專利名稱：多細(xì)胞因子－抗體復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)建和表達(dá)多細(xì)胞因子蛋白復(fù)合物及其組合物的方法。更具體地講，本發(fā)明涉及由多種細(xì)胞因子和一種靶向組分組成的融合蛋白，以及使用所述融合蛋白治療如癌癥和病毒感染的疾病的方法。
背景技術(shù)：
控制免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)依賴于稱為細(xì)胞因子的分泌性蛋白信號分子開啟和關(guān)閉免疫細(xì)胞的功能以及調(diào)節(jié)它們的增殖。這些反應(yīng)一般涉及協(xié)調(diào)產(chǎn)生所需要的生物效應(yīng)的多種細(xì)胞因子。某些細(xì)胞因子如白介素-2(IL-2)可以單獨(dú)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖，并可以激活其它的功能，包括次級細(xì)胞因子分泌。另一種細(xì)胞因子白介素-12(IL-12)[綜述Trinchieri，1994，Blood 844008-4027]可誘導(dǎo)某些免疫細(xì)胞增殖，并可以誘導(dǎo)另一種關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)物γ干擾素(IFN-γ)。這種對IFN-γ的誘導(dǎo)是IL-12的主要活性，但是IL-12具有其它重要的獨(dú)立于IFN-γ的活性。因?yàn)镮L-12本身是在感染性疾病的早期被誘導(dǎo)，所以認(rèn)為IL-12是聯(lián)系先天免疫系統(tǒng)和后天免疫系統(tǒng)的紐帶。
對小鼠和人類免疫細(xì)胞的許多體外研究說明了細(xì)胞因子組合在產(chǎn)生最適免疫應(yīng)答中的重要性。例如，大多數(shù)T細(xì)胞不表達(dá)IL-12受體(IL-12R)，直到它們被促細(xì)胞分裂原激活或在高濃度IL-2下培養(yǎng)才表達(dá)該受體[Desai等(1992)，J.Immunol.1483125-3132]。一旦表達(dá)IL-12受體，則所述細(xì)胞對IL-12的反應(yīng)性要強(qiáng)得多。而且，IL-12誘導(dǎo)IFN-γ轉(zhuǎn)錄，但此后不久IFN-γmRNA就被降解。在IL-2存在時(shí)，IFN-γmRNA是穩(wěn)定的，使產(chǎn)生的IFN-γ量急劇增加[Chan等(1992)J.Immunol.14892-98]。在其他研究中，發(fā)現(xiàn)IL-3+IL-11或IL-3+青灰因子的細(xì)胞因子組合與IL-12一起對早期造血祖細(xì)胞的增殖具有協(xié)同作用[以上引用的Trinchieri，1994]。IL-4和GM-CSF組合對刺激樹突細(xì)胞特別有用(Palucka等J.Immunology 1604587-4595)。為了刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，還可使用IL-12與IL-18的組合，IL-18是最近公開的一種具有某些IL-12互補(bǔ)活性的Th1-促進(jìn)型細(xì)胞因子(Hashimoto等J.Immunology 163583-589；Barbulescu等J.Immunology 1603642-3647)。另外，IL-2與IFN-γ在某些情況下產(chǎn)生協(xié)同作用[Palladino，M.A.，美國專利第5,082,658號]。
在許多協(xié)同作用研究中，發(fā)現(xiàn)每種細(xì)胞因子的相對水平非常重要。盡管在存在次優(yōu)量IL-2時(shí)加入IL-12在誘導(dǎo)增殖、溶細(xì)胞活性和IFN-γ誘導(dǎo)方面產(chǎn)生協(xié)同作用，但發(fā)現(xiàn)其中一種細(xì)胞因子使用高劑量的IL-2和IL-12組合是拮抗性的[Perussia等，J.Immunol.1493495-3502(1992)；Mehrotra等，J.Immunol.1512444-2452(1993)]。IL-12和IL-7組合也存在相似的情況。
IL-12和其它細(xì)胞因子在小鼠中產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)的協(xié)同研究也顯示混合性各種結(jié)果。在某些模型中，在每種細(xì)胞因子的次優(yōu)劑量和導(dǎo)致毒性增強(qiáng)的較高劑量觀察到協(xié)同作用，而在其它模型中，IL-12和IL-2組合顯示很小或沒有協(xié)同作用[參見例如Nastala等，J.Immunol.1531697-1706.(1994)]。這些結(jié)果可能反映出體內(nèi)組合兩種潛在協(xié)同因子的固有困難，尤其是當(dāng)需要保持兩種具有不同藥理特性(如不同的循環(huán)半衰期和生物分布)的因子的固定活性比時(shí)。
在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，可直接控制細(xì)胞因子水平，但許多因素可以影響體內(nèi)細(xì)胞因子的相對生物分布和定位，因此影響它們的免疫刺激能力。這些因素中最重要的是半衰期。在單次快速注射后IL-2的循環(huán)半衰期約為10分鐘。與這些藥代動力學(xué)特性顯著不同的是，已經(jīng)報(bào)道了IL-12在小鼠中的循環(huán)半衰期大于3小時(shí)[Wysocka等(1995)Eur.J.Immunol.25672]，而在人體內(nèi)的循環(huán)半衰期為5-10小時(shí)[Lotze等(1996)Ann NY Acad Sci 795440-454]。
這種差異被認(rèn)為是由于IL-2和GM-CSF都相對較小(15-25kD，而IL-12為75kD)，使得IL-2和GM-CSF可被腎過濾清除。分子量小于約50kD的蛋白可被腎過濾清除。幾乎所有的細(xì)胞因子都小于50kD，并存在相似快速的腎過濾清除。當(dāng)需要用兩種這樣的被快速清除的小細(xì)胞因子治療時(shí)，僅共同給予所述細(xì)胞因子就可以了。然而，共同給予對于半衰期顯著不同的細(xì)胞因子并不是最優(yōu)的。
難以系統(tǒng)給予細(xì)胞因子，因?yàn)樗鼈兙哂杏泻Φ母弊饔?。例如，高水平的?干擾素導(dǎo)致嚴(yán)重副作用，包括皮膚、神經(jīng)、免疫和內(nèi)分泌毒性。預(yù)期多細(xì)胞因子融合蛋白可能出現(xiàn)特別嚴(yán)重的副作用。
為減少系統(tǒng)給予細(xì)胞因子的副作用，一種策略是將一種細(xì)胞因子與第二種具有靶向能力的分子融合。其中Fc區(qū)位于另一種蛋白的N端的融合蛋白(稱為‘免疫融合蛋白’或‘Fc-X’融合蛋白，其中X為配體，如α-干擾素)具有許多與眾不同的有利生物特性[Lo等，美國專利第5,726,044號和第5,541,087號；Lo等，Protein Engineering 11495]。具體來說，這樣的融合蛋白仍可以結(jié)合細(xì)胞表面上的相關(guān)Fc受體。然而，當(dāng)所述配體結(jié)合細(xì)胞表面上的其受體時(shí)，F(xiàn)c區(qū)的取向改變，介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體結(jié)合的序列似乎被封閉。結(jié)果，F(xiàn)c-X分子中的Fc區(qū)沒有有效介導(dǎo)ADCC或補(bǔ)體結(jié)合。N端細(xì)胞因子和C端Fc區(qū)的融合蛋白產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用是眾所周知的。例如，IL-2與Fc區(qū)的N端融合產(chǎn)生一種能夠結(jié)合具有IL-2受體的細(xì)胞、結(jié)合補(bǔ)體并因此溶解細(xì)胞的分子[Landolfi，N.F.(1993)，美國專利第5,349,053號]。相反，F(xiàn)c-IL-2融合蛋白不具有這種特性。因此，預(yù)期Fc-X融合蛋白具有增加血清半衰期和肝中相對濃度的功效，而沒有ADCC和補(bǔ)體結(jié)合的有害副作用。
已經(jīng)證明，許多不同的短血清半衰期蛋白可以Fc-X構(gòu)型與Fc區(qū)融合，獲得的融合蛋白具有長得多的血清半衰期。然而，兩種不同F(xiàn)c融合蛋白的血清半衰期一般不相同。因此，當(dāng)需要傳遞兩種不同的X部分時(shí)，共同給予兩種不同的Fc-X蛋白一般不是最優(yōu)的。
在某些情況下，較好的方法是通過將細(xì)胞因子融合至對細(xì)胞表面抗原具有特異性和親和性的抗體(或其衍生片段)(Gillies，美國專利第5,650,150號；Gillies等，Proc.Natl.Acad.Sci.891428)，或通過肽鍵以融合蛋白形式使蛋白抗原和刺激性細(xì)胞因子連接(Hazama等，Vaccine 11629)，將細(xì)胞因子的作用靶向細(xì)胞表面抗原。盡管抗體自身可增加融合細(xì)胞因子的半衰期，但在和相同抗體融合的不同細(xì)胞因子融合蛋白之間仍存在差異[參見例如Gillies等，BioconjugateChem.4230-235(1993)；Gillies等，J.Immunol.1606195-6203]，這種差異使得難以在靶位共同定位。如上所述，這可以導(dǎo)致細(xì)胞因子活性不平衡，降低所需要的協(xié)同作用。另外，使用兩種不同的融合蛋白需要分別測試每種融合蛋白的安全性和有效性分布，然后作為混合物進(jìn)一步測試。
發(fā)明概述本發(fā)明提供兩種或多種不同細(xì)胞因子的復(fù)合物或融合物，它們可用于一般免疫治療以及靶向免疫治療。這些復(fù)合物或融合物可選地包括其它蛋白部分。所述復(fù)合物或融合物的一個(gè)特征在于它們提供細(xì)胞因子組分固定活性比。
一般而言，本發(fā)明涉及含有至少兩種不同細(xì)胞因子的蛋白復(fù)合物。所述細(xì)胞因子可位于同一多肽鏈中，或者可通過共價(jià)鍵(如二硫鍵或化學(xué)交聯(lián)形成的鍵)連接?；蛘?，所述細(xì)胞因子可為穩(wěn)定的非共價(jià)鍵結(jié)合。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白復(fù)合物包含在哺乳動物中使所述復(fù)合物靶向特定部位的靶向部分，如抗體或抗體片段。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供將一種雙鏈細(xì)胞因子(如IL-12)的生物活性和第二種細(xì)胞因子的生物活性組合在一起的蛋白復(fù)合物。所述細(xì)胞因子互相之間可共價(jià)結(jié)合(例如融合)。所述細(xì)胞因子還可以通過其它部分結(jié)合。例如，含有第二種細(xì)胞因子的多肽鏈可包括特異性結(jié)合IL-12的結(jié)合部分，如IL-12抗體或IL-12受體?；蛘撸鼋Y(jié)合部分可作用于結(jié)合IL-12的第二個(gè)部分。例如，如果編碼IL-12亞單位的多肽鏈還包括抗生物素蛋白，則含有第二種細(xì)胞因子的多肽可包括作為靶向部分的生物素蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種細(xì)胞因子為IL-2。
本發(fā)明提供制備IL-12融合蛋白的方法，所述融合蛋白既保持IL-12活性，也保持第二種細(xì)胞因子的活性，所述融合蛋白在提供一種類似于IL-12自身的更長的單一藥代動力學(xué)特性的同時(shí)，延長第二種細(xì)胞因子的活性持續(xù)時(shí)間，并在注射入動物后保持兩種細(xì)胞因子的活性平衡。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含異源二聚體形式的IL-12，其中IL-12的p35和p40亞單位通過二硫鍵連接，并在IL-12的p35或p40亞單位的N端或C端與第二種細(xì)胞因子共價(jià)結(jié)合，通式為IL-12-X或X-IL-12，其中X為第二種細(xì)胞因子。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含與單鏈(sc)形式IL-12的N端或C端共價(jià)結(jié)合的第二種細(xì)胞因子，通式為scIL-12-X或X-scIL-12，其中所述單鏈形式的IL-12包含兩個(gè)通過柔性肽接頭連接的多肽亞單位。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，兩種細(xì)胞因子進(jìn)一步融合至一種能夠形成二聚體或多聚體結(jié)構(gòu)的蛋白，融合部位在所述蛋白鏈的氨基端或羧基端。在該實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選形式中，IL-12與第二種細(xì)胞因子的一種融合蛋白形式進(jìn)一步融合至能夠二聚體化的免疫球蛋白(Ig)鏈的一部分，如Fc區(qū)。進(jìn)一步的實(shí)施方案包括在Ig鏈部分的任一端的至少一條IL-12多肽鏈和在另一端融合的第二種細(xì)胞因子的融合蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩種或多種細(xì)胞因子與因?yàn)榻Y(jié)合特異性受體具有靶向能力的蛋白融合。例如，F(xiàn)c區(qū)能夠結(jié)合肝臟富有的Fc受體。Fc區(qū)與多種細(xì)胞因子的融合蛋白例證了二聚體和靶向的優(yōu)勢，但在某些情況下可構(gòu)建僅具有多聚化能力或靶向能力但二者不同時(shí)具備的多種細(xì)胞因子的融合蛋白。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，包含多種細(xì)胞因子的融合蛋白進(jìn)一步在氨基端或羧基端與具有多種靶向能力的分子類型中的一種分子融合，所述分子例如為抗體或具有或不具有支架結(jié)構(gòu)的適體(aptamer)(Colas等Proc Natl Acad Sci USA.9514272-7)。一個(gè)具體的實(shí)施方案是多種細(xì)胞因子與能夠結(jié)合抗原的抗體的至少一部分(如完整抗體、單鏈抗體或單鏈Fv區(qū))的融合蛋白。其它的實(shí)施方案包括在能夠結(jié)合抗原的至少一部分抗體鏈的任一端的至少一條IL-12多肽鏈與融合在另一端的第二種細(xì)胞因子的融合蛋白。
按照以上的描述，一般優(yōu)選通過遺傳工程技術(shù)使組成蛋白通過共價(jià)鍵(如酰胺鍵或二硫鍵)連接，構(gòu)建多細(xì)胞因子融合蛋白和多細(xì)胞因子-抗體融合蛋白。但是，也可使用化學(xué)交聯(lián)劑構(gòu)建所述蛋白復(fù)合物。這樣的方法在蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域是成熟的方法。另一方面，有時(shí)通過將不同的細(xì)胞因子與配偶體蛋白融合形成穩(wěn)定非共價(jià)復(fù)合物就足以制得蛋白復(fù)合物。例如，使用一種非共價(jià)異源二聚體支持蛋白第一種細(xì)胞因子融合至所述異源二聚體的一個(gè)亞單位，第二種細(xì)胞因子融合至所述異源二聚體的第二個(gè)亞單位，然后在合適的條件下混合兩種融合蛋白。例如，在同一細(xì)胞中表達(dá)編碼兩種亞單位-細(xì)胞因子融合蛋白的核酸。因此，可構(gòu)建其中組成細(xì)胞因子直接或間接非共價(jià)連接的多細(xì)胞因子蛋白復(fù)合物。為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述復(fù)合物必須在給予動物時(shí)保持足夠穩(wěn)定并實(shí)現(xiàn)生物效應(yīng)。
本發(fā)明還提供編碼包含兩種或多種細(xì)胞因子的融合蛋白的核酸，其中一種細(xì)胞因子優(yōu)選為IL-12，而由所述核酸編碼的融合蛋白可選地包括其它蛋白部分。優(yōu)選的實(shí)施方案包括編碼兩種或多種細(xì)胞因子與二聚體蛋白(如抗體鏈的Fc部分)的融合蛋白的核酸。另一組優(yōu)選實(shí)施方案為編碼兩種或多種細(xì)胞因子與具有靶向能力的蛋白(如抗體)的融合蛋白的核酸。
本發(fā)明還提供構(gòu)建兩種或多種細(xì)胞因子的融合蛋白的方法以及表達(dá)這樣的融合蛋白的方法。
本發(fā)明還提供治療疾病和其它病癥的方法，其中治療包括兩種或多種蛋白活性的有效組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種蛋白具有短血清半衰期(例如少于20分鐘)或僅具有中等血清半衰期(例如少于40分鐘)。通過遺傳工程或其它技術(shù)融合所述蛋白并給予人或動物。因此，兩種蛋白的活性為固定活性比，并且不需要按照兩種蛋白的不同給藥方案分別給予。另外，融合蛋白的血清半衰期一般更近似于血清半衰期較長的蛋白組分的血清半衰期，因此延長了血清半衰期較短蛋白的有效半衰期。
更具體地說，本發(fā)明提供免疫治療性治療可用一種雙鏈細(xì)胞因子(如IL-12)和第二種細(xì)胞因子聯(lián)合有效治療的疾病(如癌癥或感染或其它疾病)的方法。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，IL-12與IL-2或GM-CSF融合并給予動物或人。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，GM-CSF與IL-4融合并給予動物或人。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，IL-12與IL-18融合并給予動物或人。所述治療可與其它疾病治療聯(lián)合使用。另外，本發(fā)明提供針對多種抗原的免疫方法，所述方法可用于預(yù)防或治療各種疾病。
在這些方法的其它實(shí)施方案中，兩種不同的細(xì)胞因子與二聚體蛋白部分(如抗體的Fc區(qū))融合并給予動物或人。在這些方法的一個(gè)優(yōu)選形式中，細(xì)胞因子IL-12和第二種細(xì)胞因子與Fc區(qū)融合，所述第二種細(xì)胞因子更優(yōu)選IL-2或GM-CSF。
在這些方法另外的其它實(shí)施方案中，兩種不同的細(xì)胞因子與完整抗體融合，并給予動物或人。在這些方法的一個(gè)優(yōu)選形式中，細(xì)胞因子IL-12和第二種細(xì)胞因子與抗體部分融合，所述第二種細(xì)胞因子更優(yōu)選IL-2或GM-CSF。本發(fā)明還公開了可用于治療疾病的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用抗體-IL-2融合蛋白與抗體-IL-12融合蛋白的混合物治療疾病。例如，治療癌癥、病毒感染或細(xì)菌感染。
附圖簡述當(dāng)同時(shí)閱讀以下說明書和附圖時(shí)，可更充分地理解本發(fā)明的前述目的和其它目的及其各種特征。


圖1A圖示說明兩種細(xì)胞因子最簡單形式的融合蛋白一種細(xì)胞因子可選地通過接頭與第二種細(xì)胞因子融合。圖1B-1I顯示了其中第二種細(xì)胞因子(標(biāo)記為‘cyt’)可連接至異源二聚體細(xì)胞因子IL-12的各種方式。具體地說，第二種細(xì)胞因子可融合至p40的C端(圖1B)、p40的N端(圖1C)、p35的C端(圖1D)或p35的N端(圖1E)。另外，圖1顯示第二種細(xì)胞因子如何與單鏈型IL-12融合。具體而言，單鏈IL-12分子可為p35(N端)至p40，而第二種細(xì)胞因子在C端(圖1F)或N端(圖1G)?；蛘?，單鏈IL-12分子可為p40(N端)至p35，而第二種細(xì)胞因子在C端(圖1H)或N端(圖1I)。
圖2A-2C圖示說明圖1描述的多細(xì)胞因子融合蛋白(框形)進(jìn)一步如何與抗體的Fc區(qū)(圖中所示為鉸鏈區(qū)(H)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域(各種卵形))融合。具體而言，圖1中的8種分子中的任一種均可與Fc區(qū)的C端(圖2A)或N端(圖2B)融合。另外，第一種細(xì)胞因子和第二種細(xì)胞因子(分別為框形)互相之間不需要直接連接，而可以通過Fc部分連接(圖2C)。
圖3A-3G圖解顯示多細(xì)胞因子融合蛋白進(jìn)一步與完整免疫球蛋白(如IgG)融合的亞類方式。重鏈V區(qū)顯示為卵形標(biāo)記的VH，輕鏈V區(qū)顯示為卵形標(biāo)記的VL，而恒定區(qū)為空白卵形。圖1例舉的多細(xì)胞因子融合蛋白可位于重鏈的C端(圖2A)、重鏈的N端(圖2B)、輕鏈的N端(圖2C)或輕鏈的C端(圖2D)。另外，有多種方式可將第一種和第二種細(xì)胞因子分別連接至重鏈和輕鏈的N端和C端；圖3E-3G顯示了其中的三種。
圖4A-4C圖解顯示第一種細(xì)胞因子和第二種細(xì)胞因子如何與“單鏈”抗體融合，其中所述抗體的可變區(qū)輕鏈和可變區(qū)重鏈融合，并且所述蛋白以單一多肽表達(dá)，然后同源二聚體化。具體地說，多細(xì)胞因子融合蛋白可位于C端(圖4A)或N端(圖4B)。另外，第一種細(xì)胞因子和第二種細(xì)胞因子不需要直接連接，而可通過單鏈抗體部分連接(圖4C)。
圖5A-5C圖解顯示第一種細(xì)胞因子和第二種細(xì)胞因子如何與單鏈Fv區(qū)(由重鏈和輕鏈的可變區(qū)融合組成)融合。具體地說，第一種細(xì)胞因子-細(xì)胞因子融合蛋白可位于C端(圖5A)或N端(圖5B)。另外，第一種細(xì)胞因子和第二種細(xì)胞因子不需要直接連接，而可通過單鏈Fv部分連接(圖5C)。
圖6A和6B顯示在單獨(dú)細(xì)胞因子或融合蛋白作用下，IL-12和IL-2誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生IFN-γ的協(xié)同作用。在圖6A中，在植物凝集素活化之前(方形)或之后(X形)用人IL-12處理細(xì)胞，或在植物凝集素活化之前(菱形)或之后(三角形)用IL-12-IL-2融合蛋白處理細(xì)胞。圖6B顯示其中細(xì)胞以1∶1摩爾比加入IL-12和IL-2的混合物(黑色菱形)、人Fc-IL-12-IL-2融合蛋白(灰色方塊)和人抗體-IL-12-IL-2融合蛋白(淺灰三角)處理的實(shí)驗(yàn)。X軸表示IL-12的濃度(pg/ml)，無論其是以完整蛋白存在還是以融合蛋白存在。y軸表示應(yīng)用ELISA測定的IFN-γ濃度(ng/ml)。
圖7顯示了分別檢測融合蛋白活性并比較其與非融合IL-12分子活性的典型IL-12生物測定。所描述的是小鼠IL-12(空白圓圈)、小鼠IL-12與以1∶1摩爾比加入的IL-2的混合物(黑色方塊)、小鼠IL-2(空白三角形)和抗體-小鼠IL-12-IL-2融合蛋白(黑色菱形)對人PBMC的3H-胸苷攝取的刺激作用。X軸表示單體細(xì)胞因子的濃度(pM)，無論其是以完整蛋白存在還是以融合蛋白存在；y軸表示摻入氚化胸苷的cpm。
圖8顯示標(biāo)準(zhǔn)的IL-2生物活性測定。曲線圖顯示小鼠IL-2(圓圈)、抗體-小鼠IL-12-IL-2融合蛋白(菱形)和小鼠IL-12(方塊)對小鼠CTLL細(xì)胞增殖的刺激作用。X軸表示單體細(xì)胞因子的濃度(pM)，無論其是以完整蛋白存在還是以融合蛋白存在。在含各種量的細(xì)胞因子或融合蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)，然后使用MTT/MTS測定檢測活細(xì)胞數(shù)。y軸表示490nm吸光度的光密度(OD)單位。
圖9顯示了小鼠IL-12(空白圓圈)、小鼠IL-12與以1∶1摩爾比加入的IL-2的混合物(黑色圓圈)、小鼠Fc-單鏈IL-12-IL-2融合蛋白(黑色三角形)和融合小鼠IL-2的小鼠單鏈IL-12(黑色菱形)對人PBMC的3H-胸苷攝取的刺激作用。x軸表示單體細(xì)胞因子的濃度(pM)，無論其是以完整蛋白存在還是以融合蛋白存在；y軸表示摻入氚化胸苷的cpm。
圖10顯示了小鼠IL-12(空白圓圈)、小鼠IL-12與以1∶1摩爾比加入的GM-CSF的混合物(黑色圓圈)、小鼠GM-CSF(黑色三角形)和小鼠Fc-小鼠IL-12-GM-CSF融合蛋白(X形)對人PBMC的3H-胸苷攝取的刺激作用。x軸表示單體細(xì)胞因子的濃度(pM)，無論其是以完整蛋白存在還是以融合蛋白存在；y軸表示摻入氚化胸苷的cpm。
圖11顯示抗體-細(xì)胞因子-細(xì)胞因子融合蛋白治療帶有皮下腫瘤的Balb/C小鼠的功效，所述皮下腫瘤由工程為表達(dá)人EpCAM(KS-1/4抗原)的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生。黑色菱形表示在第0、1、2、3和4天注射PBS對照的小鼠腫瘤平均體積。三角形表示用6μg KS-IL-12-IL-2治療的小鼠中的平均腫瘤體積。正方形表示用3.4μg KS-IL2和5.3μgKS-IL12治療的小鼠中的平均腫瘤體積。進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射。x軸表示首次注射后經(jīng)過的天數(shù)；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖12.顯示抗體-細(xì)胞因子-細(xì)胞因子融合蛋白治療帶有皮下腫瘤的SCID小鼠的功效，所述皮下腫瘤由工程為表達(dá)人EpCAM的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生。菱形表示在第0、1、2、3和4天注射PBS對照的小鼠中的平均腫瘤體積。三角形表示用6μg KS-IL-12-IL-2治療的小鼠中的平均腫瘤體積。正方形表示用3.4μg KS-IL2和5.3μg KS-IL12治療的小鼠中的平均腫瘤體積。進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射。x軸表示首次注射后經(jīng)過的天數(shù)；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖13顯示抗體-細(xì)胞因子和抗體-細(xì)胞因子-細(xì)胞因子融合蛋白治療帶有皮下腫瘤的小鼠的功效，所述皮下腫瘤由工程為表達(dá)人EpCAM的Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞產(chǎn)生。菱形表示在第0、1、2、3和4天腫瘤內(nèi)注射PBS對照的小鼠中的平均腫瘤體積。正方形表示在第0、1、2、3和4天腫瘤內(nèi)注射20μg KS-IL2的小鼠中的平均腫瘤體積。三角形表示在第0、1、2、3和4天腫瘤內(nèi)注射20μg KS-IL12的小鼠中的平均腫瘤體積。X形表示在第0、1、2、3和4天腫瘤內(nèi)注射20μg KS-IL-12-IL-2的小鼠中的平均腫瘤體積。x軸表示首次注射后經(jīng)過的天數(shù)；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖14顯示抗體-細(xì)胞因子-細(xì)胞因子融合蛋白對帶有皮下腫瘤的小鼠的治療功效，所述皮下腫瘤由工程為表達(dá)人EpCAM的Lewis肺癌細(xì)胞產(chǎn)生。菱形表示在第0、1、2、3和4天注射PBS對照的小鼠中的平均腫瘤體積。三角形表示用20μg KS-IL-12-IL-2治療的小鼠中的平均腫瘤體積。正方形表示用11.5μg KS-IL2和18μg KS-IL12治療的小鼠中的平均腫瘤體積。進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射。x軸表示首次注射后經(jīng)過的天數(shù)；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖15顯示抗體-細(xì)胞因子-細(xì)胞因子融合蛋白對帶有皮下腫瘤的小鼠的治療作用，所述皮下腫瘤由表達(dá)或不表達(dá)人EpCAM的Lewis肺癌細(xì)胞產(chǎn)生。黑色正方形表示帶有LLC-KSA衍生腫瘤的小鼠中的平均腫瘤體積。黑色菱形表示帶有LLC衍生腫瘤的小鼠中的平均腫瘤體積。在第0、1、2、3和4天用20μg KS-IL12-IL2治療小鼠。進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射。x軸表示首次注射后經(jīng)過的天數(shù)；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖16顯示抗體-細(xì)胞因子-細(xì)胞因子融合蛋白對帶有皮下腫瘤的小鼠的治療功效，所述皮下腫瘤由Lewis肺癌細(xì)胞產(chǎn)生。在第0天皮下注射約106細(xì)胞。菱形表示原初小鼠的平均腫瘤體積。正方形表示先前帶有Lewis肺癌細(xì)胞(工程為表達(dá)人EpCAM)產(chǎn)生的皮下腫瘤但已被KS-IL12-IL2治愈的小鼠中的平均腫瘤體積。x軸表示首次注射后經(jīng)過的天數(shù)；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖17A和17B顯示腫瘤細(xì)胞分泌的單一細(xì)胞因子蛋白或多細(xì)胞因子蛋白對該細(xì)胞在免疫系統(tǒng)正常的動物中形成腫瘤能力的作用。在圖17A中，比較4組小鼠皮下注射1×106LLC腫瘤細(xì)胞的C57BL/6小鼠(黑色菱形)；皮下注射5×106LLC腫瘤細(xì)胞的C57BL/6小鼠(白色菱形)；皮下注射1×106表達(dá)scIL-12的LLC腫瘤細(xì)胞的C57BL/6小鼠(黑色三角形)；以及皮下注射5×106表達(dá)scIL-12的LLC腫瘤細(xì)胞的C57BL/6小鼠(白色三角形)。圖17B比較了皮下注射1×106LLC腫瘤細(xì)胞的C57BL/6小鼠(黑色菱形)；皮下注射5×106LLC腫瘤細(xì)胞的C57BL/6小鼠(白色菱形)；皮下注射1×106表達(dá)scIL-12-IL-2的LLC腫瘤細(xì)胞的C57BL/6小鼠(X形)；以及皮下注射5×106表達(dá)scIL-12的LLC腫瘤細(xì)胞的C57BL/6小鼠(白色圓圈)。x軸表示注射所述腫瘤細(xì)胞后的天數(shù)。y軸表示腫瘤體積(mm3)。
圖18顯示腫瘤細(xì)胞分泌的單一細(xì)胞因子蛋白或多細(xì)胞因子蛋白對該細(xì)胞在免疫缺陷型動物中形成腫瘤能力的作用。該圖比較了皮下注射1×106LLC腫瘤細(xì)胞的SCID小鼠(黑色菱形)；皮下注射1×106表達(dá)scIL-12的LLC腫瘤細(xì)胞的SCD小鼠(黑色三角形)；以及皮下注射1×106表達(dá)scIL-12的LLC腫瘤細(xì)胞的SCID小鼠(白色圓圈)。x軸表示注射所述腫瘤細(xì)胞后的天數(shù)。y軸表示腫瘤體積(mm3)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供其中兩種或多種不同的細(xì)胞因子融合或復(fù)合的蛋白分子。所述蛋白復(fù)合物或融合蛋白可選地包括其它的蛋白部分，包括具有多聚體化和靶向能力的部分，例如抗體Fc區(qū)和包括抗原結(jié)合部位的抗體區(qū)。本發(fā)明還提供編碼多細(xì)胞因子融合蛋白的核酸。本發(fā)明還提供構(gòu)建多細(xì)胞因子融合蛋白編碼核酸的方法、產(chǎn)生多細(xì)胞因子融合蛋白的方法以及使用多細(xì)胞因子融合蛋白治療疾病和病癥的方法。
本文使用的“細(xì)胞因子”是指調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細(xì)胞活性的分泌性蛋白或其活性片段或突變體。細(xì)胞因子的實(shí)例包括白介素、干擾素、趨化因子、腫瘤壞死因子、免疫細(xì)胞前體的集落刺激因子等。
本文使用的“異源二聚體細(xì)胞因子”是指由兩種不同蛋白亞單位組成的細(xì)胞因子。IL-12是目前唯一已知的天然異源二聚體細(xì)胞因子。但是，可構(gòu)建人工異源二聚體細(xì)胞因子。例如，IL-6和IL-6R可溶性片段可組合形成異源二聚體細(xì)胞因子，CNTF和CNTF-Rα同樣可以構(gòu)建異源二聚體[Trinchieri(1994)Blood 844008]。
本文使用的“白介素-12”(IL-12)是指由p35和p40亞單位組成的兩個(gè)亞單位細(xì)胞因子，或p35和p40的活性單鏈融合物，或其種變異體、片段或衍生物。
本文使用的“白介素-2”(IL-2)是指任何哺乳動物IL-2，如人IL-2、小鼠IL-2或其活性種變異體或等位基因變異體、片段或衍生物。
本文使用的“GM-CSF”是指哺乳動物粒細(xì)胞/單核細(xì)胞-集落刺激因子細(xì)胞因子蛋白，如人GM-CSF、小鼠GM-CSF或其活性種變異體或等位基因變異體、片段或衍生物。
本文使用的“免疫球蛋白Fc區(qū)”是指免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的羧基端部分，或其類似物或部分。例如，IgG的免疫球蛋白Fc區(qū)可包含至少一部分鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包括至少一部分鉸鏈區(qū)和CH3結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包括至少CH2結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選還包括至少一部分鉸鏈區(qū)。
本文使用的“肽接頭”是指用于將兩種蛋白(例如一個(gè)蛋白和一個(gè)Fc區(qū))偶聯(lián)在一起的一個(gè)或多個(gè)肽。所述肽接頭經(jīng)常是一系列氨基酸，例如主要為甘氨酸和/或絲氨酸。所述肽接頭最好是主要為甘氨酸和絲氨酸殘基的混合系列，約10-15個(gè)氨基酸長度。
本文使用的術(shù)語“多聚(的)”是指兩個(gè)或多個(gè)蛋白亞單位通過共價(jià)或非共價(jià)作用(例如二硫鍵連接)穩(wěn)定結(jié)合。
本文使用的術(shù)語“二聚(的)”是指其中兩個(gè)蛋白亞單位通過共價(jià)或非共價(jià)作用穩(wěn)定結(jié)合的特定多聚分子。一種穩(wěn)定復(fù)合物是解離速率至少幾分鐘的復(fù)合物，使得所述復(fù)合物在體內(nèi)使用時(shí)穩(wěn)定足夠長時(shí)間，以到達(dá)靶組織并具有生物效應(yīng)。Fc片段自身通常形成重鏈片段二聚體，所述重鏈片段包含一部分鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和/或CH3結(jié)構(gòu)域。然而，已知許多蛋白配體結(jié)合其二聚體受體。如果細(xì)胞因子X天然二聚化，則Fc-X分子中的X部分高得多的程度上二聚化，因?yàn)槎垠w化過程是濃度依賴性的。由Fc連接的兩種X部分的物理接近使二聚體化成為分子內(nèi)過程，將平衡向有利于二聚體化的方向大幅移動，并增強(qiáng)了其與受體的結(jié)合。
本文使用的“載體”是指包含核苷酸序列的任何核酸，它能夠摻入到宿主細(xì)胞中并與宿主細(xì)胞基因組重組和整合入其中，或能夠作為附加體自主復(fù)制。這樣的載體包括線性核酸、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、RNA載體、病毒載體等。病毒載體的非限制性實(shí)例包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。
本文使用的“基因表達(dá)”或“蛋白表達(dá)”是指DNA序列的轉(zhuǎn)錄、mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯以及蛋白產(chǎn)物的分泌或可分離形式的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生。
本文使用的“免疫細(xì)胞因子”是如美國專利第5,650,150號公開的包含抗體和細(xì)胞因子的融合蛋白。
本文使用的“前導(dǎo)序列”是這樣一種蛋白序列它通常在N端與第二種蛋白序列連接，并引導(dǎo)細(xì)胞分泌第二種蛋白序列。前導(dǎo)序列通常由第二種蛋白序列中切除，使所述蛋白成為成熟蛋白。術(shù)語“前導(dǎo)序列”一般與“信號序列”同義。
本文使用的“EpCAM”代表上皮細(xì)胞粘附分子(Cirulli等1401519-1534)，與“KSA”同義，是指單克隆抗體KS-1/4結(jié)合的抗原。EpCAM是一種在上皮細(xì)胞衍生的癌細(xì)胞上豐富表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白。
本文使用的“KS-1/4”是指結(jié)合EpCAM的特定單克隆抗體。
本文使用的“KS-IL2”、“KS-IL12”和“KS-IL12-IL2”等是指分別由KS-1/4與IL-2、KS-1/4與IL-12以及KS-1/4與IL-12和IL-2二者組成的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白。本文還使用類似名稱的融合蛋白構(gòu)建物。因?yàn)榧?xì)胞因子可能在幾個(gè)位置融合在抗體分子上，所以諸如“KS-IL12-IL2”的描述是指包含在任何可能的位置與IL-12和IL-2二者融合的KS-1/4的蛋白類型，除非另外明確說明。
本文使用的“14.18”是指結(jié)合腫瘤特異性抗原GD2的特定單克隆抗體。
在圖1-5中舉例說明了數(shù)個(gè)體現(xiàn)本發(fā)明的說明性蛋白構(gòu)建物實(shí)施方案。圖2-5圖示的分子組成部分標(biāo)記為1A-1I，是指圖1A-1I所示的融合蛋白，說明圖1的任何融合蛋白均可進(jìn)一步融合至所示的其它蛋白。細(xì)胞因子以矩形表示，抗體恒定區(qū)以卵形表示，而重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以標(biāo)記卵形表示。
本發(fā)明描述了包含兩種不同細(xì)胞因子和可選地包括另外的蛋白部分的蛋白復(fù)合物。同源二聚體細(xì)胞因子(例如α干擾素、β干擾素、γ干擾素、IL-5、IL-8等)盡管含有多個(gè)亞單位，但仍然是單個(gè)細(xì)胞因子。同樣，異源二聚體細(xì)胞因子如IL-12盡管含有不同的亞單位，但也是單個(gè)細(xì)胞因子。而且，正常同源二聚體細(xì)胞因子的異源二聚體形式(如MCP-1/MCP-2異源二聚體)或正常同源二聚體細(xì)胞因子的兩種等位基因的異源二聚體(例如Zhang，J.Biol.Chem.26915918-24)，也是單一細(xì)胞因子。本發(fā)明的復(fù)合物包含兩種不同的細(xì)胞因子，其中每種細(xì)胞因子(例如IL-2和IL-12；IL-4和GM-CSF；MCP-1和eotaxin等)都能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的活性。
圖1A描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案在融合蛋白10中，第一種細(xì)胞因子12的C端可選地通過連接區(qū)(未顯示)融合至第二種細(xì)胞因子14的N端。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白復(fù)合物包含至少兩種血清半衰期顯著不同的細(xì)胞因子。例如，使用小蛋白和大蛋白通常導(dǎo)致融合蛋白具有較大蛋白的循環(huán)半衰期特征。因此，在需要IL-12和第二種細(xì)胞因子的聯(lián)合作用的情況下，優(yōu)選將兩種細(xì)胞因子表達(dá)為以下通式的融合蛋白IL-12-X或X-IL-12，其中X為第二種細(xì)胞因子。觀察到兩種特別的優(yōu)勢。首先，更快被清除的細(xì)胞因子的血清半衰期延長。第二，兩種細(xì)胞因子的血清半衰期互相之間變得非常相似。
諸如IL-12的雙鏈細(xì)胞因子可在其任一條鏈的N端或C端與另一個(gè)細(xì)胞因子融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種細(xì)胞因子融合在IL-12的p35或p40亞單位的N端或C端(圖1B-1E)。在圖1B的融合蛋白16中，第一種細(xì)胞因子12的N端融合至IL-12亞單位p40 18的C端。亞單位p40 18通過共價(jià)鍵22與IL-12亞單位p35 20連接。在圖1C的融合蛋白24中，p40亞單位18的N端融合至第一種細(xì)胞因子12的C端，并通過共價(jià)鍵22與p35亞單位20連接。圖1D描述了其中第一種細(xì)胞因子12的N端融合至p35亞單位20的C端的融合蛋白26，p35亞單位20通過共價(jià)鍵22與p40亞單位18連接。在圖1E中，融合蛋白28包括p35亞單位20，其N端融合第一種細(xì)胞因子12的C端，并通過共價(jià)鍵22與p40亞單位18連接。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，IL-12亞單位可融合形成單鏈蛋白scIL-12，處于N端部位的或者為p35亞單位或者為p40亞單位；第二種細(xì)胞因子可結(jié)合至產(chǎn)生的scIL-12的N端或C端(圖1F-1I)。因此，在圖1F描述的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，融合蛋白30包含單鏈IL-12，其中p40亞單位18的N端可選地通過肽接頭融合至p35亞單位20的C端。在該實(shí)施方案中，細(xì)胞因子12的N端融合至p40亞單位18的C端。在圖1G顯示的實(shí)施方案中，p35亞單位20的N端可選地通過肽接頭融合至細(xì)胞因子12的C端。圖1H和1I顯示了包含另一種單鏈型IL-12的融合蛋白34和36，其中p35亞單位的N端可選地通過肽接頭融合至p40亞單位的C端。在圖1H顯示的融合蛋白34中，細(xì)胞因子12的N端融合至p35亞單位的C端。在圖1I顯示的融合蛋白36中，p40亞單位18的N端融合至細(xì)胞因子12的C端。在一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-12融合至IL-2。
在實(shí)施例中進(jìn)一步描述了這些分子的制備。
將異源多聚體分子如IL-12或抗體表達(dá)為其中不相同的亞單位通過短氨基酸接頭連接的單鏈分子通常是很方便的[Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.855879；Lieschke等(1997)Nat Biotechnol.1535；Lieschke；G.J.和Mulligan；R.C.，美國專利第5,891,680號]。構(gòu)建基因融合物，然后可以在包含單一重組DNA構(gòu)建物的細(xì)胞中表達(dá)需要的蛋白。這樣的單鏈型異源多聚體細(xì)胞因子可進(jìn)一步融合至第二種細(xì)胞因子，這仍然允許由單一重組DNA構(gòu)建物表達(dá)具有需要活性的融合蛋白。在實(shí)施例中描述了所述分子的表達(dá)。
本發(fā)明還描述了包含IL-4和GM-CSF的融合蛋白。該組合在功能性刺激樹突細(xì)胞提呈抗原方面特別有用。另一種有用的融合蛋白包含IL-12和IL-18。這些細(xì)胞因子都促進(jìn)Th1應(yīng)答，但互補(bǔ)活性稍有不同。
本發(fā)明還描述了其中多種不同的融合細(xì)胞因子進(jìn)一步融合至能夠形成多聚體(如同源二聚體或異源二聚體)的蛋白的融合蛋白。這種分子的優(yōu)勢在于二聚體化可增強(qiáng)一種或多種細(xì)胞因子的效力。在某些情況下，二聚化對效力的增強(qiáng)可能因?yàn)榧?xì)胞因子結(jié)合其二聚體受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，多種細(xì)胞因子融合至抗體分子的一部分，如Fc區(qū)(圖2)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，IL-12和第二種細(xì)胞因子融合至同源二聚化蛋白部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種細(xì)胞因子為IL-2或GM-CSF。所述融合蛋白可以各種方式產(chǎn)生，反映幾種不同蛋白部分由融合蛋白的N端至C端的所有不同排序。例如當(dāng)IL-12和第二種細(xì)胞因子融合至Fc區(qū)時(shí)，兩種細(xì)胞因子都可以任何順序融合至Fc區(qū)的N端或C端，或者一種細(xì)胞因子可融合在N端，而另一種細(xì)胞因子融合在C端。
在圖2描述了一些這樣的排列。例如，在圖2A所示的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白44融合至含有鉸鏈區(qū)38、CH2區(qū)40和CH3區(qū)42的Fc區(qū)的C端。融合蛋白44可具有各種結(jié)構(gòu)，包括例如圖1A-1I中描述的融合蛋白10、16、24、26、28、30、32、34或36的結(jié)構(gòu)。如果融合蛋白44如同融合蛋白16、24、26和28一樣具有一個(gè)以上的N端和C端，則Fc區(qū)可融合至融合蛋白44的任一個(gè)N端。如圖2B所示，融合蛋白44可融合至Fc區(qū)的N端。在圖2C所示的實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞因子12可融合至Fc區(qū)的N端，而第二種細(xì)胞因子14可融合至Fc區(qū)的C端。結(jié)構(gòu)設(shè)想要著重指出的是，細(xì)胞因子作為一類蛋白質(zhì)，在大小和一般折疊特性上是相似的。因此，本文公開的具體實(shí)施例描述了如何構(gòu)建細(xì)胞因子蛋白家族的多細(xì)胞因子融合蛋白。例如，許多細(xì)胞因子屬于稱為“四螺旋束”的蛋白折疊類型。四螺旋束蛋白包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、生長激素、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、苗條蛋白、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素5(IL-5)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、IL-2、IL-4、白介素3(IL-3)、IL-10、β干擾素、α干擾素和密切相關(guān)的τ干擾素以及γ干擾素(IFN-γ)。
除了IL-5和IFN-γ以外，所有這些蛋白都折疊為具有四個(gè)大致平行的α螺旋和兩個(gè)交叉連接的單體。在除了IL-5和IFN-γ以外的每種情況下，N端和C端都在所述蛋白的同一面。因?yàn)镮L-5和IFN-γ以外的四螺旋束蛋白都具有相同的折疊模式，本文描述的用于IL-2、IL-4和GM-CSF的方法也適用于其它四螺旋束蛋白和其它的折疊為單體的細(xì)胞因子小蛋白。
趨化因子是一類特殊的細(xì)胞因子，人們認(rèn)為其形成胞外梯度和介導(dǎo)特定類型免疫細(xì)胞的趨化性。例如，MCP-1是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和活化T細(xì)胞的化學(xué)引誘物；eotaxin是嗜酸性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘物；而IL-8是嗜中性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘物。趨化因子除了其化學(xué)引誘物功能以外，同其它細(xì)胞因子一樣，也能夠誘導(dǎo)特定基因在特定的靶細(xì)胞中表達(dá)。例如，認(rèn)為MCP-1在血管平滑肌細(xì)胞中誘導(dǎo)組織因子表達(dá)(Schecter等，J Biol Chem.27228568-73)。
本發(fā)明公開了其中一種或多種細(xì)胞因子為趨化因子的細(xì)胞因子-細(xì)胞因子融合蛋白和抗體-細(xì)胞因子-細(xì)胞因子融合蛋白。本發(fā)明還公開了具有三種或三種以上的細(xì)胞因子的蛋白構(gòu)建物，其中一種或多種細(xì)胞因子為趨化因子。例如，趨化因子IP-10、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、巨噬細(xì)胞趨化蛋白、eotaxin、淋巴趨化因子(lymphotactin)、BLC可融合至有或沒有其它部分(如抗體部分)的第二種細(xì)胞因子。
例如人基因組編碼至少50個(gè)趨化因子。已知的趨化因子一般具有相似的三維單體結(jié)構(gòu)和蛋白折疊模式。因此，本文公開的一般類型的蛋白構(gòu)建物和構(gòu)建策略可適用于各種已知的趨化因子和迄今尚未發(fā)現(xiàn)的趨化因子。
趨化因子具有一種獨(dú)特的含三個(gè)β鏈和一個(gè)α螺旋的折疊模式。在某些但不是所有情況下，趨化因子折疊為單體，然后在折疊后二聚化。對于所有的趨化因子，單體亞單位的折疊模式相同，整體結(jié)構(gòu)極其相似。例如，IL-8、血小板因子4、黑素瘤生長刺激因子(MGSA)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白、MIP、RANTES(受激活作用調(diào)節(jié)的正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的蛋白)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1、MCAF)、Eotaxin、單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)、fractalkine趨化因子結(jié)構(gòu)域、嗜中性白細(xì)胞活化肽-2(NAP-2)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2、趨化因子hcc-2(巨噬細(xì)胞炎性蛋白-5)、Groβ、細(xì)胞因子誘導(dǎo)性嗜中性白細(xì)胞化學(xué)引誘物和CINC/Gro的三維結(jié)構(gòu)已通過X射線晶體學(xué)和/或NMR方法測定；所有這些結(jié)構(gòu)都顯示相同的折疊和廣泛的相似。因?yàn)橼吇蜃泳哂邢嗤恼郫B模式，所以本文描述的用于淋巴趨化因子的方法也適用于其它趨化因子蛋白。
趨化因子的自由N端對其功能通常很重要。因此，在某些實(shí)施方案中可優(yōu)選構(gòu)建其中第二種細(xì)胞因子、抗體部分或其它蛋白部分與趨化因子C端融合的融合蛋白。為了構(gòu)建含有兩種活性趨化因子的蛋白復(fù)合物，例如將兩種不同趨化因子融合至抗體重鏈和輕鏈的N端是有效的。某些趨化因子如IL-8在生理?xiàng)l件下為二聚體。對于某些用途，有效的作法是共表達(dá)多細(xì)胞因子抗體融合蛋白(如IL-8-抗體-細(xì)胞因子融合蛋白)以及未融合的IL-8部分或具有不與抗體部分相互作用的不同融合配偶體的IL-8部分。因此，不同的IL-8部分可異源二聚化而沒有在所有的IL-8部分都融合至抗體鏈時(shí)可能導(dǎo)致的空間約束或多聚化。然后可根據(jù)大小或根據(jù)與抗體結(jié)合蛋白(如葡萄球菌A蛋白)的結(jié)合分離需要的多細(xì)胞因子融合蛋白。
對于含有趨化因子的多細(xì)胞因子融合蛋白，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案為所述融合蛋白還包含定位功能，如結(jié)合抗原的抗體部分。盡管希望不受理論的束縛，但是一般認(rèn)為趨化因子在體內(nèi)的廣泛分布將失去作用或?qū)е录?xì)胞對所述趨化因子全面脫敏。另外，認(rèn)為趨化因子的化學(xué)引誘物功能僅可以在所述趨化因子存在濃度差時(shí)才能表現(xiàn)出來。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是淋巴因子-抗體-IL-2融合蛋白。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是其中趨化因子和第二種細(xì)胞因子都促進(jìn)Th1應(yīng)答的融合蛋白。例如，含有IP-10和IL-12的融合蛋白是一個(gè)高度優(yōu)選的單獨(dú)的Fc區(qū)或作為完整抗體組成部分的Fc區(qū)，可以賦予多細(xì)胞因子融合蛋白幾種特性，這些特性可能是有利的或是不利的，取決于具體的用途。這些特性包括二聚體化、延長血清半衰期、結(jié)合補(bǔ)體的能力、介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的能力以及與Fc受體結(jié)合。如果血清半衰期延長是主要需要的特征，并且Fc區(qū)的免疫特性是不重要或不需要的，則優(yōu)選使用缺乏一種或多種免疫特性的Fc區(qū)天然變異體或突變體。例如，如果需要均等或延長兩種或多種血清半衰期短的細(xì)胞因子的血清半衰期，則優(yōu)選構(gòu)建含有人IgG2或IgG4的Fc區(qū)的多細(xì)胞因子融合蛋白，所述人IgG2或IgG4的Fc區(qū)各自對Fc受體的親和力降低或消失，或者優(yōu)選使用在Fc受體結(jié)合位點(diǎn)具有突變的Fc區(qū)。實(shí)際上，已經(jīng)表明某些細(xì)胞因子與抗體的融合蛋白增加了所述融合蛋白對Fc受體的親和性，導(dǎo)致其在動物體內(nèi)的清除速率更快。使用對Fc受體親和力降低的Fc區(qū)極大改善這些分子的血清半衰期(Gillies等Cancer Res.592159-2166)。在某些情況下并取決于所使用的細(xì)胞因子，結(jié)合Fc受體的Fc區(qū)導(dǎo)致多細(xì)胞因子融合蛋白內(nèi)化和一種或多種細(xì)胞因子部分的降解。靶向本發(fā)明還描述了其中兩種或多種細(xì)胞因子連接到能夠?qū)⑺黾?xì)胞因子定位到特定靶分子、細(xì)胞或機(jī)體部位的蛋白的融合蛋白。優(yōu)選的具有定位能力的分子為抗體或含有抗原結(jié)合可變區(qū)的抗體部分。然而，可以使用其它定位分子或其結(jié)構(gòu)域，諸如特異性配體或受體、天然存在的結(jié)合蛋白、結(jié)合特定底物的酶、經(jīng)選擇特定結(jié)合或定位能力的人工制備肽、具有產(chǎn)生靶向能力的特殊物理-化學(xué)特性的肽、因?yàn)榕c另一個(gè)靶向分子結(jié)合而具有靶向能力的蛋白或其它類型的蛋白。在融合兩種細(xì)胞因子至靶向分子的情況下，優(yōu)選的第一種細(xì)胞因子為IL-12。當(dāng)使用IL-12時(shí)，優(yōu)選的第二種細(xì)胞因子為IL-2或GM-CSF。
在使用抗體的情況下，存在無數(shù)可將兩種或多種細(xì)胞因子融合的方式，因?yàn)榇嬖谌舾煽赡艿倪B接部位。例如，IgG抗體由兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈組成。兩種細(xì)胞因子可互相融合，然后融合至重鏈或輕鏈中任一條鏈的N端或C端?；蛘?，每種細(xì)胞因子可分別融合至所述抗體分子上的一個(gè)N端或C端。
圖3描述了一部分可將兩種細(xì)胞因子融合至抗體分子的方法。例如，參照圖3A，本發(fā)明的融合蛋白44可融合至免疫球蛋白重鏈46的C端，而免疫球蛋白重鏈46與免疫球蛋白輕鏈48相連。如圖2所示，融合蛋白44可具有許許多多的結(jié)構(gòu)，包括例如圖1A-1I中描述的融合蛋白10、16、24、26、28、30、32、34或36的結(jié)構(gòu)。如圖3B所示，融合蛋白44可融合至與免疫球蛋白輕鏈48相連的免疫球蛋白重鏈46的N端。在圖3C和3D顯示的實(shí)施方案中，融合蛋白44融合至與免疫球蛋白重鏈46相連的免疫球蛋白輕鏈48的N端(圖3C)或C端(圖3D)。如圖3E和3F所示，第一種細(xì)胞因子12可融合至免疫球蛋白輕鏈48，而免疫球蛋白輕鏈48與融合第二種細(xì)胞因子14的免疫球蛋白重鏈46相連。細(xì)胞因子12和14可融合至免疫球蛋白鏈的N端(圖3E)或C端(圖3F)?；蛘?，如圖3G所示，第一種細(xì)胞因子12可融合至免疫球蛋白輕鏈48的N端，而第二種細(xì)胞因子14融合至免疫球蛋白重鏈46的C端。與單鏈抗體融合將抗體表達(dá)為單鏈抗體有時(shí)是非常適合的。本發(fā)明還提供其中兩種或多種細(xì)胞因子融合至單鏈抗體的融合蛋白。其優(yōu)勢是在表達(dá)特別用于基因治療的需要的融合蛋白時(shí)減少了使用的DNA構(gòu)建物數(shù)。具體地說，如果所述細(xì)胞因子為單鏈分子，則其與單鏈抗體的融合將允許所述融合蛋白以單一蛋白鏈表達(dá)。
如圖4A-4C所示，在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子可融合至單鏈抗體的N端、C端或兩端。例如，如圖4A所示，融合蛋白44可融合至具有輕鏈可變區(qū)52和重鏈可變區(qū)54的單鏈抗體50的C端。如圖4B所示，融合蛋白44也可融合至單鏈抗體50的N端。在圖4C顯示的實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞因子12融合至單鏈抗體50的N端，而第二種細(xì)胞因子融合至單鏈抗體50的C端。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包含IL-12和第二種細(xì)胞因子與單鏈抗體的融合蛋白。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案包含作為第二種細(xì)胞因子的IL-2或GM-CSF。
抗體的恒定區(qū)具有介導(dǎo)各種效應(yīng)子功能的潛能。例如，IgG1介導(dǎo)補(bǔ)體結(jié)合、ADCC和與Fc受體的結(jié)合。所述細(xì)胞因子融合的位置可改變抗體恒定區(qū)的效應(yīng)子功能，這在需要調(diào)節(jié)這些效應(yīng)子功能時(shí)是有用的。
在某些情況下，可能需要構(gòu)建兩種或多種細(xì)胞因子與具有抗體靶向區(qū)但不具有恒定區(qū)的部分的融合蛋白。這樣的融合蛋白小于完整抗體與兩種或多種細(xì)胞因子的融合蛋白，這可能在某些用途上具有優(yōu)勢。另外，這樣的融合蛋白缺少完整抗體的一種或多種效應(yīng)子功能，但仍保留抗體的靶向能力。
因此本發(fā)明的特征在于其中兩種或多種細(xì)胞因子融合至單鏈Fv區(qū)的融合蛋白。如圖5A-5C描述的實(shí)施方案所示，兩種細(xì)胞因子可融合至Fv區(qū)的N端或C端，或者一端融合一種細(xì)胞因子。例如，如圖5A所示，本發(fā)明的融合蛋白44可融合至含有免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)52和免疫球蛋白重鏈可變區(qū)54的單鏈Fv區(qū)的C端。融合蛋白44還可以融合至示于圖5B的Fv區(qū)的N端。如圖5C所示，第一種細(xì)胞因子12可融合至Fv區(qū)的N端，而第二種細(xì)胞因子14可融合至Fv區(qū)的C端。作為多細(xì)胞因子異源二聚體載體的抗體在某些情況下，需要構(gòu)建兩種或多種細(xì)胞因子的融合蛋白，其中對于兩種所述細(xì)胞因子而言，所述蛋白的同一末端是其活性必須的。例如，兩種不同的細(xì)胞因子的天然存在的N端對每種細(xì)胞因子的活性都可能是必不可少的。不可能構(gòu)建其中兩種細(xì)胞因子部分都有活性的單一多肽鏈融合蛋白。
抗體為由重鏈和輕鏈組成、通過二硫鍵共價(jià)連接的異源二聚體蛋白。如果需要構(gòu)建具有兩種細(xì)胞因子部分(都需要完整的非融合N端)的多細(xì)胞因子融合蛋白，最好將所述兩種細(xì)胞因子分別融合至抗體重鏈和輕鏈的N端(圖3E)。同樣地，如果需要構(gòu)建具有兩種細(xì)胞因子部分(都需要完整的非融合C端)的多細(xì)胞因子融合蛋白，最好將所述兩種細(xì)胞因子分別融合至抗體重鏈和輕鏈的C端(圖3F)。如果所述抗體僅用作以此方式連接兩種細(xì)胞因子的載體，則突變或去除所述抗體的那些具有其它免疫功能相關(guān)特性的部分可能有用。例如，可優(yōu)選使用Fab區(qū)作為載體，因?yàn)镕ab區(qū)保留了抗體的異源二聚體特征但缺少Fc區(qū)的功能特征。使用其中抗原結(jié)合部位無功能的抗體或抗體片段也可能有用。
多種細(xì)胞因子與抗體的融合蛋白兼有多種本發(fā)明的新特征。在抗體-多細(xì)胞因子融合蛋白中，所述細(xì)胞因子的血清半衰期均等或延長；兩種細(xì)胞因子的活性局限于靶，并避免了由于系統(tǒng)給予多種協(xié)同作用的細(xì)胞因子而產(chǎn)生的特別毒性作用；各細(xì)胞因子有效二聚化或多聚化；所述細(xì)胞因子不需要直接融合但可以融合至抗體分子重鏈和輕鏈上的不同部位。
在設(shè)計(jì)含有多種細(xì)胞因子和一種抗體的融合蛋白時(shí)，存在許多可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法區(qū)分的選擇和構(gòu)型。結(jié)構(gòu)性生物學(xué)設(shè)想也是有用的。例如，許多細(xì)胞因子屬于叫做4螺旋束的一類。這些結(jié)構(gòu)由4個(gè)α螺旋組成，并且N端和C端在同一鄰近位置。一般而言，細(xì)胞因子在N端和C端周圍的一面不用于結(jié)合細(xì)胞因子受體，所以任一端都可用于和抗體或第二種細(xì)胞因子融合。然而，有時(shí)由于空間原因難以直接將4螺旋束細(xì)胞因子的N端和C端融合至不同的部分。因此，當(dāng)需要將兩種不同的4螺旋束細(xì)胞因子融合至抗體時(shí)，有效作法是將每種細(xì)胞因子融合至所述抗體上的不同部位?；蛘?，如果必須構(gòu)建Ig鏈-細(xì)胞因子-細(xì)胞因子形式的多肽鏈，則可使用一種或多種柔性接頭克服空間問題。
還可能使用其它分泌性異源二聚體分子代替抗體來攜帶多種細(xì)胞因子。例如，可使用包括前列腺特異性抗原和與其復(fù)合的蛋白酶抑制劑的復(fù)合物、IgA重鏈和J鏈、TGF-β家族成員及其蝦紅素樣結(jié)合配偶體或IL-12。核酸本發(fā)明的特征還在于能夠表達(dá)上述每種類型蛋白的核酸。這些核酸包括含兩種或多種細(xì)胞因子的融合蛋白的編碼核酸、含兩種或多種細(xì)胞因子以及二聚體化結(jié)構(gòu)域(如Fc區(qū))的融合蛋白的編碼核酸、含兩種或多種融合至抗體的細(xì)胞因子的融合蛋白的編碼核酸以及含兩種或多種融合至Fc區(qū)的細(xì)胞因子的融合蛋白的編碼核酸。優(yōu)選形式的核酸為可在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白的DNA載體。對于含多條多肽鏈的融合蛋白，可使用一個(gè)以上的編碼核酸。或者，可將兩種或多種融合蛋白編碼序列置于單一核酸分子上。實(shí)施例描述了編碼多細(xì)胞因子的特征核酸的具體形式。
本發(fā)明的核酸特別用于表達(dá)多細(xì)胞因子融合蛋白，或用于產(chǎn)生這些蛋白或用于基因治療目的。
在實(shí)施例中描述了合成本發(fā)明有用實(shí)施方案的方法，以及用于測試其藥理學(xué)活性的測定。
本發(fā)明還提供藥用組合物及其用于治療和預(yù)防各種疾病(包括但不限于治療各種感染和癌癥)的方法，以及針對各種疾病的疫苗接種。
多細(xì)胞因子融合蛋白可用于治療細(xì)菌、寄生物、真菌或病毒感染，或者用于治療癌癥。例如，已知IL-12在許多類型的感染中具有保護(hù)作用，所述感染包括但不限于細(xì)菌單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)感染；寄生物鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、碩大利什曼原蟲(Leishmania major)和曼氏裂體吸蟲(Schistosomamansoni)感染；真菌白色念珠菌(Candida albicans)感染；以及病毒脈絡(luò)叢腦膜炎病毒和巨細(xì)胞病毒感染。因?yàn)榧?xì)胞因子一般聯(lián)合起作用，故使用含兩種或多種已知協(xié)同起作用的細(xì)胞因子常常是有用的。例如，因?yàn)镮L-2增強(qiáng)IL-12的作用，所以在治療細(xì)菌、寄生物、真菌和病毒感染性疾病時(shí)組合這些細(xì)胞因子是有用的。
治療感染性疾病的一個(gè)優(yōu)選方法是使用進(jìn)一步融合至靶向劑的多細(xì)胞因子融合蛋白，所述靶向劑將所述多種細(xì)胞因子靶向感染部位。以下描述各種靶向策略。
可使用固體、半固體或液體劑型的本發(fā)明藥用組合物，例如丸劑、膠囊劑、粉末劑、液體制劑、懸浮劑等，優(yōu)選適用于準(zhǔn)確劑量給予的單位劑型。所述組合物包括常規(guī)藥用載體或賦形劑，以及另外可包括其它醫(yī)療藥物、藥用劑、載體、佐劑等。這樣的賦形劑可包括其它蛋白，例如人血清白蛋白或血漿蛋白。制備所述劑型的實(shí)際方法是已知的，或者是對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的。要給予的組合物或制劑在任何情況下都含有一定量的活性組分，其量可有效在受治療患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)治療作用。
關(guān)于所述組合物的給予，可通過任何已接受的給予模式，以使所給予的藥物具有所述活性。這些給藥方法包括口服、胃腸外或局部給予以及其它的系統(tǒng)形式，注射是優(yōu)選的給予方法。
當(dāng)然，給予活性化合物的量取決于要治療的患者、病患的嚴(yán)重程度、給予方式和主治醫(yī)師的判斷。
如上所述，已經(jīng)研究了細(xì)胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF、IL-4和其它一些細(xì)胞因子在治療癌癥方面的作用。在某些情況下，使用多細(xì)胞因子融合蛋白治療癌癥是有利的，原因是給予較簡單、增加了一種組成細(xì)胞因子的血清半衰期和/或良好調(diào)節(jié)兩種細(xì)胞因子的相對活性。
治療癌癥的一個(gè)優(yōu)選方法是將細(xì)胞因子靶向特定的器官和組織，因此可集中細(xì)胞因子的功效，并可避免系統(tǒng)分布的副作用。例如，期望多種細(xì)胞因子和Fc區(qū)的融合蛋白集中于肝臟，這對于治療局限于肝臟的癌癥有利。一個(gè)更優(yōu)選的方法是使用進(jìn)一步融合至靶向劑(如抗體)的多細(xì)胞因子融合蛋白。具體地說，抗體KS-1/4和14.18針對腫瘤特異性抗原(Varki NM等，Cancer Res44681-7；Gillies等，Journal of Immunological Methods 125191；美國專利第4,975,369號和第5,650,150號)。當(dāng)使用抗體-多細(xì)胞因子融合蛋白時(shí)，常常需要分析腫瘤類型和選擇針對可能存在于所述類型腫瘤上的抗原的抗體。例如，可通過FACS分析、蛋白質(zhì)印跡、檢測腫瘤DNA或僅鑒定腫瘤細(xì)胞類型，特征鑒定腫瘤。這樣的腫瘤表征方法是腫瘤表征領(lǐng)域技術(shù)人員(如腫瘤學(xué)家和腫瘤生物學(xué)家)眾所周知的。還可通過多種其它方法靶向多細(xì)胞因子融合蛋白，如與特異性配體或受體部分融合、與具有預(yù)先選定的結(jié)合活性的肽適體融合、與具有定位特性的小分子化學(xué)結(jié)合等等。這些靶向方法還可用于治療其它疾病，如感染。通過基因療法治療癌癥和其它細(xì)胞疾病本發(fā)明的核酸可用作治療癌癥和其它需要將免疫系統(tǒng)靶向特殊細(xì)胞類型的疾病的基因治療藥物。例如，由人或動物中取出癌細(xì)胞，將一種或多種編碼多細(xì)胞因子融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)染入癌細(xì)胞中，然后將癌細(xì)胞再導(dǎo)入人或動物體內(nèi)?；蛘呖蓪NA引入到癌細(xì)胞原位。人或動物隨后建立起針對癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，這可治愈或緩解癌癥?？赏ㄟ^眾多技術(shù)中的任一種，將偶合至在哺乳動物細(xì)胞中促進(jìn)表達(dá)的合適調(diào)節(jié)元件的多細(xì)胞因子基因融合物轉(zhuǎn)染入癌細(xì)胞中，所述方法包括磷酸鈣法、“基因槍”法、腺病毒載體轉(zhuǎn)染方法、陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染方法或任何其它有效的轉(zhuǎn)染方法。所述核酸可編碼進(jìn)一步融合至其它部分的多細(xì)胞因子融合蛋白。
采用表達(dá)一種以上融合細(xì)胞因子的融合蛋白的核酸進(jìn)行的抗癌基因治療可與其它癌癥治療組合進(jìn)行，如可增強(qiáng)融合細(xì)胞因子蛋白的免疫刺激特性的治療。例如，本發(fā)明的核酸還可以表達(dá)其它蛋白部分，這些蛋白部分可幫助激發(fā)針對癌細(xì)胞表達(dá)抗原的免疫應(yīng)答，或者可以與其它表達(dá)所述蛋白部分的核酸共轉(zhuǎn)染。具體地說，表達(dá)B7共刺激表面蛋白的核酸可共轉(zhuǎn)染入癌細(xì)胞中[Robinson等，美國專利第5,738,852號]。用表達(dá)多細(xì)胞因子融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞還可以與采用針對癌細(xì)胞的抗體或免疫細(xì)胞因子的治療同時(shí)進(jìn)行[Lode等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.952475]。用表達(dá)多細(xì)胞因子融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞還可以與采用血管發(fā)生阻斷劑的治療同時(shí)進(jìn)行[Lode等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.91591]。
采用其它免疫刺激物和/或血管發(fā)生阻斷劑的治療也可以與采用多細(xì)胞因子融合蛋白的系統(tǒng)治療組合進(jìn)行。與其它的免疫刺激物或血管發(fā)生阻斷劑共同治療的優(yōu)勢在于這些治療與DNA損傷劑和細(xì)胞周期阻斷劑不同，它們不殺死可能由于所述多細(xì)胞因子融合蛋白的刺激而正在分裂的免疫細(xì)胞。
所述基因療法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是將一種或多種編碼IL-12和第二種細(xì)胞因子的核酸引入到癌細(xì)胞中，然后再將所述癌細(xì)胞引入到人或動物中。第二種細(xì)胞因子優(yōu)選為IL-2或GM-CSF。
本發(fā)明提供新型疫苗組合物和輔助疫苗的方法，該方法使用兩種或多種已經(jīng)融合的細(xì)胞因子作為佐劑，用來在接種宿主哺乳動物中產(chǎn)生一種抗某些病原體的保護(hù)性細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答。例如，如果需要Th1型免疫應(yīng)答，則可以融合多種Th1促進(jìn)型細(xì)胞因子，并將獲得的融合蛋白與抗原一起給予動物。
具體地說，可融合IL-12和IL-2，并與抗原一同給予?；蛘?，可將IL-12和IL-2進(jìn)一步融合至抗原性蛋白自身，并用于刺激免疫應(yīng)答。在此情況下，本發(fā)明涉及依賴于宿主的細(xì)胞介導(dǎo)免疫的疫苗，即激發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和活化吞噬細(xì)胞，以提供抗特定病原體感染的保護(hù)。特別有用的是用含IL-12、IL-2和所述抗原的融合蛋白進(jìn)行疫苗接種，因?yàn)檫@種組合產(chǎn)生針對所述抗原的Th1應(yīng)答。在人類使用的常規(guī)佐劑，如明礬，常常用于誘導(dǎo)Th2應(yīng)答。
如果需要Th2型免疫應(yīng)答，則可使用Th2促進(jìn)型細(xì)胞因子的融合組合物。例如，可融合IL-4和IL-10以形成單一分子，獲得的融合蛋白用作佐劑。具體地說，如果需要在動物中募集樹突細(xì)胞，則可將IL-4和GM-CSF的融合組合物與促進(jìn)結(jié)合抗原提呈細(xì)胞的Fc區(qū)進(jìn)一步融合，或者與能夠?qū)⑺鋈诤霞?xì)胞因子導(dǎo)向靶組織(如腫瘤)的抗體進(jìn)一步融合。
本發(fā)明還提供新型治療組合物和用來提供與某些治療組合物的協(xié)同作用的輔助方法，所述治療組合物包括所謂的‘癌癥疫苗’，可以包括存在于癌細(xì)胞上的選定抗原。例如，可通過合適的途徑，將含兩種或多種融合細(xì)胞因子的蛋白連同適當(dāng)處理的癌細(xì)胞一起直接給予。
實(shí)施例實(shí)施例1構(gòu)建能夠表達(dá)細(xì)胞因子-細(xì)胞因子融合蛋白的基因融合物為制備有眾多細(xì)胞因子的多功能蛋白，合成IL-12 p40和IL-2基因融合物以及IL-12 p40和GM-CSF基因融合物。另外，將成熟小鼠p35的編碼序列(SEQ ID NO1)融合至允許高水平表達(dá)和有效分泌的啟動子序列和前導(dǎo)序列。小鼠p40-IL-2和p40-GM-CSF的編碼序列分別示于SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。還構(gòu)建了人p40-IL-2融合蛋白(SEQ ID NO4)。使用先前公開的表達(dá)質(zhì)粒(Lo等，ProteinEngineering 11495-500；Lo等，美國專利第5,726,087號)，構(gòu)建小鼠IgG2a Fc區(qū)與小鼠p35的融合物(SEQ ID NO5)以及人p35與人IgG1 Fc區(qū)的融合物(SEQ ID NO6)。
Gillies等人描述了成熟小鼠和人p35與KS-1/4抗體重鏈C端的融合蛋白(J.Immunology1606195-6203)。以相似的方式構(gòu)建了成熟小鼠和人p35與14.18抗體重鏈C端的融合蛋白(PCT國際公開號WO99/29732)。
本文討論的融合p40與IL-2以及融合p40與GM-CSF的策略類型一般可應(yīng)用于兩種或多細(xì)胞因子的融合蛋白。具體地說，大多數(shù)N端部分的編碼序列包含用于分泌的信號序列，而C端部分不需要信號序列。在某些情況下，可將短肽接頭編碼序列(優(yōu)選10-15個(gè)氨基酸長，富含甘氨酸和絲氨酸)置于兩種細(xì)胞因子的編碼序列之間。涉及制備所有所述類型的融合蛋白的DNA操作都在本領(lǐng)域的技術(shù)水平范圍內(nèi)。
例如，以下描述了構(gòu)建小鼠IL-12 p40亞單位與小鼠IL-2的融合蛋白的細(xì)節(jié)。通過PCR由伴刀豆球蛋白A(Concavalin A)活化的小鼠脾細(xì)胞(每ml培養(yǎng)基5μg伴刀豆球蛋白A，活化3天)克隆小鼠IL-12p40亞單位的全長cDNA。正向引物序列為AA GCT AGC ACC ATGTGT CCT CAG AAG CTA ACC(SEQ ID NO7)，其中NheI位點(diǎn)GCTAGC(SEQ ID NO7的殘基3-8)位于翻譯起始密碼子ATG的上游，而反向引物序列為CTC GAG CTA GGA TCG GAC CCT GCAGGG(SEQ ID NO8)，其中XhoI位點(diǎn)CTCGAG(SEQ ID NO8的殘基1-6)緊接著位于翻譯終止密碼子TAG(反密碼子為CTA)的下游。驗(yàn)證序列后，將含有mu-p40 cDNA及其天然前導(dǎo)序列的NheI-XhoI片段連接至XbaI-XhoI消化的表達(dá)載體pdCs[Lo等(1998)ProteinEngineering 11495-500]。限制位點(diǎn)NheI和XbaI具有匹配粘性末端，而NheI位點(diǎn)用于克隆mu-p40，因?yàn)閙u-p40具有內(nèi)部XbaI位點(diǎn)。
為了構(gòu)建mu-p40-muIL-2編碼DNA，使用寡核苷酸接頭經(jīng)由PstI位點(diǎn)(C TGC AG)連接mu-p40 DNA與含有成熟小鼠IL-2 cDNA的SmaI-XhoI片段。在所述融合蛋白連接處的DNA序列為C TGC AGGGTC CGA TCC CCG GGT AAA GCA CCC(SEQ ID NO9)，其中CTGC AG(SEQ ID NO9的殘基1-6)為PstI位點(diǎn)，C CCG GG(SEQ IDNO9的殘基15-20)為SmaI位點(diǎn)，TCC是小鼠p40的C端氨基酸殘基，而GCA是成熟小鼠IL-2的N端殘基。
通過用muGMCSF cDNA在SmaI位點(diǎn)置換muIL2 cDNA，由編碼以上的單鏈muIL12-muIL2的DNA構(gòu)建物獲得單鏈muIL12-muGMCSF編碼DNA。在單鏈muIL2和muGMCSF連接處的DNA序列為C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA AAA GCA(SEQ IDNO10)，其中C TGC AG(SEQ ID NO10的殘基1-6)為PstI位點(diǎn)，C CCG GG(SEQ ID NO10的殘基17-22)為SmaI位點(diǎn)，TCC是小鼠p40的C端氨基酸殘基，而GCA是成熟小鼠GMCSF的N端殘基。實(shí)施例2表達(dá)IL-12融合蛋白如下表達(dá)IL-12-IL-2融合蛋白。將不同組合的編碼p40融合蛋白的單個(gè)載體和編碼含p35的蛋白的載體共轉(zhuǎn)染入人293表皮癌細(xì)胞，以瞬時(shí)表達(dá)融合蛋白。使用制備型試劑盒(Wiazrd，Promega Inc.)純化DNA，乙醇沉淀以滅菌，并在無菌水中重懸浮。
為了表達(dá)生物活性IL-12融合蛋白異源二聚體，通過共轉(zhuǎn)染人293表皮癌細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)不同組合的編碼融合形式亞單位和非融合形式亞單位的單個(gè)載體。使用制備型試劑盒(Wiazrd，Promega Inc.)純化DNA，乙醇沉淀以滅菌，并在無菌水中重懸浮。使用10μg DNA/ml(當(dāng)共轉(zhuǎn)染兩個(gè)質(zhì)粒時(shí)質(zhì)粒DNA各5μg)通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備磷酸鈣沉淀，按0.5ml/板加入到在60mm平板中培養(yǎng)的約70％融合的293培養(yǎng)物中(Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis編著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。16小時(shí)后，去除含所述沉淀的培養(yǎng)基，代之以新鮮培養(yǎng)基。3天后，取出上清液，通過ELISA分析產(chǎn)生的轉(zhuǎn)染基因表達(dá)、生物測定IL-12活性或者對放射性標(biāo)記蛋白進(jìn)行免疫沉淀和SDS凝膠分析。為了標(biāo)記，在培養(yǎng)第2天使用無甲硫氨酸的培養(yǎng)基代替所述生長培養(yǎng)基，并加入35S-甲硫氨酸(100μCi/ml)。再溫育16小時(shí)后，收獲所述培養(yǎng)基，通過離心澄清(在臺式微型離心機(jī)中以13,000rpm離心5分鐘)并與A蛋白瓊脂糖珠(每ml培養(yǎng)上清液10μl珠量)溫育。于室溫1小時(shí)后，通過重復(fù)的離心和在含1％Nonidet-P40(NP-40)的PBS緩沖液中重懸浮清洗所述瓊脂糖珠。將最終的沉淀在含SDS的凝膠緩沖液中重懸浮，并煮沸2分鐘。離心去除瓊脂糖珠后將上清液分為兩等份。向1個(gè)樣品中加入還原劑(5％2-巰基乙醇)，將兩個(gè)樣品都煮沸5分鐘，然后上SDS聚丙烯酰胺凝膠。電泳后將所述凝膠對X射線膠片曝光(放射自顯影)。
使用以下的表達(dá)質(zhì)粒劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染mu.p35+mu.p40-IL-2、KS-1/4-mu.p35+mu.p40、KS-1/4-mu.p35+mu.p40-IL-2、14.18-mu.p35+mu.p40-IL-2、hu.Fc-.p35+hu.p40-IL-2、KS-1/4-hu.p35+hu.p40-IL-2和14.18-hu.p35+hu.p40-IL-2，其中“mu”是指小鼠蛋白，而“hu”是指人蛋白。
當(dāng)用35S-甲硫氨酸代謝標(biāo)記細(xì)胞并用還原性SDS凝膠電泳和放射自顯影檢測分泌性蛋白時(shí)，在每種情況下都觀察到高水平表達(dá)。根據(jù)組成蛋白的分子量預(yù)測的還原性融合蛋白的分子量如下IL-12p35，35kD；IL-12p40，40kD；IL-12，16kD；Fc，32kD；Ig重鏈，55kD；以及Ig輕鏈，28kD。觀測到的蛋白遷移約為預(yù)測的分子量。
還分離了表達(dá)多細(xì)胞因子融合蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。在異源二聚體構(gòu)建物情況下，編碼IL-12 p40-IL-2或IL-12 p40-GM-CSF融合蛋白的表達(dá)載體如早前對單獨(dú)的IL-12 p40亞單位所述(Gillies等J.Immunol.1606195-62030)。按照所述(Gillies等J.Immunol.1606195-62030)用編碼IL-12 p35亞單位、Fc-p35融合蛋白或抗體-p35融合蛋白的表達(dá)載體第二次轉(zhuǎn)染表達(dá)p40融合蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
收集表達(dá)人Fc-IL-12-IL-2(即表達(dá)KS-p35和p40-IL-2)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的上清液，按照生產(chǎn)商的方法(Repligen，Needham，MA)通過與A蛋白瓊脂糖結(jié)合并從其上洗脫，純化產(chǎn)物。通過ELISA測定純化蛋白中的IL-12和IL-2含量。結(jié)果顯示各種細(xì)胞因子含量在質(zhì)量上相差約4倍，與IL-12和IL-2的分子量相差4倍有關(guān)。同樣地，通過ELISA測定表達(dá)人KS-IL-12-IL-2的轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)物的IL-12和IL-2水平得到相似的IL-12和IL-2值。因此，在ELISA精度范圍內(nèi)，檢測值表示IL-12和IL-2以約1∶1摩爾比產(chǎn)生。用Fc或完整抗體制備的IL-12-GM-CSF融合蛋白獲得相同的結(jié)果。實(shí)施例3融合蛋白在IFN-γ誘導(dǎo)測定中的協(xié)同活性使用人類志愿者的靜止或促有絲分裂原活化的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)以IFN-γ誘導(dǎo)測定檢測IL-12-IL-2融合蛋白的生物活性(圖6)。通過ELISA檢測IFN-γ產(chǎn)生。
由健康志愿者獲得人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，通過Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度離心(1700rpm，20分鐘)純化。用無血清培養(yǎng)基(SF-RPMI)將含PBMC的“血沉棕黃”層稀釋至50ml體積，于1000rpm.離心5分鐘收集。梯度離心后，在有或沒有植物凝集素(PHA；10μg/ml)的情況下，在含10％胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-10)中以5×106細(xì)胞/ml的密度重懸浮細(xì)胞，并在濕潤的CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)3天。離心收集細(xì)胞，用等體積的SF-RPMI清洗三次，并在新鮮RPMI-10中重懸浮(1×106細(xì)胞/ml)。將等份溶液(100μl)分散入多個(gè)96孔平板的各孔中，每孔的最終細(xì)胞數(shù)為105個(gè)。在新鮮培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋培養(yǎng)基測試樣品，并加入到所述96孔平板的各孔中。對照孔加入IL-12(圖6A)或市售IL-2和IL-12的等摩爾混合物(圖6B；細(xì)胞因子購自R&D Systems)。在CO2溫育箱中于37℃溫育所述平板48小時(shí)，此時(shí)取出等份溶液(20μl)按照生產(chǎn)商的說明(Endogen，Inc.，Woburn，MA USA)通過ELISA分析IFN-γ濃度。
在圖6A中，比較人IL-12-IL-2融合蛋白和單獨(dú)的IL-12的活性。結(jié)果表明單獨(dú)的IL-12誘導(dǎo)中等水平的IFN-γ，而IL-12-IL-2融合蛋白強(qiáng)烈誘導(dǎo)IFN-γ合成。因?yàn)檫€已知IL-2不足以合成IFN-γ，所以這些結(jié)果表明IL-12和IL-2部分不但在所述融合蛋白中都有功能，而且還協(xié)同起作用。
再者，比較了Fc-IL-12-IL-2融合蛋白、KS-IL-12-IL-2融合蛋白和由1∶1摩爾比的IL-12和IL-2組成的混合物在誘導(dǎo)IFN-γ能力方面的活性。圖6B的結(jié)果表明，F(xiàn)c-IL-12-IL-2融合蛋白和KS-IL-12-IL-2融合蛋白與IL-12和IL-2等摩爾混合物具有大約相同的活性。當(dāng)使用小鼠形式的IL-2和IL-12構(gòu)建融合蛋白時(shí)，獲得了相同的結(jié)果，其中所述小鼠形式的IL-2和IL-12通過在實(shí)施例1描述的用于構(gòu)建人類形式的IL-2和IL-12的方式構(gòu)建。實(shí)施例4IL-12-IL-2融合蛋白的IL-2和IL-12生物活性以增殖型測定比較了融合蛋白中的IL-2和IL-12活性與單獨(dú)的細(xì)胞因子的活性。以典型的IL-12增殖測定測試了小鼠抗體14.18-IL-12-IL-2分子的活性。由志愿者獲得人PBMC，將其與5μg/ml植物凝集素-P培養(yǎng)3天，用Hank’s HBSS清洗，按照標(biāo)準(zhǔn)方法以105細(xì)胞/孔平板接種入微量培養(yǎng)板(Gately，M.K.，Chizzonite，R.和Presky，D.H.Current Protocols in Immunology6.16.1-6.16.15頁)。在各種測試蛋白存在下溫育細(xì)胞48小時(shí)，并在測定放射性摻入水平之前10小時(shí)加入0.3μCi3H-胸苷。IL-12和IL-12與IL-2的等摩爾混合物以劑量依賴方式刺激3H-胸苷摻入細(xì)胞，14.18-IL-12-IL-2融合蛋白在刺激3H-胸苷摻入方面差不多等效。IL-2僅在較高摩爾濃度刺激3H-胸苷摻入，表明所觀察到的14.18-IL-12-IL-2融合蛋白刺激的3H-胸苷摻入主要是由于其IL-12活性。結(jié)果示于圖7。
另外，按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Davis，L.S.，Lipsky，P.E.和Bottomly，K.Current Protocols in Molecular Immunology6.3.1-6.3.7頁)以不同的細(xì)胞增殖測定測試IL-2部分的生物活性。小鼠CTLL-2細(xì)胞系增殖依賴于IL-2。CTLL-2細(xì)胞系還可以在IL-4作用下增殖，但對IL-12沒反應(yīng)。將處于活躍對數(shù)生長期的CTLL-2細(xì)胞在缺少IL-2的培養(yǎng)基中清洗2次，并在各種量的市售小鼠IL-2、小鼠14.18-IL-12-IL-2融合蛋白或市售小鼠IL-12存在下以約1×104細(xì)胞/孔接種在微量滴定板上，培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，使用MTT/MTS測定定量活細(xì)胞數(shù)。圖8顯示了一個(gè)其中IL-2、IL-12或14.18-IL-12-IL-2融合蛋白水平變化的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示小鼠IL-2和小鼠14.18-IL-12-IL-2融合蛋白在刺激細(xì)胞增殖方面差不多等效，而小鼠IL-12量增加沒有對細(xì)胞增殖產(chǎn)生可檢測的刺激作用。該結(jié)果表明14.18-IL-12-IL-2融合蛋白刺激CTLL-2細(xì)胞增殖是緣于IL-2部分而不是IL-12部分。實(shí)施例5構(gòu)建和表達(dá)具有和沒有抗體部分的單鏈和多鏈IL-12-IL-2融合蛋白如下構(gòu)建單鏈小鼠IL-12-IL-2融合蛋白。通過與實(shí)施例1中構(gòu)建人p40-IL-2融合蛋白使用方法類似的方法構(gòu)建p40-IL-2編碼序列融合蛋白。為連接編碼IL-12的p35和p40亞單位的DNA和產(chǎn)生單一編碼序列，合成在5′末端具有XhoI位點(diǎn)和在3′末端具有BamHI位點(diǎn)的接頭編碼DNA。修飾成熟p40-IL-2編碼序列的5′末端，以引入限制性位點(diǎn)，然后連接至所述接頭的3′末端。修飾小鼠p35編碼序列的3′末端，以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，并連接至所述接頭的XhoI位點(diǎn)。利用p40中適宜的限制性位點(diǎn)組合編碼實(shí)施例1中所述的單鏈muIL12和mu-p40-muIL2的cDNA，獲得編碼單鏈muIL12-muIL2的第三個(gè)DNA構(gòu)建物。這些步驟使用不同載體進(jìn)行，并根據(jù)需要分離DNA片段。獲得的小鼠p35-接頭-p40-IL-2編碼區(qū)序列為SEQ ID NO11。
與此同時(shí)，通過相應(yīng)的方法構(gòu)建對應(yīng)的單鏈小鼠IL-12編碼序列。該編碼序列為SEQ ID NO12。
另外，我們還構(gòu)建了編碼融合至p35-接頭-p40-IL-2N端的小鼠IgG2a Fc區(qū)的DNA序列。該編碼序列為SEQ ID NO13。
用編碼小鼠單鏈Fc-IL-12-IL-2和Fc-IL-12蛋白的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的293細(xì)胞。如實(shí)施例2所述測定融合蛋白的表達(dá)。通過與A蛋白瓊脂糖凝膠結(jié)合純化Fc融合蛋白，并觀測到Fc-IL-12-IL-2和Fc-IL-12高水平表達(dá)。根據(jù)SDS凝膠遷移的表觀分子量Fc-IL-12-IL-2，123kD；和Fc-IL-12，107kD推斷，合成了完整蛋白。
實(shí)施例1中描述的KS-scIL12-IL2融合蛋白是一種四聚體，具有兩種不同多肽鏈KS-1/4輕鏈和KS-1/4重鏈及在C端的scIL 12-IL2部分。為研究抗體分子上的哪些位點(diǎn)適于結(jié)合細(xì)胞因子部分，構(gòu)建了其中KS-1/4抗體、IL-12和IL-2部分的構(gòu)型與實(shí)施例1中的KS-IL12-IL-2構(gòu)型不同的第二種融合蛋白。該第二種蛋白為四聚體，由兩種不同的多肽組成。一種多肽由KS-1/4抗體的輕鏈組成。另一種多肽包括融合至KS1/4抗體重鏈成熟N端的單鏈muIL12，后面是在重鏈羧基端的小鼠IL-2。
通過PCR由伴刀豆球蛋白A活化的小鼠脾細(xì)胞(每ml培養(yǎng)基5μg伴刀豆球蛋白A，活化3天)克隆編碼小鼠IL-12p35亞單位的cDNA。正向引物序列為AAGCTT GCTAGCAGC ATG TGT CAA TCA CGCTAC(SEQ.ID NO14)，其中HindIII位點(diǎn)AAGCTT(SEQ ID NO14的殘基1-6)位于翻譯起始密碼子ATG的上游，而反向引物序列為CTCGAG CTT TCA GGC GGA GCT CAG ATA GCC(SEQ ID NO15)，其中XhoI位點(diǎn)CTCGAG(SEQ ID NO15的殘基1-6)位于翻譯終止密碼子TGA(反密碼子為TCA)的下游。
編碼單鏈IL-12的DNA包括連接寡核苷酸的mup35 DNA，其后為mup40 DNA，其中所述寡核苷酸編碼富含甘氨酸和絲氨酸殘基的接頭。獲得的構(gòu)建物在寡核苷酸連接處具有以下序列Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerG AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGA TCCAla(SEQ ID NO17)GCC ATG(SEQ ID NO16)其中G AGC TC(SEQ ID NO16的殘基1-6)為SacI限制位點(diǎn)，恰好位于小鼠p35翻譯終止密碼子上游，GCG編碼小鼠p35的C端氨基酸殘基，GGA TCC(SEQ ID NO16的殘基50-55)是為了有利于連接而引入的BamHI限制性位點(diǎn)，而ATG編碼成熟mu-p40的N端殘基。
編碼單鏈muIL12-KS重鏈-muGMCSF的DNA在mup40和KS重鏈的成熟N端連接處的序列如下Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyC TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGAGly Gly Ser Leu Ser (SEQ ID NO19)GGG GGC TCC TTA AGC CAG (SEQ ID NO18)其中C TGC AG(SEQ ID NO18的殘基1-6)為PstI位點(diǎn)，恰好位于小鼠p40翻譯終止密碼子上游，TCC編碼小鼠p40的C端氨基酸殘基，而CAG編碼成熟KS重鏈的N端殘基。然后將獲得的編碼單鏈muIL 12-KS重鏈-muIL2的DNA與KS輕鏈共表達(dá)。
為進(jìn)一步研究抗體分子的哪個(gè)末端可用于產(chǎn)生融合連接以及為了研究許多截然不同的多肽怎樣可以裝配入一個(gè)多細(xì)胞因子融合蛋白中，表達(dá)含KS-1/4、IL-12和IL-2的第三種蛋白，即IL12-KS(輕鏈)+KS(重鏈)-IL2，并測試其活性。該融合蛋白為六聚體，并含有三種不同多肽。一種多肽由小鼠p35與KS1/4抗體輕鏈融合組成。第二種多肽由融合至人IL-2的KS1/4抗體重鏈組成[Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.891428]，而第三種多肽為小鼠p40。在表達(dá)時(shí)，兩條輕鏈和兩條重鏈以二硫鍵鍵合，形成四聚體抗體-細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)。另外，輕鏈N端的p35還與p40以二硫鍵結(jié)合。
編碼mup35-KS輕鏈的DNA在連接處的序列如下Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerG AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGA TCCLeu Ser (SEQ ID NO21)TTA AGC GAG (SEQ ID NO20)其中G AGC TC(SEQ ID NO20的殘基1-6)為SacI限制性位點(diǎn)，恰好位于小鼠p35翻譯終止密碼子上游，GCG編碼小鼠p35的C端氨基酸殘基，GGA TCC(SEQ ID NO20的殘基50-55)是為有利于連接而引入的BamHI限制性位點(diǎn)，而GAG編碼輕鏈的N端氨基酸殘基。
為表達(dá)此六聚體融合蛋白，通過用含新霉素抗性基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染并用G418選擇，獲得表達(dá)小鼠p40的細(xì)胞系。然后用含輕鏈和重鏈轉(zhuǎn)錄單元以及允許用氨甲蝶呤選擇的二氫葉酸還原酶選擇標(biāo)記的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染表達(dá)小鼠p40的細(xì)胞系[Gillies等(1998)J.Immunol.1606195]。實(shí)施例6小鼠單鏈IL-12-IL-2融合蛋白活性使用在實(shí)施例4中使用的相同方法測試通過瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)生的小鼠單鏈IL-12-IL-2的活性。首先通過ELISA測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中每種細(xì)胞因子的量，并用于建立劑量-反應(yīng)曲線。所述活性與用上述Fc和抗體IL-12-IL-2融合蛋白發(fā)現(xiàn)的活性密切相關(guān)。
具體而言，以實(shí)施例4描述的人PBMC細(xì)胞增殖測定測試小鼠單鏈(sc)IL-12-IL-2和小鼠Fc-scIL-12-IL-2分子的IL-12活性。IL-12和IL-12與IL-2的等摩爾混合物以劑量依賴方式刺激3H-胸苷摻入細(xì)胞中。以每摩爾為基準(zhǔn)，scIL-12-IL-2和Fc-scIL-12-IL-2融合蛋白在刺激3H-胸苷摻入方面與IL-12大致等效(圖9)。如實(shí)施例4所述，IL-2僅在非常高摩爾濃度刺激3H-胸苷摻入，表明所觀察到的scIL-12-IL-2融合蛋白刺激的3H-胸苷摻入主要是由于其IL-12活性。
另外，在細(xì)胞型測定中測試scIL-12-IL-2融合蛋白的IL-2部分的生物活性，發(fā)現(xiàn)其與市售IL-2以每摩爾為基準(zhǔn)在所述測定的精度范圍內(nèi)大致相同。如實(shí)施例4所述，在CTLL-2細(xì)胞增殖測定中測試IL-2部分的生物活性。結(jié)果表明，小鼠IL-2、小鼠scIL-12-IL-2和小鼠Fc-IL-12-IL-2融合蛋白在刺激增殖的能力上大致相等，小鼠IL-12對CTLL-2細(xì)胞增殖不產(chǎn)生可檢測的刺激作用。這些結(jié)果表明scIL-12-IL-2融合蛋白對CTLL-2細(xì)胞增殖的刺激作用緣于IL-2部分而不是IL-12部分。
還在細(xì)胞型測定中測試了實(shí)施例5描述的Fc-IL12-IL2、IL12-KS-IL2和IL12-KS(輕鏈)+KS(重鏈)-IL2蛋白的IL-12活性和IL-2活性。使用PBMC細(xì)胞增殖/氚化胸苷摻入測定，F(xiàn)c-IL12-IL2、IL12-KS-IL2和IL12-KS(輕鏈)+KS(重鏈)-IL2蛋白都顯示出有效的IL-12活性。同樣地，使用CTLL-2細(xì)胞增殖測定，F(xiàn)c-IL12-IL2、IL12-KS-IL2和IL12-KS(輕鏈)+KS(重鏈)-IL2蛋白都顯示出有效的IL-2活性。另外，在ELISA中IL12-KS-IL2和IL12-KS(輕鏈)+KS(重鏈)-IL2蛋白都緊密結(jié)合EpCAM抗原，即使重鏈和輕鏈V區(qū)分別融合至其它蛋白的N端。實(shí)施例7小鼠IL-12-GM-CSF融合蛋白的活性在細(xì)胞增殖測定中測試小鼠Fc-IL-12-GM-CSF的IL-12活性(圖10)。由三個(gè)志愿者獲得人PBMC，將其與5μg/ml植物凝集素-P培養(yǎng)3天，用Hank’s HBSS清洗，按照標(biāo)準(zhǔn)方法以105細(xì)胞/孔接種入微量滴定板(Gately，M.K.，Chizzonite，R.和Presky，D.H.CurrentProtocols in Immunology6.16.1-6.16.15頁)。在各種測試蛋白存在下溫育細(xì)胞48小時(shí)，并在測定放射性摻入水平之前10小時(shí)加入0.3μCi3H-胸苷。IL-12和IL-12與GM-CSF的等摩爾混合物以劑量依賴方式刺激3H-胸苷摻入細(xì)胞，而14.18-IL-12-GM-CSF融合蛋白在刺激3H-胸苷摻入方面差不多等效。GM-CSF在測試濃度不刺激3H-胸苷摻入，表明所觀察到的14.18-IL-12-GM-CSF融合蛋白刺激的3H-胸苷摻入主要是由于其IL-12活性。
另外，在細(xì)胞型測定中測試了各種IL-12-Gm-CSF融合蛋白的GM-CSF部分的生物活性。發(fā)現(xiàn)GM-CSF部分有活性，每摩爾的活性與市售GM-CSF在相同的常規(guī)范圍內(nèi)。例如，在不同的細(xì)胞增殖測定中按照分子免疫學(xué)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法(Cooper，S.C.和Broxmeyer，H.E.，Current Protocols in Molecular Immunology6.4.1-6.4.20頁)測試GM-CSF部分的生物活性。小鼠32D(GM)細(xì)胞系增殖依賴于GM-CSF；該細(xì)胞系由Cooper和Broxmeyer描述的原始32D細(xì)胞系改變獲得，對GM-CSF特別敏感(Faas等，Eur.J.Immunol.231201-14)。32D(GM)細(xì)胞系對IL-12無應(yīng)答。將處于活躍對數(shù)生長期的32D(GM)細(xì)胞在沒有GM-CSF的培養(yǎng)基中清洗兩次，并在各種量的市售小鼠GM-CSF或小鼠IL-12-GM-CSF融合蛋白存在下以約5×103細(xì)胞/孔接種在微量滴定板各孔中，培養(yǎng)48小時(shí)。在測定放射性摻入水平之前16小時(shí)加入0.3μCi3H-胸苷。隨著IL-12-GM-CSF融合蛋白水平增加，3H-胸苷摻入呈劑量反應(yīng)性增加，表明IL-12-GM-CSF融合蛋白的GM-CSF部分有活性。而且，以1摩爾為基準(zhǔn)計(jì)算，所述融合蛋白的GM-CSF生物活性與市售小鼠GM-CSF相當(dāng)。實(shí)施例8用多細(xì)胞因子融合蛋白治療免疫功能良好(immune-proficient)的哺乳動物的結(jié)腸癌為測試多細(xì)胞因子-抗體融合蛋白是否可用于治療免疫系統(tǒng)完好的哺乳動物的結(jié)腸癌，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。CT26是得自Balb/C小鼠的結(jié)腸癌細(xì)胞系。通過標(biāo)準(zhǔn)的遺傳工程技術(shù)工程該細(xì)胞系，使其表達(dá)人上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)，EpCAM是KS-1/4抗體識別的抗原；這些細(xì)胞被稱為CT26/KSA細(xì)胞。
用2×106CT26/KSA細(xì)胞皮下接種Balb/C小鼠。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100-200mm3時(shí)，隨機(jī)將小鼠分為三組，每組9只，供進(jìn)一步研究用。從第0天開始用PBS、約3.4μg KS-IL2與約5.3μg KS-IL12的混合物或約6μg KS-IL2-IL12治療腫瘤小鼠。這些劑量用來將相等數(shù)量IL-12和IL-2分子傳遞給每組小鼠。對小鼠進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射，每天一次，共5天。用測徑器檢測腫瘤大小。
一個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖11。在該實(shí)驗(yàn)中，KS-IL12-IL2極為顯著地抑制腫瘤生長。KS-IL12和KS-IL2的混合物也明顯抑制腫瘤生長，但不如KS-IL12-IL2徹底。在KS-IL12-IL2治療的小鼠組中，9只小鼠中的6只腫瘤表觀治愈這6只小鼠直至所述實(shí)驗(yàn)終止時(shí)的第93天仍存活；而且這些小鼠中的腫瘤萎縮和消失，從第39天至第93天不能檢測到皮下腫瘤。另3只小鼠的腫瘤生長延遲，腫瘤體積僅在第87天后超過4,000mm3。
在KS-IL12和KS-IL2混合物治療的小鼠中，2只小鼠的皮下腫瘤表觀治愈，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍存活。余下的7只小鼠的腫瘤沒有消失，最終生長至體積為1,000mm3(1只小鼠)或大于4,000mm3(6只小鼠)。
KS-IL12-IL2比KS-IL12和KS-IL2的等摩爾混合物更有效的事實(shí)令人驚奇。該實(shí)驗(yàn)中的給予劑量為每劑約19pmol融合蛋白，相當(dāng)于約9×1012個(gè)分子。在治療開始時(shí)，每個(gè)腫瘤的體積約160mm3，相當(dāng)于約1.6億個(gè)細(xì)胞。每個(gè)細(xì)胞表達(dá)約106個(gè)EpCAM分子，由此KS抗體可能結(jié)合的EpCAM抗原分子約1.6×1014個(gè)。因此，當(dāng)混合KS-IL12和KS-IL2并注射入帶有所述腫瘤的小鼠中時(shí)，這兩種免疫細(xì)胞因子融合蛋白互相之間不大可能競爭抗原結(jié)合部位。因此，對于KS-IL12和KS-IL2混合物和KS-IL12-IL2而言，在腫瘤部位的IL12和IL2有效劑量應(yīng)當(dāng)至少一樣高。實(shí)施例9.用多細(xì)胞因子融合蛋白治療免疫缺陷哺乳動物中的結(jié)腸癌許多形式的癌癥治療具有殺傷分裂細(xì)胞的作用，包括免疫系統(tǒng)細(xì)胞。因此，癌癥患者常常發(fā)生免疫抑制。為了了解多細(xì)胞因子融合蛋白是否可用于治療免疫系統(tǒng)受抑制的哺乳動物，用KS-IL12-IL2、KS-IL12和KS-IL2的混合物或PBS治療帶有CT26/KSA腫瘤的SCID小鼠。SCID小鼠的B細(xì)胞和T細(xì)胞均存在缺陷，依賴于具抗感染能力的先天免疫系統(tǒng)分支如NK細(xì)胞。
如實(shí)施例8所述制備攜帶皮下CT26/KSA腫瘤的小鼠。用與實(shí)施例8相同的給藥劑量和方案通過腫瘤內(nèi)注射治療三組各8只攜帶約100-200mm3腫瘤的小鼠。結(jié)果示于圖12。在該實(shí)驗(yàn)中，KS-IL12-IL2融合蛋白與KS-IL12和KS-IL2的混合物差不多等效第25天時(shí)每組8只小鼠中的5只被治愈。然而，在未治愈的小鼠中，6個(gè)腫瘤中的5個(gè)開始以未治療小鼠的腫瘤特征性速率生長，有效延遲約14-21天。這與實(shí)施例8中的免疫良好小鼠的腫瘤大不相同即使在用KS-IL12-IL2治療未完全消除腫瘤時(shí)，實(shí)驗(yàn)開始后約60天后腫瘤才開始侵蝕性生長。
這些實(shí)驗(yàn)證明，多細(xì)胞因子抗體融合蛋白可用于治療免疫抑制動物癌癥。實(shí)施例10.通過腫瘤內(nèi)注射多細(xì)胞因子融合蛋白治療肺癌與單獨(dú)免疫細(xì)胞因子治療比較為了解多細(xì)胞因子融合蛋白和具有單一細(xì)胞因子部分的免疫細(xì)胞因子抗肺細(xì)胞衍生癌癥的有效性，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
Lewis肺癌(LLC)是在C57BL/6小鼠中產(chǎn)生的一種侵襲性腫瘤。通過標(biāo)準(zhǔn)遺傳工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)人EpCAM蛋白的LLC細(xì)胞系；此細(xì)胞系稱為LLC/KSA。
如實(shí)施例8所述制備攜帶皮下LLC/KSA腫瘤的C57BL/6小鼠(用KML核對細(xì)胞序號#)。通過腫瘤內(nèi)注射治療四組各5只攜帶約100-200mm3腫瘤的小鼠5天。用PBS、約20μg KS-IL12、約20μg KS-IL12或約20μg KS-IL12-IL2注射小鼠。
結(jié)果示于圖13。在此實(shí)驗(yàn)中，KS-IL12-IL2融合蛋白遠(yuǎn)比KS-IL12或KS-IL2有效。在用KS-IL12-IL2融合蛋白治療的所有小鼠中，腫瘤至第27天全部消失。在第74天，對這些小鼠進(jìn)行實(shí)施例14所述的肺轉(zhuǎn)移測定；在干預(yù)期或第二個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，原來的皮下腫瘤沒有再出現(xiàn)。相反，KS-IL2或KS-IL12治療使腫瘤外觀有一定縮小以及腫瘤生長明顯延遲，但腫瘤最終還是生長。比較此實(shí)驗(yàn)和前述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，對于某些疾病和給予方式，用具有不同細(xì)胞因子部分的免疫細(xì)胞因子混合物治療優(yōu)于用單一類型的免疫細(xì)胞因子治療。實(shí)施例12.通過腫瘤內(nèi)注射多細(xì)胞因子融合蛋白治療肺癌與免疫細(xì)胞因子混合物治療比較為了解多細(xì)胞因子融合蛋白和具有不同細(xì)胞因子部分的免疫細(xì)胞因子混合物對肺細(xì)胞性癌癥的有效性，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
如實(shí)施例11所述制備攜帶皮下LLC/KSA腫瘤的C57BL/6小鼠。通過腫瘤內(nèi)注射治療三組各7只攜帶約100-200mm3腫瘤的小鼠5天。用PBS、約18μg KS-IL12和約11.5μg KS-IL12的混合物或約20μgKS-IL12-IL2注射小鼠。
結(jié)果示于圖14。在此實(shí)驗(yàn)中，KS-IL12-IL2融合蛋白遠(yuǎn)比KS-IL12和KS-IL2的混合物有效。在用KS-IL12-IL2融合蛋白治療的所有小鼠中，腫瘤至第27天為止全部消失。相反，用KS-IL12和KS-IL2的混合物治療使腫瘤表觀有一定縮小以及腫瘤生長明顯延遲，但此治療組的所有腫瘤最終再發(fā)生生長。實(shí)施例13.多細(xì)胞因子抗體融合蛋白的抗原依賴性抗腫瘤活性為了解多細(xì)胞因子-抗體融合蛋白治療腫瘤的有效性是否依賴于腫瘤特異性表達(dá)的所述抗體識別抗原，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
如實(shí)施例11所述制備攜帶皮下LLC/KSA腫瘤的一組7只C57BL/6小鼠和攜帶親代LLC細(xì)胞系衍生腫瘤的第二組9只小鼠。通過腫瘤內(nèi)注射治療這兩組攜帶約100-200mm3腫瘤的小鼠5天。用約20μgKS-IL12-IL2注射小鼠。
結(jié)果示于圖15。在此實(shí)驗(yàn)中，攜帶LLC/KSA腫瘤的所有小鼠的腫瘤都完全治愈。相反，LLC腫瘤小鼠只有2只治愈，其余的LLC腫瘤小鼠的腫瘤體積都曾有短時(shí)縮小，但腫瘤體積最終增大。
這些結(jié)果表明，對EpCAM表面抗原的識別促進(jìn)了KS-IL12-IL2粘附于LLC/KSA腫瘤細(xì)胞表面，增強(qiáng)了產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。也觀察到對LLC-衍生腫瘤的一定抗腫瘤作用；盡管不希望受理論束縛，但是仍然認(rèn)為在此實(shí)驗(yàn)中的KS-IL12-IL2抗腫瘤作用是由于以下事實(shí)所述融合蛋白直接注射入腫瘤并因此瞬時(shí)局限于腫瘤。實(shí)施例14.產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞類型的免疫記憶發(fā)生轉(zhuǎn)移是癌癥治療中的主要問題。為測試多細(xì)胞因子抗體融合蛋白治療是否可形成抗腫瘤細(xì)胞類型的長久免疫記憶，以及是否可預(yù)防形成轉(zhuǎn)移，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例11中的5只C57BL/6小鼠用KS-IL12-IL2進(jìn)行了治療，并且其皮下腫瘤已表觀治愈。如實(shí)施例14所述，從治療開始計(jì)的第74天，這5只小鼠靜脈內(nèi)注射106LLC/KSA細(xì)胞。作為對照，還對8只C57BL/6小鼠靜脈內(nèi)注射106LLC/KSA細(xì)胞。
在第28天，處死小鼠，檢查肺部轉(zhuǎn)移。8只對照小鼠的肺部轉(zhuǎn)移占70％-100％，肺表面覆蓋平均為85％。這些小鼠的平均肺重量為0.86克。相比之下，在5只預(yù)治療小鼠的肺表面未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，平均肺重量為0.28克，與正常小鼠的肺重量相當(dāng)。這些結(jié)果表明，對原腫瘤細(xì)胞的治療產(chǎn)生了對所述腫瘤細(xì)胞的長久免疫記憶；該記憶防止所述腫瘤細(xì)胞類型形成轉(zhuǎn)移。
表X.“腫瘤消退”小鼠對LLC-KSA肺轉(zhuǎn)移的保護(hù)作用在先治療 轉(zhuǎn)移記分 肺重量(g)無 4，4，4，4，4，4，3，30.88+/-0.27KS-IL12/IL2 0，0，0，0，0 0.27+/-0.03無腫瘤對照組的平均肺重量為0.2克。轉(zhuǎn)移記分是基于融合腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的表面范圍百分率，其中0＝無轉(zhuǎn)移；1＝1-25％范圍；2＝25-50％范圍；3＝50-75％范圍；而4＝75-100％范圍。
測試免疫記憶形成的第二個(gè)實(shí)驗(yàn)使用實(shí)施例12的7只小鼠中的6只，這6只小鼠已經(jīng)注射了LLC/KSA腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生了皮下腫瘤并且已經(jīng)使這些腫瘤消失。在實(shí)施例12的治療開始后62天，對6只預(yù)治療小鼠和10只原初未治療的C57BL/6對照小鼠皮下注射106LLC細(xì)胞。這些細(xì)胞不表達(dá)人KS抗原EpCAM。
在所述原初小鼠中，注射的LLC細(xì)胞形成的腫瘤在所有小鼠中快速生長。相比之下，預(yù)治療小鼠腫瘤的生長要慢得多，而在1只小鼠中未檢測到皮下腫瘤。結(jié)果示于圖16。因?yàn)槿薑S抗原EpCAM不在LLC細(xì)胞上表達(dá)，所以針對LLC細(xì)胞的免疫應(yīng)答是基于這些細(xì)胞表達(dá)的其它抗原。實(shí)施例15.作為疫苗的多細(xì)胞因子融合蛋白多細(xì)胞因子融合蛋白當(dāng)融合至抗原蛋白時(shí)可用作疫苗。疫苗部分由N端至C段的具體順序或者所述融合蛋白是單一多肽鏈還是寡聚物，可根據(jù)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的方便性而有所變化?？赏ㄟ^各種途徑如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)等給予所述蛋白。同樣地，給予的劑量和頻率一般需要經(jīng)驗(yàn)性確定，這是人類疫苗的標(biāo)準(zhǔn)操作，是疫苗開發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的。
例如，給予小鼠抗原-IL-12-細(xì)胞因子形式的融合蛋白，其中所述融合蛋白中的細(xì)胞因子為與IL-12不同的第二種細(xì)胞因子。對照小鼠給予相同量的抗原-細(xì)胞因子、抗原-IL-12或單獨(dú)的抗原。在給予所述抗原融合蛋白期間和/或以后的各個(gè)時(shí)間通過眼眶后取血收集血樣，然后制備血漿并分析抗所述抗原的抗體存在情況。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了抗所述抗原的抗體。而且，針對所述抗原的免疫應(yīng)答性質(zhì)為Th1型應(yīng)答特征性的。與某些對照免疫相比，所述抗體應(yīng)答更強(qiáng)，產(chǎn)生的抗體類型不同。
更具體地說，將人源化抗體-小鼠IL-12-IL-2融合蛋白的PBS緩沖液靜脈注射入Balb/c小鼠中(5μg/天×5)。對照小鼠接受相同量的相同抗體，但所述抗體未附著IL-12-IL-2。兩種注射溶液都不含有任何其它類型的佐劑。在第10天，通過眼眶后取血將血樣收集到微量離心管中，并通過收集含檸檬酸鈉的塑料管中的血樣，接著在Eppendorf臺式微量離心機(jī)中全速離心制備血漿。用人源化抗體蛋白包被ELISA板(96孔)，所述人源化抗體蛋白含有人恒定區(qū)，并用于捕獲免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的任何小鼠抗體。洗去未結(jié)合物質(zhì)之后，用偶合辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠Fc抗體(Jackson ImmunoResearch)檢測結(jié)合的小鼠抗體。任何結(jié)合抗體都可能涉及人恒定區(qū)或可變區(qū)，而人源化抗體和所述融合蛋白共有這二者。
對沒有融合IL-12-IL-2的人源化抗體幾乎沒有反應(yīng)性。另一方面，所述融合蛋白在沒有外源佐劑的情況下誘導(dǎo)強(qiáng)抗體應(yīng)答，盡管靜脈內(nèi)給予途徑和皮下或腹膜內(nèi)給予相比對于誘導(dǎo)這種應(yīng)答是非常不宜的。為典型的IL-12增強(qiáng)型應(yīng)答的IgG2a同種型抗體見于抗體-IL-12-IL-2注射組，但不見于人源化抗體注射組。
通過注射融合蛋白(諸如上述融合蛋白)的PBS溶液或其它生物相容性緩沖溶液或已知的佐劑(如弗氏不完全佐劑或完全佐劑)，測試由各種途徑給予的抗原-IL-12多細(xì)胞因子融合蛋白的免疫原性。例如，可每兩周給予單次或多次的皮下、皮內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。或者，所述融合蛋白首先可通過皮下注射給予，然后通過腹膜內(nèi)注射給予。弗氏佐劑由于刺激注射部位而不能用于人類用途。其它佐劑如氫氧化鋁沉淀(Alum)被批準(zhǔn)用于人類用途并可用于本發(fā)明。基于鯊烯和脂質(zhì)的新型有機(jī)化學(xué)佐劑也可由于皮膚注射。實(shí)施例16.用多細(xì)胞因子融合蛋白進(jìn)行基因治療通過基因療法傳遞多細(xì)胞因子融合蛋白的抗癌活性也已經(jīng)被證明可用于治療肺癌。使用前述病毒載體系統(tǒng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞(pLNCX-scIL-12-IL-2DNA或pLNCX-scIL-12 DNA轉(zhuǎn)染入PA317包裝細(xì)胞系)。這些構(gòu)建物編碼其中p35和p40已通過接頭連接起來的單鏈型IL-12。使用含G418的培養(yǎng)基體外選擇克隆，并通過ELISA(R&D Systems)鑒定穩(wěn)定表達(dá)約50-60ng/ml IL-12的克隆。
將大約1×106和大約5×106的表達(dá)scIL-12或scIL-12-IL-2的LLC細(xì)胞皮下注射入C57BL/6小鼠以及SCID小鼠。作為對照，將2×106LLC細(xì)胞注射入C57BL/6小鼠以及SCID小鼠。表達(dá)IL-12的LLC細(xì)胞形成的腫瘤的生長速率與沒有被工程為表達(dá)細(xì)胞因子的LLC細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤大致相同。然而，在C57BL/6小鼠以及在SCID小鼠中，表達(dá)scIL-12-IL-2的LLC細(xì)胞或者不形成皮下腫瘤，或者形成隨后縮小消失的腫瘤(圖17和18)。實(shí)施例17.構(gòu)建含IL-4和GM-CSF的多細(xì)胞因子融合蛋白細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF當(dāng)聯(lián)合使用時(shí)是有效的樹突細(xì)胞激活物。如下構(gòu)建含IL-4和GM-CSF活性的多細(xì)胞因子-抗體融合蛋白。將GM-CSF的編碼序列按照讀框融合至位于前導(dǎo)序列之后的KS-1/4抗體重鏈編碼序列的3′末端。另外，用接頭將IL-4的編碼序列(包括前導(dǎo)序列)按照讀框融合至成熟KS-1/4抗體輕鏈編碼序列的5′末端。
具體而言，為構(gòu)建小鼠IL-4和KS-1/4抗體輕鏈的融合蛋白編碼DNA，使用正向引物序列TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAGC(SEQ ID NO22)通過PCR修飾小鼠IL-4 cDNA，其中XbaI位點(diǎn)TCTAGA(SEQ ID NO22的殘基1-6)位于翻譯起始密碼子ATG的上游，而反向引物序列為C GGA TCC CGA GTA ATC CAT TTG CATGAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G(SEQ ID NO23)，它含有的BamHI位點(diǎn)GGA TCC(SEQ ID NO23的殘基2-7)緊接著編碼小鼠IL-4的C端氨基酸殘基的TCG密碼子(反密碼子為CGA)的3′?？寺CR片段并驗(yàn)證序列后，將含有小鼠IL-4 cDNA的XbaI-BamHI片段連接至編碼富含甘氨酸和絲氨酸殘基的柔性肽接頭的BamHI-AflII寡核苷酸雙鏈體。AflII末端又連接至人工放置于成熟KS-1/4輕鏈N端之前的AflII位點(diǎn)。在兩次連接產(chǎn)生的連接處的DNA和蛋白序列如下。DNA TCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA蛋白 (Ser)Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyGGG GGC TCC TTA AGC GAG (SEQ ID NO24)Gly Gly ser Leu Ser (Glu) (SEQ ID NO25)在該DNA序列中，GGATCC(SEQ ID NO24的殘基4-9)和CTTAAG(SEQ ID NO24的殘基48-53)分別為用于再構(gòu)建的兩個(gè)限制性位點(diǎn)BamHI和AflII；TCG編碼小鼠IL-4的C端絲氨酸殘基；GAG編碼KS-1/4輕鏈的成熟N端；而在DNA序列之下顯示了富含GlySer的肽接頭的氨基酸序列。使用前面實(shí)施例描述的技術(shù)和其它分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將包括強(qiáng)啟動子的用于高水平表達(dá)的輔助序列適當(dāng)?shù)刂糜趦煞N融合多肽編碼DNA節(jié)段的周圍。
將編碼IL4-KS(輕鏈)和KS(重鏈)-GM-CSF的融合蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)染入NS/0細(xì)胞，高水平表達(dá)相應(yīng)的多肽。SDS-PAGE在還原條件下顯示約80kD的分散帶(對應(yīng)于重鏈-GM-CSF多肽)和約50kD的多條帶(對應(yīng)于IL-輕鏈融合蛋白)。出現(xiàn)分散帶和多條帶分別是由于IL-4和GM-CSF的可變糖基化。
將所述亞單位裝配入其結(jié)構(gòu)對應(yīng)于圖3G通式結(jié)構(gòu)的二硫鍵結(jié)合的四聚體蛋白。該蛋白具有KS-1/4抗原結(jié)合活性、通過其Fc區(qū)結(jié)合Staph A蛋白的能力以及IL-4和GM-CSF的細(xì)胞因子活性。通過IL-4依賴性刺激CTLL-2細(xì)胞的氚化胸苷摻入檢測IL-4活性。通過GM-CSF依賴性刺激32(D)GM細(xì)胞的氚化胸苷摻入檢測GM-CSF活性。以1摩爾為基準(zhǔn)，KS-IL4-GMCSF的IL-4活性和GM-CSF活性與純化的IL-4和GM-CSF相似。
如下構(gòu)建沒有結(jié)合抗體序列的細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF的融合蛋白。通過PCR由小鼠脾細(xì)胞RNA克隆小鼠IL-4。正向引物序列為TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C(SEQ ID NO26)，其中XbaI位點(diǎn)TCTAGA(SEQ ID NO26的殘基1-6)位于翻譯起始密碼子ATG的上游，而反向引物序列為CGA TAT CCC GGA CGAGTA ATC CAT TTG CAT GAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G(SEQ ID NO27)，其中EcoRV位點(diǎn)GAT ATC(SEQ ID NO27的殘基2-7)緊接著編碼小鼠IL-4C端氨基酸殘基的TCG密碼子(反密碼子為CGA)的3′。驗(yàn)證序列后，將含有muIL-4 cDNA與其天然前導(dǎo)序列的XbaI-EcoRV片段連接至含muGM-CSF cDNA的SmaI-XhoI片段，在muIL-4和muGM-CSF融合的連接處產(chǎn)生以下序列ATG GATTAC TCG TCC GGG ATG GGA AAA GCA CCC GCC CGC(SEQ IDNO28)，其中muIL-4的C端序列和muGM-CSF的N端序列為粗體，而G ATG GG(SEQ ID NO28的殘基17-22)是將EcoRV平端連接至SmaI平端產(chǎn)生的序列。然后將獲得的編碼muIL4-muGMCSF的DNA克隆入表達(dá)載體。通過SDS-PAGE分析所表達(dá)的蛋白，發(fā)現(xiàn)跑出一條表觀分子量為45-50kD的分散帶。以1摩爾為基準(zhǔn)，IL4-GMCSF的IL-4活性和GM-CSF活性與純化的IL-4和GM-CSF相似。實(shí)施例18.構(gòu)建淋巴趨化因子-KS-IL2編碼DNA和表達(dá)淋巴趨化因子-KS-IL2蛋白趨化因子是一類獨(dú)特的被認(rèn)為形成梯度和介導(dǎo)免疫細(xì)胞趨化性的細(xì)胞因子。另外，同其它細(xì)胞因子一樣，趨化因子也能夠誘導(dǎo)特定基因在靶細(xì)胞中表達(dá)。趨化因子的一個(gè)特征在于自由N端往往是其活性必需的，這可能對構(gòu)建融合蛋白的途徑構(gòu)成限制。
構(gòu)建一種細(xì)胞因子-抗體-細(xì)胞因子融合蛋白，包含細(xì)胞因子淋巴趨化因子(為一種趨化因子)、抗體KS-1/4和細(xì)胞因子IL-2。該融合蛋白為四聚體，并含有兩種不同多肽。一種多肽包括融合至KS-1/4抗體重鏈N端的小鼠淋巴趨化因子，其后為位于C端的IL-2。先前已經(jīng)描述了KS-1/4重鏈與在C端的IL-2的融合蛋白-“KS-IL2重鏈”[Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.891428]。另一種多肽由KS1/4抗體輕鏈組成。
Kelner和Zlotnik公開了小鼠淋巴趨化因子的完全編碼序列(Science 2661395)。為構(gòu)建小鼠淋巴趨化因子與KS-IL2重鏈的融合蛋白的編碼DNA，使用正向引物TCTAGAGCCACC ATGAGA CTT CTC CTC CTG AC(SEQ ID NO29)通過PCR修飾小鼠淋巴趨化因子cDNA，其中XbaI位點(diǎn)TCTAGA(SEQ ID NO29的殘基1-6)位于翻譯起始密碼子ATG的上游，而反向引物序列為GGATCC CCC AGT CAG GGT TAC TGC TG(SEQ ID NO30)，其BamHI位點(diǎn)GGA TCC(SEQ ID NO30的殘基1-6)緊接著編碼小鼠淋巴趨化因子的C端氨基酸殘基的GGG密碼子(反密碼子為CCC)的3′。克隆PCR片段并驗(yàn)證序列后，將含有小鼠淋巴趨化因子cDNA的XbaI-BamHI片段連接至編碼富含甘氨酸和絲氨酸殘基的柔性肽接頭的BamHI-AflII寡核苷酸雙鏈體。AflII末端又連接至人工放置于KS-IL2重鏈成熟N端之前的AflII位點(diǎn)。在兩次連接產(chǎn)生的連接處的DNA序列如下
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser LeuCCC GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA GGG GGC TCC TTASer(SEQ ID NO32)AGC CAG(SEQ ID NO31)其中GGATCC(SEQ ID NO31的殘基4-9)和CTTAAG(SEQ ID NO31的殘基48-53)分別為用于再構(gòu)建的兩個(gè)限制性位點(diǎn)BamHI和AflII；CCC編碼小鼠淋巴趨化因子的C端氨基酸殘基；CAG編碼KS-IL2重鏈的成熟N端；而在DNA序列之上顯示了富含GlySer的肽接頭的氨基酸序列。然后將小鼠淋巴趨化因子-KS-IL2重鏈的編碼DNA克隆入表達(dá)載體，再與KS1/4輕鏈共表達(dá)。
使用T細(xì)胞以Boyden室遷移測定(Boyden chamber migrationassay)測試表達(dá)的淋巴趨化因子-KS-IL2融合蛋白的淋巴趨化因子活性(Leonard等，Current Protocols in Immunology 6.12.3頁)。或者，使用NK細(xì)胞?；蛘撸迷贕蛋白偶聯(lián)受體活化作用下的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞鈣流量測定觀測淋巴趨化因子活性(Maghazachi等，F(xiàn)ASEB J.；11765-74)。另外，測試了淋巴趨化因子-KS-IL2融合蛋白，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)合EpCAM的能力測定中有活性，并且在IL-2活性測定(如CTLL-2細(xì)胞增殖測定)中也有活性。
文獻(xiàn)引用本文以上提及的所有出版物都通過引用整體結(jié)合到本申請中。
等同實(shí)施方案可在不背離本發(fā)明精神或基本特征的情況下以其它具體形式實(shí)施本發(fā)明。因此認(rèn)為前述的實(shí)施方案是在所有方面進(jìn)行闡述，而不是限制本文描述的本發(fā)明。因此，本發(fā)明的范圍由所附而不是由以上描述限定，所以權(quán)利要求書包括權(quán)利要求書等同含義和范圍內(nèi)的所有變化。
說明書的核苷酸和氨基酸序列表序列表<110>Gillies，StephenLo，Kin Ming<120>多細(xì)胞因子蛋白復(fù)合物<130>LEX-010PC<140><141><150>60/147，924<151>1999-08-09<160>32<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>582<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220><223>人工序列的描述成熟蛋白的小鼠p35編碼序列<400>1agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcct ga582<210>2<211>1472<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述小鼠p40-IL-2融合蛋白編碼序列<400>2atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 780agtaccctga ctcctggagc actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa 840tccagcgcaa gaaagaaaag atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt 900tcctcgtaga gaagacatct accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag 960ctcaggatcg ctattacaat tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc 1020gatccccggg taaagcaccc acttcaagct ctacagcgga agcacagcag cagcagcagc 1080agcagcagca gcagcagcag cacctggagc agctgttgat ggacctacag gagctcctga 1140gcaggatgga gaattacagg aacctgaaac tccccaggat gctcaccttc aaattttact 1200tgcccaagca ggccacagaa ttgaaagatc ttcagtgcct agaagatgaa cttggacctc 1260tgcggcatgt tctggatttg actcaaagca aaagctttca attggaagat gctgagaatt 1320tcatcagcaa tatcagagta actgttgtaa aactaaaggg ctctgacaac acatttgagt 1380gccaattcga tgatgagtca gcaactgtgg tggactttct gaggagatgg atagccttct 1440gtcaaagcat catctcaaca agccctcaat aa 1472<210>3<211>1409<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述小鼠p40-GM-CSF融合蛋白編碼序列<400>3atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 780agtaccctga ctcctggagc actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa 840tccagcgcaa gaaagaaaag atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt 900tcctcgtaga gaagacatct accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag 960ctcaggatcg ctattacaat tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc 1020gatccccggg aaaagcaccc gcccgctcac ccataattgt tacccggcct tggaagcatg 1080tagaggccat caaagaagcc ctaaacctcc tggatgacat gcctgtcacg ttgaatgaag 1140aggtagaagt cgtctctaac gagttctcct tcaagaagct aacatgtgtg cagacccgcc 1200tgaagatatt cgagcagggt ctacggggca atttcaccaa actcaagggc gccttgaaca 1260tgacagccag ctactaccag acatactgcc ccccaactcc ggaaacggac tgtgaaacac 1320aagttaccac ctatgcggat ttcatagaca gccttaaaac ctttctgact gatatcccct 1380ttgaatgcaa aaaaccaagc caaaaatga 1409<210>4<211>1389<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人p40-IL-2融合蛋白編碼序列<400>4atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960gaatgggcat ctgtgccctg cagtgcacct acttcaagtt ctacaaagaa aacacagcta 1020caactggagc atttactgct ggatttacag atgattttga atggaattaa taattacaag 1080aatcccaaac tcaccaggat gctcacattt aagttttaca tgcccaagaa ggccacagaa 1140ctgaaacatc ttcagtgtct agaagaagaa ctcaaacctc tggaggaagt gctaaattta 1200gctcaaagca aaaactttca cttaagaccc agggacttaa tcagcaatat caacgtaata 1260gttctggaac taaagggatc tgaaacaaca ttcatgtgtg aatatgctga tgagacagca 1320accattgtag aatttctgaa cagatggatt accttttgtc aaagcatcat ctcaacacta 1380acttgataa 1389<210>5<211>1278<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述小鼠Fc-p35融合蛋白編碼序列<400>5gagcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc 60ttgggtggac catccgtctt catcttccct ccaaagatca aggatgtact catgatctcc 120ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag 180atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggactggatg 300agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga 360accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctccacca 420gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct 480gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact 540gaaccagtcc tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag 600aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat 660caccacacga ctaagagctt ctcccggacc ccgggtaggg tcattccagt ctctggacct 720gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg 780gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacatc 840acacgggacc aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag 900agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag 960aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac 1020cagacagagt tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt 1080ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc 1140gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag 1200ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc 1260tatctgagct ccgcctga1278<210>6<211>1287<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人Fc-p35融合蛋白編碼序列<400>6gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcacgg 420gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 600aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggaagaaacc tccccgtggc cactccagac 720ccaggaatgt tcccatgcct tcaccactcc caaaacctgc tgagggccgt cagcaacatg 780ctccagaagg ccagacaaac tctagaattt tacccttgca cttctgaaga gattgatcat 840gaagatatca caaaagataa aaccagcaca gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc 900aagaatgaga gttgcctaaa ttccagagag acctctttca taactaatgg gagttgcctg 960gcctccagaa agacctcttt tatgatggcc ctgtgcctta gtagtattta tgaagacttg 1020aagatgtacc aggtggagtt caagaccatg aatgcaaagc ttctgatgga tcctaagagg 1080cagatctttc tagatcaaaa catgctggca gttattgatg agctgatgca ggccctgaat 1140ttcaacagtg agactgtgcc acaaaaatcc tcccttgaag aaccggattt ttataaaact 1200aaaatcaagc tctgcatact tcttcatgct ttcagaattc gggcagtgac tattgacaga 1260gtgacgagct atctgaatgc ttcctaa 1287<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于構(gòu)建小鼠p40-IL-2融合蛋白的正向引物<220><221>其它特征<222>(12)..(14)<223>翻譯起始密碼子<400>7aagctagcac catgtgtcct cagaagctaa cc 32<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于構(gòu)建小鼠p40-IL-2融合蛋白的反向引物<220><221>其它特征<222>互補(bǔ)物(complement)((7)..(9))<223>翻譯終止密碼子<400>8ctcgagctag gatcggaccc tgcaggg 27<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述小鼠p40-IL-2融合蛋白連接處的DNA序列<220><221>其它特征<222>(14)..(16)<223>編碼小鼠p40的C端氨基酸殘基<220><221>其它特征<222>(26)..(28)<223>編碼成熟小鼠IL-2的N端氨基酸殘基<400>9ctgcagggtc cgatccccgg gtaaagcacc c 31<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在單鏈小鼠IL12和GMCSF連接處的DNA序列<220><221>其它特征<222>(14)..(16)<223>編碼小鼠p40的C端氨基酸殘基<220><221>其它特征<222>(26)..(28)<223>編碼成熟小鼠GMCSF的N端氨基酸殘基<400>10ctgcagggtc cga tccccgg gaaaagca 28<210>11<211>2013<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述小鼠p35-接頭-p40-IL-2融合蛋白編碼序列<400>11agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc 600ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720gaagaagatg acatcacctg gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag 780accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga 840ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc 900actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac 960tccggacggt tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gttcaacatc 1020aagagcagta gcagttcccc tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtct 1080gcagagaagg tcacactgga ccaaagggac tatgagaagt attcagtgtc ctgccaggag 1140gatgtcacct gcccaactgc cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg 1200cagcagaata aatatgagaa ctacagcacc agcttcttca tcagggacat catcaaacca 1260gacccgccca agaacttgca gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggtcagctgg 1320gagtaccctg actcctggag cactccccat tcctacttct ccctcaagtt ctttgttcga 1380atccagcgca agaaagaaaa gatgaaggag acagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg 1440ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa 1500gctcaggatc gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggtc 1560cgatccccgg gtaaagcacc cacttcaagc tctacagcgg aagcacagca gcagcagcag 1620cagcagcagc agcagcagca gcacctggag cagctgttga tggacctaca ggagctcctg 1680agcaggatgg agaattacag gaacctgaaa ctccccagga tgctcacctt caaattttac 1740ttgcccaagc aggccacaga attgaaagat cttcagtgcc tagaagatga acttggacct 1800ctgcggcatg ttctggattt gactcaaagc aaaagctttc aattggaaga tgctgagaat 1860ttcatcagca atatcagagt aactgttgta aaactaaagg gctctgacaa cacatttgag 1920tgccaattcg atgatgagtc agcaactgtg gtggactttc tgaggagatg gatagccttc 1980tgtcaaagca tcatctcaac aagccctcaa taa 2013<210>12<211>1569<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述小鼠p35-接頭-p40融合蛋白編碼序列<400>12agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc 600ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720gaagaagatg acatcacctg gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag 780accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga 840ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc 900actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac 960tccggacggt tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gttcaacatc 1020aagagcagta gcagttcccc tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtct 1080gcagagaagg tcacactgga ccaaagggac tatgagaagt attcagtgtc ctgccaggag 1140gatgtcacct gcccaactgc cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg 1200cagcagaata aatatgagaa ctacagcacc agcttcttca tcagggacat catcaaacca 1260gacccgccca agaacttgca gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggtcagctgg 1320gagtaccctg actcctggag cactccccat tcctacttct ccctcaagtt ctttgttcga 1380atccagcgca agaaagaaaa gatgaaggag acagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg 1440ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa 1500gctcaggatc gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggtc 1560cgatcctag 1569<210>13<211>2709<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述小鼠Fc-p35-接頭-p40-IL-2融合蛋白編碼序列<400>13gagcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc 60ttgggtggac catccgtctt catcttccct ccaaagatca aggatgtact catgatctcc 120ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag 180atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggactggatg 300agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga 360accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctccacca 420gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct 480gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact 540gaaccagtcc tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag 600aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat 660caccacacga ctaagagctt ctcccggacc ccgggtaggg tcattccagt ctctggacct 720gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg 780gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacatc 840acacgggacc aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag 900agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag 960aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac 1020cagacagagt tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt 1080ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc 1140gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag 1200ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc 1260tatctgagct ccgcgtcgag cgggggcagc gggggcggag gcagcggcgg gggcggatcc 1320gccatgtggg tgctggagaa agacgtttat gttgtagagg tggactggac tcccgatgcc 1380cctggagaaa cagtgaacct cacctgtgac acgcctgaag aagatgacat cacctggacc 1440tcagaccaga gacatggagt cataggctct ggaaagaccc tgaccatcac tgtcaaagag 1500tttctagatg ctggccagta cacctgccac aaaggaggcg agactctgag ccactcacat 1560ctgctgctcc acaagaagga aaatggaatt tggtccactg aaattttaaa aaatttcaaa 1620aacaagactt tcctgaagtg tgaagcacca aattactccg gacggttcac gtgctcatgg 1680ctggtgcaaa gaaacatgga cttgaagttc aacatcaaga gcagtagcag ttcccctgac 1740tctcgggcag tgacatgtgg aatggcgtct ctgtctgcag agaaggtcac actggaccaa 1800agggactatg agaagtattc agtgtcctgc caggaggatg tcacctgccc aactgccgag 1860gagaccctgc ccattgaact ggcgttggaa gcacggcagc agaataaata tgagaactac 1920agcaccagct tcttcatcag ggacatcatc aaaccagacc cgcccaagaa cttgcagatg 1980aagcctttga agaactcaca ggtggaggtc agctgggagt accctgactc ctggagcact 2040ccccattcct acttctccct caagttcttt gttcgaatcc agcgcaagaa agaaaagatg 2100aaggagacag aggaggggtg taaccagaaa ggtgcgttcc tcgtagagaa gacatctacc 2160gaagtccaat gcaaaggcgg gaatgtctgc gtgcaagctc aggatcgcta ttacaattcc 2220tcatgcagca agtgggcatg tgttccctgc agggtccgat ccccgggtaa agcacccact 2280tcaagctcta cagcggaagc acagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcac 2340ctggagcagc tgttgatgga cctacaggag ctcctgagca ggatggagaa ttacaggaac 2400ctgaaactcc ccaggatgct caccttcaaa ttttacttgc ccaagcaggc cacagaattg 2460aaagatcttc agtgcctaga agatgaactt ggacctctgc ggcatgttct ggatttgact 2520caaagcaaaa gctttcaatt ggaagatgct gagaatttca tcagcaatat cagagtaact 2580gttgtaaaac taaagggctc tgacaacaca tttgagtgcc aattcgatga tgagtcagca 2640actgtggtgg actttctgag gagatggata gccttctgtc aaagcatcat ctcaacaagc 2700cctcaataa 2709<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR擴(kuò)增小鼠IL-12 p35亞單位的正向引物<220><221>其它特征<222>(16)..(18)<223>翻譯起始密碼子<400>14aagcttgcta gcagcatgtg tcaatcacgc tac 33<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR擴(kuò)增小鼠IL-12 p35亞單位的反向引物<220><221>其它特征<222>互補(bǔ)物((10)..(12))<223>翻譯終止密碼子<400>15ctcgagcttt caggcggagc tcagatagcc 30<210>16<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含小鼠單鏈IL-12的p35和p40連接處的編碼序列<220><221>其它特征<222>(8)..(10)<223>編碼小鼠p35的C端氨基酸殘基<220><221>其它特征<222>(59)..(61)<223>編碼成熟小鼠p40的N端氨基酸殘基<400>16gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccgccat 60g 61<210>17<211>16<212>蛋白<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含小鼠單鏈IL-12的p35和p40的連接處的蛋白序列<400>17Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala1 5 10 15<210>18<211>73<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在小鼠p40和KS重鏈成熟N端之間連接處的編碼序列<220><221>其它特征<222>(14)..(16)<223>編碼小鼠p40的C端氨基酸殘基<220><221>其它特征<222>(71)..(73)<223>編碼成熟KS重鏈的N端殘基<400>18ctgcagggtc cgatccccgg gatccggagg ttcagggggc ggaggtagcg gcggaggggg 60ctccttaagc cag73<210>19<211>18<212>蛋白<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在小鼠p40和KS重鏈成熟N端之間連接處的蛋白序列<400>19Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15Leu Ser<210>20<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在小鼠p35和KS輕鏈之間連接處的編碼序列<220><221>其它特征<222>(8)..(10)<223>編碼小鼠p35的C端氨基酸殘基<220><221>其它特征<222>(62)..(64)<223>編碼輕鏈的N端氨基酸殘基<400>20gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccttaag 60cgag 64<210>21<211>17<212>蛋白<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在小鼠p35和KS輕鏈連接處的蛋白序列<400>21Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu1 5 10 15Ser<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR擴(kuò)增小鼠IL-4的正向引物<220><221>其它特征<222>(9)..(11)<223>翻譯起始密碼子<400>22tctagaccat gggtctcaac ccccagc 27<210>23<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR擴(kuò)增小鼠IL-4的反向引物<220><221>其它特征<222>互補(bǔ)物((8)..(10))<223>編碼小鼠IL-4的C端氨基酸殘基<400>23cggatcccga gtaatccatt tgcatgatgc tctttaggct ttccagg47<210>24<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在小鼠IL-4和成熟KS-1/4輕鏈的連接處的編碼序列<220><221>其它特征<222>(1)..(3)<223>編碼小鼠IL-4的C端絲氨酸殘基<220><221>其它特征<222>(55)..(57)<223>編碼成熟KS-1/4輕鏈的N端氨基酸殘基<400>24tcgggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagcgag 57<210>25<211>19<212>蛋白<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在小鼠IL-4和成熟KS-1/4輕鏈連接處的蛋白序列<400>25Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15Leu Ser Glu<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR擴(kuò)增小鼠IL-4的正向引物<220><221>其它特征<222>(9)..(11)<223>翻譯起始密碼子<400>26tctagaccat gggtctcaac ccccagc 27<210>27<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR擴(kuò)增小鼠IL-4的反向引物<220><221>其它特征<222>互補(bǔ)物((13)..(15))<223>編碼小鼠IL-4的C端氨基酸殘基<400>27cgatatcccg gacgagtaat ccatttgcat gatgctcttt aggctttcca gg52<210>28<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在小鼠IL-4和小鼠GM-CSF之間連接處的編碼序列<220><221>其它特征<222>(1)..(12)<223>編碼muIL4的C端序列<220><221>其它特征<222>(28)..(39)<223>編碼muGM-CSF的N端序列<400>28atggattact cgtccgggat gggaaaagca cccgcccgc 39<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR擴(kuò)增小鼠淋巴趨化因子的正向引物<220><221>其它特征<222>(13)..(15)<223>翻譯起始密碼子<400>29tctagagcca ccatgagact tctcctcctg ac 32<210>30<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR擴(kuò)增小鼠淋巴趨化因子的反向引物<220><221>其它特征<222>互補(bǔ)物((7)..(9))<223>編碼小鼠淋巴趨化因子的C端氨基酸殘基<400>30ggatccccca gtcagggtta ctgctg26<210>31<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在小鼠淋巴趨化因子和KS-IL2重鏈之間連接處的編碼序列<220><221>其它特征<222>(1)..(3)<223>編碼小鼠淋巴趨化因子的C端氨基酸殘基<220><221>其它特征<222>(55)..(57)<223>編碼KS-IL2重鏈的N端氨基酸殘基<400>31cccggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagccag 57<210>32<211>17<212>蛋白<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在小鼠淋巴趨化因子和KS-IL2重鏈之間連接處的蛋白序列<400>32Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu1 5 10 15Ser
權(quán)利要求
1.一種多功能融合蛋白，它包含限定為免疫球蛋白區(qū)段(Ig)、第一種細(xì)胞因子(C1)和第二種不同的細(xì)胞因子(C2)的多肽鏈。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述Ig、所述C1和所述C2從N端至C端的方向排列產(chǎn)生由選自以下的組成式定義的融合蛋白(i)Ig—C1—C2；(ii)C1—Ig—C2；和(iii)C1—C2—Ig，其中破折號表示多肽鍵或多肽接頭。
3.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述C1或所述C2包括IL-2、IL-4或GM-CSF。
4.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述C1或所述C2包括異源二聚體細(xì)胞因子亞單位。
5.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述C1為趨化因子。
6.權(quán)利要求4的融合蛋白，其中所述亞單位包括IL-12的p35亞單位或IL-12的p40亞單位。
7.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述C1或所述C2為人細(xì)胞因子。
8.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述Ig包括免疫球蛋白重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(VH)。
9.權(quán)利要求1或8的融合蛋白，其中所述Ig包括免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。
10.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中所述恒定區(qū)包含鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。
11.權(quán)利要求10的融合蛋白，其中所述恒定區(qū)還含有CH1結(jié)構(gòu)域。
12.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中所述VH對癌癥特異性抗原或病毒抗原具有免疫反應(yīng)性。
13.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述C1和所述C2當(dāng)以所述融合蛋白連接時(shí)在體內(nèi)具有相似的循環(huán)半衰期。
14.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述Ig、所述C1和所述C2在相同條件下都具有活性。
15.一種多功能蛋白復(fù)合物，它包含第一條多肽鏈和第二條多肽鏈，其中所述第一條多肽鏈限定為免疫球蛋白區(qū)段和第一種細(xì)胞因子的第一部分，所述第二條多肽鏈限定為第二種細(xì)胞因子和第一種細(xì)胞因子的第二部分。
16.權(quán)利要求15的多功能蛋白復(fù)合物，其中所述第一條多肽鏈與所述第二條多肽鏈共價(jià)連接。
17.權(quán)利要求15的多功能蛋白復(fù)合物，其中所述第一種細(xì)胞因子為二聚體細(xì)胞因子。
18.權(quán)利要求15的多功能蛋白復(fù)合物，其中所述第一種細(xì)胞因子為IL-12。
19.權(quán)利要求15的多功能蛋白復(fù)合物，其中所述第二種細(xì)胞因子為IL-2。
20.一種多功能蛋白復(fù)合物，它至少包含第一種融合蛋白它包含與至少一部分免疫球蛋白輕鏈融合的第一種細(xì)胞因子，以及第二種融合蛋白它包含與至少一部分免疫球蛋白重鏈融合的第二種不同的細(xì)胞因子。
21.權(quán)利要求20的蛋白復(fù)合物，其中所述第一種融合蛋白與所述第二種融合蛋白共價(jià)結(jié)合。
22.權(quán)利要求21的蛋白復(fù)合物，其中所述免疫球蛋白輕鏈部分以二硫鍵與所述免疫球蛋白重鏈部分結(jié)合。
23.權(quán)利要求20的蛋白復(fù)合物，其中所述第一種細(xì)胞因子的N端與所述免疫球蛋白輕鏈的C端融合。
24.權(quán)利要求20的蛋白復(fù)合物，其中所述第二種細(xì)胞因子的N端與所述免疫球蛋白重鏈的C端融合。
25.權(quán)利要求20的蛋白復(fù)合物，其中所述第一種細(xì)胞因子為IL-12。
26.權(quán)利要求20的蛋白復(fù)合物，其中所述第二種細(xì)胞因子為IL-12。
27.一種多功能融合蛋白，它包含限定為第一種細(xì)胞因子(C1)和第二種不同的細(xì)胞因子(C2)的多肽鏈，其中所述C2單獨(dú)具有的體內(nèi)循環(huán)半衰期比單獨(dú)的C1高約2倍，但當(dāng)所述C1以所述融合蛋白與所述C2連接時(shí)，所述融合蛋白中的所述C1的體內(nèi)循環(huán)半衰期與所述C2大致相同。
28.權(quán)利要求27的融合蛋白，其中所述C1為IL-2或GM-CSF。
29.權(quán)利要求27的融合蛋白，其中所述C2為IL-4、IL-12或其亞單位。
30.權(quán)利要求27的融合蛋白，其中所述C1的C末端與所述C2的N末端連接。
31.權(quán)利要求27的融合蛋白，其中所述C2的C末端與所述C1的N末端連接。
32.權(quán)利要求30或31的融合蛋白，其中所述C末端通過多肽接頭與所述N末端連接。
33.權(quán)利要求32的融合蛋白，它還含有免疫球蛋白區(qū)段(Ig)。
34.權(quán)利要求33的融合蛋白，其中所述Ig含有免疫球蛋白重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(VH)。
35.權(quán)利要求33的融合蛋白，其中所述Ig含有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。
36.權(quán)利要求35的融合蛋白，其中所述恒定區(qū)包含鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。
37.權(quán)利要求36的融合蛋白，其中所述重鏈恒定區(qū)還含有CH1結(jié)構(gòu)域。
38.權(quán)利要求27的融合蛋白，其中所述單獨(dú)的C2的體內(nèi)循環(huán)半衰期比C1的體內(nèi)循環(huán)半衰期至少高約4倍。
39.權(quán)利要求38的融合蛋白，其中所述C2的循環(huán)半衰期比C1的體內(nèi)循環(huán)半衰期至少高約8倍。
40.一種核酸，它編碼權(quán)利要求1、15、20或27的融合蛋白。
41.一種細(xì)胞，它包含權(quán)利要求40的核酸。
42.一種制備融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含第一種細(xì)胞因子(C1)、第二種不同的細(xì)胞因子(C2)和能夠靶向哺乳動物預(yù)先選定部位的靶向部分，所述方法包括以下步驟(a)在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含所述C1、所述C2和在給予哺乳動物時(shí)能夠?qū)⑺鋈诤系鞍装邢蝾A(yù)先選定部位的靶向部分；和(b)收獲所述融合蛋白。
43.一種將第一種細(xì)胞因子(C1)和第二種不同的細(xì)胞因子(C2)靶向哺乳動物預(yù)先選定部位的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物一種多功能融合蛋白，該融合蛋白包含C1、C2和能夠?qū)⑺鋈诤系鞍装邢虿溉閯游镱A(yù)先選定部位的免疫球蛋白區(qū)段(Ig)。
44.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述Ig包含與布局在哺乳動物預(yù)先選定部位的抗原具有免疫反應(yīng)性的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述抗原為癌癥特異性抗原或病毒抗原。
46.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述Ig包含能夠結(jié)合布局在哺乳動物預(yù)先選定部位的免疫球蛋白Fc受體的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。
47.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述Ig、所述C1和所述C2在所述融合蛋白給予所述哺乳動物時(shí)均有活性。
48.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述哺乳動物為人。
49.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述C1為IL-12或其亞單位。
56.權(quán)利要求49的方法，其中所述C2選自IL-2和GM-CSF。
57.一種治療哺乳動物疾病的方法，該方法包括給予所述哺乳動物權(quán)利要求1、15、20或27的蛋白。
58.一種治療哺乳動物疾病的方法，該方法包括給予所述哺乳動物權(quán)利要求40的核酸。
59.一種治療哺乳動物疾病的方法，該方法包括給予所述哺乳動物權(quán)利要求41的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括至少兩種不同細(xì)胞因子分子的蛋白復(fù)合物和融合蛋白。所述蛋白復(fù)合物和融合蛋白還可以包括諸如免疫球蛋白區(qū)段的靶向部分。本發(fā)明還公開了使用所述蛋白復(fù)合物和融合蛋白的方法。
文檔編號A61K48/00GK1382158SQ00813726
公開日2002年11月27日 申請日期2000年8月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月9日
發(fā)明者S·D·吉利斯, 勞健明 申請人:利思進(jìn)藥品公司