專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療癌癥的修飾細(xì)胞因子的制作方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2001年2月13日，申請(qǐng)?zhí)枮?1807712.9，發(fā)明名稱(chēng)為“用于治療癌癥的修飾細(xì)胞因子”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及用于治療癌癥的修飾細(xì)胞因子。更詳細(xì)地講，本發(fā)明涉及能夠“歸巢”腫瘤血管和抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞因子衍生物。
部分細(xì)胞因子的抗腫瘤活性是眾所周知的并已有描述。部分細(xì)胞因子也已經(jīng)應(yīng)用于人類(lèi)治療(29)。已經(jīng)證實(shí)諸如白介素-2(IL-2)和α干擾素(IFNα)的細(xì)胞因子對(duì)不同類(lèi)型腫瘤(例如腎轉(zhuǎn)移癌、毛細(xì)胞白血病、卡波濟(jì)氏肉瘤、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤(multiple mieloma)等)患者具有可靠的抗腫瘤活性。其它細(xì)胞因子如IFNβ、腫瘤壞死因子(TNF)α、TNFβ、IL-1、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15和集落刺激因子(CFS)對(duì)某些類(lèi)型的腫瘤具有一定的抗腫瘤活性，因此將其作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)。
一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞因子的治療性應(yīng)用主要受限于其全身性毒性。例如最初發(fā)現(xiàn)TNF能夠誘導(dǎo)某些腫瘤出血性壞死(1)，對(duì)不同腫瘤系具有體外細(xì)胞性作用(2)，但是隨后證實(shí)它具有強(qiáng)烈促炎活性，在過(guò)量產(chǎn)生的情況下嚴(yán)重危害人類(lèi)身體健康(3)。
因?yàn)樗鋈硇远拘允羌?xì)胞因子人類(lèi)藥理活性劑量的基本問(wèn)題，所以旨在減少這種生物學(xué)效應(yīng)物的毒性作用而維持其治療效力的新的衍生物和治療策略現(xiàn)正在評(píng)定中。
一些新的方法涉及a)研制能夠?qū)NF傳遞到腫瘤并增加局部濃度的融合蛋白。例如，已生產(chǎn)出由TNF和腫瘤特異性抗體組成的融合蛋白(4)；b)研制保持抗腫瘤活性而全身性毒性降低的TNF突變體。因此，已制備出僅能選擇性識(shí)別一種受體(p55或p75)的突變體(5)；c)能夠降低TNF部分毒性作用而不影響抗腫瘤活性的抗TNF抗體的應(yīng)用。該抗體在文獻(xiàn)中已有描述(30)；d)具有較長(zhǎng)半衰期的TNF衍生物的應(yīng)用(例如與與聚乙二醇綴合的TNF)。
關(guān)于能夠選擇性地靶向腫瘤位點(diǎn)的TNF衍生物的制備最近已有報(bào)道。例如關(guān)于融合蛋白已有描述，將抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體重鏈基因和TNF基因融合獲得融合蛋白(4)，或者將TNF和針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原TAG72的單克隆抗體鉸鏈區(qū)融合獲得的融合蛋白(6)，或者Fv-TNF融合蛋白(6)。
EP 251 494公開(kāi)了一種給予診斷試劑或治療藥物的體系，該體系包括一種綴合有抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的抗體，一種能夠使所述綴合抗體和綴合有生物素的診斷試劑或治療藥物組成的化合物復(fù)合的試劑，它們序貫給予而且適當(dāng)延遲，以便讓所述診斷試劑或治療藥物通過(guò)生物素-鏈霉抗生物素蛋白在抗體識(shí)別的靶細(xì)胞上相互作用而定位。所述診斷試劑或治療藥物包括金屬螯合物，特別是放射性核素和低分子量抗腫瘤藥物(例如順鉑、阿霉素等)的螯合物。
EP 496 074公開(kāi)了一種提供序貫給予生物素化抗體、抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白以及生物素化診斷試劑或治療藥物的方法。盡管一般性列舉了細(xì)胞毒性藥物如蓖麻蛋白，但關(guān)于放射性同位素標(biāo)記化合物的應(yīng)用公開(kāi)最多。
WO 95/15979公開(kāi)了一種用于將高毒性藥物定位在細(xì)胞靶上的方法，該方法基于給予包含綴合配體或抗配體的的特異性靶分子的第一綴合物，接著給予包含與抗配體或配體結(jié)合的毒性藥物的第二綴合物。
WO 99/13329公開(kāi)了一種將分子靶向腫瘤生血管血管的方法，該方法基于所述分子與NGR受體配體綴合。許多分子已被認(rèn)為是可能的候補(bǔ)物質(zhì)，但僅有阿霉素被明確描述。沒(méi)有NGR受體配體作為細(xì)胞因子載體誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的用途被公開(kāi)。
現(xiàn)在令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，某些細(xì)胞因子的治療指數(shù)能被顯著提高并且其免疫治療特性能通過(guò)與氨基肽酶-N受體(CD13)的配體偶聯(lián)而增強(qiáng)。CD13是一種在不同物種中高度保守的150kDa的跨膜糖蛋白。它在正常的細(xì)胞中表達(dá)，也在骨髓性腫瘤系、生血管內(nèi)皮以及一些上皮細(xì)胞中表達(dá)。CD13受體通常稱(chēng)為“NGR”受體，因?yàn)樗碾呐潴w共有“NGR”氨基酸基元。
按照第一個(gè)方面，本發(fā)明提供選自TNF及IFNγ的細(xì)胞因子和CD13受體配體的綴合制品。所述配體可以是抗體或其片段(例如Fab、Fv、單鏈Fv)、肽或肽模擬物(即能夠結(jié)合CD13受體的肽樣分子，任選包含修飾而非天然存在的氨基酸)。所述配體優(yōu)選包含所述NGR基元的直鏈或環(huán)肽，例如CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環(huán)肽CVLNGRMEC或環(huán)肽CNGRC，或者更優(yōu)選CNGRC肽。所述肽可直接與細(xì)胞因子結(jié)合或通過(guò)一個(gè)間隔物(可以是單個(gè)氨基酸、氨基酸序列或有機(jī)殘基(例如6-氨基癸?；?N-羥基琥珀酰亞胺))與細(xì)胞因子間接結(jié)合。所述結(jié)合方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的，包括遺傳工程技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)。
所述肽配體最好與細(xì)胞因子N末端連接，從而最小化所述修飾細(xì)胞因子與其受體結(jié)合時(shí)的任何干擾。另一方面，所述肽能連接到氨基酸殘基上，所述氨基酸殘基是天然存在于所述分子或用遺傳工程技術(shù)人工插入的酰胺鍵或羧基鍵接受者。所述修飾細(xì)胞因子最好使用包含編碼所述肽的5’連續(xù)序列的cDNA來(lái)制備。
按照一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，提供TNF和CNGRC序列的綴合制品。更優(yōu)選TNF的氨基末端通過(guò)間隔物G(甘氨酸)連接到肽CNGRC。
所述合成制品(NGR-TNF)在RMA-T淋巴瘤動(dòng)物模型上證明比TNF更有效。而且，用NGR-TNF處理的動(dòng)物能夠更進(jìn)一步地抵制致瘤劑量的RMA-T或RMA細(xì)胞。同通常TNF相比，能夠在免疫正常動(dòng)物觀測(cè)到這種抗腫瘤活性增加而在免疫缺陷動(dòng)物觀測(cè)不到這種作用。說(shuō)明所述綴合“NGR”肽的TNF抗腫瘤活性增加是由于免疫應(yīng)答的增強(qiáng)而不是綴合物的直接細(xì)胞毒性作用。
還證實(shí)NGR-TNF的體內(nèi)免疫作用與CD13受體直接相關(guān)。例如已觀察到，抗CD13受體及GNGRC配體的抗體在體內(nèi)與NGR-TNF競(jìng)爭(zhēng)，從而提示NGR-TNF靶向受體的機(jī)制。
應(yīng)用能夠選擇性結(jié)合兩種TNF受體(p75TNFR和p55TNFR)中的一種受體的突變型TNF能更進(jìn)一步改善所述TNF/CD13配體綴合物的治療指數(shù)。所述TNF突變體能通過(guò)定點(diǎn)誘變獲得(5；7)。
本發(fā)明修飾細(xì)胞因子的藥物代謝動(dòng)力學(xué)能通過(guò)制備聚乙二醇衍生物得到改善，聚乙二醇衍生物可延長(zhǎng)所述細(xì)胞因子本身的血漿半衰期。
本發(fā)明再一實(shí)施方案為雙功能衍生物，其中用所述CD13配體修飾的細(xì)胞因子同針對(duì)腫瘤抗原或其它腫瘤血管形成標(biāo)記物(如αv整聯(lián)蛋白、金屬蛋白酶或血管生長(zhǎng)因子)的抗體或其片段或者針對(duì)胞外基質(zhì)組分的抗體或其片段(如抗肌腱蛋白抗體或抗纖連蛋白EDB結(jié)構(gòu)域)相結(jié)合。TNF與針對(duì)胃腺癌和卵巢腺癌表達(dá)的腫瘤相關(guān)性TAG72抗原的單克隆抗體鉸鏈區(qū)的融合產(chǎn)物的制備近來(lái)已有報(bào)道(6)。
本發(fā)明另一實(shí)施方案是以生物素/抗生物素蛋白系統(tǒng)預(yù)靶向腫瘤。按照這種途徑，一種三元復(fù)合物在不同階段的腫瘤抗原位點(diǎn)上，其組成為1)生物素化單克隆抗體，2)抗生物素蛋白(或鏈霉抗生物素蛋白)，3)用所述CD13配體和生物素修飾的二價(jià)細(xì)胞因子。許多論文證實(shí)，與用免疫綴合物常規(guī)靶向相比，所述預(yù)靶向方法能確實(shí)增加在靶部位結(jié)合的活性分子與游離活性分子的比率，從而減少治療毒性(11，10，9，8)。這種方法利用生物素化TNF產(chǎn)生了良好結(jié)果，該生物素化TNF能夠在體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性并在正常TNF不起作用的情況下降低腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(14，26)。所述預(yù)靶向方法還可以通過(guò)使用雙特異性抗體(同時(shí)結(jié)合所述腫瘤抗原和所述修飾細(xì)胞因子)的兩相程序來(lái)實(shí)現(xiàn)。針對(duì)癌胚抗原和TNF的雙特異性抗體用作TNF腫瘤預(yù)靶向的手段近來(lái)已有報(bào)道(31)。
按照再一實(shí)施方案，本發(fā)明包含在不同TNF亞基上同時(shí)與CD13配體和抗體或其片段綴合(直接綴合或通過(guò)生物素-抗生物素蛋白橋間接綴合)的TNF分子，，所述抗體或其片段針對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原或其它腫瘤基質(zhì)組分(如肌腱蛋白和纖連蛋白EDB結(jié)構(gòu)域)。使得所述修飾細(xì)胞因子的腫瘤尋靶特性更進(jìn)一步改善以及后者在腫瘤微環(huán)境中通過(guò)三聚體-單體-三聚體的轉(zhuǎn)變得到緩慢釋放。實(shí)際上以前的研究工作證實(shí)，所述TNF綴合物的修飾亞基能與靶向復(fù)合物解離并再締合，形成未修飾的三聚體TNF分子，然后擴(kuò)散在腫瘤微環(huán)境中。已證明所述生物活性TNF的釋放在靶向后24-48小時(shí)內(nèi)發(fā)生(21)。
治療應(yīng)用時(shí)，本發(fā)明修飾細(xì)胞因子適合制備成用于口或腸道外給予的藥物制劑。優(yōu)選腸道外給予的制劑，它們包括注射溶液劑或混懸液劑以及輸注用液體劑。對(duì)于所述腸道外型制劑，將有效劑量的所述活性組分溶解或懸浮在無(wú)菌媒介物中，任選添加賦形劑如助溶劑、等滲劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑或分散劑，隨后將其分裝在密封管形瓶或安瓿中。
脂質(zhì)體形式的所述細(xì)胞因子制劑能改善它的生物學(xué)活性。事實(shí)上在體外已觀測(cè)到所述TNF的氨基基團(tuán)?；蛊涫杷栽黾佣粨p失生物學(xué)活性。而且據(jù)報(bào)導(dǎo)，結(jié)合脂類(lèi)的TNF的體外細(xì)胞毒性不受影響、體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用不受影響而體內(nèi)毒性減低(12，13)。
人體快速濃注TNF的最大耐受劑量為218-410μg/m2(32)，比在動(dòng)物中的有效劑量低約10倍。根據(jù)來(lái)自小鼠模型的數(shù)據(jù)認(rèn)為，要在人類(lèi)中達(dá)到抗腫瘤效果至少高十倍的劑量是必需的(15)。對(duì)肢體高溫隔離灌注的首個(gè)臨床研究中，以4mg TNF與苯丙氨酸氮芥和干擾素γ聯(lián)合應(yīng)用獲得了高反應(yīng)率(16)。其它研究表明，可以不要干擾素γ，更低劑量的TNF也能充分引起治療性反應(yīng)(17，18)。因?yàn)樗鰞煞N細(xì)胞因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)揮協(xié)同作用，它們的聯(lián)合選擇性靶向可能導(dǎo)致更強(qiáng)的抗腫瘤活性，從而克服相同細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用在癌癥治療中通常遇到的全身性毒性問(wèn)題。此外，已知TNF能降低內(nèi)皮性血管的屏障功能，從而提高它們對(duì)大分子的通透性。利用本發(fā)明修飾TNF分子的治療毒性降低和它們的腫瘤血管尋靶特性，另一個(gè)可供選擇的應(yīng)用是它們?cè)黾幽[瘤血管對(duì)其它化合物的通透性，無(wú)論是治療目的或還是診斷目的。例如在腫瘤的放射免疫閃爍成像法或放射免疫治療中所述修飾TNF可用以增加腫瘤攝取放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記激素(腫瘤成像化合物)。另一方面，還可增強(qiáng)化學(xué)治療藥物、免疫毒素、攜帶藥物或基因的脂質(zhì)體或者其它抗癌藥物的攝取也能增加，從而增強(qiáng)其抗腫瘤作用。
所以，癌癥治療或診斷時(shí)，本發(fā)明細(xì)胞因子也可與其它診斷或治療物質(zhì)一起以組合、分開(kāi)或貫序的制劑形式應(yīng)用。
本發(fā)明最后一個(gè)方面涉及編碼本文公開(kāi)的綴合細(xì)胞因子的cDNA，它可由所述細(xì)胞因子的cDNA增加編碼所述CD13配體、優(yōu)選上述尋靶肽的5’-或3’-連續(xù)DNA序列制備。所述聯(lián)合cDNA可原樣用于基因治療或插入載體后用于基因治療。所述合適載體的制備和治療性應(yīng)用在(19)中公開(kāi)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
附圖描述

圖1TNF和NGR-TNF對(duì)RMA-T淋巴瘤生長(zhǎng)(a和b)以及動(dòng)物體重(c和d)的作用。
5只動(dòng)物/組，在腫瘤移植10天后用單一劑量的TNF或NGR-TNF(腹腔內(nèi)注射)治療。根據(jù)對(duì)數(shù)曲線內(nèi)推不同劑量(b)的第14天的腫瘤面積值和治療后體重的降低(第11天和第12天的平均值)(d)。在第14天1μg或9μg的NGR-TNF的抗腫瘤作用比相當(dāng)劑量的TNF作用的更強(qiáng)(分別P＝0.024和P＝0.032)，而治療后體重降低是相似的。箭頭指示產(chǎn)生類(lèi)似作用的TNF和NGR-TNF外推劑量。
圖2單克隆抗體R3-63和CNGRC對(duì)NGR-TNF(a)和TNF(b)的抗腫瘤活性的作用。
腫瘤移植12天后，用混合NGR-TNF或TNF的單抗R3-63或CNGRC對(duì)具有RMA-T腫瘤的動(dòng)物給藥(n＝5只動(dòng)物/組)。在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)(c)中對(duì)具有11天大的腫瘤的動(dòng)物用TNF和NGR-TNF與CNGRC或CARAC(對(duì)照肽)聯(lián)合給藥(n＝5)。1μg NGR-TNF的抗腫瘤作用比9μg TNF的抗腫瘤作用強(qiáng)(P＝0.009，第20天t-檢驗(yàn))并且抗腫瘤活性被CNGRC(P＝0.035)和單抗R3-63(P＝0.011)顯著抑制。
圖3NGR-TNF和TNF的限制性胰蛋白酶消化對(duì)它們的分子量(a)和抗腫瘤活性(b)的作用。
按照廠商說(shuō)明書(shū)將1mg胰蛋白酶偶聯(lián)到1ml活化CH瓊脂糖凝膠(Pharmacia-Upjohn)上制備出胰蛋白酶-瓊脂糖。NGR-TNF和TNF(在300μl 0.15M氯化鈉和0.05M磷酸鈉中各170μg，pH7.3)與15μl樹(shù)脂混懸液(1∶4)或單獨(dú)的緩沖液混合并且在37℃端對(duì)端旋轉(zhuǎn)持續(xù)所示時(shí)間。所述四種產(chǎn)物通過(guò)0.22μm Spin-X儀器(Costar，Cambridge，MA)過(guò)濾并在使用之前保存在-20℃。(a)電噴霧質(zhì)譜分析。每一個(gè)峰指出分子量大小和相應(yīng)的產(chǎn)物(N-末端序列)。序列上的箭頭指示裂解位點(diǎn)。(b)1μg或3μg的NGR-TNF和TNF(沒(méi)用胰蛋白酶溫育(上圖)或用胰蛋白酶溫育(下圖))對(duì)RMA-T腫瘤生長(zhǎng)和動(dòng)物體重的作用(用1μg和3μg劑量治療的組平均值±SE)。在腫瘤移植13天后治療動(dòng)物(n＝5只動(dòng)物/組)。
圖4變性/再折疊前后人NGR-TNF的SDS-PAGE和抗腫瘤活性。
人TNF(a)、NGR-TNF在實(shí)施例V所述變性/再折疊過(guò)程前(b)和后(c)在非還原條件下的SDS-PAGE(A)。
TNF和未再折疊的NGR-TNF對(duì)所述RMA-T淋巴瘤的生長(zhǎng)(B)和對(duì)體重(C)的作用。人TNF(D)和再折疊的NGR-TNF(包含＞95％的具有鏈內(nèi)二硫鍵的三聚體)(E)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。在腫瘤移植10天后用一個(gè)劑量的TNF或NGR-TNF腹腔內(nèi)注射治療動(dòng)物(如圖所示，15或5只小鼠/組)。
下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例I小鼠TNF和NGR-TNF的制備細(xì)胞質(zhì)cDNA在大腸桿菌中表達(dá)制備小鼠重組TNF和Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF(NGR-TNF)。用5′-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′和5′-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3′作為3′和5′引物，對(duì)分離自脂多糖刺激的小鼠RAW-264.7單核巨噬細(xì)胞的mRNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)制備編碼小鼠Met-TNF1-156的cDNA(20)。
將所述擴(kuò)增片段用Nde I和Bam HI(New England Biolabs，Beverley，MA)酶切并克隆到預(yù)先用相同的酶酶切得到的pET-11b(Novagen，Madison，WI)中(pTNF)。
用5′-GCAGATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3′作為5′引物和上述的3′引物，通過(guò)對(duì)pTNF的PCR擴(kuò)增編碼Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF1-156的所述cDNA。將擴(kuò)增片段如上所述酶切并克隆到pET-11b中并用來(lái)轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞(Novagen)。按照所述pET-11b的廠商說(shuō)明書(shū)，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)TNF和NGR-TNF的表達(dá)。在2mM乙二胺四乙酸、20mM Tris-HCl，pH8.0緩沖液中經(jīng)過(guò)超聲處理細(xì)菌，接著離心(15000×g，20分鐘，4℃)從兩升培養(yǎng)物中回收可溶性的TNF和NGR-TNF。兩種提取液都與硫酸銨混合(飽和度25％)，4℃放置1小時(shí)，如上所述再離心。使上清液中的硫酸銨達(dá)到65％的飽和度，4℃放置24小時(shí)并再離心。將各沉淀物溶于200ml緩沖液(1M硫酸銨，50mM Tris-HCl，pH8.0)中，在Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)上經(jīng)疏水層析純化(梯度洗脫，緩沖液A50mM磷酸鈉，pH8.0，含1M硫酸銨；緩沖液B20％甘油，5％甲醇，50mM磷酸鈉，pH8.0)。合并含TNF免疫活性物的流分(蛋白質(zhì)印跡法)，用2mM乙二胺四乙酸，20mM Tris-HCl，pH8.0的緩沖液透析，并在DEAE-Sepharose FastFlow(Pharmacia-Upjohn)上經(jīng)離子交換層析進(jìn)一步純化(梯度洗脫，緩沖液A20mM Tris-HCl，pH8.0；緩沖液B1M氯化鈉，20mM Tris-HCl，pH8.0)。合并含TNF免疫活性的流分并在Sephacryl-S-300HR(Pharmacia-Upjohn)上經(jīng)凝膠過(guò)濾層析純化，用150mM氯化鈉，50mM磷酸鈉，pH7.3的緩沖液(PBS)預(yù)平衡并洗脫。合并相當(dāng)于40000-50000Mr產(chǎn)物的流分，等分并凍存于-20℃。用于所述層析步驟中的所有溶液都是用無(wú)菌無(wú)內(nèi)毒素的水(Salf，Bergamo，Italy)制備的。最后產(chǎn)量為45mg TNF和34.5mg NGR-TNF。
純化的TNF和NGR-TNF的分子量用電噴霧質(zhì)譜測(cè)定法測(cè)定。蛋白質(zhì)含量用市售蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce，Rockgord，IL)測(cè)定。用定量產(chǎn)色鱟變形細(xì)胞溶解產(chǎn)物(LAL)檢驗(yàn)法(Bio Whittaker)測(cè)定NGR-TNF和TNF的內(nèi)毒素含量分別是0.75單位/μg和1.38單位/μg。
按照標(biāo)準(zhǔn)程序，用12.5％或15％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡分析。
少量TNF和NGR-TNR在如下可溶性p55-TNF受體(sTNF-R1)-Sepharose(按照文獻(xiàn)(22)所述制備5mg重組sTNF-R1并按廠商說(shuō)明書(shū)結(jié)合到2ml Activated-CH-Sepharose(Pharmacia))上經(jīng)親和層析進(jìn)一步純化。用無(wú)菌無(wú)內(nèi)毒素的溶液徹底清洗兩個(gè)單獨(dú)的柱子(每個(gè)柱子1ml)，用PBS中純化的TNF或NGR-TNF上樣并經(jīng)梯度洗脫解除吸附(1h，緩沖液APBS；緩沖液B0.5M氯化鈉，0.2M甘氨酸-鹽酸)。中和包含TNF-抗原的組分的流分并用無(wú)菌生理鹽水透析。在透析前加入無(wú)內(nèi)毒素的人血清白蛋白(0.5mg/ml)防止蛋白吸附在膜上。用ELISA和細(xì)胞溶解試驗(yàn)測(cè)定每一流分的TNF含量。
與預(yù)期的TNF單體(未顯示)一樣，TNF的非還原性SDS-PAGE顯示出17-18kDa的單一條帶。相矛盾的是，NGR-TNF的非還原性SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析顯示出可能相當(dāng)于單體、二聚體和三聚體的不同免疫活性型的18、36和50kDa。在還原條件下大多數(shù)50和36kDa的條帶轉(zhuǎn)變?yōu)?8kDa的形式，說(shuō)明存在具有鏈間二硫鍵的NGR-TNF分子。所述18kDa條帶占總物質(zhì)的2/3，而所述36kDa的條帶占剩余部分的大多數(shù)。這些電泳圖譜表明NGR-TNF是由具有正確的鏈內(nèi)二硫鍵(至少50％)的三個(gè)單體亞基組成的三聚體和其余部分(大多數(shù)為具有一個(gè)或多個(gè)鏈間二硫鍵的三聚體)的混合物。還原性SDS-PAGE仍然觀察到36kDa條帶表明NGR-TNF還包含不可逆變性的二聚體(大約為總數(shù)的10％)。
通過(guò)電噴霧質(zhì)譜測(cè)定法測(cè)定TNF和NGR-TNF單體的分子量分別是17386.1±2.0Da和17843.7±2.5Da。所述檢測(cè)值與Met-TNF1- 156(17386.7Da)和CNGRCG-TNF1-156(17844.2Da)的預(yù)期分子量非常接近。
實(shí)施例II小鼠TNF和NGR-TNF的體外細(xì)胞毒性活性如文獻(xiàn)(23)所述，通過(guò)基于L-M小鼠成纖維細(xì)胞(ATCC CCL1.2)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞溶解試驗(yàn)測(cè)定TNF和NGR-TNF的生物學(xué)活性。在30ng/ml放線菌素D存在的條件下測(cè)定TNF和NGR-TNF對(duì)RMA-T細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。每一樣品在三種不同濃度下以雙份試驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié)果用2-3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±SD表示。
按照L-M細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞溶解試驗(yàn)，所述TNF和NGR-TNF的體外細(xì)胞毒性活性分別為(1.2±0.14)×108單位/mg和(1.8±0.7)×108單位/mg。這些結(jié)果表明所述NGR-TNF分子中的CNGRCG部分未阻止其折疊、寡聚化和綴合TNF受體。
在先前的研究中我們已證明，在30ng/ml放線菌素D存在的條件下RMA-T細(xì)胞能被TNF殺死，然而在缺少轉(zhuǎn)錄抑制劑的條件下，甚至在培育幾天后這些細(xì)胞對(duì)TNF仍然有抵抗力。根據(jù)用TNF((1.2±0.14)×108單位/mg)作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行的測(cè)定，在放線菌素D存在的條件下NGR-TNF對(duì)RMA-T細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性活性為(1.4±0.8)×108單位/mg。
實(shí)施例III小鼠TNF和NGR-TNF的治療活性和毒性的表征Rauscher病毒引起的C57BL/6RMA淋巴瘤在體外用RPMI1640、5％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.25μg/ml兩性霉素B、2mM谷酰氨和50μM 2-巰基乙醇維持。RMA-T是由編碼Thy1.1等位基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染RMA細(xì)胞系衍生來(lái)的，按照文獻(xiàn)(14)所述培養(yǎng)。
B16F1黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI 1640、5％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.25μg/ml兩性霉素B、2mM谷酰氨、1％無(wú)必需氨基酸的MEM中(BioWhittaker Europe，Verviers，Belgium)。
在動(dòng)物模型的體內(nèi)研究得到the Ethical Committee of the SanRaffaele H Scientific Institute批準(zhǔn)并按照規(guī)定方針執(zhí)行。在左肋側(cè)分別用5×104RMA-T或B16F1活細(xì)胞皮下注射攻擊C57BL/6(CharlesRiver Laboratories，Calco，Italy)(16-18g)。腫瘤移植12天后，腹腔內(nèi)注射250μlTNF或NGR-TNF溶液(0.9％的無(wú)內(nèi)毒素氯化鈉稀釋)治療小鼠。初步實(shí)驗(yàn)表明添加人血清白蛋白(作為載體)到TNF和NGR-TNF溶液中沒(méi)有改變所述抗腫瘤活性。每組用5只小鼠進(jìn)行每個(gè)實(shí)驗(yàn)。每天用卡尺測(cè)量腫瘤大小監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。通過(guò)計(jì)算r1×r2估計(jì)腫瘤面積，而通過(guò)計(jì)算r1×r2×r3×4/3估計(jì)腫瘤體積，r1和r2是縱向半徑和橫向半徑，r3是從正常皮膚表面凸起的腫瘤厚度。在腫瘤直徑達(dá)到1.0-1.3cm前殺死動(dòng)物。腫瘤大小以平均值±SE表示(每組5-10只動(dòng)物，如圖例說(shuō)明所示)并通過(guò)t-檢驗(yàn)比較。
用在C57BL6小鼠中的RMA-T淋巴瘤和B16F1黑素瘤模型比較NGR-TNF和TNF的抗腫瘤活性和毒性。因?yàn)樗鯮MA-T模型以前已經(jīng)進(jìn)行了特征鑒定并用研究不同靶向草案(26)的TNF抗腫瘤活性，所以我們決定在本文的研究中也使用這個(gè)模型。
小鼠TNF給予帶有皮下注射建立的RMA-T腫瘤的動(dòng)物，24h后引起腫瘤質(zhì)量減少和腫瘤中心部位的出血性壞死，繼之顯著生長(zhǎng)抑制持續(xù)數(shù)天(26)。用單一TNF治療不能引起腫瘤完全消退(甚至在劑量接近LD50時(shí))，因?yàn)樵谥委熀髷?shù)天腫瘤壞死區(qū)域附近殘存的活細(xì)胞重新開(kāi)始生長(zhǎng)。
在第一套實(shí)驗(yàn)中我們研究TNF或NGR-TNF的各種劑量(腹腔內(nèi)注射)對(duì)動(dòng)物存活率的影響。為避免過(guò)多的痛苦當(dāng)所述腫瘤直徑大于1-1.3cm時(shí)殺死動(dòng)物。治療后3天，TNF和NGR-TNF的致死率相似(LD50分別為60μg和45μg)而它們的抗腫瘤活性顯著不同(表1)。
表1.用小鼠TNF和NGR-TNF治療帶有RMA-T淋巴瘤的小鼠的存活率
a)腫瘤移植10天后用TNF或NGR-TNF(腹腔內(nèi)注射)治療帶腫瘤的動(dòng)物。當(dāng)腫瘤直徑超過(guò)1-1.3cm時(shí)殺死動(dòng)物。
b)存活動(dòng)物在指示的時(shí)間再用50,000RMA-T細(xì)胞(第二次攻擊)或50,000RMA(第三次)攻擊。在每個(gè)時(shí)間用5只正常動(dòng)物監(jiān)測(cè)注射細(xì)胞的致腫瘤性。所有對(duì)照動(dòng)物10天內(nèi)生長(zhǎng)出腫瘤(數(shù)據(jù)未列出)。
例如，1或3μg的NGR-TNF比27μg的TNF更有效延遲腫瘤生長(zhǎng)，說(shuō)明NGR-TNF更有效至少1個(gè)數(shù)量級(jí)。有趣的是，一些動(dòng)物用低于LD50的劑量NGR-TNF治愈，而用TNF根本沒(méi)有動(dòng)物被治愈。治愈動(dòng)物抵制致瘤劑量的RMA-T或野生型RMA細(xì)胞的進(jìn)一步攻擊，表明用NGR-TNF單一治療能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。值得注意的是，增加TNF或NGR-TNF劑量至9-27μg以上毒性顯著增加而治療活性很少或沒(méi)有增加。
伴隨TNF治療的體重減少是眾所周知的全身性毒性表現(xiàn)(26)。因此為進(jìn)一步比較TNF和NGR-TNF的效力/毒性比，我們監(jiān)測(cè)治療后腫瘤生長(zhǎng)和動(dòng)物體重。1μg NGR-TNF對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的效果相似或高于9μg TNF的(圖1a)，而治療后1-2天的體重減少效果與1μg TNF治療類(lèi)似(圖1c)。當(dāng)我們內(nèi)推以劑量-反應(yīng)作圖的對(duì)數(shù)曲線數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，9μg TNF第14天的治療效果能用少到0.6μg的NGR-TNF獲得(圖1b)。相反，必需8.5μg才引起類(lèi)似的毒性作用(圖1d)。因此，在這些條件下計(jì)算出的NGR-TNF效力/毒性比比TNF大14倍。
用B16F1黑素瘤模型獲得了相似的結(jié)果。在第11天和17天用1μgNGR-TNF治療，在第19天引起的抗腫瘤反應(yīng)大于用4μgTNF獲得的反應(yīng)而與12μgTNF獲得的相似(數(shù)據(jù)未列出)。相反，1μgNGR-TNF引起的體重減少顯著地低于由4μg和12μgTNF引起的體重減少。用12μg NGR-TNF治療產(chǎn)生強(qiáng)得多的抗腫瘤效果，而毒性效果與12μgTNF相似。
當(dāng)在第19天第三次注射時(shí)，1-2天后所有組中有一些動(dòng)物死亡(鹽水和12μgNGR-TNF治療組中5只中2只死亡，其它組中5只中1只死亡)。值得注意的是，用12μgNGR-TNF治療的一只動(dòng)物徹底消除了腫瘤。當(dāng)用第二劑致瘤劑量的B16F1細(xì)胞第二次攻擊這個(gè)動(dòng)物時(shí)，18天后生長(zhǎng)出可捫及的腫瘤，而對(duì)照動(dòng)物在6-7天內(nèi)生長(zhǎng)出腫瘤。
總而言之，這些結(jié)果表明NGR-TNF抑制腫瘤生長(zhǎng)的效力比TNF大10-15倍而毒性是相似的。此外，NGR-TNF比TNF能更有效地誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。
實(shí)施例IVNGR-TNF的作用機(jī)理經(jīng)蛋白-G瓊脂糖層析(Pharmacia-Upjohn，Uppsala，Sweden)從腹水中純化抗小鼠CD13單克隆抗體R3-63，并用0.9％氯化鈉透析。
兔多克隆抗血清從Primm srl(Milan，Italy)購(gòu)買(mǎi)并在蛋白-A-瓊脂糖(Pharmacia-Upjohn)上親和層析純化。肽CNGRC和CARAC如前所述制備(28)。
為提供NGR-TNF的改良活性是依賴(lài)借助于NGR部分的腫瘤靶向的證據(jù)，我們研究NGR-TNF的體內(nèi)活性是否能被CNGRC部分競(jìng)爭(zhēng)。為這個(gè)目的我們給予帶RMA-T腫瘤的小鼠NGR-TNF(1μg)(含或不含過(guò)摩爾量的CNGRC)。平行地，其它動(dòng)物用TNF(3或9μg)治療(也含或不含CNGRC)。正如所料，CNGRC顯著降低了NGR-TNF的抗腫瘤活性(圖2a)但沒(méi)有降低TNF的抗腫瘤活性(圖2b)。相矛盾的是，對(duì)照肽(CARAC)不能引起NGR-TNF活性顯著降低(圖2c)。這些結(jié)果表明CNGRC競(jìng)爭(zhēng)NGR-TNF與CNGRC受體的綴合，并支持改善活性的靶向機(jī)制假說(shuō)。值得注意的是，CNGRC不能降低NGR-TNF的體外細(xì)胞毒性作用(數(shù)據(jù)未列出)。
因?yàn)榻鼇?lái)報(bào)道氨肽酶N(CD13)是肽CNGRC的受體，于是我們研究這個(gè)受體在NGR-TNF靶向機(jī)制中的貢獻(xiàn)。為這個(gè)目的，我們研究了抗-CD13單克隆抗體(R3-63)對(duì)NGR-TNF和TNF抗腫瘤活性的作用。單克隆抗體R3-63顯著抑制NGR-TNF的抗腫瘤活性(圖2a)但沒(méi)有抑制TNF的抗腫瘤活性(圖2b)，表明所述CD13確實(shí)決定性地涉及NGR-TNF的抗腫瘤活性。通過(guò)用單克隆抗體R3-63對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的FACS分析觀測(cè)到在RMA-T細(xì)胞表面沒(méi)有CD13的表達(dá)(未列出)，表明所述抗體識(shí)別其它體內(nèi)細(xì)胞。
雖然這些數(shù)據(jù)表明CD13是NGR-TNF的重要受體，我們不能完全排除綴合其它尚未識(shí)別的NGR受體也對(duì)所述靶向機(jī)制有貢獻(xiàn)(即使較低程度)。
蛋白質(zhì)部分水解的初步實(shí)驗(yàn)表明TNF的N-末端部分(2-3個(gè)殘基)中的Arg-Ser鍵對(duì)胰蛋白酶非常敏感，而該分子其余部分有非常強(qiáng)的抗性。因此，為了進(jìn)一步提供NGR-TNF改善的活性與它的NGR部分有關(guān)系的證據(jù)，我們?cè)噲D通過(guò)用固定的胰蛋白酶部分消化從突變型蛋白的N-末端區(qū)域切除NGR結(jié)構(gòu)域。這個(gè)處理將NGR-TNF和TNF都轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)相當(dāng)于TNF3-156片段的分子(預(yù)期分子量為16986.2Da；測(cè)定分子量和預(yù)期序列參見(jiàn)圖3a)。
盡管消化作用不降低NGR-TNF在體外對(duì)L-M細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性((2.3±1.4)×108U/mg)，它在體內(nèi)的抗腫瘤活性降低到TNF的水平(圖3b)。值得注意的是根據(jù)治療后1天動(dòng)物體重的減少判斷(圖3b，右圖)，NGR-TNF和TNF的毒性在消化前后是相似的，表明所述NGR-依賴(lài)的靶向機(jī)制不改變毒性。
實(shí)施例V人TNF和NGR-TNF的制備和表征人重組TNF和NGR-TNF(包含融合有CNGRCG的C末端的人TNF1-157)通過(guò)重組DNA技術(shù)制備并基本如所述小鼠TNF和NGR-TNF純化。用下列引物-NGR-hTNF/1(有義)5’A TATCAT ATGTGC AAC GGC CGTTGC GGC GTC AGA TCA TCdT TCT CG 3’-NGR-hTNF/2(反義)5’TCAGGA TCCTCA CAG GGC AATGAT CCC AAA GTA GAC 3’對(duì)包含所述hTNF編碼序列(33)的質(zhì)粒pET11b/hTNF通過(guò)PCR制備編碼人NGR-TNF的cDNA。
擴(kuò)增片段經(jīng)酶切克隆到pET-11b(Nde I/BamH I)中，并用于轉(zhuǎn)化BL21(DE3)有義細(xì)胞(Novagen)。按照pET-11b廠商說(shuō)明書(shū)用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)NGR-hTNF的表達(dá)。通過(guò)在2mM乙二胺四乙酸，20mM Tris-HCl，pH8.0中超聲處理細(xì)菌接著離心(15000×g，20分鐘，4℃)從兩升培養(yǎng)物中回收可溶性的NGR-TNF。
所述提取液與硫酸銨混合(飽和度35％)，4℃放置1小時(shí)，如上再離心。然后使上清液中的硫酸銨達(dá)到65％的飽和度，4℃放置24小時(shí)并進(jìn)一步離心。將各沉淀物溶于1M硫酸銨，50mM Tris-HCl，pH8.0中，通過(guò)在Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)上疏水層析純化(梯度洗脫，緩沖液A100mM磷酸鈉，pH8.0，含有1M硫酸銨；緩沖液B70％乙二醇，5％甲醇，100mM磷酸鈉，pH8.0)。合并含有hTNF免疫活性物質(zhì)(經(jīng)ELISA)的流分，用20mM Tris-HCl，pH8.0透析，并進(jìn)一步通過(guò)在DEAE-Sepharose Fast F1ow(Pharmacia-Upjohn)上離子交換層析純化(梯度洗脫，緩沖液A20mM Tris-HCl，pH8.0；緩沖液B1M氯化鈉，20mM Tris-HCl，pH8.0)。所述層析步驟中使用的所有溶液都用無(wú)菌無(wú)內(nèi)毒素的水制備(Salf，Bergamo，Italy)。
這里從兩升培養(yǎng)物中回收了大約30mgTNF和32mg NGR-TNF。非還原性SDS-PAGE顯示相應(yīng)于單體、二聚體和三聚體的條帶，表明人NGR-TNF也是具有正確的鏈內(nèi)二硫鍵的三聚體和具有一個(gè)或多個(gè)鏈間二硫鍵的三聚體的混合物(圖4A，泳道b)(與用小鼠NGR-TNF觀察的一樣)。
具有正確的鏈內(nèi)二硫鍵的三聚體經(jīng)如下四個(gè)步驟的變性-再折疊過(guò)程從該混合物中分離出來(lái)用7M尿素使純化的人NGR-TNF變性，然后通過(guò)7M尿素，100mM Tris-HCl，pH8.0預(yù)平衡的HR Sephacryl S-300柱(1025ml)(Pharmacia)凝膠過(guò)濾。合并相應(yīng)單體TNF的流分，經(jīng)YM MWCO 10kDa膜(Amicon)超濾，然后用33倍體積2.33M尿素，100mM Tris-HCl，pH8在4℃透析(140分鐘)，接著經(jīng)1.55M尿素，100mM Tris-HCl，pH8透析(140分鐘)和1M尿素，100mM Tris-HCl，pH8透析(140分鐘)而再折疊。最后產(chǎn)物用80倍體積的100mM Tris-HCl透析(16小時(shí))，在13000×g離心(30分鐘)，經(jīng)SFCA 0.45μm膜(Nalgene)過(guò)濾并用0.15M氯化鈉，0.05M磷酸鈉(PBS)預(yù)平衡的HRSephacryl S-300柱(1020ml)凝膠過(guò)濾?；厥沾蠹s23mg再折疊蛋白。
在非還原性SDS-PAGE后最終產(chǎn)物大部分為單體(圖4A，泳道c)，在Superdex 75HR柱上經(jīng)分析性凝膠過(guò)濾HPLC，液體力學(xué)體積與三聚體人TNF相似(未列出)，電噴霧質(zhì)譜測(cè)定法測(cè)定分子量17937.8+1.8Da(CNGRCG-TNF1-157預(yù)期分子量為17939.4Da)。未再折疊和再折疊的NGR-TNF對(duì)小鼠L-M細(xì)胞的體外細(xì)胞溶解活性分別是(6.11×107)+4.9和(5.09×107)+0.３單位/mg，而純化的人TNF是(5.45×107)+3.1單位/mg。這些結(jié)果表明所述變性-再折疊過(guò)程不影響人NGR-TNF和小鼠p55受體的相互作用。
1μg人NGR-TNF(未再折疊)的體內(nèi)抗腫瘤活性比10μgTNF更大(圖4B)，而通過(guò)動(dòng)物體重減少判斷的毒性顯著地較低(圖4C)。0.3μgNGR-TNF再折疊后足以誘導(dǎo)比10μgTNF達(dá)到的更強(qiáng)烈的抗腫瘤作用(圖4D，4E)。
這些結(jié)果說(shuō)明人NGR-TNF的抗腫瘤活性比人TNF的抗腫瘤活性更大。
此外，我們觀察到再折疊的人NGR-TNF和小鼠NGR-TNF對(duì)帶有RMA-T的小鼠，即使以沒(méi)有毒性作用證據(jù)的非常低的劑量(1-10ng/小鼠)也能引起顯著的抗腫瘤作用，而TNF以這樣的劑量不能引起顯著作用(未列出)。
實(shí)施例VI小鼠NGR-IFγ的制備和表征基本如NGR-TNF所述，與CNGRCG融合的重組小鼠干擾素(IFN)γ(NGR-IFNγ)經(jīng)重組DNA技術(shù)制備。CNGRC結(jié)構(gòu)域與IFNγ的C末端融合。此外134位的半胱氨酸被絲氨酸替換；甲硫氨酸被引入位點(diǎn)-1，用于在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)。用于制作NGR-IFNγcDNA的PCR引物是5’-A TAT CTA CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATTGAA AGC C(有義)和5’-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTTGCA GCC GGA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT GAG GC。在pET-11b(Nde I/BamH I)中克隆所述cDNA并用于轉(zhuǎn)化BL21(DE3)有義細(xì)胞(Novagen)。按照pET-11b廠商說(shuō)明書(shū)用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)固定在瓊脂糖上的抗小鼠IFNγ單克隆抗體(AN18)免疫親和層析從大腸桿菌提取液中純化所述產(chǎn)物。最終產(chǎn)物的還原和非還原性SDS-PAGE顯示出16Kda的單一條帶。電噴霧質(zhì)譜測(cè)定法測(cè)定顯示相當(dāng)于小鼠Met-IFNγ1-134(C134S)CNGRC(NGR-IFNγ)的分子量為16223+3.6Da(預(yù)期1625.5Da)。
NGR-IFNγ和NGR-TNF與抗-CD13抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到腫瘤相關(guān)血管的能力通過(guò)使用免疫組織化學(xué)方法研究。
從the Histopathology Department of the San Raffaele H ScientificInstitute獲得人腎臟細(xì)胞癌的新鮮外科標(biāo)本。制備Bouin固定(4-6小時(shí))的石蠟包埋標(biāo)本的切片(5-6μm厚)并吸附到聚賴(lài)氨酸包被的玻片上。如下用抗生物素蛋白-生物素復(fù)合法檢測(cè)CD13抗原組織切片按照標(biāo)準(zhǔn)程序用二甲苯和分級(jí)乙醇系列再水合。將組織切片置于含有1mM EDTA的容器中并用微波爐(1000W)煮沸7分鐘。然后往容器中再裝1mM EDTA并再煮沸5分鐘。將所述組織切片放置冷卻，然后在含有0.3％的過(guò)氧化氫的PBS中孵育15分鐘來(lái)抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。然后用PBS漂洗所述標(biāo)本并用100-200μl PBS-BSA孵育(室溫1小時(shí))，接著用單克隆抗體WM15(抗hCD13)(單獨(dú)或與各種競(jìng)爭(zhēng)劑混合(見(jiàn)表2))在PBS-BSA中孵育(4℃過(guò)夜)。然后用PBS洗滌玻片3次(每次3分鐘)并用含2％普通馬血清的PBS-BSA(PBS-BSA-NHS)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育5分鐘。用3μg/ml生物素化馬抗小鼠IgG(H+L)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)的PBS-BSA-NHS代替上述溶液，然后室溫再孵育1小時(shí)。再洗滌玻片，用PBS 1∶100稀釋的Vectastain Elite Reagent(Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育30分鐘。然后將一片3，3’-二氨基-聯(lián)苯胺-四鹽酸鹽(Merck，Darmstadt，Germany)溶于10ml含有0.03％過(guò)氧化氫的去離子水中，經(jīng)0.2μm膜過(guò)濾并覆蓋在組織切片上5-10分鐘。如上所述洗滌玻片并用Harris’蘇木紫復(fù)染。腫瘤相關(guān)血管用抗CD13單克隆抗體(mAb JC/70A，抗人CD31，IgG1，DAKO，Copenhagen，Denmark)經(jīng)連續(xù)組織切片染色鑒定。
結(jié)果總結(jié)于表2。如表所示，WM15對(duì)腫瘤相關(guān)血管的結(jié)合被過(guò)量NGR-TNF、NGR-IFNγ和CNGRC所抑制，但沒(méi)有被其它缺乏NGR基元的對(duì)照試劑所抑制。這表明CD13上的NGR結(jié)合位點(diǎn)與所述WM15抗原決定簇在空間上重疊。相反地，NGR-TNF不能與13C03競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到上皮細(xì)胞上。
我們的結(jié)論是，NGR-IFNγ和NGR-TNF的NGR部分能和在腫瘤相關(guān)血管上由單克隆抗體WM15識(shí)別的CD13形式相互作用。此外，這些結(jié)果表明當(dāng)被連接到細(xì)胞因子的N-末端或C-末端時(shí)CNGRC基元是有功能性的。
表2.在各種競(jìng)爭(zhēng)劑存在的條件下WM15與腎臟細(xì)胞癌切片的結(jié)合
a在封閉步驟中在含有2％BSA的PBS中添加競(jìng)爭(zhēng)劑并和最初的抗體混合。
b單克隆抗體WM15(抗人CD13，IgG1)來(lái)自Pharmingen(San Diego，CA)；合成肽CgA(60-68)相應(yīng)于嗜鉻粒蛋白A片段60-68。
實(shí)施例VII用抗腫瘤抗體和抗生物素蛋白定向傳遞生物素化NGR-TNF到腫瘤(預(yù)導(dǎo)向)下列實(shí)例闡明TNF(基于腫瘤自動(dòng)靶向抗體和肽CNGRC的聯(lián)合應(yīng)用)的“雙”靶向可能性。
通過(guò)將NGR-TNF和D-生物素基-6-氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Societá Prodotti Antibiotici S.p.A，Milan，Italy)在1M碳酸鈉緩沖液pH6.8中混合(室溫3小時(shí))，制備生物素-NGR-TNF綴合物(21)。用1MTris-HCl，pH7.5中斷反應(yīng)。
所述綴合物用質(zhì)譜測(cè)定法檢定發(fā)現(xiàn)含有1個(gè)生物素/三聚體(平均)。然后用5×104RMA-T活細(xì)胞左肋皮下注射攻擊C57BL/6(CharlesRiver Laboratories，Calo，Italy)。當(dāng)腫瘤面積達(dá)到40mm2時(shí)，按照如前(26)所述的“3天”方案相繼注射生物素化抗體、抗生物素蛋白和生物素-TNF。我們注射40μg生物素-mAb19E12(腹腔內(nèi)注射，步驟I)，分別在18和19小時(shí)后60μg抗生物素蛋白和60μg鏈霉抗生物素蛋白(腹腔內(nèi)注射，步驟II)，在24小時(shí)后3μg生物素-NGR-TNF(腹腔內(nèi)注射，步驟III)。每種化合物用無(wú)菌的0.9％氯化鈉溶液稀釋。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，省略抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白。每個(gè)實(shí)驗(yàn)用5只小鼠/組完成。通過(guò)每日用卡尺測(cè)量腫瘤大小監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。在用mAb19E12-生物素/抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白/生物素-NGR-TNF(5只動(dòng)物，平均±SE值)治療的組中，腫瘤面積在治療前和治療10天后分別是39±4mm2和8±5mm2。在對(duì)照組中(只用mAb 19E12-生物素/生物素-NGR-TNF治療)腫瘤面積在治療前和治療10天后分別是40±4mm2和20±6mm2，表明用腫瘤自動(dòng)靶向抗體和抗生物素蛋白預(yù)靶向提高了NGR-TNF活性。
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序列表<110>Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor<120>用于治療癌癥的修飾細(xì)胞因子<130>modcyt<140>
<141>
<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>1ctggatcctc acagagcaat gactccaaag 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>2tgcctcacat atgctcagat catcttctc29<210>3<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物
<400>3gcagatcata tgtgcaacgg ccgttgcggc ctcagatcat cttctc 46<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>4atatcatatg tgcaacggcc gttgcggcgt cagatcatct tctcg 45<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>5tcaggatcct cacagggcaa tgatcccaaa gtagac 36<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>6atatctacat atgcacggca cagtcattga aagcc 35<210>7<211>58<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>7tcggatcctc agcaacggcc gttgcagccg gagcgactcc ttttccgctt cttgaggc 58
權(quán)利要求
1.一種綴合制品，該綴合制品為選自TNF或IFNγ的細(xì)胞因子和CD13受體配體的綴合物。
2.權(quán)利要求1要求保護(hù)的綴合制品，其中所述細(xì)胞因子是TNFα或TNFβ。
3.權(quán)利要求1-2要求保護(hù)的綴合制品，其中所述CD13受體配體選自抗體或其活性片段、肽或肽模擬物。
4.權(quán)利要求3要求保護(hù)的綴合制品，其中所述配體是一種包含NGR基元的肽。
5.權(quán)利要求4要求保護(hù)的綴合制品，其中所述肽選自CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環(huán)形CVLNGRMEC、線性或環(huán)形CNGRC。
6.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求要求保護(hù)的綴合制品，其中所述細(xì)胞因子是用聚乙二醇或?；鶜埢芑募?xì)胞因子。
7.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求要求保護(hù)的綴合制品，其中所述細(xì)胞因子進(jìn)一步與抗體或其片段或者與生物素綴合，所述抗體或其片段為針對(duì)腫瘤抗原、腫瘤血管形成標(biāo)記物或胞外基質(zhì)組分的抗體。
8.權(quán)利要求7的綴合制品，其中所述細(xì)胞因子是TNF，并且在不同亞基上與CD13配體和抗體或其片段或生物素綴合。
9.一種編碼選自TNF和IFN的細(xì)胞因子的cDNA，該cDNA帶有編碼CD13配體的5’或3’連續(xù)序列。
10.權(quán)利要求9的cDNA，其中所述CD13配體是權(quán)利要求5的肽。
11.一種包含權(quán)利要求9-10的cDNA的基因治療載體。
12.一種藥物組合物，它包含有效量的權(quán)利要求1-8保護(hù)的綴合制品和制藥學(xué)允許的載體及賦形劑。
13.權(quán)利要求12要求保護(hù)的組合物，該組合物為注射溶液或懸混液或用于輸注的液體形式。
14.權(quán)利要求12-13要求保護(hù)的組合物，它為脂質(zhì)體形式。
15.權(quán)利要求1-8要求保護(hù)的綴合制品或權(quán)利要求9-10的cDNA在制備用于治療癌癥的藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求15的綴合制品用途，它可與其它抗腫瘤藥物或診斷性腫瘤成像化合物聯(lián)合應(yīng)用。
全文摘要
能自動(dòng)靶向腫瘤血管和抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞因子衍生物及其作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1853730SQ20061000927
公開(kāi)日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2001年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月15日
發(fā)明者A·科爾蒂 申請(qǐng)人:圣拉斐爾德?tīng)柮商厮┗鹬行?br>