專利名稱：灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物及其制備方法，以及該活性總皂苷在制備治療癌癥藥物中的應用。更具體的說，本發(fā)明涉及灰氈毛忍冬花及花蕾中包括含抗癌活性糖鏈結構皂苷在內(nèi)的成分及其制備方法，通過將總皂苷先水解再分，由此獲得的提取物直接由活性皂苷成分組成，主要皂苷成分比例明確，易于掌握其有效劑量，且用于制備治療癌癥藥物更為安全、更為穩(wěn)定。
背景技術：
灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.)為忍冬科Caprfoliaceae忍冬屬植物，2005版中華人民共和國藥典收載，列入山銀花項下。忍冬屬植物含有大量的皂苷，主要為常春藤型和齊墩果酸型皂苷。常春藤皂苷及齊墩果酸型皂苷具有保肝(時京珍等，黃褐毛忍冬和灰氈毛忍冬幾種成分對大、小鼠化學性肝損傷的保護作用，中國中藥雜志，1999，24(6)363-364)、抗癌(Cytotoxic saponins from the root of Dipsacus asper Wall.Arch Pharm Res.2005，28(9)1053-6.)活性。江蘇省中國科學院藥用植物研究開發(fā)中心在對灰氈毛忍冬花及花蕾中主要皂苷類成分的分離中，得到了二個主要皂苷類成分，明確了其皂苷類成分的組成和性質和用途。本發(fā)明采取堿水解后分離，既簡化了工藝步驟，適合工業(yè)化大量生產(chǎn)，又大大提高了活性皂苷的得率，且由此得到的灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物的抗癌活性比未水解總皂苷高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是，給出一種從灰氈毛忍冬花及花蕾中提取以灰氈毛忍冬活性總皂苷為主要活性部位的組合物以及該組合物的制備方法，使制劑原料(活性總皂苷)得率及純度高，工藝簡便易行，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明進一步要解決的技術問題是，給出以灰氈毛忍冬活性總皂苷為有效部位制備藥物的醫(yī)藥用途。
本發(fā)明所采用的技術方案如下本發(fā)明涉及一種灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物，提取物中主要活性部位活性總皂苷含量為50％-90％，所含的皂苷類成分符合權利要求1中通式(1)。其中主要所含的皂苷及它們的重量比為灰氈毛忍冬次皂苷乙∶灰氈毛忍冬次皂苷甲＝12～6∶1。
本發(fā)明所述的灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物是通過下述方法獲得的提取物灰氈毛忍冬花及花蕾，用濃度為50％-90％的乙醇提取，回收溶劑，用石油醚、汽油、苯等低極性溶劑萃取，水層再用乙酸乙酯萃取，水層回收溶劑至濃浸膏，加入1％-10％NaOH或KOH溶液，40-100□下降解2-4小時，冷后加入丙酮沉淀，離心，離心所得沉淀用水洗至中性，用稀醇溶解，調(diào)節(jié)PH值為4-7，上大孔樹脂柱(HP20、D101、AB-8、HPD100、HPD300等)或聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗滌柱，再用30％-90％乙醇洗脫，收集洗脫液，加3％-5％的藥用活性炭脫色，過濾，濃縮干燥，即得灰氈毛忍冬活性總皂苷。
本發(fā)明所說的灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物，是指經(jīng)過上述方法提取獲得的有效部位。
本發(fā)明所述的灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物，經(jīng)藥理學、藥效學和大量的動物實驗研究證明，具有抗腫瘤作用；在體外實驗中，顯著抑制人肝癌HepG2細胞及人肺癌A549細胞增殖；在體內(nèi)實驗中，對H22肝癌細胞荷瘤小鼠及Lewis肺癌細胞荷瘤小鼠，能抑制腫瘤的生長，增長荷瘤小鼠免疫力及生存期。所含成分明確，劑量易于掌握控制，因此可以在制備治療癌癥的藥物中應用。
本發(fā)明提取物灰氈毛忍冬活性總皂苷可以制備成片劑、膠囊劑、顆粒劑、沖劑、散劑、丸劑、口服液、糖漿劑、混懸劑、噴霧劑、溶液、湯劑、凝膠劑、霜劑、乳膏劑、滴劑等。在上述制劑中，有效劑量的本發(fā)明提取物可以單獨或與藥學尚可接受的載體賦形劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑等組成混合物。
具體實施例方式
實施例一 灰氈毛忍冬花蕾水部分得到的皂苷類成分灰氈毛忍冬干燥花蕾，90％乙醇回流提取三次，合并提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，剩下的水液上大孔樹脂柱，經(jīng)水-乙醇梯度洗脫，反相柱反復純化脫色得到二個主要皂苷類成分，結構均含有抗癌活性單位。
二個皂苷分別為灰氈毛忍冬次皂苷乙(A)，即3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(14)-β-D-吡喃葡萄糖基(1-3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂甙元； 灰氈毛忍冬次皂苷甲(B)，即3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂甙元；

皂苷的含量測定1.儀器與試劑高效液相色譜儀Aglient 1100系列，四元泵，自動進樣器，檢測器Alltech ELSD2000(Alltech，Deerfield，IL，USA)，色譜柱Aglient Zorbax SB-C18柱(150×4.6mm，5.0μm)，乙腈為色譜純，磷酸為分析純。
2.色譜條件流動相0-10min，乙腈0.5％磷酸溶液維持比例(29∶71)，10-25min，流動相比例由(29∶71)線形改變到(46∶54)，25-30min，流動相維持比例(46∶54)。ELSD管溫度106□。氮氣流速2.6L/min。
3.對照品溶液的制備分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的灰氈毛忍冬次皂苷乙和灰氈毛忍冬次皂苷甲對照品，各加甲醇制成每1ml分別含0.03mg的溶液，作為對照溶液。
4.樣品測定取本品中粉約20mg(同時另取本品粉測定水分)，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇回流提取4小時，放冷后，轉移至100ml容量瓶中，甲醇定容即得。各樣品經(jīng)高效液相檢測，計算得兩種次皂苷的含量比例為12～6∶1，詳見實施實例三至十。下面給出按前述技術方案的制備方法提取灰氈毛忍冬活性總皂苷及皂苷的含量測定的8個實施實例，詳見下表實施例二

實施例三

實施例四

實施例五

實施例六

實施例七

實施例八

實施例九

實施例十 灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物的體內(nèi)外抗腫瘤活性評價實驗1.灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物對人肝癌細胞HepG2及人肺癌細胞A549的抑制作用1.1目的研究灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物對人肝癌細胞HepG2及人肺癌細胞A549的體外生長抑制作用。
1.2材料四甲基唑氮藍(MTT)；灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物臨用前配成相應濃度；人肝癌HepG2細胞株或人肺癌A549細胞株置于含10％小牛血清的RPMI-1 640培養(yǎng)基中，在5％CO2、37□的細胞培養(yǎng)箱中傳代待用。
1.3方法與結果將處于對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細胞株或人肺癌A549細胞株調(diào)整濃度為2×105ml-1，培養(yǎng)24小時后，按表中所列藥物濃度分別加入到5個藥物組，每個藥物濃度均設4個復孔，取平均值計算，另設一個空白對照孔。細胞在37□、5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，加入5mg/ml的MTT液20M1，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時，加入DMSO溶解后迅速用酶標儀在570nm處測定OD值，計算細胞生長抑制率，實驗結果見表1。
生長抑制率(％)＝(1-加藥孔平均A值/空白對照孔平均A值)×100％表1 對HepG2細胞及A549細胞的細胞毒作用

用不同濃度的灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物處理HepG2細胞及A549細胞，可見癌細胞的生長均受到抑制，且呈濃度和時間依賴性。結果表明，灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物對腫瘤細胞有較強的細胞毒作用。
2.灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物與未水解總皂苷提取物抗癌活性的比較研究2.1目的比較灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物與未水解總皂苷提取物的抗癌活性。
2.2材料灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物臨用前配成相應濃度；未水解總皂苷提取物灰氈毛忍冬花蕾，用濃度為90％的乙醇提取，回收溶劑，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，水層回收溶劑至濃浸膏，加入丙酮沉淀，離心，沉淀用稀醇溶解，調(diào)節(jié)PH值為6，上D101大孔樹脂柱，先用水及20％乙醇洗滌柱，再用30％-90％乙醇洗脫，洗脫液脫色、過濾、濃縮干燥即得。
2.3方法與結果MTT比色法同前，分為空白對照組、活性組和未水解組，其中為水解組分為五個濃度組，實驗結果見表2。
表2 灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物與未水解總皂苷提取物的抗癌活性的比較

從實驗結果可以看出，未水解灰氈毛忍冬總皂苷抗腫瘤活性降低，IC50＞300μg/ml。水解反應大大提高了提取物的抗腫瘤活性。
3.灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤實驗3.1目的研究灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物對小鼠肝癌H22的抑制作用。
3.2材料昆明種雄性小鼠40只，體重(20±2g)；5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業(yè)產(chǎn)品；灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物臨用前用生理鹽水配成相應濃度。實驗室溫度20±3□，相對濕度75％。
3.3方法與結果無菌條件下剝?nèi)鞔?0天的肝癌H22癌塊，制成勻漿，用生理鹽水1∶3稀釋，計數(shù)調(diào)整細胞濃度為2×106L-1，每只0.2ml，接種于小鼠右腋部皮下，24小時后隨機分為5組，即陰性對照組(生理鹽水)、藥物大劑量組、藥物中劑量組、藥物小劑量組及陽性對照組(5-氟尿嘧啶)，每組均灌胃相應濃度藥物或生理鹽水，每天一次，十天后稱重處死，腫瘤塊稱重計算腫瘤生長抑制率，結果見表3。
腫瘤生長抑制率抑制率(％)＝(1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％表3 灰氈毛忍冬活性總皂苷對H22荷瘤小鼠和Lewis荷瘤小鼠抑瘤率的影響

灰氈毛忍冬活性總皂苷對H22荷瘤小鼠生存期的影響結果見表4。
表4 灰氈毛忍冬活性總皂苷對H22荷瘤小鼠生存期的影響

結果表明樣品組與陰性對照組比較小鼠生存期顯著增長，有非常顯著差異，p＜0.01。
4.灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物對小鼠Lewis肺癌的抑制作用4.1目的研究灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物對小鼠Lewis肺癌的抑制作用。
4.2材料昆明種雄性小鼠32只，體重(20±2g)；灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物臨用前用生理鹽水配成相應濃度。實驗室溫度20±3□，相對濕度75％。
4.3方法與結果無菌條件下剝?nèi)鞔?0天的Lewis肺癌癌塊，制成勻漿，用生理鹽水1∶3稀釋，計數(shù)調(diào)整細胞濃度為1×107ml-1，每只0.2ml，接種于小鼠右腋部皮下，24小時后隨機分為5組，即陰性對照組(生理鹽水)、藥物大劑量組、藥物中劑量組及藥物小劑量組，每組均灌胃相應濃度藥物或生理鹽水，每天一次，十天后稱重處死。稱量腫瘤塊重量，計算腫瘤生長抑制率，見表3。
腫瘤生長抑制率抑制率(％)＝(1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％結果表明灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物能顯著抑制H22荷瘤小鼠瘤重及Lewis荷瘤小鼠瘤重，具有抗癌活性。
權利要求
1.一種灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物，其特征是提取物中主要活性部位活性總皂苷含量為50％-90％，所含的皂苷類成分符合以下通式(1)，其中主要所含的皂苷及它們的重量比為灰氈毛忍冬次皂苷乙∶灰氈毛忍冬次皂苷甲＝12～6∶1， R3＝H，OHR2＝HR1＝H，糖鏈(1)。
2.根據(jù)權利要求1所述的提取物，其特征是所說的提取物是通過下述方法獲得的提取物灰氈毛忍冬花及花蕾，用濃度為50％-90％的乙醇提取，回收溶劑，用低極性溶劑萃取，水層再用乙酸乙酯萃取，水層回收溶劑至濃浸膏，加入1％-10％NaOH或KOH溶液，40-100□下降解2-4小時，冷后加入丙酮沉淀，離心，離心所得沉淀用水洗至中性，用稀醇溶解，調(diào)節(jié)PH值為4-7，上大孔樹脂柱或聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗滌柱，再用30％-90％乙醇洗脫，收集洗脫液，加3％-5％的藥用活性炭脫色，過濾，濃縮干燥，即得灰氈毛忍冬活性總皂苷。
3.根據(jù)權利要求2所述的提取物，其特征是用石油醚、汽油、苯等低極性溶劑萃取，水層再用乙酸乙酯萃取，水層回收溶劑至濃浸膏，加入1％-10％NaOH或KOH溶液，40-100□下降解2-4小時，冷后加入丙酮沉淀，離心，離心所得沉淀用水洗至中性，用稀醇溶解，調(diào)節(jié)PH值為4-7，拌樣或直接上大孔樹脂柱(HP20、D101、AB-8、HPD100、HPD300)或聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗滌柱，再用30％-90％乙醇洗脫，收集洗脫液，加3％-5％的藥用顆粒狀活性炭脫色，過濾，濃縮干燥，即得灰氈毛忍冬活性總皂苷。
4.根據(jù)權利要求1-3所提取的灰氈毛忍冬花及花蕾有效部位灰氈毛忍冬活性總皂苷的提取工藝方法，其特征是所提的灰氈毛忍冬活性總皂苷為灰氈毛忍冬次皂苷乙灰氈毛忍冬次皂苷甲。
5.根據(jù)權利要求1-3所提取的灰氈毛忍冬次皂苷乙灰氈毛忍冬次皂苷甲，其特征在制備治療或預防人體肝癌的藥中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種灰氈毛忍冬活性總皂苷提取物及其制備方法和用途。提取物為灰氈毛忍冬活性總皂苷，制備方法包括50－90％乙醇提取，低極性溶劑萃取，乙酸乙酯萃取，堿水解，丙酮沉淀，離心，大孔樹脂或聚酰胺柱層析，活性炭脫色，得到灰氈毛忍冬活性總皂苷。本發(fā)明的提取工藝及方法獲得的有效成分得率及純度高，已明確了灰氈毛忍冬活性總皂苷的藥理、藥效作用及其中的有效成分和它們的含量比例，易于掌握有效劑量。本發(fā)明獲得的有效成分的有效劑量對體外培養(yǎng)的人癌細胞株有細胞毒活性，對小鼠肝癌H
文檔編號A61K31/56GK1821262SQ20061003929
公開日2006年8月23日 申請日期2006年4月4日 優(yōu)先權日2006年4月4日
發(fā)明者馮煦, 賈曉東, 王鳴, 趙友誼, 孫浩, 郭可耀 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所