專利名稱：紋狀體或黑質(zhì)密部中的神經(jīng)缺陷的治療的制作方法
專利說明紋狀體或黑質(zhì)密部中的神經(jīng)缺陷的治療 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及通過給予人重組GDF5治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部(substanta nigra pars compacta)的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的方法，并涉及用于這類治療方法的包含人重組GDF5的組合物和基質(zhì)。

背景技術(shù)：
目前尚無修復(fù)由神經(jīng)病引起的損傷的滿意方法，這些損傷可能導(dǎo)致帕金森氏病(帕金森氏綜合征)或中風(fēng)。帕金森氏病是由諸如震顫、僵直、遲鈍-和運(yùn)動功能減退的神經(jīng)缺陷，以及在平衡和姿勢中其它缺陷組成的綜合征。帕金森氏病通常與神經(jīng)系統(tǒng)的老化有關(guān)。類似地，中風(fēng)可影響運(yùn)動系統(tǒng)，使得患者具有輕偏癱或麻痹的癥狀。
黑質(zhì)是帕金森氏病的主要位置。黑質(zhì)的色素神經(jīng)元很大程度上且廣泛地表達(dá)到尾狀殼核(caudate-putamen)(紋狀體)上，并且特異性合成和釋放多巴胺。當(dāng)75-80％多巴胺能神經(jīng)分布被破壞時，帕金森氏綜合征的癥狀出現(xiàn)。帕金森氏病患者對多巴胺置換性療法(dopaminereplacement therapy)應(yīng)答。不幸的是，多巴胺置換性療法的功效隨黑質(zhì)紋狀體的多巴胺途徑的衰退而持續(xù)降低。
干細(xì)胞的鑒定刺激了針對更新藥物的特定細(xì)胞類型的選擇性產(chǎn)生(regenerative medicine)的研究。雖然已研制出將干細(xì)胞直接分化為治療相關(guān)的細(xì)胞類型的方案，例如治療帕金森氏病的多巴胺能(DA)神經(jīng)元、治療ALS的運(yùn)動神經(jīng)元以及治療MS的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但是這些源于干細(xì)胞的細(xì)胞類型的實(shí)際數(shù)量的有效增殖尚未報(bào)道。產(chǎn)生無限數(shù)量的表達(dá)完整中腦DA神經(jīng)元標(biāo)記物的DA神經(jīng)元的能力是為帕金森氏病提供治愈的重要部分。因此，可用于刺激干細(xì)胞分化為DA譜系的藥物為影響大腦中動脈(MCA)及其分支的帕金森氏病以及中風(fēng)提供了一種利用和區(qū)分外源性和內(nèi)源性干細(xì)胞的可能性。
在其它情況下，抵抗大腦和/或脊髓的急性或神經(jīng)變性性損傷的作用的嘗試都主要涉及植入胎神經(jīng)元，以補(bǔ)償損失或不足的神經(jīng)功能。但是，人胎兒細(xì)胞移植研究受到嚴(yán)格限制。也已建議給予諸如神經(jīng)生長因子和胰島素樣生長因子的神經(jīng)營養(yǎng)因子以刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)神經(jīng)的生長。參見，例如Lundborg，Acta Orthop.Scand.58145-169(1987)；美國專利No.5,093,317。給予CNS神經(jīng)營養(yǎng)因子需要繞過血-腦屏障。該屏障可通過直接輸注，或者通過修飾分子增加其進(jìn)入該屏障的輸送、通過化學(xué)修飾或軛合或者通過分子截?cái)鄟砜朔?。TGF-β超家族的許多生長因子[Kingsley，Genes & Development8 133-146(1994)以及其中摘引的文獻(xiàn)]都與很多尤其涉及傷口愈合和組織再生的內(nèi)科療法和應(yīng)用有關(guān)。某些這類多功能蛋白除具有諸如在多種細(xì)胞類型中調(diào)節(jié)增殖和分化作用外，還對神經(jīng)元具有促進(jìn)生存作用[Roberts and Sporn，Handbook of Experimental Pharmacology 95419-472，eds.Spom and Roberts(1990)；Sakurai等，J.Biol.Chem.，26914118-14122(1994)]。因此，例如證實(shí)TGF-β體外對胚胎運(yùn)動和感覺神經(jīng)元的營養(yǎng)作用[Martinou等，Devl.Brain Res.，52 175-181(1990)；Chalazonitis等，Dev.Biol.，152121-132(1992)]。另外，蛋白TGF-β-1、-2、-3、激活素A和GDNF(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系-衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子)對中腦的多巴胺能神經(jīng)元呈現(xiàn)促進(jìn)生存的作用，但是這些作用并不通過星細(xì)胞介導(dǎo)，GDNF為一種與TGF-β超家族成員具有結(jié)構(gòu)類似性的蛋白[Krieglstein等，EMBO J.，14，736-742(1995)]。各種組織和發(fā)育階段中TGF-β超家族的蛋白的出現(xiàn)與其準(zhǔn)確功能以及靶位、生存期、輔助因子的需要量、必需的細(xì)胞生理環(huán)境和/或?qū)λネ说目剐陨系牟顒e相符合。
GDF5表達(dá)于新生大鼠的中腦中，表明其在多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育中可能發(fā)揮作用[Krieglstein等，J.Neurosci.Res.，42 724-32(1995)]。體外研究表明MP52對大鼠胚胎的多巴胺能神經(jīng)元具有促生存作用，保護(hù)它們對抗毒素1-甲基-4-吡啶鎓(MPP+)。另外，體內(nèi)研究表明薄壁組織內(nèi)注射GDF5能預(yù)防成熟大鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)由前腦內(nèi)側(cè)束的6-羥基多巴胺(6OHDA)損傷誘導(dǎo)的死亡[Sullivan等，Eur.J.Neurosci.，233 73-6(1997)]。然而，雖然這些研究表明GDF5在多巴胺能邊緣系統(tǒng)的發(fā)育和保護(hù)中發(fā)揮重要作用，但是針對神經(jīng)再生性能力或區(qū)分內(nèi)源性或外源性細(xì)胞群能力，它們未呈現(xiàn)或顯示出任何與GDF5的相關(guān)性。
因此，目前需要一種治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的方法。本發(fā)明尋求以能治療或預(yù)防這樣產(chǎn)生的缺陷的方式來利用人重組GDF5。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的方法，該方法包括給予人紋狀體或黑質(zhì)密部有效誘導(dǎo)細(xì)胞群的量的人重組GDF5，所述細(xì)胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便實(shí)際上使所述細(xì)胞向多巴胺能表型分化，本發(fā)明還涉及包含適用于治療此類缺陷的人重組GDF5的組合物和基質(zhì)。
發(fā)明詳述 已證實(shí)神經(jīng)發(fā)生存在于成人海馬、室下區(qū)(subventricular)、黑質(zhì)和嗅球中。因此，在治療由可為帕金森氏病病因的人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷中，可將這些細(xì)胞補(bǔ)充和/或分化成DA特異性神經(jīng)元的藥物對提供細(xì)胞替代是必要的。在本發(fā)明的治療方法和組合物中，將人重組GDF5用作一種預(yù)分化劑或分化劑以分化無論是內(nèi)源性或外源性的干細(xì)胞群或祖細(xì)胞群。本發(fā)明基于，至少部分基于這種發(fā)現(xiàn)，即人重組GDF5是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，其能選擇性誘導(dǎo)成人神經(jīng)海馬祖細(xì)胞向多巴胺能表型分化。本文所述的資料表明人重組GDF5是神經(jīng)干細(xì)胞分化的有效誘導(dǎo)物。因此，這些結(jié)果表明人重組GDF5除能提供除其本身的神經(jīng)保護(hù)功能外，還提供神經(jīng)再生功能的協(xié)同作用。
GDF5是一種功能為生長和分化因子的蛋白質(zhì)。哺乳動物中可發(fā)現(xiàn)天然狀態(tài)的該蛋白質(zhì)。按本發(fā)明進(jìn)一步地描述及本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的方法，可將天然存在的人GDF5改良、純化或另外處理形成人重組GDF5。本文將“Human recombinant GDF5”稱為GDF5-HR。已知的GDF5-HR蛋白包括BMP-14、CDMP-1和MP52。
MP52由Biopharm GmbH提供，Biopharm GmbH是一家營業(yè)場所在德國海德堡的德國公司，1994年首次分離MP52的cDNA，其歸屬于TGF-β基因超家族的骨生成因子。MP52是一種具有120個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其N-末端為丙氨酸，其氨基酸序列公開于WO93/16099和WO95/04819。多種動物實(shí)驗(yàn)表明MP52與成骨作用有關(guān)，類似于其它的骨生成因子。
由于已發(fā)現(xiàn)MP52是神經(jīng)干細(xì)胞分化的有效誘導(dǎo)物，所以已確定其可用于治療人紋狀體或黑質(zhì)密部中的神經(jīng)缺陷，所述缺陷歸因于神經(jīng)變性疾病，尤其是帕金森氏病，或者由影響中腦動脈(MCA)及其分支的中風(fēng)引起的損傷。雖然我們已發(fā)現(xiàn)MP52單獨(dú)即可刺激海馬中分離的成人神經(jīng)原向多巴胺能表型分化，但是可將其與激動劑聯(lián)合以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞或其它具有向多巴胺能表型分化的能力的細(xì)胞中的多巴胺能分化提高。例如，可將MP52與Sonic Hedgehog(SHH)或成纖維細(xì)胞生長因子8(FGF8)聯(lián)合使用，以便為誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞和本文所述的其它細(xì)胞成為表型為多巴胺能的細(xì)胞提供明顯增強(qiáng)的方法。SHH是Wnt信號途徑中的一個完整部分；該發(fā)育途徑中的其它因子與GDF5-HR聯(lián)合應(yīng)用中對神經(jīng)的形成可能是重要的。
GDF5-HR可用于分化除成熟神經(jīng)祖細(xì)胞外的干細(xì)胞形式，如海馬祖細(xì)胞或海馬干細(xì)胞，或者其它具有向多巴胺能表型分化的能力的細(xì)胞。這些其它形式的細(xì)胞包括，但不限于間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESCs)、源于胚胎干細(xì)胞的祖細(xì)胞、產(chǎn)后衍生的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、源于臍帶或胎盤組織的細(xì)胞、源于肌肉的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、源于胰的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、源于緣的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、源于視網(wǎng)膜的干細(xì)胞或祖細(xì)胞以及源于肝的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
GDF5-HR可單獨(dú)用作神經(jīng)營養(yǎng)因子，以在治療人紋狀體或黑質(zhì)密部內(nèi)的神經(jīng)缺陷中誘導(dǎo)細(xì)胞群分化。此處所用術(shù)語神經(jīng)營養(yǎng)性被定義為包括恢復(fù)、再生和分化細(xì)胞的潛在性。還可將所述蛋白質(zhì)與神經(jīng)營養(yǎng)組合物混合或者與用作傳遞或支持系統(tǒng)的適合基質(zhì)聯(lián)合使用。所述神經(jīng)營養(yǎng)組合物包括有效量的GDF5-HR。有效量指誘導(dǎo)細(xì)胞群的有效量，所述細(xì)胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便實(shí)際上使所述細(xì)胞向多巴胺能表型分化。本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)組合物可包含約0.5-約1,000納克的MP52，或約0.5-約200納克的MP52。
神經(jīng)營養(yǎng)組合物可通過將GDF5-HR固定、混合、溶解或混懸于藥學(xué)上可接受的載體或水性溶劑中而獲得。例如，載體或水性溶劑的適合的實(shí)例包括，但不限于臨床級別的無菌水、無菌鹽水、無菌磷酸緩沖鹽水、葡萄糖的鹽水溶液、無菌液體介質(zhì)或其它生理學(xué)上可接受的等滲液體。另外，本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)組合物可包含多種藥學(xué)上可接受的、可與載體或水性溶劑混合的添加劑，如穩(wěn)定劑、防腐劑、增厚劑、助溶劑等。
還可將GDF5-HR與適合的用作傳遞或支持系統(tǒng)的基質(zhì)結(jié)合使用。GDF5-HR的成功基質(zhì)期望能執(zhí)行幾種重要的功能。期望其與GDF5-HR結(jié)合，并能用作緩慢或持續(xù)釋放的傳遞系統(tǒng)，并調(diào)節(jié)分化過程中細(xì)胞響應(yīng)的各個步驟?；|(zhì)阻止GDF5-HR從傳遞部位分散出去，因此將GDF5-HR的作用集中在所傳遞的細(xì)胞上。另外，所選擇的基質(zhì)材料應(yīng)該是體內(nèi)可生物降解的、多孔的并且優(yōu)選是可生物降解的。此處所用的術(shù)語生物可降解的被定義為包括能在體內(nèi)生理?xiàng)l件下降解或損壞掉(化學(xué)或物理性)，從而所降解的產(chǎn)物可被體內(nèi)排泄或吸收的物質(zhì)。生物降解率可根據(jù)植入紋狀體或黑質(zhì)密部內(nèi)后所要求的釋放速率而變化。基質(zhì)還可按要求用作暫時性支架(scaffold)，直至被新生長的神經(jīng)組織代替。因此，在一實(shí)施方案中，基質(zhì)為需要此種因子的患者提供持續(xù)釋放的神經(jīng)營養(yǎng)因子成分，并可在患者中提供供組織生長發(fā)育的結(jié)構(gòu)。基質(zhì)可以是微粒形式(直徑超過10微米的大?；蛑睆叫∮?0的微粒)，或者可以是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、三維植入片形式(例如，支架)。移植片可以是立方體(cube)、圓筒、軟管(tube)、嵌入塊(block)、薄膜、薄片或適合的構(gòu)造形式。
影響體內(nèi)生物降解聚合物的機(jī)械性能的因素對于聚合物科學(xué)家來講是熟知的，包括單體的選擇、啟發(fā)過程條件和添加劑的存在。生物降解已能通過合成聚合物實(shí)現(xiàn)，該聚合物在骨架中具有不穩(wěn)定的鍵，或者具有在體內(nèi)能被安全地氧化或水解的鍵。具有該特性的最常用化學(xué)官能團(tuán)是醚、酯、酐、原酸酯和酰胺。因此，在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，GDF5-HR被控制性地從可生物降解的聚合物基質(zhì)中釋放至在可生物降解聚合物中需要通過水解化學(xué)鍵的部位上。可生物降解性聚合物基質(zhì)優(yōu)選為粉末、微粒、微球、條狀物、凝膠(如原位可聚合的凝膠)、網(wǎng)狀物或海綿的形式。
生物相容性基質(zhì)可以包括天然的、改良的天然或合成的可生物降解聚合物，包括同聚物、共聚物和嵌段聚合物，以及它們的組合物。值得注意的是一般根據(jù)合成的單體來命名聚合物。
適合的可生物降解的聚合物或聚合物類別的實(shí)例包括纖維素、膠原、彈性蛋白、明膠、玻連蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、再生基膜基質(zhì)、淀粉、葡聚糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸酶(hyaluron)、殼多糖、殼聚糖、瓊脂糖、多糖、透明質(zhì)酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乙二醇、去細(xì)胞組織(decellularized tissue)、自主裝配肽(self-assemblingpeptides)、多肽、糖胺聚糖、它們的衍生物及其混合物。對于羥乙酸和乳酸，一般在聚合前，將中間體環(huán)狀二聚體制備和純化。分別將這些中間二聚體稱為乙交酯和交酯。其它有用的可生物降解聚合物或聚合物類別包括，但不限于聚二氧六環(huán)酮、聚碳酸酯、聚草酸酯、聚(α-酯)、聚酐、聚乙酸酯、聚己內(nèi)酯(polycaprolactones)、聚(原酸酯)、聚氨基酸、聚酰胺及其混合物和共聚物。其它有用的可生物降解的聚合物包括，但不限于L-和D-乳酸的立體聚合物、雙(對-羧基苯氧基)丙酸和癸二酸的共聚物、癸二酸共聚物、己內(nèi)酯的共聚物、聚(乳酸)/聚(羥乙酸)/聚乙二醇共聚物、聚氨酯和聚(乳酸)的共聚物、聚氨基甲酸酯和聚(乳酸)的共聚物、α-氨基酸的共聚物、α-氨基酸和己酸的共聚物、α-芐基谷氨酸酯和聚乙二醇的共聚物、琥珀酸酯和聚(乙二醇)的共聚物、聚磷腈、聚羥基鏈烷酸酯及其混合物。二元和三元系統(tǒng)也包括在內(nèi)。
一般來講，將用作基質(zhì)的適合的可生物降解性聚合物按要求構(gòu)型，以使其具有適合預(yù)期用途的機(jī)械性質(zhì)、保持充分的完整性直至組織已向內(nèi)生長(in-grown)和愈合、不引起炎癥或毒性反應(yīng)、在實(shí)現(xiàn)其目的后在體內(nèi)代謝，易于加工成所需要形成的終產(chǎn)品、證明有可接受的儲存期以及容易滅菌。
在本發(fā)明的一方面，用于形成基質(zhì)的生物相容性聚合物為水凝膠形式。通常，水凝膠是交聯(lián)聚合物質(zhì)，其可在水中吸收超出其重量20％的水，而同時保持特定的三維結(jié)構(gòu)。這種定義包括在水性環(huán)境中膨脹的干燥交聯(lián)聚合物以及水膨脹性材料。很多親水聚合物可交聯(lián)產(chǎn)生水凝膠，而無論該聚合物是否是生物來源的、半合成的或全合成的。水凝膠可由合成聚合材料生產(chǎn)。可將這些合成聚合物特制為具有一定范圍特性和可預(yù)測批批(lot-to-lot)均勻的聚合物，且代表一類通常不含免疫原性問題的可靠來源的物質(zhì)?；|(zhì)可以包括由自主裝配肽形成的水凝膠，如在美國專利Nos.5,670,483和5,955,343、美國專利申請No.2002/0160471、PCT申請No.WO02/062969中描述的那些。
使水凝膠能在藥物傳遞應(yīng)用中有價值的性質(zhì)包括平衡膨脹度、吸收動力學(xué)、溶質(zhì)滲透性以及其體內(nèi)的功能特性。對化合物包括GDF5-HR的滲透性部分取決于膨脹度或含水量以及生物降解速率。由于凝膠的機(jī)械強(qiáng)度根據(jù)膨脹度的直接比例衰減，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括可將水凝膠連接于底物上，以使該復(fù)合系統(tǒng)能增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度。在其它備選實(shí)施方案中，可將水凝膠浸漬在多孔底物中，使得水凝膠具有對GDF5-HR的有用的傳遞性質(zhì)的同時，獲得底物的機(jī)械強(qiáng)度。在一實(shí)施方案中，向黑質(zhì)密部或紋狀體內(nèi)直接薄壁組織內(nèi)注射GDF5-HR或包含GDF5-HR的神經(jīng)營養(yǎng)組合物或包含GDF5-HR的基質(zhì)，可有效促進(jìn)祖細(xì)胞或干細(xì)胞的殘留群(pool)的分化，使得將神經(jīng)祖細(xì)胞或干細(xì)胞的定位活動范圍分化為多巴胺能族系(lineage)。
另外，可將GDF5-HR神經(jīng)營養(yǎng)(neutrophic)組合物和/或包含GDF5-HR的基質(zhì)通過直接移植、通過微導(dǎo)管、內(nèi)導(dǎo)管插入術(shù)(intracatheterization)或者通過微型泵傳遞至所述部位上。還可將GDF5-HR組合物和/或基質(zhì)通過鞘內(nèi)傳遞或腦室內(nèi)或通過鼻內(nèi)給予而間接地傳遞至黑質(zhì)密部或紋狀體內(nèi)。所述溶媒賦形劑或載體可以是已知的藥學(xué)上可接受的能給予患者的任何物質(zhì)，尤其是能誘導(dǎo)細(xì)胞在局限的位點(diǎn)上分化。實(shí)例包括液體介質(zhì)，如Dulbeccos改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)、無菌鹽水、無菌磷酸緩沖鹽水、Leibovitz氏培養(yǎng)基(L15，Invitrogen，Carlsbad，CA)、葡萄糖的無菌水溶液和任何其它生理學(xué)上可接受的液體。一種傳遞至黑質(zhì)密部的優(yōu)選的方法是根據(jù)已知的技術(shù)，如F.Balis & D.Poplack，Am.J.Pediatric.Hematol.Oncol.11(l)74-86(1989)中所講授的技術(shù)，用奧馬耶貯器鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給予。一種傳遞至黑質(zhì)密部的更為優(yōu)選的方法是通過微導(dǎo)管直接薄壁組織內(nèi)注射。
在備選實(shí)施方案中，GDF5-HR可用于移植前預(yù)處理成熟干細(xì)胞或祖細(xì)胞，或者在移植前與其它細(xì)胞混合加入以在體內(nèi)誘導(dǎo)腦內(nèi)細(xì)胞群中這些轉(zhuǎn)錄物的上行調(diào)節(jié)，或者另外強(qiáng)制腦中神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的分化。因此，可利用這些條件在植入紋狀體或黑質(zhì)前預(yù)處理細(xì)胞群，包括神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞，或者其它的干細(xì)胞或祖細(xì)胞或者本文所述的其它細(xì)胞。例如，可將海馬神經(jīng)干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)/帶有GDF5-HR的支架上分化，然后直接將其分化形式移植到紋狀體或黑質(zhì)密部中。
提供下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面，但下列實(shí)施例并不限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1MP52-誘導(dǎo)成熟嚙齒動物海馬神經(jīng)祖細(xì)胞向多巴胺能表型分化 按先前公開的方法[Svendson等，Nat Rev Genet.，5(2)136-44(2004)]，從成熟大鼠大腦中分離成熟嚙齒動物海馬神經(jīng)祖細(xì)胞。將分離的細(xì)胞以1000個細(xì)胞/cm2接種于層粘連蛋白包被的24孔組織培養(yǎng)板中(Becton Dickson，Bedford，MA)。
使接種的細(xì)胞最初在一種補(bǔ)充的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(NBM)中生長。NBM是帶有B27補(bǔ)充物(Invitrogen，Carlsbad，CA)和L-谷氨酰胺(4毫摩爾)(Sigma，St.Lovis，MO)的Neurobasal-A培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)。補(bǔ)充的NBM也包含20納克/毫升的上皮生長因子(EGF)(Sigma，St.Louis，MO)和20納克/毫升的基本的成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)(Peprotech，Rocky Hill，NJ)。
將一份(Set one)細(xì)胞在補(bǔ)充的NBM中培養(yǎng)17日。將第二份(Settwo)細(xì)胞先在補(bǔ)充的NBM中培養(yǎng)4日。然后，從培養(yǎng)板中除去補(bǔ)充的NBM，將細(xì)胞在含有20納克/毫升的MP52(Biopharm GmbH，Heidelberg，Germany)的NMB中培養(yǎng)13日。將第三份(Set three)細(xì)胞先在補(bǔ)充的NBM中培養(yǎng)10日。然后，從培養(yǎng)板中除去補(bǔ)充的NBM，將細(xì)胞在含有200納克/毫升的Sonic Hedgehog(SHH)(Sigma，St.Louis，MO)和100納克/毫升的成纖維細(xì)胞生長因子8(FGF8)(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的NMB中培養(yǎng)。將第四份(Set four)細(xì)胞先在補(bǔ)充的NBM中培養(yǎng)10日。然后，從培養(yǎng)板中除去補(bǔ)充的NBM，將細(xì)胞在含有20納克/毫升的MP52、200納克/毫升的SHH和100納克/毫升的FGF8的NMB中培養(yǎng)。
在17-日實(shí)驗(yàn)期結(jié)束時，將所有的培養(yǎng)基用4％多聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)固定，然后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色以評估β微管蛋白III(TuJl)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維(fibrilary)酸性蛋白(GFAP)和酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)。
簡言之，將固定的培養(yǎng)基用磷酸緩沖鹽水(PBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)洗滌，然后暴露于蛋白封閉溶液中30分鐘。該蛋白封閉溶液為帶有4％山羊血清(Chemicon，Temecula，CA)和0.3％Triton(Triton X-100，Sigma)的PBS。然后在室溫下，將初級抗體溶液應(yīng)用于含有封閉溶液加上1∶500稀釋的TuJl抗體(Sigma，St.Louis，MO)、1∶1000稀釋GFAP抗體(Chemicon，Temecula，CA)以及1∶2000稀釋的TH(Chemicon，Temecula，CA)的樣本中1小時。
除去該初級抗體溶液，將樣本用PBS洗滌。然后在室溫下，應(yīng)用次級抗體溶液1小時。該次級抗體溶液為帶有1∶250稀釋的山羊抗-小鼠IgG-德克薩斯紅(Chemicon，Temecula，CA)和1∶250稀釋的山羊抗-家兔IgG-Alexa 488(Chemicon，Temecula，CA)的蛋白封閉溶液。然后將樣本洗滌，與10微摩爾的4’-6-二脒基-2-苯基吲哚-2HCl(DAPI)(Molecular Probes，Eugene，OR)一起孵育10分鐘以使細(xì)胞核顯影。
免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，使用Olympus倒置偏熒光(epifluorescent)顯微鏡觀察熒光，然后用數(shù)字照相機(jī)和ImagePro軟件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)獲取影像。為進(jìn)一步對反應(yīng)定量，在200x放大倍率下，對細(xì)胞視野計(jì)數(shù)以檢查對各標(biāo)記物的陽性細(xì)胞的百分率，然后與在單獨(dú)NBM下生長的對照樣本進(jìn)行比較。對每個條件下最少1000個細(xì)胞計(jì)數(shù)(或者如果更少)，在該條件下觀察細(xì)胞總數(shù)。
對所給定的標(biāo)記物呈陽性的細(xì)胞的百分率通過用對特定標(biāo)記物呈陽性的細(xì)胞的數(shù)量除以DAPI染色確定的有核細(xì)胞總數(shù)來測定。表1顯示對TuJl、TH和GFAP染色呈陽性的細(xì)胞的比例。
表1對給定標(biāo)記物染色呈陽性的細(xì)胞的百分率 該表顯示用NBM加上FGF8和單獨(dú)用SHH，9％這些神經(jīng)祖細(xì)胞分化為多巴胺能表型(通過TH陽性染色證實(shí))。當(dāng)將MP52與FGF8和SHH混合時，多巴胺能性分化明顯增強(qiáng)(26％TH陽性)。此外，MP52還誘導(dǎo)這些神經(jīng)祖細(xì)胞分化為星形細(xì)胞，其可通過免疫細(xì)胞化學(xué)證明的中間絲蛋白GFAP的表達(dá)增加所證實(shí)。雖然無論是否加入MP52與SHH和FGF8混合時，神經(jīng)元(TuJl陽性細(xì)胞)總數(shù)并不明顯變化，但發(fā)育成熟為多巴胺能TH陽性表型的這些細(xì)胞的百分率在MP52存在下確實(shí)明顯增加。
實(shí)施例2MP52-誘導(dǎo)產(chǎn)后細(xì)胞中Nurrl表達(dá) 根據(jù)美國專利申請序列號10/887,012和10/877,446中所述，從臍帶和胎盤消化液中分離產(chǎn)后細(xì)胞。簡單地講，從產(chǎn)后組織移出物中分離人臍帶和胎盤細(xì)胞。
從分娩或正常手術(shù)分娩時的孕婦中獲得所述各組織。在無菌狀態(tài)下，在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行下列細(xì)胞分離方案。
在抗霉菌劑和抗生素(AA)(每100毫升1毫升(每毫升10,000單位))(PBS-AA)存在下，將產(chǎn)后組織用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌。洗滌步驟包括在溫和攪拌下用PBS-AA沖洗組織。將該過程進(jìn)行數(shù)次以除去血和碎屑。然后在150cm組織培養(yǎng)板中，在50毫升DMEM-低葡萄糖(DMEM:Lg)或DMEM-高葡萄糖(DMEM:Hg)培養(yǎng)基存在下，將洗滌的組織機(jī)械性離解。
將組織剁成小碎片后，立即將其轉(zhuǎn)移至50-毫升圓錐形管中，每管裝約5gm組織。然后在40毫升含有AA的DMEM:Lg或DMEM:Hg中將組織消化，所述AA含有溶于DMEM中的10毫升膠原酶∶分散酶(C∶D)或者含有溶于DMEM中的膠原酶∶分散酶∶透明質(zhì)酸酶(C∶D∶H)。C∶D是帶有稀釋于50毫升DMEM中的500毫克分散酶(0.4單位/毫克)的750毫克II型膠原酶(每毫克＞125單位(每毫克0.5-3FALGA單位))。因此，C∶D∶H是帶有稀釋于50毫升DMEM中的500毫克分散酶(0.4單位/毫克)和200毫克(300單位/mg)的750毫克II型膠原酶(每毫克＞125單位(每毫克0.5-3FALGA單位))?；蛘撸诒痉桨钢?，還可利用IV型膠原酶(750毫克，每毫克＞125單位(每毫克0.5-3FALGA單位))。在37℃下，在定軌振蕩器(溫和震蕩)內(nèi)，將裝有組織、培養(yǎng)基和消化酶的圓錐形管溫育至少24小時。
消化后，將組織通過40微米尼龍細(xì)胞過濾器過濾。然后將過濾的細(xì)胞混懸液在1000×g下離心10分鐘。將上清液抽氣，然后再將細(xì)胞沉淀混懸于50毫升新鮮培養(yǎng)基中。將該過程完成2次，以從細(xì)胞群中除去殘留的酶活性。然后移去上清液，將細(xì)胞沉淀再懸浮于2毫升擴(kuò)充培養(yǎng)基(DMEM:Lg或DMEM:Hg；15％FBS(Hyclone確定的牛血清Lot#AND 18475)；2-巰基乙醇(1微升/100毫升)；每一抗霉菌素的抗生素(1毫升/100毫升(10,000單位/毫升))中。通過錐蟲藍(lán)排除的手工計(jì)數(shù)法，確定每批分離細(xì)胞的細(xì)胞生存力。
將分離的臍帶和胎盤細(xì)胞以1000細(xì)胞/cm2接種于層粘連蛋白包被的24孔組織培養(yǎng)板(Corning，NY)中。按文獻(xiàn)nonprov系列號中所述，先將細(xì)胞接種于維持培養(yǎng)基(空白對照)中。在維持培養(yǎng)基中4日后，將細(xì)胞分為4份。將第一份細(xì)胞轉(zhuǎn)換為補(bǔ)充EGF(20納克/毫升)和bFGF(20納克/毫升)的NBM中，使其生長13日。將第2-4份細(xì)胞轉(zhuǎn)換為補(bǔ)充EGF(20納克/毫升)和bFGF(20納克/毫升)的NBM中，使其生長6日。然后，除去補(bǔ)充有EGF和FGF8的NBM，使細(xì)胞在含下列成分的各NBM再培養(yǎng)7日MP52+SHH+FGF8(第二份)；MP52+SHH+FGF8+視黃酸(RA)(第三份)；或者M(jìn)P52+RA(第四份)。
在17-日實(shí)驗(yàn)期結(jié)束時，使用Rneasy試劑盒(RNeasy Mini kit，Qiagen，Valencia，CA)，從所誘導(dǎo)的細(xì)胞群中分離RNA。根據(jù)制造商說明書(RNeasy Mini kit，Qiagen，Valencia，CA)，用含有β-巰基乙醇(Sigma St.Louis，MO)的350微升的緩沖RLT溶解細(xì)胞，然后在-80℃下儲存。將細(xì)胞溶胞產(chǎn)物溶化，根據(jù)制造商說明書，用2.7U/樣本DNase處理(Sigma St.Louis，MO)來提取RNA。將RNA用50微升的DEPC-處理的水(0.1％焦碳酸二乙酯，Sigma，St.Louis，MO)稀釋，在-80℃下儲存。使用帶有TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑的無規(guī)六聚體(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)，將RNA在25℃下逆轉(zhuǎn)錄10分鐘，37℃下60分鐘以及95℃下10分鐘。將樣本在-20℃下儲存。
采用Assays-on-DemandTM基因表達(dá)產(chǎn)品Nurr I(Hs00428691)、酪氨酸羥化酶(Hs00428691)和GAPDH(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA)，用TaqMan Universal PCR標(biāo)準(zhǔn)混合器，根據(jù)制造商說明書，利用帶有ABI prism 7000SDS軟件的7000序列檢測系統(tǒng)，對cDNA樣本進(jìn)行定量PCR(Q-PCR)測定。熱循環(huán)條件最初為50℃2分鐘和95℃10分鐘，接著是95℃15秒和60℃1分鐘的40個循環(huán)。
表2中顯示產(chǎn)后細(xì)胞分化后Nurrl和酪氨酸羥化酶(TH)mRNA的表達(dá)。該表顯示MP52誘導(dǎo)產(chǎn)后細(xì)胞中Nurrl和TH表達(dá)。當(dāng)與對照組(NBM+EGF+FGF8)比較時，在與SHH+FGF8+MP52或者SHH+FGF8+MP52+視黃酸一起培養(yǎng)后，在產(chǎn)后細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)Nurrl表達(dá)。與對照組相比，當(dāng)將產(chǎn)后細(xì)胞與MP52并僅與視黃酸混合一起培養(yǎng)時，Nurrl誘導(dǎo)進(jìn)一步增加。與對照組(神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基+B27補(bǔ)充物+EGF/FGF)比較，在與SHH+FGF8+MP52、SHH+FGF8+MP52+視黃酸或者M(jìn)P52+視黃酸培養(yǎng)后，在臍帶細(xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)酪氨酸羥化酶(TH)表達(dá)。
表2多巴胺能分化后產(chǎn)后細(xì)胞中Nurrl和酪氨酸羥化酶的表達(dá) 注釋SHH＝Sonic Hedgehog，F(xiàn)GF8＝成纖維細(xì)胞生長因子8，RA＝視黃酸 實(shí)施例3MP52-誘導(dǎo)成熟嚙齒動物海馬神經(jīng)祖細(xì)胞分化為少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞 通過復(fù)乳化(double-emulsion)技術(shù)制備包含MP52的微球核。簡單地講，將固有粘度為0.4dl/gm的50mg聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)的90∶10共聚物(以商品名MEDISORB出售，Alkermes，Inc.，Wilmington，OH)溶解于1.5ml二氯甲烷和0.5ml丙酮中。將25微克MP52溶解于含有0.1％(wt./vol.)人血清白蛋白(HSA)(Sigma，St，Louis，MO)的0.15ml的16mM檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中。在混合入微球體之前，將MP52用賦形劑重新配制以穩(wěn)定蛋白質(zhì)。采用Branson超聲儀450(Branson Ultrasonics，Danbury，CT)，通過脈沖將聚合物/MP52水溶液連續(xù)超聲10秒，得到一種單一乳劑(single emulsion)。將該單一乳劑加入到30ml含有5％(wt./vol.)聚乙烯醇(MW 31,000-50,000，87-89％水解化；Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)和5％(wt./wt.)NaCl的水溶液中。將得到的溶液經(jīng)磁力攪拌1分鐘，產(chǎn)生一種復(fù)乳劑(double emulsion)。
將該復(fù)乳劑(水/油/水)加入到包含10％(wt./wt.)NaCl的去離子水(400毫升)中，經(jīng)磁力攪拌25分鐘。然后將微球核通過40-微米尼龍細(xì)胞過濾器(Becton Dickinson，NJ)過濾，用去離子水(400ml)洗滌。然后將各核心在-80℃下冷凍2小時。隨后采用Virtis Freezemobile(VirtisCompany，Gardinier，NYC)，通過冷凍干燥過程，將微球冷凍干燥。在-40℃的環(huán)境溫度下，將微球體保持冷凍干燥，在4℃下的無菌微量小管中儲存以備進(jìn)一步使用。
將冷凍干燥的微球體在神經(jīng)基礎(chǔ)-A培養(yǎng)基中洗滌數(shù)次以除去碎屑。將洗滌過的微球體用層粘連蛋白(Sigma，St.Louis，MO)以20微克/毫升的量包被。在無菌eppendorf(Ambion，Austin，TX)中，將20-50個層粘連蛋白包被的微球體與500,000個成熟嚙齒動物神經(jīng)祖細(xì)胞(按實(shí)施例1中所述方法制備)在1毫升神經(jīng)基礎(chǔ)-A培養(yǎng)基中混合10-30分鐘。將該核心/細(xì)胞混懸液接種于24孔超低群(ultra low cluster)組織培養(yǎng)板(Corning Inc.，Corning，NY)內(nèi)的2孔中(500微升/孔)。再向各孔中補(bǔ)充100微升新鮮培養(yǎng)基維持另外5日。
實(shí)驗(yàn)期結(jié)束時，將附在微球上的細(xì)胞用4％多聚甲醛固定，然后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)以評估GFAP(GFAP，1∶1000，DakoCytomation，Carpinteria，CA)和髓磷脂堿性蛋白(MBP，1∶500，Chemicon，Temecula，CA)的表達(dá)。
為適當(dāng)制備供染色的樣本，將固定的、細(xì)胞包被的微球體在15ml圓錐形軟管中以100x g離心3分鐘。然后將沉淀再懸浮于少量無菌PBS中。用微量吸管將混合物置于稱重舟形碟(weigh boat dish)的中心。將埋入化合物的OCT(Tissue-Tek OCT Compound，Sakura，Torrance，CA)加入到所述少量沉淀周圍直至填充滿稱重舟。然后將稱重舟置于乙醇和干冰冷凍浴頂端，以快速降低OCT的溫度，從而在一種硬塊(hard block)上包埋該細(xì)胞包被的微球。
然后用標(biāo)準(zhǔn)恒冷切片機(jī)(Leica)切成10-微米切片，然后置于載玻片上染色。用疏水性筆在切片周圍劃出一疏水表面以供染色，按以上實(shí)施例1中所述進(jìn)行免疫染色，這一次采用以上提及的各濃度下直接對抗GFAP和MBP(1∶500，髓磷脂堿性蛋白，Chemicon，Temecula，CA)的抗體。
免疫組織化學(xué)證明接種于裝載MP52的微球體上的成熟嚙齒動物海馬神經(jīng)原的分化。裝載MP52的微球體誘導(dǎo)明顯數(shù)量的成熟嚙齒動物神經(jīng)祖細(xì)胞分化為GFAP陽性的星形細(xì)胞和髓磷脂堿性蛋白陽性的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這種作用在未裝載MP52的對照粒子中未觀察到。
在此，我們提供通過應(yīng)用MP52將內(nèi)源性或外源性(移植的)干細(xì)胞或者原粒子(progenitor)-樣細(xì)胞或者其它可應(yīng)用的細(xì)胞分化為多巴胺能表型，從而利用MP52作為在人中治療帕金森氏病的藥物的證據(jù)?？捎眠@種方法緩解成人中由于喪失多巴胺能神經(jīng)元從黑質(zhì)密部突出至紋狀體所引起的這類疾病。在尤其涉及海馬神經(jīng)原的該應(yīng)用中，強(qiáng)烈的MP52分化能力為產(chǎn)生大量治療帕金森氏病的多巴胺能細(xì)胞提供了一種治療途徑。
權(quán)利要求
1.一種治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的方法，該方法包括給予所述人的所述紋狀體或所述黑質(zhì)密部有效誘導(dǎo)細(xì)胞群的量的GDF5-HR，所述細(xì)胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便實(shí)際上使所述細(xì)胞向多巴胺能表型分化。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述GDF5-HR以單一劑量給予。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述GDF5-HR以緩釋劑量給予。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述GDF5-HR作為包含生理學(xué)上可接受的載體的神經(jīng)營養(yǎng)組合物給予。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述載體選自臨床級無菌水、無菌鹽水、無菌磷酸緩沖鹽水、無菌葡萄糖水溶液、無菌液體介質(zhì)和生理學(xué)上可接受的等滲液體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述GDF5-HR在一種基質(zhì)中被給予。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述基質(zhì)的形式選自顆粒、支架、立方體、圓筒、軟管、嵌入塊、薄膜、水凝膠或薄片。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述GDF5-HR通過微導(dǎo)管、內(nèi)導(dǎo)管插入術(shù)、鞘內(nèi)傳遞而顱內(nèi)給予，或者通過微型泵腦室內(nèi)給予，或者鞘內(nèi)或鼻內(nèi)給予。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞群包括選自干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞，其為成熟神經(jīng)原、海馬祖細(xì)胞、海馬干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、源于胚胎干細(xì)胞的祖細(xì)胞、產(chǎn)后衍生的細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、臍帶祖細(xì)胞、胎盤干細(xì)胞、胎盤祖細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、胰干細(xì)胞、緣干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞、肌肉祖細(xì)胞、胰祖細(xì)胞、緣祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和肝祖細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述GDF5-HR選自MP52、BMP-14和CDMP-1。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述GDF5-HR包含MP52。
12.權(quán)利要求4的方法，其中所述GDF5-HR包含MP52。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)組合物包含約0.5-1,000納克的所述MP52。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)組合物還包含SonicHedgehog和FGF8。
15.一種適用于治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的神經(jīng)營養(yǎng)組合物，它包含
有效誘導(dǎo)細(xì)胞群的量的GDF5-HR，所述細(xì)胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便實(shí)際上使所述細(xì)胞向多巴胺能表型分化，
Sonic Hedgehog；
FGF8；以及
生理學(xué)上可接受的載體。
16.權(quán)利要求15的神經(jīng)營養(yǎng)組合物，其中所述GDF5-HR選自MP52、BMP-14和CDMP-1。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述GDF5-HR包含MP52。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)組合物包含約0.5-1,000納克的所述MP52。
19.權(quán)利要求17的組合物，它還包含Sonic Hedge Hog和FGF8。
20.權(quán)利要求15的組合物，它還包含Sonic Hedge Hog和FGF8。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過給予人紋狀體或黑質(zhì)密部有效誘導(dǎo)細(xì)胞群的量的人重組GDF5，來治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的方法，所述細(xì)胞群具有向多巴胺能表型分化的能力以便實(shí)際上使所述細(xì)胞向多巴胺能表型分化，本發(fā)明還涉及神經(jīng)營養(yǎng)組合物和適于這類治療用途的基質(zhì)。
文檔編號A61K38/18GK101065142SQ200580040119
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月28日
發(fā)明者S·米斯特里, D·J·梅西納 申請人:伊西康公司