本發(fā)明涉及生物制劑領(lǐng)域，具體是指一種肌酸激酶檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

肌酸激酶(creatinekinase,ck)通常存在于動(dòng)物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、atp再生有直接關(guān)系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與atp之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)。肌酸激酶在臨床診斷中有十分重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗塞發(fā)生時(shí)，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，目前認(rèn)為在心肌梗塞的診斷中測(cè)定肌酸激酶的活性比做心電圖更為可靠。心肌梗死時(shí)，肌酸激酶在起病6小時(shí)內(nèi)升高，24小時(shí)達(dá)高峰，3-4日內(nèi)恢復(fù)正常。肌酸激酶因其具有重要的生理功能和臨床應(yīng)用價(jià)值已引起人們廣泛的重視和深入的研究，臨床上主要用于心肌梗死、病毒性心肌炎的輔助診斷。

目前檢測(cè)肌酸激酶(ck)總活性的方法有比色法、酶偶聯(lián)法、熒光法和生物發(fā)光法，其中比色法及酶偶聯(lián)法更常用。酶偶聯(lián)法多采用輔酶指示系統(tǒng)，如cn101063111b(2010.08.25)、cn1904062b(2010.11.24)、cn1916623b(2013.05.29)、cn103173519b(2014.07.02)、cn104374905b(2016.03.30)、cn104357544a(2015.02.18)。但是這些方案均存在不能有效消除內(nèi)源性肌酸干擾，影響檢測(cè)精度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，而提供一種肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，適合臨床應(yīng)用推廣。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是包括有由試劑1和試劑2的液體雙試劑，其中試劑1包括有以下組分：

磷酸鹽緩沖液100mmol/l-200mmol/l，ph＝7.4-7.8；

肌酸酶20ku/l-40ku/l

肌氨酸氧化酶8ku/l-16ku/l

4-氨基安替比林1mmol/l-10mmol/l

色原1mmol/l-10mmol/l

過氧化物酶10ku/l-20ku/l

酶保護(hù)劑該酶保護(hù)劑為液體酶保護(hù)劑，其含量為1ml-3ml/100ml；或者酶保護(hù)劑為固體酶保護(hù)劑，其含量為單位為1g-3g/100ml；

防腐劑nan30.6g/l-1.0g/l；

所述試劑2包括以下組分：

磷酸鹽緩沖液100mmol/l-200mmol/l，ph＝6.5-6.9；

磷酸肌酸260mmol/l-410mmol/l

二磷酸腺苷1.5mmol/l-3.2mmol/l

激活劑

防腐劑nan30.6g/l-1.0g/l。

進(jìn)一步設(shè)置是所述的試劑1中的磷酸鹽緩沖液的ph＝7.6；試劑2中的磷酸鹽緩沖液的ph＝6.7。

進(jìn)一步設(shè)置是該色原為3,5-二氯-2-羥基苯磺酸、n-乙基-(2-羥-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-4-氟苯胺、n-(2-羥-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、2,4,6-三碘-3-羥基苯甲酸、4-氯酚、2,4二氯酚或苯酚中的任意一種。

進(jìn)一步設(shè)置是色原為2,4,6-三碘-3-羥基苯甲酸，其濃度為6mmol/l。

進(jìn)一步設(shè)置是所述酶保護(hù)劑為果糖與表面活性劑的組合物，其中表面活性劑可選自脂肪醇聚氧乙烯(7)醚、月桂酸聚氧乙烯(9)酯、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、烷基酚聚氧乙烯(10)醚中的一種或多種。

進(jìn)一步設(shè)置是酶保護(hù)劑為果糖和月桂酸聚氧乙烯(9)酯1:1質(zhì)量比組合。

進(jìn)一步設(shè)置是所述激活劑為醋酸鎂與巰基試劑的組合物，其中巰基試劑選自n-乙酰半胱氨酸、巰基甘油、二硫蘇糖醇、二硫赤癬糖醇、巰基乙酸、巰基乙醇、半胱氨酸中一種或幾種組合。

進(jìn)一步設(shè)置是所述激活劑為醋酸鎂與n-乙酰半胱氨酸組合物，其中醋酸鎂的濃度為10mmol/l-25mmol/l，n-乙酰半胱氨酸組合物濃度16mmol/l-30mmol/l。

本發(fā)明的試劑盒的工作檢測(cè)原理為：肌酸激酶(ck)催化磷酸肌酸(crp)轉(zhuǎn)變成肌酸(cr)，同時(shí)二磷酸腺苷(adp)磷酸化成三磷酸腺苷(atp)；在肌酸酶的催化下肌酸水解產(chǎn)生肌氨酸和尿素；肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下釋放出h2o2；h2o2和4-氨基安替比林(4-aap)在過氧化物酶(pod)參與下發(fā)生trinder反應(yīng)(偶聯(lián)終點(diǎn)比色法)，反應(yīng)式如下：

本發(fā)明的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，采用液體雙試劑，可以有效消除內(nèi)源性肌酸干擾，無需樣本前處理，可直接利用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行大批量樣本檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，適合臨床應(yīng)用推廣。

本發(fā)明的試劑盒，采用上述具體組分配置的雙試劑，從而在實(shí)際檢測(cè)肌酸激酶時(shí)，可采用兩步法檢測(cè)，血清樣本與試劑1(r1)混合，37℃保溫5min，使樣品中所含內(nèi)源性肌酸引起的副反應(yīng)進(jìn)行完畢，然后加入試劑2(r2)啟動(dòng)ck的催化反應(yīng)，在主波長(zhǎng)546nm/輔助波長(zhǎng)660nm下讀取吸光度值，最后于37℃反應(yīng)計(jì)算出ck總活力，從而解決內(nèi)源性肌酸對(duì)肌酸激酶(ck)測(cè)定的干擾，本試劑盒的成分分配和對(duì)應(yīng)成分比例可先將血清樣本中原有肌酸反應(yīng)完全，從而可提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步介紹。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1于2-8℃和37℃水浴一周的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2于2-8℃和37℃水浴一周的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3于2-8℃和37℃水浴一周的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

實(shí)施例1

肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

磷酸鹽緩沖液100mmol/l，ph＝7.6,本實(shí)施例該ph值還可以是7.4或者7.8；

肌酸酶20ku/l

肌氨酸氧化酶8ku/l

4-氨基安替比林(4-aap)1mmol/l

htib6mmol/l

過氧化物酶(pod)10ku/l

果糖5g/l

月桂酸聚氧乙烯(9)酯0.5％

nan30.6g/l

試劑2的組成：

磷酸鹽緩沖液100mmol/l，ph＝6.7

磷酸肌酸(crp)260mmol/l

二磷酸腺苷(adp)1.5mmol/l

醋酸鎂17mmol/l

nac23mmol/l

nan30.6g/l

實(shí)施例2

肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

磷酸鹽緩沖液150mmol/l，ph＝7.6

肌酸酶30ku/l

肌氨酸氧化酶12ku/l

4-氨基安替比林(4-aap)5mmol/l

htib6mmol/l

過氧化物酶(pod)15ku/l

果糖10g/l

月桂酸聚氧乙烯(9)酯1％

nan30.8g/l

試劑2的組成：

磷酸鹽緩沖液150mmol/l，ph＝6.7，本實(shí)施例該ph值還可以是6.5或者6.9；

磷酸肌酸(crp)330mmol/l

二磷酸腺苷(adp)2.3mmol/l

醋酸鎂17mmol/l

nac23mmol/l

nan30.8g/l

實(shí)施例3

肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

磷酸鹽緩沖液200mmol/l，ph＝7.6

肌酸酶40ku/l

肌氨酸氧化酶16ku/l

4-氨基安替比林(4-aap)10mmol/l

htib6mmol/l

過氧化物酶(pod)20ku/l

果糖15g/l

月桂酸聚氧乙烯(9)酯1.5％

nan31.0g/l

試劑2的組成：

磷酸鹽緩沖液200mmol/l，ph＝6.7

磷酸肌酸(crp)410mmol/l

二磷酸腺苷(adp)3.2mmol/l

醋酸鎂17mmol/l

nac23mmol/l

nan31.0g/l

實(shí)施例4

將本發(fā)明實(shí)施例1-3試劑盒進(jìn)行性能評(píng)價(jià)

1.準(zhǔn)確度驗(yàn)證：

選用朗道低、高值質(zhì)控品(1530，批號(hào)：1093un；1532，批號(hào)：849ue)，采用bs-420全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，具體操作方法如表一所述，采用單點(diǎn)定標(biāo)法定標(biāo)后，ck測(cè)定值及空白吸光度值可從儀器上直接讀取，為了減少偶然誤差，重復(fù)測(cè)定三次取均值，計(jì)算測(cè)定值與靶值的相對(duì)偏差。

表2實(shí)施例1-3測(cè)定低值質(zhì)控(1530)準(zhǔn)確度比較

表3實(shí)施例1-3測(cè)定高值質(zhì)控(1532)準(zhǔn)確度比較

由以上結(jié)果可知，本發(fā)明的試劑盒測(cè)定均值位于靶值范圍內(nèi)，相對(duì)偏差明顯<10％，說明本發(fā)明試劑盒準(zhǔn)確度較高。

2.精密度實(shí)驗(yàn)：

選用臨床常規(guī)樣本，用本發(fā)明實(shí)施例1-3試劑盒重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表4。

表4實(shí)施例1-3試劑盒重復(fù)性測(cè)定

由以上結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒實(shí)施例1-3變異系數(shù)(cv)分別為0.92％、0.98％、0.91％，均明顯<6％，說明本發(fā)明試劑盒具有良好的精密度。

3.穩(wěn)定性試驗(yàn)：

將本發(fā)明實(shí)施例1-3進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn)。將以上三種試劑盒每種平均分成兩份，一份至于2-8℃保存，另一份至于37℃水浴中保存，每隔一天測(cè)定一次，連續(xù)監(jiān)測(cè)一周，觀察血清樣本測(cè)定值(血清定值110.60u/l，允許誤差范圍(±10％)：99.54u/l-121.66u/l)，通過準(zhǔn)確度的測(cè)定比較試劑穩(wěn)定性。

表5實(shí)施例1試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表6實(shí)施例2試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表7實(shí)施例3試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

由圖1、圖2和圖3可以看出，實(shí)施例1-3制得的試劑盒的穩(wěn)定性良好。實(shí)施例1-3制得的試劑盒于37℃水浴一周，雖然測(cè)定ck濃度有一定程度的下降，但是下降的幅度不大，在允許范圍內(nèi)，說明加入合適的酶保護(hù)劑和ck激活劑可以保護(hù)相應(yīng)酶的活性，進(jìn)而提高試劑盒的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)試劑盒的保存期。

綜上性能評(píng)價(jià)可知，本發(fā)明實(shí)施例1-3試劑盒具有準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，可配合全自動(dòng)生化分析儀使用，在臨床診斷心肌梗死、病毒性心肌炎病情方面有很好的應(yīng)用價(jià)值。

應(yīng)用實(shí)施例

本發(fā)明肌酸激酶(ck)檢測(cè)試劑盒適用于各類全自動(dòng)生化分析儀，現(xiàn)于全自動(dòng)生化分析儀bs-420上的應(yīng)用，其具體使用方法如下：

表1樣本檢測(cè)操作程序

樣品中的ck含量(u/l)＝δat/δas×校準(zhǔn)液濃度

式中：δat：以空白管吸光度為對(duì)照的樣品管吸光度；

δas：以空白管吸光度為對(duì)照的校準(zhǔn)管吸光度；

本發(fā)明所使用的質(zhì)控品為朗道高、低值質(zhì)控品；所測(cè)樣品為不溶血血清。

有益效果：本發(fā)明采用trinder指示系統(tǒng)制備的肌酸激酶(ck)檢測(cè)試劑盒為液體雙試劑，采用兩步法，有效消除內(nèi)源性肌酸干擾，同時(shí)添加ck激活劑和相應(yīng)酶保護(hù)劑，可以提高ck測(cè)定的準(zhǔn)確度和試劑的穩(wěn)定性。