專利名稱：紋狀體或黑質(zhì)密部中的神經(jīng)缺陷的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過給予骨成形蛋白-7(BMP7)來治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的方法，并涉及用于這類治療方法的包含人重組BMP7的組合物和基質(zhì)。
背景技術(shù)：
目前尚無修復(fù)由神經(jīng)病變引起的損傷的滿意方法，這些損傷可能導(dǎo)致帕金森氏病(帕金森綜合征)或中風(fēng)。帕金森氏病是由諸如震顫、僵直、遲鈍-和運(yùn)動(dòng)功能減退的神經(jīng)缺陷和平衡和姿勢(shì)中其它缺陷組成的綜合征。帕金森氏病通常與神經(jīng)系統(tǒng)的老化有關(guān)。類似地，中風(fēng)可影響運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)，使得患者具有輕偏癱或麻痹的癥狀。
黑質(zhì)是帕金森氏病的主要位置。黑質(zhì)的色素神經(jīng)元很大程度上且廣泛地表達(dá)到尾狀殼核-核(紋狀體)上，并且特異性合成和釋放多巴胺。當(dāng)75-80％多巴胺能神經(jīng)分布被破壞時(shí)，帕金森綜合征的癥狀出現(xiàn)。帕金森氏病患者對(duì)多巴胺置換性療法應(yīng)答。不幸的是，多巴胺置換性療法的功效隨黑質(zhì)紋狀體的多巴胺途徑的衰退而持續(xù)降低。
干細(xì)胞的鑒定刺激針對(duì)特定細(xì)胞類型選擇產(chǎn)生更新藥物的研究。雖然已研制出草案將干細(xì)胞直接劃分為治療相關(guān)的細(xì)胞類型，例如治療帕金森氏病的多巴胺能(DA)神經(jīng)元、治療ALS的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及治療MS的少突質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，但是這些源于干細(xì)胞的細(xì)胞類型的實(shí)際數(shù)量的有效增殖尚未報(bào)道。增殖無限數(shù)量的表達(dá)完整中腦DA神經(jīng)元標(biāo)記物的DA神經(jīng)元的能力是為帕金森氏病提供治愈的重要部分。因此，可用于刺激干細(xì)胞分化為DA譜系的藥物為影響大腦中動(dòng)脈(MCA)及其分支的帕金森氏病以及中風(fēng)提供了一種管理和區(qū)分外源性和內(nèi)源性干細(xì)胞的可能性。
在其它情況下，抵抗大腦和/或脊髓的急性或神經(jīng)變性性損傷的作用的嘗試都主要涉及植入胎神經(jīng)元，以補(bǔ)償損失或不足的神經(jīng)功能。但是，人胎兒細(xì)胞移植研究受到嚴(yán)格限制。也已建議給予諸如神經(jīng)生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)神經(jīng)的生長(zhǎng)。參見，例如Lundborg，Acta Orthop.Scand.58145-169(1987)；美國(guó)專利No.5,093,317。給予CNS神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子需要繞過血-腦屏障。該屏障可通過直接輸注、或者通過修飾分子增加其進(jìn)入該屏障的輸送、通過化學(xué)修飾或軛合會(huì)或者通過分子截?cái)鄟砜朔GF-β超家族的許多生長(zhǎng)因子[Kingsley，Genes &Development 8 133-146(1994)以及其中摘引的文獻(xiàn)]都與很多尤其涉及傷口愈合和組織再生的內(nèi)科療法和應(yīng)用有關(guān)。某些這類多功能蛋白除具有諸如在多種細(xì)胞類型中調(diào)節(jié)增殖和分化作用外，還對(duì)神經(jīng)元具有促進(jìn)生存作用[Roberts and Sporn，Handbook of ExperimentalPharmacology 95 419-472，eds.Sporn and Roberts(1990)；Sakurai等，J.Biol.Chem.，269 14118-14122(1994)]。因此，例如證實(shí)TGF-β體外對(duì)胚胎運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)作用[Martinou等，Devl.Brain Res.，52 175-181(1990)；Chalazonitis等，Dev.Biol.，152 121-132(1992)]。另外，蛋白TGF-β-1、-2、-3、激活素A和GDNF(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系-衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)對(duì)中腦的多巴胺能神經(jīng)元呈現(xiàn)促進(jìn)生存的作用，但是這些作用并不通過星細(xì)胞介導(dǎo)，GDNF為一種與TGF-β超家族成員具有結(jié)構(gòu)類似性的蛋白[Krieglstein等，EMBO J.，14，736-742(1995)]。各種組織和發(fā)育階段中TGF-β超家族的蛋白的出現(xiàn)與其準(zhǔn)確功能以及靶位、生存期、輔助因子的需要量、必需的細(xì)胞生理環(huán)境和/或?qū)λネ说目剐陨系牟顒e相對(duì)映應(yīng)。
骨成形蛋白(BMPs)是歸屬于TGF-β超家族的分泌性信號(hào)分子(Kingsley，1994)。已知BMP′s在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、組織和器官中發(fā)揮重要作用，迄今為止已鑒定出30種以上的BMPs。BMP6和BMP7都是BMPs的60A家族的成員，體內(nèi)和體外研究已表明在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用。特定的作用包括指定早期發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)圖式結(jié)構(gòu)形成和神經(jīng)特性的分配(Nguyen等，2000，Schneider等，1999)。其它作用包括增強(qiáng)神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的細(xì)胞向外生長(zhǎng)和合成。另外，已確定BMPs的作用在各實(shí)施例的該超家族中不同，這樣BMP4而不是BMP7能刺激嗅神經(jīng)上皮培養(yǎng)物中的神經(jīng)發(fā)生(Shou等，2000)。因此，由于在發(fā)育中明顯不同的作用，可有趣地假定在特定的神經(jīng)通路(如多巴胺能邊緣系統(tǒng))的發(fā)育中BMPs可具有獨(dú)特的作用。
因此，目前需要一種治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的方法。本發(fā)明尋求以能治療或預(yù)防這樣產(chǎn)生的缺陷的方式來利用骨成形蛋白-7(BMP7)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的方法，該方法包括給予人紋狀體或黑質(zhì)密部有效誘導(dǎo)細(xì)胞群的量的骨成形蛋白-7(BMP7)，所述細(xì)胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便實(shí)際上使所述細(xì)胞向多巴胺能表型分化，本發(fā)明還涉及包含適用于治療此類缺陷的骨成形蛋白-7(BMP7)的組合物和基質(zhì)。
發(fā)明詳述已證實(shí)神經(jīng)發(fā)生存在于成人海馬、室下區(qū)(subventricular)、黑質(zhì)和嗅球中。因此，在治療由可歸因于帕金森氏病的人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷中，可將這些細(xì)胞補(bǔ)充和/或分化至DA特定神經(jīng)元的藥物提供必要的細(xì)胞替代。在本發(fā)明的治療方法和組合物中，將BMP7用作一種預(yù)分化劑或分化劑以分化無論是內(nèi)源性或外源性的干細(xì)胞或祖細(xì)胞群。本發(fā)明基于，至少部分基于這種發(fā)現(xiàn)，即BMP7是一種神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子，其能選擇性誘導(dǎo)成人神經(jīng)海馬祖細(xì)胞分化為多巴胺能表型。本文所述的資料表明BMP7是神經(jīng)干細(xì)胞分化的有效誘導(dǎo)物。因此，這些結(jié)果表明BMP7在提供神經(jīng)再生功能中的用途。
由于已發(fā)現(xiàn)BMP7是神經(jīng)干細(xì)胞分化的有效誘導(dǎo)物，所以已確定其可用于治療人紋狀體或黑質(zhì)密部中的神經(jīng)缺陷，所述缺陷歸因于神經(jīng)變性疾病，尤其是帕金森氏病，或者由影響中腦動(dòng)脈(MCA)及其分支的中風(fēng)引起的損傷。雖然我們已發(fā)現(xiàn)BMP7單獨(dú)即可刺激海馬中的成熟神經(jīng)原(adult neural progenitors)分化為多巴胺能表型，但是可將其與激動(dòng)劑聯(lián)合以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞或其它具有向多巴胺能表型分化能力的細(xì)胞中的多巴胺能分化提高。例如，可將BMP7與SonicHedgehog(SHH)或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF8)聯(lián)合使用，以便為誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞和本文所述的其它細(xì)胞成為表型為多巴胺能的細(xì)胞提供明顯增強(qiáng)的方法。SHH是Wnt信號(hào)途徑中的一個(gè)完整部分；該發(fā)育途徑中的其它因子與BMP7聯(lián)合應(yīng)用中對(duì)神經(jīng)的形成可能是重要的。
BMP7可用于分化除成熟神經(jīng)祖細(xì)胞外的干細(xì)胞形式，如海馬祖細(xì)胞或海馬干細(xì)胞，或者其它具有向多巴胺能表型分化的能力的細(xì)胞。這些其它形式的細(xì)胞包括，但不限于間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESCs)、源于胚胎干細(xì)胞的祖細(xì)胞、產(chǎn)后衍生的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、源于臍帶或胎盤組織的細(xì)胞、源于肌肉的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、源于胰的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、源于緣(limbal)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、源于視網(wǎng)膜的干細(xì)胞或祖細(xì)胞以及源于肝的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
BMP7可單獨(dú)用作神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，以在治療人紋狀體或黑質(zhì)密部?jī)?nèi)的神經(jīng)缺陷中誘導(dǎo)細(xì)胞群分化。此處所用術(shù)語(yǔ)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性被定義為包括恢復(fù)、再生和分化細(xì)胞的潛在性。還可將所述蛋白質(zhì)與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物混合或者與用作傳遞或支持系統(tǒng)的適合基質(zhì)聯(lián)合使用。所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物包括有效量的BMP7。有效量指誘導(dǎo)細(xì)胞群的有效量，所述細(xì)胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便實(shí)際上使所述細(xì)胞向多巴胺能表型分化。本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物可包含約0.5-約1,000納克的BMP7，或約0.5-約200納克的BMP7。
神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物可通過將BMP7固定、混合、溶解或混懸于藥學(xué)上可接受的載體或水性溶劑中而獲得。例如，載體或水性溶劑的適合的實(shí)例包括，但不限于臨床級(jí)別的無菌水、無菌鹽水、無菌磷酸緩沖鹽水、葡萄糖的鹽水溶液、無菌液體介質(zhì)或其它生理學(xué)上可接受的等滲液體。另外，本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物可包含多種藥學(xué)上可接受的、可與載體或水性溶劑混合的添加劑，如穩(wěn)定劑、防腐劑、增厚劑、助溶劑等。
還可將BMP7與適合的用作傳遞或支持系統(tǒng)的基質(zhì)結(jié)合使用。BMP7的成功基質(zhì)期望能執(zhí)行幾種重要的功能。期望其與BMP7結(jié)合，并能用作緩慢或持續(xù)釋放的傳遞系統(tǒng)，并調(diào)節(jié)分化過程中細(xì)胞響應(yīng)的各個(gè)步驟?；|(zhì)阻止BMP7從傳遞部位分散出去，因此將BMP7的作用集中在所傳遞的細(xì)胞上。另外，所選擇的基質(zhì)材料應(yīng)該是體內(nèi)可生物降解的、多孔的并且優(yōu)選是可生物降解的。此處所用的術(shù)語(yǔ)生物可降解的被定義為包括能在體內(nèi)生理?xiàng)l件下降解或損壞掉(化學(xué)或物理性)，從而所降解的產(chǎn)物可被體內(nèi)排泄或吸收的物質(zhì)。生物降解率可根據(jù)植入紋狀體或黑質(zhì)密部?jī)?nèi)后所要求的釋放速率而變化。基質(zhì)還可按要求用作暫時(shí)性支架(scaffold)，直至被新生長(zhǎng)的神經(jīng)組織代替。因此，在一實(shí)施方案中，基質(zhì)為需要此種因子的患者提供持續(xù)釋放的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子成分，并可在患者中提供供組織生長(zhǎng)發(fā)育的結(jié)構(gòu)?；|(zhì)可以是微粒形式(直徑超過10微米的大粒或直徑小于10的微粒)，或者可以是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、三維植入片形式(例如，支架)。移植片可以是立方體(cube)、圓筒、軟管(tube)、嵌入塊(block)、薄膜、薄片或適合的構(gòu)造形式。
影響體內(nèi)生物降解聚合物的機(jī)械性能的因素對(duì)于聚合物科學(xué)家來講是熟知的，包括單體的選擇、啟發(fā)過程條件和添加劑的存在。生物降解已能通過合成聚合物實(shí)現(xiàn)，該聚合物在骨架中具有不穩(wěn)定的鍵，或者具有在體內(nèi)能被安全地氧化或水解的鍵。具有該特性的最常用化學(xué)官能團(tuán)是醚、酯、酐、原酸酯和酰胺。因此，在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，BMP7被控制性地從可生物降解的聚合物基質(zhì)中釋放至在可生物降解聚合物中需要通過水解化學(xué)鍵的部位上?？缮锝到庑跃酆衔锘|(zhì)優(yōu)選為粉末、微粒、微球、條狀物、凝膠(如原位可聚合的凝膠)、網(wǎng)狀物或海綿的形式。
生物相容性基質(zhì)可以包括天然的、改良的天然或合成的可生物降解聚合物，包括同聚物、共聚物和嵌段聚合物，以及它們的組合物。值得注意的是一般根據(jù)合成的單體來命名聚合物。
適合的可生物降解的聚合物或聚合物類別的實(shí)例包括纖維素、膠原、彈性蛋白、明膠、玻連蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、再生基膜基質(zhì)、淀粉、葡聚糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸酶(hyaluron)、殼多糖、殼聚糖、瓊脂糖、多糖、透明質(zhì)酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乙二醇、去細(xì)胞組織(decellularized tissue)、自主裝配肽(self-assemblingpeptides)、多肽、糖胺聚糖、它們的衍生物及其混合物。對(duì)于羥乙酸和乳酸，一般在聚合前，將中間體環(huán)狀二聚體制備和純化。分別將這些中間二聚體稱為乙交酯和交酯。其它有用的可生物降解聚合物或聚合物類別包括，但不限于聚二氧六環(huán)酮、聚碳酸酯、聚草酸酯、聚(α-酯)、聚酐、聚乙酸酯、聚己內(nèi)酯(polycaprolactones)、聚(原酸酯)、聚氨基酸、聚酰胺及其混合物和共聚物。其它有用的可生物降解的聚合物包括，但不限于L-和D-乳酸的立體聚合物、雙(對(duì)-羧基苯氧基)丙酸和癸二酸的共聚物、癸二酸共聚物、己內(nèi)酯的共聚物、聚(乳酸)/聚(羥乙酸)/聚乙二醇共聚物、聚氨酯和聚(乳酸)的共聚物、聚氨基甲酸酯和聚(乳酸)的共聚物、α-氨基酸的共聚物、α-氨基酸和己酸的共聚物、α-芐基谷氨酸酯和聚乙二醇的共聚物、琥珀酸酯和聚(乙二醇)的共聚物、聚磷腈(polyphosphazene)、聚羥基鏈烷酸酯及其混合物。二元和三元系統(tǒng)也包括在內(nèi)。
一般來講，將用作基質(zhì)的適合的可生物降解性聚合物按要求構(gòu)型，以使其具有適合預(yù)期用途的機(jī)械性質(zhì)、保持充分的完整性直至組織已向內(nèi)生長(zhǎng)(in-grown)和愈合、不引起炎癥或毒性反應(yīng)、在實(shí)現(xiàn)其目的后在體內(nèi)代謝，易于加工成所需要形成的終產(chǎn)品、證明有可接受的儲(chǔ)存期以及容易滅菌。
在本發(fā)明的一方面，用于形成基質(zhì)的生物相容性聚合物為水凝膠形式。通常，水凝膠是交聯(lián)聚合物質(zhì)，其可在水中吸收超出其重量20％的水，而同時(shí)保持特定的三維結(jié)構(gòu)。這種定義包括在水性環(huán)境中膨脹的干燥交聯(lián)聚合物以及水膨脹性材料。很多親水聚合物可交聯(lián)產(chǎn)生水凝膠，而無論該聚合物是否是生物來源的、半合成的或全合成的。水凝膠可由合成聚合材料生產(chǎn)?？蓪⑦@些合成聚合物特制為具有一定范圍特性和可預(yù)測(cè)批批(lot-to-lot)均勻的聚合物，且代表一類通常不含免疫原性問題的可靠來源的物質(zhì)。基質(zhì)可以包括由自主裝配肽形成的水凝膠，如在美國(guó)專利Nos.5,670,483和5,955,343、美國(guó)專利申請(qǐng)No.2002/0160471、PCT申請(qǐng)No.WO02/062969中描述的那些。
使水凝膠能在藥物傳遞應(yīng)用中有價(jià)值的性質(zhì)包括平衡膨脹度、吸收動(dòng)力學(xué)、溶質(zhì)滲透性以及其體內(nèi)的功能特性。對(duì)化合物的滲透性(BMP7)部分取決于膨脹度或含水量以及生物降解速率。由于凝膠的機(jī)械強(qiáng)度根據(jù)膨脹度的直接比例衰減，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括可將水凝膠連接于底物上，以使該復(fù)合系統(tǒng)能增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度。在其它備選實(shí)施方案中，可將水凝膠浸漬在多孔底物中，使得水凝膠具有對(duì)BMP7的有用的傳遞性質(zhì)的同時(shí)，獲得底物的機(jī)械強(qiáng)度。在一實(shí)施方案中，向黑質(zhì)密部或紋狀體內(nèi)直接薄壁組織內(nèi)注射BMP7或包含BMP7的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物或包含BMP7的基質(zhì)，可有效促進(jìn)祖細(xì)胞或干細(xì)胞的殘留群(pool)的分化，使得將神經(jīng)祖細(xì)胞或干細(xì)胞的定位活動(dòng)范圍分化為多巴胺能族系(lineage)。
另外，可將BMP7神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)(neutrophic)組合物和/或包含BMP7的基質(zhì)通過直接移植、通過微導(dǎo)管、內(nèi)導(dǎo)管插入術(shù)(intracatheterization)或者通過微型泵傳遞至所述部位上。還可將BMP7組合物和/或基質(zhì)通過鞘內(nèi)傳遞或腦室內(nèi)或通過鼻內(nèi)給予而間接地傳遞至黑質(zhì)密部或紋狀體內(nèi)。所述溶媒賦形劑或載體可以是已知的藥學(xué)上可接受的能給予患者的任何物質(zhì)，尤其是能誘導(dǎo)細(xì)胞在局限的位點(diǎn)上分化。實(shí)例包括液體介質(zhì)，如Dulbeccos改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)、無菌鹽水、無菌磷酸緩沖鹽水、Leibovitz氏培養(yǎng)基(L15，Invitrogen，Carlsbad，CA)、葡萄糖的無菌水溶液和任何其它生理學(xué)上可接受的液體。一種傳遞至黑質(zhì)密部的優(yōu)選的方法是根據(jù)已知的技術(shù)，如F.Balis & D.Poplack，Am.J.Pediatric.Hematol.Oncol.11(l)74-86(1989)中所講授的技術(shù)，用奧馬耶貯器鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給予。一種傳遞至黑質(zhì)密部的更為優(yōu)選的方法是通過微導(dǎo)管直接薄壁組織內(nèi)注射。
在另一實(shí)施方案中，BMP7可用于移植前預(yù)處理成熟干細(xì)胞或祖細(xì)胞，或者在移植前與其它細(xì)胞混合加入以在體內(nèi)誘導(dǎo)腦內(nèi)細(xì)胞群中這些轉(zhuǎn)錄物的上行調(diào)節(jié)，或者另外強(qiáng)制腦中神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的分化。因此，可利用這些條件在植入紋狀體或黑質(zhì)前預(yù)處理細(xì)胞群，包括神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞，或者其它的干細(xì)胞或祖細(xì)胞或者本文所述的其它細(xì)胞。例如，可將海馬神經(jīng)干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)/帶有BMP7的支架上分化，然后直接將其分化形式移植到紋狀體或黑質(zhì)密部中。
提供下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面，但下列實(shí)施例并不限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1BMP7誘導(dǎo)成熟嚙齒動(dòng)物海馬神經(jīng)祖細(xì)胞向多巴胺能表型分化按先前公開的方法[Svendson等，Nat Rev Genet.，5(2)136-44(2004)]，從成熟大鼠大腦中分離成熟嚙齒動(dòng)物海馬神經(jīng)祖細(xì)胞。將分離的細(xì)胞以1000個(gè)細(xì)胞/cm2接種于層粘連蛋白包被的24孔組織培養(yǎng)板中(Becton Dickson，Bedford，MA)。
使接種的細(xì)胞最初在一種補(bǔ)充的神經(jīng)基礎(chǔ)的培養(yǎng)基或NBM中生長(zhǎng)。NBM是帶有B27補(bǔ)充物(Invitrogen，Carlsbad，CA)和L-谷氨酰胺(4毫摩爾)(Sigma，St.Louis，MO)的Neurobasal-A培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)。補(bǔ)充的NBM也包含20納克/毫升的上皮生長(zhǎng)因子(EGF)(Sigma，St.Louis，MO)和20納克/毫升的基本的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(Peprotech，Rocky Hill，NJ)。
將一份(Set one)細(xì)胞在補(bǔ)充的NBM中培養(yǎng)17日。
將第二份(Set two)細(xì)胞先在補(bǔ)充的NBM中培養(yǎng)4日。然后，從培養(yǎng)板中除去補(bǔ)充的NBM，將細(xì)胞在含有20納克/毫升的BMP7(Curis，Cambridge，MA)的NMB中培養(yǎng)13日。
將第三份(Set three)細(xì)胞先在補(bǔ)充的NBM中培養(yǎng)10日。然后，從培養(yǎng)板中除去補(bǔ)充NBM，將細(xì)胞在含有200納克/毫升的SonicHedgehog或SHH(Sigma，St.Louis，MO)和100納克/毫升的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8或FGF8(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的NMB中培養(yǎng)。
將第四份(Set four)細(xì)胞先在補(bǔ)充的NBM中培養(yǎng)10日。然后，從培養(yǎng)板中除去補(bǔ)充的NBM，將細(xì)胞在含有20納克/毫升的BMP7、200納克/毫升的Sonic Hedgehog和100納克/毫升的FGF8的NMB中培養(yǎng)。
在17-日實(shí)驗(yàn)期結(jié)束時(shí)，將所有的培養(yǎng)基用4％多聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)固定，然后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色以評(píng)估β微管蛋白III(TuJl)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維(fibrilary)酸性蛋白(GFAP)和酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)。
簡(jiǎn)言之，將固定的培養(yǎng)基用磷酸緩沖鹽水(PBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)洗滌，然后暴露于蛋白封閉溶液中30分鐘。該蛋白封閉溶液為帶有4％山羊血清(Chemicon，Temecula，CA)和0.3％Triton(Triton X-100，Sigma)的PBS。然后在室溫下，將初級(jí)抗體溶液應(yīng)用于含有封閉溶液加上1∶500稀釋的TuJl抗體(Sigma，St.Louis，MO)、1∶1000稀釋GFAP抗體(Chemicon，Temecula，CA)以及1∶2000稀釋的TH(Chemicon，Temecula，CA)的樣本中1小時(shí)。
除去該初級(jí)抗體溶液，將樣本用PBS洗滌。然后在室溫下，應(yīng)用次級(jí)抗體溶液1小時(shí)。該次級(jí)抗體溶液為帶有1∶250稀釋的山羊抗-小鼠IgG-德克薩斯紅(Chemicon，Temecula，CA)和1∶250稀釋的山羊抗-家兔IgG-Alexa 488(Chemicon，Temecula，CA)的蛋白封閉溶液。然后將樣本洗滌，與10微摩爾的4’-6-二脒基-2-苯基吲哚-2HCl(DAPI)(Molecular Probes，Eugene，OR)一起孵育10分鐘以使細(xì)胞核顯影。
免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，使用Olympus倒置偏熒光(epifluorescent)顯微鏡觀察熒光，然后用數(shù)字照相機(jī)和ImagePro軟件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)獲取影像。為進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)定量，在200x放大倍率下，對(duì)細(xì)胞視野計(jì)數(shù)以檢查對(duì)各標(biāo)記物的陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，然后與在單獨(dú)NBM下生長(zhǎng)的對(duì)照樣本進(jìn)行比較。對(duì)每個(gè)條件下最少1000個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)(或者如果更少)，在該條件下觀察細(xì)胞總數(shù)。
對(duì)所給定的標(biāo)記物呈陽(yáng)性的細(xì)胞的百分率通過用對(duì)特定標(biāo)記物呈陽(yáng)性的細(xì)胞的數(shù)量除以DAPI染色確定的有核細(xì)胞總數(shù)來測(cè)定。表1顯示對(duì)TuJl、TH和GFAP染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞的比例。
表1對(duì)給定標(biāo)記物染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞的百分率
該表顯示單獨(dú)用補(bǔ)充的NBM，20.1％這些神經(jīng)祖細(xì)胞分化為TuJl+神經(jīng)元。當(dāng)然，那些TuJl+細(xì)胞中，43.8％分化(8.8％的所有DAPI+有核細(xì)胞)成為多巴胺能表型(通過TH陽(yáng)性染色證實(shí))。當(dāng)將BMP7加入到NBM中時(shí)，多巴胺能性分化明顯增強(qiáng)(74.7％的TuJl+細(xì)胞為TH陽(yáng)性；7.4％的所有有核細(xì)胞)。
類似地，雖然加入BMP7與SHH和FGF8(分別為35.9％對(duì)19.4％)混合時(shí)，神經(jīng)元(TuJl陽(yáng)性細(xì)胞)總數(shù)明顯降低，但發(fā)育成熟為多巴胺能TH陽(yáng)性表型的這些細(xì)胞的百分率在BMP7(分別為25.1％，僅用SHH和FGF8，對(duì)有BMP7的45.9％)存在下并未明顯增加。
此外，BMP7還誘導(dǎo)這些神經(jīng)祖細(xì)胞分化為星形細(xì)胞，其可通過免疫細(xì)胞化學(xué)證明的中間絲蛋白GFAP的表達(dá)增加所證實(shí)(單獨(dú)BMP7為≥80％對(duì)僅用補(bǔ)充的NBM為5.5％)。
實(shí)施例2BMP7誘導(dǎo)產(chǎn)后細(xì)胞中Nurrl表達(dá)根據(jù)美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/887,012和10/887,446(通過引用結(jié)合到本發(fā)明中)中所述，從臍帶和胎盤組織消化液中分離產(chǎn)后細(xì)胞。簡(jiǎn)單地講，從產(chǎn)后組織移出物中分離人臍帶和胎盤細(xì)胞。從分娩或正常手術(shù)分娩時(shí)的孕婦中獲得所述各組織。在無菌狀態(tài)下，在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行下列細(xì)胞分離方案。在抗霉菌劑和抗生素(AA)(每100毫升1毫升(每毫升10,000單位))(PBS-AA)存在下，將產(chǎn)后組織用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌。洗滌步驟包括在溫和攪拌下用PBS-AA沖洗組織。將該過程進(jìn)行數(shù)次以除去血和碎屑。然后在150cm組織培養(yǎng)板中，在50毫升DMEM-低葡萄糖(DMEM:Lg)或DMEM-高葡萄糖(DMEM:Hg)培養(yǎng)基存在下，將洗滌的組織機(jī)械性離解。將組織剁成小碎片后，立即將其轉(zhuǎn)移至50-毫升圓錐形管中，每管裝約5gm組織。然后在40毫升含有AA的DMEM:Lg或DMEM:Hg中將組織消化，所述AA含有溶于DMEM中的10毫升膠原酶∶分散酶(C∶D)或者含有溶于DMEM中的膠原酶∶分散酶∶透明質(zhì)酸酶(C∶D∶H)。C∶D是帶有稀釋于50毫升DMEM中的500毫克分散酶(0.4單位/毫克)的750毫克II型膠原酶(每毫克＞125單位(每毫克0.5-3FALGA單位))。因此，C∶D∶H是帶有稀釋于50毫升DMEM中的500毫克分散酶(0.4單位/毫克)和200毫克(300單位/mg)的750毫克II型膠原酶(每毫克＞125單位(每毫克0.5-3FALGA單位))?；蛘撸诒痉桨钢?，還可利用IV型膠原酶(750毫克，每毫克＞125單位(每毫克0.5-3FALGA單位))。在37℃下，在定軌振蕩器(溫和震蕩)內(nèi)，將裝有組織、培養(yǎng)基和消化酶的圓錐形管溫育至少24小時(shí)。消化后，將組織通過40微米尼龍細(xì)胞過濾器過濾。然后將過濾的細(xì)胞混懸液在1000×g下離心10分鐘。將上清液抽氣，然后再將細(xì)胞沉淀混懸于50毫升新鮮培養(yǎng)基中。將該過程完成2次，以從細(xì)胞群中除去殘留的酶活性。然后移去上清液，將細(xì)胞沉淀再懸浮于2毫升擴(kuò)充培養(yǎng)基(DMEM:Lg或DMEM:Hg；15％FBS(Hyclone確定的牛血清Lot#AND18475)；2-巰基乙醇(1微升/100毫升)；每一抗霉菌素的抗生素(1毫升/100毫升(10,000單位/毫升))中。通過錐蟲藍(lán)排除的手工計(jì)數(shù)法，確定每批分離細(xì)胞的細(xì)胞生存力。
將分離的臍帶和胎盤細(xì)胞以1000細(xì)胞/cm2接種于層粘連蛋白包被的24孔組織培養(yǎng)板(Corning，NY)中。按60/483264中所述，先將細(xì)胞接種于維持培養(yǎng)基(空白對(duì)照)中。在維持培養(yǎng)基中4日后，將細(xì)胞分為4份。將第一份細(xì)胞轉(zhuǎn)換為補(bǔ)充EGF(20納克/毫升)和bFGF(20納克/毫升)的NBM中，使其生長(zhǎng)13日。將第2-4份細(xì)胞轉(zhuǎn)換為補(bǔ)充EGF(20納克/毫升)和bFGF(20納克/毫升)的NBM中，使其生長(zhǎng)6日。然后，除去補(bǔ)充有EGF和FGF8的NBM，使細(xì)胞在含下列成分的各NBM再培養(yǎng)7日BMP7+SHH+FGF8(第二份)；BMP7+SHH+FGF8+視黃酸(RA)(第三份)；或者BMP7+RA(第四份)。
在17-日實(shí)驗(yàn)期結(jié)束時(shí)，使用Rneasy試劑盒(RNeasy Mini kit，Qiagen，Valencia，CA)，從所誘導(dǎo)的細(xì)胞群中分離RNA。根據(jù)制造商說明書(RNeasy Mini kit，Qiagen，Valencia，CA)，用含有β-巰基乙醇(Sigma St.Louis，MO)的350微升的緩沖RLT溶解細(xì)胞，然后在-80℃下儲(chǔ)存。將細(xì)胞溶胞產(chǎn)物溶化，根據(jù)制造商說明書，用2.7U/樣本DNase處理(Sigma St.Louis，MO)來提取RNA。將RNA用50微升的DEPC-處理的水(0.1％焦碳酸二乙酯，Sigma，St.Louis，MO)稀釋，在-80℃下儲(chǔ)存。使用帶有TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑的無規(guī)六聚體(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)，將RNA在25℃下逆轉(zhuǎn)錄10分鐘，37℃下60分鐘以及95℃下10分鐘。將樣本在-20℃下儲(chǔ)存。
采用Assays-on-DemandTM基因表達(dá)產(chǎn)品Nurr I(Hs00428691)和GAPDH(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，用TaqMan UniversalPCR標(biāo)準(zhǔn)混合器，根據(jù)制造商說明書，利用帶有ABI prism 7000SDS軟件的7000序列檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)cDNA樣本進(jìn)行定量PCR(Q-PCR)測(cè)定。熱循環(huán)條件最初為50℃2分鐘和95℃10分鐘，接著是95℃15秒和60℃1分鐘的40個(gè)循環(huán)。
表2中顯示產(chǎn)后細(xì)胞分化后Nurrl mRNA的表達(dá)。該表顯示BMP7誘導(dǎo)產(chǎn)后細(xì)胞中Nurrl表達(dá)。當(dāng)與對(duì)照組(NBM+EGF+FGF8)比較時(shí)，在與sonic hedgehog(SHH)+成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF8)+BMP7或者SHH+FGF8+BMP7+視黃酸一起培養(yǎng)后，在產(chǎn)后細(xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)Nurrl表達(dá)。與相同條件下的對(duì)照組(成神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基+B27補(bǔ)充物+EGF/FGF)或胎盤細(xì)胞比較，當(dāng)將細(xì)胞在RA+SHH+FGF8+BMP7存在下培養(yǎng)時(shí)，臍帶細(xì)胞強(qiáng)烈誘導(dǎo)Nurrl表達(dá)。
表2多巴胺能分化后產(chǎn)后細(xì)胞中Nurrl的表達(dá)
注釋SHH＝形態(tài)發(fā)育基因，F(xiàn)GF8＝成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8，RA＝視黃酸
權(quán)利要求
1.一種治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的方法，該方法包括給予所述人的紋狀體或黑質(zhì)密部有效誘導(dǎo)細(xì)胞群的量的BMP7，所述細(xì)胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便實(shí)際上使所述細(xì)胞向多巴胺能表型分化。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述BMP7以單一劑量給予。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述BMP7以持續(xù)釋放劑量給予。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述BMP7作為包含生理學(xué)上可接受的載體的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物給予。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述載體選自臨床級(jí)的無菌水、無菌鹽水、無菌磷酸緩沖鹽水、無菌葡萄糖水溶液、無菌液體介質(zhì)和生理學(xué)上可接受的等滲液體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述BMP7在一種基質(zhì)中給予。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述基質(zhì)的形式選自顆粒、支架、立方體、圓筒、軟管、嵌入塊、薄膜、水凝膠或薄片。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述BMP7通過微導(dǎo)管注射、內(nèi)導(dǎo)管插入術(shù)、鞘內(nèi)傳遞而顱內(nèi)給予，或者通過微型泵腦室內(nèi)給予，或者鞘內(nèi)或鼻內(nèi)給予。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞群包括選自干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞，其為成熟神經(jīng)原、海馬祖細(xì)胞、海馬干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、源于胚胎干細(xì)胞的祖細(xì)胞、產(chǎn)后衍生的細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、臍帶祖細(xì)胞、胎盤干細(xì)胞、胎盤祖細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、胰干細(xì)胞、緣干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞、肌肉祖細(xì)胞、胰祖細(xì)胞、緣祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和肝祖細(xì)胞。
10.權(quán)利要求4的方法，其中所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物包含約0.5-約1,000納克的所述BMP7。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物還包含SonicHedgehog和FGF8。
12.一種適用于治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物，它包含有效誘導(dǎo)細(xì)胞群的量的BMP7，所述細(xì)胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便實(shí)際上使所述細(xì)胞向多巴胺能表型分化，Sonic Hedgehog；FGF8；以及生理學(xué)上可接受的載體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物包含約0.5-約1,000納克的所述BMP7。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過給予人紋狀體或黑質(zhì)密部有效誘導(dǎo)細(xì)胞群的量的BMP7，來治療由人紋狀體或黑質(zhì)密部的損傷或疾病所引起的神經(jīng)缺陷的方法，所述細(xì)胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便實(shí)際上使所述細(xì)胞向多巴胺能表型分化，本發(fā)明還涉及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物和適于這類治療用途的基質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K38/18GK101065143SQ200580040120
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月28日
發(fā)明者D·J·梅西納, S·米斯特里 申請(qǐng)人:伊西康公司