專利名稱：寡核苷酸合成的改進方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸合成的改進方法。具體而言，本發(fā)明提供了液相合成純化的短鏈寡核苷酸偶聯(lián)單元如二聚體、三聚體和四聚體的改進方法，這些偶聯(lián)單元適用于寡核苷酸的液相或固相合成。
背景技術(shù)：
起初，利用磷酸三酯(“三酯法”)或亞磷酸酯(“亞磷酸酯法”)來進行固相寡核苷酸合成。隨著相對穩(wěn)定的單核苷氨基亞磷酸酯(phosphoramidite)偶聯(lián)單元的發(fā)現(xiàn)(參見，例如，Beaucage和Caruthers，Tetra.Lett.，1981，Vol.22，1859-1862)，固相寡核苷酸合成成為切實可行和常用。典型的固相寡核苷酸合成包括重復(fù)進行四個步驟脫保護、偶聯(lián)、加帽和氧化。
標(biāo)準(zhǔn)方法包括沿5′方向逐步合成寡核苷酸。第一步(“脫保護”)中，在3′端以3′-O-基與固相載體(support)連接的增長的寡核苷酸5′端被脫保護，以提供反應(yīng)活性基團(即5′-OH基)。例如，通常在吡啶中與4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl)反應(yīng)得到5′-ODMT，使5′-OH被保護，它在堿性條件下是穩(wěn)定的，但是在酸性條件下如二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(TCA)存在下容易脫保護。
第二步(“偶聯(lián)”)中，將5′-脫保護的連接于載體上的寡核苷酸與目的核苷酸單體反應(yīng)，該單體預(yù)先已被轉(zhuǎn)化為5′-保護的3′-氨基亞磷酸酯。例如，5′-OH可以以5′-ODMT基團形式被保護，3′-OH可以被轉(zhuǎn)化為3′-氨基亞磷酸酯，如-OP(OR′)NR2，其中R是異丙基即-CH(CH3)2，R′例如是-H(產(chǎn)生氨基亞磷酸二酯)，或-CH3、-CH2CH3或β-氰乙基即-CH2CH2CN(產(chǎn)生氨基亞磷酸三酯)。單體的3′-氨基亞磷酸酯基團與增長的寡核苷酸脫保護的5′-OH反應(yīng)，產(chǎn)生亞磷酸酯鍵5′-OP(OR′)O-3′。參見，例如，Caruthers，M.H.和S.L.Beaucage，美國專利號No.4415732，公布于1995年11月15日。
不是所有的增長的寡核苷酸都會與提供的單體偶聯(lián)；那些沒有“生”的會產(chǎn)生不完全寡核苷酸，因此必須從下一步合成中除去。通過第三步(“加帽”)達(dá)到這一目的，其中所有殘余的-OH(即未反應(yīng)的5′-OH)均被加帽，例如通過與乙酐(CH3C(O)-O-C(O)CH3)反應(yīng)生成乙酸酯形式(5′-OC(O)CH3)。
最后，在氧化步驟中，例如通過與碘水溶液和吡啶反應(yīng)，使增長的寡核苷酸的新形成的亞磷酸酯基(即5′-OP(OR′)O-3′)轉(zhuǎn)化為磷酸酯基團(即5′-OP(＝O)(OR′)O-3′)。
然后該四步法可重復(fù)進行，因為氧化后得到的寡核苷酸仍然是5′-被保護(如5′-ODMT)形式，并可用于上述第一步脫保護步驟中。
當(dāng)已獲得所需的寡核苷酸時，例如，可以用堿和熱處理將其從固相載體上裂解下來。此步驟也可將磷酸三酯(即R′不是-H時)轉(zhuǎn)化為磷酸二酯(-OP(＝O)2O-)，并且使核苷酸堿基堿不穩(wěn)定的被保護氨基脫保護。
在制備較長鏈的寡核苷酸中，由于合適的三酯二聚體和三聚體偶聯(lián)單元的可獲得性，早期的三酯法能得到較好的收率(參見，例如Hirose等，Tetra.Lett.，1978，pp.2449-2452)。但是，與僅使用核苷酸單體不同，寡核苷酸合成中的最近進展已使用核苷酸多聚體(即短鏈寡核苷酸)，如核苷酸二聚體氨基亞磷酸酯，由此減少所需重復(fù)次數(shù)并提高總收率、減少化學(xué)操作。參見，例如，Kumar和Poonian，J.Org.Chem.1984，Vol.49，第4905-4912頁。例如，為獲得寡核苷酸(dGdT)10dG，可以從dG-型固相載體(如dG-CPG)開始，利用dGdT-二聚體單元(如5′-保護的-dG-dT-3′-氨基亞磷酸酯)進行10次重復(fù)操作，與此相反，從dG-型固相載體開始使用dG-和dT-單體單元(如5′-保護的-dG-3′-氨基亞磷酸酯和5′-保護的-dT-3′-氨基亞磷酸酯)進行20次重復(fù)操作。
例如，當(dāng)一次偶聯(lián)效率為99％(假設(shè)單體偶聯(lián)和二聚體偶聯(lián)效率相等)，那么20次單體偶聯(lián)收率僅為(0.99)20或81.8％，而10次二聚體偶聯(lián)收率為(0.99)10或90.4％。若一次偶聯(lián)效率為97％，那么，偶聯(lián)單體和二聚體的收率分別為(0.97)20＝54.4％和(0.97)10＝73.7％。單體與二聚體收率之比反映了二聚體經(jīng)濟合成所需的“無損失率”，例如，97％的偶聯(lián)效率時，無損失率為54.4/73.7＝73.8％；也就是說，當(dāng)能夠以73.8％或更高收率從單體單元制備二聚體偶聯(lián)單元且其它所有因素均相同時，可以更清楚地認(rèn)識到基于二聚體合成的優(yōu)點。
例如，理論上來看，對于20次單體偶聯(lián)，可以進行20步，每步采用1000單體當(dāng)量；對于相應(yīng)的10次二聚體偶聯(lián)，將進行10步，每步采用1000二聚體當(dāng)量，其中必須從單體制備出這些二聚體，帶有一些內(nèi)在損失。如果僅能以80％的收率從單體合成二聚體，那么與單體偶聯(lián)所需的20,000單體當(dāng)量相比，可從25,000單體當(dāng)量制備出所需的10,000個有用的二聚體當(dāng)量。偶聯(lián)效率為97％時，通過采用20,000單體當(dāng)量的20個循環(huán)的單體偶聯(lián)法，每1000個固相載體位點獲得544個正確的寡核苷酸(即2.72×10-5寡核苷酸/位點/單體)，而采用25,000單體當(dāng)量的10個循環(huán)的二聚體偶聯(lián)法，每1000位點得到737個正確的寡核苷酸(即2.95×10-5寡核苷酸/位點/單體)。
這種“密集型”合成的成功依賴于可獲得合適的二聚體-氨基亞磷酸酯。例如，可購買到所有16個二(脫氧核苷酸)二聚體(形式為N-封閉的-5′-ODMT-3′-[2-氯苯基]-2′-脫氧核苷酸基-[3′5′]-N-封閉的-[2-氯苯基]-2′-脫氧核苷-3′-[2-氰乙基]磷酸酯)。通常使用固相寡核苷酸合成法制備這些二聚體。因此，與使用單個的單體相比，使用多個合成二聚體成本相對要高。
本發(fā)明提供了液相合成短鏈寡核苷酸如核苷酸二聚體的改進方法，這些短鏈寡核苷酸能用作液相或固相寡核苷酸合成的偶聯(lián)單元。
發(fā)明簡述本發(fā)明一方面提供了制備偶聯(lián)寡核苷酸YZ的方法，包括步驟(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每個所述第一片段具有至少一個活性官能團(a)n，其中n是正整數(shù)，表示第n個Y活性官能團；(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每個所述第二片段具有至少兩個不同的活性官能團b(m)和c(p)，其中m和p是正整數(shù)，分別表示第m個Z-b和第p個Z-c活性官能團，其中每個b(m)活性官能團與每個c(p)活性官能團不同；(c)使所述第一片段和第二片段在一定條件下反應(yīng)，從而所述的至少一個Y活性官能團a(n)與所述至少兩個Z活性官能團b(m)和c(p)反應(yīng)，形成連接Y和Z的核苷間共價鍵合，由此生成至少一個第一鍵合異構(gòu)體YZ-b(m)，它保留至少一個殘余的活性官能團b(m)，以及生成至少一個不同的第二鍵合異構(gòu)體YZ-c(p)，它保留至少一個殘余的活性官能團c(p)；(d)使所述YZ鍵合異構(gòu)體或其衍生物的混合物與選擇性加帽劑反應(yīng)，從而所述的至少一個YZ-b(m)鍵合異構(gòu)體的所述至少一個殘余的活性官能團b(m)選擇性地保持不變，所述的至少一個YZ-c(p)鍵合異構(gòu)體的所述至少一個殘余的活性官能團c(p)被選擇性加帽。
本發(fā)明的另一方面提供了制備偶聯(lián)寡核苷酸YZ的方法，包括步驟(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每個所述的第一片段具有活性官能團a；(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每個所述的第二片段具有兩個不同的活性官能團b和c；(c)使所述第一片段和第二片段在一定條件下反應(yīng)，從而所述的Y活性官能團a與所述Z活性官能團b和c反應(yīng)，形成連接Y和Z的核苷間共價鍵合，由此生成保留一個殘余的活性官能團b的第一鍵合異構(gòu)體YZ-b和一個不同的保留一個殘余的活性官能團c的第二鍵合異構(gòu)體YZ-c；(d)使所述YZ鍵合異構(gòu)體或其衍生物的混合物與選擇性加帽劑反應(yīng)，從而所述YZ-b鍵合異構(gòu)體的所述一個殘余的活性官能團b選擇性地保持不變，所述YZ-c鍵合異構(gòu)體的所述一個殘余的活性官能團c被選擇性加帽。
本發(fā)明的另一方面提供了制備偶聯(lián)寡核苷酸YZ的方法，包括步驟(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每個所述的第一片段具有一個活性官能團a；(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每個所述的第二片段具有兩個不同的活性官能團b和c；(c)使所述第一片段和第二片段在一定條件下反應(yīng)，從而所述的Y活性官能團a與所述的Z活性官能團b和c反應(yīng)，形成連接Y和Z的核苷間共價鍵合，由此生成保留一個殘余的活性官能團b的第一鍵合異構(gòu)體YZ-b和一個不同的保留一個殘余活性官能團c的第二鍵合異構(gòu)體YZ-c；(d)使所述第一鍵合異構(gòu)體YZ-b和所述第二鍵合異構(gòu)體YZ-c的混合物與一種氧化劑反應(yīng)，由此生成第一YZ鍵合異構(gòu)體的衍生物YZ′-b和第二YZ鍵合異構(gòu)體的衍生物YZ′-c；(e)使所述YZ′鍵合異構(gòu)體衍生物的混合物與選擇性加帽劑反應(yīng)，從而所述YZ′-b鍵合異構(gòu)體衍生物的所述一個殘余活性官能團b選擇性地保持不變，所述YZ′-c鍵合異構(gòu)體衍生物的所述一個殘余的活性官能團c被選擇性加帽。
核苷酸片段Y和Z可包括一個核苷，它們可以相同或不同。優(yōu)選的Y活性官能團是氨基亞磷酸酯基。特別優(yōu)選的Y活性官能團是式為-OP(OR′)NR2的氨基亞磷酸酯，其中R′選自-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CN和-C6H5Cl；R選自-CH3、-CH2CH3和-CH(CH3)2，或為氨基亞磷酸酯基二異丙基-(2-氰乙基)-氨基亞磷酸酯即-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。
優(yōu)選的第一核苷酸片段Y是5′-保護的-3′-氨基亞磷酸酯核苷，特別優(yōu)選的是5′-ODMT-3′-氨基亞磷酸酯核苷，尤其是5′-ODMT-3′-(二異丙基-(2-氰乙基)-氨基亞磷酸酯)鳥苷。
優(yōu)選的Z活性官能團b是仲醇，優(yōu)選的Z活性官能團c是伯醇。優(yōu)選的第二核苷酸片段Z是5′-OH、3′-OH核苷，優(yōu)選胸苷。
優(yōu)選的選擇性加帽劑包括DMT-Cl、MMT-Cl、叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三異丙基氯硅烷、新戊酰氯和pixylchloride，但不限于此。特別優(yōu)選的選擇性加帽劑是DMT-Cl。
優(yōu)選的氧化劑是碘水溶液和吡啶。
附圖簡要說明

圖1是表明形成dGdT二聚體單元的偶聯(lián)反應(yīng)的流程圖。
圖2是磷酸酯二聚體C48H53N8O13P的1H-NMR圖譜。
圖3是磷酸酯二聚體C48H53N8O13P的13C-NMR圖譜。
圖4是磷酸酯二聚體C48H53N8O13P的31P-NMR圖譜。
圖5是磷酸酯二聚體C48H53N8O14P的1H-NMR圖譜。
圖6是磷酸酯二聚體C48H53N8O14P的31P-NMR圖譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了液相合成短鏈寡核苷酸偶聯(lián)單元如核苷酸二聚體的改進方法，這些偶聯(lián)單元能用于寡核苷酸合成。為在反應(yīng)產(chǎn)物混合物中高收率生成所需的短鏈寡核苷酸，此改進方法利用兩個選擇性化學(xué)反應(yīng)，(i)從反應(yīng)產(chǎn)物混合物中可容易地分離和純化所需產(chǎn)物，且(ii)反應(yīng)混合物中不需要的異構(gòu)體已被轉(zhuǎn)化為非活性形式。
通常寡核苷酸合成的氨基亞磷酸酯法利用氨基亞磷酸酯基(即-OP(OR′)NR2)和醇基(即-OH)之間的化學(xué)反應(yīng)形成共價的亞磷酸三酯鍵(即-OP(OR′)O-)。許多氨基亞磷酸酯可選擇性地與5′-OH反應(yīng)，例如，2-氰乙基-氨基亞磷酸酯對5′-OH的選擇性約超過3′-OH的選擇性80％。在固相寡核苷酸合成中，這點沒有什么影響，因為反應(yīng)僅可使用的-OH是3′-連接載體的增長寡核苷酸的末端(脫保護的)5′-OH基。但是，在液相合成中，必須除去與3′-OH非選擇性反應(yīng)得到的不需要的產(chǎn)物和此產(chǎn)物之后得到的產(chǎn)物。
本發(fā)明的改進方法使來自非選擇性偶聯(lián)反應(yīng)的副產(chǎn)物鈍化并容易分離。為說明本發(fā)明的改進方法，我們可以考慮下面這個例子，從活性單體J和K液相合成通式化短鏈寡核苷酸J-3′-5′-K，一個核苷酸二聚體。通過在合適溶劑中，在合適的堿存在下，將呈5′-被保護的3′-氨基亞磷酸酯形式的第一核苷酸片段J與呈5′-OH，3′-OH單核苷形式的第二核苷酸片段K反應(yīng)，可制備出這種二聚體。但是，由于氨基亞磷酸酯對5′-OH的選擇性小于100％，該反應(yīng)產(chǎn)生三種不同的產(chǎn)物(i)所需的J-3′-5′-K二聚體，收率相對較高；(ii)不需要的J-3′-3′-K二聚體，收率相對低；以及(iii)不需要的J-3′-3′-K-5′-3′-J三聚體，收率更低。
僅占產(chǎn)物混合物小部分的不需要的三聚體JKJ兩(即5′)端被保護，不再進行隨后的偶聯(lián)。這樣，在一般的寡核苷酸合成偶聯(lián)步驟中，少量的這種5′-雙重(且簡并(degenerately))加帽的三聚體的存在不會產(chǎn)生什么問題。并且，這種雙重保護(并簡并保護)的三聚體的色譜性質(zhì)和溶解性與單重保護的二聚體很不相同(如此保護的三聚體極性小得多)，例如通過溶劑萃取法可容易地除去此三聚體。
然而，所需的J-3′-5′-K和不需要的J-3′-3′-K二聚體(即鍵合異構(gòu)體)均只是單重保護的(如分別為K-3′-OH和K-5′-OH)，且均具有反應(yīng)活性。如果在寡核苷酸合成中采用這種混合物(例如，首先形成磷酸酯，然后將-OH基轉(zhuǎn)化為氨基亞磷酸酯基)，將會得到需要的和不需要的寡核苷酸鍵合。因此必須分離和純化所需要的二聚體。但是，由于所需二聚體和不需要二聚體的色譜性質(zhì)和溶解性相似，所以這種純化相當(dāng)困難。
本發(fā)明的改進方法通過在不需要的短鏈寡核苷酸末端-OH基選擇性加帽克服了這些困難。繼續(xù)上面所述的例子，用5′-OH選擇性加帽劑進一步處理反應(yīng)混合物，以便將不需要的5′-保護的-J-3′-3′-K-5′-OH二聚體的K-5′-OH轉(zhuǎn)化為雙重保護的5′-保護的-J-3′-3′-K-5′-保護的二聚體，而基本上所有的所需5′-保護的-J-3′-5′-K-3′-OH二聚體未改變。這樣，使不需要的J-3′-3′-K二聚體沒有反應(yīng)活性，且色譜性質(zhì)不同于所需的單重保護的J-3′-5′-K二聚體。因此，可較容易地分離和純化所需的二聚體，任何殘余的不反應(yīng)的雙重保護的(或者更優(yōu)選簡并保護的)不需要的二聚體是不起反應(yīng)的，便沒有什么影響。
在一優(yōu)選實施方案中，雙重保護的不需要的二聚體的保護基是相同的，因此不需要的二聚體以類似于不需要三聚體的形式被“簡并”加帽。這種簡并加帽在寡核苷酸合成中具有實際價值。因為同樣的保護基已存在于應(yīng)有位置上(即上述實例中的J-5′-端)，所以已知它的化學(xué)結(jié)構(gòu)和形成它所需的反應(yīng)條件對所討論的分子是溫和的。
由此，本發(fā)明提供了液相合成短鏈寡核苷酸偶聯(lián)單元的改進方法，該短鏈寡核苷酸偶聯(lián)單元可用于長鏈寡核苷酸的合成中。在溶液中通過偶聯(lián)兩個核苷酸片段合成本發(fā)明的短鏈寡核苷酸；通過選擇加帽，使液相偶聯(lián)反應(yīng)的不需要產(chǎn)物沒有反應(yīng)活性并易于分離。
這里所用的術(shù)語“液相寡核苷酸合成”是常規(guī)意義上的，用于描述一類合成方法，這類方法中增長的寡核苷酸和其組分均不被支持或者不與載體連接(被支持或與載體連接的情況是所熟知的“固相寡核苷酸合成”法)。
這里所用的術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”在常規(guī)意義上可交換使用，指包含兩個或多個核苷的分子，每個核苷與至少另一個核苷通過核苷間鍵連接。本發(fā)明的寡核苷酸可以是線狀的、分支的或環(huán)狀，但優(yōu)選線狀的。這里所用的術(shù)語“短鏈寡核苷酸”指包含2至約16個、優(yōu)選2至約8個、更優(yōu)選2至約4個核苷的寡核苷酸。
這里所用的術(shù)語“核苷”是常規(guī)意義上的，通常指包含一個連接于一個核酸堿基上的“糖”部分的化合物。
這里所用的術(shù)語“糖”指單糖部分。優(yōu)選糖呈環(huán)形，例如呈呋喃糖(5元環(huán))或吡喃糖(6元環(huán))形，但更優(yōu)選呈呋喃糖形。糖可以是其對映體、非對映體或立體異構(gòu)體的任何一種形式。優(yōu)選糖包括戊糖和戊糖衍生物。優(yōu)選戊糖是核糖。在優(yōu)選的呋喃糖形式中，核糖(通常用帶撇號數(shù)字表示這里的糖的碳原子)在5′-位置(即5′-OH)具有伯醇基(即羥基)，在3′-位置具有仲醇基(即3′-OH)，2′-位置具有仲醇基(即2′-OH)。優(yōu)選的核糖衍生物是2′-脫氧核糖，其中以2′-H取代了2′-OH。其它優(yōu)選的核糖衍生物包括2′-O-甲基核糖、2′-O-烯丙基核糖、2′-氟代核糖或2′-疊氮基核糖。優(yōu)選糖包括D-核糖和2′-脫氧-D-核糖。
這里用的術(shù)語“核酸堿基”、“核苷酸堿基”和“核苷堿基”在常規(guī)意義上指嘌呤和嘧啶堿。優(yōu)選的核酸堿基包括熟知的天然存在的嘌呤腺嘌呤和鳥嘌呤；和嘧啶胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。本領(lǐng)域已知的核酸堿基的其它例子包括嘌呤和嘧啶類似物，如吖丙啶基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基-硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-戊炔基尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。核酸堿基的活性官能團可以是被保護的或未被保護的形式，例如，伯胺可以被保護成酰胺，如異丁酰胺或苯甲酰胺。
優(yōu)選通過堿基和糖的環(huán)上原子使核酸堿基與糖部分共價連接，其中通常以無撇號數(shù)字編號核酸堿基的環(huán)上原子。對于呈環(huán)狀呋喃糖形式的戊糖，核酸堿基優(yōu)選連接在戊糖1′-位上。優(yōu)選通過堿基的環(huán)上氮原子連接核酸堿基。對于嘧啶，優(yōu)選在(N)-1-位連接；而對于嘌呤，優(yōu)選在(N)-9-位連接。
優(yōu)選的且熟知的由核糖和腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶形成的核苷的例子為“核糖核苷”，分別是腺苷、鳥苷、尿苷和胞苷。優(yōu)選的且熟知的由脫氧核糖和腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶形成的核苷例子為“脫氧核糖核苷”，分別是脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷和脫氧胞苷。
本發(fā)明的許多寡核苷酸通?？杀徽J(rèn)為是核苷酸多聚體，即包含核苷酸單體單元的多聚體。
這里所用的術(shù)語“核苷酸”是常規(guī)意義上的，通常指核苷的磷酸酯，即含磷酸酯基(即-OP(＝O)(OR)2，其中R可獨立地為-H、陽離子或有機基團)、糖部分和核酸堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)部分。一組優(yōu)選的核苷酸包含一個呈環(huán)狀呋喃糖形式的戊糖，作為糖部分。優(yōu)選在3′位或5′位形成磷酸酯。一組優(yōu)選的核苷酸為那些由核糖和2′-脫氧核糖衍生的核苷酸。一組優(yōu)選的核苷酸包括3′-核糖核苷酸和3′-(2′-脫氧)核糖核苷酸(更常見地簡單寫為3′-脫氧核糖核苷酸)。另一組優(yōu)選核苷酸包括5′-核糖核苷酸和5′-(2′-脫氧)核糖核苷酸(更常見地簡單寫為5′-脫氧核糖核苷酸)。
這里所用的術(shù)語“核苷間鍵合”指連接相鄰核苷的二價化學(xué)部分。優(yōu)選的核苷間鍵合包括磷酸二酯基(即磷酸二酯鍵橋-OP(＝O)(OH)O-)和磷酸三酯基(即磷酸三酯鍵橋-OP(＝O)(OR′)O-)，其中R′是含1至20個碳的有機基團。優(yōu)選的R′例子有-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CN和-C6H5Cl。其它優(yōu)選的核苷間鍵合包括亞磷酸二酯基(即-OP(OH)O-)和亞磷酸三酯基(即-OP(OR′)O-)，其中R′定義同上。其它核苷間鍵合的例子包括膦酸酯(即-OP(＝O)(R)O-)如甲基膦酸酯，和酰胺(即-NHCO-)。
本發(fā)明寡核苷酸的核苷間鍵合將核苷的一個原子與相鄰核苷的一個原子連接起來。一組優(yōu)選的核苷間鍵合包括那些將一個核苷的3′-位與相鄰核苷的5′-位連接起來的鍵合(即3′-5′鍵合)；將一個核苷5′-位與相鄰核苷的3′-位連接起來的鍵(即5′-3′鍵合)；將一個核苷3′-位與相鄰核苷3′-位連接起來的鍵(即3′-3′鍵合)；或?qū)⒁粋€核苷5′-位與相鄰核苷5′-位連接起來的鍵(即5′-5′鍵合)。
脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)是寡核苷酸的重要例子。在這兩種寡核苷酸中，所有的核苷間鍵合均為磷酸二酯(即-OP(＝O)(OH)O-)鍵且均在5′-3′方向上；DNA是脫氧核糖核苷酸的聚合物，主要包括核酸堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，而RNA是核糖核苷酸的聚合物，主要包括核酸堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。按常規(guī)習(xí)慣，這里用寡核苷酸5′-端至寡核苷酸3′-端排列的核酸堿基(即分別為A、G、C和U；或dA、dG、dC和T(或dT)，其中“d”表示脫氧核糖核苷酸)來表示簡單的核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸及其聚合物。(注意胸苷常指“脫氧胸苷”，縮寫為“dT”。)例如，dGT是由脫氧鳥苷和脫氧胸苷形成的二核苷酸，其中脫氧鳥苷5′-位是5′-OH；脫氧鳥苷3′-位通過磷酸二酯基與胸苷的5′-位相連；胸苷的3′-位是3′-OH。
這里用的術(shù)語“核苷酸片段”包括核苷單體、核苷酸單體(即核苷磷酸酯)、核苷酸聚合物(即寡核苷酸)及其衍生物。一組優(yōu)選的核苷酸片段正好包含一個核苷。其它優(yōu)選的核苷酸片段包含正好兩個、三個、四個、六個或八個核苷。優(yōu)選的核苷酸片段是線狀的。核苷酸片段具有至少一個活性官能團，且可以具有一個或多個其它被保護的或者不反應(yīng)的官能團。
這里所用的術(shù)語“活性官能團”是指在特定條件下可以與其它可利用官能團反應(yīng)形成共價鍵合的官能團。優(yōu)選的活性官能團的例子是羥基(即-OH)和氨基亞磷酸酯(即-OP(OR′)NR2，其中R′且R是含1至20個碳原子的有機基團)。一組優(yōu)選的氨基亞磷酸酯官能團是R′為-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CN或-C6H4Cl且R是CH(CH3)2的那些官能團。
這里所用的術(shù)語“被保護的或者不反應(yīng)的官能團”指在特定條件下與其它可利用官能團基本上不反應(yīng)的官能團。這里所用的術(shù)語“官能團保護”在常規(guī)化學(xué)意義上指普通化學(xué)方法，利用該方法可逆地使一個官能團變?yōu)椴环磻?yīng)的，該官能團在特定條件下(如pH、溫度、輻射、溶劑等等)會具有反應(yīng)活性。各種“保護”、“封閉”、“掩閉”法廣泛用于有機合成，是熟知方法。例如，具有兩個不同活性官能團的化合物(在特定條件下兩個官能團均具反應(yīng)活性)可被衍生，使一個官能團被保護，那么在特定條件下此官能團是不反應(yīng)的；這樣保護后，該化合物可用作反應(yīng)劑，僅有一個有效的活性官能團。在所需反應(yīng)(涉及其它官能團)完成之后，被保護基可“脫保護”，恢復(fù)為其原始功能。
各種保護基策略是已知。例如，在堿性條件下與某些其它官能團(如氨基亞磷酸酯)可反應(yīng)的羥基(即-OH)可通過轉(zhuǎn)化為合適的醚而“被保護”，在堿性條件下醚是不反應(yīng)的。之后，當(dāng)需要對羥基脫保護時，可用酸處理被保護的化合物。例如，可將-OH與DMT-Cl反應(yīng)生成酸不穩(wěn)定的-ODMT基而保護起來，例如通過用合適的酸如二氯乙酸處理可將-ODMT基脫保護。類似地，可將-NH2與苯甲酰氯反應(yīng)生成堿不穩(wěn)定的酰胺C6H5-C(＝O)-NH-，使-NH2以酰胺形式被保護，例如通過用合適的堿如氨水溶液處理將酰胺脫保護。
一組為核苷單體的優(yōu)選核苷酸片段是所熟知的核苷腺苷、鳥苷、尿苷、胞苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、胸苷和脫氧胞苷。優(yōu)選這些核苷酸片段的3′-和5′-基團是活性官能團，如3′-OH和5′-OH。更優(yōu)選除這些核苷酸片段的3′-和5′-活性官能團之外，所有的活性官能團均用對堿穩(wěn)定的保護基保護。也可以需要將3′-和5′-官能團之一保護起來。例如，對于腺苷、脫氧腺苷、胞苷和脫氧胞苷這些片段，優(yōu)選將核酸堿基的伯氨基(即-NH2)例如與苯甲酰氯(即C6H5-C(＝O)-Cl，生成酰胺C6H5-C(＝O)-NH-)反應(yīng)，以酰胺形式保護起來。類似地，對于腺苷、鳥苷、尿苷、胞苷這些核糖核苷酸，優(yōu)選將2′-OH以甲硅烷基醚的形式保護，例如2′-OSi(i-Pr)3或2′-O-Si(CH3)2(C(CH3)3)或甲氧基四氫吡喃基、四氫呋喃基、2-硝基芐基或苯甲?；Ｌ貏e優(yōu)選核苷酸片段胸苷，因為它既沒有2′-OH，也沒有核酸堿基的-NH2。
另一組優(yōu)選的核苷酸片段由那些包括例如氨基亞磷酸酯和亞磷酸酯的核苷單體所衍生的片段組成。一組優(yōu)選的這種核苷酸片段是那些3′-核糖核苷和3′-脫氧核糖核苷，其中5′-OH已被保護成對堿穩(wěn)定的保護性基團，如-ODMT；3′-OH已衍生為活性官能團，如氨基亞磷酸酯(即-OP(OR′)NR2)或亞磷酸酯(即-OP(OR′)2)。優(yōu)選所有余下的活性官能團(即除3′-和5′-基團之外的)均已被上述對堿穩(wěn)定的保護基保護。這類優(yōu)選的核苷酸片段的例子包括N-封閉的-5′-ODMT-脫氧核苷-3′-氨基亞磷酸酯，如N-封閉的-5′-ODMT-脫氧腺苷-3′-(2-氰乙基-N，N-二異丙基)氨基亞磷酸酯；5′-ODMT-脫氧鳥苷-3′-(2-氰乙基-N，N-二異丙基)氨基亞磷酸酯；5′-ODMT-脫氧胸苷-3′-(2-氰乙基-N，N-二異丙基)氨基亞磷酸酯；和N-封閉的-5′-ODMT-脫氧胞苷-3′-(2-氰乙基-N，N-二異丙基)氨基亞磷酸酯。
另一組優(yōu)選的核苷酸片段由那些核苷酸單體或由核苷酸單體衍生的片段組成，更優(yōu)選3′-核糖核苷酸、3′-(2′-脫氧)核糖核苷酸(即3’-脫氧核糖核苷酸)、5′-核糖核苷酸、5′-(2′-脫氧)核糖核苷酸(即5′-脫氧核糖核苷酸)，更優(yōu)選3′-核糖核苷酸和3′-脫氧核糖核苷酸。
還有一組為核苷酸多聚體的優(yōu)選的核苷酸片段，它們是本發(fā)明的短鏈寡核苷酸自身。例如前面舉例中所述的二聚體J-3′-5′-K。在許多方面，這種二聚體類似一個單體，因為它具有可被保護或衍生的5′-和3′-基團。
本發(fā)明提供了液相合成短鏈寡核苷酸的改進方法，該方法包括步驟(a)偶聯(lián)兩個核苷酸片段；和(b)對不需要的產(chǎn)物選擇性加帽。
這里用的術(shù)語“選擇性的”和“選擇性”涉及一類化學(xué)反應(yīng)，其中可能有許多種反應(yīng)產(chǎn)物，但是過量產(chǎn)生一種或幾種產(chǎn)物。例如，等量產(chǎn)生兩種產(chǎn)物A和B的化學(xué)反應(yīng)是非選擇性的，而產(chǎn)生A多于B的化學(xué)反應(yīng)可以說是對A具有選擇性。這里所用的術(shù)語“高度選擇性的”或“高度選擇性”涉及選擇性化學(xué)反應(yīng)，其中一種或幾種所需產(chǎn)物占反應(yīng)產(chǎn)物多于70％，而優(yōu)選多于80％，更為優(yōu)選多于90％。
用任何一種已知方法可使兩個核苷酸片段Y和Z偶聯(lián)，生成偶聯(lián)的片段Y-Z。偶聯(lián)法的例子包括氨基亞磷酸酯法、H-磷酸酯法和磷酸三酯法，均為本領(lǐng)域熟知的方法。
優(yōu)選的偶聯(lián)方法包括第一核苷酸片段的氨基亞磷酸酯基(即Y-OP(OR′)NR2)和第二核苷酸片段的未保護醇基(即Z-OH)間的反應(yīng)，形成磷酸三酯鍵合(即Y-OP(OR′)O-Z)。此偶聯(lián)法的優(yōu)點是，它具有選擇性；氨基亞磷酸酯基對伯醇(即5′-OH)基比對仲醇(如3′-OH)基具有選擇性。例如，2′-氰乙基-二異丙基氨基亞磷酸酯對5′-OH(伯醇)基的選擇性比對3′-OH(仲醇)基的選擇性約高80％。
選擇性偶聯(lián)法減少或消除保護Z上所有活性官能團的需要，這些活性官能團可能導(dǎo)致不需要的副產(chǎn)物。例如，當(dāng)Z具有3′-OH和5′-OH(即HO-5′-Z-3′-OH)時，可選擇這種偶聯(lián)策略，致使通過Z-5′-OH的偶聯(lián)主要生成所需產(chǎn)物(即Y-5′-Z-3′-OH)并僅產(chǎn)生少量的不需要產(chǎn)物(即Y-3′-Z-5′-OH)。以這種方式，不必保護Z-3′-OH。當(dāng)然，正如上面所述，Y上除3′-氨基亞磷酸酯外的任何一種活性官能團(如5′-OH)也可能需要保護。
如果需要Y-3′5′-Z核苷間鍵合，可選擇這種偶聯(lián)策略，這樣核苷酸片段Y的氨基亞磷酸酯基被連接于Y的3′-位。這種選擇性偶聯(lián)策略產(chǎn)生大部分所需產(chǎn)物(即Y-3′-5′-Z′-3′-OH)和僅少部分的不需要產(chǎn)物(即Y-3′-3′-Z′-5′-OH)；即兩種鍵合異構(gòu)體。注意，這些產(chǎn)物均可進一步與Y-3′-氨基亞磷酸酯反應(yīng)生成相同的“三片段”產(chǎn)物Y-3′-5′-Z-3′-3′-Y。這種三片段產(chǎn)物是不反應(yīng)的(如在堿性偶聯(lián)條件下)，因為所有余下的官能團均被保護或者在偶聯(lián)反應(yīng)條件下均無反應(yīng)活性；這種三片段產(chǎn)物被雙重加帽。還應(yīng)注意在兩端存在Y-5′-保護基；因此，這種不反應(yīng)的三片段產(chǎn)物是被“簡并加帽”的。
如此獲得的偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物混合物包含所需產(chǎn)物和不需要產(chǎn)物，必須將其分離。但是這些鍵合異構(gòu)體具有基本相似的色譜性質(zhì)和溶解性，且它們的分離不是無關(guān)緊要的。本發(fā)明的改進方法使不需要的產(chǎn)物衍生(即通過選擇性加帽)，由此使得其無反應(yīng)活性并容易分離。
通過將偶聯(lián)產(chǎn)物混合物與一種合適的選擇性加帽劑反應(yīng)，使不需要的產(chǎn)物被選擇加帽。例如對于含帶有3′-OH的所需產(chǎn)物和帶有5′-OH的不需要產(chǎn)物的反應(yīng)混合物，為衍生不需要產(chǎn)物可將該混合物與5′-OH-選擇性試劑反應(yīng)?？梢詮氖巩a(chǎn)物可分離的角度或使不需要產(chǎn)物無反應(yīng)活性的角度或從這兩個角度，或者依據(jù)其它合成或策略因素，來選擇選擇性加帽劑。
合適的加帽劑包括DMT-Cl、MMT-Cl、叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三異丙基氯硅烷、新戊酰氯和pixyl chloride，但不限于此。優(yōu)選的選擇性加帽劑是合適堿和溶劑如吡啶中的DMT-Cl(即4，4′-二對甲氧三苯甲基氯)。與3′-OH比，該試劑對5′-OH是高度選擇性的，生成約90％或更多的5′-ODMT，僅生成約10％或更少的3′-ODMT。這種優(yōu)選的選擇性加帽劑的使用可由下面偶聯(lián)策略說明(i)將第一核苷酸片段DMTO-5′-Y-3′-氨基亞磷酸酯和第二核苷酸片段HO-5′-Z-3′-OH偶聯(lián)，產(chǎn)生所需的和不需要的YZ鍵合異構(gòu)體，分別為DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OH和DMTO-5′-Y-3′-3′-Z-5′-OH；(ii)含這些異構(gòu)體(或其衍生物)的反應(yīng)混合物進一步與選擇性偶聯(lián)劑吡啶中的DMT-Cl反應(yīng)，主要產(chǎn)生未改變的所需YZ鍵合異構(gòu)體DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OH和被“簡并加帽”的不需要的鍵合異構(gòu)體DMTO-5′-Y-3′-3′-Z-5′-ODMT。
這種偶聯(lián)劑提供了許多重要的實用的優(yōu)點。首先，偶聯(lián)劑是高度選擇性的；在上述說明中，僅有極少部分的所需鍵合異構(gòu)體被簡并加帽而損失掉。第二，被雙重加帽的不需要的鍵合異構(gòu)體具有明顯不同的色譜性質(zhì)和溶解性(它的極性比單一加帽的異構(gòu)體小得多)，因此可容易地從所需鍵合異構(gòu)體中分離出來。第三，有效選擇加帽所需的DMT-Cl/吡啶反應(yīng)條件對核苷酸片段和短鏈寡核苷酸是溫和的，這一點是已知的，因為該試劑已被廣泛用來對核苷、核苷酸和寡核苷酸5′-OH進行選擇性加帽和保護。第四，污染所需鍵合異構(gòu)體的任何一種被簡并加帽的不需要鍵合異構(gòu)體無足輕重在它可能作為污染物存在的大多數(shù)寡核苷酸合成步驟中(如偶聯(lián))它是不反應(yīng)的。
所需鍵合異構(gòu)體(即短鏈寡核苷酸)可進一步被衍生，生成適用于固相或液相寡核苷酸合成的反應(yīng)單元(即偶聯(lián)片段)。例如，對于通過氨基亞磷酸酯反應(yīng)被偶聯(lián)的且具有亞磷酸三酯核苷間鍵的鍵合異構(gòu)體來說，可以用已知方法將該異構(gòu)體氧化，生成磷酸三酯。可任選地或另外，可將該鍵合異構(gòu)體衍生以具有其它活性官能團如氨基亞磷酸酯基，致使其用作液相或固相寡核苷酸合成中的偶聯(lián)片段。為說明這種方法，考慮下面的策略(i)偶聯(lián)將第一核苷酸片段DMTO-5′-Y-3′-氨基亞磷酸酯與第二核苷酸片段HO-5′-Z-3′-OH偶聯(lián)，主要生成所需的和不需要的YZ(亞磷酸酯)鍵合異構(gòu)體，分別為DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OH和DMTO-5′-Y-3′-3′-Z-5′-OH；(ii)氧化所需的YZ(亞磷酸酯)鍵合異構(gòu)體DMTO-5′-Y-3′-亞磷酸酯-5′-Z-3′-OH和不需要的YZ(亞磷酸酯)鍵合異構(gòu)體DMTO-5′-Y-3′-亞磷酸酯-3′-Z-5′-OH通過熟知方法進一步與一種氧化劑如碘和吡啶水溶液反應(yīng)，生成所需的YZ(磷酸酯)鍵合異構(gòu)體DMTO-5′-Y-3′-磷酸酯-5′-Z-3′-OH和不需要的YZ(磷酸酯)鍵合異構(gòu)體DMTO-5′-Y-3′-磷酸酯-3′-Z-5′-OH；(iii)選擇性加帽含有這些磷酸酯鍵合異構(gòu)體的混合物進一步與5’-OH選擇性試劑即吡啶中的DMT-Cl反應(yīng)，生成主要為未改變的所需YZ鍵合異構(gòu)體DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OH和被“簡并加帽”的不需要的YZ鍵合異構(gòu)體DMTO-5′-Y-3′-3′-Z-5′-ODMT。
(iv)(任選)衍生使用熟知方法，將所需YZ(磷酸酯)鍵合異構(gòu)體DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OH進一步與衍生試劑如2-氰乙基-N， N-二異丙基氯氨基亞磷酸酯(CEDICPA)或雙(二異丙基氨基)氰乙基亞磷酸酯(BDIACEP)反應(yīng)，生成所需的氨基亞磷酸酯DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OP(OR′)NR2，其中R′是-CH2CH2CN，R是-CH(CH3)2。
在選擇性加帽之后的任何時候，例如通過熟知的溶劑萃取法或色譜法可分離和純化該所需鍵合異構(gòu)體。在一些如下所述的例子中，可以不必或不需分離和純化所需鍵合異構(gòu)體，因為在主要相關(guān)條件下，不需要的鍵合異構(gòu)體和三片段產(chǎn)物是無反應(yīng)活性的。
在本發(fā)明方法的某些實施方案中，可優(yōu)選在“氧化”步驟之前進行“選擇性加帽”步驟。
例如，對于這種具有亞磷酸二酯型核苷酸間鍵合的亞磷酸酯連接的二聚體，選擇選擇性加帽劑，對5′-OH選擇性均大于3′-OH和亞磷酸酯基。優(yōu)選的選擇性加帽劑包括封閉的甲硅烷基化劑和?；瘎?，最優(yōu)選叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷和三異丙基氯硅烷。
在采用DMT-Cl/吡啶作為選擇性加帽劑的優(yōu)選實施方案中，氧化步驟在選擇性加帽步驟之前，以減少選擇性加帽步驟中產(chǎn)生的副反應(yīng)(例如，DMT陽離子和亞磷酸酯的磷原子間的親核反應(yīng))。但是，在其它實施方案中，可優(yōu)選對亞磷酸酯鍵合異構(gòu)體進行選擇性加帽，隨后再進行氧化步驟，生成(被選擇加帽的)磷酸酯鍵合異構(gòu)體。由此，在其它優(yōu)選實施方案中，按以下順序進行上面的步驟(i)偶聯(lián)；(ii)選擇性加帽；(iii)氧化；和(iv)(任選)衍生。
在本發(fā)明其它實施方案中，可僅僅需要進行以下步驟(i)偶聯(lián)；(ii)氧化；和(iii)選擇性加帽。例如，隨后的分離和純化會提供所需的鍵合異構(gòu)體DMTO-5′-Y-3′-磷酸酯-5′-Z-3′-OH，它本身是本發(fā)明的核苷酸片段；通過5′-ODMT基的脫保護，它可被表示為HO-5′-W-3′-OH，直接類似于上述的核苷酸片段HO-5′-Z-3′-OH。
步驟(iv)的產(chǎn)物本身是本發(fā)明的核苷酸片段；它可被表示為DMTO-5′-W-3′-OP(OR′)NR2，直接類似于上述核苷酸片段Y-3′-OP(OR′)NR2。如此制備的步驟(iv)的產(chǎn)物能以基本類似于單體反應(yīng)性片段的使用方式用于一般的固相或液相寡核苷酸合成中。
或者，在本發(fā)明中可使用步驟(iv)的產(chǎn)物來合成較長的“短鏈寡核苷酸偶聯(lián)單元”。例如，使用本發(fā)明方法，可以由活性單體J和K開始，產(chǎn)生并分離出所需的JK-二聚體；將JK-二聚體的一半衍生，得到反應(yīng)活性的JK二聚體(如JK-氨基亞磷酸酯)；再次使用本發(fā)明方法，使剩余的JK-二聚體與JK-氨基亞磷酸酯反應(yīng)，以產(chǎn)生并分離出所需的JK JK-四聚體；衍生JK JK-四聚體的一半，得到反應(yīng)活性的JKJK-四聚體(如JK JK-氨基亞磷酸酯)；再次使用本發(fā)明方法，使剩余的JK JK-四聚體與JK JK-氨基亞磷酸酯反應(yīng)，以產(chǎn)生并分離出所需的JK JK JK JK-八聚體，如此進行下去。注意，在產(chǎn)生氨基亞磷酸酯的衍生步驟中，被簡并加帽的不需要的鍵合異構(gòu)體是不反應(yīng)的；因此，該產(chǎn)物混合物的這一半不必進行純化。
本說明書中引用的所有出版物和專利申請在此插入引作參考文獻，正如每篇單獨的出版物或?qū)＠暾埍惶囟ǖ貑为氁鲄⒖家粯印?br> 實施例1dGdT氨基亞磷酸酯二聚體偶聯(lián)單元的制備A.dG與dT的偶聯(lián)所有玻璃器皿在使用前均通過真空下加熱被干燥，反應(yīng)在氬氣中進行。未保護的胸苷5′-OH-dT-3′-OH作為化合物(1)(4.87g，20.1mmol，Aldich)溶于無水DMF(60ml，Aldrich)中，真空下將該溶液蒸餾至40ml體積，以干燥反應(yīng)混合物。冷卻至室溫后，加入化合物(2)5′-ODMT-dG-3′-氰乙基氨基亞磷酸酯(7.36g，8.76mmol，Cruchem)。在該氨基亞磷酸酯溶解后，在快速攪拌下滴加四唑的乙腈溶液(0.45M，39ml，18mmol，Millipore ActivatorSolution)40分鐘。就5′-ODMT-dG-3′-氰乙基氨基亞磷酸酯/四唑混合物而言，薄層色譜(TLC)(二氧化硅，乙酸乙酯)表明完全反應(yīng)。
含一半體積反應(yīng)混合物的試樣被移去用于亞磷酸酯二聚體的分離。該試樣在室溫下被汽提以除去大量乙腈。在快速攪拌下，00C時將該所得溶液(18.5g)滴加入新制備的碳酸氫鈉水溶液(0.3M，250ml)和乙酸乙酯(50ml)的混合物中。由于亞磷酸酯二聚體在乙酸乙酯中具有部分溶解性，形成了膠質(zhì)固體。向該混合物中加入硅藻土512(TM10g)和己烷(TM100ml)，濾出固體并用水和己烷洗滌。該固體用二氯甲烷(150ml)提取，濾液被干燥(用硫酸鈉)、過濾，并被汽提成泡沫形玻璃(4.48g，4.57g，52％)。TLC分析(二氧化硅，10％EtOH/CHCl3)表明在Rf＝0.21和0.29處有兩個主要產(chǎn)物，在Rf＝0.43處有極微量的第三個產(chǎn)物(三聚體？)。在室溫條件下，發(fā)現(xiàn)亞磷酸酯二聚體是穩(wěn)定的(至少達(dá)幾個月)。
通過液相色譜分離這兩個主要產(chǎn)物的努力沒有成功。在利用硅膠柱(57×300mm，55-105微米，目錄號WAT050041)的WatersDeltaPrep上對該粗制三酯(4.28g)進行色譜分離。使用線性梯度為40分鐘內(nèi)0-10％甲醇的二氯甲烷溶液，50ml/min流速，在45分鐘時以寬峰形式洗脫出1％的等份試樣。然后，使用線性梯度為40分鐘內(nèi)5-10％甲醇的二氯甲烷溶液，50mL/min流速，對殘余產(chǎn)物進行色譜；再次在45分鐘以寬峰洗脫出產(chǎn)物。將由TLC測定的最純凈級分合并，并汽提為泡沫玻璃(1.08g，25％)，為含3′-5′和3′-3′異構(gòu)體(2.11g，50％)的混合級分。
B.氧化dG-亞磷酸酯-dT成為dG-磷酸酯-dT用標(biāo)準(zhǔn)氧化劑溶液(0.05MI2)一滴滴處理反應(yīng)混合物的殘余物，直至溶液中持續(xù)存在黃色(75ml，3.8mmol)。立即在真空下室溫時從混合物中汽提乙腈，除去過量的碘。將得到的無色溶液快速攪拌下滴加入新制備的含硫代硫酸鈉(TM100mg)的碳酸氫鈉水溶液(0.5M，200ml)中。濾出粗制固體，重新溶于二氯甲烷(100ml)中，干燥(用硫酸鈉)并汽提為泡沫玻璃(4.25g，4.26mmol，收率49％)。TLC分析(二氧化硅，20％EtOH/CHCl3)表明在Rf＝0.44和0.50處有兩個主要產(chǎn)物，在Rf＝0.60處存在極少量的第三個產(chǎn)物(三聚體？)。由于外來的DCl，通過在CDCl3中數(shù)小時內(nèi)DMT基團的失去，磷酸酯二聚體分解；它對酸(脫三苯甲基作用)和堿(除去氰乙基)均不穩(wěn)定。
粗制磷酸三酯在硅膠60(230g，Baxter C4582-87)上進行急驟層析，先以10％乙醇/氯仿(1L)洗脫，然后再以20％乙醇/氯仿(1L)洗脫。將最純凈的級分合并，并汽提為泡沫玻璃(820mg，19％)，為含3′-5′和3′-3′異構(gòu)體(1.05g，25％)的級分。
為進一步鑒別兩個主要產(chǎn)物，對單獨合成的3′-5′和3′-3′偶聯(lián)異構(gòu)體進行關(guān)聯(lián)色譜。利用T-5′-CPG的15微摩爾柱(500A，72微摩爾/g，Glen Research)在MilliGen8750上制備3′-3′偶聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)物。使用標(biāo)準(zhǔn)方法進行與dG-酰亞胺(amidite)的單一偶聯(lián)。已被偶聯(lián)的CPG與濃氨水溶液(1ml)混合，在室溫下放置5天，通過薄棉紙塞(tissue paper plug)過濾，用水洗滌(2×1ml)，并在氮氣流下濃縮。按相似方法制備出3′-5′偶聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)物。使用T-3′-CPG的15μmol柱(1000A，31μmol/gm，Glen Research)，在1.5ml濃氨水中55OC下水解16小時。用柱純化獲得的最純凈(23.4mg)和混合(13.Smg)級分，通過類似的水解作用，制備出相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物。通過對粗制、經(jīng)汽提的亞磷酸酯反應(yīng)溶液進行氧化和水解，制備出產(chǎn)物比率樣品。
在Vydac C-18柱(目錄號218 TP5415)上分析樣品，流速1.00ml/min，25分鐘內(nèi)梯度為從緩沖液B(5％緩沖液A的乙腈溶液)中95％緩沖液A(0.1M乙酸三乙銨的水溶液)至50％緩沖液A。在20.0分鐘時洗脫水解的3′-5′標(biāo)準(zhǔn)物，與水解的下面流動的(主要)二聚體一起洗脫。在20.5分鐘時洗脫水解的3′-3′標(biāo)準(zhǔn)物，與水解的上面流動的(少量)二聚體一起洗脫。
C.不需要的3′-3′鍵合異構(gòu)體的簡并加帽將磷酸三酯柱純化的混合級分(1.04g，1.04mmol)溶于吡啶(10mL)中，并在真空下汽提(至TM7ml)以使該混合物干燥。在快速攪拌下，立即加入DMT-Cl(232g，0.69mmol，Aldrich，室溫氬氣流下攪拌該混合物2小時。再加入DMT-Cl(30mg，0.09mmol)，且在室溫下攪拌該混合物一晝夜。將該混合物在稀釋的碳酸氫鈉水溶液(TM50ml)中淬滅，并用二氯甲烷(3×TM10ml)萃取。萃取液通過硅膠塞(TM4g)過濾，除去低Rf雜質(zhì)，并汽提為稀油。用乙酸乙酯(10ml)洗脫硅膠塞，油被洗脫液吸收，并加入快速攪拌的10％乙酸乙酯/己烷(50ml)中。過濾沉淀，并用少量己烷洗滌，干燥，得白色固體(670mg，64％)，正如由極小的高Rf點所測定的，其僅含微量的3′-3′二聚體。
權(quán)利要求
1.一種制備偶聯(lián)寡核苷酸YZ的方法，包括步驟(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每個所述第一片段具有至少一個活性官能團a(n)，其中n是正整數(shù)，表示第n個Y活性官能團；(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每個所述第二片段具有至少兩個不同的活性官能團b(m)和c(p)，其中m和p是正整數(shù)，分別表示第m個Z-b和第p個Z-c活性官能團，其中每個b(m)活性官能團與每個c(p)活性官能團不同；(c)使所述第一片段和第二片段在一定條件下反應(yīng)，從而所述的至少一個Y活性官能團a(n)與所述的至少兩個Z活性官能團b(m)和c(p)反應(yīng)，形成連接Y和Z的核苷間共價鍵合，由此生成至少一個第一鍵合異構(gòu)體YZ-b(m)，它保留至少一個殘余的活性官能團b(m)，以及生成至少一個不同的第二鍵合異構(gòu)體YZ-c(p)，它保留至少一個殘余的活性官能團c(p)；(d)使所述YZ鍵合異構(gòu)體或其衍生物的混合物與選擇性加帽劑反應(yīng)，從而所述的至少一個YZ-b(m)鍵合異構(gòu)體的所述至少一個殘余活性官能團b(m)選擇性地保持不變，所述的至少一個YZ-c(p)鍵合異構(gòu)體的所述至少一個殘余活性官能團c(p)被選擇性加帽。
2.一種制備偶聯(lián)寡核苷酸YZ的方法，包括步驟(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每個所述第一片段具有一個活性官能團a；(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每個所述第二片段具有兩個不同的活性官能團b和c；(c)使所述第一片段和第二片段在一定條件下反應(yīng)，從而所述的Y活性官能團a與所述Z活性官能團b和c反應(yīng)，形成連接Y和Z的核苷間共價鍵合，由此生成一種保留一個殘余的活性官能團b的第一鍵合異構(gòu)體YZ-b和一種不同的保留一個殘余活性官能團c的第二鍵合異構(gòu)體YZ-c；(d)使所述YZ鍵合異構(gòu)體或其衍生物的混合物與選擇性加帽劑反應(yīng)，從而所述YZ-b鍵合異構(gòu)體的所述一個殘余活性官能團b選擇性地保持不變，所述YZ-c鍵合異構(gòu)體的所述一個殘余活性官能團c被選擇性加帽。
3.一種制備偶聯(lián)寡核苷酸YZ的方法，包括步驟(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每個所述的第一片段具有一個活性官能團a；(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每個所述的第二片段具有兩個不同的活性官能團b和c；(c)使所述第一片段和第二片段在一定條件下反應(yīng)，從而所述的Y活性官能團a與所述的Z活性官能團b和c反應(yīng)，形成連接Y和Z的核苷間共價鍵合，由此生成一種保留一個殘余活性官能團b的第一鍵合異構(gòu)體YZ-b和一種不同的保留一個殘余活性官能團c的第二鍵合異構(gòu)體YZ-c；(d)使所述第一鍵合異構(gòu)體YZ-b和所述第二鍵合異構(gòu)體YZ-c的混合物與一種氧化劑反應(yīng)，由此生成第一YZ鍵合異構(gòu)體的衍生物YZ′-b和第二YZ鍵合異構(gòu)體的衍生物YZ′-c；(e)使所述YZ′鍵合異構(gòu)體衍生物的混合物與選擇性加帽劑反應(yīng)，從而所述YZ′-b鍵合異構(gòu)體衍生物的所述一個殘余活性官能團b選擇性地保持不變，所述YZ′-c鍵合異構(gòu)體衍生物的所述一個殘余活性官能團c被選擇性加帽。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述核苷酸片段Y和Z每個都包含單一核苷，它們可以相同或不同。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述Y活性官能團是氨基亞磷酸酯基。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述Y活性官能團是式為-OP(OR′)NR2的氨基亞磷酸酯，這里R′選自-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CN和-C6H5Cl；R選自-CH3，-CH2CH3和-CH(CH3)2。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述Y活性官能團是二異丙基-(2-氰乙基)-氨基亞磷酸酯-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述第一核苷酸片段Y是5′-保護的-3′-氨基亞磷酸酯核苷。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的第一核苷酸片段Y是5′-ODMT-3′-氨基亞磷酸酯核苷。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述第一核苷酸片段是5′-ODMT-3′-(二異丙基-(2-氰乙基)-氨基亞磷酸酯)鳥苷。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的Z活性官能團b是仲醇，所述Z活性官能團c是伯醇。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述第二核苷酸片段Z是5′-OH，3′-OH核苷。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述第二核苷酸片段Z是胸苷。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述選擇性加帽劑選自DMT-Cl、MMT-Cl、叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三異丙基氯硅烷、新戊酰氯和pixyl chloride。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述選擇性加帽劑是DMT-Cl。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述氧化劑是碘水溶液和吡啶。
全文摘要
本發(fā)明提供了液相合成純化的短鏈寡核苷酸偶聯(lián)單元如二聚體、三聚體和四聚體的改進方法,這些偶聯(lián)單元適用于液相或固相合成寡核苷酸。
文檔編號C07H21/00GK1190973SQ96195563
公開日1998年8月19日 申請日期1996年5月16日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者D·A·利文斯頓 申請人:拉卓拉藥物公司