、可行并且效果最佳地進(jìn)行多核苷酸，例如寡核苷酸的非親本遞送。
轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞能夠通過改變特定基因的表達(dá)水平對正?；虿±泶碳ぷ龀龇磻?yīng)。因此，許多疾病可能與一或多個基因的異常表達(dá)(過表達(dá)或表達(dá)不足)聯(lián)系在一起。通常，這些基因的表達(dá)是由多種轉(zhuǎn)錄因子控制的。
轉(zhuǎn)錄因子代表細(xì)胞內(nèi)一組其功能是將從胞外信號到胞內(nèi)應(yīng)答之間的途徑聯(lián)系起來的分子。受到環(huán)境刺激之后，這些主要位于胞質(zhì)溶膠的蛋白質(zhì)立即被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，在核內(nèi)它們與靶基因之啟動子元件的特異DNA序列結(jié)合，并激活這些靶基因的轉(zhuǎn)錄。
a.NF-κB轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是一個可誘導(dǎo)性的二聚體轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族包含識別一個相同序列基元的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)中的Rel家族的成員。在其活性DNA結(jié)合形態(tài)中，NF-κB是異源的二聚體集合，包含NF-κB/Rel家族成員間的各種組合。目前，該家族由5個成員構(gòu)成，命名為p52、p50、p65、cRel和Rel B。Rel家族成員間的同源性體現(xiàn)在Rel同源性結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域有約300個氨基酸，構(gòu)成了這些蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
不同NF-κB二聚體對NF-κB位點顯示出不同的結(jié)合親和性，該位點帶有共有序列GGGRNNYYCC(SEQ ID NO1)，其中R是嘌呤，Y是嘧啶，N是任意堿基。Rel蛋白質(zhì)激活轉(zhuǎn)錄的能力不同，比如在哺乳動物家族成員中只有p65/RelA和c-Rel被發(fā)現(xiàn)含有強(qiáng)力的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的NF-κB是其非活性形態(tài)，它與43kDa的蛋白質(zhì)IκB結(jié)合在一起，后者覆蓋了p65/p50二聚體的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位信號區(qū)。NF-κB的活化由IκB被蛋白水解降解開始，然后RelA/p50復(fù)合體被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，在核中它結(jié)合到DNA上的識別位點，并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。關(guān)于NFκB家族的進(jìn)一步綜述，參見例如Gomez et al.，F(xiàn)rontiers in Bioscience 249-60(1997)。
p52和p50不含有反式激活結(jié)構(gòu)域。僅含有p52和/或p50蛋白質(zhì)的二聚體缺少轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，通常不是轉(zhuǎn)錄激活子，并且能介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制。
Rel/NF-κB家族的轉(zhuǎn)錄因子是免疫和炎性反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對淋巴細(xì)胞增殖、存活以及腫瘤發(fā)生有作用。因此，NF-κB對參與發(fā)炎、細(xì)胞增殖和免疫應(yīng)答的多個基因的表達(dá)起著關(guān)鍵作用(D′Acquisto et al.，GeneTherapy 71731-1737(2000)；Griesenbach et al.，Gene Therapy 7，306-313(2000)；Morishita et al.，Gene Therapy 71847-1852(2000))。NF-κB所調(diào)節(jié)的基因中有許多在各種疾病和病癥中發(fā)揮重要的作用，比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、再狹窄(restenosis)、心肌梗塞、缺血再灌注損傷(ischemiareperfusion injury)、腎小球性腎炎、異位性皮炎(atopic dermatitis)、大隱靜脈移植物(saphenous vein graft)、阿爾茨海默氏病等等。參見例如，Khaled et al.，Clinical Immunology and Immunopathology 86(2)170-179(1998)；Morishita etal.，Nature Medicine 3(8)894-899(1997)；Cho-Chung et al.，Current Opinion inMolecular Therapeutics 1(3)386-392(1999)；Nakamura et al.，Gene Therapy 91221-1229(2002)；Shintani et al.，Ann.Thorac.Surg.741132-1138(2002)；以及Li et al.，J.Neurochem.74(1)143-150(2000)。
已有人提議用NF-κB誘騙物來抑制血管成形術(shù)后的新生內(nèi)膜增生(neointimal hyperplasia)、再狹窄和心肌梗塞(Yoshimura et al.，Gene Therapy 81635-1642(2001)；Morishita et al.，Nature Medicine 3(8)894-899(1997))。更強(qiáng)地抑制再灌注損傷、移植后的急性和慢性排斥導(dǎo)致異源移植存活時間延長以及移植物冠狀動脈疾病下降(Feeley et al.，Transplantation 70(11)1560-1568(2000))。體內(nèi)轉(zhuǎn)染NFκB誘騙物提供了一種治療急性心肌炎的新策略(Yokoseki et al.，同前)。Ueno et al.(同前)報導(dǎo)了用NFκB誘導(dǎo)物阻斷NFκB能夠預(yù)防心臟的缺血再灌注損傷。
Ziegler-Heitbrock et al.(J.Leukoc.Biol.55(1073-80(1994)、Kastenbauer和Ziegler-Heitbrock(Infect.Immunol.67(4)1553-9(1999)已經(jīng)證實將人單核細(xì)胞系Mono Mac6用低劑量的脂多糖(LPS)預(yù)先處理兩天時，其對隨后的LPS刺激的應(yīng)答急劇下降。在用LPS刺激這些LPS-耐受性細(xì)胞時，凝膠阻滯實驗顯示這些細(xì)胞主要形成p50同型二聚體。然后這些作者借助報告基因分析法檢測了被改變的NF-B復(fù)合體對基因表達(dá)的影響。將NF-B-依賴性HIV-1 LTR報告基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到Mono Mac6細(xì)胞中，然后在有和沒有LPS的情況下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，測量螢光素酶活性。當(dāng)檢測LPS耐受性細(xì)胞時，LPS刺激沒有提高NF-B-依賴性HIV-1 LTR報告基因的反式激活。這表明LPS耐受性細(xì)胞中的NF-B復(fù)合體不具備功能活性。這也適用于NF-B控制的TNF基因的轉(zhuǎn)錄。利用TNF啟動子控制的螢光素酶報告構(gòu)建體，LPS耐受性細(xì)胞對LPS刺激僅顯示出最低水平的應(yīng)答。因此，結(jié)論是LPS耐受性所誘導(dǎo)產(chǎn)生的p50同型二聚體缺乏反式激活活性。相反這些p50同型二聚體占據(jù)了相關(guān)的NF-B結(jié)合位點并阻止p50/p65復(fù)合體的反式激活作用，因此也就阻止了它引發(fā)的轉(zhuǎn)錄。
b.E2F轉(zhuǎn)錄因子另一個轉(zhuǎn)錄因子家族，E2F轉(zhuǎn)錄因子家族在控制細(xì)胞周期的進(jìn)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并能調(diào)節(jié)大量基因的表達(dá)，這些基因包括參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，編碼c-Myc、c-Myb、Cdc2、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、細(xì)胞周期蛋白A、二氫葉酸還原酶、胸苷激酶和DNA聚合酶α的基因。
目前E2F被認(rèn)為是一個包含由不同基因編碼的6個異源二聚體復(fù)合體的家族，可分成不同的兩組E2F蛋白質(zhì)(E2F-1-E2F-6)和DP蛋白質(zhì)(DP-1和DP-2)。E2F蛋白質(zhì)本身又可以從功能上分為兩組，即在休眠細(xì)胞中過表達(dá)時能夠誘導(dǎo)S期進(jìn)展的那些蛋白質(zhì)(E2Fs 1-3)，和沒有誘導(dǎo)功能的蛋白質(zhì)(E2Fs 4-5)。E2F-6在功能上與之不同，因為有報導(dǎo)說過表達(dá)E2F-6能抑制和它一起表達(dá)的E2F-1和DP-1的反式激活作用。此外，有報導(dǎo)說E2F-6的表達(dá)延遲了脫離S期，而非誘導(dǎo)S期的發(fā)生。E2F和DP組中的蛋白質(zhì)通過異源二聚體化產(chǎn)生E2F活性。體內(nèi)存在E2F-DP復(fù)合體的所有可能組合形態(tài)。根據(jù)D2F基元的情況，以及該復(fù)合體相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，各個E2F-DP復(fù)合體會引發(fā)不同的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。另外E2F分子的同源二聚體也已有描述。(見例如，Zheng et al.，Genes & Devel 13666-674(1999))根據(jù)是否與口袋蛋白成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(Rb)家族相關(guān)，E2F蛋白質(zhì)可以成為轉(zhuǎn)錄的阻抑蛋白或激活蛋白(Hiebert et al.，Genes & Devel 6177-185(1992)；Weintraub et al.，Nature 358259-261(2002))。
E2F轉(zhuǎn)錄因子負(fù)責(zé)激活血管細(xì)胞生長和增殖過程中必須啟動的十幾個或更多的基因。阻斷它能夠防止這些異常細(xì)胞的增殖(新生內(nèi)膜增生)，而這種增殖最終會造成動脈粥樣硬化。因為其生物學(xué)功能，E2F轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被認(rèn)為可能參與新生內(nèi)膜增生、腫瘤相關(guān)性腎小球腎炎、血管再生和炎癥。已有報導(dǎo)描述了多個E2F家族成員在癌癥中有一些作用，并且認(rèn)為它們是抗癌劑的作用目標(biāo)。關(guān)于E2F家族成員的綜述、其調(diào)節(jié)和途徑參見例如Harbour，J.W.and Dean，D.C.，Genes Dev 14，2393-2409(2000)；.Mundle，S.D.and Saberwal，G.，F(xiàn)aseb J 17，569-574(2003)；以及Trimarchi，J.M.and Lees，J.A.Nat Rev Mol Cell Biol 3，11-20(2002)。
許多細(xì)胞基因的啟動子區(qū)都鑒定到了E2F結(jié)合位點，在例如以下出版物中有報導(dǎo)Farnham et al.，Biochim.Biophys.Acra 1155125-131(1993)；Nevins，J.R.，Science 258424-429(1992)；Shan et al.，Mol.Cell.Biol.14299-309(1994)；Thalmeier et al.，Genes Dev.3517-536(1989)；Delton et al.，EMBO J.111797-1804(1992)；Yamaguchi et al.，Jpn.J.Cancer Res.83609-617(1992)。
1995年5月4日公開的PCT公開號WO 95/11687中描述了針對E2F轉(zhuǎn)錄因子的寡核苷酸誘騙物，該文件的全部內(nèi)容此處確切引做參考文獻(xiàn)。
臨床上正在開發(fā)E2F寡核苷酸誘騙物以用于改變靜脈移植物的自然發(fā)展史(natural history)，因其沒有那些需要體內(nèi)引入寡核苷酸的方法的潛在危害，預(yù)期對于解決所有手術(shù)轉(zhuǎn)流和各種臨床情況中需要修復(fù)動脈時都會遇到的問題有極高的臨床價值。美國食品與藥品監(jiān)督局已經(jīng)給一個E2F誘騙物分子(Corgentech，Inc.，South San Francisco，CA)授予了快速審批資格，設(shè)計該分子是用于防止冠狀動脈和外周動脈旁路移植過程中靜脈移植物發(fā)生堵塞和失效。
涉及到E2F誘騙物療法的其他代表性參考文獻(xiàn)包括Morishita，R.，G.H.Gibbons，M.Horiuchi，K.E.Ellison，M.Nakama，L.Zhang，Y.Kaneda，T.Ogihara and V.J.Dzau.(1995).A gene therapy strategy using a transcriptionfactor decoy of the E2F binding site inhibits smooth muscle proliferation in vivo.Proceedings of the National Academy of Sciences USA，92，5855-5859；Dzau，V.J.，M.J.Mann，R.Morishita and Y.Kaneda.(1996)Fusigenic viral liposomefor gene therapy in cardiovascular diseases.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA，93，11421-11425；von der Leyen，H.E.，M.J.Man andV.J.Dzau.(1996)Gene inhibition and gene augmentation for the treatment ofvascular proliferative disorders.Semin Interv Cardiology，1，209-214；Kaneda，Y.，R.Morishita and V.J.Dzau.(1997).Prevention of restenosis by gene therapy.Annals of the NY Academy of Sciences，811，299-308，discussion 308-210；Mann，M.J.and V.J.Dzau.(1997).Genetic manipulation of vein grafts.CurrentOpinion in Cardiology，12，522-527；Mann，M.J.，G.H.Gibbons，P.S.Tsao，H.E.von der Leyen，J.P.Cooke，R.Buitrago，R.Kernoff and V.J.Dzau.(1997).Cellcycle inhibition preserves endothelial function in genetically engineered rabbitvein grafts.Journal of Clinical Investigation，99，1295-1301；Morishita，R.，G.H.Gibbons，M.Horiuchi，M.Nakajima，K.E.Ellison，W.Lee，Y.Kaneda，T.Ogihara and V.J.Dzau.(1997).Molecular Delivery System for AntisenseOligonucleotidesEnhanced Effectiveness of Antisense Oligonucleotides byHVJ-liposome Mediated Transfer.Journal of Cardiovascular Pharmacology，2，213-222；Braun-Dullaeus，R.C.，M.J.Mann and V.J.Dzau.(1998).Cell cycleprogressionnew therapeutic target for vascular proliferative disease.Circulation，98，82-89；Mann，M.J.(1998).E2F decoy oligonucleotide for geneticengineering of vascular bypass grafts.Antisense Nucleic Acid Drug Development，8，171-176；Morishita，R.，G.H.Gibbons，M.Horiuchi，Y.Kaneda，T.Ogiharaand V.J.Dzau.(1998).Role of AP-1 complex in angiotensin II-mediatedtransforming growth factor-beta expression and growth of smooth muscle cellsusing decoy approach against AP-1 binding site.Biochemistry and BiophysicsRes Community，243，361-367；Poston，R.S.，K.P.Tran，M.J.Mann，E.G.Hoyt，V.J.Dzau and R.C.Robbins.(1998).Prevention of ischemically inducedneointimal hyperplasia using ex-vivo antisense oligodeoxynucleotides.Journalof Heart and Lung Transplant，17，349-355；Tomita，N.，M.Horiuchi，S.Tomita，G.H.Gibbons，J.Y.Kim，D.Baran and V.J.Dzau.(1998).An oligonucleotidedecoy for transcription factor E2F inhibits mesangial cell proliferation in vitro.American Journal of Physiology，275，F(xiàn)278-284；*Mann，M.J.，G.H.Gibbons，H.Hutchinson，R.S.Poston，E.G.Hoyt，R.C.Robbins and V.J.Dzau.(1999).Pressure-mediated oligonucleotide transfection of rat and human cardiovasculartissues.Proceedings of the National Academy of Sccinces USA，96，6411-6416；Mann，M.J.，A.D.Whittemore，M.C.Donaldson，M.Belkin，M.S.Conte，J.F.Polak，E.J.Orav，A.Ehsan，G.Dell′Acqua and V.J.Dzau.(1999).Ex-vivo genetherapy of human vascular bypass grafts with E2F decoythe PREVENTsingle-centre，randomised，controlled trial.Lancet，354，1493-1498；Poston，R.S.，M.J.Mann，E.G.Hoyt，M.Ennen，V.J.Dzau and R.C.Robbins.(1999).Antisense oligodeoxynucleotides prevent acute cardiac allograft rejection via anovel，nontoxic，highly efficient transfection method.Transplantation，68，825-832；Tomita，S.，N.Tomita，T.Yamada，L.Zhang，Y.Kaneda，R.Morishita，T.Ogihara，V.J.Dzau and M.Horiuchi.(1999).Transcription factor decoy tostudy the molecular mechanism of negative regulation of renin gene expressionin the liver in vivo.Circulation Research，84，1059-1066；von der Leyen，H.E.，R.Braun-Dullaeus，M.J.Mann，L.Zhang，J.Niebauer and V.J.Dzau.(1999).Apressure-mediated nonviral method for efficient arterial gene and oligonucleotidetransfer.Human Gene Therapy，10，2355-2364；Ehsan，A.，and M.J.Mann.(2000).Antisense and gene therapy to prevent restenosis.Vascular Medicine，5，103-114；Mann，M.J.(2000).Gene therapy for vein grafts.Current CardiologyReports，2，29-33；Mann，M.J.(2000).Gene therapy for peripheral arterialdisease.Molecular Medicine Today，6，285-291；Mann，M.J.and.J.Dzau.(2000).Therapeutic applications of transcription factor decoy oligonucleotides.Journalof Clinical Investigation，106，1071-1075；Tomita，N.，R.Morishita，S.Tomita，G.H.Gibbons，L.Zhang，M.Horiuchi，Y.Kaneda，J.Kaneda，J.Higaki，T.Ogihara，and V.J.Dzau.(2000).Transcription factor decoy for NFkappaBinhibits TNF-alpha-induced cytokine and adhesion molecule expression in vivo.Gene Therapy，7，1326-1332；Ehsan，A.，M.J.Mann，G.Dell′Acqua and V.J.Dzau.(2001).Long-term stabilization of vein graft wall architecture andprolonged resistance to experimental atherosclerosis after E2F decoyoligonucleotide gene therapy.Journal of Thoracic_Cardiovascular Surgery，121，714-722。所引用的文獻(xiàn)全文引入本文作參考。
c.HIF-1轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)是一個異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，它介導(dǎo)對組織氧合作用發(fā)生的變化的適應(yīng)性反應(yīng)。HIF-1是一個由組成型表達(dá)的HIF-1β亞基和一個受到高度調(diào)節(jié)的HIF-1α亞基構(gòu)成的異源二聚體。HIF-1α的合成不依賴于氧氣，但是其降解主要是通過氧氣依賴性的機(jī)制調(diào)節(jié)的。活化的HIF-1α亞基遷移到細(xì)胞核內(nèi)，與ARNT(芳香基受體核轉(zhuǎn)位子)亞基發(fā)生二聚體化從而形成活性的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1。HIF-1識別位于許多基因增強(qiáng)子或啟動子內(nèi)的低氧反應(yīng)元件(HRE，或者5’-ACGTG-3’(SEQ ID NO1)，并導(dǎo)致它們的表達(dá)。目前已知HIF的三個亞型(HIF-1、HIF-2、HIF-3)；它們都是借助保守的HRE來影響基因的調(diào)節(jié)的。
已鑒定的HIF-1直接作用的假定靶基因有60多個，鑒定這些基因是基于其是否存在含HIF-1結(jié)合位點的順式作用低氧反應(yīng)元件，在HIF-1α缺失細(xì)胞中這些基因失去低氧誘導(dǎo)性的表達(dá)，或者是基于其在von Hippel-Lindau(VHL)缺失細(xì)胞中或轉(zhuǎn)染了HIF-1α表達(dá)載體的細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)。
假定受HIF-1調(diào)節(jié)的基因包括腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin)、醛縮酶A、醛縮酶C、自分泌運(yùn)動因子、組織蛋白酶、內(nèi)分泌腺來源的VEGF、endoglin、內(nèi)皮素-1、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、纖連蛋白1、烯醇化酶1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶、己糖激酶、類胰島素生長因子2、類胰島素生長因子結(jié)合蛋白1和2、角蛋白14、18和19、多藥耐藥蛋白1、基質(zhì)金屬蛋白酶2、一氧化氮合酶2、纖溶酶原激活物抑制劑1、丙酮酸激酶M、轉(zhuǎn)化生長因子-α、轉(zhuǎn)化生長因子β2、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、尿激酶纖溶酶激活物受體、VEGF受體-2和波形蛋白(Semenza，Nature Rev.3721-732(2003))。
一些HIF-1靶基因(如VEFG)的表達(dá)在多數(shù)細(xì)胞類型中都被低氧誘導(dǎo)，但是對絕大多數(shù)HIF-1靶基因來說，低氧所誘導(dǎo)的表達(dá)具有細(xì)胞型特異性。
其轉(zhuǎn)錄被HIF-1所激活的基因參與到癌癥生物學(xué)的一些重要方面，包括血管發(fā)生、細(xì)胞存活、葡萄糖的代謝以及癌癥侵入。腫瘤內(nèi)低氧和基因改變能夠?qū)е翲IF-1α過表達(dá)，而人們已將HIF-1α的過表達(dá)與一些類型癌癥患者死亡率增加聯(lián)系在了一起。已有建議針對HIF-1及其作用途徑來開發(fā)抗癌劑(Semenza 2003，同前)。
雙鏈HIF-1寡脫氧核苷酸誘騙物(dsODN)分子曾被用于研究HIF-1的生物學(xué)作用。Wang and Semenza，J.Biol.Chem.26821513-21518(1993)以及Wang and Semenza，J.Biol.Chem.2701230-1237(1995)描述過具有以下序列的HIF-1 dsODN分子5′-GCCCTACGTGCTGTCTCA-3′(有義鏈)(SEQ IDNO338)和5′-TGAGACAGCACGTAGGGC-3′(反義鏈)(SEQ ID NO339)。Oikawa et al.，Biochem.Biophys.res.Commun.28939-43(2001)；以及Yangand Zou，Am.J.Physiol.Renal Physiol.281F900-8(2001)中也公開過HIF-1誘騙物分子。
美國申請(公開號20050164240)(PCT/US04/33272)公開了E2F dsODN分子；美國申請公開號20050182012(PCT/US04/40673)公開了NF-κBdsODN分子；PCT/US04/40704公開了HIF-1 dsODN分子，這些專利申請全文以參考文獻(xiàn)的形式明確引入本文。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的有效的方法和制劑來向細(xì)胞遞送核酸分子(包括多-和寡核苷酸)。
因此，本發(fā)明一方面涉及通過令生物膜與制劑進(jìn)行接觸向細(xì)胞遞送多核苷酸的方法，所述制劑包含多核苷酸、至少一種重量總濃度約0.2％到約10％的滲透增強(qiáng)劑(penetration enchancer)、以及濃度約1％到60％的乙醇。
一實施方案中，所述多核苷酸是寡核苷酸。
另一實施方案中，本發(fā)明涉及向哺乳動物細(xì)胞遞送寡核苷酸。
另一實施方案中，本發(fā)明涉及將寡核苷酸遞送給人。
再一實施方案中，發(fā)明涉及向細(xì)胞遞送寡核苷酸，其中所述生物膜是皮膚或粘膜。
一實施方案中，所述滲透增強(qiáng)劑是陰離子表面活性劑。另一實施方案中，該陰離子表面活性劑是月桂基硫酸鈉、硫酸烷基乙醚或月桂醇醚硫酸鈉或N-月桂酰肌氨酸(N-lauroylsarcosine)。
一實施方案中，所述滲透增強(qiáng)劑是非離子性表面活性劑。另一實施方案中，該非離子表面活性劑是失水山梨醇單月桂酸酯(sorbitan monolaurate)20(Span 20)。
另一實施方案中，本發(fā)明涉及向細(xì)胞遞送寡核苷酸，其中所述制劑包含重量約0.4％到10％的所述滲透增強(qiáng)劑，或重量約為0.4％到1％的所述滲透增強(qiáng)劑，或者重量約0.8％的所述滲透增強(qiáng)劑。一實施方案中，該制劑包含約0.8％的月桂醇醚硫酸鈉。還有一實施方案中，該制劑包含約0.6％的N-月桂酰肌氨酸和約0.4％的失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及向細(xì)胞遞送寡核苷酸，其中的制劑包含乙醇。一實施方案中，該制劑包含重量約1％到約50％的醇，或者重量約為5％到50％的醇，或者重量約為10％到50％的醇，或者重量約20％到50％的醇，或者重量約30％到50％的醇，或重量約40％到50％的醇，或者重量約49％的醇，或者重量約20％的醇，或重量約10％的醇，或重量約5％的醇，或者重量約為1％的醇。在另一實施方案中，所述醇是乙醇。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及向細(xì)胞遞送寡核苷酸，其中的制劑是水性制劑。再一實施方案中，所述水性制劑是基于凝膠的水性制劑。
在一實施方案中，所述基于凝膠的水性制劑包含約0.8％重量的月桂醇醚硫酸鈉。另一實施方案中，該基于凝膠的水性制劑進(jìn)一步包含約重量1％、約5％、約10％、約20％或約49％的乙醇。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及向細(xì)胞遞送寡核苷酸，其中的制劑是含有脂質(zhì)體的制劑。
在另一實施方案中，該含脂質(zhì)體的制劑包含重量約0.8％的月桂醇醚硫酸鈉。在另一實施方案中，該含脂質(zhì)體的制劑進(jìn)一步包含重量約2.5％、約5％、或約10％的乙醇。
另一實施方案中，所述含脂質(zhì)體的制劑包含重量約0.6％的N-月桂酰肌氨酸、重量約0.4％的失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)和重量約5％的乙醇。
在一實施方案中，本發(fā)明涉及一種通過令生物膜與一種基于乳劑的制劑進(jìn)行接觸向細(xì)胞遞送多核苷酸的方法，所述制劑含有多核苷酸，至少一種重量總濃度約0.2％到約10％的滲透增強(qiáng)劑和水。在一實施方案中，所述多核苷酸是寡核苷酸。
在一實施方案中，上述基于乳劑的制劑包含重量約0.8％或0.35％的月桂醇醚硫酸鈉。另一實施方案中，該基于乳劑的制劑包含重量約0.15％的1-苯基哌嗪(phenyl piperazine)。再有一實施方案中，該基于乳劑的制劑包含重量約0.6％的N-月桂酰肌氨酸，約0.4％的失水山梨醇單月桂酸酯20(Span20)和約5％的乙醇。在另一實施方案中，該基于乳劑的制劑進(jìn)一步包含重量約10％的十四烷酸異丙酯(isopropyl myristate)。還有一實施方案中，該基于乳劑的制劑進(jìn)一步包含重量約10％的單硬脂酸甘油酯(glycerylmonostearate)。
在一實施方案中，本發(fā)明涉及向細(xì)胞遞送多核苷酸或寡核苷酸，其中所述細(xì)胞是血管平滑肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。
另一實施方案中，發(fā)明涉及向細(xì)胞遞送寡核苷酸，其中的寡核苷酸是雙鏈寡脫氧核苷酸(dsODN)分子。在一實施方案中，dsODN分子的第一鏈與第二鏈至少部分互補(bǔ)或者與第二鏈完全互補(bǔ)。在另一實施方案中，該dsODN分子包含至少一個單鏈突出端。另一實施方案中，dsODN分子包含兩條寡脫氧核苷酸鏈，它們在3’或5’末端，或者兩個末端共價地結(jié)合在一起，因此形成一個啞鈴結(jié)構(gòu)，或者環(huán)形分子。另一實施方案中，該dsODN分子具有一個磷酸二酯骨架。在另一實施方案中，該dsODN分子具有一個硫代磷酸酯骨架。另一實施方案中，該dsODN分子具有磷酸二酯-硫代磷酸二酯混合骨架。另一實施方案中，所述dsODN分子的第一和第二鏈僅通過Watson-Crick堿基配對聯(lián)系在一起。另一實施方案中，該dsODN至少有5、10、15、20或25個堿基對長。
再一實施方案中，發(fā)明涉及向細(xì)胞遞送dsODN分子，其中所述dsODN分子包含一段能夠與轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的序列。在一實施方案中，所述轉(zhuǎn)錄因子選自E2F、AP-1、AP-2、HIF-1和NFκB。另一實施方案中，所述dsODN分子能夠特異結(jié)合NFκB轉(zhuǎn)錄因子。
在一具體實施方案中，所述能特異結(jié)合NFκB轉(zhuǎn)錄因子的dsODN分子在其第一鏈中，從5’到3’，包含F(xiàn)LANK1-CORE-FLANK2序列，其中CORE選自下列序列GGGACTTTCC(SEQ ID NO5)、GGGACTTTCC(SEQ ID NO7)、GGGACTTTCCC(SEQ ID NO9)、GGGATTTCC(SEQ IDNO11)、GGACTTTCC(SEQ ID NO13)、GACTTTCC(SEQ ID NO15)、GACTTTCCC(SEQ ID NO17)、GGATTTCC(SEQ ID NO19)、GGATTTCCC(SEQ ID NO21)、GATTTCC(SEQ ID NO23)、GATTTCCC(SEQ ID NO24)、GGACTTTCCC(SEQ ID NO25)和AGGACTTTCCA(SEQID NO78)；FLANK1選自CCTTGAA(SEQ ID NO79)；AT；TC；CTC；CT；AGTTGA(SEQ ID NO80)，TTGA(SEQ ID NO81)；AGTTGC(SEQ ID NO82)；GTTGA(SEQ ID NO83)；A；AAGA(SEQ ID NO84)；ATAT(SEQ ID NO85)；CAAC(SEQ ID NO86)；CAGT(SEQ ID NO 87)；TGA；和GA；以及FLANK2選自TCC；GT；TC；TGT；TCA；TC；CA；AGGC(SEQ ID NO88)；.AG；AGG；A；AGAG(SEQ ID NO89)；TTAA(SEQ ID NO90)；ACAC(SEQ ID NO91)；ACTG(SEQ ID NO92)和AGGCT(SEQ ID NO93).
在一實施方案中，CORE選自GGGATTTCC(SEQ ID NO11)、GGACTTTCC(SEQ ID NO13)和GGATTTCC(SEQ ID NO19)；并且
FLANK1是AT，F(xiàn)LANK2是GT；或者FLANK1是TC，F(xiàn)LANK2 is TC；或者FLANK1是CTC，F(xiàn)LANK2是TGT；或者FLANK1是AGTTGA(SEQID NO80)，F(xiàn)LANK 2是AGGC(SEQ ID NO88)。
另一實施方案中，CORE是GGGATTTCC(SEQ ID NO11)或GGACTTTCC(SEQ ID NO13)；FLANK1是AGTTGA(SEQ ID NO80)，F(xiàn)LANK 2是AGGC(SEQ ID NO88)。
再一實施方案中，CORE是GGACTTTCC(SEQ ID NO13)，F(xiàn)LANK1是AGTTGA(SEQ ID NO80)，F(xiàn)LANK 2是AGGC(SEQ ID NO88)。
在一實施方案中，所述能夠特異結(jié)合NFκB轉(zhuǎn)錄因子的dsODN分子包括一個第二鏈，該鏈與所述第一鏈至少部分互補(bǔ)，并具有磷酸二酯、硫代磷酸酯、混合的磷酸二酯-硫代磷酸酯，或其他修飾形式的骨架。另一實施方案中，這兩條鏈僅通過Watson-Crick堿基配對和/或共價鍵聯(lián)系在一起。再一實施方案中，所述能夠特異結(jié)合NFκB轉(zhuǎn)錄因子的dsODN分子包含一段序列，從5’到3’方向，選自SEQ ID NO 26到77。再一實施方案中，所述能夠特異結(jié)合NFκB轉(zhuǎn)錄因子的dsODN分子包含一段序列，從5’到3’方向，選自SEQ ID NO 26到34。再一實施方案中，所述能夠特異結(jié)合NFκB轉(zhuǎn)錄因子的dsODN分子包含一段序列，從5’到3’方向，選自SEQ ID NO 26到31。還有一實施方案中，所述能夠特異結(jié)合NFκB轉(zhuǎn)錄因子的dsODN分子包含SEQ ID NO30的序列。
在一實施方案中，所述能夠特異結(jié)合NFκB轉(zhuǎn)錄因子的dsODN分子是12到28，或14到24，或14到22個堿基對長，并且可能包含修飾的或不常見的核苷酸。
另一實施方案中，dsODN分子能夠特異結(jié)合E2F轉(zhuǎn)錄因子。在具體實施方案中，所述能夠特異結(jié)合E2F轉(zhuǎn)錄因子的dsODN分子包含核心序列，該序列能夠特異結(jié)合E2F轉(zhuǎn)錄因子，旁接5′和3′序列，其中(i)所述核心序列由約5到12個堿基對組成；(ii)所述分子包含約12到28個堿基對長的雙鏈區(qū)，該區(qū)域由兩條完全互補(bǔ)的鏈組成；以及(iii)該E2F dsODN結(jié)合到所述E2F轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合親和力至少是圖26(SEQ ID NOS94和95)所示參照誘騙物分子與該轉(zhuǎn)錄因子親和力的約5倍，這一數(shù)據(jù)是通過用THP-1細(xì)胞的核提取物進(jìn)行的競爭性凝膠阻滯試驗測定的。
在另一實施方案中，dsODN分子能夠特異結(jié)合HIF-1轉(zhuǎn)錄因子。在具體實施方案中，所述能夠特異結(jié)合HIF-1轉(zhuǎn)錄因子的dsODN分子包含核心序列，后者能夠特異結(jié)合HIF-1轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明的另一方面涉及一種制劑，其含有寡核苷酸分子、至少一種總重量濃度為約0.2％到10％的滲透增強(qiáng)劑、和重量濃度為約1％到60％的醇。
在一實施方案中，所述制劑是水性制劑。另一實施方案中，該制劑是基于凝膠的水性制劑。再一實施方案中，該制劑是一種含有脂質(zhì)體的制劑。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及一種乳劑制劑，其含有寡核苷酸，至少一種總重量濃度約0.2％到10％的滲透增強(qiáng)劑和水。
發(fā)明的所有方面和實施方案中，所述寡核苷酸優(yōu)選是雙鏈寡脫氧核苷酸分子(dsODN)，更優(yōu)選是一種轉(zhuǎn)錄因子(TF)dsODN。
本發(fā)明涉及向細(xì)胞非親體遞送核苷酸分子(包括多-和寡核苷酸)的方法和制劑。相應(yīng)地，這里描述的優(yōu)選實施方案適用于本發(fā)明的方法和制劑。
附圖簡述

圖1的曲線顯示了用含有NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑F1在小鼠模型中治療塵螨抗原誘導(dǎo)的異位性皮炎的效果。該基于凝膠的水性制劑F1包含0.8％月桂醇醚硫酸鈉、49％乙醇、1.5％HPMC 4000cps和48.7％100mM磷酸緩沖液。測量了小鼠皮膚(耳)厚度以便對炎癥，進(jìn)而對NF-κB誘騙物分子在各種濃度時的治療效果進(jìn)行量化。
圖2的曲線顯示了用含有NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑F6在小鼠模型中治療塵螨抗原誘導(dǎo)的異位性皮炎的效果。測量了小鼠皮膚(耳)厚度以便對炎癥，進(jìn)而對NF-κB誘騙物分子在濃度為0.25％和1％時的治療效果進(jìn)行量化。
圖3的曲線顯示其乙醇濃度不同的含有NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑的效果。
圖4的曲線顯示塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的Nc/Nga小鼠接觸性皮炎，在用含有0.25％NF-κB分子的基于凝膠的水性制劑治療時，其IL-1β基因表達(dá)水平的下降。
圖5的曲線顯示塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的Nc/Nga小鼠接觸性皮炎，在用含有0.25％NF-κB分子的基于凝膠的水性制劑F2治療時，其IL-6基因表達(dá)水平的下降。
圖6的曲線顯示塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的Nc/Nga小鼠接觸性皮炎，在用含有0.25％NF-κB分子的基于凝膠的水性制劑F2治療時，其TNFα基因表達(dá)水平的下降。
圖7的曲線顯示塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的Nc/Nga小鼠接觸性皮炎，在用含有0.25％NF-κB分子的基于凝膠的水性制劑F2治療時，其TSLP基因表達(dá)水平的下降。
圖8顯示了經(jīng)福爾馬林固定的異位皮炎小鼠皮膚的蘇木精和曙紅染色結(jié)果，(A)未進(jìn)行治療，(B)局部使用倍他米松(betamethasone)治療，(C)用含有重量約49％的乙醇和重量約0.8％月桂醇醚硫酸鈉的制劑進(jìn)行治療，以及(D)用含有重量約49％的乙醇和重量約0.8％月桂醇醚硫酸鈉，并含有NF-κB誘騙物分子的制劑進(jìn)行治療。
圖9顯示對塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的Nc/Nga小鼠接觸性皮炎，在停止治療后，NF-κB誘騙物分子的持續(xù)療效，而在倍他米松治療停止后，腫脹和發(fā)炎的突然嚴(yán)重復(fù)發(fā)。
圖10(A)的曲線顯示Nc/Nga小鼠經(jīng)塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)接觸性皮炎，在未經(jīng)治療、用倍他米松治療，以及用NF-κB誘騙物分子治療時其皮膚厚度。圖10(A)顯示了倍他米松治療導(dǎo)致皮膚萎縮。
圖10(B)顯示在NF-κB誘騙物分子治療中，沒有出現(xiàn)可見于倍他米松治療的全身性皮膚萎縮副作用。
圖11顯示倍他米松治療和NF-κB誘騙物治療對皮膚厚度的影響。圖11顯示NF-κB誘騙物治療沒有導(dǎo)致皮膚變薄。
圖12顯示患有異位性皮炎的小鼠用含有0.25％NF-κB誘騙物分子的制劑F6治療和用局部倍他米松治療后，其經(jīng)福爾馬林固定的皮膚用苦味酸-天狼星紅(picro-sirius red)染色的結(jié)果。
圖13示利用基于凝膠的水性制劑F2給豬皮膚遞送NF-κB誘騙物分子。
圖14顯示競爭性結(jié)合凝膠變動實驗的定量結(jié)果，它表明在DNFB致炎的豬皮膚中存在著NF-κB結(jié)合誘騙物分子，該豬皮膚用含有10％乙醇和不同濃度NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑F2治療過。這個實驗中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針是放射性標(biāo)記的。將加入競爭劑后剩下的條帶量做曲線。條帶用TYPHOONTM8600 phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)進(jìn)行了定量。凝膠圖像中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針與P65蛋白質(zhì)結(jié)合的減少證明豬皮膚中存在著結(jié)合了NF-κB的誘騙物分子。
圖15顯示競爭性結(jié)合凝膠變動實驗的定量結(jié)果，它表明在DNFB致炎的豬皮膚中存在著NF-κB結(jié)合誘騙物分子，該豬皮膚用含有5％乙醇和不同濃度NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑F3治療過。這個實驗中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針是放射性標(biāo)記的。將加入競爭劑后剩下的條帶量做曲線。條帶用TYPHOONTM8600 phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)進(jìn)行了定量。凝膠圖像中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針與P65蛋白質(zhì)結(jié)合的減少證明豬皮膚中存在著結(jié)合了NF-κB的誘騙物分子。
圖16顯示競爭性結(jié)合凝膠變動實驗的定量結(jié)果，它表明在DNFB致炎的豬皮膚中存在著NF-κB結(jié)合誘騙物分子，該豬皮膚用含有10％乙醇和不同濃度NF-κB誘騙物分子的含脂質(zhì)體的制劑F9治療過。這個實驗中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針是放射性標(biāo)記的。將加入競爭劑后剩下的條帶量做曲線。條帶用TYPHOONTM8600 phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)進(jìn)行了定量。凝膠圖像中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針結(jié)合到P65蛋白質(zhì)的減少證明豬皮膚中存在著結(jié)合了NF-κB的誘騙物分子。
圖17的曲線顯示二硝基氟苯致炎的豬皮膚中的IL-6mRNA表達(dá)水平。
圖18的曲線顯示用含有0.25和0.5％NF-κB誘騙物分子的含脂質(zhì)體的制劑F9治療過的二硝基氟苯致炎的豬皮膚中，當(dāng)與安慰劑治療或未治療皮膚相比時，相對IL-6mRNA表達(dá)水平的下降。
圖19的曲線顯示了用含有0.25％NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑治療后，二硝基氟苯致炎的豬皮膚中的相對IL-6mRNA表達(dá)水平下降。
圖20的曲線顯示用含0.5或1％NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑治療后，二硝基氟苯致炎的豬皮膚中相對IL-1βmRNA表達(dá)水平下降。
圖21顯示的TUNNEL試驗結(jié)果表明倍他米松和NF-κB誘騙物分子治療在Ag(Dp)誘導(dǎo)的炎癥中導(dǎo)致凋亡增加。
圖22顯示異位性皮炎的福爾馬林固定的小鼠皮膚的Ki67染色結(jié)果，所述小鼠皮膚用含有1％NF-κB的基于凝膠的水性制劑F6和局部倍他米松治療過。
圖23的曲線顯示一些NF-κB誘騙物分子的p65/p50結(jié)合。
圖24的曲線顯示一些NF-κB誘騙物分子的p50/p50結(jié)合。
圖25顯示EMSA試驗的定量結(jié)果。試驗中檢測了指定為“E”的誘騙物分子非特異性競爭結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子Oct-1。該項試驗中對Oct-1誘騙物分子進(jìn)行了同位素標(biāo)記。加入競爭劑后剩余的條帶量進(jìn)行做圖。條帶用TyphoonPhosphorimager(Molecular Dynamics)定量。結(jié)果表明，受測NF-κB誘騙物分子不能非特異性競爭結(jié)合對它而言不具備特異性的啟動子。陽性對照是沒有同位素標(biāo)記的Oct-1探針(cold Oct-1probe)。
圖26顯示的序列是“參照誘騙物分子”(SEQ ID NO 94和95)，″新誘騙物分子″(SEQ ID NO96和97)以及″拼湊誘騙物分子″(SEQ ID NO 98和99)，其中核心序列是粗體并加有下劃線。
圖27顯示了競爭結(jié)合試驗的結(jié)果，該試驗是用本發(fā)明描述的代表性誘騙物分子進(jìn)行的，與參照誘騙物分子和陰性對照進(jìn)行了比較。
圖28的矩陣從計算學(xué)上描述了本發(fā)明的HIF-1誘騙序列的核心和其緊鄰的旁側(cè)區(qū)的堿基組成。
圖29顯示了按照結(jié)合親和性分類的HIF-1誘騙物分子，其中強(qiáng)調(diào)了與結(jié)合親和性相關(guān)的一些共有序列。
優(yōu)選實施方案詳述A.定義除非另外界定，本文使用的技術(shù)和科學(xué)名詞其含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常的理解相同。Singleton et al.，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley & Sons(New York，NY 1994)andMarch，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure 4thed.，John Wiley & Sons(New York，NY 1992)，對本發(fā)明申請中使用的許多名詞可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供一個普遍的指導(dǎo)。
名詞″多核苷酸″以單數(shù)或復(fù)數(shù)形式使用時，通常是指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，它們可以是未修飾的RNA或DNA，或者修飾過的RNA或DNA。因此，例如本文界定的多核苷酸包括，不限于，單鏈和雙鏈DNA、包含單鏈和雙鏈區(qū)域的DNA、單鏈和雙鏈RNA、以及包含單鏈和雙鏈區(qū)域的RNA、包含DNA和RNA的雜交分子，該雜交分子可以是單鏈或，更常見的雙鏈分子，或者包括單鏈和雙鏈區(qū)域。此外，文中所用的名詞“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或者既有RNA也有DNA的三鏈區(qū)域。這樣區(qū)域中的鏈可以來自相同的分子或不同的分子。所述區(qū)域可以包括全部一或多個分子，但更常見地只涉及到一些分子的一個區(qū)域。三螺旋區(qū)域的分子中的一個經(jīng)常是一個寡核苷酸。名詞“多核苷酸”特別包括cDNAs。該名詞包括含有一或多個修飾堿基的DNAs(包括cDNAs)和RNAs。因此，那些因為穩(wěn)定性或其他原因而對骨架進(jìn)行了修飾的DNA或RNA也是本文中名詞所要表達(dá)的“多核苷酸”。此外，包含罕見堿基(比如肌苷)，或者修飾堿基，比如含氚堿基也包含在本文界定的名詞“多核苷酸”中?？傊~“多核苷酸”涵蓋了未修飾多核苷酸的所有化學(xué)方法、酶學(xué)方法和/或代謝修飾形式，也涵蓋了化學(xué)合成的病毒和細(xì)胞(包括簡單和復(fù)雜細(xì)胞)所特有的DNA和RNA，尤其包括寡核苷酸，比如例如寡核苷酸誘騙物分子和反義寡核苷酸。
名詞“寡核苷酸”是指相對較短的多核苷酸，包括但不限于，單鏈脫氧核糖核苷酸、單或雙鏈核糖核苷酸、RNA:DNA雜交分子和雙鏈DNA。寡核苷酸，比如單鏈DNA探針寡核苷酸通常是通過化學(xué)方法合成的，例如利用市場上銷售的自動寡核苷酸合成儀來合成。但是，寡核苷酸也可以通過其他許多種方法來制備，這些方法包括體外重組DNA介導(dǎo)的技術(shù)以及通過在細(xì)胞和生物體內(nèi)表達(dá)DNA。通常，寡核苷酸由約5到50(比如10到40，或15到30)個核苷酸堿基組成。
名詞“反義寡核苷酸”用來表示這樣一種寡核苷酸或其類似物，它與RNA或DNA的一個片段互補(bǔ)，并與之結(jié)合而抑制其正常功能。
名詞“生物膜”用于指代哺乳動物中隔離外界的任何類型的身體表面。該名詞特別包括皮膚和動物體內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)的被覆層，比如粘膜。
名詞“雙鏈”用于指代包含兩條互補(bǔ)核苷酸鏈的核酸分子，其中兩條鏈?zhǔn)峭ㄟ^Watson-Crick堿基配對結(jié)合在一起。該名詞特別包括那些除了由兩條互補(bǔ)鏈形成的雙鏈區(qū)域，還含有單鏈突出端，和/或在其3’和/或5’末端共價連在一起的分子。
名詞“寡核苷酸誘騙物”、“雙鏈寡核苷酸誘騙物”、“寡脫氧核苷酸誘騙物”以及“雙鏈寡脫氧核苷酸誘騙物”可以互換使用，用于指代一些短的核酸分子，其包含一個能夠結(jié)合并干擾目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子生物功能的雙鏈區(qū)。例如，名詞″NF-κB寡核苷酸誘騙物″、“雙鏈NF-κB寡核苷酸誘騙物″、“NF-κB寡脫氧核苷酸誘騙物”以及″雙鏈NF-κB寡脫氧核苷酸誘騙物″可以互換使用，指代一些短的核酸分子，其包含一個能夠結(jié)合并干擾NF-κB轉(zhuǎn)錄因子生物功能的雙鏈區(qū)。名詞“雙鏈”用于指代包含兩條通過Watson-Crick堿基配對結(jié)合在一起的互補(bǔ)核苷酸鏈的核酸分子。該名詞特別包括E2F、NF-κB和HIF-1寡脫氧核苷酸誘騙物分子，除了由兩條互補(bǔ)鏈形成的雙鏈區(qū)，這些分子還包含單鏈突出端。此外，該名詞還特別包括E2F、NF-κB和HIF-1寡脫氧核苷酸誘騙物分子，除了雙鏈區(qū)，其中的兩條鏈還在3′和/或5′末端共價連在一起。
文中所用名詞″E2F″是其最廣泛的含義，包括所有天然存在于任何動物物種(比如哺乳動物)的E2F分子，包括E2F-1、E2F-2、E2F-3、E2F-4、E2F-5和E2F-6。
文中所用名詞″NF-κB″″是其最廣泛的含義，包括所有天然存在于任何動物物種(比如哺乳動物)的NF-κB，包括NF-κB/Rel家族成員的所有組合形式，例如p52、p50、p65、cRel和Rel B。
名詞″HIF-1″以其最廣泛的含義用于本文，包括所有天然存在于任何動物物種(比如哺乳動物)的HIF-1分子，包括HIF-1α/HIF-1β異源二聚體及其亞基。
名詞″轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列″是結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的短核苷酸序列。該名詞特別包括一些天然結(jié)合序列，它們通?？梢娪谄滢D(zhuǎn)錄受到一或多個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的那些基因的調(diào)控區(qū)。該名詞進(jìn)一步包括人工(合成的)序列，它們不是天然存在的，但能競爭性地抑制轉(zhuǎn)錄因子與內(nèi)源基因中的結(jié)合位點的結(jié)合。
用于本文的短語″修飾核苷酸″是指那些與天然核苷酸和三磷酸核苷酸在組成和/或結(jié)構(gòu)上不同的核苷酸或三磷酸核苷酸。
用于本文時，名詞″5撇″或″5以及″3撇″或″3是指相對核酸來說的特定方向。核酸具有不同的化學(xué)方向性，因此它們的兩個末端用5撇(5′)或3撇(3′)來區(qū)別。核酸的3′端含有連在末端戊糖的3′碳上的游離羥基。核酸的5′端含有連在末端戊糖的5′碳身的游離羰基或磷酸基團(tuán)。
用于本文時，名詞″突出端″是指這樣一些雙鏈核酸分子，它們沒有平末端，因此兩條鏈的末端不是共同延伸的，以致一條鏈的5′端延伸超過其互補(bǔ)鏈的3′端。線性核酸分子可能有零、一或兩個5′突出端。
用于本文時，名詞″優(yōu)先結(jié)合″及其在語法上的等同詞匯用來表示其特異性/親和性系數(shù)至少約40，其中的特異性/親和性比率定義如下特異性/親和性系數(shù)＝(Sp50/p50-Sp65/p50)×Sp50/p50/Sp65/p50
其中Sp50/p50等于競爭50％p50/p50與來自HIV的非哺乳動物NF-κB啟動子(序列113/114)之間的結(jié)合所需的誘騙物摩爾多余量；Sp65/p50等于競爭50％p65/p50與來自HIV的非哺乳動物NF-κB啟動子(序列113/114)之間的結(jié)合所需的誘騙物摩爾多余量。如果誘騙物在試驗的任何摩爾比率都不能競爭至少50％結(jié)合，其分?jǐn)?shù)(S)定為100。
名詞“炎性疾病”或“炎性紊亂”用在本文中是指導(dǎo)致炎癥的病理學(xué)狀態(tài)，通常是由嗜中性粒細(xì)胞趨化性引起的。這類紊亂的例子包括，但不限于炎性皮膚病(包括銀屑病(psoriasis)和異位性皮炎)；系統(tǒng)性硬皮病和胞壁增厚(sclerosis)；以及與發(fā)炎性腸道疾病(IBD)(比如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)相關(guān)的反應(yīng)；缺血再灌注紊亂包括手術(shù)組織再灌注損傷(surgical tissuereperfusion injury)、心肌缺血病癥比如心肌梗塞、心搏停止、心臟手術(shù)后的再灌注和經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronaryangioplasty)后的縮窄、中風(fēng)和腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysms)；中風(fēng)繼發(fā)腦水腫(cerebral edema secondary to stroke)；顱外傷、低血容量性休克(hypovolemic shock)；窒息；成人呼吸窘迫綜合征(adult respiratory distresssyndrome)；急性肺損傷；白塞氏病(Behcet′s Disease)；皮肌炎(dermatomyositis)；多發(fā)性肌炎(polymyositis)；多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)(MS)；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎(uveitis)；骨關(guān)節(jié)炎；狼瘡性腎炎；自身免疫疾病比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、Sjorgen綜合征、血管炎；涉及白細(xì)胞滲出(leukocyte diapedesis)的疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性疾病、敗血癥或創(chuàng)傷引發(fā)的多器官損傷綜合征；酒精性肝炎；細(xì)菌性肺炎；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病包括腎小球性腎炎；膿毒(sepsis)；肉樣瘤病(sarcoidosis)；組織/器官移植的免疫病理反應(yīng)；肺部炎癥，包括肋膜炎、齒槽炎、脈管炎、肺炎、慢性支氣管炎、細(xì)支氣管擴(kuò)張、禰漫性泛細(xì)支氣管炎(diffuse panbronchiolitis)、過敏性肺炎(hypersensitivity pneumonitis)，特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonary fibrosis)(IPF)，和囊腫性纖維化等。優(yōu)選的適應(yīng)癥包括，但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、類風(fēng)濕性脊椎炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和其他關(guān)節(jié)炎癥狀、慢性炎癥、自體免疫糖尿病、多發(fā)性硬化(MS)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、成人呼吸窘迫綜合征、白塞氏病、銀屑病、慢性肺部炎性疾病、移植物抗宿主反應(yīng)、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、發(fā)炎性腸道疾病(IBD)、阿爾茨海默氏病、和pyresis，以及任何與炎癥及其相關(guān)紊亂有關(guān)的疾病或紊亂。
名詞″凋亡″和″凋亡活性″以其廣義用于本文，是指哺乳動物中有序或控制性的細(xì)胞死亡方式，通常伴有一或多種特征性的細(xì)胞變化，包括細(xì)胞質(zhì)縮合、質(zhì)膜微絨毛脫落、細(xì)胞核分節(jié)、染色體DNA降解或線粒體功能丟失。該活性可通過例如細(xì)胞活性檢測、FACS分析或DNA電泳來確定和測量。
名詞″癌癥″和″癌性的″是指或者描述了哺乳動物體內(nèi)的一種生理狀態(tài)，其典型特征是失控的細(xì)胞生長。癌癥例子包括，但不限于癌(carcinoma)、淋巴癌、白血病、母細(xì)胞瘤(blastoma)和肉瘤。這些癌癥的具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme)、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、結(jié)腸癌和頭頸鱗癌。在一個優(yōu)選實施方案中，所述癌癥包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌。
名詞“治療”是指治愈性治療以及預(yù)防性(prophylactic或preventative)措施，其目的是預(yù)防或緩解(減輕)目標(biāo)病理學(xué)狀況或紊亂。為本發(fā)明目的，有益的或期望的臨床結(jié)果包括，但不限于癥狀的減輕、疾病進(jìn)展停止、疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即不再惡化)、疾病進(jìn)展延緩或減慢、疾病狀態(tài)改善或緩和，以及能檢測到或不能檢測到的病愈(部分或完全)。需要治療的人包括已經(jīng)患有紊亂的人和那些容易染上紊亂的人，或者要預(yù)防紊亂的人。在腫瘤(例如癌癥)的治療中，治療劑可能能夠直接減輕腫瘤細(xì)胞的病理，或使得腫瘤細(xì)胞對其他治療劑治療(例如放射和/或化療)更敏感。
“受試者”是脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選是人類。
名詞″哺乳動物″在本文中指任何劃歸哺乳動物的動物，包括但不限于，人類、高級靈長類、嚙齒類、家養(yǎng)和農(nóng)場動物、以及動物園、運(yùn)動或?qū)櫸飫游?，如羊、狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選，文中所述哺乳動物是人類。
名詞″細(xì)胞毒劑″用于本文是指抑制或妨礙細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞被破壞的物質(zhì)。該名詞包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素)、化療劑、和一些毒素(比如細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或有酶活性的毒素)，包括其片段和/或變異體。
名詞″化療劑″用于本文是指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物。化療劑的例子包括，但不限于烷化劑比如硫替哌(thiotepa)和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸鹽比如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶比如benzodopa、卡波醌(carboquone)、meturedopa和uredopa；乙烯亞胺和甲胺包括六甲蜜胺(altretamine)、三胺嗪(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和trimethylolomelamine；番荔枝內(nèi)酯(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和bullatacinone)；喜樹堿(camptothecin)(包括其合成類似物拓?fù)涮婵?topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素(cryptophycins)(尤其是隱藻素1和隱藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；duocarmycin(包括其合成類似物KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥比如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide，雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、雙氯乙基甲胺氧化鹽酸(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、novembichin、phenesterine、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲比如亞硝脲氮芥(carmustine)、葡糖氯乙亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素比如烯二炔類抗生素(例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素(1I和加利車霉素2I1，參見例如Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33183-186(1994)；達(dá)內(nèi)霉素(dynemicin)，包括達(dá)內(nèi)霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色團(tuán)和相關(guān)的生色蛋白烯二炔類抗生素生色團(tuán))，阿克拉霉素aclacinomysins、放線菌素、authramycin、重氮絲氨酸、博萊霉素、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、carzinophilin、色霉素、放線菌素(dactinomycin)D、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(包括嗎啉-阿霉素、氰嗎啉(cyano morpholino)-阿霉素、2-吡咯啉(pyrrolino)-阿霉素和脫氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾加霉素、橄欖霉素、培來霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素、quelamycin、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑霉素、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結(jié)核霉素、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物比如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物比如denopterin、氨甲蝶呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物比如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、thiamiprine、硫代鳥嘌呤；嘧啶類似物比如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟脫氧尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素比如卡普睪酮(calusterone)、屈他雄酮(dromostanolone)丙酸鹽、環(huán)硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酪(testolactone)；抗腎上腺素比如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑比如frolinic acid；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；edatraxate；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；美登木素生物堿(maytansinoids)比如美登素和安絲菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；硝氨吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；podophyllinic acid；2-ethylhydrazide；甲基芐肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；力索新(rhizoxin)；西佐糖(sizofiran)；鍺羅胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2′’-三氯三乙胺(trichlorotriethylamine)；單端孢霉毒素族(trichothecenes)(特別是T-2毒素、verracurin A，漆斑菌素(roridin)A和anguidine；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(″Ara-C″)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；硫替哌(thiotepa)；taxoids，例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他賽(doxetaxel)(TAXOTERE，Rhne-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物比如順鉑和卡鉑(carboplatin)；長春堿(vinblastine)；鉑；鬼臼亞乙苷(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春花新堿(vincristine)；去甲長春花堿(vinorelbine)；長春瑞濱(navelbine)；novantrone；替尼泊苷(teniposide)；柔毛霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希羅達(dá)(xeloda)；伊班磷酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；以及任何以上物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。同樣包含在這個定義中的是調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，比如抗雌激素，包括例如三苯氧胺、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羥基黛莫芬(hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬鹽酸鹽(keoxifene)、LY117018、歐那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素比如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任意物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。
″抗炎藥物″用于本文包括但不限于非類固醇抗炎藥物和皮質(zhì)類固醇，如倍他米松(betamethasone)?？煞謩e參見The Merck Manual of Diagnosis andTherapy(15版，Berkow et al.Eds.，1987，Rahway，N.J.)p2499-2506和p46-49。
B.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及利用制劑向細(xì)胞遞送多核苷酸(包括寡核苷酸)的方法，所述制劑能夠提高靶生物膜的通透性，從而使得多核苷酸能夠跨越該生物膜。這些方法和制劑可以用于許多目的中多核苷酸(包括寡核苷酸)的遞送，包括但不限于，用于基因表達(dá)的調(diào)控。尤其是，本發(fā)明涵蓋含有雙鏈寡核苷酸分子的制劑。
本發(fā)明的制劑包括，但不限于膠、溶液、乳劑和含有脂質(zhì)體的制劑。
本發(fā)明的一個方面，所述制劑包括一或多種滲透增強(qiáng)劑以便協(xié)助多核苷酸(包括寡核苷酸)跨生物膜運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞內(nèi)。
本發(fā)明一些實施方案提供了這樣的制劑，其含有一或多種多核苷酸與其他藥物活性成分組合在一起，比如例如，一或多種化療劑和/或抗炎藥物。
在另一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明的制劑可以含有針對轉(zhuǎn)錄因子的一或多種寡核苷酸，尤其是雙鏈寡核苷酸誘騙物分子。誘騙物分子的大量例子是本領(lǐng)域已知的。
劑量取決于根據(jù)待治療疾病的嚴(yán)重性和對藥物的反應(yīng)性，治療過程持續(xù)幾天到數(shù)月，或者直至病愈或病況好轉(zhuǎn)。最佳劑量安排可以從藥物在患者體內(nèi)累積的測定值計算得到。普通技術(shù)人員可以容易地確定最佳劑量、給藥方法學(xué)和重復(fù)率。根據(jù)各個寡核苷酸的相對效力，最佳劑量可能有所變化。一般來說，劑量是每公斤體重0.01μg到100g，每天、每周、每月或每年給予一或多次，甚至每2到20年給予1次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)測定到的藥物在體液或組織中存留的時間和濃度很容易地估計出給藥重復(fù)率。
滲透增強(qiáng)劑(penetration enhancer)本發(fā)明應(yīng)用滲透增強(qiáng)劑來影響多核苷酸，尤其是寡核苷酸(比如雙鏈寡脫氧核苷酸)經(jīng)動物皮膚的遞送效率，所述動物是比如包括人在內(nèi)的哺乳動物。滲透增強(qiáng)劑是本領(lǐng)域熟知的，可以劃歸5個大類，即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合性非表面活性劑之一(Lee et al.，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92)。以上提到的滲透增強(qiáng)劑種類在下文有更詳細(xì)的描述。
表面活性劑表面活性劑(Surfactants或″surface-active agents″)是這樣一些化學(xué)實體，當(dāng)溶于水溶液時能使溶液的表面張力或水溶液和另一種液體之間的臨界面張力降低，這樣就導(dǎo)致寡核苷酸經(jīng)生物膜的吸收被提高。除了膽汁鹽和脂肪酸，這類滲透增強(qiáng)劑包括例如，月桂基硫酸鈉、月桂醇醚硫酸鈉、N-月桂酰肌氨酸、失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)、十四烷酸異丙酯、聚氧化乙烯-9-月桂基乙醚和聚氧化乙烯-20-十六烷基乙醚(Leeet al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92)；以及全氟化化合物乳劑，比如FC-43(Takahashi et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1988，40，252)。
表面活性劑廣泛應(yīng)用于制劑中比如溶膠(包括微乳)和脂質(zhì)體。對大量不同種類天然和合成表面活性劑進(jìn)行分類和特性分級的最常用方法是采用親水/親脂平衡值(HLB)。親水基團(tuán)(又稱為“頭部”)的特性是對制劑中使用的不同表面活性劑進(jìn)行分類的最有用手段(Rieger，in Pharmaceutical DosageForms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p285)。
如果表面活性劑分子沒有離子化，它就劃分為非離子表面活性劑。非離子表面活性劑在藥物和化妝產(chǎn)品中有廣泛應(yīng)用，它們可以在很寬的pH值范圍內(nèi)使用。通常根據(jù)其結(jié)構(gòu)，它們的HLB值處于2到約18。非離子表面活性劑包括非離子酯類，比如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、山梨聚糖酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非離子烷醇酰胺和乙醚比如乙氧基脂肪醇、丙氧基醇和乙氧基/丙氧基嵌段共聚物也包含在這一類中。聚氧乙烯表面活性劑是非離子表面活性劑這一類中最受歡迎的成員。
在溶于或分散于水中時，表面活性劑分子如果攜帶負(fù)電荷，該表面活性劑劃分為陰離子型。陰離子表面活性劑包括羧基鹽比如肥皂、?；轷｛}、氨基酸的酰胺物、硫酸酯類比如烷基硫酸鹽和乙氧基化的烷基硫酸鹽、磺酸鹽比如烷基苯磺酸鹽、?；u乙基磺酸鹽、酰基?；撬猁}和磺基琥珀酸鹽以及磷酸鹽。陰離子表面活性劑的最重要成員是烷基硫酸鹽和肥皂。
在溶于或分散于水中時，表面活性劑分子如果攜帶正電荷，該表面活性劑劃分為陽離子型。陽離子表面活性劑包括季胺鹽和乙氧化胺。季胺鹽是這類中最常用的。
如果表面活性劑分子既能攜帶陽離子，也可攜帶陰離子，該表面活性劑就是兩性的。兩性表面活性劑包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜堿和磷脂。
表面活性劑在藥物制品、制劑和乳劑中的應(yīng)用已有綜述(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p285)。
脂肪酸可以用做滲透增強(qiáng)劑的各種脂肪酸包括例如，油酸、月桂酸、癸酸(n-癸酸)、豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯(dicaprate)、三癸酸(tricaprate)、油酸單甘油酯(1-單油酰-rac-甘油)、二月桂酸甘油酯(dilaurin)、辛酸、花生四烯酸、甘油1-單癸酸酯、1-dodecylazacycloheptan-2-one、?；鈮A(acylcarnitines)、?；憠A、其1-10碳烷基酯(例如甲基、異丙基和t-丁基)，及其單-和二甘油酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞油酸酯等)(Lee et al.，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92；Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；El Hariri et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)。
膽汁鹽膽汁的生理學(xué)作用包括促進(jìn)脂肪和脂溶性維生素的分散和吸收(Brunton，Chapter 38 inGoodman & Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，9th Ed.，Hardman et al.Eds.，McGraw-Hill，New York，1996，p934-935)。各種天然膽汁鹽及其合成衍生物可以作為滲透增強(qiáng)劑。因此名詞″膽汁鹽″包括膽汁的所有天然成分以及它們的合成衍生物。本發(fā)明的膽汁鹽包括例如，膽酸(或其可藥用鈉鹽膽酸鈉)、脫氫膽酸(脫氫膽酸鈉)、脫氧膽酸(脫氧膽酸鈉)、glucholic acid(sodium glucholate)、乙醇酸(乙醇酸鈉)、甘氨脫氧膽酸(甘氨脫氧膽酸鈉)、?；悄懰??；悄懰徕c)、牛磺脫氧膽酸(?；敲撗跄懰徕c)、鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid)(鵝脫氧膽酸鈉)、熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid)(UDCA)、牛-24，25-二氫-梭鏈孢酸鈉(sodiumtauro-24，25-dihydro-fusidate(STDHF))、甘氨二氫梭鏈孢酸鈉(sodiumglycodihydrofusidate)和聚氧化乙烯-9-月桂基乙醚(polyoxyethylene-9-laurylether(POE))(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92；Swinyard，Chapter 39 InRemington′s Pharmaceutical Sciences，18thEd.，Gennaro Eds.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990，p782-783；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Yamamoto et al.，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25；Yamashita et al.，J.Pharm.Sci.，1990，79，579-583)。
螯合劑螯合劑在用于本發(fā)明時，可以定義為這樣的化合物，它們能夠通過與金屬離子形成復(fù)合物而將之從溶液中去除，從而使得寡核苷酸經(jīng)生物膜的吸收增強(qiáng)。就在本發(fā)明中作為滲透增強(qiáng)劑而言，螯合劑另外還有可以作為DNase抑制劑的優(yōu)點，因為多數(shù)已有研究的DNA核酸酶的催化都需要二價金屬離子，所以會被螯合劑抑制(Jarrett，J.Chromatogr.，1993，618，315-339)。本發(fā)明的螯合劑包括但不限于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉、5-甲氧水楊酸鹽和高香草酸鹽)、膠原蛋白的N-?；苌?、laureth-9和β-二酮(烯胺)的N-氨?；苌?Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Buur et al.，J.Control Rel.，1990，14，43-51).
非螯合非表面活性劑用在本文，非螯合非表面活性劑滲透增強(qiáng)化合物可以定義為這樣的化合物，它們沒有明顯的螯合劑或表面活性劑活性，但是卻能增強(qiáng)寡核苷酸經(jīng)生物膜的吸收(Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33)。這類滲透增強(qiáng)劑包括，例如不飽和環(huán)脲、1-烷基-和1-alkenylazacyclo-烷酮衍生物(Lee et al.，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92)；以及非類固醇抗炎藥物比如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛(indomethacin)和苯丁唑啉(phenylbutazone)(Yamashita et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1987，39，621-626)。
還可以在發(fā)明所述制劑中加入能夠增強(qiáng)寡核苷酸細(xì)胞水平的吸收的試劑。例如，陽離子脂質(zhì)，比如陽離子脂質(zhì)體(lipofectin)(Junichiet al.，美國專利5,705,188)、陽離子甘油衍生物和多聚陰離子分子，比如聚賴氨酸(Lollo etal.，PCT申請WO 97/30731)，也顯示出增強(qiáng)寡核苷酸的細(xì)胞吸收的活性。
其他可以用于所給予寡核苷酸的促滲透試劑包括甘醇(比如乙二醇和丙二醇)、吡咯(比如2-吡咯)、azones和萜(比如檸檬烯和薄荷酮)。
本發(fā)明涉及向細(xì)胞遞送核酸分子(包括多核苷酸和寡核苷酸)的方法和制劑，其包含使生物膜與含有至少一種滲透增強(qiáng)劑的制劑進(jìn)行接觸。在一實施方案中，所述滲透增強(qiáng)劑是陰離子表面活性劑。一實施方案中，該陰離子表面活性劑是烷基硫酸鹽或月桂基硫酸鹽。另一實施方案中，該陰離子表面活性劑是烷基乙醚硫酸鹽或月桂醇醚硫酸鈉。在一實施方案中，所述制劑包含至少兩種滲透增強(qiáng)劑，其中的滲透增強(qiáng)劑是N-月桂酰肌氨酸和失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)。另一實施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含十四烷酸異丙酯。
載體(carrier)本發(fā)明的一些組合物還在制劑中加入了載體。用在本文中″載體化合物″或″載體″可以例如是指一種核酸或其類似物，它是惰性的(即其本身沒有生物活性)，但會被那些能減少核酸的生物可得性的體內(nèi)過程(例如降解有生物學(xué)活性的核酸或者促進(jìn)其從循環(huán)系統(tǒng)的去除)認(rèn)為是核酸。將本發(fā)明的多核苷酸與載體化合物一起給藥，通常情況下要使用過量的后者，會使得肝、腎或其他循環(huán)外儲存器吸收的多核苷酸量大大減少，猜測這是由于載體化合物和核酸競爭同一受體造成的。例如，如果與多聚肌苷酸、葡聚糖硫酸鹽、多聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4′-異硫氰-茋-2，2′-二磺酸一起給藥時，部分硫代磷酸酯化的寡核苷酸在肝組織中的吸收會下降(Miyao et al.，Antisense Res.Dev.，1995，5，115-121；Takakura et al.，Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.，1996，6，177-183)。
賦形劑(excipient)與載體化合物不同，″可藥用載體″或″賦形劑″是指可藥用溶劑、懸浮劑或其他任何用于向動物遞送一或多種核酸的藥理學(xué)上惰性的傳遞媒介。賦形劑可以是液體或固體，在選擇時要考慮到計劃的給藥方式，從而能夠在與核酸以及指定藥物組合物的其他成分組合時，提供所需要的體積、密度等。典型的可藥用載體包括，但不限于粘合劑(例如，預(yù)凝膠化糯玉米淀粉(maize starch)、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填充劑(例如，乳糖和其他糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、硅石、膠體二氧化硅、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米淀粉(corn starch)、聚乙二醇、苯甲酸鈉、醋酸鈉等)；崩解劑(例如淀粉、羧乙酸淀粉鈉等)；和潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉等)。
適用于非親代給藥的可藥用有機(jī)或無機(jī)賦形劑也可以用來配制發(fā)明所述組合物，這些賦形劑不會與核酸發(fā)生有害反應(yīng)。合適的可藥用載體包括，但不限于水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
其他成分本發(fā)明所述制劑可以另外含有其他藥物組合物中常見的輔助成分，參照技術(shù)領(lǐng)域已知用量使用。因此，例如所述制劑可以另外含有相容的藥物活性物質(zhì)，比如例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑；或者可以另外含有用于配制發(fā)明所述組合物的各種劑量形式的物質(zhì)，比如染料、增味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。但是，加入這些物質(zhì)時，它們不能不適當(dāng)?shù)赜绊懓l(fā)明所述制劑之成分的生物活性。可以將制劑滅菌，如果需要還可以與不會與制劑中的寡核苷酸進(jìn)行有害反應(yīng)的輔劑混合，例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透亞的鹽、緩沖液、增色劑、增味劑和/或香料等。
水性制劑(aqueous formulation)本發(fā)明的制劑可以制備成水性膠、水性溶液或水性懸浮液。
發(fā)明的一個方面，本發(fā)明所述用于向細(xì)胞遞送多核苷酸的水性制劑包括至少一種滲透增強(qiáng)劑，其總重量濃度約0.2％到10％，以及重量濃度約1％到60％的醇。在一實施方案中，所述多核苷酸是寡核苷酸。
在另一實施方案中，水性制劑中滲透增強(qiáng)劑的重量濃度約0.8％。用于本發(fā)明的各種滲透增強(qiáng)劑是本領(lǐng)域所熟知的。
在另一實施方案中，水性制劑中醇的重量濃度可以在約5％到50％的范圍內(nèi)。一實施方案中，所述醇是乙醇。
再一實施方案中，所述水性制劑是基于凝膠的水性制劑。在一實施方案中，所述基于凝膠的水性制劑包含重量濃度約0.8％的月桂醇醚硫酸鈉。另一實施方案中，所述基于凝膠的水性制劑進(jìn)一步包含重量濃度約1％、5％、10％、20％或49％的乙醇。
在一實施方案中，本發(fā)明的基于凝膠的水性制劑粘度足以形成粘膠。另一實施方案中，該基于凝膠的水性制劑中的滲透增強(qiáng)劑是月桂醇醚硫酸鈉，醇是乙醇。再一實施方案中，該基于凝膠的水性制劑包含重量濃度約0.8％的月桂醇醚硫酸鈉和約49％的乙醇。另一實施方案中，所述基于凝膠的水性制劑還含有另外的可藥用的非活性物質(zhì)，比如羥丙基甲基纖維素-4000 (HPMC 4000)和/或氯化鎂。
在另一實施方案中，所述基于凝膠的水性制劑進(jìn)一步包含1-苯基哌嗪。
水溶膠制劑中采用的非活性成分的最佳用量可以根據(jù)具體的活性藥物和預(yù)期用途來決定。
水懸浮液可以另外或替代地含有能增加懸浮液粘度的物質(zhì)，這類物質(zhì)包括例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或萄聚糖。所述懸浮液還可以含有穩(wěn)定劑。
基于乳劑的制劑(emulsion-based formulation)本發(fā)明的制劑可以制備成乳劑。典型的乳劑是一種液體以通常直徑超過0.1μm的小滴的形式分散在另一種液體中所形成的異源體系(Idson，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p199；Rosoff in PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.2，p335；Higuchi et al.，in Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1985，p301)。乳劑通常是包含兩個不可混合液相的兩相體系，這兩個液相密切混合和分散的。一般來說，乳劑或是油包水(w/o)或是水包油(o/w)類型。水相細(xì)致地分解成微小液滴并分散到很大體積的油相中時所產(chǎn)生的組合物稱為油包水(w/o)乳劑。替代地，如果油相分解成微小液滴并擴(kuò)散到大體積水相，產(chǎn)生的組合物稱為水包油(o/w)乳劑。除了擴(kuò)散相和活性藥物，乳劑還可以含有其他成分，其中活性藥物可能是以水相、油相中的溶液形式存在，或者本身自成一相。如果需要，乳劑中還可以有可藥用賦形劑，比如乳化劑、穩(wěn)定劑、染料和抗氧化劑?？伤幱萌閯┻€可以是多重乳劑，包含兩個以上的液相，比如例如oil油-水-油(o/w/o)和水-油-水(w/o/w)乳劑。這類復(fù)合制劑通常具有一些簡單的兩相乳劑所沒有的優(yōu)勢。o/w乳劑中的單個油滴包裹著小的水滴就構(gòu)成w/o/w乳劑。類似地，如果油滴被油液中穩(wěn)定存在的水珠包裹著所構(gòu)成的體系就是o/w/o乳劑。
乳劑特性在于有很少或沒有熱動力學(xué)穩(wěn)定性。通常，乳劑的分散或不連續(xù)相很好地分散到外相或連續(xù)相中，并且借助乳化劑或制劑的粘度而維持這種狀態(tài)。乳劑的液相可以是半固體或固體的，比如乳劑形式的軟膏基質(zhì)和霜就是這種情況。乳化劑可以大概分成4類合成表面活性劑、天然乳化劑、吸收基質(zhì)和超細(xì)分散固相(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p199)。
合成表面活性劑(surfactants)，又稱為表面活性劑(surface active agents)廣泛應(yīng)用于乳劑制劑，對此已有文獻(xiàn)綜述(Rieger，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，Vol.1，p285；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，Vol.1，p199)。表面活性劑通常是兩親性的，包含親水部分和疏水部分。表面活性劑親水部分與疏水部分的比率被稱為親水/親脂平衡值(HLB)，是對表面活性劑進(jìn)行分類和選擇用于制備制劑的有用工具。表面活性劑根據(jù)其親水基團(tuán)可以分成不同種類非離子型、陰離子型、陽離子型和兼性型(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p285)。
用于乳劑制劑的天然乳劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂和金合歡膠。吸附基質(zhì)具有親水特性因此它們能夠吸收水分形成w/o乳劑，但仍保持它們的半固體稠度，比如無水羊毛脂和親水凡士林。顆粒極細(xì)的固體也可以是很好的乳化劑，尤其是與表面活性劑組合來用于粘性制備物中。這類乳化劑包括極性無機(jī)固體，比如重金屬氧化物、非膨潤性粘土比如皂土、凹凸棒粘土、水輝石(hectorite)、高嶺土、蒙脫石(montmorillonite)、膠體硅酸鋁和膠體硅酸鎂鋁、色素以及非極性固體比如碳或甘油三硬脂酸酯。
乳劑制劑中還包括許多影響乳劑特性的非乳化物質(zhì)。這些物質(zhì)包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、油酯、濕潤劑、親水膠體、防腐劑和抗氧化劑(Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.335；Idson，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。
親水膠體(Hydrophilic colloids或hydrocolloids)包括天然樹膠和合成多聚物比如多糖(例如金合歡膠、瓊脂、褐藻酸、角叉藻聚糖、瓜爾豆膠(guargum)、刺梧桐膠(karaya gum)和黃茋膠)、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羧丙基纖維素)以及合成多聚物(例如carbomers、纖維素醚和多聚羧乙烯)。這些物質(zhì)分散到水中或者在水中膨脹形成膠溶液，進(jìn)而通過在分散相液滴周圍形成強(qiáng)的界面膜以及增加外相粘度來穩(wěn)定乳劑。
因為乳劑經(jīng)常含有許多便于微生物生長的成分，比如碳水化合物、蛋白質(zhì)、固醇和磷脂，這類制劑常要加入防腐劑。乳劑制劑中常用的防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯(methyl paraben)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben)、季胺鹽、苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、對羥基苯甲酸和硼酸的酯類。乳劑制劑中也經(jīng)常加入抗氧化劑來防止制劑的變質(zhì)。常用抗氧化劑可以是自由基清除劑(比如生育酚、烷基沒食子酸鹽、丁化羥基苯甲醚、丁化羥基甲苯)，或者還原劑(比如抗壞血酸和焦亞硫酸鈉)，以及抗氧化增效劑(比如檸檬酸、酒石酸和卵磷脂)。
乳劑制劑的經(jīng)皮、口服以及親代途徑應(yīng)用和它們的制備方法已有綜述文獻(xiàn)(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。口服的乳劑制劑應(yīng)用很廣泛因為制劑方便、吸收效果和生物可得性方面的原因(Rosoff in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245；Idson，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。礦物油基質(zhì)緩瀉藥、脂溶維生素和高脂營養(yǎng)制是常見的以o/w乳劑形式經(jīng)口服給予的物質(zhì)中的例子。
本發(fā)明一實施方案中，遞送寡核苷酸的制劑制備成微乳液。
微乳液可以定義為水、油和親水脂分子體系，它是一個光學(xué)上各向同性的、熱動力學(xué)穩(wěn)定的液體溶液(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245)。制備典型的微乳液是首先將油分散到水表面活性劑溶液中，然后加入足夠量的第四種成分(通常是中等鏈成的醇)從而形成一個透明體系。因此，微乳液被描述為是兩種不相溶液體構(gòu)成的熱動力學(xué)穩(wěn)定、各向同性的清澈分散體系，其中這兩種液體借助表面活性分子的界面膜來穩(wěn)定(Leung and Shah，inControlled Release of DrugsPolymers and AggregateSystems，Rosoff，M.，Ed.，1989，VCH Publishers，New York，pages 185-215)。微乳液通常是將包括油、水、表面活性劑、共表面活性劑和電解質(zhì)的三到五種成分混合制備的。微乳液是油包水(w/o)或水包油(o/w)型取決于所用的油和表面活性劑的特性以及表面活性劑分子極性頭部和碳?xì)浠衔镂膊康慕Y(jié)構(gòu)和幾何排列方式(Schott，in Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1985，p.271)。
人們廣泛研究了采用相位圖進(jìn)行的現(xiàn)象學(xué)方法，獲取的大量知識可供本領(lǐng)域技術(shù)人員決定如何配制微乳液(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，volume 1，p.245；Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.335)。相較傳統(tǒng)的乳劑，微乳液的優(yōu)點在于使水不溶性的藥物能夠溶于自發(fā)形成的熱動力學(xué)液滴構(gòu)成的制劑中。
用于制備微乳液的表面活性劑包括，但不限于離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油單月桂酸酯(ML310)、四甘油單油酸酯(MO310)、六甘油單油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油單癸酸酯decaglycerol monocaprate(MCA750)、十甘油單油酸酯(MO750)、十甘油X油酸酯decaglycerolsequioleate(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，它們單獨或與共表面活性劑組合使用。共表面活性劑通常是能夠增加界面流動性的短鏈醇(比如乙醇、1-丙醇和1-丁醇)，因為它們能滲透到表面活性劑膜內(nèi)，由于表面活性劑分子間產(chǎn)生的空隙而形成無序的膜。
但是可以不使用共表面活性劑來制備微乳液，技術(shù)上已有無醇自乳化微乳液。本發(fā)明的一實施方案中，所制備的微乳液制劑沒有醇。
水相一般是，但不限于是水、藥物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、多聚甘油、丙二醇和乙二醇衍生物。油相包括，但不限于以下物質(zhì)，比如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中鏈(C8-C12)單、二和三甘油酯、聚氧乙烯化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化的甘油酯、飽和聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅酮油。
從藥物溶解性和促進(jìn)藥物吸收的角度考慮，人們對微乳液尤其感興趣。已有提議利用脂基微乳液(o/w和w/o)來增加包括肽在內(nèi)的藥物的口服生物可得性(Constantinides et al.，Pharmaceutical Research，1994，11，1385-1390；Ritschel，Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.，1993，13，205)。微乳液具備的優(yōu)點是能提高藥物溶解度、防止藥物被酶水解、由于表面活性劑導(dǎo)致的膜流動性和通透性的改變使得可能增加藥物吸收、易于制備、比固體劑型易于口服給藥、臨床藥效提高以及毒性降低(Constantinides et al.，PharmaceuticalResearch，1994，11，1385；Ho et al.，J.Pharm.Sci.，1996，85，138-143)。室溫將全部成分放在一起時，微乳液經(jīng)常能自發(fā)形成。這在配制不耐熱的藥物、肽或寡核苷酸時尤其有利。微乳液在化妝品和醫(yī)藥應(yīng)用中都能有效地透皮遞送活性成分。我們預(yù)期本發(fā)明的微乳液制劑能協(xié)助提高由腸胃道系統(tǒng)吸收寡核苷酸，以及增強(qiáng)腸胃道、陰道、口腔和其他給藥部位內(nèi)寡核苷酸的局部細(xì)胞攝取。
本發(fā)明的微乳液還可以含有其他成分和添加劑比如失水山梨醇單硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol以及滲透增強(qiáng)劑來改善制劑的特性，并促進(jìn)發(fā)明所述寡核苷酸的吸收。用于本發(fā)明所述微乳液的滲透增強(qiáng)劑可以劃歸5大類之一-表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑(Lee etal.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。這些種類在上文都已討論過。用于本發(fā)明的各種滲透增強(qiáng)劑是本領(lǐng)域熟知的。
發(fā)明的一實施方案中，所述基于乳劑的制劑包括一或多種滲透增強(qiáng)劑。在一實施方案中，該滲透增強(qiáng)劑是表面活性劑。在另一實施方案中，滲透增強(qiáng)劑可以選自月桂醇醚硫酸鈉、N-月桂酰肌氨酸、失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)和十四烷酸異丙酯。
基于乳劑的制劑中的滲透增強(qiáng)劑重量濃度可以在約0.2％到10％，或者約0.35％到0.8％。
本發(fā)明的一實施方案中，基于乳劑的制劑包含重量濃度約0.35％的月桂醇醚硫酸鈉。發(fā)明的另一實施方案中，基于乳劑的制劑包含重量濃度約0.8％的月桂醇醚硫酸鈉。再一實施方案中，所述基于乳劑的制劑包含重量濃度約0.4％的失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)和約0.6％的N-月桂酰肌氨酸。還有一實施方案中，該基于乳劑的制劑進(jìn)一步包含重量約10％的十四烷酸異丙酯。
在發(fā)明的另一實施方案中，所述基于乳劑的制劑還可以含有其他非藥物活性物質(zhì)，比如羥丙基甲基纖維素-4000(HPMC 4000)以及防腐劑，比如對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯。
發(fā)明的一實施方案中，所述基于乳劑的制劑進(jìn)一步包含1-苯基哌嗪。
含脂質(zhì)體的制劑除了微乳液，還有許多有序的表面活性劑結(jié)構(gòu)得到研究并被應(yīng)用于藥物制劑。它們包括單分子層、膠束、雙分子層和囊泡。人們對象脂質(zhì)體這類囊泡很感興趣，因為其特異性和從藥物遞送角度來說的藥效持續(xù)性。用于本發(fā)明時，名詞“脂質(zhì)體”表示處于球形雙分子層或雙分子層的兩親性脂構(gòu)成的囊泡。
脂質(zhì)體是這樣的單層或多層囊泡，其具有由親油性物質(zhì)形成的膜和水性內(nèi)部。水性部分含有要遞送的組合物。陽離子脂質(zhì)體的優(yōu)點是能與細(xì)胞壁融合。非陽離子脂質(zhì)體雖然不能很有效地與細(xì)胞壁融合，但能被體內(nèi)巨噬細(xì)胞攝取。
脂質(zhì)體的其他優(yōu)點還包括由天然磷脂得到的脂質(zhì)體是生物相容的和生物可降解的；脂質(zhì)體中可以引入大量水和脂溶性藥物；脂質(zhì)體可以使包裹在其內(nèi)部的藥物免于被代謝和降解(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，volume 1，p.245)。制備脂質(zhì)體制劑時需要重點考慮的是油脂表面電荷、囊泡大小以及脂質(zhì)體的水容積。
脂質(zhì)體可用來將活性成分轉(zhuǎn)移和遞送到它們的作用部位。由于脂質(zhì)體膜與生物膜結(jié)構(gòu)類似，將脂質(zhì)體供給組織時，脂質(zhì)體就會開始與細(xì)胞膜融合。隨著脂質(zhì)體與細(xì)胞的融合逐步進(jìn)行，脂質(zhì)體內(nèi)的物質(zhì)就會流入細(xì)胞，活性成分在此發(fā)揮作用。
脂質(zhì)體制劑以及許多藥物的遞送模式一直是許多研究項目的重心所在。越來越多的證據(jù)表明對于局部給藥來說，脂質(zhì)體比其他制劑形式更有優(yōu)勢。這些優(yōu)勢包括由于所給予的藥物的系統(tǒng)吸收高了，相關(guān)地副作用降低；藥物在目標(biāo)部位蓄積增加，以及能夠?qū)⒍喾N(親水性和疏水性)藥物給予皮內(nèi)。
有些報道描述了脂質(zhì)體能夠?qū)ǜ叻肿恿緿NA在內(nèi)的藥劑遞送到皮內(nèi)。包括止痛藥、抗生素、激素和高分子量DNA在內(nèi)的化合物都曾被給予皮膚。這些應(yīng)用多數(shù)實現(xiàn)了針對上表皮的定向。
脂質(zhì)體歸屬兩大類。陽離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，它們能與帶負(fù)電的DNA分子相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體。帶正電的DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體結(jié)合到帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面，并被內(nèi)在化到內(nèi)體中。內(nèi)體中的酸性pH使得脂質(zhì)體破裂，其內(nèi)部物質(zhì)被釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(Wang et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1987，147，980-985)。
pH-敏感或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體會截留DNA，而不是和它形成復(fù)合體。因為DNA和脂類帶電荷類似，它們之間會發(fā)生排斥而非形成復(fù)合體。但是，一些DNA會被截留到脂質(zhì)體的水性內(nèi)部。已有人用pH-敏感的脂質(zhì)體來將編碼胸苷激酶基因的DNA遞送給培養(yǎng)物中的單層細(xì)胞。在靶細(xì)胞中檢測到了該外源基因的表達(dá)(Zhou et al.，Journal of Controlled Release，1992，19，269-274)。
一類主要的脂質(zhì)組合物包括除了天然獲得的磷脂酰膽堿之外的磷脂。例如可以由二豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)或二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)形成中性脂質(zhì)組合物。陰離子脂質(zhì)組合物通常是由二豆蔻酰磷脂酰甘油形成的，而陰離子膜融合脂質(zhì)體主要是由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成的。另一類脂質(zhì)組合物是由磷脂酰膽堿(PC)(比如大豆PC和卵PC)形成的。還有一類是由磷脂和/或磷脂酰膽堿和/或膽固醇的混合物形成的。
有些研究對局部遞送脂質(zhì)藥物制劑到皮膚進(jìn)行了評價。在豚鼠皮膚敷上含有干擾素的脂質(zhì)體導(dǎo)致皮膚皰疹裂口減少，而經(jīng)其他方式(例如做成溶液或乳液)遞送干擾素?zé)o效(Weiner et al.，Journal of Drug Targeting，1992，2，405-410)。此外，另一項研究檢測了將干擾素作為脂質(zhì)制劑的一部分來給藥，和用水性體系給予干擾素的效力，得到的結(jié)論是脂質(zhì)體制劑優(yōu)于水性給藥方式(du Plessis et al.，Antiviral Research，1992，18，259-265)。
非離子型脂質(zhì)系統(tǒng)，特別是包含非離子型表面活性劑和膽固醇的系統(tǒng)也受到檢驗以便確定它們在給皮膚遞送藥物方面的用途。有人用包含NOVASOME(甘油二月桂酸酯/膽固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚和甘油二硬脂酸酯/膽固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚)的非離子型脂質(zhì)制劑將環(huán)孢菌素-A遞送到小鼠皮膚真皮。結(jié)果表明這類非離子型脂質(zhì)系統(tǒng)能夠有效地促進(jìn)環(huán)孢菌素沉積到皮膚的不同層中(Hu et al.S.T.P.Pharma.Sci.，1994，4，6，466)。
有些脂質(zhì)體包含的脂類上衍生出一或多個親水多聚體，許多這類脂質(zhì)體及其制備方法是本領(lǐng)域已知的。Sunamoto et al.(Bull.Chem.Soc.Jpn.，1980，53，2768)描述了包含一種非離子型去污劑的脂質(zhì)體，該去污劑含有PEG部分。Illum et al.(FEBS Lett.，1984，167，79)提到用聚乙二醇對聚苯乙烯顆粒進(jìn)行親水包被導(dǎo)致其在血液中的半衰期顯著提高。Sears(美國專利4,426,330和4,534,899)描述了通過連接聚亞烴基二醇(例如PEG)的羧基基團(tuán)被修飾的合成磷脂。Klibanov et al.(FEBS Lett.，1990，268，235)描述的實驗顯示包含衍生了PEG或PEG硬脂酸酯的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂質(zhì)體在血循環(huán)系統(tǒng)中半衰期明顯延長。Blume et al.(Biochimica et Biophysica Acta，1990，1029，91)將這些觀察結(jié)果推廣了到其他PEG-衍生化的磷脂中，例如DSPE-PEG，它是由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG組合形成的。授予Fisher的歐洲專利EP 0 445 131 B1和WO 90/04384描述了其外表面帶有共價結(jié)合的PEG部分的脂質(zhì)體。Woodle et al.(美國專利5,013,556和5,356,633)和Martin et al.(美國專利5,213,804和歐洲專利EP 0 496 813 B1)描述了一些脂質(zhì)體組合物及其使用方法，這些組合物含有1-20摩爾百分比的PE發(fā)生了PEG衍生化。WO 91/05545和美國專利5,225,212(都是授予Martin et al.)以及WO94/20073(Zalipsky et al.)公開了包含許多其他脂類-多聚體偶聯(lián)物的脂質(zhì)體。包含PEG修飾的神經(jīng)酰胺脂類的脂質(zhì)體在WO 96/10391(Choi et al.)中有描述。美國專利5,540,935(Miyazaki et al.)和5,556,948(Tagawa et al.)描述了含有PEG的脂質(zhì)體，可以進(jìn)一步在它們的表面衍生出功能部分。
本領(lǐng)域已知的包含核酸的脂質(zhì)體很少。授予Thierry et al.的WO96/40062公開了在脂質(zhì)體中包裹大分子量核酸的方法。授予Tagawa等的美國專利5,264,221公開了結(jié)合蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體，并且宣稱這些脂質(zhì)體的內(nèi)容物可以包括反義RNA。授予Rahman的美國專利5,665,710描述了一些在脂質(zhì)體內(nèi)包裹寡脫氧核苷酸的方法。授予Love等的WO 97/04787公開的脂質(zhì)體中包含了定向到raf基因的反義寡核苷酸。
傳遞體(transfersome)是另外一類脂質(zhì)體，作為形狀高度可變的脂類聚集體，它們是一種很有吸引力的可能用于藥物遞送的載體。傳遞體可以描述為這樣的脂類液滴，因為有高度變形能力，它們能很容易地滲透到比液滴小的孔中。傳遞體能適應(yīng)它的使用環(huán)境，例如它們能自優(yōu)化(適應(yīng)皮膚上的孔的形狀)、自身修復(fù)、經(jīng)常無須分裂就能到達(dá)目標(biāo)、以及經(jīng)常自組裝。要制備傳遞體，可以向標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)組合物中加入表面膜軟化劑(通常是表面活性劑)。傳遞體已被用于向皮膚遞送血清清蛋白。傳遞體介導(dǎo)的血清清蛋白的遞送已被證實與皮下注射含有血清清蛋白的溶液一樣有效。
本發(fā)明的一個方面，所述含脂質(zhì)體制劑包括一或多種滲透增強(qiáng)劑和醇。用于本發(fā)明的各種滲透增強(qiáng)劑是本領(lǐng)域熟知的。在一實施方案中，該滲透增強(qiáng)劑是表面活性劑。還有一實施方案中，滲透增強(qiáng)劑可以選自月桂醇醚硫酸鈉、N-月桂酰肌氨酸、失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)和磷脂酰膽堿(phospholipon 90-H)。
在一實施方案中，所述含脂質(zhì)體制劑中的滲透增強(qiáng)劑的重量濃度可以在約0.2％到10％的范圍，或者約0.4％到0.8％。
另一實施方案中，含脂質(zhì)體制劑中的醇的重量濃度在約1％到60％的范圍，或者約2.5％到10％。在一實施方案中，所述醇是乙醇。
本發(fā)明的一實施方案中，含脂質(zhì)體制劑包含重量濃度約2.5％的乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，所述含脂質(zhì)體制劑包含重量濃度約5％的乙醇。發(fā)明再一方面，該含脂質(zhì)體制劑包含重量濃度約10％的乙醇。本發(fā)明還有一實施方案中，含脂質(zhì)體制劑包含重量濃度約0.8％的月桂醇醚硫酸鈉和重量約2.5％、5％或10％的乙醇。在一實施方案中，含脂質(zhì)體制劑包含重量約0.4％的失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)、重量約0.6％的N-月桂酰肌酸和重量約5％的乙醇。還有一實施方案中，該含脂質(zhì)體制劑包含重量約10％的磷脂酰膽堿(phospholipon 90-H)。
發(fā)明的另一個方面，該含脂質(zhì)體制劑進(jìn)一步包含丙二醇。
本發(fā)明的再一個方面，所述含脂質(zhì)體制劑還可以含有其他非活性物質(zhì)，比如緩沖液、增稠劑和防腐劑。
給藥方式本發(fā)明所述制劑的給藥方式可以是局部(包括眼和粘膜(包括口腔、陰道和直腸)遞送)、肺部(例如通過吸入或吹入粉末或者氣霧劑，包括利用噴霧器)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮、透皮或口服。
用于局部、口服、親代、鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥的制劑包括，但不限于透皮膜片、軟膏、洗液(lotion)、霜(cream)、膠、滴液、栓劑、噴霧、液體、懸浮液或水溶液或者非水性介質(zhì)、膠囊、香囊或藥片。
本發(fā)明的一實施方案中，核酸是經(jīng)直腸方式進(jìn)行給藥的。具體來說，用于直腸給藥的組合物包括溶液(灌腸劑)、乳劑和栓劑。當(dāng)使用的是常見基質(zhì)可可油時，成人用的直腸栓劑通常在一端或兩端逐漸變細(xì)，一般每個重約2g，而嬰兒直腸栓劑通常是這個的一半重(Block，Chapter 87 InRemington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Gennaro，Eds.，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，1990)。
使用促吸收佐劑來改變直腸膜的屏障作用是本領(lǐng)域已知的，并且已有綜述(Nishihata and Rytting，Advanced Drug Delivery Reviews，1997，28，205)。促吸收佐劑顯示出在影響那些吸收不好的藥物制劑(比如稍大的水溶性藥物和肽)發(fā)揮藥效方面有很好的應(yīng)用前景。氨基酸的烯胺衍生物表現(xiàn)出促吸收特性，但是其提高直腸吸收能力的機(jī)制還不清楚。有人證實一些化合物比如螯合劑和巰基去除劑能夠提高藥物經(jīng)旁細(xì)胞途徑和穿細(xì)胞途徑的直腸吸收。水楊酸鹽及其衍生物也能提高藥物經(jīng)旁細(xì)胞和穿細(xì)胞途徑的直腸吸收。脂肪酸在通過藥物的直腸吸收方面顯示出與水楊酸鹽類似的性質(zhì)。凝集素也能借助誘導(dǎo)微絨毛融合來提高藥物的直腸吸收。
發(fā)明的另一實施方案中，一或多個核酸是經(jīng)口遞送進(jìn)行給藥的。
經(jīng)口給藥的組合物包括粉末或顆粒、懸浮液或者水或其他非水介質(zhì)溶液、膠囊、袋劑、錠劑、片劑或SECs(軟彈性膠囊或″囊形片劑″)?？梢愿鶕?jù)需要給這些制劑中加入增稠劑、調(diào)味劑、稀釋液、乳化劑、分散劑、載體物質(zhì)或粘合劑。片劑可以通過擠壓或壓模來制備，任選有一或多種附屬成分。擠壓片劑可以通過將處于自由流動形式的活性成分，任選與粘合劑(PVP或樹膠比如西黃蓍膠、金合歡膠、角叉藻聚糖)、潤滑劑(例如硬脂酸鹽比如硬脂酸鎂)、滑動劑(滑石、膠體二氧化硅)、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑混合在一起，在一個合適的機(jī)器內(nèi)進(jìn)行擠壓來制備。優(yōu)選的粘合劑/崩解劑包括EMDEX(dextrate)、PRECIROL(甘油三酯)、PEG和AVICEL(纖維素)。壓模片劑可以通過將用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末化化合物混合物壓模來制備。片劑任選有包衣或者是劃痕片，并且可以配制成能夠緩慢或控制釋放其中的活性成分。
利用這類制劑可以將核酸遞送到消化道與那里的粘膜接觸。相應(yīng)地，這類制劑可以含有這樣的腸道物質(zhì)，該物質(zhì)能有效保護(hù)核酸免于胃部極端pH影響，或者控制核酸的逐漸釋放從而優(yōu)化將所述核酸遞送到特定粘膜部位。用于耐酸片劑、膠囊和囊狀片劑的腸道物質(zhì)是本領(lǐng)域已知的，通常包括醋酸鄰苯二甲酸、丙二醇、失水山梨醇單油酸酯、鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、醋酸纖維素、偏苯三酸醋酸纖維素(cellulose acetate trimellitate)和羥丙甲纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP)。腸道物質(zhì)可以加入劑量形式或者作為覆蓋片劑、膠囊或囊狀片劑整個表面的包被。腸道物質(zhì)還可以伴有增塑劑，后者可以賦予腸道物質(zhì)柔性復(fù)原能力來防止例如片劑固化或熟化過程中發(fā)生破碎。增塑劑是本領(lǐng)域已知的，通常包括鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、三乙酰甘油酯、二丁基癸二酸鹽(DBS)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和檸檬酸三乙酯(TEC)。
制備用于消化道遞送的制劑的各種方法是本領(lǐng)域公知的。一般可參見Naim，Chapter 83；Block，Chapter 87；Rudnic et al.，Chapter 89；Porter，Chapter90；以及Longer et al.，Chapter 91，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEd.，Gennaro，Eds.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990。本發(fā)明中描述的寡核苷酸可以以已知方式，利用惰性無毒的可藥用賦形劑或溶劑來配制成常規(guī)制劑，比如片劑、有衣片劑、藥丸、顆粒、膠囊、氣霧劑、糖漿、膠、乳劑、懸浮液和溶液。在以上各種情況中，藥物活性寡核苷酸的濃度應(yīng)該是全部混合物重量的約0.1％到0.5％，就是說其量足夠達(dá)到標(biāo)明的劑量范圍。組合物可以根據(jù)情況用另外的可藥用載體或賦形劑，通過傳統(tǒng)方式來配制。因此，組合物可以通過傳統(tǒng)方式，用載體或賦形劑來配制，所述載體或賦形劑是比如粘合劑(例如預(yù)先明膠化的粘玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙甲纖維素)、填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或硅)、崩解劑(例如淀粉或羧乙酸淀粉鈉)或潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域公知的方法將片劑包被。產(chǎn)品根據(jù)情況還可以含有調(diào)味劑、著色劑和/或甜味劑。
用于口服遞送的膠囊可以包括本領(lǐng)域所熟知的配方。另外，Digenis等(美國專利5,672,359)描述的具有控制性釋放特性的多隔間硬膠囊，以及Amidon等(美國專利5,674,530)描述的有多級藥物遞送系統(tǒng)的水通透性膠囊也可以用來配制本發(fā)明所述組合物。
我們認(rèn)為本發(fā)明藥物組合物的配制及其后給藥是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
一般用于治療目的時，按照本發(fā)明將一或多種核酸(包括寡核苷酸)用可藥用載體給予染有或易染某種疾病或紊亂的患者。根據(jù)病人的年齡和所治療的紊亂或病況的嚴(yán)重性，其劑量在每公斤體重0.01μg到100g。此外，根據(jù)具體疾病或紊亂的特點、其嚴(yán)重性和患者整體情況，治療療程可以持續(xù)一段時間，用藥可以從每天一次延長到每20年一次。在本發(fā)明的語境中，名詞″治療療程″涵蓋治療、緩解和預(yù)防等形式。治療之后，對患者的狀態(tài)變化，以及紊亂或病況癥狀的減輕進(jìn)行監(jiān)測。如果患者對現(xiàn)有劑量沒有產(chǎn)生明顯的反應(yīng)，可以將核酸的劑量提高；或者如果觀察到紊亂或病況癥狀減輕，或者紊亂或病況消退，可以減少劑量。
劑量取決于待治療病況的嚴(yán)重性和反應(yīng)性，治療過程可以持續(xù)幾天到幾個月，或者直至治愈或達(dá)到病況減輕。最佳劑量方案可以由測量藥物在患者體內(nèi)的累積計算得到。普通技術(shù)人員可以很容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)頻率。根據(jù)各個寡核苷酸的相對效力，其最佳劑量可能有變化，通常可以基于在動物模型體外和體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有效的EC.sub.50數(shù)值來估計。一般來說，劑量在每公斤體重0.01mu.g to 100g，可以每天、每周、每月或每年給予一或多次，甚至每2到20年給一次。采用最佳給藥方案經(jīng)特定給藥模式來遞送治療有效量的核酸。
名詞″治療有效量″用于本發(fā)明，是指含核酸的制劑的量，能有效地實現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)，而沒有不好的副作用(比如毒性、不適或過敏反應(yīng))。雖然個體需求會有不同，確定制劑有效量的最佳范圍是本領(lǐng)域已有技術(shù)。根據(jù)動物研究可以推斷人的劑量(Katocs et al.，Chapter 27 InRemington′s PharmaceuticalSciences，18th Ed.，Gennaro，Eds.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990)。通常能夠提供有效量制劑的劑量(可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員調(diào)整)會隨接受者的年齡、健康、身體狀況、體重、疾病或紊亂的類型和程度，治療頻率、同步治療(如果有的話)的特性以及預(yù)期療效的性質(zhì)和范圍而變(Nies et al.，Chapter 3 InGoodman & Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，9th Ed.，Hardman et al.，Eds.，McGraw-Hill，New York，N.Y.，1996)。
治療成功后，可能希望患者進(jìn)行維持治療以便防止病況的復(fù)發(fā)。在這種維持治療中給予維持劑量的核酸，每公斤體重0.01μg到100g，每天一或多次，至20年一次。例如，在個體已知或懷疑容易發(fā)生自身免疫或炎癥狀況的情況下，可以通過給予預(yù)防劑量(每公斤體重0.01μg到100g，每天一或多次，至20年一次)來達(dá)到預(yù)防的效果。類似地，可以使個體對由一些醫(yī)學(xué)治療所導(dǎo)致可能發(fā)生的炎癥的易感性降低，例如給個體移植細(xì)胞、組織或器官導(dǎo)致的移植物抗宿主病。
用于非親代遞送核酸的制劑可以包括滅菌和沒有滅菌的水性溶液、溶于常見溶劑比如醇中的非水性溶液、或者所述核酸在液體或固體油基質(zhì)中的溶液。溶液還可以含有緩沖液、稀釋劑和其他合適的添加劑?？梢允褂貌粫c核酸發(fā)生有害反應(yīng)，適用于非親代給藥的可藥用有機(jī)或無機(jī)載體物質(zhì)。合適的可藥用載體包括，但不限于水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。如果需要可以將制劑滅菌，并混合那些不會與制劑中的核酸發(fā)生有害反應(yīng)的佐劑，例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖液、著色劑、增味劑和/或香料等。
可藥用制劑可以按照醫(yī)藥業(yè)熟知的傳統(tǒng)技術(shù)制備成方便的單位劑量形式。這類技術(shù)包括將活性成分與可藥用載體或賦形劑放到一起的步驟。通常制劑的制備是通過使活性成分與液態(tài)載體或精細(xì)粉碎的固態(tài)載體或者兩者均一地密切地混在一起，然后根據(jù)需要使產(chǎn)品成型。
還可以依照本發(fā)明采用寡核苷酸和其他核酸的許多生物等同體。因此本發(fā)明也涵蓋了寡核苷酸和核酸等同體，比如但不限于，寡核苷酸和核酸的前藥、刪除衍生物、寡核苷酸的偶聯(lián)體、適配子和核酶。
本發(fā)明的方法和制劑還涵蓋寡核苷酸固相制備過程中合成的包括內(nèi)部和末端刪除寡核苷酸在內(nèi)的各種刪除寡核苷酸，因為這類刪除序列是非常實用的生物等同體。具有特異催化活性的合成RNA分子及其衍生物稱為核酶，我們認(rèn)為它們也是用于本發(fā)明所述方法和組合物的寡核苷酸生物等同體。為了本發(fā)明的方法和制劑，同樣被認(rèn)為是寡核苷酸生物等同體的是肽核酸(PNAs)和核酸適配子(一般可參見Ellington et al.，Nature，1990，346，818；U.S.Pat.No.5,523,389(Ecker et al.，Jun.4，1996))。
適配子(aptamer)這一名詞是Ellington和Szostak(Nature，1990，346，818)為一些核酸分子起的，它們與象肽、蛋白質(zhì)和小分子(比如藥物和染料)這樣的非核酸配體吻合并能高特異性地結(jié)合。因為這種特異配體結(jié)合特性，可以利用帶有固定化配體的柱子經(jīng)親和層析容易地純化或分離到屬于核酸適配子的核酸和寡核苷酸。核酸適配子可以是相對那些長達(dá)幾百核苷酸的核酸來說較短的核酸。例如Ellington和Szostak報道過他們發(fā)現(xiàn)的155核苷酸長的RNA適配子能夠與染料(比如Cibacron Blue和Reactive Blue 4)高選擇性地結(jié)合(Ellington and Szostak，Nature，1990，346，818)。雖然最初是RNA分子被稱為適配子，該名詞用在本發(fā)明中指代任何特異結(jié)合小分子配體的核酸或寡核苷酸，包括但不限于DNA、RNA、DNA衍生物和偶聯(lián)物、RNA衍生物和偶聯(lián)物、修飾的寡核苷酸、嵌合寡核苷酸和gapmers。
在一實施方案中，本發(fā)明集中描述了將具有生物活性的核酸(比如寡核苷酸)非親代遞送給動物。″具有生物活性″意味著該核酸能調(diào)整動物的一或多個基因的表達(dá)，從基因的絕對功能(比如核酶活性)或者這些基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生可以反映這一點。在本發(fā)明的語境中，″調(diào)整″意味著使得基因的表達(dá)或者增加(刺激)或者減少(抑制)。這樣的調(diào)整可以通過例如雙鏈寡核苷酸誘騙物分子以已知的多種機(jī)制結(jié)合到靶轉(zhuǎn)錄因子上來實現(xiàn)。以下更詳細(xì)地描述了利用本發(fā)明所述制劑進(jìn)行給藥的多種雙鏈寡核苷酸誘騙物分子。
在非人動物中，本發(fā)明的制劑和方法可以用于研究該動物的一或多個基因的功能。
如上所述，本發(fā)明的制劑和方法有治療用途，即可以給患有或懷疑患有或者易感某疾病或紊亂的動物(包括人)提供治療、緩解或預(yù)防，而所述疾病或紊亂可以完全或部分地用一或多種核酸進(jìn)行治療。名詞″疾病或紊亂″(1)包括任何生物或部位的異常狀況，尤其是感染、天生虛弱；(2)排除懷孕本身，但包括自身免疫和其他與懷孕相關(guān)的疾??；以及(3)包括癌癥和腫瘤。名詞″患有或懷疑患有或者易感″表明受試動物已被檢驗出，或者懷疑相對該動物的一般群體增加了發(fā)展出此次定義的特定疾病或紊亂的危險性。例如，受試動物可能有經(jīng)常發(fā)生某種疾病或紊亂的個人和/或家庭病史。另外一個例子，可能根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)通過基因篩選確定出受試動物有這類易感性(參見例如U.S.Congress，Office of Technology Assessment，Chapter 5 InGenetic Monitoring and Screening in the Workplace，OTA-BA-455，U.S.Government Printing Office，Washington，D.C.，1990，pages 75-99)。名詞″可以完全或部分地用一或多種核酸進(jìn)行治療的疾病或紊亂″是指如文中界定的疾病或紊亂(1)其管理、控制或治療，和/或(2)其治療、緩解和/或預(yù)防可以借助給予一或多種核酸實現(xiàn)。在一個優(yōu)選實施方案中，這類疾病或紊亂可以用雙鏈寡核苷酸誘騙物分子進(jìn)行完全或部分治療。
可以利用上文描述的一或多種制劑進(jìn)行給藥的針對各種轉(zhuǎn)錄因子的寡核苷酸誘騙物分子包括，但不限于以下描述的這些。
NF-κB寡核苷酸誘騙物分子本發(fā)明的一個方面是這樣一個想法，即通過設(shè)計能與p65/p50和/或cRel/p50異源二聚體結(jié)合，而不結(jié)合p50/p50同源二聚體的誘騙物分子，或者優(yōu)先與p65/p50和/或cRel/p50異源二聚體結(jié)合的誘騙物分子，就可以讓p50/p50同源二聚體留下來占有這些位點，從而更多地阻斷NF-κB驅(qū)動的啟動子。結(jié)果，這類選擇性誘騙物分子比已有的NF-κB誘騙物更能阻斷NF-κB的活性。
設(shè)計性能提高的NF-κB誘騙物1.設(shè)計NF-κB dsODN分子設(shè)計本發(fā)明的寡核苷酸誘騙物利用了結(jié)合到免疫球蛋白輕鏈基因上的p50/p65異源二聚體的晶體結(jié)構(gòu)(Chen et al.，Nature 391(6665)410-3(1998))，該基因含有一個共有序列5’-GGGACTTTCC-3’(SEQ ID NO2)。作者證明p50與5堿基對亞位點5’-GGGAC-3’(SEQ ID NO3)有接觸，而p65與4堿基對亞位點5’TTCC-3’(SEQ ID NO4)接觸。p50/p65異源二聚體與DNA的接觸情況類似于同源二聚體結(jié)構(gòu)(Ghosh et al.，Nature 373(6512)303-10(1995)；Muller et al，F(xiàn)EBS Lett.369(1)113-7(1995))。
一實施方案中，本發(fā)明的NF-κB dsODN分子由通過Watson-Crick堿基配對結(jié)合在一起的兩個寡核苷酸鏈組成。通常兩條鏈中所有的核苷酸都會參與堿基配對，但這不是必需的。那些一或多個(比如1-3或者1或2個)核苷酸沒有參與堿基配對的寡核苷酸誘騙物分子也包括在發(fā)明中。此外，雙鏈誘騙物分子可以含有3′和/或5′單鏈突出端。
在另一實施方案中，本發(fā)明的NF-κB dsODN分子包含通過Watson-Crick堿基配對結(jié)合在一起，并且在3′或5′端或者兩端共價結(jié)合的兩個寡核苷酸鏈，形成一個啞鈴結(jié)構(gòu)或者環(huán)形分子。共價鍵可以由例如磷酸二酯鍵或其他連接基團(tuán)(比如例如一硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酰胺鍵)提供。
概括來說本發(fā)明的dsODN分子包含一個能夠特異結(jié)合NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的核心序列，側(cè)接5′和/或3′序列。該核心序列由約5到14，或約6到12個，或約7到10個堿基對組成；旁側(cè)序列有約2到8個，或者2到6個，或者2到4個堿基對長。這些分子通常包含約12到28，優(yōu)選約14到24個堿基對長的雙鏈區(qū)，這一雙鏈區(qū)由兩條完全或部分互補(bǔ)的鏈組成(包括核心和旁側(cè)序列)。
改變核心序列(包括其長度、序列、堿基修飾和骨架結(jié)構(gòu))就可能改變結(jié)合親和性、以及NF-κB誘騙物分子的穩(wěn)定性和特異性。的確，本發(fā)明的NF-κB dsODN分子，能夠高親和性結(jié)合p65/p50和/或cRel/p50異源二聚體，而對p50/p50同源二聚體顯示出沒有或很低的結(jié)合親和性，它們就是根據(jù)結(jié)合到DNA上的p65/p50異源二聚體的晶體結(jié)構(gòu)，通過刪除或改變共有寡核苷酸誘騙物分子的結(jié)合位點(核心)中的靶殘基設(shè)計成的。
此外，旁側(cè)序列的變化會真實地影響并明顯提高NF-κB誘騙物分子的體內(nèi)穩(wěn)定性，還可能影響其結(jié)合親和性和/或特異性。具體來說，可以通過改變核心結(jié)合序列旁邊的序列來改變NF-κB誘騙物分子的形狀/結(jié)構(gòu)，這些改變會使其穩(wěn)定性和/或結(jié)合親和性提高。DNA的形狀和結(jié)構(gòu)受到堿基對序列、DNA的長度、核苷酸骨架和性質(zhì)(即天然DNA相對于修飾過的糖或堿基)的影響。因此也可以通過其他手段來改變分子的形狀和/或結(jié)構(gòu)，比如例如，通過改變總長、分子中完全互補(bǔ)的雙鏈區(qū)長度，通過核心和旁側(cè)序列中的改變，通過改變骨架結(jié)構(gòu)和進(jìn)行堿基修飾。
本發(fā)明的誘騙物分子的核苷酸序列可以包含修飾的或罕見核苷酸，并可以有替代的骨架化學(xué)特性。合成核苷酸可以多種方式進(jìn)行修飾，參見例如Bielinska et al.，Science 250997-1000(1990)。因此，可以用氮、硫或碳取代氧；碳取代磷；用其他糖取代脫氧核糖或?qū)⒏鱾€堿基取代為非天然堿基。所以用硫基(能夠形成硫代磷酸酯鍵)代替核苷酸間的不能成鍵氧原子可以提高dsODN分子的核酸酶抗性。下文的實施例部分列出了一些實驗，用于確定硫修飾和NF-κB dsODN分子的穩(wěn)定性和特異性之間的關(guān)系。
每種情況中都要對變化進(jìn)行評估，即評估所做修飾對寡核苷酸誘騙物分子與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子之間的結(jié)合能力和親和性的影響，對解鏈溫度和體內(nèi)穩(wěn)定性的影響，以及任何有害的生理影響。這類修飾已為本領(lǐng)域所熟知，在反義寡核苷酸中有廣泛應(yīng)用，因此它們的安全性和能夠保留結(jié)合親和性是得到證實的(參見例如Wagner et al.，Science 26015 10-1513(1993))。
修飾核苷酸的例子(不限于)有4-乙酰胞嘧啶核苷、5-(羧羥甲基)尿苷、2′-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氫尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖Q核苷、2′-O-甲基鳥苷、肌苷、N6-異戊基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷、β，D-甘露糖Q核苷、5-甲氧基羰甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰)蘇氨酸、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨甲?；?蘇氨酸、尿苷-5-氧化乙酸-甲酯尿苷-5-氧化乙酸、wybutoxosine、假尿苷Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)-氨甲酰蘇氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、3-(3-3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷(acp3)u和wybutosine。
此外，核苷酸可以通過例如磷酰胺鍵互相連接。該鍵是天然磷酸二酯鍵的類似物，只是成鍵氧原子(-O-)被氨基(-NR-)取代，其中的R通常是氫或低級烷基，象例如甲基或乙基。也可能利用其他鍵，比如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯鍵等。
本發(fā)明的誘騙物分子還可以含有通常存在于多核苷酸結(jié)構(gòu)中的核糖或脫氧核糖糖類的修飾或類似物形式。這些修飾包括，但不限于2′-取代的糖(比如2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基-、2′-氟-和2′-疊氮-核糖)、羧基糖類似物、α-端基差向異構(gòu)體糖、差向立體異構(gòu)體糖(比如阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、開鏈類似物和無堿基核苷類似物(比如甲基核苷)。
總之，本發(fā)明的寡核苷酸誘騙物分子優(yōu)選包含超過約50％、更優(yōu)選超過約80％、最優(yōu)選超過約90％的傳統(tǒng)脫氧核糖核苷酸。
本發(fā)明的NF-κB dsODN誘騙物分子可以被進(jìn)一步修飾以助于其定位、純化或者提高其一些性能。例如，為了促進(jìn)它們遞送到細(xì)胞核內(nèi)，可以給誘騙物分子連上一個核定位信號(NLS)。NF-κB/Rel蛋白包含一個共有的包含NLS的Rel同源結(jié)構(gòu)域。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的誘騙物分子中采用了這種天然NLS，或其變異體。
此外，發(fā)明所述NF-κB誘騙物分子可以象例如以下參考文獻(xiàn)描述的，偶聯(lián)上一些載體分子，比如肽、蛋白質(zhì)或其他類型分子Avrameas et al.，JAutoimmun 16，383-391(2001)；Avrameas et al.，Bioconjug.Chem.1087-93(1999)；Gallazzi et al.，Bioconjug.Chem.14，1083-1095(2003)；Ritter，W.et al.，J.Mol.Med.81，708-717(2003)。
本發(fā)明的NF-κB誘騙物分子可以進(jìn)一步衍生以便包含遞送載體，后者能夠提高誘騙物分子的遞送、分配、尋靶到特異細(xì)胞類型或者協(xié)助穿過細(xì)胞屏障轉(zhuǎn)運(yùn)。這類遞送載體包括，但不限于細(xì)胞滲透增強(qiáng)劑、脂質(zhì)體、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑、樹狀聚合物(dendrimers)、DNA嵌入劑(intercalators)和納米粒子。
2.NF-κB dsODN分子的合成本發(fā)明的NF-κB sdODN誘騙物分子可以用商品自動合成儀通過標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯或亞磷酰胺化學(xué)來合成。實施例中描述的特定dsODN分子是用自動DNA合成儀(Model 380B；Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)合成的。誘騙物分子經(jīng)過柱層析純化，凍干并溶于培養(yǎng)基中。每種誘騙物分子的濃度經(jīng)分光光度法確定。
3.NF-κB dsODN分子的定性研究本發(fā)明的NF-κB誘騙物分子可以方便地在凝膠變動分析或電泳遷移率變動(EMSA)分析中檢測和研究。該項分析提供了一種探測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的快速和敏感的方法。這項分析是基于這樣的觀察，即蛋白質(zhì)和DNA的復(fù)合體在非變性聚丙烯酰胺凝膠中比游離雙鏈寡核苷酸移動得慢。凝膠變動分析的進(jìn)行是將純化蛋白或復(fù)雜的蛋白混合液(比如核提取物)與含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的32P末端標(biāo)記DNA片段一起保溫。然后將反應(yīng)產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上做分析。轉(zhuǎn)錄因子對結(jié)合位點的特異性是用過量寡核苷酸(含有目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合位點或者拼湊DNA序列)通過競爭實驗來確定。含在混合體系中的蛋白質(zhì)的身份確定是通過利用識別該蛋白的抗體，然后看DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體的位移是否減少或者該復(fù)合體與放射標(biāo)記的寡核苷酸探針的結(jié)合被破壞。
本文中在設(shè)計選擇性NF-κB誘騙物分子時，根據(jù)結(jié)合到DNA上的p65/p50異源二聚體的晶體結(jié)構(gòu)，我們刪除了共有寡核苷酸誘騙物分子結(jié)合位點(核心)中的靶殘基。我們的最終目標(biāo)是設(shè)計這樣的雙鏈寡核苷酸，其能高親和性地結(jié)合p65/p50和/或cRel/p50異源二聚體，優(yōu)選p65/p50和cRel/p50異源二聚體兩者，而對p50/p50同源二聚體親和性低。為了實現(xiàn)這個目標(biāo)，我們在如以下實施例所述的凝膠位移分析中檢測了多種NF-κB誘騙物分子結(jié)合不同NF-κB蛋白質(zhì)的能力。
4.NF-κB dsODN分子的用途NF-κB參與調(diào)控大量基因的轉(zhuǎn)錄。以下提供了其轉(zhuǎn)錄被NF-κB激活的代表性基因的分組和名單。
細(xì)胞因子/趨化因子及其調(diào)節(jié)子，象例如干擾素-γ(IFN-γ)、干擾素-β(IFN-β)、白介素(比如IL-1，Il-2，IL-6，IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15)、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、TNF-α、MIP-1、MIP-2、MIP-3、RANTES、TNF-α、TRAIL。
免疫調(diào)節(jié)劑，比如例如BRL-1、CCR5、CCR7、CD137、CD154、CD40和CD40配體、CD48、CD83、CD23、IL-2受體α鏈、一些免疫球蛋白重鏈和輕鏈、I型MHC抗原、T細(xì)胞受體亞基、TNF受體(p75/80)。
參與抗原遞呈的蛋白質(zhì)，比如例如補(bǔ)體B、補(bǔ)體成分3、TAP1和tapasin。
細(xì)胞粘附分子，比如例如E-和P-選擇蛋白、ICAM-1、MadCAM-1、VCAM-1和Tenascin-C。
急性期蛋白，比如例如血管緊張肽原、β-防衛(wèi)素-2、補(bǔ)體因子、組織因子-1(TF-1)、尿激酶型纖溶酶原激活物。
應(yīng)激基因，比如例如血管緊張肽-2、COX-2、MAP4K1、磷脂酶A2。
細(xì)胞表面受體，比如例如CD23、CD69、EGF-R、Lox-1、Mdr1。
凋亡調(diào)節(jié)子，比如例如Bfl1、Bcl-xL、Caspase-11、CD95(Fas)、TRAF-1、TRAF-2。
生長因子及其調(diào)節(jié)子，比如例如G-CSF、GM-CSF、EPO、IGFBP-1、IGFBP-2、M-CSF、VEGF-C。
早期應(yīng)答基因，比如例如TIEG、B94、Egr-1。
此外，NF-κB能夠調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子(比如c-myc-、c-myb、A20、junB、p53、WT1和病毒)的轉(zhuǎn)錄。
因此，抑制NF-κB誘導(dǎo)了一些促炎細(xì)胞因子(比如IL-1和TNF-α)和免疫調(diào)節(jié)子的表達(dá)，可以用于治療炎性、免疫和自身免疫疾病，比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(Roshak et al，Current Opinion in Pharmacology 2316-321(2002))；克羅恩氏病和炎癥性腸病(IBD)(Dijkstra et al.，Scandinavian J.ofGastroenterology Suppl.23637-41(2002))、胰腺炎(Eeber and Adler，Pancreatology 1356-362(2001))、periodonitis(Nichols et al.，Annals ofPeriodontology 620-29(2001))；狼瘡(Kammer and Tsokos，Current Directionsin Autoimmunity 5131-150(2002))；哮喘(Pahl and Szelenyi，InflammationResearch 51273-282(2002))；和過敏性眼病(Bielory et al.，Opinion in Allergyand Clinical Immunology 2435-445(2003))。
因為NF-κB在參與以下情況中的細(xì)胞因子和粘附分子基因的協(xié)調(diào)性順式激活發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，NF-κB誘騙物分子也可以應(yīng)用于治療這些疾病和狀況。所述疾病和病況包括動脈粥樣硬化和血管損傷后損毀的形成(Yoshimura et al.，Gene Therapy 81635-1642(2001))；大腦缺血后的神經(jīng)損傷(Ueno et al.，J.Thoracic and Cardiovascular Surgery 122(4)720-727(2001))；支氣管炎癥(Griesenbach et al.，Gene Therapy 7，306-313(2000))；自身免疫性心肌炎進(jìn)展(Yokoseki et al.，Circ.Res.89899-906(2001))；心臟移植中的急性排斥和移植物動脈病(Suzuki et al.，Gene Therapy 71847-1852(2000))；以及心肌梗塞(Morishita et al.，Nature Medicine 3(8)894-899(1997))。
最近有證據(jù)表明NF-κB及參與其活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對腫瘤發(fā)展也很重要。參見例如Karin et al.，Nat.Rev.Cancer 2(4)301-10(2002)。所以，本發(fā)明的誘騙物分子用于阻斷NF-κB可以預(yù)防和治療癌癥，單獨使用或與其他治療方案結(jié)合起來提供一種新的抗癌策略。
許多抗炎癥和抗風(fēng)濕藥物，包括糖皮質(zhì)激素、阿司匹林、水楊酸鈉和sulfosalazine都是NF-κB活化的抑制劑。用于治療炎性和自身免疫疾病和癥狀時，可以任選將本發(fā)明的NF-κB誘騙物分子與這些藥物治療結(jié)合起來給藥。組合治療包括同時給藥以及將2或多種藥物以任何順序連續(xù)給藥。
E2F寡核苷酸誘騙物分子設(shè)計性能改良的E2F誘騙物眾所周知，許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到它們的識別位點時能夠使DNA折曲，而該非線性DNA結(jié)構(gòu)會促進(jìn)，甚至決定參與轉(zhuǎn)錄的近端和遠(yuǎn)端DNA-蛋白質(zhì)接觸(Perez-Martin et al.，Microbiol Rev58268-290(1994)；and van der Vlietand Verriizer，Bioassays1525-32(1993))。近期，E2F識別位點被發(fā)現(xiàn)含有一個內(nèi)在DNA折曲(Cress and Nevins，Mol.Cel..Biol.162119-2127(1996))。游離E2F結(jié)合到該識別位點造成一個與內(nèi)在折曲大小類似，但方向相反的DNA折曲。人們還知道E2F-1啟動子的結(jié)構(gòu)會影響該啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。E2F位點內(nèi)和其周圍的5個堿基對的取代改變了DNA螺旋結(jié)構(gòu)、E2F結(jié)合，并影響了轉(zhuǎn)錄活性。E2F結(jié)合位點存在的天然折曲，以及E2F與位點的結(jié)合對該結(jié)構(gòu)有巨大的影響這一事實似乎提示了DNA結(jié)構(gòu)在E2F結(jié)合和E2F依賴性轉(zhuǎn)錄控制中發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合位點之間的結(jié)合對DNA的結(jié)構(gòu)和形狀很敏感。它們之間的相互作用的特異性水平會被DNA的彈性和/或變形所提高。更多細(xì)節(jié)還可參見Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci351501-9(1996)和Rhodes et al.，Indian J.Biochem Biophys3383-7(1996)。
本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即改變E2F誘騙物分子的形狀和/或結(jié)構(gòu)，人們可以極大地提高它和靶E2F轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合親和性，而這進(jìn)而會更有效地抑制靶E2F轉(zhuǎn)錄因子的生物功能。
在本文提供的實施例中，E2F誘騙物分子的形狀/結(jié)構(gòu)已被通過改變核心結(jié)合序列旁邊的序列來進(jìn)行改變，這使得E2F結(jié)合親和性提高了一個數(shù)量級。結(jié)合親和性提高使E2F誘騙物分子成了一個E2F生物功能的更有效抑制劑。DNA的形狀和結(jié)構(gòu)受到堿基對序列、DNA長度、核苷酸骨架和屬性(即天然DNA相對修飾過的糖或堿基)的影響。因此，也可以通過其他方法來改變分子的形狀和/或結(jié)構(gòu)，象例如通過改變總長、改變分子中完全互補(bǔ)的雙鏈區(qū)的長度、通過核心和旁側(cè)序列內(nèi)的變動、改變骨架結(jié)構(gòu)和堿基修飾。其結(jié)合親和性增強(qiáng)和/或體內(nèi)穩(wěn)定性提高了的E2F誘騙物分子可以通過任意這類方法或者方法的組合進(jìn)行設(shè)計和制備。
具體來說，通過改變核心序列(包括其長度、序列、堿基修飾和骨架結(jié)構(gòu))，就可能改變E2F誘騙物分子的結(jié)合親和性、穩(wěn)定性和特異性。旁側(cè)序列中的變化能真正地影響并明顯提高該分子的體內(nèi)穩(wěn)定性，并可能影響結(jié)合親和性和/或特異性。
因此，在最寬泛的方面，本發(fā)明涉及這樣的E2F誘騙雙鏈寡核苷酸(dsODN)分子，它們有能改變形狀和/或結(jié)構(gòu)的彈性結(jié)構(gòu)，例如折曲和對靶E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合親和性增強(qiáng)。因此，本發(fā)明的E2F誘騙物分子可以具有對E2F-1、E2F-2、E2F-3、E2F-4、E2F-5和E2F-6中的一或多個提高的結(jié)合親和性。
在一個更特定的方面，本發(fā)明涉及性能改良的E2F誘騙雙鏈寡核苷酸(dsODN)分子。具體來說，發(fā)明涉及新的E2F誘騙dsODN分子，其與E2F轉(zhuǎn)錄因子(包括它的異源二聚體(E2F/DP)和同源二聚體(E2F/E2F)形式)的結(jié)合親和性提高，并且/或者體內(nèi)穩(wěn)定性增加。
在一實施方案中，所述E2F誘騙dsODN分子包含能夠特異結(jié)合E2F轉(zhuǎn)錄因子，并側(cè)接5′和3′序列的核心序列，其中(i)該核心序列由約5到12個，優(yōu)選6到10個堿基對構(gòu)成；(ii)所述分子包含一個約12到28個，優(yōu)選約14到24個堿基對長的雙鏈區(qū)，該雙鏈區(qū)由完全互補(bǔ)的兩條鏈組成；以及(iii)該E2F誘騙dsODN結(jié)合靶E2F轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合親和性是圖26中參照誘騙物分子(SEQ ID NOs94和95)的結(jié)合親和性的至少約5倍，優(yōu)選至少約7倍，更優(yōu)選至少約10倍，最優(yōu)選至少約15倍。數(shù)據(jù)是按照實施例1描述的實驗方案，在血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的核提取物上進(jìn)行競爭性凝膠變動分析測定的。優(yōu)選，改良的E2F誘騙dsODN分子的解鏈溫度(Tm)也比圖26參照誘騙物分子(SEQ ID NOs94和95)的Tm(42.3℃)明顯要高。
E2F誘騙物分子的完全互補(bǔ)雙鏈部分的長度據(jù)信對增強(qiáng)結(jié)合親和性和穩(wěn)定性非常重要。為了達(dá)到改良這些特性的目的，該區(qū)域應(yīng)該含有至少約12個堿基對，通常其長度在約12到28個堿基對。構(gòu)成所謂″完全互補(bǔ)″區(qū)域的兩個核苷酸鏈中，第一鏈中的每個核苷酸都與第二鏈中的每個核苷酸形成Watson-Crick堿基配對。
所述核心序列通常應(yīng)該包含至少6個堿基對，一般至少8個堿基對以便令人滿意地結(jié)合到靶E2F轉(zhuǎn)錄因子上。一般來說，核心序列由約5到12個，更常見6到10個堿基對組成。核心序列可能是或者含有來自那些轉(zhuǎn)錄被E2F轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)或下調(diào)的基因之啟動子區(qū)的E2F結(jié)合序列。替代地，核心序列可以是非天然E2F結(jié)合序列的合成序列，比如根據(jù)多個基因的E2F結(jié)合序列，或者多種E2F轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列中每個位點上最常見的核苷酸設(shè)計出的共有序列。
所述旁側(cè)序列通常是5到50個堿基長，可以是，但不必須是完全互補(bǔ)的。因此，旁側(cè)區(qū)可以在任一端包含單鏈突出。據(jù)信本發(fā)明所述寡核苷酸誘騙物分子的結(jié)合親和性和穩(wěn)定性更多是受到其內(nèi)由兩條完全互補(bǔ)的鏈組成的真正雙鏈區(qū)的長度和序列影響，而非旁側(cè)區(qū)本身長度的影響。
本發(fā)明的誘騙物分子的核苷酸序列可以包含修飾的或罕見的核苷酸，并且可以有替代的骨架化學(xué)構(gòu)成。合成核苷酸可以以多種方式進(jìn)行修飾，參見例如Bielinska et al.Science25)；997-1000(1990)。因此，可以用氮、硫或碳取代氧；碳取代磷；用其他糖取代脫氧核糖或?qū)⒏鱾€堿基取代為非天然堿基。每種情況中，都要評價修飾對寡核苷酸誘騙物分子與E2F轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力和親和性的影響，對解鏈溫度和體內(nèi)穩(wěn)定性的影響，以及任何有害生理效果。這類修飾是本領(lǐng)域眾所周知的，在反義寡核苷酸中有廣泛應(yīng)用，因此它們的安全性和保留結(jié)合親和性的能力都是公知的(參見例如Wagner et al.Science2601510-1513(1993))。
修飾核苷酸的例子(不限于)有4-乙酰胞嘧啶核苷、5-(羧羥甲基)尿苷、2′-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氫尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖Q核苷、2′-O-甲基鳥苷、肌苷、N6-異戊基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷、β，D-甘露糖Q核苷、5-甲氧基羰甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰甲基尿苷(5-metHoxycarbonYlmethyluridine)、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰)蘇氨酸、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨甲?；?蘇氨酸、尿苷-5-氧化乙酸-methylester尿苷-5-氧化乙酸、wybutoxosine、假尿苷Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)-氨甲酰蘇氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、3-(3-3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷(acp3)u和wybutosine。
此外，核苷酸可以通過例如磷酰胺酯鍵連在一起。該鍵是天然磷酸二酯鍵的類似物，只是成鍵氧原子(-O-)被氨基(-NR-)取代，其中的R通常是氫或低級烷基，象例如甲基或乙基。
本發(fā)明的E2F誘騙物分子可以利用商品自動合成儀，通過標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯或磷酰胺化學(xué)反應(yīng)來合成。
在具體實施方案中，本發(fā)明的E2F誘騙物分子包括一個選自以下鏈的核心序列TTTSGCGS(SEQ ID NO100)TTTGGCGC(SEQ ID NO101)TTTCGCGC(SEQ ID NO102)TTTCCCGC(SEQ ID NO103)TTTGCCGC(SEQ ID NO104)CTTCCCGC(SEQ ID NO105)GTTCCCGC(SEQ ID NO106)CTTCGCGC(SEQ ID NO107)TTAGCGCC(SEQ ID NO108)TGAGCGCC(SEQ ID NO109)GTAGCGCC(SEQ ID NO110)GGAGCGCC(SEQ ID NO111)CTAGCGCC(SEQ ID NO112)CGAGCGCC(SEQ ID NO113)GTTCGCGC(SEQ ID NO114)TTTGCGCC(SEQ ID NO115)TGTGCGCC(SEQ ID NO116)GTTGCGCC(SEQ ID NO117)GGTGCGCC(SEQ ID NO118)CTTGCGCC(SEQ ID NO119)CGTGCGCC(SEQ ID NO120)TTTCCGG (SEQ ID NO121)TTTCGCGG(SEQ ID NO122)GTTGGCGC(SEQ ID NO123)CTTGGCGC(SEQ ID NO124)CTTGCCGC(SEQ ID NO125)GTTGCCGC(SEQ ID NO126)
TTTGGCGG(SEQ ID NO127)TTACCGCC(SEQ ID NO128)TGACCGCC(SEQ ID NO129)GTACCGCC(SEQ ID NO130)GGACCGCC(SEQ ID NO131)CTACCGCC(SEQ ID NO132)CGACCGCC(SEQ ID NO133)TTTCCGCC(SEQ ID NO134)TGTCCGCC(SEQ ID NO135)GTTCCGCC(SEQ ID NO136)GGTCCGCC(SEQ ID NO137)CTTCCGCC(SEQ ID NO138)CGTCCGCC(SEQ ID NO139)CTTCCCGG(SEQ ID NO140)TTTGCCGG(SEQ ID NO141)GTTCCCGG(SEQ ID NO142)CTTCGCGG(SEQ ID NO143)TTTGCGCG(SEQ ID NO144)TTAGCGCG(SEQ ID NO145)TGTGCGCG(SEQ ID NO146)TGAGCGCG(SEQ ID NO147)GTTGCGCG(SEQ ID NO148)GTAGCGCG(SEQ ID NO149)GGTGCGCG(SEQ ID NO150)TTTSGCGCGMNR(SEQ ID NO151)GTTGGCGG(SEQ ID NO153)GTTCGCGG(SEQ ID NO154)TTTCCCGG(SEQ ID NO155)CTTGCCGG(SEQ ID NO156)GTTGCCGG(SEQ ID NO157)TGTCGCGC(SEQ ID NO158)
CTTCCCGG(SEQ ID NO159)CGTCGCGC(SEQ ID NO160)GGTCGCGC(SEQ ID NO161)TTTCGGGC(SEQ ID NO162)TGTGGCGC(SEQ ID NO163)TGTCGCGG(SEQ ID NO164)及其互補(bǔ)鏈，其中S是G或C根據(jù)該信息和其他有關(guān)內(nèi)在E2F結(jié)合序列結(jié)構(gòu)的知識，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以例如通過已有的分子模擬技術(shù)、與E2F-DP復(fù)合體共結(jié)晶的技術(shù)和其他本領(lǐng)域的已知手段對這些E2F誘騙物分子的結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步優(yōu)化?？拷诵男蛄械呐詡?cè)區(qū)真實序列比更遠(yuǎn)區(qū)域的序列更關(guān)鍵。因此，與核心序列相鄰的位點或者只隔幾個核苷酸位置的核苷酸身份需要比離核心序列更遠(yuǎn)的位置上的核苷酸更謹(jǐn)慎地控制。在具體實施方案中，旁側(cè)序列是圖26中所示SEQ ID NOS96和97，它們可以與上面列出的任何核心序列連接在一起。
正如前面討論過的，E2F和DP蛋白質(zhì)形成異源二聚體從而產(chǎn)生E2F功能活性。此外，一些E2F蛋白的同源二聚體也已有描述。各個E2F-DP或E2F-E2F種類根據(jù)E2F基序的身份以及與復(fù)合體相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)的不同，會引用不同的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。如果需要，可以將E2F dsODN分子設(shè)計成優(yōu)選結(jié)合某一或多種E2F轉(zhuǎn)錄因子，而這樣會繼而產(chǎn)生不同的體內(nèi)生物活性。所以可以通過這個方法來設(shè)計用于癌癥治療的E2F誘騙物分子。
候選誘騙物分子的結(jié)合親和性可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法測定，例如經(jīng)凝膠變動分析。凝膠變動或電泳遷移率變動(EMSA)分析提供了一種檢測轉(zhuǎn)錄因子或其他DNA結(jié)合蛋白與DNA發(fā)生結(jié)合的快速和敏感方法。這項分析是基于這樣的觀察，即蛋白質(zhì)和DNA的復(fù)合體在非變性聚丙烯酰胺凝膠中比游離雙鏈寡核苷酸移動得慢。凝膠變動分析的進(jìn)行是將純化蛋白或復(fù)雜的蛋白混合液(比如核提取物)與含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的32P末端標(biāo)記DNA片段一起保溫。然后將反應(yīng)產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上做分析。轉(zhuǎn)錄因子對結(jié)合位點的特異性是用過量寡核苷酸(含有目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合位點或者拼湊DNA序列)通過競爭實驗來確定。含在混合體系中的蛋白質(zhì)的身份確定是通過利用識別該蛋白的抗體，然后看DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體的位移是否減少或者該復(fù)合體與放射標(biāo)記的寡核苷酸探針的結(jié)合被破壞。
主要治療目標(biāo)本發(fā)明的E2F誘騙物分子有希望臨床用于預(yù)防和治療冠心病。美國心臟協(xié)會的數(shù)據(jù)表明冠心病是美國男性和女性第一位的致死原因，1998年在美國引起450,000例死亡。
此外，E2F誘騙物分子還可用于治療外周血管疾病，該病特點在于外周動脈粥樣硬化變窄，導(dǎo)致危害血液循環(huán)。在早期臨床階段，該病征兆在于腿部疼痛，如果不進(jìn)行治療，就會發(fā)展成壞疽，導(dǎo)致必須截肢，造成很高的不可逆轉(zhuǎn)的致殘率和致死率。
E2F誘騙物分子更進(jìn)一步的臨床目標(biāo)是新生內(nèi)膜增生，該病理過程存在于移植物動脈粥樣硬化、狹窄和多數(shù)血管移植物閉塞。新生內(nèi)膜增生常見于發(fā)生各種形式的血管損傷之后，并且是靜脈移植物對摘除和手術(shù)植入高壓動脈循環(huán)的反應(yīng)的主要體現(xiàn)。
此外，研究表明E2F在癌癥進(jìn)展中有著重要作用。如上文討論過的，E2F能夠誘導(dǎo)一組細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂所必需的基因的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞收到生長抑制信號時，E2F被腫瘤抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因Rb去活化。結(jié)果，E2F調(diào)節(jié)的生長控制基因維持無活性狀態(tài)，細(xì)胞停留在靜止態(tài)。有人提議說在攜帶突變拷貝的Rb的腫瘤細(xì)胞中，E2F不再被Rb控制。結(jié)果，E2F會激活指導(dǎo)細(xì)胞分裂的基因，使細(xì)胞停留在永久性增殖狀態(tài)。更多細(xì)節(jié)，包括替代機(jī)制可參見例如Johnson and Schneider-Broussard，F(xiàn)ront Biosci 3d447-8(1998)。有報道說，能夠抑制E2F活性的小肽在引入腫瘤細(xì)胞系時會導(dǎo)致凋亡(Bandara et al.，Nature Biotechnology15896-901(1997)。無論其機(jī)制為何，本發(fā)明的E2F誘騙物分子有望用于治療包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥。
HIF-1寡核苷酸誘騙物分子在本發(fā)明的一實施方案中，我們系統(tǒng)地開發(fā)和優(yōu)化了幾組能特異結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的轉(zhuǎn)錄因子誘騙物。
1.設(shè)計HIF-1 dsODN分子在一實施方案中，本發(fā)明的HIF-1 dsODN分子由兩個通過Watson-Crick堿基配對連在一起的寡核苷酸鏈組成。通常兩條鏈中所有核苷酸都參與堿基配對，但這不是必須的。那些有一或多個(比如1-3或者1或2個)核苷酸不參與堿基配對的寡核苷酸誘騙物分子也包括在內(nèi)。此外，所述雙鏈誘騙物分子可以含有3′和/或5′單鏈突出。
另一實施方案中，本發(fā)明的HIF-1 dsODN分子包含兩個通過Watson-Crick堿基配對連在一起的寡核苷酸鏈，另外還在3′或5′端，或者兩個末端共價結(jié)合，形成一個啞鈴結(jié)構(gòu)或者環(huán)形分子。共價鍵可以由例如磷酸二酯鍵或其他連接基團(tuán)(象例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酯氨酰鍵)提供。
通常本發(fā)明的dsODN分子包含能夠特異結(jié)合HIF-1轉(zhuǎn)錄因子，并側(cè)接5′和/或3′序列的核心序列，其中該核心序列由約5到14個，或者約6到12個，或者約7到10個堿基對組成；旁側(cè)序列是約2到8個、或者約2到6個、或者2到4個堿基對長。所述分子一般包含一個約12到28個，優(yōu)選約14到24個堿基對長的雙鏈區(qū)，該雙鏈區(qū)由完全或者部分互補(bǔ)的兩條鏈組成(包括核心和旁側(cè)序列)。
改變核心序列(包括其長度、序列、堿基修飾和骨架結(jié)構(gòu))就有可能改變HIF-1誘騙物分子的結(jié)合親和性。此外，旁側(cè)序列中的變化能真正地影響并明顯提高HIF-1誘騙物分子的體內(nèi)穩(wěn)定性，并可能影響其結(jié)合親和性和/或特異性。具體來說，HIF-1誘騙物分子的形狀/結(jié)構(gòu)可以通過改變核心結(jié)合序列旁的序列來進(jìn)行改變，這使得該分子的穩(wěn)定性和/或結(jié)合親和性提高。DNA的形狀和結(jié)構(gòu)受到堿基對序列、DNA長度、核苷酸骨架和屬性(即天然DNA相對修飾過的糖或堿基)的影響。因此，也可以通過其他方法來改變分子的形狀和/或結(jié)構(gòu)，象例如通過改變總長、改變分子中完全互補(bǔ)的雙鏈區(qū)的長度、通過核心和旁側(cè)序列內(nèi)的變動、改變骨架結(jié)構(gòu)和堿基修飾。
本發(fā)明的誘騙物分子的核苷酸序列可以包含修飾或罕見核苷酸，并且可以有替代的骨架化學(xué)構(gòu)成。合成核苷酸可以以多種方式進(jìn)行修飾，參見例如Bielinska et al.Science25)；997-1000(1990)。因此，可以用氮、硫或碳取代氧；碳取代磷；用其他糖取代脫氧核糖或?qū)⒏鱾€堿基取代為非天然堿基。所以用硫基團(tuán)(能夠形成硫代磷酸酯鍵)代替核苷酸間的不能成鍵氧原子可以用于提高dsODN分子的核酸酶抗性。下文的實施例中列出了一些實驗，用于確定硫修飾和HIF-1 dsODN分子的穩(wěn)定性和特異性之間的關(guān)系。
每種情況中，都要評價修飾對寡核苷酸誘騙物分子與HIF-1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力和親和性的影響，對解鏈溫度和體內(nèi)穩(wěn)定性的影響，以及任何有害生理效果。這類修飾是本領(lǐng)域眾所周知的，在反義寡核苷酸中有廣泛應(yīng)用，因此它們的安全性和保留結(jié)合親和性的能力都是公知的(參見例如Wagner et al.Science2601510-1513(1993))。
修飾核苷酸的例子(不限于)有4-乙酰胞嘧啶核苷、5-(羧羥甲基)尿苷、2′-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氫尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖Q核苷、2′-O-甲基鳥苷、肌苷、N6-異戊基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷、β，D-甘露糖Q核苷、5-甲氧基羰甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰)蘇氨酸、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨甲?；?蘇氨酸、尿苷-5-氧化乙酸-甲酯尿苷-5-氧化乙酸、wybutoxosine、假尿苷Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)-氨甲酰蘇氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、3-(3-3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷(acp3)u和wybutosine。
此外，核苷酸可以通過例如磷酰胺鍵互相連接。該鍵是天然磷酸二酯鍵的類似物，只是成鍵氧原子(-O-)被氨基(-NR-)取代，其中的R通常是氫或低級烷基，象例如甲基或乙基。也可能是其他鍵，比如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯鍵等。
本發(fā)明的誘騙物分子還可以含有通常存在于多核苷酸結(jié)構(gòu)中的核糖或脫氧核糖糖類的修飾或類似物形式。這些修飾包括，但不限于2′-取代的糖(比如2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基-、2′-氟-和2′-疊氮-核糖)、羧基糖類似物、α-端基差向異構(gòu)體糖、差向立體異構(gòu)體糖(比如阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、開鏈類似物和無堿基核苷類似物(比如甲基核苷)。
總之，本發(fā)明的寡核苷酸誘騙物分子優(yōu)選包含超過約50％、更優(yōu)選超過約80％、最優(yōu)選超過約90％的傳統(tǒng)脫氧核糖核苷酸。
本發(fā)明的HIF-1 dsODN誘騙物分子可以被進(jìn)一步修飾以助于其定位、純化或者提高其一些性能。例如，為了促進(jìn)它們遞送到細(xì)胞核內(nèi)，可以給誘騙物分子連上一個核定位信號(NLS)。
此外，發(fā)明所述HIF-1誘騙物分子可以象例如以下參考文獻(xiàn)描述的，偶聯(lián)上一些載體分子，比如肽、蛋白質(zhì)或其他類型分子Avrameas et al.，JAutoimmun 16，383-391(2001)；Avrameas et al.，Bioconjug.Chem.1087-93(1999)；Gallazzi et al.，Bioconjug.Chem.14，1083-1095(2003)；Ritter，W.et al.，J. Mol.Med.81，708-717(2003)。
本發(fā)明的NF-κB誘騙物分子可以進(jìn)一步衍生以便包含遞送載體，后者能夠提高誘騙物分子的遞送、分配、尋靶到特異細(xì)胞類型或者協(xié)助穿過細(xì)胞屏障轉(zhuǎn)運(yùn)。這類遞送載體包括，但不限于細(xì)胞滲透增強(qiáng)劑、脂質(zhì)體、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑、樹狀聚合物(dendrimers)、DNA嵌入劑(intercalators)和納米粒子。
2.HIF-1 dsODN分子的合成本發(fā)明的HIF-1 sdODN誘騙物分子可以用商品自動合成儀通過標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯或亞磷酰胺化學(xué)法來合成。實施例中描述的特定dsODN分子是用自動DNA合成儀(Model 380B；Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)合成的。誘騙物分子經(jīng)過柱層析純化，凍干并溶于培養(yǎng)基中。每種誘騙物分子的濃度經(jīng)分光光度法確定。
3.HIF-1 dsODN分子的定性研究本發(fā)明的HIF-1誘騙物分子可以方便地在凝膠變動分析或電泳遷移率變動(EMSA)分析中檢測和研究。該項分析提供了一種探測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的快速和敏感的方法。這項分析是基于這樣的觀察，即蛋白質(zhì)和DNA的復(fù)合體在非變性聚丙烯酰胺凝膠中比游離雙鏈寡核苷酸移動得慢。凝膠變動分析的進(jìn)行是將純化蛋白或復(fù)雜的蛋白混合液(比如核提取物)與含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的32P末端標(biāo)記DNA片段一起保溫。然后將反應(yīng)產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上做分析。轉(zhuǎn)錄因子對結(jié)合位點的特異性是用過量寡核苷酸(含有目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合位點或者拼湊DNA序列)通過競爭實驗來確定。含在混合體系中的蛋白質(zhì)的身份確定是通過利用識別該蛋白的抗體，然后看DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體的位移是否減少或者該復(fù)合體與放射標(biāo)記的寡核苷酸探針的結(jié)合被破壞。
4.HIF-1 dsODN分子的用途如前面討論過的，研究表明HIF-1在腫瘤生長(包括血管發(fā)生和糖酵解)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且被認(rèn)為是抗癌治療策略的潛在目標(biāo)(Semenza，Nature Rev.3721-732(2003)；Williams et al.，Oncogene 21282-90(2002)；Griffiths et al.，Cancer Res.62688-95(2002)；Welsh et al.，Mol.Cancer Ther.2235-43(2003))。HIF-1在乳腺癌中過表達(dá)，并可能與更有侵襲性的腫瘤相關(guān)(Bos et al.，J.Natl.Cancer Inst.93309-314(2001))。此外，HIF-1在最近被鑒定為炎癥和腫瘤發(fā)生之間的關(guān)鍵銜接(Jung et al.，The FASEB JoumakExpress Article 10.1096/fj.03-0329fjc，published online September 4，2003)。在腦、乳腺、宮頸、食管、口咽和卵巢癌的活體解剖中發(fā)現(xiàn)的HIF-1α過表達(dá)與治療無效和死亡率有相關(guān)性。HIF-1活性提高會促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，而抑制HIF-1代表了一種新的腫瘤治療方法。所以利用本發(fā)明的誘騙物分子來阻斷HIF-1可以用于癌癥的預(yù)防和治療，單獨使用或與其他治療手段結(jié)合使用為我們提供一種新的抗癌策略。通過給予本發(fā)明的dsODN分子來抑制HIF-1可能還可以增強(qiáng)其他癌癥療法(比如放射治療和/或用化療劑治療)的效力。具體的目標(biāo)癌癥包括，但不限于實體惡性瘤和非霍奇金淋巴瘤。
此外，HIF-1被鑒定為一大類疾病的治療目標(biāo)，這些疾病中缺氧是一個主要表現(xiàn)，象例如心臟疾病和中風(fēng)(Giaccia et al.，Nat.Ray.Drug Discov.2803-822(2003))。相應(yīng)地，本發(fā)明的HIF-1誘騙物分子還可以用于預(yù)防和治療缺氧-相關(guān)的病理疾病和狀況，象例如心血管疾病，比如心肌局部缺血、心肌梗塞、充血性心力衰竭、心肌病、心肌肥厚和中風(fēng)。
HIF-1誘騙物分子另外還可以用于眼科學(xué)，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變，該病在美國是致盲的首要原因。其他的眼科目標(biāo)包括年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)，和與移植手術(shù)相關(guān)的角膜新生血管。
HIF-1 sdODN分子還可以用于預(yù)防和治療與例如銀屑病、角膜新生血管、感染或創(chuàng)傷相關(guān)的血管病理性生長。
血管發(fā)生的增加也是滑膜炎和關(guān)節(jié)炎中骨塑造的關(guān)鍵體現(xiàn)。血管發(fā)生抑制劑在炎性關(guān)節(jié)炎的動物模型中的臨床前研究支持了抑制新生血管可以降低炎癥和關(guān)節(jié)損傷這一設(shè)想。因此，其他的治療目標(biāo)還包括關(guān)節(jié)炎(比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎RA)這類炎性疾病和肌肉骨骼病患。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可參見例如Walsh and Haywood，Curr Opin Investig Drugs.2(8)1054-63(2001)。此外，與腫瘤生長類似，子宮內(nèi)膜異位植入物需要新生血管來建立、生長和侵襲?？梢岳帽景l(fā)明的HIF-1誘騙物分子來阻斷這個過程。還可參見Taylor et al..Ann N Y Acad Sci.95589-100(2002)。
誘騙物分子的給藥本發(fā)明所述誘騙物分子的優(yōu)選遞送方式是通過使用上文描述的制劑和以下實施例所示。
放在脂質(zhì)體中給予時，空腔內(nèi)的誘騙物分子濃度一般在每種誘騙物約0.1μM到50μM的范圍，更常見是約1μM到10μM，最常見約3μM。
確定合適的濃度和劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠勝任的。根據(jù)適應(yīng)癥、誘騙物分子、和患者的臨床狀態(tài)等，最佳治療參數(shù)可能有所不同，這可以根據(jù)本文提供的建議和本領(lǐng)域常識來經(jīng)驗性地確定。
所述誘騙物分子可以以包含單個誘騙物分子或者誘騙物分子混合物的形式給藥。通常，混合物含有最多6種，常見最多4種，更常見是最多2種誘騙物分子。
在癌癥治療中，給予誘騙物分子可以與其他治療方法結(jié)合使用，包括結(jié)合化療抗癌劑和/或放射治療。
超聲介導(dǎo)的誘騙物分子的遞送本發(fā)明的一個方面，證實利用超聲波可以提高透皮藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，這一現(xiàn)象被稱為超聲波導(dǎo)入。我們試圖在多種與皮膚炎癥(異位性皮炎和銀屑病)和關(guān)節(jié)炎癥(類風(fēng)濕性和骨關(guān)節(jié)炎)相關(guān)的靶臨床適應(yīng)癥中，就該方法對我們的轉(zhuǎn)錄因子誘騙物分子的局部遞送治療之影響進(jìn)行評估。選擇合適的超聲波參數(shù)，包括頻率、強(qiáng)度、脈沖長度以及轉(zhuǎn)導(dǎo)器到皮膚的距離對實現(xiàn)有效的超聲波導(dǎo)入非常關(guān)鍵。根據(jù)文獻(xiàn)中成功使用該方法的報道，我們從評估兩種超聲波導(dǎo)入治療策略開始1)治療頻率超聲波導(dǎo)入(1MHz頻率，2W/cm2強(qiáng)度)；2)低頻超聲波導(dǎo)入(20kHz頻率，最多225mW/cm2強(qiáng)度)。治療頻率超聲波導(dǎo)入是超聲波導(dǎo)入最常用的超聲波頻范圍率(1MHz)，顯示出對多種低分子量藥物通常提高10倍或更少，這使得它的用途只限于局部遞送而非系統(tǒng)遞送。低頻超聲波導(dǎo)入(20kHz)能夠增強(qiáng)各種低分子量藥物和高分子蛋白質(zhì)(至48kDA)的透皮轉(zhuǎn)運(yùn)，可能能夠使透皮通透性比治療超聲波提高達(dá)1000倍。我們希望將超聲波導(dǎo)入和或不和我們的滲透增強(qiáng)劑組合使用來更高效地進(jìn)行藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，并且提高對多種靶器官的遞送。
本發(fā)明的更多細(xì)節(jié)由以下實施例是顯而易見的，這些實施例用于解釋本發(fā)明而非限制它。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過常規(guī)實驗、特定物質(zhì)的大量等同物以及文中描述的過程識別或者弄清發(fā)明。這類等同物被認(rèn)為是本發(fā)明范圍內(nèi)的。
實施例制備制劑的各種方法是本領(lǐng)域公知的。因此相信制備具有如下所述成分的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。
制劑成分在下面的表中進(jìn)行示范。百分比是重量百分比，除非另有說明。
膠基制劑的制備是通過將合適量的A部分和B部分加入兩個分開的玻璃容器中。待A部分和B部分完全溶解后，用三刃攪拌翼強(qiáng)力攪拌混勻。乳劑和脂質(zhì)體基制劑的制備是通過將合適量的A部分和B部分加入兩個分開的玻璃容器中。將A部分和B部分加熱到65℃直至完全溶解。用三刃攪拌翼將兩部分強(qiáng)力攪拌混合到一起。使混合物邊攪拌邊冷卻至室溫。
實施例1基于凝膠的水性制劑制備了有以下成分的基于凝膠的水性制劑制劑F1
制備了有以下成分的基于凝膠的水性制劑制劑F2
制備了有以下成分的基于凝膠的水性制劑制劑F3
制備了有以下成分的基于凝膠的水性制劑制劑F4
制備了有以下成分的基于凝膠的水性制劑制劑F5
制備了有以下成分的基于凝膠的水性制劑制劑F6
制備了有以下成分的基于凝膠的水性制劑制劑F7
實施例2制備含脂質(zhì)體制劑制備了有以下成分的含脂質(zhì)體制劑制劑F8
制備了有以下成分的含脂質(zhì)體制劑制劑F9
制備了有以下成分的含脂質(zhì)體制劑制劑F10
制備了有以下成分的含脂質(zhì)體制劑制劑F11
制備了有以下成分的含脂質(zhì)體制劑
制劑F12
實施例3基于乳劑的制劑制備了有以下成分的基于乳劑的制劑制劑F13
制備了有以下成分的基于乳劑的制劑制劑F14
制備了有以下成分的基于乳劑的制劑制劑F15
實施例4遞送含有NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑-小鼠模型本實施例顯示NF-κB誘騙物分子，在利用本發(fā)明的基于凝膠的水性制劑進(jìn)行給藥時，可以高效地滲透入皮膚減少皮膚炎癥。
該項分析的基本實驗方案在Sasakawa et al.，Int.Arch.Allergy Immunol.，126(3)239-247(2001)和Matsuoka et al.，Allergy，58(2)139-145(2003)中有描述。
不含特異性病原菌(SPF)的NC/Nga雌性小鼠(4-5周)購自Charles RiversJapan(Yokohama，Japan)。將動物在SPF條件下繼續(xù)生長至6周齡。然后在第0、2、4、7、9和10天，給小鼠在其右耳腹側(cè)皮內(nèi)注射溶于鹽水的5mg/20μl屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus(Dp))提取物(Greer Laboratories，Lenoir，NC)。最后一次Dp注射后1-2天，在Dp處理過的耳朵背側(cè)施用20微升含有±0.1、0.25、0.5或1％NF-κB誘騙物分子的載體2次/天，共進(jìn)行14天。通過測量耳朵厚度來間接測發(fā)炎程度。組織學(xué)表明皮膚厚度與真皮和表皮中的炎癥細(xì)胞量的相關(guān)性很高。用改良的彈簧測微計(Oditest，Dyer，Co.，Lancaster，CA)在每次Dp注射后24小時測量耳朵厚度，然后在療程中隔一天測一次。
圖1顯示了基于凝膠的水性制劑F1中NF-κB誘騙物分子的劑量滴定，該制劑F1含有0.8％月桂醇醚硫酸鈉、49％乙醇、1.5％HPMC 4000cps和48.7％100mM磷酸緩沖液。圖1表明用0.1、0.25和0.5％NF-κB誘騙物分子進(jìn)行的治療減少了塵螨抗原誘導(dǎo)的異位性皮炎中的耳朵腫脹。該曲線圖展示了與沒有任何治療、用不含NF-κB誘騙物分子的制劑進(jìn)行治療，以及用倍他米松治療的小鼠皮膚相比，NF-κB誘騙物分子的效果。
圖2進(jìn)一步顯示了基于凝膠的水性制劑F6中NF-κB誘騙物分子的劑量滴定，該制劑F6含有0.8％月桂醇醚硫酸鈉、20％乙醇、2.0％HPMC 4000cps和10.0％100mM磷酸緩沖液。圖2表明用0.25和1％NF-κB誘騙物分子進(jìn)行的治療減少了塵螨抗原(Dp)誘導(dǎo)的NC/Nga小鼠接觸性皮炎中的耳朵腫脹。該曲線圖展示了與沒有任何治療、用ELIDEL(Novartis AG Corp.，Basel，Switzerland)進(jìn)行治療、用含有1％拼湊誘騙物分子的制劑進(jìn)行治療、以及用倍他米松治療的小鼠皮膚相比，NF-κB誘騙物分子的效果。
圖3的曲線顯示含有不同濃度乙醇和0.25％NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑的效果。指定為F2的制劑含有10％乙醇，制劑F3含有5％乙醇，F(xiàn)4含有1％乙醇。指定為F2對照的制劑不含有NF-κB誘騙物分子。結(jié)果與未治療和用倍他米松治療的樣品進(jìn)行了比較。
實施例5NF-κB誘騙物分子的抗炎效果-小鼠模型本實施例顯示NF-κB誘騙物分子，在利用本發(fā)明的基于凝膠的水性制劑進(jìn)行給藥時，能有效地降低NC/Nga小鼠之塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的接觸性皮炎中促炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)，所述細(xì)胞因子有比如IL-1β、IL-6、TNFα和TSLP(胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素)。
塵螨抗原誘導(dǎo)的異位性皮炎是如上所述進(jìn)行誘導(dǎo)的(Sasakawa，et al.，2001)。最后一次誘騙物分子治療1天后，切除注射了Dp的小鼠的右耳。將部分耳朵在液氮中速凍，保存在-80℃。按照廠商的說明，用QIAZOLlysis reagent(Qiagen，Amtsgericht Düsseldorf，Germany)從耳朵中分離總RNA。利用ABI PRISM7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，經(jīng)實時定量PCR檢測小鼠基因的表達(dá)。如前所述執(zhí)行所有過程(Hurst et al.，J.Immunol.，169(1)443-453(July 1，2002))。將DNase處理過的總RNAs與任意六聚體(Gibco-BRL，Carlsbad，California)、Oligo dt(Boehringer，Germany)短暫地混勻，用SurperScript IITMreverse transcriptase(Gibco-BRL，Carlsbad，California)合成cDNA第一鏈。各個基因的引物是用引物設(shè)計軟件PRIMER EXPRESS(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)設(shè)計的。引物是在Sigma Genosys(Woodlands，TX)合成的。用TAQMANPCRreagent kit(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)按照廠商的實驗方法進(jìn)行定量PCR。384孔PCR板中每個反應(yīng)的樣品取等同于25ng RNA的cDNA樣品進(jìn)行檢驗。測量每個樣品中的泛素水平，并用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。用相對泛素水平的表達(dá)量來表示細(xì)胞因子的水平。
圖4的曲線顯示Nc/Nga小鼠中塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的接觸性皮炎，在用含有0.25％NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑治療時，其相對IL-1β基因表達(dá)水平的下降。
圖5的曲線顯示塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的Nc/Nga小鼠接觸性皮炎，在用含有0.25％NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑F2治療時，其相對IL-6基因表達(dá)水平的下降。
圖6的曲線顯示塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的Nc/Nga小鼠接觸性皮炎，在用含有0.25％NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑F2治療時，其相對TNFα基因表達(dá)水平的下降。
圖7的曲線顯示塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的Nc/Nga小鼠接觸性皮炎，在用含有0.25％NF-κB分子的基于凝膠的水性制劑F2治療時，其相對TSLP基因表達(dá)水平的下降。
實施例6含NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑的遞送-小鼠模型本實施例進(jìn)一步展示了NF-κB誘騙物分子對塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的NC/Nga小鼠接觸性皮炎的效力。這個實驗中使用的基于凝膠的水性制劑F1含有0.8％月桂醇醚硫酸鈉、49％乙醇、1.5％HPMC 4000cps和48.7％100mM磷酸緩沖液。
如上所述，該項分析的基本實驗方案在Sasakawa et al.，Int.Arch.AllergyImmunol.，126(3)239-247(2001)和Masuoka et al.，Allergy，58(2)139-145(2003)中已有描述。
方法將小鼠用含有0.25％NF-κB誘騙物分子的制劑、不含任何誘騙物分子的制劑自身或者局部倍他米松治療17天。最后一次誘騙物分子治療1天后，切除注射了Dp的小鼠的右耳。將部分耳朵在10％磷酸緩沖的福爾馬林(pH7.2)中固定，包埋在石蠟中，切出3個顯微切片。將樣品用蘇木精和曙紅染色，以便進(jìn)行組織學(xué)分析，用甲苯胺藍(lán)染色來探測脫顆粒肥大細(xì)胞。
結(jié)果與分析在治療的第17天對皮損進(jìn)行組織學(xué)檢驗。蘇木精和曙紅染色顯現(xiàn)空白載體治療過的注射了Dp的耳朵，有嚴(yán)重的表皮過度增生和細(xì)胞浸潤到真皮的現(xiàn)象，而用NF-κB誘騙物分子治療使得表皮過度增生和細(xì)胞浸潤都有降低。注射了Dp的空白載體治療的小鼠的多數(shù)肥大細(xì)胞都是脫顆粒的，而用NF-κB誘騙物分子治療后脫顆粒肥大細(xì)胞減少。
圖8顯示了經(jīng)福爾馬林固定的異位皮炎小鼠皮膚的蘇木精和曙紅染色結(jié)果，(A)未進(jìn)行治療，(B)用倍他米松治療，(C)用含有重量約49％的乙醇和重量濃度約0.8％月桂醇醚硫酸鈉的制劑F1進(jìn)行治療，以及(D)用含有重量濃度約49％的乙醇和約0.8％月桂醇醚硫酸鈉，并含有NF-κB誘騙物分子的制劑F1進(jìn)行治療。
這些數(shù)據(jù)表明疾病施用NF-κB誘騙物分子能夠抑制耳朵上注射Dp引起的炎癥。相應(yīng)地，NF-κB誘騙物分子治療降低了表皮過度增生、細(xì)胞浸潤和肥大細(xì)胞的脫顆粒。
實施例7NF-κB誘騙物分子的效果-小鼠模型本實施例展示了在塵螨Ag(Dp)誘導(dǎo)的NC/Nga小鼠接觸性皮炎中，用倍他米松治療的副作用，而在NF-κB誘騙物分子治療中沒有這樣的副作用。
塵螨抗原誘導(dǎo)的異位性皮炎如上所述誘導(dǎo)得到(Sasakawa，et al.，2001)。簡而言之，在第0、2、4、7、9和11天，給六周齡雄性NC/Nga小鼠右耳腹側(cè)皮內(nèi)注射溶于鹽水的5mg Dp提取物(Greer Laboratories，Lenoir，NC)。從第11天開始，用20μl含有0.25％或0.1％NF-κB誘騙物分子的制劑F1、F6局部治療注射了Dp的耳朵，或者局部用0.1％倍他米松戊酸鹽治療作為陽性對照。治療每天兩次共進(jìn)行11天。每次皮內(nèi)注射或治療后24小時用耳朵厚度尺(Oditest，Dyer Co.，Lancaster，CA)測量耳朵厚度。
圖9顯示停止倍他米松治療會導(dǎo)致突然并且嚴(yán)重的復(fù)發(fā)腫脹和炎癥。而觀察到的NF-κB誘騙物分子的治療效果在治療停止后可以維持15天。
而且，圖10顯示用倍他米松進(jìn)行治療時，在4天內(nèi)就導(dǎo)致皮膚萎縮，與此不同，持續(xù)施用NF-κB誘騙物分子沒有表現(xiàn)出任何副作用。圖10(A)中治療的耳朵是注射了塵螨/發(fā)炎的耳朵。由于發(fā)炎，塵螨處理的耳朵的厚度增加。相反，圖10(B)中沒有治療的耳朵是正常的對側(cè)耳朵。圖10(B)表明給發(fā)炎耳朵施用倍他米松時，它會導(dǎo)致未治療耳朵變薄，表現(xiàn)出皮膚萎縮的系統(tǒng)性副作用。
圖11進(jìn)一步展示了倍他米松治療對正常耳朵的副作用。圖11顯示了沒有任何治療、用倍他米松治療和用NF-κB誘騙物分子治療的正常耳朵的厚度測量值。倍他米松和NF-κB誘騙物分子每天給藥2次，在治療的第13天讀取測量值。
圖10和11清楚地顯示局部類固醇，比如倍他米松會導(dǎo)致皮膚變薄，而NF-κB誘騙物分子持續(xù)治療不會表現(xiàn)出類似的有害副作用。
進(jìn)一步的實驗，用苦味酸天狼星紅將膠原染色。福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣品用天狼星紅F3B染料給膠原染色(Puchtler et al.，Beitrag fürPathologie，150174-187(1973)；Junqueira et al.，Histochem J.，11447-455(1979))。在真皮中，該染色法可以特異性探測III型膠原(表皮基底膜內(nèi)的IV型膠原不被染色)。實驗皮膚切片在苦味酸-天狼星紅染色前，用愛茜藍(lán)(Alcian blue)(pH＝2.5)染色來刻畫軟骨(Kiernan，J.A.，Histological &Histochemical MethodsTheory and Practice.3rdEd.，Butterworth-Heinemann，Oxford(1999))。
切片在脫石蠟和重新水化后，用愛茜藍(lán)(pH＝2.5)染色30分鐘(BioCareMedical，Walnut Creek，CA)，然后在流動DI水中洗。切片用苦味酸天狼星紅(溶于苦味酸(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)的飽和水溶液的0.1％天狼星紅F3B(CI 35782，Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO))染色過夜，隨后在流動的DI水中洗，經(jīng)乙醇脫水，用二甲苯透明并蓋上蓋片。
用Axioskop 2 microscope，(Carl Zeiss AG，Gottingen，Germany)分析載玻片，所用物鏡為20x PlanApo，亮視野照明。用NIKON DXM1200F數(shù)碼相機(jī)(Technical Instruments，Burlingame，CA)收集并在ADOBEPHOTOSHOP(Adobe，San Jose，CA)中組合數(shù)碼圖像。
結(jié)果如圖12所示。圖12顯示了倍他米松治療對正常(未發(fā)炎)對側(cè)耳朵表皮厚度的副作用。圖12表明當(dāng)利用本發(fā)明的基于凝膠的水性制劑F6來給藥，以0.25％NF-κB誘騙物分子治療正常耳朵時，沒有膠原的損失。相反，圖12顯示了用倍他米松治療的正常耳朵，表皮厚度變薄。NF-κB誘騙物分子治療的耳朵表皮厚度是102±17μm，而倍他米松治療的是67±12μm。
實施例8向豬皮膚遞送NF-κB誘騙物分子本實施例展示了豬模型中NF-κB誘騙物分子的有效遞送。豬皮膚是測試藥物遞送和滲透的理想模型，因為它與人皮膚在結(jié)構(gòu)成分和經(jīng)皮吸收方面是類似的。
在這項實驗中，將含在基于凝膠的水性制劑F2中的0.5％生物素化NF-κB誘騙物分子以30μl/cm2涂在淺膚色雌性Yorkshire豬(70-80公斤)的背部區(qū)域24小時。用PBS將皮膚徹底清洗以除去任何殘留的制劑。將皮膚凍在包埋介質(zhì)中。將皮膚冷凍切片染色以便給上藥部位的誘騙物分子定位。橫切片中的生物素化NF-κB誘騙物分子用標(biāo)記Alexa的鏈霉親和素(Molecular Probes，Eugene，OR)來顯像，并用Hoechst染色劑(MolecularProbes，Eugene，OR)復(fù)染進(jìn)行細(xì)胞核共定位。用彩色數(shù)碼相機(jī)(SPOT DigitalCamera System，Diagnostic Instruments，Inc.，Sterling Heights，MI)獲取熒光圖像。圖13顯示了用NF-κB誘騙物分子治療正常豬皮膚可以高效地做角質(zhì)形成細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的核定位。
實施例9含有NF-κB誘騙物分子的水性制劑-豬模型本實施例用豬皮膚炎癥模型展示了發(fā)明所述制劑遞送NF-κB誘騙物分子的效力。本實施例中，檢驗了二硝基氟苯致炎的豬皮膚中的藥物滲透情況。
用于本實驗的基于凝膠的水性制劑F2含有0.8％月桂醇醚硫酸鈉、10％乙醇、2.0％HPMC 4000cps和10％100mM磷酸緩沖液。
DNFB-誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)在淺膚色雌性Yorkshire豬(70-80公斤)中誘導(dǎo)對接觸二硝基氟苯(DNFB)的超敏反應(yīng)，這是通過在第一天給每個耳廓的內(nèi)側(cè)部位和腹股溝施用100μl溶于50％丙酮/10％二甲基亞砜(DMSO)/30％橄欖油混合物的10％(W/V)DNFB實現(xiàn)的。動物在第4天再次在兩個耳廓的外側(cè)部分接觸100μl溶于58％丙酮/10％二甲基亞砜(DMSO)/30％橄欖油的2％DNFB混合物。在進(jìn)行最后的DNFB攻擊前每隔一定時間，給致敏動物背部皮膚上指定的4cm2區(qū)域以25mg/cm2平均地施用局部對照制劑或者是含有NF-kB誘騙物分子的相同制劑，保留一段時間，之后用蘸水的棉花施用器擦去殘存的制劑。DNFB攻擊是在第12天，將溶于69％丙酮/30％橄欖油的1％到2.5％之間的DNFB混合物，以6.4μl/cm2平均地施用在皮膚的治療區(qū)和對照區(qū)。在施加DNFB攻擊24小時后，評價目標(biāo)區(qū)域的紅斑和水腫，之后從目標(biāo)區(qū)域收集4個打孔活體解剖樣品，直徑6mm。將活體解剖樣品保存進(jìn)行組織學(xué)評價，或者分成兩半凍在干冰上用于凝膠變動分析或mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分析。
電泳遷移率變動試驗(EMSA)和分析得自上述實驗的活體解剖樣品中存在的NF-κB誘騙物分子可以通過凝膠變動或電泳遷移率變動試驗(EMSA)來方便地測試和定性研究。該項檢測提供了一種探測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的快速和敏感的方法。這項檢測是基于這樣的觀察，即蛋白質(zhì)和DNA的復(fù)合體在非變性聚丙烯酰胺凝膠中比游離雙鏈寡核苷酸移動得慢。凝膠變動檢測的進(jìn)行是將純化蛋白或復(fù)雜的蛋白混合液(比如核提取物)與含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的32P末端標(biāo)記DNA片段一起保溫。然后將反應(yīng)產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上做分析。轉(zhuǎn)錄因子對結(jié)合位點的特異性是用過量寡核苷酸(含有目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合位點或者拼湊DNA序列)通過競爭實驗來確定。
將上面6mm活體解剖樣品的一半在液氮下粉碎成細(xì)末，然后用NE-PERNuclear和Cytoplasmic Extraction Kit(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，Illinois)按照每個試劑盒的說明提取和分離細(xì)胞核蛋白質(zhì)。將含有5μg蛋白質(zhì)的核提取物與1μl 1mg/ml多聚dIdC、1μl P32標(biāo)記的寡核苷酸探針(35fmoles)、100mM KCl、10mM Tris緩沖液(pH8.0)、5mM MgCl2、6％甘油、2mM二硫蘇糖醇、2.5％小牛血清清蛋白和0.1％NP-40在總共20μl的體積中于室溫下保溫30分鐘，然后在6％非變性聚丙烯酰胺凝膠上跑膠。將膠在80℃真空干燥，然后給磷感光板曝光，隨后在MolecularDynamics TYPHOONTM8600 imager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)上掃描。
通過凝膠圖像上P32標(biāo)記探針與NF-κB的p65蛋白之間的結(jié)合有競爭性減少可以確定目標(biāo)組織中存在著結(jié)合了NF-κB的誘騙寡核苷酸。
圖14顯示表明豬皮膚中存在著結(jié)合了NF-κB的誘騙物分子的競爭結(jié)合凝膠變動實驗的定量結(jié)果，該豬皮膚用含有10％乙醇和從0.25到1％的不同濃度的NF-κB誘騙物分子之基于凝膠的水性制劑F2治療過。這項分析中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針是放射性標(biāo)記的。將加入競爭劑后剩下的條帶量做曲線。條帶用TYPHOONTM8600 phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)進(jìn)行了定量。凝膠圖像中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針結(jié)合到P65蛋白質(zhì)的減少證明豬皮膚中存在著結(jié)合了NF-κB的誘騙物分子。
圖15顯示表明豬皮膚中存在著結(jié)合了NF-κB的誘騙物分子的競爭結(jié)合凝膠變動實驗的定量結(jié)果，該豬皮膚用含有5％乙醇以及0.25或0.5％的NF-κB誘騙物分子之基于凝膠的水性制劑F3治療過。指定為F3對照的制劑不含有NF-kB誘騙物分子。這項分析中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針是放射性標(biāo)記的。將加入競爭劑后剩下的條帶量做曲線。用TYPHOONTM8600phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)對條帶進(jìn)行定量。凝膠圖像中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針結(jié)合到P65蛋白質(zhì)的減少證明豬皮膚中存在著結(jié)合了NF-κB的誘騙物分子。
圖16顯示表明豬皮膚中存在著結(jié)合了NF-κB的誘騙物分子的競爭結(jié)合凝膠變動實驗的定量結(jié)果，該豬皮膚用含有10％乙醇和從0.25到1％不同濃度NF-κB誘騙物分子的含脂質(zhì)體的制劑F9治療過。指定為F5對照的制劑不含有NF-kB誘騙物分子。這項分析中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針是放射性標(biāo)記的。將加入競爭劑后剩下的條帶量做曲線。條帶用TYPHOONTM8600phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)進(jìn)行了定量。凝膠圖像中P32標(biāo)記的寡核苷酸探針結(jié)合到P65蛋白質(zhì)的減少證明豬皮膚中存在著結(jié)合了NF-κB的誘騙物分子。
實施例10NF-kB誘騙物分子的抗炎效果-豬模型本實施例顯示了NF-κB誘騙物分子，在用本發(fā)明的基于凝膠的水性制劑進(jìn)行給藥時，能夠有效地降低二硝基氟苯致炎的豬皮膚中促炎細(xì)胞因子(比如IL-6和IL-1β)的基因表達(dá)。
在淺膚色雌性Yorkshire豬(70-80公斤)中誘導(dǎo)對接觸二硝基氟苯(DNFB)的超敏感性，這是通過在第一天給每個耳廓的內(nèi)側(cè)部位和腹股溝施用100μl溶于50％丙酮/10％二甲基亞砜(DMSO)/30％橄欖油混合物的10％(W/V)DNFB實現(xiàn)的。動物在第4天再次在兩個耳廓的外側(cè)部分接觸100μl溶于58％丙酮/10％二甲基亞砜(DMSO)/30％橄欖油的2％DNFB混合物。在進(jìn)行最后的DNFB攻擊前每隔一定時間，給致敏動物背部皮膚上確定的4cm2區(qū)域以25mg/cm2均勻地施用局部對照制劑或者是含有NF-kB誘騙物分子的相同制劑，保留一段時間，之后用蘸水的棉花施用器擦去殘存的制劑。DNFB攻擊是在第12天，將溶于69％丙酮/30％橄欖油的1％到2.5％之間的DNFB混合物，以6.4μl/cm2均勻地施用在皮膚的治療區(qū)和對照區(qū)。在施加DNFB攻擊24小時后，收集目標(biāo)區(qū)域。將活體解剖樣品做石蠟包埋保存進(jìn)行組織學(xué)分析，并用蘇木精和曙紅染色凍在干冰上用于mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的凝膠變動分析。
將部分豬皮打孔活體解剖樣品在液氮中快速冷凍，保存于-80℃。按照廠商的說明，用QIAZOLlysis reagent(Qiagen，Amtsgericht Düsseldorf，Germany)從耳朵中分離總RNA。利用ABI PRISM7900 Sequence DetectionSystem(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，經(jīng)實時定量PCR檢測小鼠基因的表達(dá)。如前所述執(zhí)行所有過程(Hurst et al.，J.Immunol.，169(1)443-453(July 1，2002))。將DNase處理過的總RNAs與任意六聚體(Gibco-BRL，Carlsbad，California)、Oligo dt(Boehringer，Germany)短暫地混勻，用SurperScript IITMreverse transcriptase(Gibco-BRL，Carlsbad，California)合成cDNA第一鏈。各個基因的引物是用引物設(shè)計軟件PRIMER EXPRESS(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)設(shè)計的。引物是在Sigma Genosys(Woodlands，TX)合成的。用TAQMANPCR reagent kit(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)按照廠商的實驗方法進(jìn)行定量PCR。384孔PCR板中每個反應(yīng)的樣品取等同于25ng RNA的cDNA樣品進(jìn)行檢驗。測量每個樣品中的泛素水平，并作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。用相對泛素水平的表達(dá)量來表示細(xì)胞因子的水平。
圖17的曲線顯示了二硝基氟苯致炎的豬皮膚中的IL-6 mRNA表達(dá)水平。
圖18的曲線顯示，與安慰劑治療或未治療皮膚相比，經(jīng)過含有0.25和0.5％NF-κB誘騙物分子的含脂質(zhì)體制劑F9治療的豬皮膚中的相對IL-6mRNA表達(dá)水平下降。
圖19的曲線顯示用含有0.25％NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑F2治療時，二硝基氟苯致炎的豬皮膚中的相對IL-6mRNA表達(dá)水平下降。
圖20顯示用含有0.5％或1％NF-κB誘騙物分子的基于凝膠的水性制劑F10治療時，二硝基氟苯致炎的豬皮膚中的相對IL-6mRNA表達(dá)水平下降。
實施例11NF-κB誘騙物分子在減輕炎癥中的作用本項實驗的目的是確定NF-κB誘騙物分子減輕NC/Nga小鼠中塵螨誘導(dǎo)的耳部腫脹的機(jī)制。
塵螨抗原誘導(dǎo)的異位性皮炎如水所述誘導(dǎo)得到(Sasakawa，et al.，2001)。簡而言之，6周齡雄性NC/Nga小鼠皮內(nèi)注射溶于鹽水的5g Dp(GreerLaboratories)提取物。注射是在第0、2、4、7、9和10天，在小鼠右耳腹側(cè)皮內(nèi)做的。從第11天開始，將注射了Dp的耳朵用20微升含有1％NF-κB誘騙物分子或0.1％倍他米松戊酸鹽(對照)的基于凝膠的水性制劑F6局部治療2次/天，共2天。將組織用福爾馬林固定，用石蠟包埋的組織樣品通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記(TUNNEL)分析(Gavrieli et al.，J.Cell Biol.，119493-501(1992))來鑒定凋亡細(xì)胞，該分析中用dUTP-FITC作為標(biāo)記。所有的試劑在“In Situ Cell Death Detection Kit”(Roche，Indianapolis，IN，Cat.No.1 684 795)中都提供了。TUNNEL反應(yīng)后，將樣品切片用4′，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)(Molecular Probes，Eugene，OR)復(fù)染，并用PROLONG GOLD抗褪色試劑(Molecular Probes，Eugene，OR)封固。
福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣品還可以用Ki67兔單克隆抗體(NeoMarkers Cat.No.RM-9106，Lab Vision Corp.，F(xiàn)remont，CA)來鑒定增殖細(xì)胞。用專用的RETRIEVER高壓鍋(EMS，Hatfield，PA)在檸檬酸鹽緩沖液(pH＝6.1)(Target Retrieval Solution，Cat.No.S-1700，DakoCytomation，Carpinteria，CA)中做抗原修復(fù)。抗原修復(fù)后，用機(jī)械免疫染色儀(DakoCytomation Autostainer，DakoCytomation，Carpinteria，CA)做Ki67的定位。用3％H2O2抑制內(nèi)源過氧化物酶活性。用以下封閉溶液阻斷免疫試劑的非特異性結(jié)合溶于TBS(50mM Tris，pH＝7.6，500mM NaCl，0.05％Tween 20，全部購自Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)的4％BSA(SigmaChem.Co.，St.Louis，MO)、1％酪蛋白(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)、0.5％硬骨魚魚皮明膠(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。封閉之后，將切片與Ki67抗體(1μg/ml終濃度)保溫1小時。切片在清洗后與標(biāo)記過氧化物酶(DakoCytomation，Carpinteria，CA)的抗兔IgG ENVISION試劑(1∶1 dilution)保溫30分鐘。用DAB底物(DAB+reagent，DakoCytomation，Carpinteria，CA)檢測過氧化物酶活性。將切片徹底清洗，蓋上蓋片(不做復(fù)染)。樣品用Axioskop 2 epi-熒光顯微鏡(Carl Zeiss AG，Gottingen Germany)做分析，所用物鏡是20x NeoFluar。數(shù)碼圖像用SPOT RTTM照相機(jī)(DiagnosticInstruments，Sterling Heights，MI)收集并在ADOBEPHOTOSHOP(Adobe，San Jose，CA)中進(jìn)行整合。
因為阻斷NF-κB的功能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制增殖都相關(guān)，我們對塵螨誘導(dǎo)的發(fā)炎耳朵進(jìn)行了TUNNEL分析(圖21)和Ki67染色(圖22)。圖21顯示在皮膚的表皮和真皮區(qū)，都觀察到由施用在發(fā)炎耳朵上的倍他米松和NF-kB誘騙物分子所介導(dǎo)的凋亡(綠色核)增強(qiáng)了。相反，拼湊誘騙物沒有引起這樣的反應(yīng)。Ki67染色(棕色核，圖22)檢測到表皮和真皮層細(xì)胞增殖加強(qiáng)。施用在發(fā)炎耳朵上的倍他米松和NF-κB誘騙物分子使有絲分裂指數(shù)急劇下降，表明它們抑制了發(fā)炎耳朵中的細(xì)胞增殖。與未治療發(fā)炎耳朵相比，拼湊誘騙物沒有帶來任何Ki67陽性細(xì)胞的變化。
圖21和22顯示局部NF-κB誘騙物分子治療在Dp誘導(dǎo)的炎癥中，導(dǎo)致凋亡增加和炎癥細(xì)胞的增殖下降。在倍他米松治療中可見到類似的效果。這些觀察解釋了NF-κB誘騙物分子在小鼠類異位性皮炎模型中的強(qiáng)大和長久的抗炎效果。
實施例12NF-κB誘騙物分子設(shè)計我們設(shè)計了NF-κB dsODN誘騙物分子并對其結(jié)合和/或競爭結(jié)合NF-κB的能力進(jìn)行了檢測。在某個特定方面，本發(fā)明的目的是設(shè)計這樣的NF-κB誘騙物分子，即較之p50/p50同源二聚體，它們更優(yōu)先結(jié)合p65/p50和/或cRel/p50異源二聚體。不會阻斷p50/p50同源二聚體的結(jié)果是，發(fā)明所述選擇性誘騙物分子使得這些同源二聚體可以阻斷受NF-κB調(diào)節(jié)的基因的啟動子，這就給基因轉(zhuǎn)錄提供了又一水平上的負(fù)調(diào)節(jié)。
設(shè)計寡核苷酸誘騙物分子時，利用了由晶體結(jié)構(gòu)研究和已知NF-κB結(jié)合位點的計算分析提供的信息。
正如以上討論過的，基于對結(jié)合到免疫球蛋白輕鏈基因(含有5’-GGGACTTTCC-3’(SEQ ID NO2)的共有序列)上的p50/p65異源二聚體晶體結(jié)構(gòu)的研究，已知p50與5堿基對亞位點5’-GGGAC-3’(SEQ ID NO3)接觸，而p65與4堿基對亞位點5’TTCC-3’(SEQ ID NO4)接觸。我們設(shè)計了一系列NF-κB寡核苷酸誘騙物分子，它們在共有結(jié)合位點的5’端含有更少的G，其目的是為了制備對p50/p50同源二聚體親和性更低，但仍能結(jié)合p65/p50異源二聚體的誘騙物分子。為了方便識別和陳述，給這些寡核苷酸誘騙物分子指定“核心”和“旁側(cè)”字母代碼。核心指定字母代碼“A”到“L”，旁側(cè)“T”到“Z”。用凝膠異位實驗來檢測誘騙物分子，確定它們與一個高親和性放射標(biāo)記的寡核苷酸競爭結(jié)合NF-κB的能力。結(jié)合NF-κB的DNA共有序列選自關(guān)于與NF-κB有關(guān)的DNA-蛋白質(zhì)相互作用的出版物，包括Blank et al.，EMBO J.104159-4167(1991)；Bours et al.Mol.Cell.Biol.12685-695(1992)；Bours et al.U.Cell 72729-739(1993)；Duckett et al.Mol.Cell.Biol.131315-1322(1993)；Fan C.-M.，Maniatis T.，Nature 354395-398(1991)；Fujita et al.，Genes Dev.6775-787(1992)；Fujita et al.Genes Dev.71354-1363(1993)；Ghosh et al.，Nature 373303-310(1995)；Ghosh et al.，Cell621019-1029(1990)；Grumont et al.，Mol. Cell.Biol.148460-8470(1994)；Henkel et al.，Cell 681121-1133(1992)；Ikeda et al.Gene 138193-196(1994)；Kunsch et al.，Mol.Cell.Biol.124412-4421(1992)；LeClair et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898145-8149(1992)；Li C.-C.et al.，J.Biol.Chem.26930089-30092(1994)；Matthews et al.，Nucleic Acids Res.211727-1734(1993)；Mueller et al.，Nature 373311-317(1995)；Neri et al.，Cell671075-1087(1991)；Nolan et al.，Cell 64961-969(1991)；Paya et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897826-7830(1992)；Plaksin et al.，J.Exp.Med.1771651-1662(1993)；Schmid et al.，Nature 352733-736(1991)；Schmitz M.L.，Baeuerle P.A. EMBO J.103805-3817(1991)；Ten et al.，EMBO J.11195-203(1992)；Toledano et al.，J.Mol.Cell.Biol.13852-860(1993)；Urban et al.，EMBO J.101817-1825(1991)。
在這些已有信息的基礎(chǔ)上，我們得到一組誘騙物分子做初始篩選。這些誘騙物分子包括″突變誘騙物分子″、拼湊誘騙物分子、其5’或3’端長度不同的誘騙物分子，以及核心區(qū)和/或旁側(cè)序列中有替代堿基組成的誘騙物分子。
為了更好地理解NF-κB核心結(jié)合位點附近的堿基組成，將核心結(jié)合位點與已知結(jié)合序列進(jìn)行計算序列比對(僅正向鏈)。基于這項序列比對，產(chǎn)生了主要的幾組誘騙物分子，它們的核心結(jié)合位點略有不同。
表1中列出了主要的核心和旁側(cè)序列。
表1
電泳遷移率變動分析(EMSA)采用EMSA分析來研究NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的寡核苷酸誘騙物分子。利用一個放射標(biāo)記的寡核苷酸探針(非哺乳動物，根據(jù)來自HIV的NF-κB啟動子，序列113/114)，用來自活化單核細(xì)胞細(xì)胞系的核提取物檢測與p65/p50、cRel/p50和p50/p50的結(jié)合，所述探針對NF-κB家族的相關(guān)成員有高親和性。利用上述修飾寡核苷酸競爭結(jié)合前面提到的NF-κB家族成員，就有可能比較這些寡核苷酸相對高親和性放射標(biāo)記探針的結(jié)合親和性，以及它們之間的比較。該項分析還使我們能夠設(shè)計選擇性結(jié)合NF-κB家族的特定成員的誘騙物分子。通過使用濃度逐漸升高的不同寡核苷酸，我們觀察到刪除或改變結(jié)合位點里的靶殘基，就可能特異地降低誘騙物分子與p50/p50同源二聚體的結(jié)合，而對p65/p50和cRel/p50異源二聚體的親和性保持不變。
如下進(jìn)行NF-κB凝膠變動分析(EMSA)。用T4多核苷酸激酶(Promega)將含有共有NF-κB結(jié)合位點(5’AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 3’)(SEQID NO26)的雙鏈寡核苷酸末端標(biāo)記上γ32P-ATP。1微克由LPS刺激的THP-1細(xì)胞(人單核細(xì)胞細(xì)胞系)制備得到的核提取物與35pmol放射標(biāo)記的探針，在有或沒有競爭性未標(biāo)記NF-κB雙鏈寡核苷酸(dsODN)或拼湊dsODN的情況下保溫。保溫于室溫下，在包含10mM Tris-HCl pH8、100mM KCl、5mMMgCl2、2mM DTT、10％甘油、0.1％NP-40、0.025％BSA和1μg Poly-dIdC的20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行30分鐘。將反應(yīng)體系上樣到6％聚丙烯酰胺凝膠中，進(jìn)行電泳并干燥。將干燥好的膠顯影，并用Typhoon 8600 PhosphorImager(Amersham)和ImageQuant軟件定量。復(fù)合體中含有的結(jié)合了放射標(biāo)記寡核苷酸探針的NF-κB蛋白質(zhì)的身份，是通過在加入放射標(biāo)記探針前，將反應(yīng)與NF-κB家族每個成員的特異抗體預(yù)先保溫5分鐘來鑒定的。
核酸酶降解和化學(xué)修飾天然DNA在細(xì)胞內(nèi)會被迅速降解，這主要是通過3’外切核酸酶的作用，但也是內(nèi)切核酸酶攻擊的結(jié)果。因此，寡核苷酸誘騙物分子設(shè)計好了，要對它們進(jìn)行修飾以增加其穩(wěn)定性。將核苷酸間鍵合中的一個不成鍵氧原子用硫基團(tuán)代替，產(chǎn)生所謂硫代磷酸酯(PS)寡脫氧核苷酸，在這方面非常成功。這些分子是相對核酸酶抗性的，但是研究表明相對3′-末端修飾的和未修飾的寡核苷酸誘騙物分子，它們表現(xiàn)出非特異性蛋白結(jié)合(Brown et al，J.Biol.Chem.269(43)26801-5(1994))。因此，我們進(jìn)行了一組實驗以便確定在3’、5’端或內(nèi)部位點需要多數(shù)個硫能夠給我們的寡核苷酸誘騙物分子提供核酸酶抗性，同時維持已有的特異性。
EMSA結(jié)果分析正如前面討論過的，本文公開的工作的一個目的是開發(fā)相對p50/p50同源二聚體來說，優(yōu)先結(jié)合NF-κB p65/p50和/或cRel/p50異源二聚體的NF-κB寡核苷酸誘騙物分子。實驗結(jié)果表明與p65/p50和cRel/p50的結(jié)合一般是相當(dāng)?shù)?，因此我們的分析僅對p65/p50條帶進(jìn)行了定量。
圖23顯示了p65/p50與一些NF-κB誘騙物分子的結(jié)合。圖24顯示了p50/p50與一些NF-κB誘騙物分子的結(jié)合。
采用特異性/親和性系數(shù)來定量優(yōu)選結(jié)合，計算如下特異性/親和性系數(shù)＝(Sp50/p50-Sp65/p50)×Sp50/p50/Sp65/p50
其中Sp50/p50等于競爭50％p50/p50與來自HIV的非哺乳動物NF-κB啟動子(sequence 113/114)之間的結(jié)合所需的摩爾過量數(shù)；Sp65/p50等于競爭50％p65/p50與來自HIV的非哺乳動物NF-κB啟動子(sequence 113/114，其中對應(yīng)序列113的反向鏈定為″114″)之間的結(jié)合所需的摩爾過量數(shù)。如果誘騙物分子在任何測試的摩爾比率都不能競爭至少50％的結(jié)合，分?jǐn)?shù)(S)定為100。
優(yōu)選的誘騙物分子應(yīng)當(dāng)對p65/p50異源二聚體的分?jǐn)?shù)較低，對p50/p50同源二聚體的分?jǐn)?shù)較高。誘騙物分子與p65/p50異源二聚體的特異性相對與p50/p50同源二聚體的特異性，和它們分?jǐn)?shù)的不同(score p50/p50-scorep65/50)是成比例的。表2總結(jié)了如上所述進(jìn)行的EMSA競爭結(jié)合實驗的結(jié)果，其中從最特異的誘騙物分子(最高特異性/親和性系數(shù))開始列出了誘騙物分子。
表2
E-Z-4是刪除了兩個5’和3’堿基的E-ZE-Z even是E-Z減去兩個5’堿基E-Z a to C Even is位點6的A改為C的E-ZA-Z-2是刪除了5’和3’堿基的A-ZE-A是核心E在5’和3’末端添加了AE-AG Flank是核心E，5’旁側(cè)序列是AAGA，3’旁側(cè)序列是AGAGE-AT Flank是核心E，5’旁側(cè)序列是ATAT，3’旁側(cè)序列是TTAAE-CAFlank是核心E，5’旁側(cè)序列是CAAC，3’旁側(cè)序列是ACACE-CAGT Flank是核心E，5’旁側(cè)序列是CAGT，3’旁側(cè)序列是ACTGH-Z’(-3’2BP)是刪除了兩個5’堿基的H-ZH-Z’(-3’1BP)是刪除了兩個5’堿基，3’端添加一個T的H-ZE-Z-3是5’端刪除AGT，3’端刪除C的E-ZE-Z-6是5’端刪除AGTT，3’端刪除GC的E-Z
表2給出的數(shù)據(jù)表明有更高p65/p50特異性的誘騙物分子，非?？赡芏加小癊”或“D”或″H″核心序列，以及“Z”或″W″或″V″或″U″旁側(cè)序列。在一組更優(yōu)選誘騙物分子中，核心序列是″E″或″D″，旁側(cè)序列是″Z″?？紤]到其他一些參數(shù)，從前幾位候選分子中選出指定為153/154的誘騙物分子為最佳(見下文)。
分析DNA骨架的化學(xué)修飾采用類似分析對被測誘騙物分子之DNA骨架的化學(xué)修飾進(jìn)行了評價。
表3具有不同DNA骨架的153/154的Sp50/p50/Sp65/p50和特異性/親和性系數(shù)
在上面表3中，骨架的化學(xué)組成用兩個命名表示，第一個表示鏈153的化學(xué)組成，第二個表示鏈154的化學(xué)組成。全部是磷酸二酯的骨架指定為“PO”，全部是硫代磷酸酯的骨架指定為“PS”?；祀s的骨架命名為“H”，后面是從3’端開始的硫代磷酸酯鍵的數(shù)量。因此，H3意味著最3’端的三個鍵是硫代磷酸酯鍵，其他骨架鏈接是磷酸二酯鍵。如果只出現(xiàn)一個命名(比如只有PO)，則兩條鏈具有相同的骨架化學(xué)組成。
表3給出的數(shù)據(jù)表明，如果任何一條鏈全部是硫代磷酸酯鍵(例如PS/PO或PO.PS)，則該誘騙物分子對p65/p50和p50/p50的親和性高，從而就會缺少所需的特異性。雖然不總是如此，但一般來說硫代磷酸酯鍵數(shù)目越多會使得特異性降低。通常有8個以上硫代磷酸酯鍵的雜合鏈沒有特異性，而少于7個硫代磷酸酯鍵會維持可以接受的親和性和特異性。但是，H4/H4只有極低的親和性，而H3/H3和H5/H5都在可以接受的范圍內(nèi)。H11/PO和PO/H11有良好的親和性和特異性?；诎胨テ?、特異性和親和性，H3/H3、H5/H5、H6/H6和H7/H7被鑒定為153/154誘騙物分子的最優(yōu)骨架。其他誘騙物分子的最優(yōu)骨架化學(xué)組成能夠以類似方式檢測和確定。
對其他轉(zhuǎn)錄因子的特異性誘騙物分子必須只特異性地阻斷靶轉(zhuǎn)錄因子，而不能非特異性地結(jié)合并阻斷無關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。事實表明有可能設(shè)計這樣的NF-κB誘騙物分子，它們在進(jìn)行EMSA時不顯示對無關(guān)啟動子的任何非特異性效應(yīng)。具體來說，利用對應(yīng)泛素轉(zhuǎn)錄因子Oct-1的啟動子序列的放射標(biāo)記寡核苷酸探針，EMSA顯示153/154(其中″154″是指對應(yīng)序列″153″的反向序列)PO和H3NF-κB誘騙物分子沒有表現(xiàn)出對該啟動子的任何結(jié)合親和性(圖25)。這一點很重要，因為寡核苷酸對細(xì)胞內(nèi)其他重要蛋白質(zhì)的非特異性效應(yīng)可能造成誘騙物分子對治療個體的不受歡迎的毒性。
半衰期天然DNA在細(xì)胞內(nèi)會被迅速降解，主要是3′外切核酸酶的作用，也是內(nèi)切核酸酶攻擊的結(jié)果。因此，寡核苷酸誘騙物分子設(shè)計好時，要對它們進(jìn)行修飾以增加其穩(wěn)定性。將核苷酸間鍵合中的一個不成鍵氧原子用硫基團(tuán)代替，產(chǎn)生所謂硫代磷酸酯(PS)寡脫氧核苷酸，在這方面非常成功。這些分子是相對核酸酶抗性的，但是研究表明相對3′-末端修飾的和未修飾的寡核苷酸誘騙物分子，它們表現(xiàn)出非特異性蛋白結(jié)合(Brown et al，J.Biol.Chem.269(43)26801-5(1994))。因此，我們進(jìn)行了一組實驗以便確定在3’、5’端或內(nèi)部位點需要多數(shù)個硫能夠給我們的寡核苷酸誘騙物分子提供核酸酶抗性，同時維持已有的特異性。
通過以上描述的凝膠變動分析對結(jié)合特異性進(jìn)行評定。3′-外切核酸酶抗性是用標(biāo)準(zhǔn)的蛇毒分析法檢驗的(Cummins et al.，Nucleic Acids Res.232019-24(1995))。為了評定誘騙物分子對更相關(guān)的哺乳動物核酸酶活性的抗性，采用了一種分析方法，其中使用了由活化的巨噬細(xì)胞制備得到的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核提取物(Hoke et al.，Nucl.Acids Res.19(20)5743-8(1991))。每次分析中都用陽性對照證實了提取物的活性。實驗證明將誘騙物分子的每個鏈的3′端罩上幾個硫基團(tuán)就足以使它免于核酸酶的降解。
綜合這些數(shù)據(jù)表明對p50/p65選擇性NF-κB誘騙物分子來說，19聚體寡核苷酸雙鏈3′端的3-5個硫就足以使該誘騙物分子免于核酸酶的降解。此外，它還能保持對轉(zhuǎn)錄因子家族中特異亞基的結(jié)合，并且不會結(jié)合無關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。這些數(shù)據(jù)論證了本發(fā)明能夠提供方法和手段，用于設(shè)計尋靶到轉(zhuǎn)錄因子(尤其是NF-κB)的特異性和持續(xù)性寡核苷酸誘騙物分子。
包含核定位信號的NF-κB誘騙物分子為了確定含有核定位信號(NLS)的肽能否提高寡核苷酸誘騙物分子進(jìn)入細(xì)胞核，Sigma Genosys在猴病毒40大腫瘤抗原(PKKKRKVEDPYC)(SEQID NO78)的基礎(chǔ)上合成了一個有NLS序列的肽，并將其如下偶聯(lián)到NF-κB153 H3寡核苷酸上。簡單來說，首先將6.5nmols寡核苷酸與40倍摩爾過量的接頭Sulfo-SMCC(Pierce)于室溫培育2小時。用NAP-10柱子(PharmaciaBiotech)從反應(yīng)中去除多余的接頭后，將活化的寡核苷酸與5倍摩爾過量的NLS肽于室溫培育過夜。將1μl反應(yīng)上樣到20％PAGE膠(非變性)進(jìn)行分析來評定成功偶聯(lián)上NLS肽的寡核苷酸的百分比。凝膠用SYBR Gold(Molecular Probes)染色，并在Typhoon Phosphorimager(Amersham)上顯影。偶聯(lián)NLS-肽的單鏈153 H3濃度通過OD吸光度確定。然后使偶聯(lián)物退火到它的互補(bǔ)鏈154 H3(相同摩爾量)，后者在5’端含有生物素分子。至此成為雙鏈的NLS誘騙物分子上的生物素分子使得能夠通過顯微鏡觀察(借助鏈霉親和素)到誘騙物分子的位置。
實施例13E2F誘騙物分子1.寡核苷酸誘騙物分子的合成圖26所示雙鏈寡核苷酸誘騙物分子是用自動DNA合成儀(Model 380B；Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)合成的。誘騙物分子經(jīng)柱層析純化、冷凍干燥并溶于培養(yǎng)基中。某種誘騙物分子的濃度經(jīng)分光光度法測定。
SEQ ID NOS94和95(″參照誘騙物分子″)代表的雙鏈寡核苷酸分子是已知的誘騙物，目前正在臨床開發(fā)。SEQ ID NOS96和97(″新誘騙物分子″)代表的雙鏈寡核苷酸誘騙物是其特性顯著改善的變異體，而SEQ ID NOS99和100代表的″拼湊誘騙物″用作陰性對照。
新誘騙物分子的Tm是55℃，比參照分子的42.3℃的Tm明顯高。所以，新誘騙物分子預(yù)計比參照誘騙物分子在體內(nèi)穩(wěn)定地多。
2.競爭性凝膠變動分析新誘騙物分子與參照誘騙物以及陰性對照(拼湊誘騙物)在競爭E2F結(jié)合到標(biāo)記探針(探針含有E2F共有結(jié)合位點)上的差異，在LPS刺激的THP-1細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了體外檢測，測試基本按照Morishita et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 5855-5859(1995)中描述的實驗方案進(jìn)行。如Horiuchi等(J.Biol.Chem.26616247-16254(1991))所述由血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)制備核提取物。如下進(jìn)行凝膠阻滯分析將含有E2F結(jié)合位點(5’CTAGATTTCCCGCGGATC 3’)(SEQ ID NO3)的雙鏈寡核苷酸用T4多核苷酸激酶(Promega)末端標(biāo)記上γ32P-ATP。5微克由LPS刺激的THP-1細(xì)胞(人單核細(xì)胞細(xì)胞系)制備得到的核提取物與50pmol放射標(biāo)記的探針，在有或沒有競爭性新誘騙物分子、參照誘騙物分子或陰性對照(拼湊誘騙物分子)的情況下保溫。保溫于室溫下，在包含10mMTris-HCl pH7.4、40mM KCl、1mM DTT、0.1mM EDTA、8％甘油、0.05％NP-40和0.5μg Poly-dIdC的20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行30分鐘。將反應(yīng)體系上樣到6％聚丙烯酰胺凝膠中，進(jìn)行電泳并干燥。將干燥好的膠顯影，并用Typhoon8600 PhosphorImager(Amersham)和ImageQuant軟件定量。復(fù)合體中含有的結(jié)合了放射標(biāo)記寡核苷酸探針的E2F蛋白質(zhì)的身份，是通過在加入放射標(biāo)記探針前，將反應(yīng)與E2F家族每個成員的特異抗體預(yù)先保溫5分鐘來鑒定的。抗E2F1(sc-193x，sc-251x)、E2F2(sc-633x)、E2F3(sc-878x，sc-879x)、E2F4(sc-866x)、E2F5(sc-999x)、p107(sc-318x)和細(xì)胞周期蛋白A(sc-239x)的抗體購自Santa Cruz Biotechnology。
如圖27所示，新誘騙物分子能夠在平滑肌提取物中競爭標(biāo)記探針與E2F之間的結(jié)合，在10倍摩爾過量時，超過60％(對比參照誘騙物分子僅阻斷7％)；在40倍摩爾過量時，超過90％(對比參照誘騙物分子只阻斷40％)。因此，所述新誘騙物分子大概比已有的參照誘騙物分子競爭性高一個數(shù)量級。
實施例14HIF-1誘騙物分子設(shè)計結(jié)合HIF-1的DNA共有序列選自關(guān)于HIF-1相關(guān)的DNA-蛋白質(zhì)相互作用的出版物，是從BioBase TRANSFAC(version7.2)數(shù)據(jù)庫總結(jié)的序列組中選出來的。我們確認(rèn)了它們的相應(yīng)調(diào)控區(qū)位置，并從最新的基因組數(shù)據(jù)庫中找到擴(kuò)展的旁側(cè)基因組DNA序列(見表4)(人的是July 2003版本；小鼠的是Feb，2003版本；大鼠的是June，2003版本)。
表4.實驗鑒定的HIF-1結(jié)合位點及相應(yīng)的旁側(cè)序列
核心共有結(jié)合位點陣列的構(gòu)建為了確認(rèn)HIF-1核心結(jié)合位點附近的堿基組成，基于以上已知的HIF-1核心結(jié)合序列將核心結(jié)合位點進(jìn)行了計算序列比對。在比對結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們制作了一個表或者“陣列”來計算學(xué)地描述核心和緊接的旁側(cè)區(qū)的堿基組成(見圖28)。圖28從統(tǒng)計學(xué)角度給出了特定位點出現(xiàn)特定堿基的概率。
HIF-1結(jié)合基元的晶體結(jié)構(gòu)分析
HIF-1屬于基本的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)DNA結(jié)合蛋白家族。位于位點30到位點70的氨基酸(HIF-1a亞基總共826個氨基酸中)負(fù)責(zé)DNA識別和結(jié)合親和性?，F(xiàn)在還沒有HIF-1 DNA結(jié)合基元的晶體結(jié)構(gòu)，但是其他有類似DNA結(jié)合基元的bHLH成員的已知信息可以提供有用的結(jié)構(gòu)信息(Michel et al.，Theor Chem Acc.10151-56(1999)；Michel et al.，J.Biomolecular Structure & Dynamics 18169-179(2000)；Michel et al.，Biochimica et Biophysica Acta 157873-83(2002))。這些研究提示了位于HIF-1結(jié)合基元內(nèi)的幾個殘基的重要性。中間核心ACGTG(SEQ ID NO165)對HIF-1復(fù)合體(HIF-1α和ARNT)的結(jié)合至關(guān)重要，核心序列緊接的5’上游堿基組成對HIF-1結(jié)合的特異性和親和性也非常重要。DNA足跡研究還提示了5’上游區(qū)域可能對HIF-1誘導(dǎo)的基因表達(dá)非常重要。因此，我們設(shè)計和測試了有不同序列和不同長度的5’旁側(cè)區(qū)的候選誘騙物分子。
初始HIF-1a誘騙物分子的序列基于從已公開的對HIF-1結(jié)合的研究，已有HIF-1核心結(jié)合序列、計算學(xué)核心結(jié)合陣列、有關(guān)bHLH家族的晶體結(jié)構(gòu)模型，以及特定生物信息學(xué)方法(用于排除那些可能結(jié)合到其他轉(zhuǎn)錄因子的誘騙物分子)獲得的知識，我們得到一組誘騙物分子進(jìn)行初篩(見表5)。這些誘騙物分子包括″突變誘騙物分子″、″拼湊誘騙物分子″，5’或3’端長度不同的誘騙物分子，以及在核心區(qū)或旁側(cè)有替代堿基組成的誘騙物分子。
表5.用于篩選的初始序列
上面表5中連在一起列出的序列(例如801/802；803/804等)是互補(bǔ)的，它們構(gòu)成一個雙鏈寡核苷酸誘騙物分子的兩條鏈。例如，HIF誘騙物分子，HIF-1誘騙物分子895896H3具有上鏈-CAC CAG CGT ACG TGC CTC*A*G*G(SEQ ID NO340)和互補(bǔ)鏈-CCT GAG GCA CGT ACG CTG*G*T*G(SEQ ID NO341)。
利用TransAM Kit進(jìn)行的初篩為了評定所述寡核苷酸對含HIF-1α復(fù)合體的相對親和性，使用了HIF-1TransAM分析法(Active Motif，Catalog#47096)。分析按照廠商的使用說明進(jìn)行。簡單來說，將含有低氧反應(yīng)元件(HRE)的雙鏈寡核苷酸固定到96孔板上。將含有HIF-1α復(fù)合體的核提取物與固定的寡核苷酸保溫并使之進(jìn)行結(jié)合。洗去未結(jié)合物質(zhì)，用特異識別HIF-1α的抗體檢測結(jié)合了的HIF-1α?？笻IF-1α抗體借助標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)的二級抗體來檢測，利用比色底物反應(yīng)測量每個孔中的HRP量，并用微孔板分光光度計讀數(shù)。
我們測定了候選誘騙物分子競爭HIF-1α結(jié)合固定在微孔板上的HRE元件的能力，并進(jìn)行了比較來獲知其相對結(jié)合親和性。以逐漸增加的摩爾比率(相對固定在微孔板上的寡核苷酸)加入候選誘騙物分子來競爭結(jié)合含HIF-1α的復(fù)合體。檢測中加入的誘騙物分子的量包括0.625、1.25、2.5、5、10和20皮摩。與對HIF-1α親和性低的誘騙物分子相比，含有以高親和性結(jié)合HIF-1α的競爭誘騙物分子的微孔會給出更低的吸光度讀數(shù)。然后將所有潛在誘騙物分子進(jìn)行比較并排序以便評定它們的相對結(jié)合親和性。
TransAM結(jié)果分析篩選是用不同誘騙物分子濃度進(jìn)行的。對于每個UV吸光讀數(shù)，通過計算樣品與野生型對照的吸光讀數(shù)的比率來做歸一化。結(jié)果總結(jié)于表6。比率越高表示與野生型對照相比，其競爭結(jié)合HIF-1α的能力越低。比率越低(低于1.0或接近1.0)代表結(jié)合更強(qiáng)或競爭力更強(qiáng)。
表6
(1)比較緊靠5’的序列表明，GCAG或GGAG或GCAT或CCCT或CCGT的堿基組成會造成比野生型誘騙物分子弱(例如比率更高)的競爭力。
(2)如果我們將比率進(jìn)行整理，那些競爭力強(qiáng)(例如比率較低)的誘騙物分子多數(shù)在位點“-4”和“-1”都分別是堿基“G”和堿基“T”(圖29)。對較好的競爭誘騙物分子，其緊靠核心序列(ACGTG；SEQ ID NO336)之前的4個堿基更可能是“GCGT”(SEQ ID NO337)(圖29)。圖29還提示了位點“-4”是“G”和位點“-1”也是“G”的組合對結(jié)合親和性并沒有幫助，位點“-3”是“A”和位點“-2”是“A”的組合同樣是這樣。
通過EMSA進(jìn)行的證實如下進(jìn)行HIF-1凝膠變動實驗(EMSA)。用T4多核苷酸激酶(Promega)將含有共有HIF-1結(jié)合位點的雙鏈寡核苷酸末端標(biāo)記上γ32P-ATP。1微克由LPS刺激的THP-1細(xì)胞(人單核細(xì)胞細(xì)胞系)制備得到的核提取物與35pmol放射標(biāo)記的探針，在有或沒有競爭性未標(biāo)記HIF-1雙鏈寡核苷酸(dsODN)或拼湊dsODN的情況下保溫。保溫于室溫下，在包含10mM Tris-HCl pH8、100mM KCl、5mM MgCl2、2mM DTT、10％甘油、0.1％NP-40、0.025％BSA和1μg Poly-dIdC的20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行30分鐘。將反應(yīng)體系上樣到6％聚丙烯酰胺凝膠中，進(jìn)行電泳并干燥。將干燥好的膠顯影，并用Typhoon8600 PhosphorImager(Amersham)和ImageQuant軟件定量。復(fù)合體中含有的結(jié)合了放射標(biāo)記寡核苷酸探針的HIF-1蛋白的身份，是通過在加入放射標(biāo)記探針前，將反應(yīng)與HIF-1家族每個成員的特異抗體預(yù)先保溫5分鐘來鑒定的。
挑選出來的誘騙物分子的結(jié)合能力通過常規(guī)EMSA方法得到證實。
說明書全文引用的所有參考文獻(xiàn)都引入本文作參考。
盡管在解釋本發(fā)明時借助了一些特定實施方案，但發(fā)明并非局限于此。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，很顯然可以在不偏離本發(fā)明的想法的情況下對其進(jìn)行改進(jìn)和變動。所有這類改進(jìn)和變動都明確地屬于本文的范圍。
序列表<110>阿尼西瓦股份有限公司(Anesiva，Inc.)DAJEE，MAYAEHRHARDT，ROLFHOFLAND，HANSMCEVOY，LESLIEMUCHAMUEL，TONYSCHRYVER，BRIAN B.
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<221>misc_feature<222>4<223>r＝嘌呤<220>
<221>misc_feature<222>(5)...(6)<223>n＝任何堿基<220>
<221>misc_feature<222>(7)...(8)<223>y＝嘧啶<400>1gggrnnyycc 10<210>2<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>共有核酸序列<400>22ttgaaggc 8
<210>23<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>23gatttcc7<210>24<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>24gatttccc 8<210>25<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>25ggactttccc 10<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>26agttgagggg actttcccag gc 22<210>27<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>27ctcggacttt cctgt 15<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>28agttgaggga tttccaggc 19<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>29agttgaggac tttcccaggc 20<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>30agttgaggac tttccaggc 19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>31agttgaggat ttcccaggc 19<210>32<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>32tcggactttc cctc14<210>33<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>33atggactttc cgt 13<210>34<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>34tcggatttcc tc 12<210>35<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>35
tcggactttc ctc 13<210>36<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>36ttgaggactt tccaggc 17<210>37<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>37tcgggacttt cctc14<210>38<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>38agttgaggat ttccaggc18<210>39<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>39tgaggacttt ccaggctc18<210>40<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>40tgaggacttt ccaggc 16<210>41<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>41ttgcggactt tccaggc 17<210>42<211>14<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>42ctgggacttt cctc14<210>43<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>43gttgagggac tttccagg18<210>44<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>44ctcgggactt tcctgt 16<210>45<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>45tcggggactt tccctc 16<210>46<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>46cagtagtatg tgagcctgc 19<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>47ttgccgtacc tgacttagcc 20<210>48<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>48agttgagggg actttcccag gc 22<210>49<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>49tcgggatttc ctc 13<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>50agttgaggga ctttccaggc 20<210>51<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>51agttgagact ttccaggc18<210>52<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>52agttgagact ttcccaggc 19<210>53<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>53ggactttcc 9<210>54<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>54aggactttcc a 11<210>55<211>13
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>55ctggactttc ctc 13<210>56<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>56aagaggactt tccagag 17<210>57<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>57atat ggactt tcctt aa 17<210>58<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>58caacggactt tccacac 17<210>59<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>59cagtggactt tccactg 17<210>60<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>60tcgactttcc ctc13<210>61<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>61ctggggactt tccctc 16<210>62<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>62tcggatttcc ctc 13<210>63<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>63tcgatttcct c 11<210>64<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>64tcgatttccc tc 12<210>65<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>65ctcggggact ttccctca18<210>66<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>66ctcggacttt cctca 15<210>67<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>67ttgaggattt ccaggc 16<210>68
<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>68ttgaggattt ccaggct 17<210>69<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>69ttgaggattt ccaggctc18<210>70<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>70tgaggacttt ccagg 15<210>71<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>71gaggactttc cag 13<210>72<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>72gttgaggact ttccaggc18<210>73<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>73gaggactttc caggc 15<210>74<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>74aggactttcc aggc14<210>75<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>75aggactttcc aggctc 16<210>76<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>76ttgaggactt tccaggctc 19<210>77<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>//ctcggggact ttccctgt18<210>78<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>78aggactttcc a 11<210>79<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>79ccttgaa 7<210>80<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>80agttga 6
<210>81<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>81ttga 4<210>82<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>82agttgc 6<210>83<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>其有核酸序列<400>83gttga 5<210>84<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>84aaga 4<210>85<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>85atat 4<210>86<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>86caac 4<210>87<211>4<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>87cagt 4<210>88<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>88aggc 4<210>89<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>89agag 4<210>90<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>90ttaa 4<210>91<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>91acac 4<210>92<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>92actg 4<210>93<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>93aggct 5
<210>94<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>94ctagatttcc cgcg14<210>95<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>95taaagggcgc ctag14<210>96<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>96ctagatttcc cgcggatc18<210>97<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>97gatctaaagg gcgcctag18<210>98<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>98tccagcttcg tagc14<210>99<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>99gaaggatcga tcg 13<210>100<211>8<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>100tttsgcgs 8<210>101<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>101tttggcgc 8<210>102<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>102tttcgcgc 8<210>103<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>103tttcccgc 8<210>104<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>104tttgccgc 8<210>105<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>105cttcccgc 8<210>106<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>106
gttcccgc 8<210>107<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>107cttcgcgc 8<210>108<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>108ttagcgcc 8<210>109<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>109tgagcgcc 8<210>110<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>110gtagcgcc 8<210>111<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>111ggagcgcc 8<210>112<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>112ctagcgcc 8<210>113<211>8<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>113cgagcgcc 8<210>114<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>114gttcgcgc 8<210>115<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>115tttgcgcc 8<210>116<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>116tgtgcgcc 8<210>117<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>117gttgcgcc 8<210>118<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>118ggtgcgcc 8<210>119<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>119cttgcgcc 8<210>120<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>120cgtgcgcc 8<210>121<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>121tttccgg7<210>122<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>122tttcgcgg 8<210>123<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>123gttggcgc 8<210>124<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>124cttggcgc 8<210>125<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>125cttgccgc 8<210>126<211>8
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>126gttgccgc 8<210>127<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>127tttggcgg 8<210>128<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>128ttaccgcc 8<210>129<211> 8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>129tgaccgcc 8<210>130<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>130gtaccgcc 8<210>131<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>131ggaccgcc 8<210>132<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>132ctaccgcc 8<210>133<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>133cgaccgcc 8<210>134<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>134tttccgcc 8<210>135<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>135tgtccgcc 8<210>136<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>136gttccgcc 8<210>137<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>137ggtccgcc 8<210>138<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>138cttccgcc 8<210>139
<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>139cgtccgcc 8<210>140<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>140cttcccgg 8<210>141<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>141tttgccgg 8<210>142<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>142gttcccgg 8<210>143<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>143cttcgcgg 8<210>144<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>144tttgcgcg 8<210>145<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>145ttagcgcg 8<210>146<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>146tgtgcgcg 8<210>147<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>147tgagcgcg 8<210>148<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>148gttgcgcg 8<210>149<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>149gtagcgcg 8<210>150<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>150ggtgcgcg 8<210>151<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<220>
<221>不確定<222>11
<223>n＝未知的<400>151tttsgcgcgm nr 12<210>152<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>152gttggcgg 8<210>153<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>153gttcgcgg 8<210>154<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>154gttcgcgg 8<210>155<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>155tttcccgg 8<210>156<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>156cttgccgg 8<210>157<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>157gttgccgg 8
<210>158<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>158tgtcgcgc 8<210>159<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>159cttcccgg 8<210>160<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>160cgtcgcgc 8<210>161<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>161ggtcgcgc 8<210>162<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>162tttcgggc 8<210>163<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>163tgtggcgc 8<210>164<211>8<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>164tgtcgcgg 8<210>165<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>165acgtg 5<210>166<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>166gtgtgctccc agtcagtcaa tcctcacgtt tatgatggat gaatgaaggc ag 52<210>167<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>167ttgtgttatt agtcaccaac aggcaacgtg cagccggaga taaggccag 49<210>168<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>168atccccccgc ccacagagag gacgtgccac gccagcacgt ccgctctcct tgccag 56<210>169<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>169tgtgctccca gtcagtcaat cctcacgttt atgatggatg aatgaaggca gtcaggt 57<210>170<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>170gtgatgaaag agcacaaacg ggtgacaaac gtgtctagcg tgattcatca tgaacaggca 60
ca 62<210>171<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>171tgcttggtaa actgtaaaat gattagcata cgtgaagcgt tagtgtgctc cctggca 57<210>172<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>172gagcgagccg ctgggtgcag gcaggcgacg tgctgccggg ctaggctgcc cgggggagat 60ga 62<210>173<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>173gtggtccgag tcacgtccga ggggg25<210>174<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>174cttcacgtgc ggggaccagg gaccgt 26<210>175<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>175cgcaggcgca ggcggcgcac gtggcc 26<210>176<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>176gagtgcgtgc gggactcgga gtacgtgacg gagccccgag ctctcatgcc 50<210>177<211>53
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>177ggggccccag agcgacgctg agtgcgtgcg ggactcggag tacgtgacgg agc 53<210>178<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>178gcaaggtcga gggccggacg tggggcccca gagcgacgct gagtgcgtgc gg 52<210>179<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>179ggggcgtgag cggggctgct gcagacgtgc gtgtgggtca tgggggctgc tc 52<210>180<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>180gccctacgtg ctgtctcaca cagcctgtct gacctctcga cct43<210>181<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>181ctccggctgc acgttgcctg 20<210>182<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>182atggagacat aattgaggaa caacgtggaa ttagtgtcat agcaaatgat ctagg 55<210>183<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>183gagcggacgt gctggcgtgg cacgtcctct c 31<210>184<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>184gacgcccgcc cccggcccag cctacacgtg ggttcccgca cgtccgctgg g 51<210>185<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>185cgtcagagtg ggagcccagc ggacgtgcgg gaacccacgt gtaggctggg c 51<210>186<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>186gtgactacgt gctgcctagg ggccactgcc 30<210>187<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>187cctgaatgct cttacacacg tacacacaca gagcagc 37<210>188<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>188ccgggtagct ggcgtacgtg ctgcag 26<210>189<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>189ccttgcggtt cgcggcgtgc cggacgtgac aaacggaagc cgcacgtctc acta54<210>190
<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>190ccttgcggtt cgcggcgtgc cggacgtgac aaacggaagc cgcacgtctc acta54<210>191<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>191ctgccagtgc acgtcagtgg 20<210>192<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>192gcccggccgc tgtcaccggg caggagagaa cgttgcttac gtgcgcccgg agtccattgg 60ccaaggcggg cc 72<210>193<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>193aaggccctgg gtccacaggc gtgccgtctg acacgcatca ggcaggcact c 51<210>194<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>194ccatttctag ggccttgggt ccacaggcgt gctggctgac acgcatcagg ccg 53<210>195<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>195ttcctgcacg tacacacaaa gcgcacgtat ttc 33<210>196<211>61<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>196tcagagcacc tcgcgagcgt acgtgcctca ggaagtgacg cacagccccc ctgggggccg 60g 61<210>197<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>197gggttttgcc agactccaca gtgcatacgt gggctccaac aggtcctctt ccctcccagt 60cactg 65<210>198<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>198gccctacgtg ctgtctca18<210>199<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>199tgagacagca cgtagggc18<210>200<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>200ctgtcctccg actgcatg18<210>201<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>201catgcagtcg gaggacag18<210>202<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>202cccctcggac gtgactcgga ccac 24<210>203<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>203gtggtccgag tcacgtccga ggggg25<210>204<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>204tctgtacgtg accacactca cctc 24<210>205<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>205gaggtgagtg tggtcacgta caga 24<210>206<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>其有核酸序列<400>206agggccggac gtggggcccc 20<210>207<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>207ggggccccac gtccggccct 20<210>208<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>208acgctgagtg cgtgcgggac 20<210>209<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>209gtcccgcacg cactcagcgt 20<210>210<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>210gccctacgtg ctgtctcaca cagc 24<210>211<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>211gctgtgtgag acagcacgta gggc 24<210>212<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>212gtgagacgtg cggcttccgt ttg 23<210>213<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>213caaacggaag ccgcacgtct cac 23<210>214<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>214ctgccgacgt gcgctccgga g21<210>215<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>215ctccggagcg cacgtcggca g21<210>216<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>216gaaatacgtg cgctttgtgt gtacgtgcag gaa 33<210>217<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>217ttcctgcacg tacacacaaa gcgcacgtat ttc 33<210>218<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>218cgcgagcgta cgtgcctcag g21<210>219<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>219cctgaggcac gtacgctcgc g21<210>220<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>220tgcatacgtg ggctccaaca g21<210>221<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>221ctgttggagc ccacgtatgc a21<210>222
<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>222aggagacgtg cgagaa 16<210>223<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>223ttctcgcacg tctcct 16<210>224<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>224aggttacgtg cggaca 16<210>225<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>225tgtccgcacg taacct 16<210>226<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>226aggagacgtg ctgcct 16<210>227<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>227aggcagcacg tctcct 16<210>228<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>228tccaatacgt gcagtact18<210>229<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>229agtactgcac gtattgga18<210>230<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>230tccaatgcgt gcagtact18<210>231<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>231agtactgcac gcattgga18<210>232<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>232ggccagacgt gccaccgg18<210>233<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>233ccggtggcac gtctggcc18<210>234<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>234aggcaacgtg cagccg 16
<210>235<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>235cggctgcacg ttgcct 16<210>236<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>236aggcaatacg cagccg 16<210>237<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>237cggctgcgta ttgcct 16<210>238<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>238agcggacgtg cagaagttgc acgtcctct29<210>239<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>239agaggacgtg caacttctgc acgtccgct29<210>240<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>240gtgcatacgt gggctcca18<210>241<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>241tggagcccac gtatgcac18<210>242<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>242gagcgtacgt gcctcagg18<210>243<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>243cctgaggcac gtacgctc18<210>244<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>244ggaacaacgt ggaattag18<210>245<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>245ctaattccac gttgttcc18<210>246<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>246gcctacacgt gggttccc18<210>247<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>247gggaacccac gtgtaggc 18
<210>248<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>248cggagtacgt gacggagc18<210>249<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>249gctccgtcac gtactccg18<210>250<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>250ttgcttacgt gcgcccgg18<210>251<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>251ccgggcgcac gtaagcaa18<210>252<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>252gtgtgtacgt gcaggaaa18<210>253<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>253tttcctgcac gtacacac18<210>254<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>254gcggacgtgc gggaacccac gtgtagg 27<210>255<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>255cctacacgtg ggttcccgca cgtccgc 27<210>256<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>256accgtacgtg ctgatc 16<210>257<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>257gatcagcacg tacggt 16<210>258<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>258ctaatacgtg ccgctg 16<210>259<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>259cagcggcacg tattag 16<210>260<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>260
agcagacgtg caggat 16<210>261<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>261atcctgcacg tctgct 16<210>262<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>262agcagacgtg caggca 16<210>263<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>263tgcctgcacg tctgct 16<210>264<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>264tccgtacgtg ctgcac 16<210>265<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>265gtgcagcacg tacgga 16<210>266<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>266agcagacgtg cagggt 16<210>267<211>16<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>267accctgcacg tctgct 16<210>268<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>268accgtacgtg ctgcca 16<210>269<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>269tggcagcacg tacggt 16<210>270<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>270tccgtacgtg ctgcgt 16<210>271<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>271acgcagcacg tacgga 16<210>272<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>272tgcagacgtg caggtc 16<210>273<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>273gacctgcacg tctgca 16<210>274<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>274accgtacgtg ctgcta 16<210>275<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>275tagcagcacg tacggt 16<210>276<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>276ggctgctgca gacgtgcagg tc 22<210>277<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>277gacctgcacg tctgcagcag cc 22<210>278<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>278ggctgcagga gacgtggaga a21<210>279<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>279ttctccacgt ctcctgcagc c21<210>280<211>16
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>280agaagacgtg caggat 16<210>281<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>281atcctgcacg tcttct 16<210>282<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>282tacagacgtg caggtc 16<210>283<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>283gacctgcacg tctgta 16<210>284<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>284ggctgcaccg tacgtgctga tc 22<210>285<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>285gatcagcacg tacggtgcag cc 22<210>286<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>286tgcatacgtg caggtc 16<210>287<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>287gacctgcacg tatgca 16<210>288<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>288ggctgctgca tacgtgcagg tc 22<210>289<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>289gacctgcacg tatgcagcag cc 22<210>290<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>290gccctacgtg ctgtctca18<210>291<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>291ctgtcctccg actgcatg18<210>292<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>292ccccctcgga cgtgactcgg accac25<210>293
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>293tctgtacgtg accacactca cctc 24<210>294<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>294agggccggac gtggggcccc 20<210>295<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>295acgctgagtg cgtgcgggac 20<210>296<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>296gccctacgtg ctgtctcaca cagc 24<210>297<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>297gtgagacgtg cggcttccgt ttg 23<210>298<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>298ctgccgacgt gcgctccgga g21<210>299<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>299gaaatacgtg cgctttgtgt gtacgtgcag gaa 33<210>300<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>300cgcgagcgta cgtgcctcag g21<210>301<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>301tgcatacgtg ggctccaaca g21<210>302<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>302aggagacgtg cgagaa 16<210>303<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>303aggttacgtg cggaca 16<210>304<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>304aggagacgtg ctgcct 16<210>305<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>305tccaatacgt gcagtact18
<210>306<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>306tccaatgcgt gcagtact18<210>307<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>307ggccagacgt gccaccgg18<210>308<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>308aggcaacgtg cagccg 16<210>309<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>309aggcaatacg cagccg 16<210>310<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>310agcggacgtg cagaagttgc acgtcctct29<210>311<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>311gtgcatacgt gggctcca18<210>312<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>312gagcgtacgt gcctcagg18<210>313<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>313ggaacaacgt ggaattag18<210>314<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>314gcctacacgt gggttccc18<210>315<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>315cggagtacgt gacggagc18<210>316<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>316ttgcttacgt gcgcccgg18<210>317<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>317gtgtgtacgt gcaggaaa18<210>318<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>318gcggacgtgc gggaacccac gtgtagg 27
<210>319<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>319accgtacgtg ctgatc 16<210>320<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>320ctaatacgtg ccgctg 16<210>321<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>321agcagacgtg caggat 16<210>322<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>322agcagacgtg caggca 16<210>323<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>323tccgtacgtg ctgcac 16<210>324<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>324agcagacgtg cagggt 16<210>325<211>16<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>325accgtacgtg ctgcca 16<210>326<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>326tccgtacgtg ctgcgt 16<210>327<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>327tgcagacgtg caggtc 16<210>328<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>328accgtacgtg ctgcta 16<210>329<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>329ggctgctgca gacgtgcagg tc 22<210>330<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>330ggctgcagga gacgtggaga a21<210>331<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>331
agaagacgtg caggat 16<210>332<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>332tacagacgtg caggtc 16<210>333<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>333ggctgcaccg tacgtgctga tc 22<210>334<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>334tgcatacgtg caggtc 16<210>335<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>335ggctgctgca tacgtgcagg tc 22<210>336<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>336acgtg 5<210>337<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>337gcgt 4<210>338<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>338gccctacgtg ctgtctca18<210>339<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>339tgagacagca cgtagggc18<210>340<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>340caccagcgta cgtgcctcag g21<210>341<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>341cctgaggcac gtacgctggt g2權(quán)利要求
1.一種向細(xì)胞遞送多核苷酸的方法，所述方法包含令生物膜與一種制劑進(jìn)行接觸，該制劑含有所述多核苷酸、至少一種總重量濃度約0.3％到約10％的滲透增強(qiáng)劑、以及重量濃度約1％到約60％的醇。
2.一種向細(xì)胞遞送多核苷酸的方法，所述方法包含令生物膜與一種基于乳劑的制劑進(jìn)行接觸，該制劑含有所述多核苷酸、至少一種總重量濃度約0.2％到約10％的滲透增強(qiáng)劑、以及水，其中所述滲透增強(qiáng)劑選自月桂醇醚硫酸鈉、N-月桂酰肌氨酸、失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)和十四烷酸異丙酯。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多核苷酸是寡核苷酸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞來自哺乳動物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述哺乳動物是人。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述生物膜是皮膚或粘膜。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述滲透增強(qiáng)劑是陰離子表面活性劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述陰離子表面活性劑是烷基硫酸鹽或烷基乙醚硫酸鹽。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述陰離子表面活性劑是月桂基硫酸鈉或月桂醇醚硫酸鈉。
10.權(quán)利要求3的方法，其中所述滲透增強(qiáng)劑是N-月桂酰肌氨酸。
11.權(quán)利要求3的方法，其中所述滲透增強(qiáng)劑是失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)。
12.權(quán)利要求3的方法，其中所述制劑包含重量約0.4％到約10％的所述滲透增強(qiáng)劑。
13.權(quán)利要求3的方法，其中所述制劑包含重量約0.8％的所述滲透增強(qiáng)劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述滲透增強(qiáng)劑是月桂醇醚硫酸鈉。
15.權(quán)利要求3的方法，其中所述制劑包含重量約0.6％的所述滲透增強(qiáng)劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述滲透增強(qiáng)劑是N-月桂酰肌氨酸。
17.權(quán)利要求3的方法，其中所述制劑包含重量約0.4％的所述滲透增強(qiáng)劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述滲透增強(qiáng)劑是失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)。
19.權(quán)利要求3的方法，其中所述醇是乙醇。
20.權(quán)利要求3的方法，其中所述制劑包含重量約1％到約50％的醇。
21.權(quán)利要求3的方法，其中所述制劑是水性制劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述水性制劑是基于凝膠的水性制劑。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述基于凝膠的水性制劑包含重量約0.8％的月桂醇醚硫酸鈉。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述基于凝膠的水性制劑進(jìn)一步包含重量約5％的乙醇。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述基于凝膠的水性制劑進(jìn)一步包含重量約10％的乙醇。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述基于凝膠的水性制劑進(jìn)一步包含重量約20％的乙醇。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述基于凝膠的水性制劑進(jìn)一步包含重量約49％的乙醇。
28.權(quán)利要求3的方法，其中所述制劑是含脂質(zhì)體的制劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述含脂質(zhì)體的制劑包含重量約0.8％的月桂醇醚硫酸鈉。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述含脂質(zhì)體的制劑進(jìn)一步包含重量約10％的乙醇。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述含脂質(zhì)體的制劑進(jìn)一步包含重量約5％的乙醇。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述含脂質(zhì)體的制劑進(jìn)一步包含重量濃度約2.5％的乙醇。
33.權(quán)利要求28的方法，其中所述含脂質(zhì)體的制劑包含重量約0.6％的N-月桂酰肌氨酸。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述含脂質(zhì)體的制劑進(jìn)一步包含重量約0.4％的失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述含脂質(zhì)體的制劑進(jìn)一步包含重量約5％的乙醇。
36.權(quán)利要求3的方法，其中所述基于乳劑的制劑包含重量約0.8％的所述月桂醇醚硫酸鈉。
37.權(quán)利要求3的方法，其中所述基于乳劑的制劑包含重量約0.35％的所述月桂醇醚硫酸鈉。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述基于乳劑的制劑進(jìn)一步包含重量約0.15％的1-苯基哌嗪。
39.權(quán)利要求3的方法，其中所述基于乳劑的制劑包含重量約0.6％的N-月桂酰肌氨酸。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述基于乳劑的制劑進(jìn)一步包含重量約0.4％的失水山梨醇單月桂酸酯20(Span 20)。
41.權(quán)利要求3的方法，其中所述基于乳劑的制劑進(jìn)一步包含重量約10％的十四烷酸異丙酯。
42.權(quán)利要求3的方法，其中所述基于乳劑的制劑進(jìn)一步包含HPMC4000cps、硬脂酸聚氧乙烯(40)酯、單硬脂酸甘油酯、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯。
43.權(quán)利要求3的方法，其中所述寡核苷酸是雙鏈寡核苷酸(dsODN)分子。
44.權(quán)利要求43的方法，其中dsODN分子的第一鏈與第二鏈至少部分互補(bǔ)。
45.權(quán)利要求43的方法，其中dsODN分子的第一鏈與第二鏈完全互補(bǔ)。
46.權(quán)利要求43的方法，其中dsODN分子包含至少一個單鏈突出端。
47.權(quán)利要求43的方法，其中dsODN分子包含的兩條寡核苷酸鏈在3′或5′端、或者兩端共價連接在一起，從而形成啞鈴結(jié)構(gòu)或成為環(huán)形分子。
48.權(quán)利要求43的方法，其中dsODN分子具有磷酸二酯骨架、硫代磷酸酯骨架、或磷酸二酯-硫代磷酸酯混合骨架。
49.權(quán)利要求43的方法，其中dsODN分子的所述第一和第二鏈僅通過Watson-Crick堿基配對連在一起。
50.權(quán)利要求43的方法，其中dsODN至少15個堿基對長。
51.權(quán)利要求43的方法，其中dsODN分子包含能特異結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的序列。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自E2F、AP-1、AP-2、HIF-1和NFκB。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述dsODN分子能夠特異結(jié)合NFκB轉(zhuǎn)錄因子。
54.權(quán)利要求52的方法，其中dsODN分子與所述E2F轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合親和性至少是所述參照分子與該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合親和性的約10倍。
55.權(quán)利要求52的方法，其中dsODN分子能夠特異結(jié)合HIF-1轉(zhuǎn)錄因子。
56.治療哺乳動物受試者炎性疾病或病癥的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-55任何一項所描述的制劑。
57.權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述寡核苷酸是能特異結(jié)合NFKB轉(zhuǎn)錄因子的雙鏈寡核苷酸(dsODN)分子。
58.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述dsODN分子在整個制劑中的重量濃度為約0.1％到1.0％。
59.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述dsODN分子在整個制劑中的重量濃度為約0.1％。
60.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述dsODN分子在整個制劑中的重量濃度為約0.25％。
61.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述dsODN分子在整個制劑中的重量濃度為約0.5％。
62.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述寡核苷酸是能特異結(jié)合HIF-1轉(zhuǎn)錄因子的雙鏈寡核苷酸(dsODN)分子。
63.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述炎性疾病或病癥是皮膚炎癥或皮膚癌。
64.權(quán)利要求63的藥物組合物，其中所述疾病或病癥與急性或慢性皮膚炎癥相關(guān)。
65.權(quán)利要求63的藥物組合物，其中所述皮膚癌是基底細(xì)胞癌(BCC)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)或黑素瘤。
66.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述疾病或病癥選自異位性皮炎、接觸性皮炎、脂溢性皮炎、銀屑病、酒糟鼻、濕疹、痤瘡、脫發(fā)病、愈合傷口和疤痕組織。
67.權(quán)利要求66的藥物組合物，其中所述病癥是異位性皮炎。
68.權(quán)利要求66的藥物組合物，其中所述病癥是銀屑病。
69.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述哺乳動物受試者是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及向細(xì)胞非親本地遞送核酸分子的方法和制劑。具體來說，本發(fā)明涉及增強(qiáng)多核苷酸和寡核苷酸跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)的方法和制劑。
文檔編號A61K48/00GK101060864SQ200580039741
公開日2007年10月24日 申請日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月21日
發(fā)明者瑪亞·達(dá)吉, 羅爾夫·埃爾哈特, 漢斯·霍夫蘭德, 萊斯利·麥克沃伊, 托尼·馬奇默爾, 布萊恩·B·施利弗 申請人:阿尼西瓦股份有限公司