專利名稱：高麗參提取物在預(yù)防和治療肌肉萎縮性疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及制備預(yù)防和治療肌肉萎縮性疾病的藥物。
背景技術(shù)：
肌肉萎縮是指橫紋肌營養(yǎng)不良，肌肉體積較正常縮小，肌肉纖維變細或消失。廢用和疾病均可導(dǎo)致肌肉萎縮，進而導(dǎo)致肌無力使患者失去生活能力甚至死亡。目前，對于肌肉萎縮的預(yù)防和治療還沒有行之有效的方法。
骨骼肌主要由I型(慢肌)和II型(快肌)肌肉組成，I型肌比II型肌含有更多的線粒體，以氧化代謝作為主要能量來源，而II型肌主要以糖酵解產(chǎn)生ATP，同時伴有酸性物質(zhì)的產(chǎn)生，因此，II型肌更易于疲勞。
PGC-1α是轉(zhuǎn)錄因子共活化因子，它不直接與DNA結(jié)合，而是通過與結(jié)合在DNA上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能。其功能包括，1參與適應(yīng)性產(chǎn)熱的調(diào)節(jié)；2參與線粒體生成的調(diào)節(jié)；3參與褐色脂肪細胞的分化(Puigserver P，et al.Endocrine Rewiews 24(1)78-90，2003)。最近，又發(fā)現(xiàn)PGC-1α在I型肌中的表達高于II型肌，轉(zhuǎn)基因鼠表明，PGC-1α能促進I型肌的生成(Lin J，et.al.Nature418797-801，2002)。持續(xù)性鍛煉也能通過上調(diào)PGC-1α來促進I型肌的生成(Baar K，et al.FASEB，161879-1886，2002.Norrbom J.et al.J Appl.Physiol96189-194，2004)。因此，上調(diào)PGC-1α促進I型肌的生成，對于治療肌肉萎縮具有重要意義，但持續(xù)性鍛煉顯然有其局限性。
高麗參即具有治療疾病的功能，又有強身健體的功能。中醫(yī)講究的是“陰陽調(diào)和”，認為疾病是由于寒熱失調(diào)所引起的，這些理論體系顯得過于虛幻，缺少現(xiàn)代分子生物學(xué)研究支持。因此，我們以高麗參提取物為研究對象，充分運用分子生物學(xué)手段，揭示高麗參能上調(diào)骨骼肌中的PGC-1α，進而促進I型肌的生成，同時，為預(yù)防和治療肌肉萎縮提供新的療效顯著的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出利用高麗參提取物，制備預(yù)防和治療肌肉萎縮性疾病的藥物。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案本發(fā)明所述高麗參提取物為紅參提取物。
1.高麗參的提取和濃縮過程20克高麗參(紅參)加入200-300毫升的蒸餾水(10-15毫升蒸餾水/克高麗參)，煎煮30分鐘，留取上清，殘渣重復(fù)上述過程一次。兩次上清經(jīng)3層紗布過濾，用蒸餾水將藥液調(diào)至50ml，得到濃度為0.4g/ml的高麗參藥液，于4℃保存；2.高麗參刺激小鼠骨骼肌PGC-1α的表達按10mg/g的量每日灌胃，共14日，發(fā)現(xiàn)15日后，PGC-1α在腓腸肌中增加4倍，比目魚肌中增加1.4倍。
本發(fā)明的有益效果是為中藥治療肌肉萎縮性疾病提供了現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論依據(jù)。本發(fā)明首次闡明了高麗參提取物具有刺激PGC-1a表達的效應(yīng)，更重要的是，該結(jié)果提示高麗參可用于肌肉萎縮的預(yù)防和治療。目前中醫(yī)和現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究還沒有很好的結(jié)合起來，中藥作用的調(diào)節(jié)途徑和靶位點更是知之甚少。本研究室與合作者首次提出PGC-1a是肌肉類型的決定因子(Lin J，et.al.Nature 418797-801，2002.)，在慢肌(I型肌肉)的形成中發(fā)揮了重要作用，同時，PGC-1a可以刺激線粒體的生成，提高肌肉的氧化能力，這些都是改善肌肉狀態(tài)、抵抗疲勞的先決條件，因此，高麗參可以用來預(yù)防和治療肌肉萎縮性疾病。
四

圖1為給藥小鼠15日腓腸肌中PGC-1a表達的變化。1為對照組，2為給藥組。
圖2為給藥小鼠15日比目魚肌中PGC-1a表達的變化。1為對照組，2為給藥組。
五具體實施例方式
本發(fā)明把高麗參經(jīng)水兩次煎煮、過濾等步驟，得到高麗參提取物。灌胃小鼠，分離腓腸肌和比目魚肌，用real-time PCR方法測定PGC-1a的表達，結(jié)果證明高麗參提取物提高了骨骼肌組織中PGC-1a的表達。
材料與來源試劑，Trizol購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶和Tag酶購于大連寶生物工程有限公司。
手術(shù)器械剪刀，彎頭小鑷等購自江蘇思來科技有限公司。
其它器材Heidolph DIAX900勻漿器；ABI Prism 7000 Sequence DetectionSystem PCR儀；C57BL/6小鼠購于南京大學(xué)模式動物中心實施例1.高麗參的提取和濃縮20g高麗參(紅參)加入200ml的蒸餾水，加熱至沸騰后，煎煮30分鐘，留取上清，殘渣重復(fù)上述過程一次。兩次上清經(jīng)3層紗布過濾，將藥液調(diào)至50ml，得到濃度為0.4g/ml的高麗參藥液，于4℃保存。
2.小鼠給藥及組織的分離保存實驗用小鼠為SPF級的野生型雄性小鼠，品系C57BL/6，8-10周齡，飼養(yǎng)于南京市鼓樓醫(yī)院動物實驗中心。用灌胃針按10mg/g藥量每日灌胃給藥，對照組小鼠用等體積的生理鹽水灌胃，第15日將小鼠頸椎脫臼法處死。剪開腿部皮膚并分離之，以跟腱為標志，分離腓腸肌和比目魚肌，生理鹽水漂洗干凈，立即放于凍存管中，于液氮中保存?zhèn)溆谩?br> 3.組織RNA的提取、RT-PCR和real-time PCR取適量組織加1ml Trizol于Heidolph DIAX900組織勻漿器將組織充分勻漿(3檔90秒)，將勻漿液轉(zhuǎn)入潔凈的1.5ml離心管中，加入200μl氯仿，13200rpm離心10分鐘，小心吸取上清至另一潔凈的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，13200rpm離心10分鐘，棄上清，75％乙醇洗滌沉淀，室溫干燥，20μl DEPC水溶解，紫外分光法檢測濃度和純度。2μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20μl，含2μg RNA，1mMdNTP，RNA酶抑制劑1U/μl，Olig(dT)18引物2.5pmol/μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5U/μl，輕輕混勻，42℃1小時，冰上放置2分鐘，所得cDNA可用于real-timePCR。real-time PCR為20μl反應(yīng)體系，分別含0.5μl(檢測GAPDH)和1.5μl(檢測PGC-1a)cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，各1pmol/μl上、下游引物及相應(yīng)的探針，0.025U/μlTag酶，混勻。PCR反應(yīng)條件95℃5分鐘，95℃30秒，60℃60秒(40個循環(huán))72℃延伸3分鐘。引物序列，GAPDH上游引物5’-tgt gtc cgt cgt gga tct ga-3’，下游引物5’-cct gct tca cca cct tct tga-3’，探針序列5’-ccg cct gga gaa acc tgc caa gta tg-3’；PGC-1α上游引物5’-tga cac aac gcg gacaga a-3’，下游引物5’-cgg tgc att cct caa ttt ca-3’，探針序列5’-tga gag acc gct ttgaag ttt ttg-3’。結(jié)果用ABI Prism 7000 SDS Software分析，見附圖。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療肌肉萎縮性疾病的藥物，其特征是高麗參提取物為紅參提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高麗參提取物的制備方法，其特征在于高麗參的提取和濃縮過程按10-15毫升蒸餾水/克高麗參，加熱至沸騰后，文火煎煮0.5小時；經(jīng)過3層紗布過濾，得到高麗參提取物溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述高麗參提取物在制備預(yù)防和治療肌肉萎縮性疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生制藥技術(shù)領(lǐng)域，所述高麗參提取物為紅參提取物。本發(fā)明將高麗參經(jīng)過水煎煮，紗布過濾，得到濃縮提取物。用該提取物灌胃小鼠，能顯著刺激小鼠骨骼肌中PGC－1α的表達。本發(fā)明闡明了高麗參提取物刺激PGC－1α蛋白在骨骼肌中的表達，可做為預(yù)防和治療肌肉萎縮性疾病的藥物。
文檔編號A61P21/00GK1872118SQ20061003966
公開日2006年12月6日 申請日期2006年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月19日
發(fā)明者孫國勛, 陳曉萍, 戚曉強, 項陽, 張辰宇 申請人:南京大學(xué)