專利名稱：：增強(qiáng)內(nèi)源化合物的配體的制作方法增強(qiáng)內(nèi)源化合物的配體相關(guān)申請本申請是于2004年11月10日申請的美國專利申請?zhí)?0/985,847的部分繼續(xù)申請，所述文獻(xiàn)的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
：包括哺乳動物和人在內(nèi)的動物會產(chǎn)生多種內(nèi)源化合物，它們具有幫助維持動物的正常健康和生理的活性。這類化合物參與例如止血、免疫功能、新陳代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化等許多生理過程。已經(jīng)分離出許多內(nèi)源化合物，而且可以制備合成或重組形式，并將其給予患者以對抗疾病。目前的治療方法通常包括給予患者內(nèi)源化合物的外源或外源產(chǎn)生形式。這類治療方法可因通常高劑量的給藥而產(chǎn)生不想要的結(jié)果，而且某些治療藥(例如重組形式的人蛋白)通常必須由哺乳動物細(xì)胞表達(dá)而產(chǎn)生，這比由細(xì)菌或酵母系統(tǒng)表達(dá)更昂貴，收率更低。這些問題可通過開發(fā)治療藥和方法而得以克服，這類方法可利用和開發(fā)內(nèi)源化合物產(chǎn)生療效的有益活性。需要這類治療藥和方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分的配體在制備藥物中的用途，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物，但基本上不抑制所述內(nèi)源把化合物的活性。優(yōu)選的配體不結(jié)合內(nèi)源靶化合物的活性部位。這種藥物可用于增加患者的內(nèi)源靶化合物數(shù)量，用于增加患者的內(nèi)源耙化合物的生物利用度，用于增加患者的內(nèi)源耙化合物的體內(nèi)半衰期。該藥物也可以用于增加內(nèi)源靶化合物的活性(例如結(jié)合活性)。該藥物可供局部或系統(tǒng)給藥。在某些實施方案中，相對于給藥之前而言，在給予藥物后約4小時，患者體內(nèi)的內(nèi)源靶配體數(shù)量增加至少1.5倍。在某些實施方案中，在給予藥物后，內(nèi)源靶化合物的體內(nèi)半衰期增加至少1.5倍。通常，配體抑制所述內(nèi)源扭化合物的活性不超過約10%,或者抑制濃度50(IC50)為至少1孩傳爾。配體可包含所述具有內(nèi)源覃巴結(jié)合位點的部分的兩個或更多個拷貝。例如，配體可以是具有內(nèi)源輩巴結(jié)合位點的部分的二聚體，例如dAb二聚體。具有內(nèi)源革巴化合物結(jié)合位點的部分可以是親和體(affibody)、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)、avimer(高親合性多聚體)、抗體或抗體片段(例如Fv片段、單鏈Fv片段、二硫鍵連接的Fv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、雙鏈抗體(diabody)、免疫球蛋白單可變區(qū)(例如人VH和人VpVHH)。如有必要，配體還可包含本文所述的半衰期延長部分。例如，配體可包含選自以下的半衰期延長部分聚烷二醇部分、血清白蛋白或其片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或其轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分、或者包含體內(nèi)延長半衰期的多肽結(jié)合位點的部分。包含體內(nèi)延長半衰期的多肽結(jié)合位點的合適部分包括親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)、avimer、抗體或抗體片段(例如Fv片段、單鏈Fv片段、二硫鍵連接的Fv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、雙鏈抗體和免疫球蛋白單可變區(qū)(例如人VH和人VL、VHH)。本發(fā)明的藥物和配體基本上是非免疫原性的。在某些實施方案種，藥物是緩釋型制劑。在某些實施方案中，內(nèi)源靶化合物是可溶性激動劑(例如細(xì)胞因子、生長因子、激素)、可溶性受體(例如可溶性細(xì)胞因子受體，例如可溶性TNFR1、可溶性TNFR2、可溶性IL-1受體、可溶性IL-4受體、可溶性IL-13受體)、內(nèi)源受體拮抗劑(例如IL-1受體拮抗劑(IL-lra))或酶。在具體的實施方案中，內(nèi)源把化合物是可溶性細(xì)胞因子受體，例如可溶性TNFR1。優(yōu)選的配體以高親和力結(jié)合內(nèi)源靶化合物，例如Kd為1x10-7M以下。在某些實施方案中，本發(fā)明的藥物或配體不包括美國專利申請公布號2003/0144484中公開的抗體、其片段或區(qū)域。在某些實施方案中，本發(fā)明的藥物或配體不抑制抗體A2或嵌合抗體A2(cA2)與人TNF-a的結(jié)合。在具體的實施方案中，本發(fā)明的藥物或配體不結(jié)合人TNF(腫瘤壞死因子)的氨基酸87-108中包含的表位，或者在M酸59-80和87-108中包含的表位。這些氨基酸是59-80:Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Glii-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-VaI-.乙eu-Leu-Thr-His-Thr-Ile(SEQIDNO:26);和87-108:Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Gh-Gly(SEQIDNO:27).本發(fā)明也涉及內(nèi)源革巴化合物在制備用于增加所述內(nèi)源華巴活性的藥物中的用途，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源靶，但基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。優(yōu)選的配體不結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物的活性部位。在一些實施方案中，內(nèi)源把配體的結(jié)合活性增加，例如結(jié)合活性(例如親和力(affinity)、親合力(avidity))可增加至少10倍。本發(fā)明也涉及配體，所述配體能結(jié)合內(nèi)源靶化合物，該活性適合于治療患者的疾病，其中所述配體不結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物的活性部位，或者基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性，用于治療適于用所述內(nèi)源靶化合物治療的疾病。本發(fā)明也涉及藥物組合物，所述組合物包含配體和生理上可接受的載體，所述配體能結(jié)合內(nèi)源靶化合物，該活性適合于治療患者的疾病，其中所述配體不結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物的活性部位，或者基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明藥物組合物的遞藥裝置。在某些實施方案中，遞藥裝置是胃腸外遞藥裝置、靜脈內(nèi)遞藥裝置、肌內(nèi)遞藥裝置、腹膜內(nèi)遞藥裝置、經(jīng)皮遞藥裝置、肺部遞藥裝置、動脈內(nèi)遞藥裝置、鞘內(nèi)遞藥裝置、關(guān)節(jié)內(nèi)遞藥裝置、皮下遞藥裝置、鼻內(nèi)遞藥裝置、陰道遞藥裝置和直腸遞藥裝置。例如，遞藥裝置可以是注射器、經(jīng)皮遞藥裝置、膠嚢劑、片劑、噴灑器(nebulizer)、吸入器、霧化器(atomizer)、煙霧器(aerosolizer)、氣霧器(mister)、干粉吸入器、計量吸入器、計量噴霧器(metereddosespmyer)、計量氣霧器(metereddosemister)、計量霧化器、導(dǎo)管。本發(fā)明涉及增加患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物半衰期的方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分。本發(fā)明涉及增加患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物數(shù)量的方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分。本發(fā)明涉及增加患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物生物利用度的方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源粑化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分。本發(fā)明涉及增加患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物活性(例如結(jié)合活性)的方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分。本發(fā)明涉及患有適于用內(nèi)源靶化合物治療的疾病的患者的治療方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源革巴化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分。本發(fā)明還涉及本文所述的新配體(例如dAb)。附圖簡述圖1是在單次靜脈內(nèi)給予PEG化dAb單體之后，經(jīng)ELISA測定的血清可溶性TNFR1相對濃度與時間的曲線圖(濃度時間曲線)，該PEG化dAb單體能結(jié)合TNFRl(TAR2m-21-23/40K支鏈PEG;也稱為PEG抗-TNFRldAb)。通過ELISA，采用1:5稀釋血清，得到繪圖數(shù)據(jù)點。曲線清楚表明，給予能結(jié)合TNFR1的PEG化dAb單體，增加了體循環(huán)的TNFR1的生物利用度。正如濃度時間曲線所示，在給予PEG化dAb單體后，血清可溶性TNFR1水平增加，達(dá)到峰值濃度，然后隨著PEG化dAb被清除，而隨時間下降到基礎(chǔ)水平。結(jié)果證明，給予能結(jié)合可溶性受體的dAb能增加受體的生物利用度，并增加體循環(huán)的可溶性受體水平或數(shù)量，然后增加的體循環(huán)可溶性受體水平或數(shù)量被清除，回復(fù)到基礎(chǔ)水平。結(jié)果表明，體循環(huán)中可溶性受體水平可因給予能結(jié)合可溶性受體的PEG化dAb單體而得到控制。發(fā)明詳述在本發(fā)明說明書中描述了實施方案，撰寫方式使得本發(fā)明說明書能夠既清楚又簡明，但是應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的情況下，可以對這些實施方案進(jìn)行各種組合或分開。本文所用的術(shù)語"配體"是指這樣的化合物該化合物包含具有所需內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的至少一個肽、多肽或蛋白質(zhì)部分。例如，具有所需內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分可以是具有所需內(nèi)源靶化合物(例如可溶性受體蛋白、內(nèi)源受體拮抗劑、細(xì)胞因子或生長因子)結(jié)合特異性的免疫球蛋白單可變區(qū)(例如VH、VpVHH)。具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分還可包含具有所需內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的合適形式的免疫球蛋白單可變區(qū)的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)，使得該部分具有內(nèi)源把化合物結(jié)合特異性。例如，CDR可以移植到合適的蛋白質(zhì)支架或骨架上，例如親和體、SpA支架、LDL受體A類區(qū)或EGF區(qū)。此外，配體可以是本文所述的單^f介(例如dAb單體)、雙價(同型雙價、異型雙價)或多價(同型多價、異型多價)。因此，"配體"包括由dAb組成的多肽，包括基本上由dAb組成的多肽，包含合適形式的dAb(或dAb的CDR)的多肽，例如抗體形式(例如IgG樣形式、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2)或合適的蛋白質(zhì)支架或骨架，例如親和體、SpA支架、LDL受體A類區(qū)或EGF區(qū)，包含能結(jié)合第一內(nèi)源靶化合物的dAb以及能結(jié)合另一內(nèi)源耙化合物(例如血清白蛋白)的第二dAb的雙特異性配體，以及本文所述的多特異性配體。具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分也可以是包含所需靶結(jié)合位點的蛋白結(jié)構(gòu)域，例如選自以下的蛋白結(jié)構(gòu)域親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)、avimer(參見例如美國專利申請公布號2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)。如有必要，"配體，，還可包含一個或多個額外部分，它們可以各自獨立為肽、多肽或蛋白部分或非肽部分(例如聚烷二醇、脂質(zhì)、碳水化合物)。例如，配體還可包含本文所述的半衰期延長部分(例如聚烷二醇部分，包含白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體的部分，包含轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白片段或轉(zhuǎn)鐵蛋白變異體的部分，能結(jié)合白蛋白的部分、能結(jié)合新生動物Fc受體的部分)。本文所用的術(shù)語"內(nèi)源耙化合物"是指由目標(biāo)患者(例如哺乳動物、人)產(chǎn)生的可溶性化合物。內(nèi)源耙化合物包括例如可溶性激動劑(例如細(xì)胞因子、生長因子、激素)、可溶性受體(例如可溶性細(xì)胞因子受體，例如可溶性TNFR1、可溶性TNFR2、可溶性IL-1受體、可溶性IL-4受體、可溶性IL-13受體)、內(nèi)源受體拮抗劑(例如IL-1受體拮抗劑(IL-lm))、酶等。本文所用的術(shù)語"活性部位"是指與內(nèi)源靶化合物的內(nèi)源結(jié)合配偶體相互作用(例如結(jié)合)的內(nèi)源靶化合物(例如蛋白質(zhì))的部位或結(jié)構(gòu)域(例如接觸受體的配體的受體蛋白部位或結(jié)構(gòu)域，接觸激動劑的受體的激動劑蛋白(例如細(xì)胞因子)的部位或結(jié)構(gòu)域。酶的催化結(jié)構(gòu)域)。例如，本文所用的可溶性內(nèi)源化合物(例如細(xì)胞因子、生長因子或激素)的"活性部位"是細(xì)胞因子、生長因子或激素上的部位，其接觸能結(jié)合細(xì)胞因子、生長因子或激素的內(nèi)源受體。本文所用的"生物利用度"是指內(nèi)源耙化合物或配體-內(nèi)源靶化合物復(fù)合物存在或進(jìn)入所需作用部位(例如體循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、局部作用部位(例如特定器官、組織的特定區(qū)域(例如肌肉、皮膚)))的范圍?？梢元毩⒂诨颊叩膬?nèi)源輩巴化合物的體內(nèi)半衰期的任何變化、或者獨立于患者體內(nèi)內(nèi)源耙化合物數(shù)量的任何變化，而增加內(nèi)源靶化合物的生物利用度。例如，配體可結(jié)合在體循環(huán)中具有有益活性、但卻快速分布到組織中的內(nèi)源靶化合物，并且延緩向組織的分布速率。這類配體可增加體循環(huán)中內(nèi)源耙化合物的生物利用度，在此內(nèi)源靶化合物的有益活性具有療效。本文所用的"結(jié)合活性"是指結(jié)合配偶體彼此結(jié)合的能力。例如，受體或可溶性受體結(jié)合其關(guān)聯(lián)配體的能力。結(jié)合活性可表示為例如親和力(Kd;K^K解離/K締合)或親合力。可通過例如增加親和力(例如增加結(jié)合速率(K締合)或降低解離速率(K解離))或者通過增加親合力，而增加結(jié)合活性?？赏ㄟ^例如增加第一結(jié)合配偶體和第二結(jié)合配偶體接觸的位點數(shù)量，而增加親合力。本文所用的術(shù)語"基本上非免疫原性"是指結(jié)合配體、配體-內(nèi)源靶化合物或內(nèi)源耙化合物的高親和力抗體不與給予患者的配體一起產(chǎn)生。高親和力抗體結(jié)合配體、配體-內(nèi)源靶化合物復(fù)合物或內(nèi)源輩巴化合物的親和力為500nM以下、或300nM以下、或100nM以下、或10nM以下、或lnM以下?？梢圆捎萌魏魏线m方法，鑒定能結(jié)合配體、配體-內(nèi)源粑化合物復(fù)合物或內(nèi)源靶化合物的抗體以及這類抗體的親和力。若干這樣的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，血清樣品可得自已接受配體的人(例如給藥后約1周、2周、3周、4周)，然后可采用例如ELISA或其它合適測定，測定血清中是否存在能結(jié)合配體、配體-內(nèi)源草巴化合物或內(nèi)源靶化合物的抗體?？刹捎闷胶馔肝龌虮砻娴入x子共振(surfaceplasmonresonance)等合適方法，測定抗體的親和力。術(shù)語"免疫球蛋白單可變區(qū)"，是指能獨立于其它V區(qū)(Vregion,Vdomain)而特異性結(jié)合抗原或表位的抗體可變區(qū)(VH、VHH、VL);然而，本文所用的術(shù)語免疫球蛋白單可變區(qū)可以與其它可變區(qū)(variableregion,variabledomain)呈現(xiàn)例如同型多聚體或異型多聚體的形式，其中其它區(qū)(region,domain)并不是免疫球蛋白單可變區(qū)的抗原結(jié)合所必需的(即其中免疫球蛋白單可變區(qū)與抗原的結(jié)合獨立于另外的可變區(qū))。"免疫球蛋白單可變區(qū)"不僅包括分離的抗體單可變區(qū)多肽，而且包括含有抗體單可變區(qū)多肽序列的一個或多個單體的較大多肽。"域抗體"或"dAb"與本文所用的術(shù)語"免疫球蛋白單可變區(qū)"多肽同義。本文所用的免疫球蛋白單可變區(qū)多肽是指哺乳動物(優(yōu)選人，但也包括嚙齒動物)免疫球蛋白單可變區(qū)多肽(例如公開于WO00/29004，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中)或駱駝科動物(camelid)VHHdAb。駱駝科動物dAb是免疫球蛋白單可變區(qū)多肽，它們來自駱駝(camel)、美洲駝(llama)、羊駝(alpaca)、單峰駱駝(dromedary)和栗色駱馬(guanaco)等物種，并且包含天然缺乏輕鏈的重鏈抗體V朋。V冊分子要比IgG分子小約10倍，作為單一多肽，它們非常穩(wěn)定，能耐受極端pH和溫度條件。"互補"，當(dāng)兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)儆谀軜?gòu)成關(guān)聯(lián)對或關(guān)聯(lián)組的結(jié)構(gòu)家族時，或者它們來源于這樣的家族并保留了該特征時，則它們是"互補"的。例如，抗體的Vh區(qū)和Vt區(qū)就是互補的；兩個Vh區(qū)則不互樸，兩個Vt區(qū)也不互補。在免疫球蛋白超家族其它成員中也可發(fā)現(xiàn)互補區(qū)，例如T細(xì)胞受體的Va和Vp(或Y和5)區(qū)。人工結(jié)構(gòu)域，例如基于蛋白質(zhì)支架的結(jié)構(gòu)域(它們不結(jié)合表位，除非經(jīng)改造使它們結(jié)合表位)，是非互補的。同樣，基于(例如)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的兩個結(jié)構(gòu)域也不是互補的。"免疫球蛋白家族"，是指這樣的多肽家族其保留抗體分子的免疫球蛋白折疊特征，含有兩個P折疊，一般還含有一個保守二硫鍵。免疫球蛋白超家族成員在體內(nèi)參與細(xì)胞和非細(xì)胞相互作用的許多方面，包括在免疫系統(tǒng)(例如抗體、T細(xì)胞受體分子等)中具有廣泛作用，參與細(xì)胞粘附(例如ICAM分子)和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如受體分子，例如PDGF受體)。本發(fā)明適用于所有具有結(jié)合域的免疫球蛋白超家族分子。優(yōu)選本發(fā)明涉及抗體。"domain(域，結(jié)構(gòu)域，區(qū))"，是經(jīng)過折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，它保留了蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，但獨立于蛋白質(zhì)的其余部分。通常，各結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的分離的功能性，并且在許多情況下可以添加、去除或轉(zhuǎn)移給其它蛋白質(zhì)，而不喪失該蛋白質(zhì)和/或該結(jié)構(gòu)域的其余部分的功能。單抗體可變區(qū)(singleantibodyvariabledomain)是指經(jīng)過折疊的多肽區(qū)，包含特征為抗體可變區(qū)的序列。因此，它包含完整抗體可變區(qū)和修飾可變區(qū)(例如其中一個或多個環(huán)已經(jīng)被不具有抗體可變區(qū)特征的序列所取代)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗體可變區(qū)，以及保留全長結(jié)構(gòu)域的至少部分結(jié)合活性和特異性的可變區(qū)的折疊片段。"庫(repertoire)",—級序列不同的多樣化變異體(例如多肽變異體)的集合。本發(fā)明所用的文庫可包括含有至少1000個成員的多肽庫。"文庫(library)"，術(shù)語文庫是指異源多肽或核酸的混合物。文庫由成員組成，每個成員都具有一個多肽或核酸序列。就這一方面而言，文庫(library)和庫(repertoire)同義。文庫成員間的序列差異造成文庫的多樣性。文庫可以呈多肽或核酸的簡單混合物的形式，或者可以呈用核酸文庫轉(zhuǎn)化的生物體或細(xì)胞的形式，例如細(xì)菌、病毒、動植物細(xì)胞等。優(yōu)選各個生物體或細(xì)胞僅含有一個文庫成員或數(shù)目有限的文庫成員。最好將核酸摻入到表達(dá)栽體中，以表達(dá)該核酸所編碼的多肽。因此，在一個優(yōu)選的方面，文庫可以呈宿主生物體群體的形式，每個生物體含有一個或多個拷貝的表達(dá)載體，所述栽體含有呈核酸形式的文庫的一個成員，所述核酸可以表達(dá)而產(chǎn)生其相應(yīng)多肽成員。因此，宿主生物體群體具有編碼很大的具有遺傳多樣性的多肽變異體庫的潛力。"抗體",抗體(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或其片段(例如Fab、F(ab')2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合構(gòu)象多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙鏈抗體)，無論是來自任何物種的天然產(chǎn)生的抗體，還是由重組DNA4支術(shù)產(chǎn)生的抗體；無論是從下列哪種樣品中分離的血清、B細(xì)胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母或細(xì)菌。"雙特異性配體"，是指包含本文所定義的第一免疫球蛋白單可變區(qū)和第二免疫球蛋白單可變區(qū)的配體，其中可變區(qū)能結(jié)合兩個不同抗原或同一抗原上的兩個表位，而它們通常并不與單特異性免疫球蛋白結(jié)合。例如，兩個表位可以在同一半抗原上，而不是同一表位或足夠近以便結(jié)合單特異性配體。本發(fā)明的雙特異性配體由具有不同特異性的可變區(qū)組成，但不包括具有相同特異性的相互互補的可變區(qū)對。雙特異性配體和制備雙特異性配體的合適方法公開于WO2004/058821、WO2004/003019和WO03/002609,這些已公布的國際申請的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。"抗原"，一種能與本發(fā)明的配體結(jié)合的分子。通常，抗原與抗體配體結(jié)合并能在體內(nèi)產(chǎn)生抗體反應(yīng)?？乖梢允嵌嚯摹⒌鞍踪|(zhì)、核酸或其它分子。一般而言，針對特定抗原的靶特異性而選擇本發(fā)明雙特異性配體。就常規(guī)抗體及其片段而言，由可變環(huán)(L1、L2、L3和H1、H2、H3)所限定的抗體結(jié)合位點能夠結(jié)合抗原。"表位"，與免疫球蛋白VH/VL對常規(guī)結(jié)合的結(jié)構(gòu)單元。表位限定針對抗體的最少結(jié)合位點，因此代表了抗體特異性的靶。就單域抗體而言，表位代表了與分離的可變區(qū)結(jié)合的結(jié)構(gòu)單元。"通用構(gòu)架(universalframework)",單抗體構(gòu)架序列，對應(yīng)于序列中的保守抗體區(qū)，根據(jù)Kabat("SequencesofProteinsofImmunologicalInterest",USDepartmentofHealthandHumanServices(美國健康和人類服務(wù)部))所定義；或者對應(yīng)于人種系免疫球蛋白庫或結(jié)構(gòu)，根據(jù)Chothia和Lesk，(1987),Mo/.腸/.196:910-917所定義。本發(fā)明提供單構(gòu)架或一組這樣的構(gòu)架的用途，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們允許事實上任何結(jié)合特異性的來源，盡管變異僅在超變區(qū)內(nèi)。"半衰期，，，是指配體的血清濃度在體內(nèi)降至50%所需要的時間，例如因為通過天然機(jī)制所^:的配體降解和/或清除或螯合。本發(fā)明的配體在體內(nèi)是穩(wěn)定的，其半衰期因結(jié)合抗降解和/或清除或螯合的分子而延長。通常，這類分子是天然存在的蛋白質(zhì)，它們本身在體內(nèi)具有較長的半衰期。如果配體的功能活性在體內(nèi)的持續(xù)時間比對延長半衰期的分子不具有特異性的類似配體更長的話，則配體半衰期延長。因此，將對HSA和草巴分子具有特異性的配體，與對HAS無特異性且不結(jié)合HAS、而結(jié)合別的分子的相同配體進(jìn)行比較。例如，它能結(jié)合靶分子上的第二表位。通常，半衰期延長10%、20%、30%、40%、50%以上。半衰期延長范圍在2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x以上是可能的?；蛘?，另外，半衰期延長范圍高達(dá)30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x也是可能的。"基本相同(或"基本同源")"，第一氨基酸或核苷酸序列與笫二氨基酸或核苷酸序列均含有足夠數(shù)量的相同或相當(dāng)(例如具有相似側(cè)鏈，例如保守氨基酸取代)氨基酸殘基或核苷酸，以使第一和第二氨基酸或核苦酸序列具有相似活性。就抗體而言，第二抗體與第一抗體具有相同的結(jié)合特異性并且具有第一抗體親和力的至少50%。本文所用的術(shù)語"約"優(yōu)選解釋為正負(fù)20%、更優(yōu)選正負(fù)10%、甚至更優(yōu)選正負(fù)5%、甚至更優(yōu)選正負(fù)2%、最優(yōu)選正負(fù)1%。本文所用的術(shù)語"低嚴(yán)格性"、"中等嚴(yán)格性"、"高嚴(yán)格性"或"極高嚴(yán)格性條件"描述了核酸雜交和洗滌條件。進(jìn)行雜交反應(yīng)的4旨南可參見Cwrewf尸rotoco/sA/o/ecw/or5Zo/ogy,JohnWiley和Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。該參考文獻(xiàn)中描述了含水方法和無水方法，都可以采用。本文所用的具體雜交條件如下(l)低嚴(yán)格性雜交條件在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中,在約45。C，再在0.2XSSC、0.P/。SDS中，在至少50'C(對于低嚴(yán)格性條件，洗滌溫度可升高至55。C)洗滌兩次；(2)中等嚴(yán)格性雜交條件在6XSSC中，在約45。C，再在0.2XSSC、0.1%SDS中'，在60。C洗滌一次或多次；(3)高嚴(yán)格性雜交條件在6XSSC中，在約45°C,再在0.2XSSC、0.1%SDS中在65。C洗滌一次或多次；和優(yōu)選(4)極高嚴(yán)格性雜交條件是0.5M磷酸鈉、7。/。SDS中，在65。C,再在0.2XSSC、1。/。SDS中，在65。C洗滌一次或多次。極高嚴(yán)格性條件(4)是優(yōu)選的條件，除非另有說明，否則應(yīng)采用該條件。本文所用的術(shù)語"竟?fàn)?是指當(dāng)笫二表位與其關(guān)聯(lián)表位結(jié)合域結(jié)合時，第一表位與其關(guān)聯(lián)表位結(jié)合域的結(jié)合受到抑制。例如，結(jié)合可以是空間上受到抑制，例如通過結(jié)合域的物理阻斷或者通過改變結(jié)合域的結(jié)構(gòu)或環(huán)境，使其對表位的親和力或親合力降低。與本文所公開的序列相似或同源(例如至少約70%序列同一性)的序列也是本發(fā)明的組成部分。在某些實施方案中，氨基酸水平上的序列同一性可以約為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上。在核酸水平上，序列同一性可以約為70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上?；蛘撸?dāng)核酸區(qū)段在所選雜交條件(例如極高嚴(yán)格性雜交條件)下與互補鏈雜交時，則存在基本的同一性。核酸可以存在于完整細(xì)胞中，存在于細(xì)胞裂解物中，或者呈部分純化或基本純化的形式。兩序列間"同源性"或"序列同一性"或"相似性，，(這些術(shù)語在本文可互換使用)的計算如下進(jìn)行。為了優(yōu)化比較目的，將序列比對(例如為了比較目的，對于最佳比對，可以在第一和笫二氨基酸或核酸序列中引入空位，非同源序列可以忽略不計)。在一個優(yōu)選的實施方案中，為了比較目的，所比對的參考序列長度占參考序列總長度的至少30%、優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50%、甚至更優(yōu)選至少60%、甚至更優(yōu)選至少70%、80%、90%、100%。然后，對相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械哪硞€位置被與第二序列相應(yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么分子在該位置上是相同的(本文所用的氨基酸或核酸"同源性"等同于氨基酸或核酸"同一性")。兩序列間的％同一性是考慮到空位數(shù)和各空位長度后的兩序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)，需要引入這些空位以進(jìn)行兩序列的最佳比對。優(yōu)選準(zhǔn)備本文所定義的氨基酸序列和核苷酸序列比對和同源性、相似性或同一性，并采用算法BLAST2Sequences進(jìn)行測定，參數(shù)設(shè)定到默認(rèn)值(Tatusova,T.A.等，M,cra6/。/Z^，174:187-188(1999))?；蛘撸詈貌捎肂LAST算法(2.0版)進(jìn)行序列比對，參數(shù)設(shè)定到默認(rèn)值。BLAST算法在美國政府(".gov")的國立健康研究院("nih")國立生物4支術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,".ncbi")的萬維網(wǎng)("www")上、在"/Blast/"目錄下、在"blast—help.html"文件內(nèi)有詳細(xì)介紹。檢索參數(shù)定義如下，最好是設(shè)定在已定好的默認(rèn)參數(shù)。BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)是blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序所采用的啟發(fā)式檢索算法；逸些程序都主要歸功于采用Karlin和Altschul，1990,爿oraf.87(6):2264-8(參見如上所述的"blast_help.html"文件)的統(tǒng)計學(xué)方法的發(fā)現(xiàn)，只有很少的強(qiáng)化。BLAST程序?qū)ｉT用于序列相似性檢索，例如鑒定查詢序列的同源物。這些程序一般不用于基序風(fēng)格的檢索。有關(guān)序列數(shù)據(jù)庫相似性檢索的基本問題的討論，參見Altschul等(1994)。在美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站可獲得的5個BLAST程序來完成以下任務(wù)"blastp"比較氨基酸查詢序列和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫；"blastn"比較核苦酸查詢序列和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫；"blastx"比較核苷酸查詢序列(兩條鏈)的六個框概念翻譯產(chǎn)物和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫；"tblastn"比較蛋白質(zhì)查詢序列和所有六個讀框(兩條鏈)動態(tài)翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫。"tblastx"比較核苷酸查詢序列的六個讀框翻譯和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的六個讀框翻譯。BLAST采用下列檢索參數(shù)HISTOGRAM顯示每次檢索得分的直方圖；默認(rèn)為yes(是)。(參見BLAST手冊中的參數(shù)H)。DESCRIPTIONS限制對指定數(shù)量報告的匹配序列簡短描述的數(shù)量；默認(rèn)限制為100個描述。(參見手冊的參數(shù)V)。另見EXPECT和CUTOFF。ALIGNMENTS將數(shù)據(jù)庫序列限定在報告高打分區(qū)段對(high-scoringsegmentpair,HSP)的指定數(shù)量；默認(rèn)限制為50。如果數(shù)據(jù)庫序列比這更多，為了滿足統(tǒng)計顯著性的報告閾值(參見以下EXPECT和CUTOFF),僅寺艮告歸于最大統(tǒng)計顯著性的匹配。(參見BLAST手冊的參數(shù)B)。EXPECT針對數(shù)據(jù)庫序列報告的匹配的統(tǒng)計顯著性的閾值；默認(rèn)值為10,使得預(yù)期僅偶然找到10個匹配，按照Karlin和Altschul(1990)的隨機(jī)模型。如果歸于匹配的統(tǒng)計顯著性大于EXPECT閾值，則將不報告匹配。EXPECT閾值越低，嚴(yán)格性越高，導(dǎo)致報告的匹配機(jī)會越少。分?jǐn)?shù)值是可接受的。(參見BLAST手冊的參數(shù)E)。CUTOFF用于報告高打分區(qū)段對的截止(Cutoff)分值。默認(rèn)值從EXPECT值(參見上文)求出。HSP是為數(shù)據(jù)庫序列而報告的，僅當(dāng)歸于它們的統(tǒng)計顯著性至少與具有等于CUTOFF值的分值的孤立HSP一樣高時。CUTOFF值越高，嚴(yán)格性越高，導(dǎo)致報告的匹配機(jī)會越少。(參見BLAST手冊的參數(shù)S)。通常，顯著性閾值可以用EXPECT更直觀地控制。MATRIX指定替代打分矩陣，用于BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX。默認(rèn)矩陣是BLOSUM62(Henikoff和Henikoff,1992,A^/.爿acad89(22):10915-9)。有效替代選擇包括PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。替代打分矩陣不適用于BLASTN;指定MATRIX在BLASTN請求中的方向返回錯誤響應(yīng)。STRAND將TBLASTN4企索正好限制在數(shù)據(jù)庫序列的頂鏈或底鏈；或?qū)LASTN、BLASTX或TBLASTX檢索正好限制在查詢序列的頂鏈或底鏈的讀框。FILTER掩蔽具有低成分復(fù)雜性的查詢序列區(qū)段(通過Wootton和Federhen(1993)CowpWeraam/C/ew,;^y17:149-163的SEG程序來確定)，或由短周期性內(nèi)部重復(fù)序列組成的區(qū)段(通過Claverie和States,1993,Co附;t^raawdC/^w/W717:191-201的XNU程序來確定，或者對于BLASTN，通過Tatusov和Lipman的DUST程序來確定(參見NCBI的互聯(lián)網(wǎng)站點))。過濾可從blast輸出中消除具有統(tǒng)計學(xué)顯著性但沒有生物學(xué)意義的報告(例如針對常見富含酸性、堿性或脯氨酸區(qū)的命中)，留下更具生物學(xué)意義的查詢序列區(qū)，適用于針對數(shù)據(jù)庫序列的特定匹配。過濾程序中發(fā)現(xiàn)的低復(fù)雜性序列在核普酸序列中用字母"N"替代(例如"N"重復(fù)13次)，在蛋白質(zhì)序列中用字母"X"替代(例如"X"重復(fù)9次)。過濾僅適用于查詢序列(或其翻譯產(chǎn)物)，而不適用于數(shù)據(jù)庫序列。對于BLASTN,默認(rèn)過濾是DUST,而對于其它程序是SEG。當(dāng)用于SWISS-PROT中的序列時，SEG、XNU或這兩者完全沒有掩蔽什么，這并非是不常見的，所以不應(yīng)當(dāng)希望過濾總會有結(jié)果。此外，在某些情況下，序列完全被掩蔽，這表明任何針對未過濾查詢序列而報告的匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性應(yīng)當(dāng)受到懷疑。NCBI-giCausesNCBIgi標(biāo)識符在輸出中顯示，除了檢索號和/或位置名稱之外。最優(yōu)選采用上述NCBI網(wǎng)址的"/BLAST"目錄下所提供的簡單BLAST檢索算法，進(jìn)行序列比較。除非另有說明，否則本文所用的所有科技術(shù)語都具有本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué))普通技術(shù)人員公知的相同含義。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于分子、遺傳和生化方法(一般參見Sambrook等，Afo/ecw/arC7ow力g:爿Z^60rato/7A/awwa/,第2版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.和Ausubel等，幼o(hù)W尸ratoco/s,力A/o/ecw/crrB油gv(1999)笫4版，JohnWiley&Sons,Inc.,所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)和化學(xué)方法。本發(fā)明涉及包含具有所需內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合部分的配體，涉及這樣的配體在治療中的用途，也涉及這樣的配體在制備藥物中的用途，而且涉及包括給予這類配體的治療方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以使用能結(jié)合可溶性內(nèi)源靶化合物、但基本上不改變這類化合物活性的藥物(例如抗體和抗體片段(例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段(例如scFv、二硫鍵連接的Fv)、dAb、雙鏈抗體))，以改變內(nèi)源靶化合物的某些特性，因而使內(nèi)源靶化合物更有效地治療、抑制或減輕疾病，或者用于診斷目的。因此，本發(fā)明涉及本文所述的配體，這類配體能結(jié)合可溶性內(nèi)源耙化合物、但基本上不抑制內(nèi)源把化合物的活性(例如不結(jié)合內(nèi)源靶化合物的活性部位)，而是用于改變內(nèi)源靶化合物的某些特性。例如，包含具有所需內(nèi)源耙化合物結(jié)合特異性的結(jié)合部分的配體可結(jié)合內(nèi)源耙化合物，因而增加了內(nèi)源耙化合物的流體動力學(xué)尺寸(hydrodynamicsize)并增加了內(nèi)源靶化合物的血清半衰期。有利的是，當(dāng)與配體結(jié)合時，內(nèi)源輩巴化合物保留其生物活性(例如在由配體和內(nèi)源靶化合物組成的復(fù)合物中具有活性)，并且對治療和/或診斷目的來說可產(chǎn)生有益的效果。本文所述的配體可增加內(nèi)源革巴化合物的血清半衰期，即通過例如降低內(nèi)源靶化合物的清除速率。在這樣的情況下，患者體內(nèi)內(nèi)源耙化合物的數(shù)量(例如在體循環(huán)中)可增至大于患者體內(nèi)正常的數(shù)量，內(nèi)源耙配體的增加數(shù)量可產(chǎn)生有益的療效，而這樣的療效是較低或正常數(shù)量的內(nèi)源草巴化合物所不能產(chǎn)生的。包含具有所需內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合部分的配體可結(jié)合內(nèi)源耙化合物，并且可以獨立于患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物的體內(nèi)半衰期的任何變化、或者獨立于患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物數(shù)量的任何變化，而增加內(nèi)源耙化合物的生物利用度。例如，配體可結(jié)合在體循環(huán)中具有有益活性、但卻快速分布到組織中或被清除的內(nèi)源靶化合物(例如甾體或肽激素)，并且延緩分布或清除速率。這樣的配體可增加體循環(huán)中內(nèi)源耙化合物的生物利用度，在此內(nèi)源輩巴化合物的活性可具有有益效果(例如治療效果)。包含具有所需內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合部分的配體可結(jié)合內(nèi)源靶化合物并增加內(nèi)源靶化合物的活性(例如結(jié)合活性)。例如，配體可結(jié)合內(nèi)源靶化合物(例如內(nèi)源激動劑(例如細(xì)胞因子)或可溶性細(xì)胞因子受體)，并通過增加內(nèi)源革巴化合物對其內(nèi)源結(jié)合配偶體的親和力和/或親合力而提高內(nèi)源靶化合物的結(jié)合活性。例如，配體的某一部分包含兩個或更多個對所需細(xì)胞因子具有結(jié)合特異性的結(jié)合位點，則該配體可結(jié)合兩個以上單獨的細(xì)胞因子分子，因而產(chǎn)生細(xì)胞因子的二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體。這樣的二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體因較高的親合力而對例如表達(dá)細(xì)胞因子受體的細(xì)胞具有改進(jìn)的結(jié)合活性。同樣，包含可溶性TNFR1的兩個以上結(jié)合位點的配體也可增加可溶性受體(例如可溶性TNFR1)的結(jié)合活性。這樣的配體可結(jié)合例如兩個可溶性TNFR1鏈，形成可溶性TNFR1二聚體，后者比單個TNFR1鏈來說結(jié)合三聚體TNF的親合力更高。本文所述的配體可系統(tǒng)給予，例如在體循環(huán)中結(jié)合內(nèi)源靶配體并在體循環(huán)中產(chǎn)生有益效果。另外，配體也可局部給予(例如通過皮下注射、肌內(nèi)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、吸入等)，因此改善了內(nèi)源靶化合物的局部生物利用度或者在局部給予配體的部位增加了內(nèi)源把化合物的數(shù)量。例如，配體的緩釋型制劑可通過皮下注射來局部給予，所給予的配體可將內(nèi)源靶配體募集到緩釋型制劑的部位并結(jié)合內(nèi)源靶配體，以改善局部生物利用度或引起內(nèi)源靶配體的局部高數(shù)量。這樣的方法是有利的，例如能促進(jìn)傷口愈合或抑制局部炎癥反應(yīng)(例如在皮膚、肺部、關(guān)節(jié))。本發(fā)明在常規(guī)治療藥和方法上提供若干優(yōu)勢。例如，本文所述的配體通常是小多肽，可以采用細(xì)菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)、而不是更昂貴、收率更低的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)濟(jì)而大量地生產(chǎn)這樣的小多肽。另外，給予本文所述的配體，以利用并開發(fā)對患者來說是內(nèi)源的化合物(例如蛋白質(zhì))的有益活性，通常配體由與患者相同來源(例如人類來源)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(例如dAb)組成，因此基本上是非免疫原性的。有利的是，這明顯降^f氐或消除了患者產(chǎn)生針對配體、配體-內(nèi)源靶化合物復(fù)合物或內(nèi)源靶化合物的高親和力中和抗體的危險。這明顯優(yōu)于包括給予外源化合物、或者甚至重組產(chǎn)生的內(nèi)源蛋白質(zhì)的治療方法，后者經(jīng)常會在患者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生高親和力抗體，從而限制或消除治療藥的功效。與內(nèi)源粑化合物結(jié)合的配體本發(fā)明涉及這樣的配體所述配體包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分(例如dAb),但基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。優(yōu)選的配體不結(jié)合內(nèi)源把化合物的活性部位。本文所述的配體基本上不抑制它們所結(jié)合的內(nèi)源靶化合物的活性，而且當(dāng)與配體結(jié)合時，內(nèi)源靶化合物保持活性。例如，可溶性受體與本發(fā)明的配體結(jié)合，而且所得受體-配體復(fù)合物中的可溶性受體可結(jié)合可溶性受體的內(nèi)源配體。在另一實例中，酶與本發(fā)明的配體結(jié)合，而且所得酶-配體復(fù)合物中的酶可結(jié)合底物并催化酶促反應(yīng)。通常，配體抑制它們所結(jié)合的內(nèi)源扭化合物的活性不超過約10%、不超過約9%、不超過約8%、不超過約7%、不超過約6%、不超過約5%、不超過約4%、不超過約3%、不超過約2%、不超過約1%,或者對內(nèi)源靶化合物的活性基本上沒有抑制效應(yīng)。在某些實例中，基本上不抑制它們所結(jié)合的內(nèi)源靶化合物活性的配體，抑制所述內(nèi)源靶化合物活性的高抑制濃度50(IC50),例如IC50為至少1毫獨b擎爾、至少10毫樣t摩爾、至少100毫4殷摩爾、至少1獨摩爾、或至少IO微摩爾?？梢圆捎煤线m的體外或體內(nèi)測定，評價配體抑制內(nèi)源耙化合物活性的能力。許多合適的測定是本領(lǐng)域眾所周知的并常規(guī)用于評價化合物的抑制活性。例如，可以采用本文所述的內(nèi)毒素休克或TNF誘發(fā)的皮膚壞死(參見Sheehan等，J.Med.，181:607-611(1995》和/或體外受體結(jié)合測定、L929細(xì)胞毒性測定、HeLaIL-8測定或MRC-5IL-8釋放測定的體內(nèi)模型，評價包含具有TNFR1結(jié)合位點的部分的配體抑制TNFR1活性的能力。評價配體是否抑制所需內(nèi)源扭化合物活性的其它合適測定，例如本文所述的那些測定，都是本領(lǐng)域眾所周知的。配體本身一般不具有基本的治療活性，但用于利用和開發(fā)內(nèi)源靶化合物的活性，用于治療或i貪斷目的。在某些實施方案中，在用于內(nèi)源革巴化合物活性的合適體外測定中，配體不具有基本的活性。例如，與在同樣的測定(但不含配體)中內(nèi)源耙化合物的活性相比，在測定中，結(jié)合內(nèi)源靶化合物并延長內(nèi)源靶化合物半衰期的配體一般不會改變內(nèi)源革巴化合物的活性。采用任何合適方法，可以鑒定能結(jié)合所需內(nèi)源靶化合物(例如受體蛋白、可溶性激動劑(例如細(xì)胞因子)或酶)、但不結(jié)合內(nèi)源靶化合物的活性部位的配體(例如dAb)。例如，在合適的竟?fàn)帨y定中，可以篩選具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的單個配體、或部分或這些部分的集合(例如文庫或庫)，其中在配體或部分(或者配體或部分的集合)存在下，評價內(nèi)源結(jié)合配偶體(例如天然配體、底物、輔因子)與內(nèi)源華巴化合物的結(jié)合。相對于合適的對照而言，內(nèi)源結(jié)合配偶體與內(nèi)源耙化合物的結(jié)合基本上沒有減少(例如抑制)，這表明所篩選的配體或部分不結(jié)合內(nèi)源草巴化合物的活性部位。本領(lǐng)域熟知許多合適的測定方法，用于篩選包含內(nèi)源靶化合物(例如酶、受體(例如細(xì)胞因子受體、生長因子受體)和可溶性激動劑(例如細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、激素)的結(jié)合位點的配體和部分。另外，竟?fàn)帨y定常規(guī)用于篩選含有106至109以上成員的化合物集合。因此，這樣的活性篩選是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員并不認(rèn)為是難以承擔(dān)的或不適當(dāng)?shù)摹＠?，在合適的竟?fàn)幍唤Y(jié)合其活性部位的能力WO03002609、WO2004101790、WO2005035572、WO2004061026、WO2004003019、WO2004058821、WO9404678、WO9749805、WO9923221、WO9937681、WO0024884、WO0043507、WO0065067、WO0140310、WO03035694、WO03053531、WO03054015、WO0305527、WO2004015425、WO2004041862、WO2004041863、WO2004041865、WO2004062551、WO2005044858和EP1134231。上述文獻(xiàn)中的可變區(qū)、它們的序列中，以便給技術(shù)人員提供具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分的實例，用于本發(fā)明。配體可延長它們所結(jié)合的內(nèi)源靶的半衰期，增加患者體內(nèi)它們所結(jié)合的內(nèi)源靶的數(shù)量(例如全身數(shù)量、所需部位或位置的數(shù)量)和/或增加它們所結(jié)合的內(nèi)源靶的生物利用度。配體可延長它們所結(jié)合的內(nèi)源把化合物的半衰期，例如通過結(jié)合內(nèi)源輩巴化合物并因此增加內(nèi)源把化合物的流體動力學(xué)尺寸，通過結(jié)合內(nèi)源靶化合物和使內(nèi)源靶化合物穩(wěn)定，或者通過結(jié)合和延緩內(nèi)源耙化合物清除或代謝速率。通常，相對于配體不存在下的內(nèi)源靶化合物半衰期而言，配體可延長它們所結(jié)合的內(nèi)源靶化合物的半衰期達(dá)至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍。例如，內(nèi)源把化合物的半衰期約1小時，而在給予包含能結(jié)合所述內(nèi)源革巴化合物結(jié)合位點的部分的配體之后，內(nèi)源耙化合物的半衰期增加到約1.5小時、至約10小時以上。在給予本文所述的配體之后，內(nèi)源靶化合物的水平或數(shù)量增加是因為配體半衰期增加的結(jié)果。例如，在給予本發(fā)明配體后的1小時、或2小時、或3小時、或4小時、或5小時、或6小時、或7小時、或8小時、或9小時、或10小時、或11小時、或12小時、或1天，內(nèi)源靶配體的水平或數(shù)量(例如在血清中)可增加至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約500倍、至少約1,000倍、至少約5,000倍、至少約10，000倍、至少約50,000倍、或至少約100,000倍?？梢圆捎萌魏魏线m方法，容易地測定內(nèi)源靶化合物增加的水平或數(shù)量。例如，在給予配體之前、在給予之后的一個或多個時間點獲取合適的樣品(例如血清)，然后用合適方法測定樣品中內(nèi)源靶化合物的水平或數(shù)量。樣品可以是例如血液、血清、腦脊液、滑液、支氣管肺泡灌洗液、灌腸樣品或活檢樣品。在某些實施方案中，相對于給予配體之前的數(shù)量或水平而言，這類樣品中配體的數(shù)量或水平增力口。配體可增加內(nèi)源靶化合物的生物利用度?？梢栽谌砘蛟谒枳饔貌课?例如在局部給予配體的部位)增加生物利用度。例如，配體可結(jié)合在體循環(huán)中具有有益活性、但卻快速分布到組織中或被清除的內(nèi)源靶化合物(例如甾體或肽激素)，并延緩分布或清除速率。這類配體可增加體循環(huán)中內(nèi)源革巴化合物的生物利用度，在此內(nèi)源靶化合物的活性可起到有益效果(例如治療效果)。配體可通過將內(nèi)源靶化合物募集到所需部位，從而增加該部位的內(nèi)源靶化合物的生物利用度。例如，可將包含所需內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的配體局部給予患者(例如作為緩釋型制劑)。局部給予的配體可結(jié)合所需內(nèi)源靶化合物并將額外的內(nèi)源靶化合物募集到該部位。因此，在該部位內(nèi)源靶化合物水平或數(shù)量的增加可產(chǎn)生有益的效果。例如，在一個實施方案中，配體包含TGF(3同種型3的結(jié)合位點的部分?？删植拷o予這樣的配體，以結(jié)合TGF(3同種型3并將TGFf3同種型3募集到局部給藥部位，因而促進(jìn)傷口愈合。采用本文所述的方法，可制備包含所需細(xì)胞表面靶結(jié)合位點的部分的類似配體，用于例如將所需細(xì)胞類型募集到所需部位(例如損傷部位、炎癥部位)。通常，相對于配體不存在時的內(nèi)源輩巴化合物的生物利用度而言，配體可增加它所結(jié)合的內(nèi)源靶化合物的生物利用度(例如在體循環(huán)中，在所需作用部位上)達(dá)至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍。例如，當(dāng)配體增加體循環(huán)中的生物利用度時，可以繪制從給予配體時開始的內(nèi)源配體濃度時間曲線，并與內(nèi)源靶配體的正常體內(nèi)水平進(jìn)行比較，確定系統(tǒng)生物利用度的范圍。配體可增加它們所結(jié)合的內(nèi)源把的活性(例如結(jié)合活性)。例如，配體可結(jié)合內(nèi)源靶化合物(例如內(nèi)源激動劑(例如細(xì)胞因子)或可溶性細(xì)胞因子受體)，并通過增加內(nèi)源靶化合物對其內(nèi)源結(jié)合配偶體的親和力和/或親合力而提高內(nèi)源靶化合物的結(jié)合活性。配體的某一部分包含兩個或更多個對所需內(nèi)源靶化合物具有結(jié)合特異性的結(jié)合位點，則該配體可結(jié)合兩個以上單獨的內(nèi)源把化合物分子，因而產(chǎn)生內(nèi)源靶化合物的二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體。這樣的二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體因較高的親合力而對例如表達(dá)內(nèi)源靶化合物的天然結(jié)合配偶體的細(xì)胞具有改進(jìn)的結(jié)合活性。通常，這樣的配體能提高內(nèi)源靶化合物結(jié)合活性。例如，與內(nèi)源靶化合物單體(即未與本發(fā)明配體形成復(fù)合物)的結(jié)合強(qiáng)度相比，內(nèi)源革巴化合物二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體對其結(jié)合配偶體的結(jié)合強(qiáng)度(例如親和力或親合力)強(qiáng)至少約10倍、至少約100倍、至少約IOOO倍或至少約10,000倍。在一個實例中，配體包含具有所需內(nèi)源激動劑(例如細(xì)胞因子、生長因子)結(jié)合特異性的結(jié)合位點的兩個以上部分，并結(jié)合兩個以上內(nèi)源激動劑分子，因而產(chǎn)生內(nèi)源激動劑二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體。這樣的二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體因較高的親合力而對例如表達(dá)內(nèi)源激動劑的受體的細(xì)胞具有改進(jìn)的結(jié)合活性，因而具有改善的療效。同樣，包含可溶性受體(例如可溶性TNFR1)的兩個以上結(jié)合位點的配體也可增加可溶性受體(例如可溶性TNFR1)的結(jié)合活性。這樣的配體可結(jié)合例如兩個可溶性受體鏈，形成可溶性受體二聚體，與單個受體鏈相比，該二聚體結(jié)合受體的內(nèi)源配體的親合力更高。在一個具體的實施方案中，配體包含具有可溶性TNFR1結(jié)合特異性、但不結(jié)合其活性部位(可溶性TNFR1的活性部位包含在域2和域3內(nèi))的兩個以上部分(dAb)。這樣的配體可結(jié)合兩個或更多可溶性TNFR1鏈，形成可溶性TNFR1二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體，它們因親合力增加而對其三聚體配體TNF具有改進(jìn)的結(jié)合活性。也可以理解，比單個可溶性TNFR1鏈的流體動力學(xué)尺寸更大的這類可溶性TNFR1二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體，其半衰期也會比單個TNFR1更長。因此，這樣的配體可提高可溶性TNFR1的TNF抑制活性并改善其療效。例如，這樣的配體可提高可溶性TNFR1的功效至少約10倍、至少約100倍、至少約1,000倍或至少約10,000倍。在該實施方案的一個實例中，采用作為結(jié)合小鼠TNFR1域l的dAb二聚體的配體，證明誘導(dǎo)可溶性TNFR1二聚化的配體提高了可溶性TNFR1的功效。例如，可以將這樣的配體加入到含有人MRC5細(xì)胞、人TNF和可溶性小鼠TNFR1的測定中?？扇苄孕∈骉NFR1將與MRC5細(xì)胞上的人TNFR1竟?fàn)幮越Y(jié)合人TNF。作為結(jié)合小鼠TNFR1域1的dAb二聚體的配體可結(jié)合兩條可溶性小鼠TNFR1鏈，形成小鼠TNFR1二聚體，這樣的二聚體在測定中能更有效抑制TNF效應(yīng)。例如，加入誘導(dǎo)可溶性TNFR1二聚化的配體，可使小鼠TNFR1的IC50從毫孩i摩爾范圍降至皮摩爾范圍(降低約10倍或約100倍或約1000倍)。將誘導(dǎo)可溶性受體鏈二聚化(或三聚化或寡聚化)的配體給予患者，可引起細(xì)胞表面表達(dá)的某些受體跨膜形式的成簇和活化。通常，與改進(jìn)的二聚化可溶性受體的結(jié)合功能和功效相比，這類活化的任何不想要的效果(例如免疫細(xì)胞的活化)可以最小化。盡管如此，如有必要，還可按本文所述來改造配體，以增加其流體動力學(xué)尺寸，從而進(jìn)一步減少二聚化、三聚化或寡聚化配體與受體跨膜形式的相互作用。例如，可將配體改造成包含PEG部分或其它半衰期延長部分，例如具有體內(nèi)延長半衰期的多肽結(jié)合位點的部分(例如結(jié)合血清白蛋白的dAb)。如本文所述，在基于細(xì)胞的測定中，采用結(jié)合TNFR1的dAb,dAb的PEG化明顯降低了dAb抑制TNFR1活性的能力，但是在近似于體內(nèi)結(jié)合可溶性TNFRl的條件的受體結(jié)合測定中，對dAb結(jié)合TNFRl的能力幾乎沒有影響。這些結(jié)果表明，PEG化dAb和包含兩個或更多dAb的配體改進(jìn)了dAb對可溶性受體(而不是跨膜形式的受體)的選擇性。一些內(nèi)源耙化合物天然結(jié)合在一起，形成活性二聚體、三聚體或多聚體。因此，具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分可以是內(nèi)源靶化合物本身或內(nèi)源把化合物的片段或部分。在某些實施方案中，例如當(dāng)具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分就是內(nèi)源靶化合物時，配體可具有內(nèi)源靶化合物的活性。因此，給予這樣的配體，如上所述，可增加內(nèi)源靶化合物的半衰期，增加內(nèi)源靶化合物的生物利用度、增加內(nèi)源把化合物的數(shù)量和/或增加內(nèi)源耙化合物的活性，并且還可因配體中存在內(nèi)源耙化合物的生物活性形式而提供額外的內(nèi)源靶化合物活性。在其它實施方案中，配體可包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分，所述部分是內(nèi)源靶化合物的部分。例如，內(nèi)源靶化合物的部分可以是體內(nèi)結(jié)合內(nèi)源靶化合物、但沒有內(nèi)源靶化合物的活性(例如配體結(jié)合活性、受體結(jié)合活性、催化活性)的部分。天然形成二聚體、三聚體或多聚體的內(nèi)源耙化合物的實例包括例如生長因子(例如形成A和B鏈的同型二聚體和異型二聚體的PDGF)、細(xì)胞因子(例如形成三聚體的TNF超家族(例如RANK-L)的細(xì)胞因子)和受體(例如形成三聚體的TNF受體超家族受體)。根據(jù)內(nèi)源靶化合物的二聚體、三聚體或多聚體形成結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)方面的知識，或者通過制備內(nèi)源靶化合物的肽或多肽片段并測定肽或多肽結(jié)合內(nèi)源靶化合物的能力(例如采用表面等離子共振或任何其它合適方法)，可以容易地制備這類內(nèi)源輩巴化合物的合適部分。是所謂的TNF受體超家族成員的前配體裝配域(PLAD)。(參見例如WO01/58953;美國專利申請公布號2003/0108992Al;Deng等，AtowreMW/c/we,doi:10.1038/nml304(2005))。來自特定受體的PLAD域在體內(nèi)彼此結(jié)合。例如，TNFR1的PLAD域在體內(nèi)可結(jié)合另一TNFR1的PLAD域。TNF受體超家族是一組本領(lǐng)域公知的蛋白質(zhì)，包括TNFR1(p55、CD120a、p60、TNF受體超家族成員1A、TNFRSF1A)、TNFR2(p75、p80、CD120b、TNF受體超家族成員1B、TNFRSF1B)，CD(TNFRSF3,LTf3民TNFR2-RP,TNFR-RP'TNFCR，TNF-R-IH)，OX40(TNFRSF4,ACT35，TXGP1L),CD40(TNFRSF5，p50,Bp50),Fas((JDy5，TNFRSF6，AP0-1，APTI)，DcR3(TNPRSF6B),CD27(TNFRSF7，Tp55，S152)，CD30(TNFRSF8，Ki-l，D1S166B),CD137(TNFRSF9，4-lBB，ELA)，TRAILR-1(TNFRSF10A，DR4，Apo2)，TRAIL-R2(TNIRSF10B，跳KILLER,TRICK2A,TRICKB)，TRAILR3(TNFRSF10C，DcRl，LIT,TRID),TRAILR4(麗RSF10D,DcR2，TRUNDD),RANK(TNFRSF11A),OPG(TNFRSF1IB,OCIF，TR1)，DR3(TNFRSF12，TRAMP，WSL"l,LARD，WS"R,DDR3，TR3，APO-3)，DR3L(TNFRSF12L),TAC1(TNFRSF13B),BAFFR(TNFRSF13C),HVEM(，RSF14，ATAR,TR2，LIGHTR,HVEA)，NGFR(TNFRSF16),BCMA(窗RSF17，BCM)，AITR(TNFRSF18，GITR)，，RSF19，F(xiàn)LJ兩3(TNFRSF19L，RELT)，DR6(TNFRSF21)，SOBa(TNFRSF22,Tnfrh2,281002,Rik),mSOB(THFRSF23,Tnfihl).一些PLAD域是本領(lǐng)域已知的，而其它PLAD域和PLAD域的變異體可以采用任何合適方法容易地分離和制備，所述方法例如以下文獻(xiàn)所述的方法WO01/58953;美國專利申請公布號2003/0108992Al;Deng等，Mm^eMe^c,力e，doi:10.1038/腿1304(2005)。多肽、蛋白質(zhì)片段和肽變異體的許多合適制備方法，以及合適的結(jié)合測定(例如本文所述的TNFR1受體結(jié)合測定)都是本領(lǐng)域眾所周知的，也是常規(guī)的。示例性的PLAD域見表1。表l受體PLAD域TNFR1CysProGinGlyLysTyrlieHisPrciGinAsnAsnSerlieCysCysThrLysCysHisLysGlyThrTyrLeuTyrAsnAspCysProGiyProGlyGinAspThrAspCy曰(SEQIDNO:28)TNFR2CysArgLeuArgGluTyrTyrAspGinThrAlaGinMetCysCysSerLysCysSerProGlyGinHisAlaLysValPheCysThrLysThrSearAspThrValCys(SEQE)NO:29)FASArgLeuSerSerLysSerValAsnAlaGinValThrAsplieAsnSerLysGlyLeuGluLeuArgLysThrValTharTha:ValGluThrGinAsnLeuGluGlyLeuHisHisAspGlyGinPheCys(SEQIDNO:30)FASArgLeuSerSerLysSerValAsnA工aGflnValThr<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>在某些實施方案中，配體包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分，該部分是PLAD,例如TNFRl、TNFR2、FAS、LT(3R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40、DR4或其它TNF受體超家族成員的PLAD,或PLAD域的變異體。PLAD域的變異體可以是例如TNFRl、TNFR2、FAS、LT(3R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40或DR4的PLAD域，其中已經(jīng)缺失、插入或取^^了一個或多個氨基酸，但仍保留與TNFRl、TNFR2、FAS、LTpR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40或DR4的相應(yīng)PLAD的結(jié)合能力。PLAD域變異體的氨基酸序列可包括至少約10個毗鄰氨基酸、至少約15個毗鄰氨基酸、至少約20個毗鄰氨基酸、至少約25個毗鄰氨基酸、至少約30個毗鄰氨基酸、至少約35個毗鄰氨基酸或至少約40個毗鄰氨基酸的區(qū)域，這些氨基酸與相應(yīng)PLAD(例如TNFR1、TNFR2、FAS、LTpR、CD40、CD30、CD27、HVEM、0X40、DR4的PLAD)氨基酸序列中的氨基酸相同。另外，或者，PLAD域變異體的氨基酸序列可以與相應(yīng)PLAD(例如TNFR1、TNFR2、FAS、LT(3R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40或DR4的PLAD)具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%同一性。作為PLAD或PLAD變異體、包含具有內(nèi)源把化合物結(jié)合位點的結(jié)合部分的配體可以按本文所述進(jìn)行改造。例如，配體可以是PLAD或PLAD變異體的二聚體、三聚體或多聚體，或者是包含PLAD或PLAD變異體和半衰期延長部分(例如具有血清白蛋白或新生動物Fc受體結(jié)合位點的部分)的融合蛋白。包含兩個或更多PLAD或PLAD變異體(例如PLAD二聚體、三聚體、多聚體)的配體可結(jié)合兩個或更多可溶性受體鏈，形成可溶性受體二聚體、三聚體或多聚體，與可溶性受體單體相比，它們?nèi)绫疚乃鼍哂懈倪M(jìn)的結(jié)合功能。在某些情況下，這樣的配體可結(jié)合可溶性受體，而且也結(jié)合細(xì)胞表面表達(dá)的受體的跨膜形式。如有必要，使用例如PEG部分、或本文所述的其它半衰期延長部分來改造配體，使之具有較大的流體動力學(xué)尺寸，可改善結(jié)合可溶性受體的選擇性。在具體的實施方案中，配體包含PLAD(例如TNFR1、TNFR2、FAS、LT(3R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40或DR4的PLAD)或PLAD變異體和半衰期延長部分，例如PEG部分或結(jié)合血清白蛋白或新生動物Fc受體的dAb。在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞測定中，誘導(dǎo)可溶性受體鏈二聚化(或三聚化或寡聚化)的優(yōu)選配體基本上不激動細(xì)胞表面受體或跨膜形式的受體(即當(dāng)濃度為1nM、10nM、100nM、1|tiM、10|iM、100fiM、1000pM或5,000pM時，在測定中，導(dǎo)致不超過約5%的由受體的天然配體所誘導(dǎo)的受體介導(dǎo)的活性)。優(yōu)選具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分以高親和力結(jié)合內(nèi)源靶化合物，例如經(jīng)表面等離子共振測定，Kd為300nM5pM(即3x10.7M~5x10.12M)、優(yōu)選50nM20pM、更優(yōu)選5nM200pM和最優(yōu)選1nM-lOOpM、例如1x10_7M以下、優(yōu)選1x10-8M以下、更優(yōu)選1xl(r9M以下、有利的是1x10"GM以下和最優(yōu)選1x10-11M以下；和/或K解離速率常數(shù)為5x10"s"~lxl(T7s"，優(yōu)選1xIO-2s"~1xIO.6s",更優(yōu)選5x10-3s'11x10墨5s.1,伊B口5x10"s隱1以下、優(yōu)選lxl(^s"以下、有利的是lx10'、"以下、更優(yōu)選lxio-4s"以下、還更優(yōu)選1xlO-Y1以下和最優(yōu)選1x10-6s—1以下。具有內(nèi)源革巴化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點并以高親和力結(jié)合內(nèi)源靶化合物的部分可以改造成本文所述的〗壬何合適的配體形式。除了本文所述的配體的特征之外，優(yōu)選配體以高親和力結(jié)合內(nèi)源耙化合物，例如經(jīng)表面等離子共振測定，Kd為300nM5pM(即3x10'75x10-12M)、優(yōu)選50nM~20pM、更優(yōu)選5nM~200pM和最優(yōu)選1nM100pM、例如1xIO-7M以下、優(yōu)選1x10'8M以下、更優(yōu)選1x10-9M以下、有利的是1x10"。M以下和最優(yōu)選1x10-11M以下；和/或K解離速率常數(shù)為5x10"s"1xIO-7s"、優(yōu)選1x10.2s11xIt)'6s'1、更優(yōu)選5xIO-3s-'1xIO-5s"、例如5x10-'s-1以下、優(yōu)選1xIt)-2s—1以下、有利的是1x10—3s—1以下、更優(yōu)選1x10"4s"以下、還更優(yōu)選1x10—5s—1以下、最優(yōu)選1x10—6s—1以下。在某些實施方案中，配體包含結(jié)合內(nèi)源靶化合物的dAb。內(nèi)源革巴化合物可以是例如可溶性受體(例如可溶性細(xì)胞因子受體、可溶性生長因子受體、可溶性激素受體)、內(nèi)源受體拮抗劑(例如IL-lra)、酶、內(nèi)源激動劑(例如細(xì)胞因子、生長因子、激素)。在某些實施方案中，配體是dAb二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體。配體可包含具有內(nèi)源把化合物結(jié)合位點的部分，其中所述具有內(nèi)源耙化合物結(jié)合位點的部分選自親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)和avimer。配體也可包含具有內(nèi)源把化合物結(jié)合位點的部分，其中該部分是抗體或抗體片段，例如Fv片段、單鏈Fv片段、二硫鍵連接的Fv片段、Fab片辜殳、Fab'片段、F(ab、片段、雙鏈抗體、免疫球蛋白單可變區(qū)(例如人VH、人Vl、Vhh)。如有必要，配體還可包含本文所述的半衰期延長部分。例如，配體可包含選自以下的半衰期延長部分聚烷二醇部分、血清白蛋白或其片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或其轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分、或者包含體內(nèi)延長半衰期的多肽結(jié)合位點的部分。合適的包含延長體內(nèi)半衰期的多肽結(jié)合位點的部分包括親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)、avimer、抗體或抗體片段，例如Fv片段、單鏈Fv片段、二硫鍵連接的Fv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、雙鏈抗體和免疫球蛋白單可變區(qū)(例如人VH、人Vl、Vhh)。如本文所述，本發(fā)明的配體基本上不抑制它們所結(jié)合的內(nèi)源靶化合物的活性。然而，當(dāng)耙標(biāo)具有不止一種活性(例如結(jié)合活性和信號傳導(dǎo)活性)時，配體可抑制與預(yù)期治療活性或益處無關(guān)的活性。例如，配體或dAb單體可結(jié)合可溶性受體，也可結(jié)合跨膜形式的受體。在這種情況下，跨膜形式的受體可具有配體結(jié)合活性和信號傳導(dǎo)活性。優(yōu)選本發(fā)明的配體不抑制配體結(jié)合活性(可溶性和跨膜形式的受體的結(jié)合活性)，這起到抑制配體誘導(dǎo)的過程的作用，也可抑制跨膜形式的受體信號傳導(dǎo)活性。為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，能結(jié)合可溶性TNFR1的配體的示例性實施方案描述如下。能結(jié)合可溶性TNFR1的配體的實施方案是說明性的結(jié)合其它受體的本發(fā)明配體。TNFR1是含有胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的跨膜受體，其中胞外區(qū)能結(jié)合配體，胞內(nèi)區(qū)缺乏內(nèi)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、但能結(jié)合信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。TNFR1與結(jié)合TNF的復(fù)合物含有3條TNFR1鏈和3條TNF鏈。(Banner等,Ce〃,75(3)431-445(1993))。TNF配體以三聚體形式存在，它與3條TNFR1鏈結(jié)合(出處同上)。這3條TNFR1鏈在受體-配體復(fù)合物中緊密簇集在一起，這種簇集是TNFR1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的先決條件。事實上，當(dāng)TNF不存在時，結(jié)合TNFR1的多價物質(zhì)(例如抗TNFR1抗體)可誘導(dǎo)TNFR1成簇和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且通常用作TNFR1激動劑。(參見例如Belka等，￡M5(9,14(6):1156-1165(1995);Mandik-Nayak等,J./聽,/.,167:1920-1928(2001))。因此，與TNFR1結(jié)合的多價物質(zhì)通常并非有效的TNFR1拮抗劑，甚至當(dāng)它們阻斷TNFa與TNFR1的結(jié)合時。TNFR1的胞外區(qū)包含13個氨基酸的氨基端區(qū)段(SEQIDNO:2(人)的氨基酸1-13;SEQIDNO:4(小鼠)的氨基酸1-13)、域1(SEQIDNO:2(人)的氨基酸14-53;SEQIDNO:4(小鼠)的氨基酸14-53)、域2(SEQIDNO:2(人)的氨基酸54-97;SEQIDNO:4(小鼠)的氨基酸54-97)、域3(SEQIDNO:2(人)的氨基酸98-138;SEQEDNO:4(小鼠)的氨基酸98-138)和域4(SEQIDNO:2(人)的氨基酸139-167;SEQIDNO:4(小鼠)的氨基酸139-167)，其后接著是膜近端區(qū)(SEQIDNO:2(人)的氨基酸168-182;SEQIDNO:4(小鼠)的氨基酸168-183)。(參見Banner等，Ce〃73(3)431-445(簡)和Loetscher等，Ce〃61(2)351-359(1990))。域2和域3接觸結(jié)合配體(TNF(3、TNFa)。(Banner等，Ce〃,73(3)431-445(1993))。TNFR1胞外區(qū)也含有一個稱為前配體結(jié)合裝配域(簡稱PLAD域)的區(qū)(SEQIDNO:2(人)的氨基酸1-53;SEQIDNO:4(小鼠)的氨基酸1-53)(美國政府，WO01/58953;Deng等，M^/reMe&c/we，doi:10.1038/nml304(2005))。TNFR1通過蛋白水解等過程在體內(nèi)從細(xì)胞表面脫落，產(chǎn)生可溶性形式的TNFR1，所述過程包括TNFR1在域4或在膜近端區(qū)(SEQIDNO:2的氨基酸168-182;SEQIDNO:4的氨基酸168-183)的蛋白水解。可溶性TNFR1保留了結(jié)合TNFoc的能力，因此起到TNFa活性的內(nèi)源抑制劑的作用。在某些實施方案中，結(jié)合可溶性TNFR1的配體或dAb單體也可結(jié)合跨膜TNFRl并抑制由TNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞表面上TNFRl的成簇，這樣的成簇能導(dǎo)致通過受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但不抑制TNFa與跨膜TNFRl和可溶性TNFRl的結(jié)合。在具體的實施方案中，配體或dAb單體不抑制可溶性和跨膜形式的TNFRl的TNF結(jié)合活性，但卻抑制TNFRl的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。這類配體或dAb單體可結(jié)合TNFRl的域1或域4。這樣的配體或dAb單體可結(jié)合可溶性TNFRl和跨膜TNFRl，但卻不抑制兩種形式的TNFRl的TNF結(jié)合活性。因此，可以給予這樣的配體或dAb，以便例如延長可溶性TNFRl的半衰期或增強(qiáng)可溶性TNFRl的結(jié)合活性。因此，將這樣的配體或dAb單體給予有需要的哺乳動物，可利用并開發(fā)內(nèi)源調(diào)節(jié)途徑，該途徑抑制細(xì)胞表面TNFRl的活性，從而用于治療目的。在其它實施方案中，本發(fā)明提供類似的配體和dAb單體，它們結(jié)合其它可溶性受體、但卻不抑制內(nèi)源配體與可溶性受體的結(jié)合。在更具體的實施方案中，配體包含dAb，其能結(jié)合TNFRl的域1并與TAR2m-21-23竟?fàn)幮越Y(jié)合小鼠TNFRl或者與TAR2h-205竟?fàn)幮越Y(jié)合人TNFRl。在更具體的實施方案中，配體是這樣的dAb的二聚體，而且如有必要還包含PEG部分。在某些實施方案中，配體或dAb單體基本上能抵抗聚集。例如，在某些實施方案中，當(dāng)將l誦5mg/ml、5-10mg/ml、10-20mg/ml、20-50mg/ml、50-100mg/ml、100-200mg/ml或200-500mg/ml配體或dAb溶液溶于藥物配制常用溶劑(例如鹽水、緩沖鹽水、檸檬酸緩沖鹽水、水、乳化劑和任何這些含有可接受的賦形劑的溶劑，所述賦形劑例如由FDA批準(zhǔn)的賦形劑)中，在約22。C、22國25。C、25誦30。C、30-37。C、37-40°C、40-50°C、50國60。C、60-70°C、70-80°C、15-2(TC、10-15°C、5誦10。C、2-5°C、0曙2。C、-l(rc至(rc、-20€至畫10°<:、-40匸至國20°(:、-601!至-401:或-80匸至-601:的溫度下，保持一段時間，例如約10分鐘、l小時、8小時、24小時、2天、3天、4天、1周、2周、3周、l月、2月、3月、4月、6月、l年或2年時，小于約10%、小于約9%、小于約8%、小于約7%、小于約6%、小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%或小于約1%的配體或dAb單體會聚集起來。可采用顯微鏡檢、通過目測或分光鏡檢測定溶液濁度等任何合適方法，對聚集進(jìn)行評價。優(yōu)選通過動態(tài)光散射來評價聚集。抗聚集的配體或dAb單體具有若干優(yōu)勢。例如，通過采用合適的生物生產(chǎn)系統(tǒng)(例如大腸桿菌)進(jìn)行表達(dá)，容易以可溶性蛋白質(zhì)的形式產(chǎn)生這類配體或dAb單體并且收率高，然后可以比常規(guī)多肽更高的濃度來配制和/或貯存，同時聚集和活性的損失較低。另外，生產(chǎn)抗聚集的配體或dAb單體，可以比生產(chǎn)其它抗原或表位結(jié)合多肽(例如常規(guī)抗體)更經(jīng)濟(jì)。例如，用于體內(nèi)應(yīng)用的抗原或表位結(jié)合多肽的制備通常包括除去聚集多肽的過程(例如凝膠過濾)。如果不能除去這樣的聚集物，會使制劑不適用于體內(nèi)應(yīng)用，例如，因為希望起到拮抗劑作用的抗原結(jié)合多肽如果聚集的話，可通過誘導(dǎo)靶抗原的交聯(lián)或成簇而起到激動劑的作用。蛋白聚集物也可通過在接受它們的患者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答而降低治療性多肽的功效。相比之下，可以制備本發(fā)明的抗聚集配體或dAb單體，用于體內(nèi)應(yīng)用，而無需包括除去聚集物的方法步驟，并且可用于體內(nèi)應(yīng)用，而沒有聚集多肽所引起的上述缺點。在某些實施方案中，配體或dAb單體當(dāng)加熱到溫度(Ts)和冷卻到溫度(Tc)時能可逆地解折疊，其中Ts高于dAb的解鏈溫度(Tm),而Tc低于dAb的解鏈溫度。例如，dAb單體當(dāng)加熱到80。C和冷卻到約室溫時能可逆地解折疊?？赡娴亟庹郫B的多肽在解折疊時會喪失功能，而一旦重折疊后又會恢復(fù)功能。這類多肽不同于在解折疊時聚集或不適當(dāng)重折疊(即不能恢復(fù)功能)的多肽(錯折疊的多肽)?？梢圆捎萌魏魏线m方法，通過直接或間接測定多肽結(jié)構(gòu)來評價多肽解折疊和重折疊。例如，可以通過圓二色性(CD)(例如遠(yuǎn)UVCD、近UVCD)、焚光(例如色氨酸側(cè)鏈的焚光)、對蛋白酶解的敏感性、核磁共振(NMR)，或者通過檢測或測定依賴于合適折疊的多肽功能(例如與靶配體的結(jié)合、與通用配體的結(jié)合)，來測定多肽結(jié)構(gòu)。在一個實例中，采用功能測定，評價多肽解折疊，其中結(jié)合功能(例如結(jié)合通用配體和/或靶配體，結(jié)合底物)的喪失，表明該多肽是解折疊的?？梢圆捎媒庹郫B或變性曲線，測定配體或dAb單體的解折疊和重折疊的程度?？赏ㄟ^縱坐標(biāo)為溫度與橫坐標(biāo)為折疊多肽相對濃度作圖，繪制解折疊曲線。可以采用任何合適的方法(例如CD、熒光、結(jié)合測定)，直接或間接測定折疊配體或dAb單體的相對濃度。例如，可以制備配體或dAb單體溶液，然后通過CD測定溶液的橢圓率。所得橢圓率值表示折疊配體或dAb單體的相對濃度為100%。再通過逐漸升高溶液溫度，使溶液中的配體或dAb單體解折疊，然后以合適增量(例如溫度每升高一度后)測定橢圓率。然后通過逐漸降低溶液溫度，使溶液中的配體或dAb單體重折疊，再以合適增量測定橢圓率?？梢詫?shù)據(jù)作圖，繪制解^t疊曲線和重折疊曲線。解折疊曲線和重折疊曲線具有特征性的S形，它包括配體或dAb單體分子折疊部分，配體或dAb單體分子解折疊到不同程度時的解折疊/重折疊轉(zhuǎn)換部分，以及配體或dAb單體分子解折疊部分。重折疊曲線的Y軸截距是恢復(fù)的重折疊配體或dAb單體的相對數(shù)量。至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%的恢復(fù)，表明配體或dAb單體可逆地解折疊。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過制備配體或dAb單體溶液并繪制加熱解折疊和重折疊曲線，測定配體或dAb單體解折疊的可逆性?？梢栽谌魏魏线m溶劑中制備配體或dAb單體溶液，所述溶劑例如含水緩沖液，其pH適于讓配體或dAb單體溶解(例如pH比等電點(pl)約高或低3個單位)。配體或dAb單體溶液足夠濃，以便可檢測出解折疊/折疊。例如，配體或dAb單體溶液可以是約O.l)iiM至約100(aM、或優(yōu)選約l)iM至約10|uM。如果配體或dAb單體的解鏈溫度(Tm)是已知的，則可將溶液加熱至比Tm低約10度(Tm-10)，然后通過橢圓率或焚光(例如遠(yuǎn)-UVCD掃描可從200nm至250nm，固定波長CD為235nm或225nm;色氨酸熒光發(fā)射光語為300-450nm,激發(fā)為298nm)進(jìn)行評價折疊曲線，以提供100%的相對折疊配體或dAb單體。再按預(yù)定增量(例如約0.1度至約1度的增加)，將溶液加熱至比Tm高至少10度(Tm+10),在每次增量時測定橢圓率或熒光。然后，按預(yù)定增量，通過冷卻到至少Tm-lO，使配體或dAb單體重折疊，在每次增量時測定橢圓率或熒光。如果不知道配體或dAb單體的解鏈溫度，可以通過從約25°C至約IO(TC逐漸增量加熱，使溶液解折疊，再逐漸增量冷卻到至少約25。C使其重折疊，在每次加熱和冷卻增量時測定橢圓率或熒光?？梢詫λ脭?shù)據(jù)作圖，繪制解折疊曲線和重折疊曲線，其中重折疊曲線的Y軸截距是恢復(fù)的重折疊蛋白質(zhì)的相對數(shù)量。配體或dAb單體可包含任何合適的免疫球蛋白可變區(qū)、優(yōu)選包含人可變區(qū)或包含人構(gòu)架區(qū)的可變區(qū)。在某些實施方案中，dAb單體包含本文所述的通用構(gòu)架。通用構(gòu)架可以是Vt構(gòu)架(VX或Vk),例如包含由人種系DPKl、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPKIO、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26或DPK28免疫球蛋白基因區(qū)段所編碼的構(gòu)架氨基酸序列的構(gòu)架。如有必要，vl構(gòu)架還可包含由人種系JK1、JK2、JK3、JK4或JK5免疫球蛋白基因區(qū)段所編碼的構(gòu)架氨基酸序列。在其它實施方案中，通用構(gòu)架可以是vh構(gòu)架，例如包含由人種系DP4、DP7、DP8、DP9、DPIO、DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68或DP69免疫球蛋白基因區(qū)段所編碼的構(gòu)架氨基酸序列的構(gòu)架。如有必要，vh構(gòu)架還可包含由人種系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6免疫球蛋白基因區(qū)段所編碼的構(gòu)架氨基酸序列。在具體的實施方案中，dAb單體配體包含DPK9V^構(gòu)架或選自DP47、DP45和DP38的Vh枸架。dAb單體可包含通用配體的結(jié)合位點，所述通用配體例如蛋白A、蛋白L和蛋白G。在某些實施方案中，dAb單體包含一個或多個構(gòu)架區(qū)，所述架構(gòu)區(qū)的氨基酸序列與人種系抗體基因區(qū)段所編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或者一個或多個所述構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列共同包含最多5個與人種系抗體基因區(qū)段所編碼的所述相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列不同的氛基酸。在其它實施方案中，dAb單體的FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列與人種系抗體基因區(qū)段所編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列共同包含最多10個與所述人種系抗體基因區(qū)段所編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列不同的氨基酸。在其它實施方案中，dAb單體包含F(xiàn)W1、FW2和FW3區(qū)，而且所述FW1、FW2和FW3區(qū)的M酸序列與人種系抗體基因區(qū)段所編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同。在某些實施方案中，dAb單體不含駱駝科動物免疫球蛋白可變區(qū)，或者不含駱駝科動物種系抗體基因區(qū)段所編碼的免疫球蛋白可變區(qū)所特有的一個或多個構(gòu)架氨基酸。在某些實施方案中，本發(fā)明的配體(例如dAb單體)當(dāng)以有效量給予時，在疾病模型中有效。通常有效量為約lmg/kg至約10mg/kg(例如約lmg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg或約10mg/kg)。存在許多合適的疾病模型。本文所述的慢性炎性疾病模型是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，用于預(yù)測對人體的療效。現(xiàn)有才支術(shù)沒有給出在這些模型中使用包含能結(jié)合內(nèi)源靶化合物部分的配體(例如可溶性細(xì)胞因子受體(例如可溶性TNFR1))的啟示，也沒有給出它們是否有效的啟示。在具體的實施方案中，配體或dAb單體在標(biāo)準(zhǔn)小鼠膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎模型中是有效的。例如，與合適對照相比，在標(biāo)準(zhǔn)小鼠膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎模型中，給予有效量的配體可降低四肢平均關(guān)節(jié)炎評分總和例如約1至約16、約3至約16、約6至約16、約9至約16或約12至約16。在另一實例中，與合適對照相比，在標(biāo)準(zhǔn)小鼠膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎模型中，給予有效量的配體可延遲關(guān)節(jié)炎癥狀發(fā)作例如達(dá)約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約10天、約14天、約21天或約28天。在另一實例中，在標(biāo)準(zhǔn)小鼠膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎模型中，給予有效量的配體可導(dǎo)致四肢平均關(guān)節(jié)炎評分總和為0至約3、約3至約5、約5至約7、約7至約15、約9至約15、約10至約15、約12至約15或約14至約15。在其它實施方案中，配體或dAb單體在小鼠關(guān)節(jié)炎AARE模型中是有效的(Kontoyiannis等，/Ex/Med196:1563-74(2002》。例如，與合適對照相比，在小鼠關(guān)節(jié)炎AARE模型中，給予有效量的配體可降低平均關(guān)節(jié)炎評分例如達(dá)約0.1至約2.5、約0.5至約2.5、約1至約2.5、約1.5至約2.5、或約2至約2.5。在另一實例中，與合適對照相比，在小鼠關(guān)節(jié)炎AARE才莫型中，給予有效量的配體可延遲關(guān)節(jié)炎癥狀發(fā)作例如達(dá)約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約10天、約14天、約21天或約28天。在另一實例中，在小鼠關(guān)節(jié)炎AARE模型中，給予有效量的配體可導(dǎo)致平均關(guān)節(jié)炎評分為0至約0.5、約0.5至約1、約1至約1.5、約1.5至約2、或約2至約2.5。在其它實施方案中，配體或dAb單體在小鼠炎性腸病(IBD)AARE模型中是有效的(Kontoyiannis等，J196:1563-74(2002))。例如，與合適對照相比，在小鼠IBDAARE模型中，給予有效量的配體可降低平均急性和/或慢性炎癥評分例如達(dá)約0.1至約2.5、約0.5至約2.5、約1至約2.5、約1.5至約2.5、或約2至約2.5。在另一實例中，與合適對照相比，在小鼠IBDAARE模型中，給予有效量的配體可延遲IBD癥狀發(fā)作例如達(dá)約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約10天、約14天、約21天或約28天。在另一實例中，在小鼠IBDAARE模型中，給予有效量的配體可導(dǎo)致平均急性和/或慢性炎癥評分為0至約0.5、約0.5至約1、約1至約1.5、約1.5至約2或約2至約2.5。在其它實施方案中，配體或dAb單體在小鼠葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘發(fā)的IBD模型中是有效的。參見例如OkayasuI.等，G"Wrae"&ra/ogy95:694-702(1990);PodolskyK.,/Ga對erae"&ra/38增刊XV:63-66(2003)。例如，與合適對照相比，在小鼠DSSIBD模型中，給予有效量的配體可降低平均嚴(yán)重性評分例如達(dá)約0.1至約2.5、約0.5至約2.5、約1至約2.5、約1.5至約2.5、或約2至約2.5。在另一實例中，與合適對照相比，在小鼠DSSIBD模型中，給予有效量的配體可延遲IBD癥狀發(fā)作例如達(dá)約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約10天、約14天、約21天或約28天。在另一實例中，在小鼠DSSIBD模型中，給予有效量的配體可導(dǎo)致平均嚴(yán)重性評分為0至約0.5、約0.5至約1、約1至約1.5、約1.5至約2或約2至約2.5。在具體實施方案中，配體或dAb單體在小鼠吸煙所致慢性阻塞性肺病(COPD)吸煙模型中是有效的。(參見Wright和Churg,C/^W,122:301-306(2002),Groneberg,DA等，"甲'rato/7"e層rc/5:18(2004),CoffmanRL等，/五jc/.Met/.201(12):1875-1879(2001),VanScott,MR等，J//.尸/;wo/.96:1433-1444(2004))。在其它實施方案中，配體或dAb單體在以下動物模型中是有效的哮喘(參見CoffmanRL等，e/.￡xpU.201(12):1875-1879(2001);VanScott,MR等，J//.尸/^wo/.95:1433-1444(2004))、肺纖維變性(例如Venkatesan,N等，287:1342-1347(2004)、系統(tǒng)性紅斑狼皰(SLE)(Knight等(1978)丄￡jc/7.A/W.,147:1653;Reinersten等(1978)MM.,299:515)、重癥肌無力(Lindstrom等(1988)/mwwo/.,42:233)、關(guān)節(jié)炎(Stuart等(1984)爿朋./mw朋o/.,42:233;VanEden等(1988)A^"m,331:171)、甲狀腺炎(Maron等(1980)丄Er/.Me乂，152:1115)、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)(Kanasawa等(l984)D/aZ^o/og/a,27:113)和多發(fā)性硬化EAE模型(參見Paterson(1986)Tex^ooA:o//附wwwo/7a^o/ogy,Mischer等主編，Grune和Stratton,NewYork,第179-213頁；McFarlin等(1973)S"'e臟，179:478;和Satoh等(1987)丄/m聽wo/,138:179)。優(yōu)選在大腸桿菌(五.co//)或畢赤酵母(例如巴斯德畢赤酵母(尸./7a對on》)中表達(dá)時，酉己體或dAb單體的分泌量至少約為0.5mg/L。在其它優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)在大腸桿菌或畢赤酵母(例如巴斯德畢赤酵母)中表達(dá)時，dAb單體的分泌量至少約0.75mg/L、至少約lmg/L、至少約4mg/L、至少約5mg/L、至少約10mg/L、至少約15mg/L、至少約20mg/L、至少約25mg/L、至少約30mg/L、至少約35mg/L、至少約40mg/L、至少約45mg/L、或至少約50mg/L、或至少約100mg/L、或至少約200mg/L、或至少約300mg/L、或至少約400mg/L、或至少約500mg/L、或至少約600mg/L、或至少約700mg/L、或至少約800mg/L、至少約900mg/L、或至少約lg/L。在其它優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)在大腸桿菌或畢赤酵母(例如巴斯德畢赤酵母)中表達(dá)時，dAb單體的分泌量至少約lmg/L到至少約lg/L、至少約lmg/L到至少約750mg/L、至少約100mg/L到至少約lg/L、至少約200mg/L到至少約lg/L、至少約300mg/L到至少約lg/L、至少約400mg/L到至少約lg/L、至少約500mg/L到至少約lg/L、至少約600mg/L到至少約lg/L、至少約700mg/L到至少約lg/L、至少約800mg/L到至少約lg/L、或至少約900mg/L到至少約lg/L。盡管在大腸桿菌或畢赤酵母(例如巴斯德畢赤酵母)中表達(dá)時，本文所述的配體和dAb單體可以分泌，但是它們也可以采用任何合適方法來制備，例如不需要用大腸桿菌或畢赤酵母的合成化學(xué)方法或生物學(xué)制備方法。在某些實施方案中，配體是對內(nèi)源靶化合物具有結(jié)合特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段或Fv片段(例如scFV)。在其它實施方案中，拮抗劑或配體是單價的，例如dAb或抗體的單價抗原結(jié)合片段，例如Fab片段、Fab'片段或Fv片段。在本說明書中所述的本發(fā)明的其它實施方案中，在本發(fā)明的配體中不使用"dAb",是考慮技術(shù)人員可使用包含能結(jié)合內(nèi)源耙化合物的dAb的CDR的結(jié)構(gòu)域(例如移植到合適蛋白質(zhì)支架或骨架上的CDR，例如親和體、SpA支架、LDL受體A類區(qū)或EGF區(qū))或者可以是包含TNFR1結(jié)合位點的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，例如其中的結(jié)構(gòu)域選自親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)或EGF區(qū)。因此，總的來說，本發(fā)明的公開內(nèi)容應(yīng)視為提供了拮抗劑、配體以及使用所述結(jié)構(gòu)域替代dAb的方法。另外，本發(fā)明的配體可以如本文所述進(jìn)行改造(例如延長半衰期的形式)。能結(jié)合內(nèi)源把化合物的配體的用途和治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分(例如dAb)、但基本上不抑制所述內(nèi)源耙化合物活性的配體。優(yōu)選的配體不結(jié)合內(nèi)源耙化合物的活性部位。本發(fā)明的配體的其它特征如本文所述。為了簡明起見并避免重復(fù)，對于本發(fā)明的用途和方法而言，并非對所有公開的配體特征都進(jìn)行具體描述?？紤]到本發(fā)明述的配體的方法。本發(fā)明涉及包含配體和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的組合物，所述配體包含具有內(nèi)源革巴化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分(例如dAb)，但基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。本發(fā)明也涉及使用本發(fā)明配體或組合物的治療和診斷方法。本文所述的配體可用于體內(nèi)治療和預(yù)防應(yīng)用、體內(nèi)診斷應(yīng)用等。例如，本發(fā)明的配體(例如dAb單體)通?？捎糜陬A(yù)防、抑制或治療疾病(例如急性和/或慢性炎性疾病)。例如，可以給予拮抗劑和/或配體，以治療、抑制或預(yù)防炎性疾病(例如急性和/或慢性炎癥)、癌癥和腫瘤(例如淋巴瘤(例如B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、急性骨髓性淋巴瘤)、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、癌)、代謝性疾病(例如糖尿病、肥胖癥)、變應(yīng)性超敏反應(yīng)、細(xì)菌性或病毒性感染、自身免疫病(其包括但不限于I型糖尿病、哮喘、多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、脊推關(guān)節(jié)病(spondylarthr叩athy)(例如關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊推炎)、系統(tǒng)性紅斑狼瘠、炎性腸病(例如節(jié)段性回腸炎(Crohn，sdisease)、潰瘍性結(jié)腸炎)、重癥肌無力和貝赫切特綜合征(Behcet'ssyndrome)、纟艮屑病、子宮內(nèi)膜異位癥和腹部粘連(例如腹部手術(shù)后)、骨關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺病或適于用內(nèi)源靶化合物治療的其它疾病。在本發(fā)明的應(yīng)用中，術(shù)語"預(yù)防"包括在疾病誘發(fā)之前給予保護(hù)性組合物。"抑制"是指在誘導(dǎo)事件之后、而在臨床上出現(xiàn)疾病之前給予組合物。"治療"包括在疾病癥狀出現(xiàn)后給予保護(hù)性組合物。本發(fā)明涉及本文所述的配體在制備藥物中的用途，可將所述藥物給予患者，以利用和開發(fā)內(nèi)源化合物的有益活性，從而產(chǎn)生有益效果(例如有益的治療效果、有益的診斷效果)。因此，本發(fā)明涉及配體在制備藥物中的用途，例如，所述藥物用于增加患者體內(nèi)所述內(nèi)源靶化合物數(shù)量(例如體循環(huán)中內(nèi)源靶化合物的數(shù)量，在特定器官、組織或區(qū)域(例如在關(guān)節(jié)、肺、肌肉、皮膚部位、CNS)等特定部位的數(shù)量)，用于增加患者體內(nèi)所述內(nèi)源靶化合物的生物利用度(例如全身或在所需作用部位(例如在關(guān)節(jié)、肺、肌肉、皮膚部位、CNS中)，用于增加所述內(nèi)源靶化合物的體內(nèi)半衰期，或者用于治療適于用內(nèi)源靶化合物治療的疾病(例如本文所述的疾病)。所述藥物可以系統(tǒng)或局部給予。本發(fā)明涉及包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分的配體在制備用于增加患者體內(nèi)所述內(nèi)源靶化合物半衰期的藥物中的用途?？蓪⑺幬锝o予患者，以增加配體所結(jié)合的內(nèi)源靶化合物的半衰期，例如通過結(jié)合內(nèi)源耙化合物并因此增加內(nèi)源輩巴化合物的流體動力學(xué)尺寸，通過結(jié)合內(nèi)源耙化合物和使內(nèi)源把化合物穩(wěn)定，或者通過結(jié)合和延緩內(nèi)源靶化合物清除或代謝速率。通常，相對于配體不存在下的內(nèi)源耙化合物半衰期而言，配體可延長它所結(jié)合的內(nèi)源靶化合物的半衰期達(dá)至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍。例如，內(nèi)源靶化合物的半衰期約1小時，而在給予包含能結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分的配體之后，內(nèi)源靶化合物的半衰期增加到約1.5小時、至約10小時以上。本發(fā)明涉及包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分的配體在制備用于增加患者體內(nèi)所述內(nèi)源耙化合物數(shù)量的藥物中的用途。在給予本文所述的配體之后，內(nèi)源靶化合物的水平或數(shù)量增加是因為配體半衰期增加的結(jié)果。例如，在給予本發(fā)明配體后的1小時、或2小時、或3小時、或4小時、或5小時、或6小時、或7小時、或8小時、或9小時、或10小時、或11小時、或12小時、或1天，內(nèi)源把配體的水平或數(shù)量(例如在血清中)可增加至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約500倍、至少約1,000倍、至少約5,000倍、至少約10，000倍、至少約50,000倍、或至少約100,000倍?？梢圆捎萌魏魏线m方法，容易地測定內(nèi)源靶化合物增加的水平或數(shù)量。例如，在給予配體之前、在給予之后的一個或多個時間點獲取合適的樣品(例如血清)，然后用合適方法測定樣品中內(nèi)源靶化合物的水平或數(shù)量。樣品可以是例如血液、血清、腦脊液、滑液、支氣管肺泡灌洗液、灌腸樣品或活檢樣品。在某些實施方案中，相對于給予配體之前的數(shù)量或水平而言，這類樣品中配體的數(shù)量或水平增力口。本發(fā)明涉及包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分的配體在制備用于增加患者體內(nèi)所述內(nèi)源靶化合物生物利用度的藥物中的用途?？蓪⑺幬锝o予患者，以便在全身或在所需作用部位(例如在局部給予配體的部位)增加內(nèi)源靶化合物的生物利用度。例如，配體可結(jié)合在體循環(huán)中具有有益活性、但卻快速分布到組織中或被清除的內(nèi)源靶化合物(例如甾體或肽激素)，并延緩分布或清除速率。這類配體可增加體循環(huán)中內(nèi)源靶化合物的生物利用度，在此內(nèi)源靶化合物的活性可起到有益效果(例如治療效果)。配體可通過將內(nèi)源靶化合物募集到所需部位，從而增加該部位的內(nèi)源靶化合物的生物利用度。例如，可將包含所需內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的配體局部給予患者(例如作為緩釋型制劑)。局部給予的配體可結(jié)合所需內(nèi)源靶化合物并將額外的內(nèi)源靶化合物募集到該部位。因此，在該部位內(nèi)源靶化合物水平或數(shù)量的增加可產(chǎn)生有益的效果。例如，在一個實施方案中，配體包含TGF(3同種型3的結(jié)合位點的部分。可局部給予這樣的配體，以結(jié)合TGF(3同種型3并將TGF(3同種型3募集到局部給藥部位，因而促進(jìn)傷口愈合。通常，相對于配體不存在時的內(nèi)源靶化合物的生物利用度而言，配體可增加它所結(jié)合的內(nèi)源靶化合物的生物利用度(例如在體循環(huán)中，在所需作用部位上)達(dá)至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍。例如，當(dāng)配體增加體循環(huán)中的生物利用度時，可以繪制從給予配體時開始的內(nèi)源配體濃度時間曲線，并將曲線和曲線下面積(AUC)與內(nèi)源耙配體的正常體內(nèi)水平進(jìn)行比4交，確定系統(tǒng)生物利用度的范圍。本發(fā)明涉及包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分的配體在制備用于增加患者體內(nèi)所述內(nèi)源靶化合物活性的藥物中的用途。配體可增加它們所結(jié)合的內(nèi)源耙的活性(例如結(jié)合活性)。例如，配體可結(jié)合內(nèi)源耙化合物(例如內(nèi)源激動劑(例如細(xì)胞因子)或可溶性細(xì)胞因子受體)，并通過增加內(nèi)源靶化合物對其內(nèi)源結(jié)合配偶體的親和力和/或親合力而提高內(nèi)源靶化合物的結(jié)合活性。包含對所需內(nèi)源輩巴化合物具有結(jié)合特異性的結(jié)合位點的兩個以上部分的配體可結(jié)合兩個以上單獨的內(nèi)源靶化合物分子，因而產(chǎn)生內(nèi)源靶化合物的二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體。這樣的二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體因較高的親合力而對例如表達(dá)內(nèi)源靶化合物的天然結(jié)合配偶體的細(xì)胞具有改進(jìn)的結(jié)合活性。通常，這樣的配體能提高內(nèi)源靶化合物結(jié)合活性。例如，與內(nèi)源靶化合物單體(即未與本發(fā)明配體形成復(fù)合物)的結(jié)合強(qiáng)度相比，內(nèi)源乾化合物的二聚體對其結(jié)合配偶體的結(jié)合強(qiáng)度(例如親和力或親合力)強(qiáng)至少約io倍、至少約100倍、至少約1,000倍或至少約10,000倍。在一個具體的實施方案中，配體包含具有可溶性TNFR1結(jié)合特異性、但不結(jié)合其活性部位(可溶性TNFR1的活性部位包含在域2和域3內(nèi))的兩個以上部分(dAb)。這樣的配體可結(jié)合兩個或更多可溶性TNFR1鏈，形成可溶性TNFR1二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體，它們因親合力增加而對其三聚體配體TNF具有改進(jìn)的結(jié)合活性。也可以理解，比單個可溶性TNFR1鏈的流體動力學(xué)尺寸更大的這類可溶性TNFR1二聚體、三聚體、寡聚體或多聚體，其半衰期也會比單個TNFR1更長。因此，這樣的配體可提高可溶性TNTFR1的TNF抑制活性并改善其療效。例如，這樣的配體可提高可溶性TNFR1的功效至少約10倍、至少約100倍、至少約1,000倍或至少約10,000倍。在該實施方案的一個實例中，采用作為結(jié)合小鼠TNFR1域1的dAb二聚體的配體，證明誘導(dǎo)可溶性TNFR1二聚化的配體提高了可溶性TNFR1的功效。例如，可以將這樣的配體加入到含有人MRC5細(xì)胞、人TNF和可溶性小鼠TNFR1的測定中?？扇苄孕∈骉NFR1將與MRC5細(xì)胞上的人TNFR1竟?fàn)幮越Y(jié)合人TNF。作為結(jié)合小鼠TNFR1域1的dAb二聚體的配體可結(jié)合兩條可溶性小鼠TNFR1鏈，形成小鼠TNFR1二聚體，這樣的二聚體在測定中能更有效抑制TNF效應(yīng)。例如，加入誘導(dǎo)可溶性TNFR1二聚化的配體，可使小鼠TNFR1的IC50從毫橫b擎爾范圍降至皮摩爾范圍(降低約10倍或約100倍或約1000倍)。在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞測定中，誘導(dǎo)可溶性受體鏈二聚化(或三聚化或寡聚化)的優(yōu)選配體基本上不激動細(xì)胞表面受體或跨膜形式的受體(即當(dāng)濃度為1nM、10nM、100nM、1fiM、10pM、100^M、1000jiM或5,000MM時，在測定中，導(dǎo)致不超過約5%的由受體的天然配體所誘導(dǎo)的受體介導(dǎo)的活性)。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明涉及配體在制備用于增加內(nèi)源耙化合物結(jié)合活性的藥物中的用途，所述配體包含具有所述內(nèi)源把化合物結(jié)合位點的兩個以上部分，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源把，但不結(jié)合所述內(nèi)源靶的活性部位，也基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的結(jié)合活性。本發(fā)明也涉及能結(jié)合內(nèi)源靶化合物的配體，用于治療適于接受所述內(nèi)源靶化合物治療的疾病，所述內(nèi)源靶化合物具有適于治療患者疾病的活性，其中所述配體不結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物的活性部位，或者基本上不補制所述內(nèi)源靶化合物的活性.。例如，配體可增加所述內(nèi)源把化合物的體內(nèi)半衰期，增加患者體內(nèi)所述內(nèi)源靶化合物的數(shù)量，增加所述內(nèi)源靶化合物的生物利用度，和/或增加所述內(nèi)源化合物的結(jié)合活性。本發(fā)明涉及包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的結(jié)合部分的配體在增加所述內(nèi)源化合物的半衰期、生物利用度或活性中的用途，其中所述具有內(nèi)源化合物結(jié)合位點的結(jié)合部分是所述內(nèi)源化合物或其部分或變異體，而且其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物，但基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。本發(fā)明涉及包含具有TNF受體超家族成員結(jié)合位點的結(jié)合部分的配體在增加所述TNF受體超家族成員的半衰期、生物利用度或活性中的用途，其中所述配體結(jié)合所述TNF受體超家族成員，但基本上不抑制所述TNF受體超家族成員的活性，而且其中所述具有TNF受體超家族成員結(jié)合位點的結(jié)合部分是前配體裝配域(PLAD)或其變異體。本發(fā)明涉及增加患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物半衰期的方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分。本發(fā)明涉及增加患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物數(shù)量的方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分。本發(fā)明涉及增加患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物生物利用度的方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源把化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分。本發(fā)明涉及增加患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物活性(例如結(jié)合活性)的方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分。本發(fā)明涉及患有適于用內(nèi)源靶化合物治療疾病的患者的治療方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分。本發(fā)明涉及增加內(nèi)源靶化合物的半衰期、生物利用度或活性的方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有所述內(nèi)源耙化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分，其中所述具有內(nèi)源化合物結(jié)合位點的結(jié)合部分是所述內(nèi)源化合物或其部分或變異體，而且其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源耙化合物，但基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。本發(fā)明涉及增加TNF受體超家族成員的半衰期、生物利用度或活性的方法，該方法包括給予有需要的患者有效量的配體，該配體包含具有TNF受體超家族成員結(jié)合位點的結(jié)合部分，其中所述配體結(jié)合所述TNF受體超家族成員，但基本上不抑制所述TNF受體超家族成員的活性，而且其中所述具有TNF受體超家族成員結(jié)合位點的結(jié)合部分是前配體裝配域(PLAD)或其變異體。本發(fā)明配體的治療和預(yù)防用途包括將本發(fā)明配體給予受體哺乳動物，例如人。雙特異性和多特異性配體(例如雙特異性抗體形式)以高親合力結(jié)合多聚體抗原。雙特異性或多特異性配體可使兩個抗原交聯(lián)，例如產(chǎn)生高親合力的可溶性受體二聚體、三聚體或多聚體。優(yōu)選將至少90-95。/。同質(zhì)性(homogeneity)的基本純化的配體給予哺乳動物，最優(yōu)選98-99%以上同質(zhì)性供藥用，尤其是當(dāng)哺乳動物是人時。一旦部分純化或純化至所需同質(zhì)性時，配體可用于診斷或治療(包括離體)或用于開發(fā)和實施測定方法、免疫熒光染色等(Lefkovite和Pernis,(1979和1981)/wmw"o/ogz'ca/Me^cx*,第I巻和第II巻,AcademicPress,NY)。通常，純化形式的配體可與藥理學(xué)上合適的載體一起使用。通常，這些載體包括水性或醇/水溶液劑、乳劑或混懸劑，任意包括鹽水和/或緩沖介質(zhì)。胃腸外溶媒包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸化林格液。可以從增稠劑中選出合適的生理上可接受的輔料，如果需要在混懸劑中維持多肽復(fù)合物的話，這些增稠劑例如羧曱基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽。靜脈內(nèi)溶媒包括液體和營養(yǎng)補充劑和電解質(zhì)補充劑，例如基于林格氏葡萄糖的那些補充劑。也可含有防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack(1982)化抓>^0"、尸/wrmacew"ca/Sc,'ewces，第16版)。各種合適制劑都可采用，包括延長釋放的制劑。本發(fā)明藥物組合物的給藥途徑可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的任何途徑。對于治療(包括但不限于免疫治療)來說，可以采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將本發(fā)明所選配體給予任何患者?？赏ㄟ^任何合適方式給藥，包括胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、通過肺部途徑，或者合適的是，通過導(dǎo)管直接輸注。胃腸外給藥也可以通過動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下或其它合適的注射或輸注進(jìn)行。額外的合適給藥方式包括肺部給藥、鼻內(nèi)給藥、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)給藥(例如通過栓劑或灌腸劑)。給藥劑量和頻次將取決于患者年齡、性別和狀況、同時給予的其它藥物、對抗適應(yīng)癥(counterindication)和臨床醫(yī)生要考慮的其它參數(shù)。按照指示，可以局部給藥(例如局部給予肺部，通過肺部給藥，例如鼻內(nèi)給藥)或系統(tǒng)給藥。本發(fā)明的配體可以作為單獨給予的組合物形式或者與其它藥物聯(lián)用。這些藥物可包括各種免疫治療藥，例如環(huán)孢菌素、曱氨蝶呤、阿霉素或順鉑，以及免疫毒素。藥物組合物可包含各種細(xì)胞毒劑或其它藥物以及本發(fā)明的拮抗劑(例如配體)、或者甚至是具有不同特異性的本發(fā)明配體(例如用不同靶抗原或表位所選擇的配體)的組合的"合劑"，無論它們是否在給藥之前混合。通常，以提供重疊療效的方式給予配體和任何別的藥物。在某些實施方案中，將包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分的配體與低劑量的內(nèi)源耙化合物(例如重組形式的內(nèi)源革巴化合物)一起給予。如本文所述，配體可以例如增加內(nèi)源靶化合物的半衰期或生物利用度，或增加內(nèi)源靶化合物的活性，使低劑量也有療效。該治療方法是有利的，因為可避免與疾病治療所用的較高劑量的藥物(例如重組形式的內(nèi)源靶蛋白)相關(guān)的副作用。在其它實施方案中，給予已經(jīng)預(yù)先裝載內(nèi)源耙化合物的配體(例如與重組形式的內(nèi)源靶化合物一起醉育并與之結(jié)合)。預(yù)裝載的配體非常適合局部^藥，以提供內(nèi)源靶配體的高生物利用度，而這樣的配體在正常情況下呈亞治療水平或者難以募集到需要內(nèi)源靶配體活性的部位上。能結(jié)合參與胞吞作用的胞外靶標(biāo)(例如網(wǎng)格蛋白(Clathrin》的本發(fā)明配體可以被胞吞，使它們能接近胞內(nèi)耙標(biāo)。此外，雙特異性或多特異性配體可提供這樣的方法通過該方法將特異性結(jié)合胞內(nèi)靶標(biāo)的結(jié)合域(例如dAb單體)遞送到胞內(nèi)環(huán)境。該策略需要例如這樣的雙特異性配體其物理特性能讓它在細(xì)胞內(nèi)保留功能性。或者，如果最終目的地的胞內(nèi)區(qū)室是氧化態(tài)的，良好折疊的配體可能不需要游離二;?；铩Ｗ詈秒p特異性或多特異性配體可用于針對在生物體內(nèi)治療環(huán)境中協(xié)同作用的細(xì)胞因子和其它分子。因此，本發(fā)明提供能協(xié)同結(jié)合細(xì)胞因子或其它分子的兩個或更多個結(jié)合域(例如dAb)活性的方法，該方法包括給予能夠結(jié)合所述兩個或更多個分子(例如細(xì)胞因子)的雙特異性或多特異性配體。在本發(fā)明的這一方面，雙特異性或多特異性配體可以是任何雙特異性或多特異性配體，包括由互補和/或非互補區(qū)組成的配體、開放構(gòu)象的配體和閉合構(gòu)象的配體。例如，本發(fā)明的這一方面涉及VH區(qū)和VL區(qū)的組合、僅有VH區(qū)的組合和僅有VL區(qū)的組合。在治療中可以多種方式達(dá)到協(xié)同。例如，^l當(dāng)配體同時4十對兩個把標(biāo)時，耙標(biāo)組合才具有治療活性，而僅針對一個靶標(biāo)則沒有療效。在另一個實施方案中，僅一個靶標(biāo)可提供稍低或最小療效，但是與笫二靶標(biāo)一起的組合協(xié)同性地增加了療效。可以采用動物模型系統(tǒng)，用于在保護(hù)機(jī)體免遭疾病或治療疾病中篩選配體的有效性。可以采用合適的動物才莫型，例如本文所公開的模型?？蓪⒈景l(fā)明配體凍干后貯存?zhèn)溆茫褂们爸嘏湓诤线m載體中。已知該技術(shù)對常規(guī)免疫球蛋白來說是有效的，可以采用本領(lǐng)域已知的凍干和重配技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，凍干和重配可導(dǎo)致不同程度的抗體活性喪失(例如對于常規(guī)免疫球蛋白，IgM抗體要比IgG抗體活性損失更高)，因此^f吏用水平應(yīng)調(diào)高以便進(jìn)行補償?？梢越o予含有本發(fā)明配體或其合劑的組合物，用于預(yù)防和/或治療性治療。在某些治療應(yīng)用中，達(dá)到至少部分抑制、遏制、調(diào)節(jié)、殺傷或某些其它可檢測參數(shù)的所選細(xì)胞群體的足夠用量，定義為"治療有效量"。盡管達(dá)到該劑量所需的用量將取決于疾病嚴(yán)重程度和患者自身免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)，但是通常范圍為每千克體重0.005-5.0mg配體，更常用的劑量為0.05-2.0mg/kg/劑。對于預(yù)防應(yīng)用而言，也可以類似或稍低劑量給予含有本發(fā)明配體或其合劑的組合物，以預(yù)防、抑制或延遲疾病發(fā)作(例如維持緩解或靜止?fàn)顟B(tài)，或者預(yù)防急性期)。熟蘇的臨床醫(yī)生能夠確定合適的給藥間隔，以便治療、抑制或預(yù)防疾A:J給予TNFR1拮抗劑(例如配體)以治療、抑制或預(yù)防慢性炎性疾病時，可以給予最多每天4次，每周兩次，每周一次，每兩周一次，每月一次，或每兩月一次，其劑量例如為約10)Llg/kg至約80mg/kg、約100|ug/kg至約80mg/kg、約lmg/kg至約80mg/kg、約lmg/kg至約70mg/kg、約lmg/kg至約60mg/kg、約lmg/kg至約50mg/kg、約lmg/kg至約40mg/kg、約lmg/kg至約30mg/kg、約lmg/kg至約20mg/kg、約lmg/kg至約10mg/kg、約10嗎/kg至約Omg/kg、約10jLig/kg至約5mg/kg、約10jxg/kg至約2.5mg/kg、約lmg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg或約10mg/kg。在具體的實施方案中，給予TNFR1拮抗劑(例如配體)以治療、抑制或預(yù)防慢性炎性疾病，每兩周一次或每月一次，劑量為約10|iig/kg至約10mg/kg(例如約10jig/kg、約100fxg/kg、約lmg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg或約10mg/kg)。也可給予配體(例如系統(tǒng)或局部)，其劑量為例如約1mg/天至約10mg/天(例:io10mg/天、9mg/天、8mg/天、7mg/天、6mg/天、5mg/天、4mg/天、3mg/天、2mg/天、或1mg/天)。因此，肺部組織局部給予藥物的劑量為約l卞g/kg/天至約200pg/kg/天(例如約10jig/kg/天、約20嗎/kg/天、約30iig/kg/天、約40fig/kg/天、約50嗎/kg/天、約60嗎/kg/天、約70ing/kg/天、約80iug/kg/天、約90嗎/kg/天、約100pg/kg/天、約110fig/kg/天、約120嗎/kg/天、約130嗎/kg/天、約140嗎/kg/天、約150ixg/kg/天、約160ing/kg/天、約170jxg/kg/天、約180(ng/kg/天或約190iug/kg/天)。相對于治療前所表現(xiàn)的所述癥狀、或者相對于未用所述組合物或其它合適對照治療的個體(人或模型動物)的所述癥狀而言，當(dāng)一種或多種癥狀減少了(例如達(dá)至少10%或在臨床評價量表中達(dá)至少一個點)時，就認(rèn)為用本文所述的組合物進(jìn)行的治療是"有效"的。盡管癥狀明顯不同，取決于所針對的疾病或障礙，但是可以由普通有技術(shù)的臨床醫(yī)生或技術(shù)人員進(jìn)行測定。這些癥狀可以通過例如以下方法來測定通過監(jiān)測疾病或障礙的一種或多種生化指標(biāo)水平(例如疾病相關(guān)的酶或代謝物水平，受累細(xì)胞數(shù)量等)、通過監(jiān)測身體表現(xiàn)(例如炎癥、腫瘤大小等)、或者通過可接受的臨床評價量表(例如擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表(ExpandedDisabilityStatusScale)(用于多發(fā)性硬化)、Irvine炎性腸病問巻調(diào)查表(32點評價表，評價有關(guān)腸功能、全身癥狀、社交功能和情感狀態(tài)的生活質(zhì)量一評分范圍為32-224,評分越高表明生活質(zhì)量越好)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎生活質(zhì)量量表、St.George呼吸問巻調(diào)查表或本領(lǐng)域已知的其它可接受的臨床評價量表。疾病或障礙癥狀持續(xù)(例如一天以上，優(yōu)選超過一天)下降達(dá)至少10%或者在給定臨床量表上下降達(dá)一個點或多個點，就表明是"有效"治療。同樣，相對于未經(jīng)組合物治療的類似個體(人或動物模型)的所述癥狀而言，當(dāng)一種或多種癥狀的發(fā)作或嚴(yán)重程度被延遲、減少或消除時，用本文所述的組合物進(jìn)行預(yù)防就是"有效"的。以幫助改變、鈍化、殺傷或去除哺乳動物的所選靶細(xì)胞群體。另外，本文所述的所選多肽庫可用于離體或體外選擇性殺傷、耗盡或從不均一細(xì)胞群體中有效去除靶細(xì)月包群體?？梢园凑諛?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將來自哺乳動物的血液在離體情況下與配體(例如抗體、細(xì)胞表面受體或其結(jié)合蛋白)混合，由此殺傷或從血液中除去不想要的細(xì)胞，再回輸?shù)讲溉閯游矬w內(nèi)。含有本發(fā)明配體的組合物可用于預(yù)防和治療裝置，以幫助改變、鈍化、殺傷或去除哺乳動物的所選耙細(xì)胞群體。另外，本文所述的所選多肽庫可用于離體或體外選擇性殺傷、耗盡或從不均一細(xì)胞群體中有效去除耙細(xì)胞群體。可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將來自哺乳動物的血液在離體情況下與配體(例如抗體、細(xì)胞表面受體或其結(jié)合蛋白)混合，由此殺傷或從血液中除去不想要的細(xì)胞，再回輸?shù)讲溉閯游矬w內(nèi)。內(nèi)源乾化合物合適的內(nèi)源把化合物包括例如可溶性細(xì)胞因子受體(例如可溶性TNFR1、可溶性TNFR2、可溶性IL-1受體、可溶性IL-4受體、可溶性IL-13受體)、內(nèi)源受體拮抗劑(IL-lm、IL-6ra)、酶(例如p-葡糖腦苷脂酶(E.C.3.2丄45))、血液因子(例如因子II、因子Vm)、紅細(xì)胞生成素、人生長激素、TPO、干擾素-a、干擾素-P、干擾素-y、GLP-1、OXM、性激素(例如睪酮、雌激素)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7)、轉(zhuǎn)化生長因子p(TGF-P)同種型1、TGF-p同種型2、TGF-(3同種型3、IL-IO、IL-2、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、胰島素、胰高血糖素、GIP。合適的內(nèi)源耙化合物包括細(xì)胞因子，例如白介素、干擾素、集落刺激因子和趨化因子。這類細(xì)胞因子的實例包括白介素(IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、ILIO、ILll、IL12、IL13、IL14、IL15(IL-T)、IU6、IL17、IL17B、IL17C、IL17E、IL17F、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、IL-31和IL-32)以及干擾素(IFN曙a、IFN-(3、IFN誦S、IFN-y、IFN畫k、麗-入國l、IFN畫X國2、IFN-入-3、IFN國o)和IFN-t)。合適的內(nèi)源耙化合物包括趨化因子，例如CCF18、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLIO、CCLll、CCU2、CCU3、CCL14、CCU5、CCX16、CCL17、CCU8、CCL19、CCL20、CCX21、CCX22、CCL23、CCL24、CCL25、CCU6、CCL27、CCL28、CXCU、CXCU、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLIO、CXCLll、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、ECIP-1、EDNAP、ENA-78、ENAP、ENAP-a、ENAP-J3、內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制劑、內(nèi)皮IL8、FIC、FDNCF、FINAP、GDCF-2、GCF、GCP-2、GRO-a、GRO-(3、GRO-y、肝素中和蛋白、Humig、1-309、ILC、ILINCK、IMAC、I國TAC、IL8、IP-9、IP-IO、淋巴細(xì)胞趨化蛋白、LAG隱1、LARC、LCC陽1、LD78-a、LD78國(3、LD78卞LDCF、LEC、Lkn國l、LMC、LAI、LCF、LA-PF4、LDGF、LDNAP、LIF、LIX、MARC、MCAF、MCIF、Mexikine、MCP陽1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、MDC、MEC、MIP-l-a、MIP國l-(3、證-1-5、MIP畫1-y、MIP-3、MlP-3-a、MEP-3-p、MIP國4、MlP-4國a、MIP國5、Monotactin-l(單核細(xì)胞趨化因子-l)、MPIF-1、MPIF-2、MRP-1、MRP-2、MDGF、MDNAP、MDNCF、巨核細(xì)胞刺激因子、MGSA、MGSA-a、MGSA-p、Mig、MIP-2、MIP-2-ouMIP-2-(5、MlP-2-y、NAF、NAP畫1、NAP-2、NAP-3、NAP-4、NCP、制瘤素A、PARC、PBP、PBP樣、PBSF、PF4、PLF、PPBP、RANTES、Regakine陽l、SCM腸l-a、SCYC1、SCYC2、SCI、SCYA1、SCYA2、SCYA3、SCYA4、SCYA5、SCYA6、SCYA7、SCYA8、SCYA9、SCYAIO、SCYAll、SCYA12、SCYA13、SCYA14、SCYA15、SCYA16、SCYA17、SCYA19、SCYA20、SCYA21、SCYA22、SCYA23、SCYA24、SCYA25、SCYA26、SCYA27、SCYA28、SLC、SMC國CF、STCP-1、SCYB1、SCYB2、SCYB3、SCYB4、SCYB5、SCYB6、SCYB7、SCYB8、SCYB9、SCYB9B、SCYB10、SCYBll、SCYB12、SCYB13、SCYB14、SCYB15、SCYB16、SDF-l-ot、SDF-l-p、SR-PSOX、SCYD1、SR國PSOX、TARC、TCA國3、TCA-4、TDCF、TECK、TSC-1、TSG陽8、TCF、TCK陽1、TLSF-a、TLSF-p、TPAR畫1、TSG-1、WECHE。合適的內(nèi)源靶化合物包括集落刺激因子(CSF)。CSF是刺激成人骨髓特異性多能干細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子。粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)對粒細(xì)胞譜系細(xì)胞的增殖效應(yīng)具有特異性。巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)對巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞具有特異性。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)對這兩類淋巴細(xì)胞具有增殖效應(yīng)。也認(rèn)為Epo是CSF以及生長因子，因為它刺激紅細(xì)胞集落形成單位增殖。也認(rèn)為IL-3(主要由T細(xì)胞分泌)是多重-CSF，因為它刺激干細(xì)胞產(chǎn)生所有形式的造血細(xì)胞。合適的內(nèi)源耙化合物包括紅細(xì)胞生成素(Epo)。Epo是由腎臟合成的，是紅細(xì)胞生成的主要調(diào)節(jié)物。Epo刺激未成熟紅細(xì)胞的增殖和分化；它也刺激祖紅細(xì)胞(erythoidprogenitorcell)(例如紅細(xì)胞爆裂型集落生成單位)的生長并誘導(dǎo)紅細(xì)胞集落生成單位向原紅細(xì)胞分化。將Epo給予因腎衰竭導(dǎo)致貧血的患者時，結(jié)果導(dǎo)致紅細(xì)胞計數(shù)快速而明顯的增加。合適的內(nèi)源耙化合物包括胰島素樣生長因子-I(IGF-I)。IGF-I(原來稱為生長調(diào)節(jié)素C)是胰島素結(jié)構(gòu)相關(guān)的生長因子。IGF-I是參與細(xì)胞響應(yīng)生長激素(GH)的主要蛋白質(zhì)，也就是說，IGF-I是響應(yīng)GH而產(chǎn)生，并隨即誘導(dǎo)細(xì)胞活性，尤其是骨生長。響應(yīng)GH并產(chǎn)生術(shù)語生長調(diào)節(jié)素，就是IGF-I的活性。然而，隨后的研究已經(jīng)證明，除了先前觀察到的對骨的內(nèi)分泌活性之外，IGF-I還具有自分泌和旁分泌活性。IGF-I受體，與胰島素受體一樣，具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性。因其結(jié)構(gòu)相似，IGF-I可結(jié)合胰島素受體，但比胰島素本身結(jié)合胰島素受體的親和力要低得多。合適的內(nèi)源靶化合物包括胰島素樣生長因子-n(igf-ii)。iGF-n幾乎只在胚胎組織和和新生組織中表達(dá)。出生后，可檢測的IGF-II蛋白水平明顯下降。因此認(rèn)為IGF-II是胎兒生長因子。IGF-II受體與負(fù)責(zé)將溶酶體酶(其含有甘露津唐-6-磷酸殘基)整合到溶酶體上的甘露糖-6-磷酸受體相同。合適的內(nèi)源靶化合物包括腫瘤壞死因子(3。TNF-(3(也稱為淋巴毒素)的特征是能殺傷大量不同細(xì)胞種類，并能誘導(dǎo)其它細(xì)胞的終末分化。對TNF-(3的一個明顯的非增殖響應(yīng)就是抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表面存在的脂蛋白脂肪酶。TNF-(3合成的優(yōu)勢部位是T淋巴細(xì)胞，尤其是稱為細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL細(xì)胞)的一類特殊的T細(xì)胞。TNF-(3表達(dá)的誘導(dǎo)是由IL-2上升以及抗原與T細(xì)胞受體相互作用而產(chǎn)生的。合適的內(nèi)源靶化合物包括腫瘤壞死因子a(TNF-a)。TNF-a(也稱為淋巴毒素B或惡液質(zhì)素)是多能炎性細(xì)胞因子，可引起某些類型的腫瘤的壞死。TNF-a與TNF-P只共享36%氨基酸序列的同一性。但是這兩種蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)十分相似，都能結(jié)合TNF受體TNFR-1和TNFR-2。TNF-a是在主要組織相容性復(fù)合物內(nèi)編碼的三聚體蛋白。最先鑒定的是其17kd分泌形式，而進(jìn)一步研究顯示，未切割的27kd前體形式也以跨膜形式存在。受刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生27kdTNF-a,它可直接通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸而結(jié)合TNFR-1受體和TNFR-2受體，或者經(jīng)過切割而以其可溶性形式進(jìn)行結(jié)合。該細(xì)胞因子由若干細(xì)胞類型產(chǎn)生，尤其是巨噬細(xì)胞。低水平TNF-a通過刺激成纖維細(xì)胞生長而促進(jìn)受損和衰老組織的重塑或置換。TNF-a的其它有益功能包括它在針對細(xì)菌和某些真菌、病毒和寄生蟲侵襲免疫應(yīng)答中的作用，以及它在特定腫瘤壞死中的作用。最終它在局部炎癥免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵性介導(dǎo)作用。TNF-a是一種急性期蛋白，它啟動細(xì)胞因子級聯(lián)并增加血管通透性，因此募集巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞到達(dá)感染部位。巨噬細(xì)胞分泌的TNF-a引起血凝固，起到遏制感染的作用。TNF-a也表現(xiàn)出慢性效應(yīng)(例如在炎癥中)，而且延長的過量產(chǎn)生的TNF-a也導(dǎo)致稱為惡病質(zhì)的病癥，其特征是厭食、凈分解代謝(netcatabolism)、體重減輕和貧血，而且發(fā)生在癌癥和AIDS等疾病過程中。巴因子)、Daniplestim、GADS(she下游GRB2相關(guān)連接物(GRB2relatedadapterdownstreamofshc))、造血細(xì)胞生長因子、造血細(xì)胞激酶、造血細(xì)胞磷酸酶、造血細(xì)胞共有的缺乏酪氨酸的激酶、造血集落刺激因子-309、血細(xì)胞生成素-1(hematopoietin-l)、血細(xì)胞生成素-2、Hemoregulatory肽、HIM、Hiwi、HnudC、progenipoietin、progenipoietin國l、progenipoietin畫2、progenipoietin-4、幼巨才亥細(xì)月包生成素(Promegapoietin)、幼巨沖亥細(xì)月包生成素-1、幼巨核細(xì)胞生成素-la和Synthokine。廣義上講，其它造血生長因子還包括各種集落刺激因子(參見CSF,包括G曙CSF、GM-CSF、M-CSF)、Epo、SCF(干細(xì)胞因子)、SCPF(干細(xì)胞增殖因子)、各種白介素(IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、ILll、IL12)、LIF、TGF-P、MIP-l-a、TNF-a，以及許多其它低分子量的因子和若干其它細(xì)胞因子。其中許多這樣的蛋白質(zhì)是多功能性的。它們在分化期的甚早期或在后期起作用；它們也可以譜系特異性方式起作用，或者可影響不止一種譜系。諸如Epo、M-CSF、G-CSF和IL5等晚作用鐠系特異性因子(late-actinglineage-specificfactor)控制定型祖細(xì)胞的增殖和成熟。多能祖細(xì)胞開始的活性細(xì)胞增殖受到一些重疊細(xì)胞因子(包括IL3、GM-CSF和IL4)的調(diào)節(jié)。觸發(fā)休眠原始祖細(xì)胞的周期并維持原始祖細(xì)胞的B細(xì)胞潛力，看來需要早期作用細(xì)胞因子的相互作用，所述細(xì)胞因子包括IL6、G-CSF、ILll、IL12、LIF和SCF。按其生物活性，將血細(xì)胞生成素分成若干亞群。術(shù)語1型血細(xì)胞生成素有時用于描述參與調(diào)節(jié)造血作用的因子，它們直接作用于某些細(xì)胞類型。該組包括IL3(multi-CSF)和GM-CSF。與集落刺激因子協(xié)同作用、但本身不具有內(nèi)在集落刺激活性的因子有時稱為2型血細(xì)胞生成素。它們包括IL1、IL4、IL5和IL6。3型血細(xì)胞生成素是通過刺激各產(chǎn)生細(xì)胞釋放集落刺激因子而調(diào)節(jié)造血細(xì)胞生長的那些血細(xì)胞生成素。它們包括IL1、IL2、TNF-(3和IFNy。一些因子對造血過程有負(fù)調(diào)節(jié)作用。它們可選擇性抑制某些類型的造血細(xì)胞的增殖，甚至引起細(xì)胞死亡。例如，轉(zhuǎn)化生長因子TGF-p，主要對原始造血細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞起作用。稱為MIP-l-a(巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1-a)的因子對原始成髓細(xì)月包(primitivemyelopoieticcell)表現(xiàn)出相似活性。合適的內(nèi)源草巴化合物包括參與血管發(fā)生的內(nèi)源化合物。參與血管發(fā)生的內(nèi)源化合物的實例包括16K促乳素、ADAMTS-1、ADAMTS-8、腎髓質(zhì)素、血管相關(guān)游走細(xì)胞蛋白、血管生成素、血管生成素相關(guān)蛋白、Angiomodulin、Angiomotin、促血管生成素-1、促血管生成素-2、促血管生成素-3、促血管生成素-4、促血管生成素-5、促血管生成素樣l、促血管生成素樣2、促血管生成素樣3、促血管生成素樣4、促血管生成素相關(guān)蛋白-2、血管生長抑素、血管緊張素-2、Angiotropin、ARP-2、B16-F1黑素瘤自分泌游動性因子、腦特異性血管發(fā)生抑制劑-1、腦特異性血管發(fā)生抑制劑-2、腦特異性血管發(fā)生抑制劑-3、C49a、CAM測定、軟骨衍生抗腫瘤因子、軟骨衍生抑制劑、CATF、cCAF、CD55、CDI、CDT6、軟骨細(xì)胞衍生抑制劑、軟骨細(xì)胞衍生血管發(fā)生和金屬蛋白酶活性抑制劑、Chondromodulin-1、軟骨肉瘤衍生生長因子、絨毛尿嚢膜測定CLAF、膠原18型、結(jié)締組織生長因子、黃體血管生成因子、脫粒抑制蛋白、EGF、EG-VEGF、胚腎衍生血管生成因子-1、胚腎衍生血管生成因子-2、內(nèi)分泌腺書亍生血管內(nèi)皮生長因子、Endorepellin、內(nèi)皮生長抑素、內(nèi)皮細(xì)胞刺激血管生成因子、內(nèi)皮細(xì)胞衍生生長因子、內(nèi)皮-單核細(xì)胞活化多肽-2、ESAF、f-ECGF、FGF、FGF-4、血纖蛋白片段E、成纖維細(xì)胞衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的分泌蛋白-12、FrzB2、GFB-lll、膠質(zhì)瘤衍生血管發(fā)生抑制因子、生長激素、GSM、HAF、觸珠蛋白、肝素結(jié)合神經(jīng)突促進(jìn)因子(promotingfactor)、肝細(xì)胞生長因子、HGF、HUAF、人血管生成因子、人抑制劑血管生成因子-1、人子宮血管生成因子、IFN-a、IFN卞IGF、IGF-1、IGF-BP-7、jagged、KAF、蒜制菌素(Rallistatin)、K-FGF、腎血管生成因子、kininostatin、遷移刺激因子、促分裂原調(diào)節(jié)蛋白/增殖蛋白、促分裂原調(diào)節(jié)蛋白-4、單核細(xì)胞-Angiotropin、MRP/PLF、MRP-4、神經(jīng)白細(xì)胞介素、神經(jīng)桂蛋白-1、NKG5、NLK、Notch-l、Notch-4、ORF-74、卵巢生長因子、PAF、曱狀旁腺激素樣相關(guān)蛋白、PD-ECGF、PDGF、PDGF-BB、PEDF、PF4、PGI、色素上皮衍生因子、胎盤生長因子、胎盤血管生成因子、血小板因子-4、血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、P1GF、PrGF、Prokineticin-l、增殖蛋白相關(guān)蛋白、前列環(huán)素刺激因子、前列腺生長因子、凝血酶原kringle-2域PRP、PTHrP、RNASE5、分散因子、腦信號蛋白-3、Sprouty、TAF、TAMF、TGF-a、TGF-(3、凝血酶、血小板反應(yīng)蛋白、TIE-1、TIE-2、組織因子、TNF-a、TNF-卩、TNF樣細(xì)胞凋亡弱誘導(dǎo)物、轉(zhuǎn)鐵蛋白、TSP、腫瘤血管生成因子、腫瘤自分泌游動性因子、Tumstatin、TWEAK、子宮血管生成因子、血管通透因子、Vasculotropin、VEGF、VEGF-162、VEGF-C、VEGF國D、VEGF-E、VEGI、VPF。.已經(jīng)知道，許多不同的生長因子和細(xì)胞因子對內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞能發(fā)揮趨化活性、促分裂活性、調(diào)節(jié)活性或抑制活性，因此有望以一種方式或另一種方式參與血管生成過程。該過程包括蛋白水解酶、胞外基質(zhì)組分、細(xì)胞粘附分子和血管活性因子的協(xié)同作用。調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞生長、趨化行為和/或功能活性的因子包括激活蛋白A、腎髓質(zhì)素、aFGF、ANF、血管生成素、血管緊張素-2、Betacellulin、bFGF、CLAF、ECDGF(內(nèi)皮細(xì)胞衍生生長因子)、ET(內(nèi)皮素)、因子X、因子Xa、HB-EGF、血管細(xì)胞增殖的心臟衍生抑制劑、IFN-y、IL1、LDGF(平滑肌瘤衍生生長因子)、MCP-1、MDGF(巨嗟細(xì)胞^[汴生生長因子、單核細(xì)胞衍生生長因子)、NPY、制瘤素M、PD-ECGF、PDGF、促乳素、蛋白S、SDGF(平滑肌細(xì)胞衍生生長因子)、SDMF(平滑肌細(xì)胞衍生遷移因子)、速激肽、TGF-P、血小板反應(yīng)蛋白。調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、趨化行為和/或功能活性的因子包括AcSDKP、aFGF、ANF、血管生成素、angiomodulin、Angiotropin、AtT20-ECGF、B61、bFGF、bFGF誘導(dǎo)活性、CAM畫RF、ChDI、CLAF、ECGF、ECI、EDMF、EGF、EMAP-2、Neurothelin(參見EMMPRIN)、內(nèi)皮生長抑素、內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制劑、內(nèi)皮細(xì)胞活力保持因子、Epo、FGF-5、IGF-2(參見血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長促進(jìn)活性)、HBNF、HGF、HUAF、IFN國y、IL1、K-FGF、LIF、MD-ECI、MECIF、NPY、制瘤素M、PD-ECGF、PDGF、PF4、P1GF、促乳素、TNF-a、TNF-|3、轉(zhuǎn)鐵蛋白、VEGF。這些因子中有些最初是因其它生物活性而檢出、但后來又表現(xiàn)出促進(jìn)血管發(fā)生的蛋白質(zhì)因子。在體內(nèi)具有血管生成活性的蛋白質(zhì)因子的一攬表包括成纖維細(xì)胞生長因子(參見FGF)、血管生成素、促血管生成素-1、EGF、HGF、NPY、VEGF、TNF-a、TGF-(3、PD-ECGF、PDGF、IGF、IL8、生長激素。也已經(jīng)知道血纖蛋白片段E具有血管生成活性。此外，促血管生成素-1等因子沒有起到傳統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的作用，而在血管生成和血管發(fā)生過程中起到主要作用。PF4和促乳素的16kDa片段是體內(nèi)抑制劑。合適的內(nèi)源靶化合物包括參與中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的形成和維護(hù)的內(nèi)源化合物，例如神經(jīng)營養(yǎng)因子，它能增強(qiáng)神經(jīng)元分化、誘導(dǎo)增殖、影響突觸功能并促進(jìn)神經(jīng)元存活(這樣的神經(jīng)元在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分化期間通常注定會死亡)。這些蛋白質(zhì)的實例包括神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，例如BDNF(腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子)、NGF、NT-3(神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3)、NT-4、NT-5、NT-6、NT-7、CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)、GDNF(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子)和Purpurin。bFGF或LIF等生長因子因其對大量神經(jīng)元的營養(yǎng)活性，所以通常也算是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。BDNF、NGF和NT-3有時也統(tǒng)稱為NGF蛋白家族，因為NGF是該蛋白質(zhì)家族的建設(shè)者成員(foundermember)。可通過來自NGF、BDNF和NT-3的結(jié)構(gòu)元件的組合，改造多功能Pan-神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-l(PNT-1),其可有效激活所有trk受體并表現(xiàn)出多重神經(jīng)營養(yǎng)特異性。另一神經(jīng)元存活因子是NSE(神經(jīng)元特異性烯醇化酶)。具有神經(jīng)營養(yǎng)活性、但通常并不屬于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、且通常具有各種功能的其它因子是EGF、HBNF(肝素結(jié)合神經(jīng)突促進(jìn)因子)、IGF-2、aFGF和bFGF、PDGF、NSE(神經(jīng)元特異性烯醇化酶)和激活蛋白A。有關(guān)影響神經(jīng)細(xì)胞的抗增殖生長因子另見神經(jīng)抗增殖蛋白、Astrostatine、GGIF(神經(jīng)膠質(zhì)生長抑制因子)。根據(jù)其生物活性，神經(jīng)突促進(jìn)因子(NPF)與神經(jīng)元分化因子之間是有區(qū)別的。神經(jīng)突促進(jìn)因子本身并不促進(jìn)神經(jīng)元存活或普通生長，而是需要除此之外的一種或多種神經(jīng)營養(yǎng)因子以誘導(dǎo)軸突或樹突增生。具有NPF活性的因子包括NGF、SIOO、GMF-p(神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子)、蛋白聚糖、分區(qū)蛋白、膠原、細(xì)胞粘附分子和層粘連蛋白。合適的內(nèi)源靶化合物包括參與傷口愈合的內(nèi)源化合物。血小板是局部活性生長因子和細(xì)胞因子的充足來源。血小板衍生因子包括腺苷二核苷酸(其誘導(dǎo)血小板聚集并刺激細(xì)胞增殖和遷移)、(3-血小板球蛋白、bFGF、CTAP-3(結(jié)締組織活化蛋白-3)、EGF、嗜酸性粒細(xì)胞趨化多肽-1(即RANTES)、f-ECGF(成纖維細(xì)胞衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)、纖連蛋白(其起到血小板聚集的早期基質(zhì)配體的作用)、HCI(人膠原酶抑制劑)、HGF(肝細(xì)胞生長因子)、HRF(組胺釋放因子)、IGF-BP-3、NAP-2(嗜中性粒細(xì)胞活化蛋白-2)、NAP-4(嗜中性粒細(xì)胞活化蛋白-4)、PBP(血小板堿性蛋白)、PD-ECGF(血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)、PDGF、PF4、血小板活化因子(PAF、也參與血小板聚集)、5-羥色胺(其誘導(dǎo)血管通透性，而且是嗜中性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘物)、促生長素抑制素、TGF-a、TGF-f3、血栓烷A2(其參與血管收縮、血小板聚集和趨化性)、玻連蛋白。循環(huán)外周血白細(xì)胞遷移到傷口部位。首先出現(xiàn)在傷口區(qū)的細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量在受傷后約24小時到達(dá)峰水平。它們的遷移受到各種趨化因子和細(xì)胞因子以及細(xì)菌多糖的刺激，所述趨化因子和細(xì)胞因子包括補體因子、IL1、TNF-a、TGF-(3和趨化因子(例如IL8、GRO-a、PF4、MCP-1、IP-IO、mig)。嗜中性粒細(xì)胞通過選擇蛋白的方式粘附到內(nèi)皮上，所述選擇蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞表面起到嗜中性粒細(xì)胞受體的作用。嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白受體有助于讓嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合到胞外基質(zhì)上。在沒有感染時，嗜中性粒細(xì)胞看來并不在傷口愈合中起關(guān)鍵性作用，因為在耗盡嗜中性粒細(xì)胞的動物中傷口也可以愈合。當(dāng)不再需要嗜中性粒細(xì)胞時，它們就:故組織巨噬細(xì)月包除去。單核細(xì)胞在受傷后約24小時出現(xiàn)，并在受傷后48小時達(dá)到峰值。因為單核細(xì)胞成熟為巨噬細(xì)胞，所以認(rèn)為它們是引發(fā)修復(fù)過程的細(xì)胞因子的必要來源。巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞也受到不同趨化因子的吸引。這些趨化因子能促進(jìn)白細(xì)胞亞群在空間和時間上的不同浸潤并因此在傷口修復(fù)期間整合炎癥和修復(fù)過程。組織巨噬細(xì)胞是控制和調(diào)節(jié)傷口愈合過程的必要細(xì)胞；缺乏傷口巨噬細(xì)胞的實驗表明，如果沒有這些細(xì)胞的參與，傷口就不能愈合。巨噬細(xì)胞的分化^^由若干特異性細(xì)胞因子引起的?；罨奘杉?xì)胞產(chǎn)生和分泌許多細(xì)胞因子，更有助于炎性細(xì)胞遷移到傷口區(qū)。巨噬細(xì)胞也控制胞外基質(zhì)的降解并調(diào)節(jié)傷口基質(zhì)的重塑。巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和生長因子，包括TGF-(3、FGF、VEGF和趨化因子，例如JE。TGF-(5看來是負(fù)責(zé)肉芽組織形成和胞外基質(zhì)蛋白合成的主要因子，因此稱為"創(chuàng)傷激素"。TGF-P是最復(fù)雜的細(xì)胞因子超家族之一的成員，由各種TGF-(5同種型和其它家族成員(例如激活蛋白A和BMP)組成。通過對TGF-(3超家族成員比例、尤其是TGF-P-1與TGF-(3-3的比例進(jìn)行操作以減少瘢痕形成和纖維化的觀察，說明了傷口愈合過程的復(fù)雜性。上皮再形成是由生長因子EGF家族的趨化和促分裂原性生長因子介導(dǎo)的。已經(jīng)知道瘦蛋白是傷口愈合期間角質(zhì)形成細(xì)胞的強(qiáng)效生長因子。傷口愈合末期的特征是結(jié)締組織逐漸取代肉芽組織。該過程也需要局部作用的細(xì)胞因子。然而，對一旦修復(fù)過程完成后最終限制組織生長的因子和機(jī)制卻知之甚少。TGF-(3及其相關(guān)因子等剌激膠原和蛋白酶抑制劑的合成。傷口閉合和瘢痕發(fā)展與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顯著縮小(包括典型的肌成纖維細(xì)胞的消失)有關(guān)。已經(jīng)認(rèn)為，由細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞死亡就是負(fù)責(zé)肉芽組織演變成瘢痕的機(jī)制。胎兒傷口愈合的突出特點就是沒有瘢痕。有證據(jù)表明，胎兒和成人成纖維細(xì)胞在遷移活性、對細(xì)胞因子的促運動原響應(yīng)(motogenicresponse)和促運動原細(xì)胞因子(motogeniccytokine)的合成、生長因子和基質(zhì)大分子等表型上是不同的。通過利用生長因子和細(xì)胞因子的作用，可以加速或改變傷口愈合。動物實驗和臨床經(jīng)驗都已證明，局部給予不同細(xì)胞因子(包括bFGF、EGF、KGF、PDGF、TGF-卩，單用或聯(lián)用)，可通過刺激肉芽組織形成并增強(qiáng)上皮形成而加速傷口愈合。合適的內(nèi)源靶化合物包括炎癥的急性期蛋白。這類蛋白質(zhì)及其功能的合適實例見下表2。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>血纖蛋白溶解纖溶酶原激活物抑制劑國l蛋白酶抑制劑凝血酶原血纖蛋白基質(zhì)的凝塊形成，用于修復(fù)血清淀粉樣蛋白A膽固醇和HDL清除劑血清淀粉樣蛋白-P形成IgG免疫復(fù)合物馮維勒布蘭德因子(vonWillebrand因子)凝固蛋白ILlm(ILl受體拮抗劑)ILlra急性期蛋白的主要誘導(dǎo)物是IL1、IL6和TNF。IL1和IL6兩種介質(zhì)已經(jīng)用于將急性期蛋白分為兩個亞類。1型急性期蛋白是需要IL6和IL1協(xié)同作用的蛋白質(zhì)，用于最大量合成。l型蛋白的實例是C-反應(yīng)蛋白、血清淀粉酶A和a-l酸性糖蛋白。2型急性期蛋白是需要IL6的蛋白質(zhì)，僅用于最大誘導(dǎo)。2型蛋白的實例是血纖蛋白原鏈、觸珠蛋白和a-2-巨球蛋白。編碼2型急性期蛋白的基因的表達(dá)經(jīng)常受到IL1的抑制、而不是增強(qiáng)(Ramadori等；Fey等)。細(xì)胞因子與影響急性期蛋白表達(dá)的其它介質(zhì)之間的相加、協(xié)同、合作和拮抗效應(yīng)確實發(fā)生了，并且已經(jīng)在幾乎所用組合中都觀察到。許多細(xì)胞因子也表現(xiàn)出不同效應(yīng)，誘導(dǎo)一種或兩種急性期蛋白(而不是其它蛋白)的合成。例如，激活蛋白A誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中的急性期蛋白亞類。細(xì)菌脂多糖和若干細(xì)胞因子(主要是IL1、IL6和TNF,也可以是LIF、CNTF、制瘤素M、IL11和心肌營養(yǎng)蛋白-l)參與SAA合成的誘導(dǎo)，這些細(xì)胞因子中的某些起到協(xié)同作用(Benigni等)。IL1和IFN-Y降j氐IL6的某些效應(yīng)。IL2和IL6的某些效應(yīng)受到TGF-(3的拮抗。兩種或甚至更多細(xì)胞因子的組合作用可產(chǎn)生一種因子自身無法達(dá)到的效應(yīng)。在培養(yǎng)的HepG2肝癌細(xì)胞中，IL1、IL6、TNF-a和TGF-(3誘導(dǎo)抗胰凝乳蛋白酶的合成，并同時遏制白蛋白和AFP(甲胎蛋白)的合成。血纖蛋白原的合成受到IL6的誘導(dǎo)，該效應(yīng)反過來又受到ILl-a、TNF-a或TGF-P-1的抑制。合適的內(nèi)源輩巴化合物包括參與止血和凝固級聯(lián)的內(nèi)源化合物。除了參與調(diào)節(jié)毛細(xì)血管通透性和血管張力之外，血管內(nèi)皮還在維護(hù)非凝血酶原表面中起到?jīng)Q定性作用，即通過提供凝固和血纖蛋白溶解的激活物和抑制劑。內(nèi)皮也參與調(diào)節(jié)各種免疫過程。在內(nèi)皮細(xì)胞中，IL1誘導(dǎo)以下各種因子的合成集落刺激因子、IL6、TNF-a、前列腺素、血小板激活因子(PAF)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)。IL1的一個重要的內(nèi)源調(diào)節(jié)物就是PGE2，其抑制IL1和TNF-a的分泌。TNF-a誘導(dǎo)組織凝血激酶(tissuethromboplastin,TPL)的合成，其參與因子X激活物復(fù)合物的形成，后者催化產(chǎn)生凝血酶。該復(fù)合物也激活因子IX。TNF-ot也誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞合成ILl,該IL1也可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TPL。TNF-a的合成也受到IL1的誘導(dǎo)。TNF-a和IL1也可誘導(dǎo)細(xì)胞表面抗原的合成。粘附分子的表達(dá)增加了血管壁上的淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞的粘附，因此有助于這些細(xì)胞的跨越內(nèi)皮的遷移。TNF-a和ILl下調(diào)蛋白C鈍化系統(tǒng)，即通過抑制凝血調(diào)制蛋白的合成。凝血調(diào)制蛋白與凝血酶結(jié)合，能活化蛋白C，其可與膜結(jié)合蛋白S形成復(fù)合物。這些復(fù)合物抑制因子Va?；罨牡鞍證也通過復(fù)合作用而中和纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)。因此，TNF-a和IL1減少了因子Va的鈍化。參與凝固的其它合適的內(nèi)源靶化合物包括激肽釋放酶、因子XII、因子XIb、因子XI、因子XIa、因子IX、因子IXa、因子VIII、因子VIIIa、因子X、因子Xa、因子Va、因子XIIIa、凝血酶原、凝血酶、血纖蛋白原、血纖蛋白、纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶。合適的內(nèi)源耙化合物也包括激素，例如應(yīng)激激素(例如腎上腺素(Adrenaline)、促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)酮、腎上腺素(Epinephrine),生長激素、氫化可的松)、體';^/電解質(zhì)和血管激素(例如醛甾酮、雄烯二酮、血管升壓素、緩激肽、降鈣素、神經(jīng)降壓肽)、肝和消化激素(例如縮膽嚢素、膽固醇、VIP)、生殖激素(例如絨毛膜促性腺激素、Epogen、雌二醇、雌三醇、雌酮、本膽烷醇酮、FSH、催乳激素、促黃體生成激素、睪酮、催產(chǎn)素、黃體酮、促乳素、促性腺激素)、糖處理激素(例如胰高血糖素、胰島素)、曱狀腺激素(例如T2、T3、T4、促曱狀腺激素、促甲狀腺釋放因子、TSH、曱狀旁腺激素)、骨激素(例如CSF-1、RANKL、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族成員)和其它激素，例如促曱狀腺激素(TSH)、促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)、促乳素(PRL)、生長激素(GH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、抗利尿激素(ADH)(血管升壓素)、催產(chǎn)素、促曱狀腺激素-釋放激素(TRH)、促性腺激素-釋放激素(GnRH)、生長激素-釋放激素(GHRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放激素(CRH)、促生長素抑制素、多巴胺、褪黑激素、曱狀腺素(T4)、降鈣素、曱狀旁腺激素(PTH)、糖皮質(zhì)激素(例如皮質(zhì)醇)、鹽皮質(zhì)激素(例如醛甾酮)、雄激素(例如睪酮)、腎上腺素類(腎上腺素)、去曱腎上腺素類(去曱腎上腺素)、雌激素(例如雌二醇)、黃體酮、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰島淀粉樣多肽、紅細(xì)胞生成素(EPO)、鈣三醇、鈣化醇(維生素D3)、心房鈉尿肽(ANP)、胃泌素、胰泌素、縮膽嚢素(CCK)、促生長素抑制素、神經(jīng)肽Y、生長素釋放肽、PYY3-36、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、血管緊張素原、血小板生成素、瘦蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白4和脂連蛋白。其它合適的激素列于下表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表4提供了并非詳盡的合適內(nèi)源靶化合物和用本文所述的配體針對內(nèi)源化合物的優(yōu)選治療藥的列表。"示例性標(biāo)識符"欄提供ChemicalAbstractsServices(CAS)注冊號(美國化學(xué)協(xié)會(AmericanChemicalSociety)出版)和/或Genbank檢索號((例如LocusID,NP—XXXXX(ReferenceSequenceProtein),而XP—XXXXX(ModelProtein)標(biāo)識符是來自國立生物4支術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)的www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)^i,其對應(yīng)于CASRegistry或Genbankdatabase的條目，其含有內(nèi)源耙化合物或內(nèi)源耙化合物的片段或變異體的氨基酸序列。有關(guān)這些CAS和Genbank和GenSeq檢索號的概要頁以及所引用的期刊出版物(例如PubMedIDnumber(PMID》都通過引用全部結(jié)合到本文中，尤其是其中所述的氨基酸序列。"生物活性"欄描述了內(nèi)源靶分子有關(guān)的生物活性。"優(yōu)選適應(yīng)癥"欄描述了用包含具有指定內(nèi)源革巴化合物結(jié)合特異性結(jié)合位點的部分的配體進(jìn)行治療、預(yù)防、診斷或改善的疾病、障礙和/或病癥。本發(fā)明也涉及包含具有表4所列舉的任何內(nèi)源耙化合物結(jié)合特異性結(jié)合位點的部分的配體在制備用于治療表4所公開的任何相應(yīng)的優(yōu)選適應(yīng)癥的藥物中的用途。本發(fā)明也涉及表4所列舉的任何優(yōu)選適應(yīng)癥的治療方法，所述方法包括給予有需要的患者有效量的包含具有表4所列舉的相應(yīng)內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性結(jié)合位點的部分的配體。表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>上面所列舉的內(nèi)源靶化合物并不是詳盡而無遺漏的。當(dāng)配體與兩個表位(在相同或不同抗原上)結(jié)合時，抗原可從該表中選取。在具體的實施方案中，配體包含能結(jié)合TNFR1的dAb以及能結(jié)^任一這些抗原的笫二dAb或表位結(jié)合域。在這樣的實施方案中，多特異性配體可包括免疫球蛋白可變區(qū)的任何組合(例如VHVH、VHVL、VLVL)。與血清白蛋白結(jié)合的配體和dAb單體本發(fā)明提供配體或dAb單體(例如包含這樣的dAb的雙特異性配體)，其與血清白蛋白(SA)結(jié)合的&為lnM~500yM(即lxl0-9~5x10,、優(yōu)選100nM~10jiM。優(yōu)選對于含有第一抗SAdAb和針對另一耙標(biāo)的笫二dAb的雙特異性配體來說，笫二dAb對其耙標(biāo)的親和力(例如經(jīng)采用BiaCore進(jìn)行表面等離子共振測定的&和/或K解離)為笫一dAb對SA的親和力的1-100000倍(優(yōu)選100-100000倍、更優(yōu)選1000-100000倍、或10000-100000倍)。例如，第一dAb結(jié)合SA的親和力約為IOmM，而第二dAb結(jié)合其靶標(biāo)的親和力為100pM。優(yōu)選的血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一個實施方案中，笫一dAb(或dAb單體)與SA(例如HSA)結(jié)合的&約為S0nM、優(yōu)選？0nM、更優(yōu)選100nM、150nM或200nM。在某些實施方案中，與SA結(jié)合的dAb單體能抵抗聚集、可逆地解折疊和/或包含如上所述的構(gòu)架區(qū)，該架構(gòu)區(qū)用于能結(jié)合TNFR1的dAb單體。配體形式配體和dAb單體可以精制成為單特異性或多特異性抗體或抗體片段或者單特異性或多特異性非抗體結(jié)構(gòu)。合適的形式包括任何合適的多肽結(jié)構(gòu)，其中抗體可變區(qū)或其一個或多個CDR可以結(jié)合起來，以便在結(jié)構(gòu)上賦予對抗原的結(jié)合特異性。各種合適的抗體形式是本領(lǐng)域已知的，例如IgG樣形式、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同型二聚體和異型二聚體、任何前述抗體的抗原結(jié)合片段(例如Fv片段(例如單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段)、單可變區(qū)(例如VH、VL、VHH)、dAb和任何前述抗體的修飾形式(例如通過共價連接聚烷二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其它合適的聚合物)而修飾)。參見PCT/GB03/002804(2003年6月30日申請，指定國為美國，公布號為WO2004/081026)有關(guān)單可變區(qū)和dAb的PEG化、其合適的制備方法、PEG化單可變區(qū)和dAb單體和多聚體的延長的體內(nèi)半衰期、合適的PEG、優(yōu)選的流體動力學(xué)尺寸的PEG和優(yōu)選的流體動力學(xué)尺寸的PEG化單可變區(qū)和dAb單體和多聚體。PCT/GB03/002804(WO2004/081026)的全部公開內(nèi)容，包括上面提及的部分，全都通過引用結(jié)合到本文中。配體可以精制成為所需dAb單體的二聚體、三聚體或多聚體，例如使用合適的接頭，例如(Gly4Ser)n,其中n=l-8，例如2、3、4、5、6或7。如有必要，配體，包括dAb單體、二聚體和三聚體，可以連接抗體Fc區(qū)，該區(qū)包括Ch2和CH3區(qū)的一個或兩個，以及任選的鉸鏈區(qū)。例如，編碼將單核苷酸序列連接Fc區(qū)的配體的載體，可用于制備所迷多肽。配體和dAb單體可以結(jié)合和/或制成非抗體多配體結(jié)構(gòu)的形式，以形成多價復(fù)合物，其結(jié)合具有相同抗原的靶分子，因而提供較高親合力。例如，天然細(xì)菌受體(例如SpA)已經(jīng)用作移植CDR的支架，以產(chǎn)生能特異性結(jié)合一個或多個表位的配體。該方法的細(xì)節(jié)參見US5,831,012。其它合適的支架包括基于纖連蛋白和親和體的支架。合適方法的細(xì)節(jié)參見WO98/58965。其它合適的支架包括脂質(zhì)運栽蛋白和CTLA4(參見vandenBeuken等，/Afo/.Bz'o/.(2001)310,591-601)以及例如描述于WO00/69907(MedicalResearchCouncil)的支架，所述支架是基于例如細(xì)菌GroEL的環(huán)狀結(jié)構(gòu)或其它陪伴分子多肽。蛋白質(zhì)支架可以進(jìn)行組合；例如，CDR可以移植到CTLA4支架上并且與免疫球蛋白Vh區(qū)或Vl區(qū)一起使用，以構(gòu)成配體。同樣，纖連蛋白、脂質(zhì)運載蛋白和其它支架也可以進(jìn)行組合。制備任何所需形式的各種合適方法是本領(lǐng)域已知的，例如，可通過表達(dá)合適的表達(dá)構(gòu)建體和/或培養(yǎng)合適的細(xì)胞(例如雜交瘤、雜合雜交瘤、含有編碼所述形式"重組構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞))，來制備抗體鏈和形式(IgG樣形式、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同型二聚體和異型二聚體)。此外，可以通過表達(dá)合適的表達(dá)構(gòu)建體，或者通過酶促消化抗體(例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)，制備抗體或抗體鏈的抗原結(jié)合片段(例如Fv片段(例如單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段)等形式。配體可以精制成為雙特異性配體或多特異性配體，例如WO03/002609所述，所述文獻(xiàn)的^p公開內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中。雙特異性配體包含各自具有不同特異性的免疫球蛋白單可變區(qū)。這些雙特異性配體可包含重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)的組合。例如，雙特異性配體可包含VH區(qū)和VL區(qū)，這兩區(qū)可以連接在一起呈scFv的形式(例如使用合適的接頭，例如Gly4Ser)或精制成為雙特異性抗體或其抗原結(jié)合片段(例如F(ab')2片段)。雙特異性配體不包含互補VH/Vt對，其構(gòu)成能協(xié)同結(jié)合抗原或表位的常規(guī)雙鏈抗體抗原結(jié)合位點。相反，雙重形式配體包含VH/Vt互補對，其中V區(qū)具有不同特異性。此外，雙特異性配體可包含一個或多個CH區(qū)或Q區(qū)，如有必要的話。鉸鏈區(qū)也可包含在其中，如有必要的話。這樣的各區(qū)組合可以是例如模擬天然抗體，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab')2分子。也考慮了其它結(jié)構(gòu)，例如包含VH、VL、CV和&區(qū)的IgG分子的單臂。優(yōu)選本發(fā)明的雙特異性配體僅包含兩個可變區(qū)，盡管幾個這樣的配體也能結(jié)合在一起成為同一蛋白質(zhì)，例如兩個這樣的配體可以結(jié)合成IgG或多聚體形式的免疫球蛋白，例如IgM。或者，在另一實施方案中，多個雙特異性配體結(jié)合形成多聚體。例如，兩個不同雙特異性配體結(jié)合在一起，以產(chǎn)生四特異性分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明方法所產(chǎn)生的雙特異性配體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，可以在同一多肽鏈上或者在不同多肽鏈上。就可變區(qū)在不同多肽鏈上而言，它們可以通過接頭、通常是柔性接頭(例如多肽鏈)、化學(xué)連接基團(tuán)而連接，或者通過本領(lǐng)域已知的任何其它方法而連接。多特異性配體具有不止一個表位結(jié)合特異性。通常，多特異性配體包含兩個或更多個表位結(jié)合域，例如包含表位的結(jié)合位點的dAb或非抗體蛋白域，例如親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)、avimer。多特異性配體可按本文所述進(jìn)一步精制。在某些實施方案中，配體是IgG樣形式。這類形式具有常規(guī)IgG分子的4條鏈結(jié)構(gòu)(2條重鏈和2條輕鏈)，其中一個或多個可交區(qū)(Vh和/或VJ已經(jīng)被具有所需特異性的dAb即單可變區(qū)取代。優(yōu)選各可變區(qū)(2個VH區(qū)和2個VL區(qū))被dAb即單可變區(qū)取代。包括在IgG樣形式中的dAb即單可變區(qū)可具有相同特異性或不同特異性。在某些實施方案中，IgG樣形式是四價的，并且可具有l(wèi)、2、3或4種特異性。例如，IgG樣形式可以是單特異性的，并且包含4個具有相同特異性的dAb;可以是雙特異性的，并且包含3個具有相同特異性的dAb和另一具有不同特異性的dAb;可以是雙特異性的，并且包含2個具有相同特異性的dAb和兩個具有共同、卻不同特異性的dAb;可以是三特異性的，并且包含具有相同特異性的笫一和第二dAb，具有不同特異性的第三dAb，具有不同于第一、笫二和笫三dAb的特異性的第四dAb;或者可以是四特異性的，并且包含4個各自具有不同特異性的dAb?？梢灾苽銲gG樣形式的抗原結(jié)合片段(例如Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFy)。優(yōu)選的IgG樣形式或其抗原結(jié)合片段不交聯(lián)TNFR1。半衰期延長形式可以改造配體，以延長體內(nèi)血清半衰期。增加的體內(nèi)半衰期可用于免疫球蛋白、尤其是抗體、最尤其是小體積的抗體片段(例如dAb)的體內(nèi)應(yīng)用。這樣的片段(Fv、二硫鍵連接的Fv、Fab、scFv、dAb)從體內(nèi)快速清除掉，這極大地限制了臨床應(yīng)用。配體(例如dAb單體)可被精制成為具有較大流體動力學(xué)尺寸，例如通過連接聚烷二醇基團(tuán)(例如聚乙二醇(PEG)基團(tuán)、聚丙二醇基團(tuán))、血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或其至少轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分、抗體Fc區(qū)，或者通過與抗體區(qū)綴合。在某些實施方案中，配體被PEG化。優(yōu)選PEG化配體結(jié)合內(nèi)源草巴化合物的親和力與未PEG化的相同配體的親和力基本上相同。例如，配體可以是能結(jié)合內(nèi)源耙化合物的PEG化dAb單體，其中PEG化dAb單體結(jié)合所述內(nèi)源把化合物的親和力，與未PEG化形式的dAb的親和力之間的差異不超過約1000倍、優(yōu)選不超過約100倍，更優(yōu)選不超過約10倍，或者前者的親和力相對于未PEG化形式的親和力來說基本不變。小配體，例如dAb單體，可精制成為抗體的較大抗原結(jié)合片段(例如精制成為Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')2、IgG、scFv)?？梢酝ㄟ^將拮抗劑與能結(jié)合本文所述的能延長體內(nèi)半衰期的抗原或表位的結(jié)合域(例如抗體或抗體片段)綴合或連接，從而增加拮抗劑(例如配體，dAb單體)的流體動力學(xué)尺寸及其血清半衰期。例如，配體(例如dAb單體)可以與抗血清白蛋白或抗新生動物Fc受體抗體或抗體片段(例如抗SA或抗新生動物Fc受體dAb、Fab、Fab'或scFv)或與抗SA親和體或抗新生動物Fc受體親和體綴合或連接?？刹捎帽绢I(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，測定本發(fā)明配體(例如dAb單體和多聚體)的流體動力學(xué)尺寸。例如，凝膠過濾色譜可用于測定配體的流體動力學(xué)尺寸。用于測定配體的流體動力學(xué)尺寸的合適凝膠過濾基質(zhì)，例如交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)，是眾所周知的并且容易得到。根據(jù)所需用途，配體形式的尺寸(例如與具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的結(jié)合部分連接的PEG部分的尺寸)可以不同。例如，當(dāng)準(zhǔn)備將配體留在循環(huán)中并進(jìn)入外周組織，最好保持配體低的流體動力學(xué)尺寸，以便從血流中外滲(extravazation)?；蛘撸?dāng)需要配體在體循環(huán)中保持較長時間時，可通過例如形成Ig樣蛋白或者通過加入30kDa~60kDaPEG部分，以增加配體大小。本發(fā)明配體所用的合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體的實例參見WO2005/077042A2,所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。具體地講，下面的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體可用于本發(fā)明SEQE)NO:1(公開于WO2005/077042A2，該序列通過引用明確地結(jié)合到本說明書中)；白蛋白片段或變異體，其包含WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸1-387或由其組成；白蛋白或其片段或變異體，其包含選自以下的tj^酸序列(a)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的絲酸54-61;(b)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的狄酸76-89;(c)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的#^酸92-100;(d)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的#^酸170-176;(e)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的餘酸247-252;(f)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的絲酸266-277;(g)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的絲酸280-288;(h)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的^J^酸362-368;(i)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的^J^酸439-447;(j)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的絲酸462-475;(k)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氬基酸478-486;和(l)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸560-566。用于本發(fā)明配體的合適白蛋白、其片段和類似物的其它實例參見WO03/076567A2,所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。具體地講，下面的白蛋白、片段或變異體可用于本發(fā)明人血清白蛋白，參見WO03/076567A2,例如在圖3中(該序列信息通過引用明確地結(jié)合到本說明書中)；^jk清白蛋白(HA),它由585個M酸的單一非糖基化多肽鏈組成，分子量為66,500(參見Meloun等，F(xiàn)5^S58:136(1975);Behrens等，濕尸roc.34:591(1975);Lawn等,iVwc/ezc爿c/^si^ean:/29:6102-6114(1981);Minghetti等，丄販C/j亂261:6747(1986》；白蛋白多態(tài)變異體或其類似物或片段，參見Weitkamp等,力"".〃鼠37:219(1973);白蛋白片段或變異體，參見EP322094，例如HA(l-373)、HA(l-388)、HA(l-389)、HA(1國369)和HA(1-419)以及1-369和1-419間的片羊殳；白蛋白片段或變異體，參見EP399666，例如HA(1-177)和HA(l-200)和HA(1-X)之間的片段，其中X為178-199間的任意數(shù)字。當(dāng)(一個或多個)半衰期延長部分(例如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及其片段和類似物)用于本發(fā)明的配體時，可以用任何合適方法將其綴合，例如通過與具有內(nèi)源耙化合物結(jié)合位點的結(jié)合部分直接融合，例如通過使用編碼融合蛋白的單個核苷酸構(gòu)建體，其中融合蛋白編碼成為單一多肽鏈和半衰期延長部分(位于tnfr1結(jié)合部分的n端或c端)。或者，可以通過使用各部分間的肽接頭(例如WO03/076567A2或wo2004/003019所述的肽接頭(這些接頭的全部公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本說明書中，以提供用于本發(fā)明的實例))，來完成綴合反應(yīng)。通常，能延長體內(nèi)血清半衰期的多肽是體內(nèi)天然存在的多肽，它^i元通過內(nèi)源機(jī)制所致的降解和/或清除，所述機(jī)制能夠從生物體(例如人)體內(nèi)除去不想要的物質(zhì)。例如，可以從胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、血液中的蛋白質(zhì)、血腦屏障或神經(jīng)組織中的蛋白質(zhì)、局限于腎、肝、肺、心、皮膚或骨中的蛋白質(zhì)、應(yīng)激蛋白、疾病特異性蛋白或參與Fc轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)中，選出能延長體內(nèi)血清半衰期的多肽。能延長體內(nèi)血清半衰期的合適多肽包括例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性酉己體-神經(jīng)藥物(neuropharmaceuticalagent)融合蛋白(參見美國專利中)、腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(例如可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)、胰島素、胰島素樣生長因子1(IGF1)受體、胰島素樣生長因子2(IGF2)受體、胰島素受體、血液凝固因子X、al-抗胰蛋白酶和HNFla。延長血清半衰期的合適多肽也包括oc-l糖蛋白(血清類粘蛋白(orosomucoid);AAG)、a-l抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、a國l微球蛋白(蛋白HC;AIM)、抗凝血酶III(ATIII)、載脂蛋白A-l(ApoA-l)、栽脂蛋白B(ApoB)、血漿銅藍(lán)蛋白(Cp)、補體成分C3(C3)、補體成分C4(C4)、Cl酯酶抑制劑(C1INH)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、鐵蛋白(FER)、血紅素結(jié)合蛋白(HPX)、脂蛋白(a)(Lp(a))、甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)、肌紅蛋白(Myo)、前白蛋白(曱狀腺素視黃質(zhì)運栽蛋白；PAL)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)和類風(fēng)濕因子(RF)。來自胞外基質(zhì)的合適蛋白質(zhì)例如膠原、層粘連蛋白、整聯(lián)蛋白和纖連蛋白。膠原是胞外基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)。目前已經(jīng)知道約15種膠原分子，在身體的不同部位發(fā)現(xiàn)，例如I型膠原(占身體總膠原的90%)在骨、皮膚、腱、韌帶、角膜、內(nèi)臟中發(fā)現(xiàn)，而II型膠原在軟骨、推間盤(invertebraldisc)、脊索、眼睛的玻璃體中發(fā)現(xiàn)。來自血液的合適蛋白質(zhì)包括例如血漿蛋白(例如血纖蛋白、ot-2巨球蛋白、血清白蛋白、血纖蛋白原(例如血纖蛋白原A、血纖蛋白原B)、血清淀粉樣蛋白A、觸珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宮球蛋白和(3-2-微球蛋白、酶和酶抑制劑(例如纖溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、a-l-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制劑)、免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)(例如免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈(K/X))、轉(zhuǎn)運蛋白(例如視黃醇結(jié)合蛋白、a-l艱t球蛋白)、防衛(wèi)素(例如P-防衛(wèi)素1、嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素1、嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素2和嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素3)等。血腦屏障或神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的合適蛋白質(zhì)，包括例如黑皮質(zhì)素受體、髓磷脂、抗壞血酸轉(zhuǎn)運蛋白等。延長體內(nèi)血清半衰期的合適多肽也包括局限于腎臟的蛋白質(zhì)(例如多嚢蛋白、IV型膠原、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運蛋白Kl、Heymann抗原)、局限于肝臟的蛋白質(zhì)(例如醇脫氫酶，G250)、局限于肺部的蛋白質(zhì)(例如分泌成分，其結(jié)合IgA)、局限于心臟中的蛋白質(zhì)(例如HSP27，它與擴(kuò)張型心肌病相關(guān))、局限于皮膚的蛋白質(zhì)(例如角蛋白)、骨特異性蛋白(例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，它們是表現(xiàn)出成骨活性(osteogenicactivity)的轉(zhuǎn)化生長因子P超家族亞類(例如BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8》、腫瘤特異性蛋白(包括滋養(yǎng)層抗原、herceptin受體、雌激素受體、組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B，其在肝和脾中發(fā)現(xiàn))。合適的疾病特異性蛋白，包括例如僅在活化T細(xì)胞上表達(dá)的抗原，包括LAG-3(淋巴細(xì)胞活化基因)、護(hù)骨蛋白(osteoprotegerin)配體(OPGL),參見Mm^e402，304-309(1999))、OX40(TNF受體家族成員，在活化T細(xì)胞上表達(dá)并在人T細(xì)胞白血病病毒I型(HTLV-I)產(chǎn)生細(xì)胞中被特異性上調(diào)；參見J./mww"o/,165(1):263-70(2000))。合適的疾病特異性蛋白還包括例如金屬蛋白酶(與關(guān)節(jié)炎/癌癥有關(guān))，包括CG6512果蠅屬(Drosophila)、人截癱蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH;和血管生成生長因子，包括酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)、血管內(nèi)皮生長因子/血管通透因子(VEGF/VPF)、轉(zhuǎn)化生長因子-ot(TGFa)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、血管生成素、白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、血小板衍生內(nèi)皮生長因子(PD-ECGF)、胎盤生長因子(P1GF)、中期因子(midkine)血小板衍生生長因子-BB(PDGF)和CX3C趨化因子。延長體內(nèi)血清半衰期的合適多肽還包括應(yīng)激蛋白，例如熱激蛋白(HSP)。HSP通常在胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。當(dāng)在胞外發(fā)現(xiàn)它們時，就表明細(xì)胞已經(jīng)死亡并溢出其內(nèi)容物。這樣的非程序性細(xì)胞死亡(壞死)僅當(dāng)作為創(chuàng)傷、疾病或損傷的結(jié)果時才發(fā)生，胞外HSP觸發(fā)免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。結(jié)合胞外HSP,可以使本發(fā)明組合物局限于疾病部位。合適的蛋白質(zhì)參與Fc轉(zhuǎn)運，包括例如Bmmbdl受體(也稱為FcRB)。該Fc受體具有兩個功能，這兩者可潛在用于遞送。其功能是(l)跨越胎盤將IgG從母親轉(zhuǎn)運給孩子，(2)保護(hù)IgG免遭降解，因而延長IgG的血清半衰期。認(rèn)為受體從核內(nèi)體中再循環(huán)IgG。(參見Holliger等，胸胸ec/wo/15(7):632-6(1997》。藥代動力學(xué)分析方法和配體半衰期的測定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。有關(guān)細(xì)節(jié)可參見Kenneth，A等，ChemicalStabilityofPharmaceuticals:AHandbookforPharmacists和Peters等，Pharmacokinetcanalysis:APracticalApproach(1996)。參考文獻(xiàn)也可參見"Pharmacokinetics",MGibaldi&DPerron,MarcelDekker出版，2ndRev.exedition(1982),該文獻(xiàn)介紹了藥代動力學(xué)參數(shù)，例如ta和tp半衰期和曲線下面積(AUC)。用于評價內(nèi)源耙化合物功能的測定以下測定、其合適修改和其它合適測定可用于評價內(nèi)源靶化合物的活性，并評價配體是否基本上抑制它所結(jié)合的內(nèi)源靶化合物的活性?？赏ㄟ^測定載脂蛋白-介導(dǎo)的脂質(zhì)從培養(yǎng)細(xì)胞的流出量，測定ABC-1功能(ZC7Z"/"ve"1999年10月；104(8):R25-31)。采用細(xì)胞毒性測定，可以在體外測定FGFl-假單胞菌外毒素嵌合體功能(尸wc扁爿c^d1989年6月；86(11):4215-4219)。可以通過針對小鼠Friend紅白血病(MEL)細(xì)胞和人K-562細(xì)胞(尸rocA^/^cad^SW1988年4月；85(8):2434-2438)測定其分化誘導(dǎo)活性，或其對垂體促卵泡激素分泌的抑制(說o/ie;ro《2000年9月;63(3):865-871),體外測定抑制素A的活性。可以通過針對小鼠Friend紅白血病(MEL)細(xì)胞和人K-562細(xì)胞(尸raciVa"t/&4.1988年4月；85(8):2434-2438)測定其分化誘導(dǎo)活性，或其對垂體促卵泡激素分泌的抑制(脂2000年9月;63(3):865-871),體外測定抑制素(3C的活性。可以通過測定噪呤分解代謝，體外測定腺香脫氨酶活性(Mo/CW/艦1985年4月;5(4):762-767)?？赏ㄟ^測定cAMP在降脂蛋白刺激的小鼠黑素瘤細(xì)胞中的積累，體外測定降脂蛋白功能。(//WWA/0/1995年2月；4(2):223-230)?？赏ㄟ^在小鼠黑素瘤細(xì)胞中測定對a-MSH刺激的cAMP積累的抑制，體外測定ASP功能(/fwwA/o/1995年2月；4(2):223-230)?？赏ㄟ^測定髓磷脂通過MAP激酶的磷酸化，或其對神經(jīng)元之間的突觸傳輸?shù)男?yīng)(5"rA^ra/.1988;28(2):57-63),體外測定髓磷脂(/A^廳c/ew.1999年9月;73(3):1090-1097)?？赏ㄟ^測定髓磷脂堿性蛋白通過MAP激酶的磷酸化，或髓磷脂堿性蛋白對神經(jīng)元之間的突觸傳輸?shù)男?yīng)(^^Wewo/.1988;28(2):57-63),體外測定髓磷脂堿性蛋白C/A^wrac/2ew.1999年9月；73(3):1090-1097)?？梢酝ㄟ^用體外膠原原纖維穩(wěn)定性測定(Ce〃Mo/Lz/e2000年5月；57(5):859-863)，或體外細(xì)胞粘附測定(JO〃歷oc/^m.1997年10月1日；67(1):75-83)，測定膠原功能?？赏ㄟ^水解發(fā)色人工底物對硝基苯基a-D-葡萄糖苷，測定a葡糖苷酶。Bergmeyer,H.U.(主編)MethodsofEnzymaticAnalysis,SecondEnglishEdition,1,459(1974)?？赏ㄟ^發(fā)色人工底物對硝基苯基a-D-半乳糖苷酶水解成為對硝基苯酚和D-半乳糖，測定a-半乳糖苷酶一Rietra等，(1975)"Propertiesoftheresiduala-galactosidaseactivityinthetissuesofaFabryhemizygote".C7/wC7'm爿cto.;62(3):401-13。通過底物A-曱基傘形基(umbelliferyl)a-L-艾杜糖酐(iduronide)水解，再進(jìn)行熒光測定，可測定a-L-艾杜糖苷酸酶(Hopwood等(1979),C/z"C/m爿cto.;92:257-65);其它測定參見Thompson(1978)"Substratesfortheassayofa-L-iduronidase".C7/wCtoKa.;89(3):435-46?？刹捎妹?xì)血管出芽(capillarysprouting)測定，體外測定促血管生成素l活性。(C群艦1998年4月23日;8(9):529-532)?？刹捎妹?xì)血管出芽測定，體外測定促血管生成素2活性(CWr說o/.1998年4月23日；8(9):529-532)。在內(nèi)皮增殖測定中，可測定血管生長抑素(人血管生長抑素Kringle區(qū))。Cao等(1"6)丄Ao/.CA柳.2"29461-29467?？赏ㄟ^測定ADMP下調(diào)背側(cè)發(fā)育因子(dorsalizingfactor)頭蛋白(noggin)、goosecoid或促濾泡素抑制素的能力，體外測定ADMP活性。(Deve/opme"f.1995年12月；121(12):4293-4301)。在細(xì)胞凋亡測定中可測定TRAIL(TRAIL-R2:anovelapoptosis-mediatingreceptorforTRAIL,Walczak等(1996)/16:5386-5397)?？赏ㄟ^測定抑制蛋白(Arresten)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管形成和基質(zhì)膠新生血管形成的能力，體外測定抑制蛋白功能(Cawcer2000年5月1日；60(9):2520-6)。可通過對N-乙?；?D-半乳糖胺硫酸酯水解的體外測定，測定芳基^e充酸酯酶B活性(J說o/CTzem.1990年2月25曰；265(6):3374-3381)?？刹捎锰於０访傅拿复贉y定，體外測定天冬酰胺酶活性04""/5/oc/z亂2000年4月10曰；280(1):42-45)?？刹捎每咕鷾y定，體外測定rBPI活性C/B/o/C/2柳.1987年11月5日；262(31):14891-14894)?？稍谏窠?jīng)元生長和突觸活性測定中，測定BDNF(BDNF在海馬細(xì)胞培養(yǎng)中增強(qiáng)神經(jīng)元生長和突觸活性。Bartrup等(1997)A^wrare;oW1;8(17):3791-4DanielsLB,GlewRH，RadinNS,VunnamRR)?？刹捎酶曛x病的熒光測定，用環(huán)己烯四醇-p-環(huán)氧化物，以肝臟作為p-葡糖苷酶的來源，測定B-葡糖腦普脂酶(C/《'wC/'m1980年9月25日；106(2):155-63;JohnsonWG,GalAE,MirandaAF,PentchevPG.DiagnosisofadultGaucherdisease:useofanewchromogenicsubstrate,2-hexadecanoylamino-4-nitrophenyl-(3曙D-glucopyranoside,inculturedskinfibroblasts,C""C/h附爿cto..1980年3月14曰；102(1):91-7)?？梢园凑找韵挛墨I(xiàn)所述方法測定BMP-2:Wang，E.A等Recombinanthumanbonemorphogeneticproteininducesboneformation.尸roc.A^爿cW.Sc/.87:2220-2224,1990?？刹捎贸趸锲缁笢y定，體外測定8丁-30功能(]\^^/<:爿"^^&1985年3月25日；13(6):2017-34)?？赏ㄟ^測定p21WAFl/CIPl的表達(dá)變化，測定BRCAl活性(O"coge"e.1998年6月11日；16(23):3069-82)。可通過測定p21WAFl/CIPl的表達(dá)變化，測定BRCA2活性((9"cog幼e.1998年6月11日；16(23):3069-82)。可采用以下文獻(xiàn)所述的主動脈環(huán)血管舒張測定，測定CGRP的血管擴(kuò)張活性尸/2^waco/1999年3月；39(3):217-20;可體外測定內(nèi)皮和成骨細(xì)胞增殖活性(5wrJP/2arwaco/.2000年12月15日；409(3):273-8;/VocA^/A7"dSd"S.A1990年5月；87(9):3299-303)。可采用鈣造影測定，體外測定鈣網(wǎng)蛋白活性(CW/.1995年9月8曰；82(5):765-71)?？赏ㄟ^測定gpl20結(jié)合(1^>"http://附附朋0/2000;13(4):547-554);或在gpl20結(jié)合后改變單核細(xì)胞對細(xì)胞因子的反應(yīng)(//附附w"o/1998年10月15日；161(8):4309-4317),體外測定CD4功能?？砂凑找韵挛墨I(xiàn)所述，測定CD40配體HollenbaughD.等，ThehumanTcellantigengp39,amemberoftheTNFgenefamily,isaligandfortheCD40receptor:expressionofasolubleformofgp39withBcellco-stimulatoryactivity(人T細(xì)胞抗原gp39,TNF基因家族成員，是CD40受體的配體具有B細(xì)胞共刺激活性的可溶形式gp39的表達(dá)).五AfSO丄1992年12月；11(12):4313-21?？刹捎檬荏w結(jié)合測定，測定趨化因子結(jié)合蛋白(/Ao/C/zem.1997年5月9日；272(19):12495-12504)?？刹捎蒙窠?jīng)元增殖和存活測定，體外測定CNTFJ".2001年4月2日；20(7)1692-1703)?？赏ㄟ^測定與整聯(lián)蛋白av(33和av(35的結(jié)合，對血小板聚集的抑制和對癌細(xì)胞粘附纖連蛋白和玻連蛋白的抑制，體外測定銅頭蛇蛋白活性。說oc/em5Zop/y^.2000年3月15日；375(2):278-288)?？刹捎肅RF結(jié)合測定，測定CRF結(jié)合蛋白的活性(尸e/^z'^y.2001年1月22日；22(1):47-56)?？刹捎肨細(xì)胞活化測定，測定CTLA4活性(J/mww"o/.2001年3月1日；166(5):3143-3150)?？刹捎皿w外膠原原纖維穩(wěn)定性測定(Ce//A/o/Zj/e2000年5月；57(5):859-863);或體外細(xì)胞粘附測定(JCe〃飾c/2綴1997年10月1日；67(1):75-83)，測定飾膠蛋白聚糖功能?？刹捎胊vp3整耳關(guān)蛋白粘附測定，體外測定Del-l功能。(GwesDev.1998年1月1日；12(1):21-33)?？梢园凑找韵挛墨I(xiàn)所述，測定Desmoteplase:Wallen，P.,Biochemistryofplasminogen.載于KlineD.L.，Reddy,K.N.N.主編，F(xiàn)ibrinolysis.BocaRaton，F(xiàn)L:CRCPress,1980:1-25;Saksela,O.，Rifkin,D.B.，Cell-associatedplasminogenactivation:Regulationandphysiologicalfunctions(細(xì)胞相關(guān)的纖溶酶原的活化調(diào)節(jié)與生理功能).^訓(xùn)ievCe〃5/o/.1988;4:93-126;WomackCJ,IveyFM,GardnerAW,MackoRF,Fibrinolyticresponsetoacuteexerciseinpatientswithperipheralarterialdisease(對夕卜周動樂&病患、者,急性處置的纖溶反應(yīng)).S戶旭五xerc.2001年2月；33(2):214-9?？刹捎靡韵挛墨I(xiàn)所述的DNA降解測定，測定DNA酶活性J5/oc/2em(Tokyo).1982年10月；92(4):1297-303。采用胞外核苷三磷酸雙磷酸酶(ectoapyrase)測定，體外測定胞外核苷三磷酸雙磷酸酶活性C7說o/O級1998年9月18日；273(38):24814-24821)。采用細(xì)胞生長測定，可測定EGF(J說o/C/jem.1995年3月31日；270(13):7495-500)。可采用毛細(xì)血管出芽測定，體外測定EMAPII活性(C^rAo/.1998年4月23日；8(9):529-532)。可采用細(xì)胞增殖測定，測定FGF-1:Ce〃，第50巻，第5期，笫729-737頁(1987年8月)。/VocA^McWSdt/.S.A,笫86巻，第3期，笫802-806頁(1989)?？刹捎迷鲋硿y定，用NR6R-3T3細(xì)胞，測定FGF-2(Rizzino1988Ca"ceri仏48:4266)。采用溶血纖蛋白測定，體外測定蛇毒溶纖酶(Fibrolase)活性。(7T2raw6i化1994年5月15日；74(4):355-367)。在增殖測定中，采用Flt曙3轉(zhuǎn)化的前B-細(xì)胞系，測定FLT3(Hannum1994A^fw"368:643)。在表達(dá)FSH受體的細(xì)胞中，通過測定cAMP的產(chǎn)生，體外測定促卵泡激素活性(Jie/7rad/wmwwo/2001年1月；49(1):1-19)?？赏ㄟ^測定響應(yīng)GDNF治療的Ret酪氨酸磷酸化，體外測定GDNF活性(編0〃脂.1995年3月15日；(3):1613-1619)?？赏ㄟ^測定肌動蛋白的蛋白酶解，體外測定凝溶膠蛋白活性(AWwe1987年1月22-28曰；325(6102):362-364)。通過在人橫紋肌肉瘤細(xì)胞中測定ERBB受體酪氨酸激酶活化，體外測定GGF2活性。2000年7月1曰；87(1):29-36)。胰高血糖素的葡萄糖生成活性由高親和力胰高血糖素受體介導(dǎo)?？赏ㄟ^直接結(jié)合測定，評價重組胰高血糖素的生物活性(Sdewce.1993年3月12日；259(5101):1614-6)?？刹捎蒙窠?jīng)突增生測定，體外測定HBNF活性。(J萬Zo/C/zem.1995年10月27曰；270(43):25992-25999)?？蓽y定hCG受體結(jié)合和活化，以評價重組hCG的生物活性C/說o/C/jew.1993年10月5日；268(28):20851-4)?？赏ㄟ^在兩種紫外誘發(fā)的小鼠腫瘤模型中給予HSP-肽復(fù)合物，測定熱激蛋白(US5,837,251)?？赏ㄟ^以下方式測定白介素1:l)在YT-NCI或C3H/HeJ細(xì)胞中與IL-1受體結(jié)合(Carter等，M^wre344:633-638,1990);2)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞粘附(Carter等，A^mm344:633-638,1990);3)對A375-C6細(xì)胞的增殖測定(MuraiT等，丄說o/.C/2e附.276:6797-6806,2001);D10Sproliferation:Orencole&Dinarello(1989)1,14-20?？赏ㄟ^以下方式測定IL-lra:l)在YT-NCI或C3H/HeJ細(xì)胞中，與IL-1竟?fàn)幮越Y(jié)合IL-1受體(Carter等，M^w仏344:633-638,1990);2)抑制IL-1誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞粘附(Carter等，A^we344:633-638,1990);3)對A375-C6細(xì)胞(一種對IL-1的抗增殖作用具有高度敏感性的人黑素瘤細(xì)胞系)的增殖測定(MuraiT等，J.Ao/.C/2e附.276:6797-6806,2001)?？赏ㄟ^以下方式測定IL-10:l)將IL-10與NK細(xì)胞結(jié)合(carsonWE等，85:3577-3585，1995);2)抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a(RileyJK等，S/o/.C/zem.274:16513-16521,1999);3)抑制巨喧細(xì)胞增殖(O'FarrellA-M等，17:1006-1018,1998);MC-9proliferation:Thompson-Snipes等(1991)/.A/e《173,507-510。在造血細(xì)胞增殖測定中可測定IL畫ll。"Inteleukin-11enhanceshumanmegakaryocytopoiesisinvitro(白介素-ll體夕卜i曾？雖人巨核細(xì)胞生成)。"脅d1992年1月15日；79(2):327-31。"Synergisticeffectsofstemcellfactorandinterleukin6orinterleukin11ontheexpansionofmurinehematopoieticprogenitorsinliquidsuspensionculture(干細(xì)胞因子和白介素6或白介素11對鼠造血祖細(xì)胞在液體懸浮培養(yǎng)中擴(kuò)增的協(xié)同效應(yīng))."Ce〃s.1995年7月；13(4):404-13;B9-11proliferation:Lu等(1994)J/mm柳o/.M"/ocfe173,19。在自然殺傷(NK)細(xì)胞細(xì)胞毒性測定和干擾素-Y(IFN-力釋放測定中可測定IL-12。"Requirementfortype2NOsynthaseforIL-12signalingininnateimmunity(在先天免疫中，需要2型NO合酶用于IL-12信號轉(zhuǎn)導(dǎo))"。Sc/e"ce284:951-955,1999;KIT-225proliferation:Hori等(1987),S/ood70,1069-1078?？赏ㄟ^測定IL18結(jié)合蛋白抑制早期Thl反應(yīng)的能力，體外測定IL18結(jié)合蛋白活性(/加mw"/W1999年l月；10(1):127-136)?？刹捎眉?xì)胞毒性測定，體外測定IL2-白喉毒素嵌合體功能。(Ex;//e/wato/.2000年12月；28(12):1390-1400)。在正常T淋巴細(xì)胞中，可在細(xì)胞毒性測定中測定IL-4。(PMID:8144944);RAMOSAugmentationofCD23expression:Siegel&Mostowski(1990)/wmwwo/AfeAo<is132,287-295?？赏ㄟ^抑制TF-1細(xì)胞的IL-4依賴性增殖能力，測定IL-4受體活性(Kitamura,T等，1989，Ce〃.P尸/2;^!'0/.140:323)?？稍趲в蠭L8R細(xì)胞中監(jiān)測鈣通量的測定中，測定IL-8(Holmes等(1991)Sc/e"ce253，1278-80)。在抗病毒測定中，采用感染EMC病毒的Hela細(xì)胞，測定干擾素Y活'l"生(Meager,A.1987,LymphokinesandInterferons,APracticalApproach,Clemens,MJ等主編，IRLPress,笫129頁)；在人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系COLO205中，可測定II類MHC表達(dá)的調(diào)節(jié)(Gibson和Kramer,1989,,/mmw"o/.A^"/20血，125:105-113)。采用體外抗病毒測定，可測定干擾素-①活性(JMedM/cra&o/1998年11月；47(11):1015-8)。可采用大鼠動脈平滑肌細(xì)胞趨化性測定，體外測定IP-10活性。(J廳C/2柳.1996年9月27日；271(39):24286-24293)。采用造血細(xì)胞分化測定，體外測定IL-3活性(Sczewce1985;228(4701):810-815)。采用上皮細(xì)胞增殖測定，體外測定KGF-1活性。(尸rac扁加"c/1989年2月；86(3):802-806)。通過在冠狀動脈血栓形成的犬模型中給予重組組織型纖溶酶原激活物(rt-PA)并測定血栓溶解、重新阻塞和出血，可體外測定蝮蛇毒素(kistrin)活性(C/rcw/a"ow1991年3月；83(3):1038-1047)?？赏ㄟ^測定針對HGF激活物的抑制活性，體外測定Kunitz蛋白酶抑制劑1活性(J說o/C/jem.1997年3月7日；272(10):6370-6376)?？刹捎皿w外病毒抑制測定(JMWMc威o/.1998年11月；47(11):1015-8)和抗微生物測定(JC/z'"/"ve就1998年9月1日；102(5):874-80),測定乳轉(zhuǎn)鐵蛋白活性。在ob/ob小鼠中，通過調(diào)節(jié)食物攝取降低、減輕體重并降低胰島素及葡萄糖水平，在放射免疫測定(RIA)和在基于細(xì)胞的測定中的瘦蛋白受體活化中，可以測定瘦蛋白。5"x;r尸wrz/1998年12月；14(3):335-42。采用造血細(xì)胞分化測定，可體外測定LIF活性。(&Ze"ce1985;228(4701):810-815)。可通過測定LFA-3抑制T細(xì)胞功能的能力，體外測定LFA-3活性。(J鄉(xiāng)她^f1993年7月1曰;178(1):211-222)?？刹捎皿w外血纖蛋白溶解測定，測定Lys纖溶酶原活性(J5/0/C/zem1992年12月25日；267(36):26150-6)。采用體外血管生成測定，可測定乳腺絲抑蛋白活性(iVafMe《2000年2月；6(2):196-9)?？砂匆韵挛墨I(xiàn)，體外測定曱硫氨酸酶活性Ito等C/說oc/2em(Tokyo),1975年11月；78(5):1105-1107)?？刹捎煤衋poB的脂蛋白分泌測定，體外測定MTP活性。(J萬/o/C72ew.1994年9月2曰;269(35):21951-21954)。通過在培養(yǎng)的交感神經(jīng)元中測定CREB轉(zhuǎn)錄因子活化，可測定NGF活性(Sde"cel的9年12月17日；286(5448):2358-2361)。可通過測定鈴蟾肽樣肽的蛋白酶解，體外測定中性內(nèi)肽酶活性(尸rocAtoMo^&Z(7.S.A1991年12月1日；88(23):10662-10666)。可采用多形核白細(xì)胞粘附測定，體外測定NIF活性(AYo/1999年11月；56(5):926-932)?？赏ㄟ^測定TNF受體對HeLa細(xì)胞的TNF刺激的反應(yīng)，測定頭蛋白活性。(J說o/C7ew.1997年2月28日；2了2(9)::5861-5870)。通過測定NT-3對培養(yǎng)的NC祖細(xì)胞在無血清的確定成分培養(yǎng)基中生長增殖的能力，體外測定NT-3活性(尸roc淑McadS"m1992年3月1日；89(5):1661-1665)。通過在胎兒大鼠顱蓋細(xì)胞中測定VEGF表達(dá)，體外測定OP-l活性(Mo/Ce//五mfocn"o/20,1999年7月20日；153(1-2):113-124)。采用針對石皮骨細(xì)胞生成的共培養(yǎng)測定、采用胎兒長骨器官培養(yǎng)系統(tǒng)的骨再吸收測定、牙質(zhì)再吸收測定或成纖維細(xì)胞增殖測定，體外測定護(hù)骨蛋白活性(FAS5S丄1998;12:845-854)。通過Stafforini等(&raA:e1997年12月；28(12):2417-20)的方法，可測定血漿PAF乙酰水解酶活性?？赏ㄟ^測定Patched配體Sonichedgehog的結(jié)合，體外測定Patched功能(Atowre1996年11月14日；384(6605):129-134)?？赏ㄟ^測定PDGF誘導(dǎo)PDGF受體的酪氨酸磷酸化，體外測定PDGF活性(《/C72ew.1989年5月25日；264(15):8905-8912)。可采用神經(jīng)突增生測定，體外測定PEDF功能C/所o/C/zew.1995年10月27日；270(43):25992-25999)。可按照以下文獻(xiàn)所述，測定纖溶酶原激活物抑制劑Wallen,P.，Biochemistryofplasminogen.栽于KlineD.L.,Reddy,K.N.N.編著，F(xiàn)ibrinolysis.BocaRaton,FL:CRCPress,1980:1-25;Saksela，O.，Rifkin,D.B.,Cell-associatedplasminogenactivation:Regulationandphysiologicalftmctions(細(xì)胞相關(guān)的纖溶酶原的活4ti:調(diào)節(jié)與生理功能).^匿CW/編1988;4:93-126;WomackCJ,IveyFM,GardnerAW,MackoRF，F(xiàn)ibrinolyticresponsetoacuteexerciseinpatientswithperipheralarterialdisease(對夕卜周動樂:K病患者急性處置的纖溶反應(yīng)).M^/S/orte5;cerc2001年2月；33(2):214-9?？赏ㄟ^測定胎肝酪氨酸激酶-3和粒細(xì)胞集落刺激因子的拮抗作用，體外測定PGP活性陶/f畫to/2001年1月；29(1):41-50)?？赏ㄟ^測定從骨髓、被動員的外周血祖細(xì)胞或臍帶中純化的CD43+細(xì)胞中誘導(dǎo)巨核細(xì)胞生成的能力，體外測定PMP活性(J/^watof/jw1999年4月；8(2):199-208)。用糖尿病大鼠，通過多劑量方案，測定Prosaptide功效(^e^/2ewo/ogy2000年11月；93(5):1271-8)。可通過采用核糖核酸酶和細(xì)胞毒活性測定，體外測定豹蛙酶(ranpirnase)活性(JMo/說o/1996年4月19曰；257(5):992-1007)。在體外測定中采用對KC1誘發(fā)的大鼠子宮收縮的抑制，體外測定松弛素活性(O"J尸/2戸o/泡謹(jǐn)co/1981年5月；59(5):507-12)?？赏ㄟ^在桿狀感光細(xì)胞中測定環(huán)GMP門控通道的活性，體外測定視網(wǎng)膜S-抗原活性C/說o/C/em1994年11月25日；269(47):29765-29770)。通過分離的豬卵泡膜細(xì)胞在響應(yīng)RhLH刺激時測定Fura-2熒光，體外測定RhLH活性(五mfem"o/ogv2000年6月；141(6):2220-2228)。采用纖溶酶原裂解測定，體外測定Saruplase活性(《/說o/C/e附2001年l月18日；epubaheadofprint)。通過測定C3b和C4b結(jié)合，體外測定補體受體1型。C/五矽M^n988年11月1日；168(5):1699-1717)?？赏ㄟ^測定Sonichedgehog與patched的結(jié)合，體夕卜溯'J定Sonichedgehog功能(Mm^e1996年11月14日；384(6605):129-134)。采用纖溶酶原裂解測定，體外測定葡萄球菌激酶活性C/說o/C/ze附2001年1月18日；epubaheadofprint)。通過測^J巴大細(xì)胞存活、增殖或產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，測定SCF活性(/m/mmo/iev2001年2月；179:57-60)。采用纖溶酶原活化測定，體外測定鏈激酶活性C7說o/Chem2001年l月18日；epubaheadofprint)。采用超氧化物歧化酶測定，體外測定超氧化物歧化酶活性(A^c/ezc^c/血1985年3月25日；13(6):2017-34)。采用Th2細(xì)胞活化測定，體外測定T1/ST2功能(//mmt/"o/2001年3月1日；166(5):3143-3150)。測定通過FGF畫2誘導(dǎo)的腎成纖維細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)，體外測定TGF(31活性(幻甴"2001年2月;59(2):579-592)。通過測定對iNOS轉(zhuǎn)錄的抑制，體外測定TGF(32功能(/一ammi^yl997年9月；46(9):327-331)?？蓽y定TGF-P3對器官培養(yǎng)中新生小鼠顱蓋產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)和骨再吸收的刺激(/WASf7&41985年7月；82(13):4535-4538),或?qū)δz原、骨橋蛋白、骨粘連蛋白和堿性磷酸酶合成的刺激，和對成骨細(xì)胞樣細(xì)胞復(fù)制的刺激能力C/5z'o/C72em1987;262:2869,/編C/2瀏1988;263:13916,/CW/說o/1988;106:915,/0〃尸/ywo/1987;133:426,5w/ocn力o/ogy1987;121:212,￡"<iocn>7o/ogy1986;19:2306和JCe//淑1987;105:457)。可測定血d、板生成素(TPO),以確定巨核細(xì)胞生長和分化的調(diào)節(jié)(Mo/Ce〃腸/2001年4月;21(8):2659-2670;五x;//薩to/2001年1月;29(1):51-58;丄ewybw/a2000年10月;14(10):1751-1756)。通過測定Tie-2/Tek響應(yīng)促血管生成素刺激的磷酸化作用，測定Tie-2/Tek功能(/"f/附mw"o/1998年8月；10(8):1217-1227)?？蓽y定組織因子途徑抑制對因子Xa的鈍化和對外因性凝血途徑的VIIa-組織因子復(fù)合物的抑制C/S,'o/C72ew1998年5月5日；263(13):6001-6004;77zram6/faemo對1998;79(2):306-309)?？赏ㄟ^測定對響應(yīng)HeLa細(xì)胞TNF刺激的PIP5K活化的抑制，測定TNF結(jié)合蛋白的活性。C/說o/C/2em1997年2月28日；272(9):5861-5870)?？赏ㄟ^測定對響應(yīng)HeLa細(xì)胞TNF刺激的PIP5K活化的抑制，測定TNF結(jié)合蛋白的活性。(J5/o/(3e附1997年2月28日；272(9):5861-5870)。可通過測定對響應(yīng)HeLa細(xì)胞TNF刺激的PIP5K活化的增加，測定TNF受體活性(J說o/Chem1997年2月28日；272(9):5861-5870)。按照以下文獻(xiàn)所述，測定t-PA:Wallen，P.，Biochemistryofplasminogen.栽于KlineD.L.,Reddy,K.匪.編著，F(xiàn)ibrinolysis.BocaRaton,FL:CRCPress,1980:1-25;Saksela,O.，Rifkin,D.B.，Cell-associatedplasminogenactivation:Regulationandphysiologicalfunctions(細(xì)胞相關(guān)的纖溶酶原的活化調(diào)節(jié)與生理功能).^騰"evCe〃1988;4:93-126;WomackCJ,IveyFM,GardnerAW，MackoRF，F(xiàn)ibrinolyticresponsetoacuteexerciseinpatientswithperipheralarterialdisease(對夕卜周動月永病患'者,急性處置的纖溶反應(yīng)).MedSpo他五jcwc2001年2月；33(2):214-9。通過在來自動情周期第13天母羊的培養(yǎng)子宮內(nèi)膜外植體中測定IFN-T誘導(dǎo)的酸性70kD蛋白的產(chǎn)生，體外測定IFN〈活性。(Mo/五mfocn'"o/1990年10月;4(10):1506-1514)。采用肌原纖維結(jié)合測定，體外測定肌原蛋白I活性C7A/^c/eCe〃Mo"71999年11月；20(8):755-760)。采用尿酸酶催化的尿酸氧化測定(」wa/02柳1999年5月15日；71(10):1928-1934);或者通過重組尿酸氧化酶的免疫測定(J尸/wm19%年9月；85(9):955-959)，體外測定尿酸氧化酶活性。采用纖溶酶原裂解測定，體外測定尿激酶活性。Sazonova等C7Ao/2001年l月18日，電子出版物先于印刷)。采用內(nèi)皮細(xì)胞增殖測定，體外測定VEGF-1活性。(尸roc層A:a"c/aS乂1989年2月；86(3):802-806)。采用粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞活化測定，測定槲寄生毒蛋白(Viscumin)活性。(^""c朋cw1999年7-8月;19(4B):2925-2928;和/脂2000年12月；68(6):845-853)?；诿庖咔虻鞍椎呐潴w的制備本發(fā)明的結(jié)合配體(例如dAb)可以按照用于抗體工程領(lǐng)域的先前建立的技術(shù)來制備，用于制備scFv、"噬菌體"抗體和其它工程抗體分子?？贵w的制備技術(shù)例如參見以下綜述及其中所引用的參考文獻(xiàn)Winter和Milstein,(1991)iVafwre349:293-299;Pluckthun(1992)/mm廳/o沐a/腸,纖130:151-188;Wright等(1992)O".版/wmwwo/.,12:125-168;Holliger,P.和Winter,G.(1993)Cwm說ofec/2""4,446-449;Carter等(1995)</.f/ewatof/ier,4,463-470;C/je自,K.A.和Hawkins，R.E.(1995)7Vewcfe5她c/w.,13，294-300;Hoogenboom,H.R.(1997)AtoreS/ofec/wio/"15,125-126;Fearon,D.(1997)A^wre5Zofec/z"o/.,15，618-619;Pltickthun,A.和Pack,P.(1997)/w臓w她c/wo/ogy3,83-105;Carter,P.和Merchant,A.M.(1997)CWrQp/".萬z'ofec/mo/,,8,449-454;Holliger，P.和Winter,G.(1997)Ca"cer/w腦no/./m臓wof/2er,45,128-130。具有所需特異性的抗體可變區(qū)選擇所用的合適技術(shù)采用的是本領(lǐng)域已知的文庫和選擇方法。采用從人B細(xì)胞收獲的重排V基因的天然文庫(Marks等(1991)/.Mo/.說'o/.,222:581;Vaughan等(1996)A^wre歷o&c/.,14:309)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。合成文庫(Hoogenboom和Winter(1992)Mo/.說o/.,227:381;Barbas等(1992)Prac,W加/.爿cW.aS.A，89:4457;Nissim等(1994)￡Mj50丄，13:692;Griffiths等(1994)丄，13:3245;DeKruif等(1995)/，Mo/.B/o/.，248:97)則是通常采用PCR、通過克隆免疫球蛋白V基因而制備的。PCR過程中出現(xiàn)的錯誤可導(dǎo)致高度隨機(jī)化?？梢苑謩e針對靶抗原或表位選擇Vh和/或Vt文庫，在這種情況下，直接選擇或一起選擇單域結(jié)合。文庫載體系統(tǒng)各種選擇系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，適用于本發(fā)明。這些系統(tǒng)的實例^口下所述。可以直接篩選噬菌體X表達(dá)系統(tǒng)的噬菌斑或溶原體的菌落，這兩者先前都有描述(Huse等(1989)S"'e"ce,246:1275;Caton和Koprowski(1990)尸亂脂/.加dSc/.t/.S.A,87;Mullinax等(1990)Prac.扁.爿c^/.&/'.[/.5.爿.，87:8095;Persson等(1991)iVoc.W加/.ZcadScZ.t/.S.A,88:2432)并且用于本發(fā)明。盡管這樣的表達(dá)系統(tǒng)可以用于篩選多達(dá)106個不同文庫成員，但是它們不適合篩選更大數(shù)量(大于106個成員)。文庫構(gòu)建中特別有用的是選擇展示系統(tǒng)，所述系統(tǒng)使核酸連接到它所表達(dá)的多肽上。本文所用的選擇展示系統(tǒng)是允許通過文庫各成員結(jié)合通用配體和/或靶配體的合適展示方法而選出的系統(tǒng)。在大文庫中分離出所需成員的選擇方案是本領(lǐng)域已知的，以噬菌體展示技術(shù)為代表。這種將多樣化肽序列展示在絲狀噬菌體表面的系統(tǒng)(Scott和Smith(1990)Sc/e"ce,249:386),已經(jīng)證明可用于產(chǎn)生抗體片段(及其編碼它們的核苷酸序列)文庫，用于體外選擇和結(jié)合靶抗原的特異性抗體片段的擴(kuò)增(McCafferty等，WO92/01047)。編碼可變區(qū)的核苦酸序列連接到編碼前導(dǎo)信號的基因片段上，這樣的信號可指導(dǎo)它們到達(dá)大腸桿菌細(xì)胞的壁膜間隙，結(jié)果所得抗體片段可展示在噬菌體表面，通常是與噬菌體外殼蛋白(例如pin或pvni)融合?；蛘?，抗體片段向外展示在x噬菌體衣殼(噬菌體)上?；谑删w的展示系統(tǒng)的一個優(yōu)點就是因為它們是生物系統(tǒng)，所以可以將含有所選文庫成員的噬菌體在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，而簡單擴(kuò)增所選文庫成員。此外，因為編碼多肽文庫成員的核苷酸序列被噬菌體或噬菌粒栽體所包含，所以測序、表達(dá)和其后的遺傳操作相對直接。噬菌體抗體展示文庫和x噬菌體表達(dá)文庫的構(gòu)建方法是本領(lǐng)域眾所周知的(McCafferty等(l990)Atowre,348:552;Kang等(1991)尸roc.A^/.^cadSc/.88:4363;Clackson等(1991)Atowe,352:624;Lo糧an等(1991)說oc/^m/W^，30:10832;Burton等(1991)iVoc.^c^/.f/SJ.,88:10134;Hoogenboom等(1991)M/c/e/cJc,'Aie&,19:4133;Chang等(簡)//mm畫/.,147:3610;Breitling等(簡)104:147;Marks等(1991),出處同上；Barbas等(1992),出處同上；Hawkins和Winter(1992)/./wmw"o/.,22:867;Marks等，1992,C/2e附.，267:16007;Lerner等(1992)Scz'e"ce,258:1313，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。一個特別具有優(yōu)勢的方法是使用scFv噬菌體-文庫(Huston等，1988,尸rac.扁.^cat/.ScZ.85:5879-5883;Chaudhary等(1990)尸roc.A^/.".5^.，87:1066-1070;McCafferty等(1990),出處同上；Clackson等(1991)A^fft^e，352:624;Marks等(1991)丄Afo/.說o/"222:581;Chiswell等(1992)7>emfeAWecA.,10:80;Marks等(1992)/.所o/.267)。在噬菌體外殼蛋白上展示的scFv文庫的各種實施方案已有描述。噬菌體展示方法的改進(jìn)也是已知的，例如參見WO96/06213和WO92/01047(MedicalResearchCouncil等)和WO97/08320(Morphosys),所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。產(chǎn)生多肽文庫的其它系統(tǒng)包括使用無細(xì)胞酶促機(jī)器，用于體外合成文庫成員。在一個方法中，通過針對靶配體的多輪選擇和PCR擴(kuò)增來選擇RNA分子(Tuerk和Gold(1990)S"'e"ce,249:505;Ellington和Szostak(1990)Atowe,346:818)。一項類似技術(shù)可用于鑒定結(jié)合預(yù)定人轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)M/c/e/c18:3203;Beaudry和Joyce(1992)257:635;WO92/05258和W092/14843)。以類似方式，體外翻譯可用于合成多肽，這作為產(chǎn)生大文庫的方法。這些通常包括穩(wěn)定的多核糖體復(fù)合物的方法進(jìn)一步參見WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、W091/02076、WO91/05058和WO92/02536。并非基于噬菌體的替代展示系統(tǒng)例如那些^Hf于W095/22625和W095/11922(Affymax)的系統(tǒng)，采用多核糖體來展示多肽，用于選擇。還有一項技術(shù)包括對人工區(qū)室中的庫作出選擇，這允許將基因與其基因產(chǎn)物聯(lián)系起來。例如，通過在油包水乳劑形成的微膠嚢中選擇編碼所需基因產(chǎn)物的核酸的選擇系統(tǒng)，參見WO99/02671、WO00/40712;Tawfik和Griffiths(1998)Mm^e萬/c^c/2"o/16(7)，652-6。將編碼具有所需活性的基因產(chǎn)物的遺傳元件在微膠嚢中區(qū)室化，然后在膠嚢內(nèi)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生它們相應(yīng)的基因產(chǎn)物(RNA或蛋白質(zhì))。隨后再分選產(chǎn)生具有所需活性的基因產(chǎn)物的遺傳元件。該方法通過各種方式檢測所需活性而選擇目標(biāo)基因產(chǎn)物。文庫構(gòu)建可以采用本領(lǐng)域已知技術(shù)，構(gòu)建例如以上提出的文庫用于選擇，或者從商業(yè)來源購買?？捎糜诒景l(fā)明的文庫參見例如WO"/20749。一旦選擇載體系統(tǒng)并將一個或多個編碼目標(biāo)多肽的核酸序列克隆到文庫載體中，通過在表達(dá)前進(jìn)行誘變，就可以在克隆分子內(nèi)產(chǎn)生多樣性；或者，可以在如上所述的誘變和多輪選擇進(jìn)行之前，表達(dá)并選擇所編碼的蛋白質(zhì)。按照標(biāo)準(zhǔn)分子方法，對編碼結(jié)構(gòu)優(yōu)化多肽的核酸序列進(jìn)行誘變。特別有用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即PCR(Mullis和Faloona(1987)A/W/o血5"^wo/,155:335，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。PCR是本領(lǐng)域眾所周知的，它是采用由熱穩(wěn)定的DNA依賴性DNA聚合酶催化的多輪DNA復(fù)制，以擴(kuò)增目標(biāo)耙序列。各種抗體文庫的構(gòu)建參見Winter等(l994)i^v./wmwo/ogy,12,433-55及其中引用的參考文獻(xiàn)。用模板DNA(至少lfg;更有用的為l-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物，進(jìn)行PCR;當(dāng)引物庫(primerpool)非常不均一時，最好采用較大量引物，因為各序列僅有少量引物庫分子作為代表，而且數(shù)量在隨后的擴(kuò)增循環(huán)中成為限制。通常反應(yīng)混合物包括2^1DNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5}xl10XPCR緩沖液1(Perkin-Elmer,FosterCity,CA)、0.4jLtl1.25岸dNTP、0.15fil(或2.5單位)TaqDNA聚合酶(PerkinElmer,FosterCity,CA)和去離子水加至總體積為25|lU。覆蓋礦物油，用程序加熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR。PCR循環(huán)中各步驟的長度和溫度以及循環(huán)次數(shù)，按照結(jié)果所需的嚴(yán)格性來調(diào)整。退火溫度和時間由引物預(yù)計與模板退火的效率和可耐受的錯配程度而定；顯然，當(dāng)核酸分子同時擴(kuò)增和誘變的話，錯配是必需的，至少在合成的第一輪。優(yōu)化引物退火條件的嚴(yán)格性的能力是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。采用的退火溫度在30。C和72。C之間。模板分子開始變性通常發(fā)生在92。C和99。C之間4分鐘，再是20-40次循環(huán)，循環(huán)是由變性(94-99。C15秒至1分鐘)、退火(按照上述溫度；1-2分鐘)和延伸(72。Cl-5分鐘，取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的長度)組成。最終延伸通常72°C4分鐘，再接著是不確定(0-24小時)步驟，在4。C。單可變區(qū)的組合本發(fā)明所用的結(jié)構(gòu)域，一旦選出就可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)行組合，包括共價和非共價方法。優(yōu)選的方法包括采用如上所述的多肽接頭，例如連接scFv分子(Bird等(1988)5We"ce242:423-426)。有關(guān)合適接頭的討論參見Bird等，Sc/e"ce242,423-426;Hudson等，Jbwma//mw朋o/A/"/20必231(1999)177-189;Hudson等，TVoc.Waf.Jcad[/&4,85，5879-5883。接頭優(yōu)選是柔性的，允許兩個單域相互作用。一個接頭的實例是(Gly4Ser)n接頭，其中n-l國8，例如2、3、4、5或7。也可采用雙鏈抗體中使用的柔性較差的接頭(Holliger等(1993)/WAS(USA)90:6444-6448)。在一個實施方案中，所用的接頭不是免疫球蛋白鉸鏈區(qū)?？勺儏^(qū)可采用不用接頭的方法而進(jìn)行組合。例如，可以開發(fā)二硫橋的用途(所述二硫橋是通過天然存在的或改造的半胱氨酸殘基而提供的)，以便穩(wěn)定VH-VH、Vl-Vl或VH-VL二聚體(Reiter等(1994)7:697-704)或者通過可變區(qū)間界面的重構(gòu)以改善"適合性(fit)"，因而穩(wěn)定相互作用(Ridgeway等(1996)/Vo&"5"g.7:617-621;Zhu等(1997)Sc,e"ce6:781-788)。適當(dāng)?shù)臅r候，可以使用用于連接或穩(wěn)定免疫球蛋白可變區(qū)、尤其是抗體VH區(qū)的其它技術(shù)。配體的表征配體(例如dAb單體、雙特異性配體)與其特異性抗原或表位的結(jié)合可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來測定，該方法包括ELISA。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，采用單克隆噬菌體ELISA來測定結(jié)合?？梢园凑杖魏魏线m方法，進(jìn)行噬菌體ELISA:示例性方案見下文?？梢酝ㄟ^ELISA篩選每輪選擇中產(chǎn)生的、與所選抗原或表位結(jié)合的噬菌體群體，以鑒定"多克隆"噬菌體抗體。然后，可通過ELISA篩選這些群體中來自單個受感染細(xì)菌菌落的噬菌體，以鑒定"單克隆"噬菌體抗體。最好也篩選結(jié)合抗原或表位的可溶性抗體片段，這也可通過ELISA、采用針對C-端或N-端標(biāo)記等試劑來進(jìn)行(參見例如Winter等(1994)爿朋./www"o/ogy12,433-55及其中引用的參考文獻(xiàn)?？梢酝ㄟ^PCR產(chǎn)物的凝月吏電泳(Marks等1991,出處同上；Nissim等1994,出處同上)、探測(Tomlinson等，1992)J.嵐腸/.227,776)或者通過載體DNA測序，來評價所選噬菌體單克隆抗體的多樣性。配體的結(jié)構(gòu)在采用例如本文所述的噬菌體展示技術(shù)從V基因庫中選出可變區(qū)的情況下，這些可變區(qū)可包含通用構(gòu)架區(qū)，使得它們可以被本文所述的特異性通用配體所識別。有關(guān)通用構(gòu)架、通用配體等的用途參見WO99/20749。當(dāng)使用V基因庫時，多肽序列中的變異優(yōu)選位于可變區(qū)結(jié)構(gòu)環(huán)內(nèi)。各可變區(qū)的多肽序列可以通過DNA改組或者通過突變而改變，以便增強(qiáng)各可變區(qū)與其互補對的相互作用。DNA改組是本領(lǐng)域已知的，參見例如Stemmer,淑騰370:389-391(1994)和美國專利第6,297,053號，所述文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中。其它誘變方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。一般而言，可以按照例如以下標(biāo)準(zhǔn)實驗室手冊的方法，構(gòu)建并操作選擇、制備和精制配體所需的核酸分子和載體構(gòu)建體Sambrook等(1989)她/ecw/arC7o"Z"g:JZ^orafo^yMwwa/,ColdSpringHarbor,USA。本發(fā)明所用的核酸的操作通常在重組載體中進(jìn)行。本文所用的載體是指這樣的分離的元件所述元件用于將異源DNA引入細(xì)胞，用于表達(dá)和/或復(fù)制異源DNA。所述載體的選擇或構(gòu)建以及隨后的使用方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。大量載體是公眾可得的，包括細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體和附加型載體。這類載體可用于簡單克隆和誘變；或者采用基因表達(dá)載體?？梢赃x擇本發(fā)明所用的載體，以適應(yīng)所需大小的多肽編碼序列，長度通常為0.25千堿基對(kb)至40kb或更大。體外克隆操作后，用載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。每個載體都含有不同的功能性組件，通常包括克隆(或"多接頭")位點、復(fù)制起點和至少一個選擇標(biāo)記基因。如果給定的載體是表達(dá)載體，它還可具有一個或多個以下元件增強(qiáng)子元件、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止和信號序列，每個都位于克隆位點附近，使得它們與編碼本發(fā)明配體的基因有效連接。克隆載體和表達(dá)載體一般都含有使載體在一種或多種所選宿主細(xì)胞中能復(fù)制的核酸序列。通常在克隆載體中，該序列使載體獨立于宿主染色體DNA而復(fù)制，并且還包含復(fù)制起點或自主復(fù)制序列。這類序列眾所周知可用于多種多樣的細(xì)菌、酵母和病毒。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性菌，2p質(zhì)粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(例如SV40、腺病毒)可用于哺乳動物細(xì)胞中的克隆載體。通常，復(fù)制起點對哺乳動物表達(dá)載體而言是不需要的，除非這些起點用于能高水平復(fù)制DNA的哺乳動物細(xì)胞，例如COS細(xì)胞。最好克隆載體或表達(dá)載體可含有選擇基因，也稱為選擇標(biāo)記。該基因編碼轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中存活或生長所需的蛋白質(zhì)。因此，沒有被含有選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞將不能在培養(yǎng)基中存活。典型的選擇基因編碼這樣的蛋白質(zhì)所述蛋白質(zhì)賦予抗生素(例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四環(huán)素)抗性和其它毒素抗性、補充生長培養(yǎng)基中所沒有的營養(yǎng)缺陷或補充關(guān)鍵性營養(yǎng)物。因為編碼本發(fā)明配體的載體的復(fù)制是在大腸桿菌中常規(guī)進(jìn)行的，所以采用大腸桿菌選擇標(biāo)記，例如賦予抗生素氨卡青霉素抗性的P-內(nèi)酰胺酶基因。這些可以得自大腸桿菌質(zhì)粒，例如pBR322或pUC質(zhì)粒，例如pUC18或pUC19。表達(dá)載體通常含有宿主生物可識別的啟動子，并且該啟動子與目標(biāo)編碼序列操作性連接。這樣的啟動子可以是誘導(dǎo)型或組成型的。術(shù)語"操作性連接"是指并置方式使所述組件的關(guān)系允許它們以既定方式起作用?？刂菩蛄信c編碼序列"操作性連接"是指連接方式使得在控制序列相容的條件可進(jìn)行編碼序列的表達(dá)。適用于原核宿主的啟動子包括例如(5-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、石威性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜合啟動子(例如tac啟動子)。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動子一般還含有與編碼序列操作性連接的Shine國Delgarno序歹寸。優(yōu)選的載體是能表達(dá)對應(yīng)于多肽文庫成員的核苷酸序列的表達(dá)載體。因此，可以通過表達(dá)多肽文庫成員的單克隆的單獨增殖和表達(dá)或者通過使用任何選擇展示系統(tǒng)，用第一和/或第二抗原或表位進(jìn)行選擇。如上所述，優(yōu)選的選擇展示系統(tǒng)是噬菌體展示。因此，可以使用噬菌體或噬菌粒載體，例如pITl或pIT2。用于本發(fā)明的前導(dǎo)序列包括pelB、stll、ompA、phoA、bla和pelA。一個實例是具有大腸桿菌復(fù)制起點(用于雙鏈復(fù)制)以及噬菌體復(fù)制起點(用于產(chǎn)生單鏈DNA)的噬菌粒載體。這類載體的操作和表達(dá)是本領(lǐng)域眾所周知的(Hoogenboom和Winter(1992),出處同上；Nissim等(1994),出處同上)。簡而言之，載體含有P-內(nèi)酰胺酶基因(以便在噬菌粒上賦予選擇性)和表達(dá)盒上游的lac啟動子，后者由以下部分組成(從N端到C端)pelB前導(dǎo)序列(指導(dǎo)表達(dá)多肽到壁膜間隙)、多克隆位點(用于克隆核苦酸形式的文庫成員)、任選一個或多個肽標(biāo)記(用于檢測)、任選一個或多個TAG終止密碼子和噬菌體蛋白pIII。因此，使用大腸桿菌的不同抑制菌抹和非抑制菌抹，并且添加葡萄糖、異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(IPTG)或輔助噬菌體(例如VCSM13),載體能夠作為質(zhì)粒進(jìn)行復(fù)制，但卻不表達(dá)，僅產(chǎn)生大量多肽文庫成員或產(chǎn)生噬菌體，它們中的一些在其表面含有至少一個拷貝的多肽-pIII融合體。編碼本發(fā)明配體的載體的構(gòu)建采用常規(guī)連接技術(shù)。分離的載體或DNA片段被切割、剪裁并重新連接成產(chǎn)生所需載體的理想形式。如有必要，可以用已知方式進(jìn)行分析，證實所構(gòu)建的載體中存在正確序列。用于構(gòu)建表達(dá)載體、制備體外轉(zhuǎn)錄物、將DNA引入宿主細(xì)胞、以及進(jìn)行評價表達(dá)和功能的分析所用的合適方法，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通過常規(guī)方法，檢測樣品中存在的基因序列、或其擴(kuò)增和/或表達(dá)量，所述常規(guī)方法例如DNA印跡分析或RNA印跡分析、蛋白質(zhì)印跡、DNA、RNA或蛋白質(zhì)斑點印跡、原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)或者核酸或蛋白質(zhì)分子的測序分析。如有必要，本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地知道如何改進(jìn)這些方法。骨架骨架可以基于免疫球蛋白分子或者可以是如上所述來源的非免疫球蛋白。本文所述的優(yōu)選免疫球蛋白骨架包括任何一個或多個選自以下的骨架至少包含以下部分的免疫球蛋白分子(i)抗體的CL(K或入亞類)區(qū)；或(ii)抗體重鏈的Ch1區(qū)；包含抗體重鏈Ch1區(qū)和&2區(qū)的免疫球蛋白分子；包含抗體重鏈Cnl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的免疫球蛋白分子；或任何(ii)亞類以及抗體的CL(K或人亞類)區(qū)。也可以包含鉸鏈區(qū)域。這樣的各區(qū)組合可以是例如模擬天然抗體，例如IgG或IgM或其片辜史，例如Fv、scFv、Fab或F(ab')2分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，該名單并非是詳盡而無遺漏的。蛋白質(zhì)支架各表位結(jié)合域包含蛋白質(zhì)支架和一個或多個CDR，它們參與結(jié)構(gòu)域與一個或多個表位的特異性相互作用。最好本發(fā)明的表位結(jié)合域包含3個CDR。合適的蛋白質(zhì)支架包括選自以下的任何支架基于免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的支架、基于纖連蛋白的支架、基于親和體的支架、基于CTLA4的支架、基于陪伴分子例如GroEL的支架、基于脂質(zhì)運載蛋白的支架和基于細(xì)菌Fc受體SpA和SpD的支架。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，該名單并非是詳盡而無遺漏的。用于構(gòu)建配體的支架主鏈構(gòu)象的選擇免疫球蛋白超家族成員都共享其多肽鏈的類似折疊。例如，盡管抗體在其一級序列上具有高度多樣性，但是序列比較和晶體結(jié)構(gòu)表明，與預(yù)期相反，抗體的6個抗原結(jié)合環(huán)中有5個(H1、H2、Ll、L2、L3)采用數(shù)目有限的主鏈構(gòu)象或正則結(jié)構(gòu)(Chothia和Lesk(1987)J.M/.艦,196:901;Chothia等(1989)Mm^，342:877)。因此，對環(huán)長度和關(guān)鍵殘基進(jìn)行分析，能夠預(yù)測在大多數(shù)人抗體中存在的Hl、H2、Ll、L2和L3的主鏈構(gòu)象(Chothia等(1992)丄Mo/.說o/.,227:799;Tomlinson等(1995)5A^(9丄，14:4628;Williams等(1996)Mo/.SZo/.,264:220)。盡管H3區(qū)在序列、長度和結(jié)構(gòu)上更具多樣性(因為使用D區(qū)段)，但是它也構(gòu)成數(shù)目有限的短環(huán)長度的主鏈構(gòu)象，這取決于環(huán)及抗體構(gòu)架的關(guān)鍵位置上特定殘基的長度和存在與否，或殘基種類(Martin等(l996)/A/o/.歷o/.,263:800;Shirai等(1996)丄e股ra，399:1)。可以設(shè)計配體和/或結(jié)構(gòu)域文庫，其中可以選擇出某些環(huán)長度和關(guān)鍵殘基，以保證各成員的主鏈構(gòu)象是已知的。如上所述，最好這些是天然存在的免疫球蛋白超家族分子的真實構(gòu)象，以將它們是非功能性的機(jī)會降至最低。種系V基因區(qū)段起到一個合適的基本構(gòu)架的作用，用于構(gòu)建抗體或T細(xì)胞受體文庫；也可使用其它序列。可以低頻率發(fā)生變異，使得少量功能性成員具有改變的主鏈構(gòu)象，這樣的改變并不影響其功能。正則結(jié)構(gòu)理論也用于評價配體所編碼的不同主鏈構(gòu)象的數(shù)目，以預(yù)測基于主鏈構(gòu)象的配體序列并選擇用于多樣化的殘基，同時又不影響正則結(jié)構(gòu)。已經(jīng)知道，在人Vk區(qū)中，Ll環(huán)可采用4種正則結(jié)構(gòu)之一，L2環(huán)具有一種正則結(jié)構(gòu)，而且90%的人Vk區(qū)的L3環(huán)采用4或5種正則結(jié)構(gòu)之一(Tomlinson等(1995),出處同上)；因此，僅在Vk區(qū)，不同正則結(jié)構(gòu)可組合產(chǎn)生大量的不同主鏈構(gòu)象。假定VX區(qū)為Ll、L2和L3環(huán)編碼各種不同正則結(jié)構(gòu)，Vk區(qū)和V人區(qū)可與任何Vh區(qū)(其可為HI和H2環(huán)編碼幾種正則結(jié)構(gòu))配對，則這5個環(huán)所觀察到的正則結(jié)構(gòu)的組合數(shù)量將會非常龐大。這表明主鏈構(gòu)象多樣性的產(chǎn)生對產(chǎn)生各種結(jié)合特異性來說是必不可少的。然而，通過構(gòu)建基于抗體文庫的一種已知主鏈構(gòu)象，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與預(yù)期相反，主鏈構(gòu)象的多樣性并非產(chǎn)生足夠的針對幾乎所有抗原的多樣性所必需的。甚至更令人吃驚的是，一種主鏈構(gòu)象不一定是共有結(jié)構(gòu)一一種天然存在的構(gòu)象可以用作整個文庫的基礎(chǔ)。因此，在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的雙特異性配體具有一種已知主鏈構(gòu)象。所選的一種主鏈構(gòu)象優(yōu)選在所述免疫球蛋白超家族類型的分子中是常見的。當(dāng)觀察到大量天然存在的分子采用該構(gòu)象時，該構(gòu)象是常見的。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方面，單獨考慮免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的各結(jié)合環(huán)的不同主鏈構(gòu)象的天然發(fā)生率，然后選擇具有不同環(huán)的主鏈構(gòu)象所需組合的天然存在的可變區(qū)。如果沒有可用的，就可選擇最接近的等同物。優(yōu)選不同環(huán)的主鏈構(gòu)象的所需組合是由所選種系基因區(qū)段(其編碼所需主鏈構(gòu)象)產(chǎn)生的。更優(yōu)選所選種系基因區(qū)段在自然界頻繁表達(dá)，最優(yōu)選它們在所有天然種系基因區(qū)段中是最頻繁表達(dá)的。在設(shè)計配體(例如dAb)或其文庫過程中，可以單獨考慮6個抗原結(jié)合環(huán)中每一個的不同主鏈構(gòu)象的發(fā)生率。對于Hl、H2、Ll、L2和L3，選擇被20%至100%之間的天然分子抗原結(jié)合環(huán)所采用的給定構(gòu)象。通常，所觀察到的它的發(fā)生率為35%以上(即介于35%和100%之間)、更理想的是50%以上或甚至65%以上。因為絕大多數(shù)H3環(huán)沒有正則結(jié)構(gòu)，所以優(yōu)先選擇在可展示正則結(jié)構(gòu)的環(huán)中常見的主鏈構(gòu)象。因此，對于每個環(huán)來說，選擇天然庫中最常見的構(gòu)象。在人抗體中，各環(huán)最常見的正則結(jié)構(gòu)(CS)如下H1-CS1(79%表達(dá)庫)、H2-CS3(46%)、Vk的L1-CS2(39%)、L2畫CS1(100%)、Vk的L3畫CS1(36%)(計算假定k:人的比例為70:30，Hood等(1967)CoWS/7""gHaAor說o/.,48:133)。對于具有正則結(jié)構(gòu)的H3環(huán)而言，具有從殘基94到殘基101的鹽橋的7個殘基的CDR3長度(Kabat等(1991)Se《wewcesypra^z'/wo/z'附附wwo/og/ca/Z"&"W,美國1建康和人類月良務(wù)部)看來是最常見的。EMBL數(shù)據(jù)文庫中有至少16個人類抗體序列具有所需H3長度和關(guān)鍵殘基，構(gòu)成該構(gòu)象，并且在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中至少有兩個晶體結(jié)構(gòu)可用作抗體建模的基礎(chǔ)(2cgr和ltet)。最常表達(dá)的種系基因區(qū)段的正則結(jié)構(gòu)組合是VH區(qū)段3-23(DP-47)、JH區(qū)段JH4b、Vk區(qū)段02/012(DPK9)和t區(qū)段Jk1。Vh區(qū)段DP45和DP38也是合適的。因此，這些區(qū)段可用于組合，作為構(gòu)建具有所需單一主鏈構(gòu)象的文庫的基礎(chǔ)?；蛘?，并非根據(jù)分離的各結(jié)合環(huán)的不同主鏈構(gòu)象的天然發(fā)生率來選擇單一主鏈構(gòu)象，而是采用主鏈構(gòu)象組合的天然發(fā)生率作為選擇單一主鏈構(gòu)象的基礎(chǔ)。就抗體而言，例如，可以確定任何2、3、4、5或所有6個抗原結(jié)合環(huán)的正則結(jié)構(gòu)組合的天然發(fā)生率。在此，優(yōu)選所選構(gòu)象在天然存在的抗體中是常見的，最優(yōu)選它是天然庫中所觀察到的最常見的。因此，在人抗體中，例如當(dāng)考慮H1、H2、Ll、L2和L3五個抗原結(jié)合環(huán)的天然組合時，確定最常見的正則結(jié)構(gòu)的組合，然后結(jié)合最常見的H3環(huán)構(gòu)象，作為選擇單一主鏈構(gòu)象的基礎(chǔ)。正則序列的多樣化如果具有所選幾種已知的主鏈構(gòu)象、或者優(yōu)選單一已知主鏈構(gòu)象，可以通過改變分子的結(jié)合位點，構(gòu)建本發(fā)明所用的配體(例如dAb)或文庫，以便產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)和/或功能多樣性的庫。這表明，產(chǎn)生變異體，使得它們在其結(jié)構(gòu)和/或功能上具有足夠的多樣性，使得它們能夠提供各種活性。所需多樣性通常是通過在一個或多個位置上改變所選分子而產(chǎn)生的。可以隨^/L或優(yōu)選選擇所要改變的位置。然后，可以通過以下方式達(dá)到變異通過隨機(jī)化(其間定居氨基酸被任何氨基酸或其類似物(天然或合成的)所取代)，產(chǎn)生數(shù)量非常大的變異體；或者通過用一個或多個氨基酸的限定亞類來取代定居氨基酸，產(chǎn)生數(shù)目更有限的變異體。已經(jīng)報道了各種方法，用于引入這樣的多樣性。易錯PCR(Hawkins等(1992)丄M/.編.，226:889)、化學(xué)誘變(Deng等(1994)5,'o/.C&w.,269:9533)或細(xì)菌突變菌抹(Low等(1996)丄Mo/,所o/.，260:359)可用于將隨機(jī)突變引入編碼分子的基因內(nèi)。使所選位置發(fā)生突變的方法也是本領(lǐng)域眾所周知的，它包括使用錯配寡核苷酸或簡并寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通過抗原結(jié)合環(huán)的定向突變，已經(jīng)產(chǎn)生了一些合成抗體文庫。使人破傷風(fēng)類毒素結(jié)合Fab的H3區(qū)隨機(jī)化，以便產(chǎn)生各種新的結(jié)合特異性(Barbas等(1992)尸rac.W加/.Xcad[/.S.A,89:4457)。隨機(jī)或半隨機(jī)H3和L3區(qū)已經(jīng)附加到種系V基因區(qū)段上，產(chǎn)生具有未突變構(gòu)架區(qū)的大文庫(Hoogenboom和Winter(1992)/.Mo/.5z'o/.,227:381;Barbas等(1992)爿cad89:4457;Nissim等(1994)五雄O13:692;Griffiths等(1994)五雄OJ.,13:3245;DeKruif等(1995)J.編.艦,248:97)。這樣的多樣化可以延伸至包括某些或所有其它抗原結(jié)合環(huán)(Cmmeri等(1996)A^wre2:100;Riechmann等(1995)說o/7fec/"o/ogy,13:475;Morphosys,WO97/08320,出處同上)。因為環(huán)隨機(jī)化僅對H3就具有產(chǎn)生約超過1015種結(jié)構(gòu)的潛力，而對其它5個環(huán)也具有產(chǎn)生類似的大數(shù)量變異體的潛力，所以不能通過使用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化技術(shù)或使用無細(xì)胞系統(tǒng)來產(chǎn)生代表所有可能組合的文庫。例如，在迄今為止所構(gòu)建的最大文庫之一中，產(chǎn)生6xl01Q個不同抗體，這僅僅是該設(shè)計文庫的潛在多樣性的一部分(Griffiths等(1994),出處同上)。優(yōu)選只有直接參與產(chǎn)生或修飾分子所需功能的殘基，才被多樣化。對于許多分子而言，功能是結(jié)合靶標(biāo)，因此，多樣性應(yīng)該集中在草巴結(jié)合位點中，而避免改變那些對分子總體包裝或保持所選主鏈構(gòu)象來說必不可少的殘基。正則序列的多樣化，當(dāng)它用于抗體區(qū)時就基于抗體的配體(例如dAb)而言，靶結(jié)合位點是最常見的抗原結(jié)合位點。因此，優(yōu)選只有在抗原結(jié)合位點的殘基才改變。在人抗體庫中，這些殘基極端多樣性，已知讓其接觸高分辨率抗體/抗原復(fù)合物。例如，在L2中，已知位置50和53在天然存在的抗體中是不同的，并且觀察到它們與抗原接觸。相比之下，常規(guī)方法已經(jīng)改變了相應(yīng)互補決定區(qū)(CDRl)中的所有殘基(定義參見Kabat等，1991,出處同上)、本發(fā)明所用的文庫中多樣化的兩個相比的某七個殘基。這顯示了產(chǎn)生各種抗原結(jié)合特異性所需的功能多樣性的顯著改善。在自然界，抗體多樣性是兩個過程的結(jié)果種系V、D和J基因區(qū)段的體細(xì)胞重組，產(chǎn)生幼稚(naive)初級庫(所謂的種系和連接多樣性)；以及所得重排V基因的體細(xì)胞高變。對人類抗體序列進(jìn)行分析表明，初級庫中的多樣性集中在抗原結(jié)合位點的中心，而體細(xì)胞高變則將多樣性擴(kuò)散到抗原結(jié)合位點周圍區(qū)，而這些區(qū)在初級庫中是高度保守的(參見Tomlinson等(1996)J.編.嵐,256:813)。這一互補性可能逐漸成為檢索序列空間的有效策略，而且，盡管顯然是抗體所特有的，但是它也可容易地用于其它多肽庫。改變的殘基是構(gòu)成靶的結(jié)合位點的殘基的亞類。如有必要，在選擇期間的不同時期，可以改變耙結(jié)合位點中殘基的不同(包括重疊)亞類。就抗體庫而言，可以產(chǎn)生起始"幼稚，，庫(initial"naive"repertoire),其中改變抗原結(jié)合位點的某些、而不是全部的殘基。在這種情況下，本文所用的術(shù)語"幼稚(naive)"是指沒有預(yù)定靶標(biāo)的抗體分子。這些分子類似于沒有經(jīng)歷免疫多樣化的個體(例如在胎兒和新生兒個體的情況下)的免疫球蛋白基因所編碼的那些分子，所述個體的免疫系統(tǒng)尚未受到各種抗原性刺激的攻擊。然后，針對各種抗原或表位來選擇該庫。如有必要，還可在起始庫改變的區(qū)域之外引入更多多樣性?？梢赃x擇具有修飾功能、特異性或親和力的這種成熟的庫。本領(lǐng)域已知用于構(gòu)建配體的結(jié)合域的幼稚文庫，其中改變了抗原結(jié)合位點中的某些或所有殘基。(參見WO2004/058821、WO2004/003019和WO03/002609)。"初級，，文庫才莫擬天然初級庫，其多樣性局限于抗原結(jié)合位點中心的殘基，它們在種系V基因區(qū)段中具有多樣性(種系多樣性)，或者在重組過程中被賦予多樣性(連接多樣性)。這些多樣化的殘基包括但不限于H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96。在"體細(xì)胞"文庫中，多樣性局限于重組過程中改變的殘基(連接多樣性)或者是高度體細(xì)胞突變的)。這些多樣化的殘基包括但不限于H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34和L96。已知讓適于這些文庫多樣性的以上列出的所有殘基在一個或多個抗體-抗原復(fù)合物中接觸。因為在這兩種文庫中，抗原結(jié)合位點中并非所有殘基都改變，在選擇中，通過改變剩余殘基而結(jié)合另外的多樣性，如果需要這樣的話。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，任何這些殘基(或者包括抗原結(jié)合位點的其它殘基)的任何亞類都可以用于抗原結(jié)合位點的起始和/或后來的多樣化。在用于本發(fā)明的文庫構(gòu)建中，所選位置的多樣化通常是在核酸水平上進(jìn)行，即通過改變指定多肽序列的編碼序列，使得許多可能的氨基酸(所有20種或其亞類)可以結(jié)合在該位置。采用IUPAC命名法，最通用的密碼子是NNK，它編碼所有氨基酸以及TAG終止密碼子。NNK密碼子優(yōu)選用于引入所需多樣性。也可以使用達(dá)到相同末端的其它密碼子，包括NNN密碼子，該密碼子導(dǎo)致產(chǎn)生額外的終止密碼子TGA和TAA。人抗體的抗原結(jié)合位點中側(cè)鏈多樣性的特征明顯對某些氨基酸殘基有偏倚。如果統(tǒng)計每個VH、Vk和V、區(qū)中10個最多變的位置的氨基酸組成的話，超過76%的側(cè)鏈多樣性僅來自7個不同殘基，它們是絲氨酸(24%)、酪氨酸(14%)、天冬酰胺(11%)、甘氨酸(9%)、丙氨酸(7%)、天冬氨酸(6%)和蘇氨酸(6%)。這種傾向于可提供主鏈柔性的親水性殘基和小殘基的偏倚，可能反映了表面進(jìn)化，該進(jìn)化傾向于結(jié)合各種抗原或表位，并且有助于解釋初級庫中抗體的所需混雜。因為優(yōu)選模擬這樣的氨基酸分布，所以在有待改變位置上的氨基酸分布優(yōu)選模擬在抗體的抗原結(jié)合位點所見到的那些。這種允許針對各種靶抗原來選擇某些多肽(不僅是抗體多肽)的氨基酸取代中的偏倚，易于用于任何多肽庫。有各種方法，用于在有待改變的位置上使氨基酸分布發(fā)生偏倚(包括使用三核苦酸誘變，參見WO97/08320),其中優(yōu)選的方法，由于容易合成，是采用常規(guī)簡并密碼子。通過比較由簡并密碼子所有組合所編碼的氨基酸分布型(在各位置上具有等比例的單、雙、三和四重簡并性)與天然氨基酸的使用，可以計算出最具代表性的密碼子。密碼子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT),也就是說，分別用IUPAC命名法命名的DVT、DVC和DVY—一就是最接近所需氨基酸分布型的密碼子它們編碼22%絲氨酸和11%酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸。因此，優(yōu)選的文庫是在各多樣化位置上用DVT、DVC或DVY密碼子構(gòu)建的。L929細(xì)胞毒性測定在小鼠L929成纖維細(xì)胞中，鑒定了TNFR1拮抗劑(例如配體、dAb單體)對TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制能力(Evans,T.(2000)Mo/ecw/arS,'ofec/2"o/ogy15,243-248)。簡而言之，將接種在孩i量滴定板上的L929細(xì)胞與TNFR1拮抗劑、100pg/mlTNF和lmg/ml放線菌素D(Sigma,Poole，英國)一起孵育過夜。細(xì)胞存活率通過在4卯nm讀出吸光度而測定，接著與[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基(carbboxy)曱氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑镥(Promega,Madison,美國)一起孵育。TNFR1拮抗劑抑制細(xì)胞毒性，因此，與僅用TNF對照相比，導(dǎo)致吸光度增加。HeLaIL-8測定鑒定了TNFR1拮抗劑(例如配體、dAb單體)對TNF誘導(dǎo)的由人HeLa細(xì)胞分泌IL-8的抑制能力(采用Akeson,L.等(1996)Jowma/o/5z'o/ogz'ca/C/^m/對o/271,30517-30523所述方法的改進(jìn)方法，所述文獻(xiàn)介紹了在HUVEC中IL-1對IL-8的誘導(dǎo)作用；在此，我們觀察了人TNFot的誘導(dǎo)作用，而且我們采用HeLa細(xì)胞替代HUVEC細(xì)胞系)。簡而言之，接種在微量滴定板上的HeLa細(xì)胞與TNFR1拮抗劑和300pg/mlTNP—起孵育過夜。孵育后，吸出上清液，采用夾心ELISA(R&DSystems)或其它合適方法，測定細(xì)胞和IL-8濃度。與僅用TNF對照相比，TNFR1拮抗劑抑制IL-8分泌，在上清液中檢出更少的IL-8。實施例實施例1.腫瘤壞死因子(TNF)血清半衰期的延長在每組10只人TNF(Tgl97)轉(zhuǎn)基因小鼠中，每周腹膜內(nèi)給予動物抗TNFdAb,其精制成為具有40k支鏈PEG的二聚體(稱為PEGTARl-5-19)或與抗血清白蛋白dAb的融合體(稱為TAR1-5-19/MSA三聚體)。給予鹽水作為對照。給藥7周后，采用抗TNF夾心ELISA試劑盒，分析動物血清的循環(huán)TNF水平。給予鹽水的動物的循環(huán)TNF水平為25.6pg/ml，而接受TAR1-5-19/MSA三聚體的動物的TNF水平升高至28.8pg/ml，PEGTAR1-5-19的水平升高至2315pg/ml。這清楚地證明，血清半衰期延長的dAb可增加具有短血清半衰期的分子(例如細(xì)胞因子)的循環(huán)水平，因此增加血清水平。實施例2.可溶性肺瘤壞死因子受體1(sTNFRl)血清半衰期的延長單次靜脈內(nèi)給予CD1小鼠lmg/kg劑量的抗小鼠TNFR1dAb,其精制成為具有40k支鏈PEG的二聚體(稱為PEG抗TNFR1dAb)或與抗血清白蛋白dAb的融合體(稱為抗TNFRl/抗SA二聚體)。采用如下詳述的抗TNFR1夾心ELISA，在不同時間點檢查血清中的可溶性TNFR1水平。TNFR1的測定用抗小鼠sTNFR1/TNFRSF1A抗體(50ul/孔，lug/ml,PBS)包被F96Maxisorp96孔平底免疫板(Nunc，產(chǎn)品目錄號439454)。各板在室溫下孵育l小時。各板用200ulPBS洗滌3次。非特異性結(jié)合用3%BSA/PBS在室溫下封閉1小時。各板用200ulPBS/0.05Q/。吐溫20洗滌3次。在PBS/1%BSA中制備5000ngmr1、500ngmr1、50ngml"和5ngm1-1重組小鼠sTNFRl(R&DSystems,產(chǎn)品目錄號4254-Rl)稀釋液，將50ul加入到孔中?；蛘撸肞BS/1%BSA制備來自用TAR2m-2卜23/40K支鏈PEG免疫小鼠的血清，稀釋度為1/5、1/50、1/500和1/5000,將50ul加入孔中。各板在室溫下孵育1小時。各板用200ulPBS/0.05。/o吐溫20洗滌3次。制備lug/ml生物素化抗小鼠sTNFRl抗體(R&DSystems,產(chǎn)品目錄號AHFOl)，將50ul加入孔中。各板在室溫下孵育1小時。各板用200ulPBS/0.05"V土溫20洗滌3次。制備160ngml—1過氧化物酶-綴合的IgG部分單克隆小鼠抗生物素(Stratech,產(chǎn)品目錄號200-032-096),將50ul加入孔中。各板在室溫下將育1小時。各板用200ulPBS/0.05y。吐溫20洗滌3次，再用PBS洗滌3次。將SureBlueTMBl-組分微孔過氧化物酶底物(KPL,產(chǎn)品目錄號52-00-00)加入到所有孔中。將板在室溫下孵育15分鐘，用1MHC1終止反應(yīng)。在450nM處讀出吸光度。所有樣品的測定都是一式兩份。包括沒有樣品的孔。將來自給予PEG抗TNFR1dAb的小鼠的1/5稀釋度的血清的OD結(jié)果對時間作圖(圖1)。結(jié)果清楚表明血清中TNFR1水平增加，然后回落到基礎(chǔ)水平，接著dAb被清除。實施例3.結(jié)合受體分子、但不結(jié)合其活性部位的dAb該實施例說明了能結(jié)合所需受體分子、但不結(jié)合該受體的活性部位的dAb的鑒定方法。該方法用腫瘤壞死因子1受體(TNFR1)為例來說明，TNFR1通常用于受體分子。由不同鼠TNFR1域和人TNFR1域組成嵌合受體分子(BannerDW,等CW/,75(3):431-45(1993》，使得該分子含有TNFR1的4種已定義的胞外域，但是它們在小鼠和人TNFR1蛋白間的衍生差異是不同的。根據(jù)不同結(jié)構(gòu)域的作用和功能，所產(chǎn)生的嵌合受體共享人TNFR1和小鼠TNFR1的特性。該分子提供對結(jié)合人或小鼠TNFR1的dAb、抗體及其抗原結(jié)合片段和其它分子(例如蛋白質(zhì)域，例如親和體、LDL受體區(qū)或EGF區(qū))的結(jié)構(gòu)域特異性的評^r方法。方法將人和小鼠TNFR1序列先通過EcoRI和Notl限制性內(nèi)切核酸酶位點克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPicZot(Invitrogen)中。模板小鼠TNFR1DNA(因此嵌合受體構(gòu)建體結(jié)束于鼠域4)含有3'6x組氨酸標(biāo)記。人TNFR1(因此嵌合受體構(gòu)建體結(jié)束于人域4)在序列的3'端同時含有Myc和6x組氨酸標(biāo)記。按照標(biāo)準(zhǔn)PCR條件，采用RubyTaqDNA聚合酶(USBCorporation,Cleveland,Ohio)、lOOng模板DNA(包含全長mTNFRl或hTNFRlDNA相關(guān)DNA小量制備物模板)，進(jìn)行起始PCR。典型的PCR反應(yīng)如下進(jìn)行含聚合酶的25pl10XRubyTaqPCR緩沖液；2pl第一引物(來自IOmM貯液)；2jal第二引物(來自10|iiM]3±液)；ljul(100ng)全長TNFR1模板DNA;20)li1dH20(至終體積50)^1)。反應(yīng)在薄壁管中進(jìn)行，并放在熱循環(huán)儀中，其中按照以下參數(shù)進(jìn)行反應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table>裝配PCR(也稱為'pull-through'或剪接重疊延伸(SOE),參見15:77(1):61-8(1989))，使初次PCR產(chǎn)物無需消化或連接而聯(lián)合在一起，使用初次PCR產(chǎn)物互補末端。在該過程中，初次產(chǎn)物聯(lián)合在一起并變性，接著在TaqDNA聚合酶和dNTP存在下，讓它們的互補末端一起退火。重復(fù)退火和延伸多次循環(huán)，導(dǎo)致互補鏈補平，產(chǎn)生全長模板。添加鄰接全長構(gòu)建體盒的引物，進(jìn)行常規(guī)PCR,擴(kuò)增裝配產(chǎn)物。進(jìn)行SOEPCR,使來自上述起始PCR的不同TNFR1域一起退火并擴(kuò)增。裝配SOEPCR如下進(jìn)行含MgCl2的40|li110xPCR緩沖液；2pl(100ng)起始PCRl的純化產(chǎn)物；~2pl(100ng)起始PCR2的純化產(chǎn)物；36i!ldH20(至終體積80|al)。在以下裝配步驟后加入SOE引物混合物2jLil5'側(cè)翼引物(引物1);2|nl3'側(cè)翼引物(引物2);,10xPCR緩沖液；6fildH2O(至終體積20pl)。使用下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。起始裝配循環(huán)需要約45分鐘，然后將熱循環(huán)儀設(shè)置停頓在94°C。引物混合物加入到各反應(yīng)物中并進(jìn)行混合。裝配條件<table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>將3-5^1各反應(yīng)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢查PCR產(chǎn)物。將裝配TNFR1嵌合體克隆到畢赤酵母表達(dá)載體中pPicZa載體(Invitrogen)依次用EcoRI和Notl酶消化，再用ChromaspinTE-1000凝月交過濾柱(Clontech,MountainView,CA)純化。將TNFR1嵌合構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中連接后的嵌合構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到HB2151電感受態(tài)(electrocompetent)大腸桿菌細(xì)胞中，在低鹽LB培養(yǎng)基中回收1小時，然后接種在含有0.25pg/ml零霉素(ZEOCIN)、含腐草霉素D的抗生素制劑(Cayla,Toulouse，法國)的低鹽LB瓊脂上，在37。C培養(yǎng)24小時。單菌落經(jīng)序列證實，以保證表達(dá)載體內(nèi)嵌合構(gòu)建體有正確序列，大規(guī)模Maxiprep質(zhì)粒制備物由各嵌合構(gòu)建體載體組成。所制備的嵌合構(gòu)建體的核苷酸序列見下文。嵌合構(gòu)建體根據(jù)其結(jié)構(gòu)域來源而命名(從左到右是域1至域4)。例如，HMMM含有人域1和小鼠域2-4。含有小鼠域4的嵌合蛋白僅具有His標(biāo)記并且缺乏^爭膜區(qū)和域4之間的間隔區(qū)。AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTC3CTGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTT(3TACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAGGGAGTGTGAAAAGGGCACCTTTACGGCTTCCCAGAATTACCTCAGGCAGTGCCTCAGTTGCAAGACATGTCGGAAAGAAATGTCCCAGGTGGAGATCTCTCCTTGCCAAGCTGACAAGGACACGGTGTGTGGCTGTAAGGAGAACCAGTTCCAACGCTACCTGAGTGAGACACACTTCCAGTGCGTGGACTGCAGCCCCTGCTTCAACGGCACCGTGACAATCCCCTOTAAGGAGACTCAGAACACCGTGTGTAACTGCCATGCAGGGTTCTTTCTGAGAGAAAGTGAGTGCGTCCCTTGCAGCCACTGCAAGAAAAATGAGGAGTGTATGAAGTTGTGCCTAAGCGCTCATCATCATCATCATCATTAATGA(SEQK)NO:19)鵬MAGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGiVrrTGCTGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAGGGAOTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGQTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACACCOTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTGCTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGCACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAACACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGGTTCTTTCTGAGAGAAAGTGAGTGCGTCCCTTGCAGCCACTGCAAGAAAAATGAGGAC3TGTATGAAGTTGTGCCTAAGCGCTCATCATCATCATCATCATTAATQA(SEQIDNO:20)HHMHAGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGAITTGCTGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTTOTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAGGGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCITCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACACCGTGTGTGGCTGTAAGGAGAACCAGTTCCAACGOTACCTGAGTGAGACACACTTCCAGTGCGGGACTGCAGCCCCTGCTTCAACGGCACCGTGACAATCCCCTGTAAGGAGACTCAGAACACCGTGfTGTAACTGCCAT(3CAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAOTGTGTCTCCTGTAGTAACTGTAAGAAAAGCCTGGAGTGCACC3AAGTTGTGCCTACCCCAGATTC;AGAATGTTAAGGGCACTGAGGACTCAGGCACCACAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAiWkACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCC(3TCGACCATCATCATCATCATCATTGA(SEQIDNO:21)HMHHAGTGTC3TGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGAT:TGCTGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATC3ACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAGGQAGTGTGAAAAGGGCACCTTTACGGCTTCCCAGAATTACCTCAGGCAGTGTCTCAGTTGCAAGACATOTCGGAAAGAAAT(3TCCCAGGTGGAGATCTCTCCTTGCCAM3CTGACAAGGACACGGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCMTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTGCTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGCACCTCTCCT(3CCAGGAGAAACAGAACACCGTGTGCACCTGdCATGCaGGTITCTTrCTAAGAGAAAACGAGTGTGTCTCCrGTAGTAACTGTAAGAAAAGCCTGGAGTGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTI3AGAATGTTAAGGGCACTGAGGACTCAGGCACCACAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA(犯QIDNO:22)MHHHAGCTTGTGTCCCCAAGGAAAOTATGTCCMTCTAAGAACAATTCCATCTGCTGCACCAAGTGCCACAAAGGAACCTAOTTGGTQAGTGACTGTCCQAGCCCAGGGCGG3ATACAGTCTGCAGGGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACACCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAC3TGCTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTC3CACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAACACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAGT(3T(3TCTCCTGTAGTAACTGTAAGAAAAGCCTC3GAOTGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAGAATC3TTAAGGGCACTGAGGACTCAGC3CACCACAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCOTCGACCATCATCATCATCATCATTGA(SEQIDNO:23)TNFR1嵌合構(gòu)建體的制備及轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母中將通過各大量制備(maxiprep)產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA用稀有切割限制內(nèi)切核酸酶Pmel消化，以便使DNA線性化，然后進(jìn)行畢赤酵母轉(zhuǎn)化。線性化DNA再通過苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀而純化，然后重懸于30|aldH20。10|ul線性化DNA溶液與80pi電感受態(tài)(electro-competent)KM71H畢赤酵母細(xì)胞混合5分鐘，然后進(jìn)行電穿孔(1.5kV,200Q,25jiF)。細(xì)胞立即用YPDS恢復(fù)并在3(TC孵育2小時，然后接種在含有100ng/ml零霉素(ZEOCIN)、含腐草霉素D的抗生素制劑(Cayla,Toulouse,法國)的YPDS瓊脂板上培養(yǎng)2天。構(gòu)建體在畢赤酵母中的表達(dá)挑取各構(gòu)建體的單個轉(zhuǎn)化菌落，接種到5mlBMGY(作為起子培養(yǎng)物)中，在30。C培養(yǎng)24小時。用該培養(yǎng)物接種500mlBMGY培養(yǎng)基，在3(TC培養(yǎng)24小時，然后在室溫下以1500-3000g離心5分鐘收獲細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于100mlBMMY中，培養(yǎng)4天，同時交錯增加曱醇濃度(笫1天0.5%,第2天1%,第3天1.5%,第4天2%)。表達(dá)后，培養(yǎng)物以3300g離心15分鐘，回收上清液。用Nickel樹脂純化TNFR1嵌合構(gòu)建體在培養(yǎng)上清液中先加入10mM終濃度的咪唑和2xPBS進(jìn)行緩沖。在室溫下加入Nickel-NTA樹脂，分批吸附His-標(biāo)記的蛋白質(zhì)達(dá)4小時(振蕩)。上清液/樹脂混合物再倒入poly-prep柱(Biorad)。樹脂再用10倍體積的2xPBS洗滌，用250mM咪唑lxPBS洗脫。更換緩沖液后，用EndoH脫糖基化酶使嵌合構(gòu)建體表達(dá)脫糖基化，再通過SDS-PAGE得以證實。PCR過程中所用的模板DNA序列人(Homosa;Ze"s)TNFR1(胞外區(qū)Genbank檢索號33991418)ctggtccctcacctaggggacagggagaagagagatagtgtgtgtccccaaggaaaatatatccaccctcaaaataattcgatttgctgtaccaagtgccacaaaggaacctacttgtacaatgactgtccaggcccgg。gcaggatacggactgcagggagtgtgagagcggctccttcaccgcttcagaaaaccacctcagacactgcctcaGCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTrCTTGCACAGtggaccgggacaccgtgtgtggctgcaggaagaaccagtaccggcattattggagtgaaaaccttttccagtgcttcaattgcagcctctgcctcaatgggaccgtocacctctcctgccaggagaaacagaacaccgtgtgcacctgc:catgcaggtttctttctaagagaaaacgagtgtgtctcctgtagtaactgtaagaaaagcctcgagTGCACGAAGTTGTGCC1ACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGGCACTGAGGACTCAGGCACCACA(SEQIDNO:l)所編碼的人TNFR1胞外區(qū)具有下列氛基酸序列。lvphlgdrekkdsvcpqgkyihpqmnsicctkchkgtylyndcpgpgqdtdcrecesgsftasenhlrhclscskcrkemgqveissctvdrdtvcgcri:nqyrhywsenlfqcfncslclngtvhlscq孤qntvctchagfflrenecvscsnckkslectklclpqienvkgtedsgtt(sbqidno:2)鼠(小家鼠(Mwswmscw/"句)TNFR1(胞外區(qū)Genbank檢索號31560798)ctagtcccttctcttggtgaccgggagaagagggatagcttgtgtccccaaggaaagtatgtccattctaagaacaattccatctgctgcaccaaotgccacaaaggaacctacttggtgagtgactgtccgagcccagggcgggatacagtctgcagggaGTGTGAAAAGGGCACCTTTACGGCTrCCCAGAATTACCTCACK3CAGTGTCTCAGttgcaagacatgtcggaaagaaatotcccaggtggagatctctccttgccaagctgacaaggacacggtgtgtggctotaaggagaaccagttccaacgctacctgagtgagacacacttccaotgc(3TGGACTGCAGCCCCTGCTTCAACGGCACCGTGAcaatcccctgtaaggagactcagaacaccgtgtgtaactgccatgcagggttctTTCTGAGAGAAAGTOAGTGCGTCCCTTGCAGCCACTGCAAa^AAAATGAGGAGtgtatgaagttgtgcctacctcctccgcttgcaaatgtcacaaacccccaggacTCAGGTACTGCG(SEQIDNO:3)所編碼的鼠(小家鼠)TNFR1胞外區(qū)具有下列氨基酸序列。LVPSLODREKRDSLCPQGKYVHSK^NSICCTKCHKGTYLVSDCFSPGRDTVCRECEKOTFTASQNYLRQCLSCKTCRKEMSQVEISPCQADKDTVCGCKENQFQRYLSETHFQCVDCSPCFNGTVTIPCKETQNTVCNCHAGFFLRESECVPCSHCKKNEECMKLCLPmANVTNPQDSGTA(SEQIDNO:4)抗TNFR1dAb的結(jié)構(gòu)域特異性當(dāng)抗體孵育并與過量的上述嵌合受體平衡之后，采用表面等離子共振(SPR)測定抗TNFR1dAb結(jié)構(gòu)域特異性('Detectionofimmuno-complexformationviasurfaceplasmonresonanceongold-coateddiffractiongratings.'S/osmson1987-88;3(4):211-25)，以確定抗體與固定在SPR芯片表面的完全人或小鼠生物素化TNFR1結(jié)合的能力。在該測定中，抗TNFRldAb流過TNFR1表面，產(chǎn)生SPR信號，表示與固定在SPR芯片上的TNFR1結(jié)合的dAb量。如果dAb經(jīng)預(yù)孵育并用包含TNFR1域(該結(jié)構(gòu)域尤其可與dAb結(jié)合)的嵌合分子平衡，那么與單獨的dAb相比，該混合物流過TNFR1表面，將會產(chǎn)生更弱的SPR信號。然而，如果dAb經(jīng)預(yù)孵育并用不包含TNFR1域(該結(jié)構(gòu)域尤其可與dAb結(jié)合)的嵌合分子平衡，那么與單獨的dAb所得到的信號相比，該混合物流過TNFR1表面，將會產(chǎn)生大致相同的SPR信號。方法SPR芯片TNFR1表面的產(chǎn)生TNFR1表面的選擇由待測抗TNFR1dAb的物種特異性來決定。因此，用人TNFR1包被的表面來評價抗人TNFR1dAb,而用小鼠TNFR1包被的芯片來評價抗小鼠TNFR1dAb。生物素化TNFR1在合適SPR緩沖液中稀釋，并在BIACORE3000SPR儀器(BiacoreInternationalAB,Uppsala,瑞典)中通過鏈霉抗生物素(SA)傳感器芯片。低流速(5-10^11/分鐘)用于使生物素化TNFR1和鏈霉抗生物素表面之間的接觸時間最大化。持續(xù)流過，直到鏈霉抗生物素表面被生物素化材料飽和，以產(chǎn)生具有最大TNFR1表面的芯片。SPR芯片上抗TNFR1響應(yīng)的效價一個成功的竟?fàn)帉嶒炐枰筎NFR1dAb有起始最佳濃度，使得最少量的dAb流過其表面，就能給出明顯的SPR信號。在某一濃度范圍內(nèi)，dAb可以劑量依賴性方式結(jié)合表面，使得dAb結(jié)合的RU數(shù)能反映流過芯片表面的dAb濃度。為了確定這樣的劑量依賴性濃度范圍，在10倍系列稀釋的Biacore緩沖液(范圍從1:10稀釋到1:1,000,000稀釋)中滴定抗TNFR1dAb。然后將稀釋液單獨且序貫注射到TNFR1芯片表面，從最稀的樣品開始。測定各稀釋液所得的最大RU數(shù)。必要時，每次注射后，TNFR1表面用合適的SPR再生緩沖液進(jìn)行再生，以除去結(jié)合的抗TOFR1dAb。采用該方法，測出產(chǎn)生約IOORU信號所需的抗TNFRIdAb的最小濃度。抗TNFR1dAb/嵌合體的預(yù)平衡一旦確定了抗TNFRldAb的最佳濃度，就可建立抗TNFRldAb/嵌合TNFR1混合物。建立混合物，使得抗TNFR1dAb的終濃度與先前測定的最佳濃度相同。反應(yīng)通常在100^1體積(含有50微升2x濃縮的抗TNFR1dAb、40微升Biacore緩沖液和10微升純化嵌合蛋白)中進(jìn)行。最終混合物通常的濃度為約10-100inM嵌合蛋白和約10-lOOnM抗TNFR1dAb。讓混合物在室溫下平衡30分鐘。竟?fàn)幮訠iacore實驗平衡后，各抗TNFR1dAb/嵌合TNFRl混合物序貫通過TNFRlSPR表面并測定響應(yīng)單元數(shù)目。各混合物注射后，表面經(jīng)再生以除去結(jié)合的抗TNFR1dAb，然后注射下一種混合物。用不同嵌合體所產(chǎn)生的不同響應(yīng)，可以測出結(jié)合特定dAb的TNPR1域。這些研究表明，TAR2m-21-23結(jié)合小鼠TNFR1的域1,而TAR2h-205結(jié)合人TNFRl的域1。TAR2m-21-23EVQLLESGGGLVQPGGSliRLSCAASGFTFN-RYSMGWIiRQAPGKG:LEWVS~~HIDSYGRGTYYEDPVKG"~RFSISRDNSKNTIjYLQMNSLRAEDTAVYYCAK-"ISQFGSNAFDY—WGQGTQVTVSS(SEQIDNO:24)TAR2h-205EVQLLESGGGLVQPGGSLRIiSCAASGFTFVwKYSMG-WVRQAP〈3KGLEWVS—QISNTGGHTYYADSVKG—RFT工SRDNSKNTL)YIjQMNS1jRAEDTAV!:YCAK---YTGRWEPFDY---WGQGTLVTVSS(SEQIDNO:25)TAR2M-21-23和TAR2h-205的氨基酸序列中，CDR1的兩側(cè)是~，CDR2的兩側(cè)是-，而CDR3的兩側(cè)是一。所示氨基酸序列是連續(xù)的，沒有空位。實施例4.篩選方法嵌合受體蛋白(例如本文所述的嵌合TNFR1蛋白)可用于測定或篩選，以分離出能結(jié)合所需受體內(nèi)特定結(jié)構(gòu)域的物質(zhì)(例如抗體、dAb)。采用TNFR1作為所需受體蛋白的模型，這些方法描述了將嵌合蛋白加入到粗抗體制備物中，然后通過ELISA或表面等離子共振篩選受體結(jié)合。另外，它們描述了在表面(例如ELISA板或SPR芯片)包被的嵌合蛋白的用途并通過測定它們與該表面上嵌合蛋白的結(jié)合而篩選抗體。類似方法可用于鑒定能結(jié)合其它受體所需結(jié)構(gòu)域(例如活性部位之外)的物質(zhì)(例如抗體，dAb)?？扇苄訣LISA篩選該方法可用于從龐大的未知特異性的抗體或抗體片段庫中，快速分離出能結(jié)合TNFR1特定結(jié)構(gòu)域的抗體或抗體片段(例如dAb)。96孔測定板用100ili1/孔的嵌合TNFR1在4'C包被過夜。各孔用0.1%TPBS(含有濃度0.1%的吐溫-20的磷酸緩沖鹽溶液)洗滌3次。加入200jli1/孔的1%TPBS封閉該板并將該板在室溫下孵育1-2小時。各孔用PBS洗滌3次，然后加入含有可溶性抗體或抗體片段(其含有c-Myc表位標(biāo)記)/50iul0.2%TPBS的50jal細(xì)菌上清液或periprep。將該板在室溫下孵育1小時。然后，將該板用0.1%TPBS(0.1%吐溫國20/PBS)洗滌5次，再向各孔中加入100|Lil笫一抗c-Myc小鼠單克隆抗體/0.1%TPBS，將該板在室溫下孵育1小時。棄去這樣的笫一抗體溶液，再將該板用0.1%TPBS洗滌5次。然后加入來自山羊的lOOjxl預(yù)稀釋的抗小鼠IgG(Fc特異性)HRP綴合物(Sigma產(chǎn)品目錄號A0168)，將該板在室溫下將育1小時。棄去第二抗體，將該板用0.1%tpbs洗滌6次，再用pbs洗滌2次。向各孔中加入50m1tmb過氧化物酶溶液，將該板在室溫下放置2-60分鐘。加入50|iil1M鹽酸，終止反應(yīng)。在加酸后的30分鐘之內(nèi)，在96孔板閱讀器上讀出該板在450nm處的OD值。粗制細(xì)菌上清液或peripreps中存在的、能結(jié)合嵌合蛋白內(nèi)存在的TNFR1域的這些抗體，將會給出較強(qiáng)烈的ELISA信號，而那些不能結(jié)合的則不能給出信號。竟?fàn)幮詄lisa篩選該方法可以用于快速篩選一系列能結(jié)合TNFR1的不同粗抗體或抗體片段制備物，以測定它們的結(jié)構(gòu)域結(jié)合特異性。96孔測定板用100|11/孔的鼠或人TNFR1(人或小鼠)在4。C包被過夜。各孔用0.1%TPBS(含有濃度0.1%的吐溫-20的磷酸緩沖鹽溶液)洗滌3次。加入200pl/孔的1%TPBS(P/o吐溫-20/PBS)封閉該板，然后將該板在室溫下孵育1-2小時。各孔用PBS洗滌3次。同時，細(xì)菌上清液或peripreps用預(yù)優(yōu)化濃度的嵌合TNFR1蛋白溶液預(yù)平衡。將含有可溶性抗體或抗體片段的50)iil該粗制細(xì)菌制備物/嵌合蛋白混合物加入到ELISA板中。將該板在室溫下孵育1小時。然后，將該板用0.1%TPBS(0.1。/o吐溫-20/PBS)洗滌5次，再向各孔中加入100|ul第一檢測抗體(或蛋白A-HRP或蛋白LHRP)的0.1%TPBS,將該板在室溫下醉育1小時。棄去這樣的笫一抗體溶液,再將該板用0.1%TPBS洗滌5次。如有必要，加入來自山羊的IOOjliI預(yù)稀釋的第二抗體/HRP綴合物，將該板在室溫下孵育1小時。然后棄去笫二抗體，將該板用0.1%TPBS洗滌6次，再用PBS洗滌2次。向各孔中加入50plTMB過氧化物酶溶液，將該板在室溫下放置2-60分鐘。加入1M鹽酸，終止反應(yīng)。在加酸后的30分鐘之內(nèi)，在96孔板閱讀器上讀出該板在450nm處的OD值。ELISA信號減弱，表明抗體與板上包被的嵌合TNFR1域、而不是完整TNPR1結(jié)合，因此，該抗體能結(jié)M合蛋白內(nèi)的一個結(jié)構(gòu)域。對與參考抗體或抗體片段竟?fàn)幮越Y(jié)合tnfr1的抗體和抗體片段的竟?fàn)幮詄lisa篩選該方法可以用于快速篩選一系列能結(jié)合TNFR1的不同粗抗體或抗體片段制備物，所述抗體或抗體片段與參考抗體或抗體片段(例如TAR2m-21-23)竟?fàn)幮越Y(jié)合TNFRl或者結(jié)合TNFR1的所需結(jié)構(gòu)域(例如域1)。該方法采用含有不同可檢測標(biāo)記(表位標(biāo)記)的參考抗體或抗體片段和試驗抗體或抗體片段(例如有待篩選的抗體群體)。96孔測定板用100fil/孔的鼠或人TNFR1在4。C包被過夜。各孔用0.1%TPBS(含有濃度0.1%的吐溫-20的磷酸緩沖鹽溶液)洗滌3次。加入200iul/孔的1%TPBS(1。/。吐溫-20/PBS)封閉該板，將該板在室溫下孵育1-2小時。各孔用PBS洗滌3次。同時，待測粗抗體制備物與預(yù)優(yōu)化濃度的參考抗體或抗體片段(例如域1-結(jié)合抗體；TAR2m-21-23)溶液混合。正如所述，重要的是該抗體不包含與有待篩選結(jié)構(gòu)域結(jié)合特異性的抗體相同的檢測標(biāo)記。將50m!該粗制抗體/參考抗體混合物加入到ELISA板中。將該板在室溫下孵育1小時。然后，將該板用0.1%TPBS洗滌5次，向各孔中加入lOOjal第一檢測抗體(其結(jié)合僅存于待篩選的抗體群體中的標(biāo)記)的0.1%TPBS,將該板在室溫下孵育1小時。棄去這樣的笫一抗體溶液，再將該板用0.1%TPBS洗滌5次。然后，加入能識別第一檢測抗體的lOOpl預(yù)稀釋的笫二抗體-HRP綴合物，將該板在室溫下孵育1小時。棄去第二抗體溶液，將該板用0.1%TPBS洗滌6次，再用PBS洗滌2次。向各孔中加入50|LilTMB過氧化物酶溶液，將該板在室溫下放置2-60分鐘。加入50jul1M鹽酸，終止反應(yīng)。在加酸后的30分鐘之內(nèi)，在96孑L板閱讀器上讀出該板在450nm處的OD值。應(yīng)該平行地進(jìn)行一個單獨而平行的ELISA，采用該方法，但不加參考抗體或抗體片段。與用相同抗體制備物、而沒有竟?fàn)幮詤⒖伎贵w或抗體片段所得到的ELISA信號相比，在參考抗體或抗體片段存在時ELISA信號減弱，TNFR1，并且與參考抗體或抗體片段一樣結(jié)合同一TNFR1域。SPR篩選可以容易地修改上述ELISA方法，以便采用表面等離子共振，例如用BIACORE3000SPR^f義器(BiacoreInternationalAB,Uppsala,Sweden)。通常，嵌合蛋白可固定在SPR芯片上，或者嵌合蛋白可用含有抗TNFR1抗體或抗體片段的粗制細(xì)菌上清液平衡，所得混合物流過用全長人TNFRl或鼠TNFRl包被的SPR芯片。實施例5.dAb的PEG化在無細(xì)胞的受體結(jié)合測定中，研究了dAb的PET化對dAb結(jié)合TNFRl能力的影響，并且在基于細(xì)胞的測定中，研究了dAb的PET化對細(xì)胞表面TNFRl功能的抑制能力的影響。細(xì)胞測定MRC-5IL-8釋放測定在以下MRC-5細(xì)胞測定中，評價了某些能結(jié)合人TNPR1的dAb的活性。測定是基于在MRC-5細(xì)胞中TNF誘導(dǎo)的IL-8分泌，該測定方法是Alceson,L.等，Jowm"/o/腸/og/cfl/C72ewZ對7271:30517-30523(1996)所述方法的改進(jìn)方法，所述文獻(xiàn)介紹了在HUVEC中IL-1對IL-8的誘導(dǎo)作用。用MRC-5細(xì)胞代替HUVEC細(xì)胞系，通過評價人TNFa對IL-8的誘導(dǎo)，測定了dAb的活性。簡而言之，MRC-5細(xì)胞接種在微量滴定板上，將這些板與dAb和人TNFa(300pg/ml)—起聘育過夜。孵育后，吸出培養(yǎng)物上清液，通過夾心ELISA(R&DSystems)測定上清液中的IL-8濃度。與僅與TNFa—起孵育的對照孔相比，抗TNFR1dAb活性導(dǎo)致上清液中IL-8分泌降低。受體結(jié)合測定測定抗TNFdAb抑制TNF與重組TNF受體1(p55)結(jié)合的能力。簡而言之，Maxisorp板與30mg/ml抗人Fc小鼠單克隆抗體(Zymed，SanFrancisco,美國)一起孵育過夜。各孔用含0.05%吐溫-20的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，再用1%BSA/PBS封閉，然后與100ng/mlTNF受體1Fc融合蛋白(R&DSystems,Minneapolis,美國)一起孵育。抗TNFdAb與TNF(其加入到洗滌孔中，終濃度為10ng/ml)混合。TNF結(jié)合的測定如下用0.2mg/ml生物素化抗TNF抗體(HyCultbiotechnology,Uben,荷蘭)，接著用1:500稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素(AmershamBiosciences,英國)，再與TMB底物(KPL,Ga池ersburg,美國)一起孵育。加入HCl終止反應(yīng)，在450nm讀出吸光度。抗TNFdAb活性導(dǎo)致TNTF結(jié)合的降低，因此，與僅用TNF對照相比，導(dǎo)致吸光度下降。PEG化dAb對重組和細(xì)胞表面TNFR1的相對效應(yīng)見下表5所示的數(shù)椐。表5.<table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table>在基于非細(xì)胞的測定形式中，利用重組形式的受體(僅含受體的胞外部分)的受體結(jié)合測定(RBA)示于左邊，其中對PEG化的效應(yīng)最小，就5KPEG而言，未觀察到結(jié)合的差異。相比之下，觀察細(xì)胞測定中所得數(shù)據(jù)，在測定中，dAb的PEG化顯著降低了dAb的有效性。在某些情況下，有效性降低33倍。在基于細(xì)胞的測定中采集數(shù)據(jù)，所述測定基于dAb阻斷細(xì)胞表面受體活性的能力。研究結(jié)果表明，dAb的PEG化對dAb抑制細(xì)胞表面TNFR1功能的能力的影響，比無細(xì)胞測定中結(jié)合TNFR1的能力大得多。實施例6.結(jié)合內(nèi)源激動劑分子、但不結(jié)合其活性部位的dAb該實施例說明了能結(jié)合所需內(nèi)源激動劑分子、但不結(jié)合內(nèi)源激動劑活性部位的dAb的鑒定方法。該方法用紅細(xì)胞生成素(epo)來說明，通常適用于內(nèi)源激動劑?？设b定結(jié)合EPO的域抗體并采用任何合適篩選方法進(jìn)行分離。在測定中，可采用表達(dá)重組EPO受體并依賴于造血因子而生長的細(xì)胞系，以鑒定結(jié)合EPO、但不結(jié)合其活性部位的dAb，因此，不阻止EPO與EPO受體的結(jié)合。例如，可以使用Ba/F3細(xì)胞，它是已經(jīng)用人EPO受體轉(zhuǎn)染并進(jìn)行epo依賴性生長的鼠IL-3依賴性細(xì)胞系。(D'Andrea等，82:46-52(1993)。Ba/F3細(xì)胞可在合適的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，可除去培養(yǎng)基，并用合適緩沖液(例如PBS)洗滌細(xì)胞。再將細(xì)胞在含有EPO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約48小時。將有待測定的域抗體加入到各培養(yǎng)物(例如合適細(xì)胞培養(yǎng)測定板的各孑L)中。約48小時后，可采用任何合適方法，評價細(xì)胞增殖，所述方法例如二曱基噻唑二苯基溴化四唑輸(MTT)還原測定。相對于含有培養(yǎng)基、而不含dAb的對照孔來說，含有dAb的孔缺乏對細(xì)胞增殖的抑制，這表明dAb不結(jié)合epo的活性部位。本說明書提到的所有出版物以及所述出版物中引用的參考文獻(xiàn)，全都通過引用結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，只要不偏離本發(fā)明的范圍和精神，可以對本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)進(jìn)行各種修改和變動。盡管用具體的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解，要求保護(hù)的發(fā)明并不限于這些具體的實施方案。當(dāng)然，對用于實施本發(fā)明的所述方式的各種修改，對于分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，這樣的修改落入所附權(quán)利要求書范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.配體在制備用于增加患者體內(nèi)內(nèi)源靶化合物數(shù)量的藥物中的用途，所述配體包含具有所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物，但基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。2.配體在制備用于增加患者體內(nèi)內(nèi)源耙化合物生物利用度的藥物中的用途，所述配體包含具有所述內(nèi)源耙化合物結(jié)合位點的部分，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物，但基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。3.配體在制備用于增加內(nèi)源靶化合物體內(nèi)半衰期的藥物中的用途，所述配體包含具有所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源扭化合物，但基本上不抑制所述內(nèi)源耙化合物的活性。4.配體在制備用于增加給藥部位內(nèi)源把化合物數(shù)量的局部給藥用藥物中的用途，所述配體包含具有所述內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分，其中所述配體能結(jié)合所述.內(nèi)源靶化合物，但基本上不抑制所述內(nèi)源耙化合物的活性。5.權(quán)利要求1-4中任一項的用途，其中相對于給予所述藥物之前而言，在給予所述藥物之后約4小時，所述患者體內(nèi)的內(nèi)源把配體數(shù)量增加至少1.5倍。6.權(quán)利要求5的用途，其中相對于給予所述藥物之前而言，在給予所述藥物之后約4小時，所述患者體內(nèi)的內(nèi)源靶配體數(shù)量增加至少10倍。7.權(quán)利要求1-6中任一項的用途，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源革巴化合物并增加所述內(nèi)源把化合物的體內(nèi)半衰期至少1.5倍。8.權(quán)利要求7的用途，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物并增加所述內(nèi)源靶化合物的體內(nèi)半衰期至少10倍。9.權(quán)利要求1-6中任一項的用途，其中所述配體抑制所述內(nèi)源耙化合物的活性不超過約10%。10.權(quán)利要求1-6中任一項的用途，其中所述配體的抑制濃度50(IC50)為至少1微摩爾。11.權(quán)利要求1-10中任一項的用途，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物，但不結(jié)合所述內(nèi)源耙化合物的活性部位。12.權(quán)利要求1-11中任一項的用途，其中所述配體包含所述具有內(nèi)源耙結(jié)合位點的部分的兩個或更多個拷貝。13.權(quán)利要求12的用途，其中所述配體是所述具有內(nèi)源靶結(jié)合位點的部分的二聚體。14.權(quán)利要求1-13中任一項的用途，其中所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分選自親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)和avimer。15.權(quán)利要求1-14中任一項的用途，其中所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分是抗體或抗體片段。16.權(quán)利要求15的用途，其中所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分是選自以下的抗體片段Fv片段、單鏈Fv片段、二硫鍵連接的Fv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、雙鏈抗體、免疫球蛋白單可變區(qū)。17.權(quán)利要求16的用途，其中所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分是免疫球蛋白單可變區(qū)。18.權(quán)利要求17的用途，其中所述免疫球蛋白單可變區(qū)選自人Vh和人Vl。19.權(quán)利要求1-18中任一項的用途，其中所述配體還包含半衰期延長部分。20.權(quán)利要求19的用途，其中所述半衰期延長部分是聚烷二醇部分、血清白蛋白或其片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或其轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分、或者包含體內(nèi)延長半衰期的多肽結(jié)合位點的部分。21.權(quán)利要求20的用途，其中所述半衰期延長部分是抗體或抗體片段，所迷抗體或抗體片段具有體內(nèi)延長半壽期的多肽結(jié)合位點。22.權(quán)利要求21的用途，其中所述抗體或抗體片段是dAb。23.權(quán)利要求20的用途，其中所述半衰期延長部分是選自以下的包含體內(nèi)延長半衰期的多肽結(jié)合位點的部分親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)和avimer。24.權(quán)利要求21-23中任一項的用途，其中體內(nèi)延長半衰期的多肽是血清白蛋白或新生動物Fc受體。25.權(quán)利要求20的用途，其中所述半衰期延長部分是聚乙二醇部分。26.權(quán)利要求1-25中任一項的用途，其中所述藥物基本上是非免疫原性的。27.權(quán)利要求1-26中任一項的用途，其中所述藥物是緩釋型制劑。28.權(quán)利要求1-27中任一項的用途，其中所述內(nèi)源革巴化合物選自可溶性細(xì)胞因子受體、內(nèi)源受體拮抗劑、酶、細(xì)胞因子、生長因子和激素。29.權(quán)利要求28的用途，其中所述內(nèi)源耙化合物是可溶性細(xì)胞因子受體。30.權(quán)利要求28的用途，其中所述可溶性細(xì)胞因子受體是可溶性TNFR1。31.權(quán)利要求1-30中任一項的用途，其中所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物的Kd為1x10-7M以下。32.權(quán)利要求1-30中任一項的用途，其中所述配體結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物的Kd為1x10-7M以下。33.配體在制備用于增加內(nèi)源靶活性的藥物中的用途，所迷配體包含具有所迷內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源靶，但基本上不抑制所述內(nèi)源耙化合物的活性。34.權(quán)利要求33的用途，其中所述配體不結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物的活性部位。35.權(quán)利要求33或權(quán)利要求34的用途，其中所述配體抑制所述內(nèi)源耙化合物的活性不超過約10%。36.權(quán)利要求33或權(quán)利要求34的用途，其中所述配體的抑制濃度50(IC50)至少為1箱b學(xué)爾。37.權(quán)利要求33-36中任一項的用途，其中所述配體包含兩個或更多個具有所述內(nèi)源靶結(jié)合位點的部分。38.權(quán)利要求33-36中任一項的用途，其中所述配體包含所述具有內(nèi)源靶結(jié)合位點的的部分的兩個或更多個拷貝。39.權(quán)利要求38的用途，其中所述配體是所述具有內(nèi)源靶結(jié)合位點的部分的二聚體。40.權(quán)利要求33-39中任一項的用途，其中所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分選自親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)和avimer。41.權(quán)利要求33-40中任一項的用途，其中所述具有內(nèi)源耙化合物結(jié)合位點的部分是抗體或抗體片段。42.權(quán)利要求41的用途，其中所述具有內(nèi)源耙化合物結(jié)合位點的部分是選自以下的抗體片段Fv片段、單鏈Fv片段、二硫鍵連接的Fv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、雙鏈抗體、免疫球蛋白單可變區(qū)。43.權(quán)利要求42的用途，其中所述具有內(nèi)源把化合物結(jié)合位點的部分是免疫球蛋白單可變區(qū)。44.權(quán)利要求43的用途，其中所述免疫球蛋白單可變區(qū)選自人Vh和人Vl。45.權(quán)利要求33-44中任一項的用途，其中所述配體還包含半衰期延長部分。46.權(quán)利要求45的用途，其中所述半衰期延長部分是聚烷二醇部分、血清白蛋白或其片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或其轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分、或者包含體內(nèi)延長半衰期的多肽結(jié)合位點的部分。47.權(quán)利要求46的用途，其中所述半衰期延長部分是抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段具有體內(nèi)延長半壽期的多肽結(jié)合位點。48.權(quán)利要求47的用途，其中所述抗體或抗體片段是dAb。49.權(quán)利要求46的用途，其中所述半衰期延長部分是選自以下的體內(nèi)延長半衰期的多肽結(jié)合位點的部分親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)和avimer。50.權(quán)利要求47-49中任一項的用途，其中體內(nèi)延長半衰期的多肽是血清白蛋白或新生動物Fc受體。51.權(quán)利要求46的用途，其中所述半衰期延長部分是聚乙二醇部分。52.權(quán)利要求33-51中任一項的用途，其中所述所述藥物基本上是非免疫原性的。53.權(quán)利要求1-27中任一項的用途，其中所述藥物是緩釋型制劑。54.權(quán)利要求33-53中任一項的用途，其中所述內(nèi)源靶化合物選自可溶性細(xì)胞因子受體、內(nèi)源受體拮抗劑、酶、細(xì)胞因子、生長因子和激素。55.權(quán)利要求54的用途，其中所述內(nèi)源靶化合物是可溶性細(xì)胞因子受體。56.權(quán)利要求55的用途，其中所述可溶性細(xì)胞因子受體是可溶性TNFR1。57.權(quán)利要求33-56中任一項的用途，其中所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分結(jié)合所述內(nèi)源把化合物的Kd為1x10-7M以下。58.權(quán)利要求33-56中任一項的用途，其中所述配體結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物的Kd為1x10'7M以下。59.配體在制備用于增加內(nèi)源靶化合物結(jié)合活性的藥物中的用途，所述配體包含兩個或更多個具有所述內(nèi)源輩巴化合物結(jié)合位點的部分，其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源靶，但不結(jié)合所述內(nèi)源靶的活性部位，也基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的結(jié)合活性。60.權(quán)利要求59的用途，其中所述配體包含具有內(nèi)源靶結(jié)合位點的部分的兩個拷貝。61.權(quán)利要求61的用途，其中所述配體是所述具有內(nèi)源靶結(jié)合位點的部分的二聚體。62.權(quán)利要求59-61中任一項的用途，其中所述結(jié)合活性增加至少10倍。63.權(quán)利要求59-63中任一項的用途，其中所述內(nèi)源靶化合物是可溶性細(xì)胞因子受體。64.權(quán)利要求64的用途，其中所述可溶性細(xì)胞因子受體是可溶性TNFRl，而且所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分獨立結(jié)合選自域1和域4的TNFR1域。65.權(quán)利要求59-64中任一項的用途，其中所述具有內(nèi)源把化合物結(jié)合位點的部分選自親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)和avimer。66.;K利要求59-64中任一項的用途，其中所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分是抗體或抗體片段。67.權(quán)利要求66的用途，其中所述具有內(nèi)源耙化合物結(jié)合位點的部分是選自以下的抗體片段Fv片段、單鏈Fv片段、二硫鍵連接的Fv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、雙鏈抗體、免疫球蛋白單可變區(qū)。68.權(quán)利要求67的用途，其中所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分是免疫球蛋白單可變區(qū)。69.權(quán)利要求68的用途，其中所述免疫球蛋白單可變區(qū)選自人Vh和人Vl。70.權(quán)利要舉59-69中任一項的用途，其中所述配體還包含半衰期延長部分。71.權(quán)利要求70的用途，其中所述半衰期延長部分是聚垸二醇部分、血清白蛋白或其片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或其轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分、或者包含體內(nèi)延長半衰期的多肽結(jié)合位點的部分。72.權(quán)利要求71的用途，其中所述半衰期延長部分是抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段具有體內(nèi)延長半壽期的多肽結(jié)合位點。73.權(quán)利要求72的用途，其中所述抗體或抗體片段是dAb。74.權(quán)利要求71的用途，其中所述半衰期延長部分是選自以下的體內(nèi)延長半衰期的多肽結(jié)合位點的部分親和體、SpA區(qū)、LDL受體A類區(qū)、EGF區(qū)和avimer。75.權(quán)利要求72-74中任一項的用途，其中所述體內(nèi)延長半衰期的多肽是血清白蛋白或新生動物Fc受體。76.權(quán)利要求71的用途，其中所述半衰期延長部分是聚乙二醇部分。77.權(quán)利要求59-76中任一項的用途，其中所述藥物基本上是非免疫原性的。78.權(quán)利要求59-77中任一項的用途，其中所述藥物是緩釋型制劑。79.權(quán)利要求59-78中任一項的用途，其中所述具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合位點的部分結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物的Kd為1x10-7M以下。80.權(quán)利要求59-78中任一項的用途，其中所述配體所述內(nèi)源靶化合物的Kd為1x1(T7M以下。81.—種配體，所述配體能結(jié)合內(nèi)源把化合物，該活性適合于治療患者的疾病，其中所述配體不結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物的活性部位，或者基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性，用于治療適于用所述內(nèi)源靶化合物治療的疾病。82.權(quán)利要求81的配體，其中所述配體增加所述內(nèi)源靶化合物的體內(nèi)半衰期。83.權(quán)利要求81或權(quán)利要求82的配體，其中所述配體增加患者體內(nèi)所述內(nèi)源靶化合物的數(shù)量。84.權(quán)利要求81-83中任一項的配體，其中所述配體增加所述內(nèi)源粑化合物的生物利用度。85.權(quán)利要求81-84中任一項的配體，其中所述配體增加所述內(nèi)源化合物的結(jié)合活性。86.權(quán)利要求81-85中任一項的配體，其中所述配體是權(quán)利要求1-80中任一項描述的配體。87.—種藥物組合物，所述組合物包含配體和生理上可接受的載體，所述配體能結(jié)合內(nèi)源靶化合物，該活性適合于治療患者的疾病，其中所述配體不結(jié)合所述內(nèi)源粑化合物的活性部位，或者基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。88.權(quán)利要求87的藥物組合物，其中所述配體增加所述內(nèi)源草巴化合物的體內(nèi)半衰期。89.權(quán)利要求87或權(quán)利要求88的藥物組合物，其中所述配體增加患者體內(nèi)所述內(nèi)源靶化合物的數(shù)量。90.權(quán)利要求87-89中任一項的藥物組合物，其中所述配體增加所述內(nèi)源靶化合物的生物利用度。91.權(quán)利要求87-90中任一項的藥物組合物，其中所述配體增加所述內(nèi)源化合物的結(jié)合活性。92.權(quán)利要求87-91中任一項的藥物組合物，其中所述配體是權(quán)利要求1-80中任一項描述的配體。93.—種遞藥裝置，所述裝置包含權(quán)利要求87-92中任一項的藥物組合物。94.權(quán)利要求93的遞藥裝置，其中所述遞藥裝置選自胃腸外遞藥裝置、靜脈內(nèi)遞藥裝置、肌內(nèi)遞藥裝置、腹膜內(nèi)遞藥裝置、經(jīng)皮遞藥裝置、肺部遞藥裝置、動脈內(nèi)遞藥裝置、鞘內(nèi)遞藥裝置、關(guān)節(jié)內(nèi)遞藥裝置、皮下遞藥裝置、鼻內(nèi)遞藥裝置、陰道遞藥裝置和直腸遞藥裝置。95.權(quán)利要求94的遞藥裝置，其中所述裝置選自注射器、經(jīng)皮遞藥裝置、膠嚢劑、片劑、噴灑器、吸入器、霧化器、煙霧器、氣霧器、干粉吸入器、計量吸入器、計量噴霧器、計量氣霧器、計量霧化器、導(dǎo)管。96.配體在增加內(nèi)源化合物的半衰期、生物利用度或活性中的用途，所述配體包含具有所述內(nèi)源把化合物結(jié)合位點的結(jié)合部分，其中所述具有內(nèi)源化合物結(jié)合位點的結(jié)合部分是所述內(nèi)源化合物或其部分或變異體，而且其中所述配體能結(jié)合所述內(nèi)源靶化合物，但基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。97.權(quán)利要求96的用途，其中所述內(nèi)源化合物是作為TNF受體超家族成員的可溶性受體。98.配體在增加TNF受體超家族成員的半衰期、生物利用度或活性中的用途，所述配體包含具有所述TNF受體超家族成員結(jié)合位點的結(jié)合部分，其中所述配體能結(jié)合所述TNF受體超家族成員，但基本上不抑制所述TNF受體超家族成員的活性，而且其中所述具有TNF受體超家族成員結(jié)合位點的結(jié)合部分是前配體裝配域(PLAD)或其變異體。全文摘要本發(fā)明涉及配體，該配體包含具有內(nèi)源靶化合物結(jié)合特異性的結(jié)合位點的部分(例如dAb)，但是基本上不抑制所述內(nèi)源靶化合物的活性。優(yōu)選所述配體不結(jié)合內(nèi)源靶化合物的活性部位。本發(fā)明涉及這樣的配體在制備用于增加與所述配體結(jié)合的內(nèi)源靶化合物的半衰期、生物利用度、活性或數(shù)量的藥物中的用途。文檔編號A61K39/395GK101098712SQ200580046184公開日2008年1月2日申請日期2005年11月10日優(yōu)先權(quán)日2004年11月10日發(fā)明者I·M·湯姆林森申請人:杜門蒂斯有限公司