專利名稱：肝素鈉副產(chǎn)物中分離提純硫酸皮膚素和低分子硫酸乙酰肝素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于從肝素鈉副產(chǎn)物中分離提純硫酸皮膚素和低分子硫酸乙酰肝素的方法，屬粘多糖生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硫酸皮膚素是一種粘多糖，通常和其他粘多糖混合存在于動(dòng)物組織中。硫酸皮膚素由(1-4)-艾杜糖醛酸-(1-3)-乙酰氨基-2-脫氧-4-O-硫酸-β-D-半乳糖二糖基本單位組成，旋光-55～-63度，抗凝效價(jià)≤10USPu/mg，硫酸基與羧酸基比值為0.8～1.2。
純的硫酸皮膚素抗凝效價(jià)低，激活肝素輔因子II活性較高，且無出血副作用，作為抗血栓藥物具有很好的前景。
硫酸乙酰肝素是肝素的亞成分，存在于未分離的肝素中，稱為快運(yùn)動(dòng)肝素，與慢運(yùn)動(dòng)肝素相比，硫酸乙酰肝素分子量較小，乙酰化程度高，硫酸基含量較少，抗凝血效價(jià)較低。低分子硫酸乙酰肝素用于抗栓、抗炎、降血脂及糖尿病患者腎臟保護(hù)，是近年來研究最熱的粘多糖類生化藥。
在肝素鈉提純過程中，硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素通常以混合物的形式作為副產(chǎn)物被收集。該副產(chǎn)物通常含有硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素和少量的硫酸軟骨素。硫酸軟骨素易于除去，關(guān)鍵是硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素性質(zhì)相似，采用通常的離子交換層析和有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀方法難以將二者分離純化；因此，目前在相關(guān)的抗血栓藥品中，一般以二者未分離的混合物形態(tài)存在。例如市售的舒洛地特(Sulodexide)和(Mesoglycan)等藥物中同時(shí)含有硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素二種成分。
由于硫酸皮膚素和低分子硫酸乙酰肝素在抗栓、降血脂及糖尿病患者腎臟保護(hù)方面的顯箸功效，人們對(duì)硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素分離提純的研究從未間斷。
硫酸皮膚素純化研究最早可以追溯到1941年，Karl Meyer用豬皮經(jīng)木瓜酶降解，在醋酸-醋酸鈣緩沖液中以18％-25％乙醇分級(jí)沉淀，得到旋光度為-55～-63度的酸性粘多糖(當(dāng)時(shí)命名為“硫酸軟骨素B”，后證實(shí)它不是硫酸軟骨素，而是硫酸皮膚素)。
70年代初，Lennart Roden等人(Method Enzy 73，140，1972)從豬皮提取的肝素粗品中采用季銨鹽結(jié)合、解析，得到硫酸皮膚素粗品后，再通過以下兩種方法純化得到純的硫酸皮膚素。一種方法是類似于早期的醋酸—醋酸鈣乙醇分級(jí)沉淀的方法；另一種方法是使用本立德銅離子結(jié)合的方法，具體操作如下1克硫酸皮膚素粗品溶解于100ml水中，加入10ml飽和氫氧化鈉溶液，加入80ml本立德銅試劑，10分鐘后離心收集沉淀，以含本立德試劑的堿性水溶液洗脫沉淀兩次，以少量4M醋酸溶解沉淀，以氫氧化鈉中和，對(duì)水透析脫鹽、乙醇沉淀，得到高純度硫酸皮膚素。
以上方法制備的硫酸皮膚素純度高，但難以用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
1994年Nicola Volpi等人(Analy.Biochemi.218，382-391.1994)用丙酮梯度分級(jí)沉淀法處理粘多糖混合物純化各種粘多糖。但該方法難以得到高純度的粘多糖單一成份。
目前還沒有一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素提純及分離的好方法，因此也沒有純硫酸皮膚素或純低分子硫酸乙酰肝素產(chǎn)品問世。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從肝素鈉純化過程中獲取的副產(chǎn)物——硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素混合物中，分離出質(zhì)量穩(wěn)定的高純度硫酸皮膚素并制得低分子硫酸乙酰肝素的方法，該法適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，生產(chǎn)成本合理。
本發(fā)明方法的原料是生產(chǎn)肝素鈉的副產(chǎn)物，具體地說，是生產(chǎn)肝素鈉過程中通過乙醇分級(jí)沉淀及離子交換層析分離純化收集的副產(chǎn)物，其主要成分為硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素的混合物。本發(fā)明方法的要點(diǎn)是將主要含有硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素混合物的上述原料通過乙醇分級(jí)沉淀，得到硫酸皮膚素粗品；然后采用亞硝酸鹽或亞硝酸酯類化合物為氧化劑，使該粗品中含有的硫酸乙酰肝素降解成低分子硫酸乙酰肝素，再通過乙醇分級(jí)沉淀，分離得到高純度的硫酸皮膚素和低分子硫酸乙酰肝素。
具體操作步驟如下以生產(chǎn)肝素鈉獲取的副產(chǎn)物為原料，溶于1～3％的NaCl溶液中，使原料的濃度為5～12％(w/v)，加入乙醇，使乙醇體積含量達(dá)31～40％(v/v)，靜置數(shù)小時(shí)，收集沉淀，經(jīng)干燥處理后即為硫酸乙酰肝素粗品；上清液中補(bǔ)加乙醇，至乙醇體積含量達(dá)37～53％(v/v)，收集沉淀，經(jīng)干燥處理后即為硫酸皮膚素粗品。
將硫酸皮膚素粗品溶于水，按硫酸皮膚素粗品重量的0.5～5％加入氧化劑亞硝酸鹽，或按相應(yīng)克分子數(shù)加入氧化劑亞硝酸酯類化合物，進(jìn)行氧降解反應(yīng)，并使反應(yīng)液維持pH值2.5～3.0；反應(yīng)完成后調(diào)節(jié)溶液pH至中性，加入乙醇至體積含量達(dá)37～47％(v/v)，收集沉淀，經(jīng)干燥處理后即為硫酸皮膚素；上清液中補(bǔ)加乙醇至體積含量達(dá)45～57％(v/v)，收集沉淀，經(jīng)乙醇脫水，干燥后得低分子硫酸乙酰肝素。
本方法制得的硫酸皮膚素和低分子硫酸乙酰肝素均可用于口服或注射用藥物。
本發(fā)明根據(jù)硫酸皮膚素分子側(cè)鏈上的氨基是與乙酰氨基(2-乙酰氨基—脫氧-4-O-硫酸-D-半乳糖)連接，而硫酸乙酰肝素分子的氨基是與硫酸基連接(葡萄糖醛酸-2-氨基-2-脫氧-O-硫酸-D-葡萄糖)的結(jié)構(gòu)差異，利用亞硝酸類化合物僅能降解和硫酸基連接的氨基粘多糖(即乙酰肝素)，不能夠降解硫酸皮膚素分子中的和乙?；B接的乙酰氨基半乳糖(即硫酸皮膚素)的性質(zhì)，選擇了合適的反應(yīng)條件，使混合物中硫酸乙酰肝素降解為有較高溶解度的低分子硫酸乙酰肝素，隨后再用乙醇分級(jí)沉淀即可順利地將低分子硫酸乙酰肝素與硫酸皮膚素分離。
本方法制得的硫酸皮膚素產(chǎn)品經(jīng)測(cè)定，旋光度低于-55度，抗凝效價(jià)≤10USPu/mg，經(jīng)核磁共振鑒別，乙酰氨基半乳糖呈陽性，氨基硫酸葡萄糖呈陰性，經(jīng)電泳測(cè)定，產(chǎn)品的遷移率和硫酸皮膚素標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率相同，證實(shí)產(chǎn)品為高純度硫酸皮膚素。
綜上所述，本發(fā)明可從生產(chǎn)肝素的副產(chǎn)品中提取分離出高純度的硫酸皮膚素，并同時(shí)制得低分子硫酸乙酰肝素，方法簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一
(1)、原料為肝素鈉生產(chǎn)的副產(chǎn)品100g，測(cè)得旋光為-2.5度，效價(jià)為28USP u/mg。將原料溶于1200ml水中，加入氯化鈉36g，調(diào)節(jié)pH中性，加入乙醇至體積含量達(dá)36.5％，靜置3小時(shí)，收集沉淀并脫水干燥，得硫酸乙酰肝素粗品55.4g。
測(cè)得硫酸乙酰肝素粗品的旋光為+22.25度，抗凝血效價(jià)為38USPu/mg。
(2)、步驟(1)分離所得的上清液中補(bǔ)加乙醇，使乙醇體積含量達(dá)50％，靜置過夜，收集沉淀，加乙醇脫水，干燥，得硫酸皮膚素粗品40.9g。
測(cè)得硫酸皮膚素粗品的旋光為-32.75度，效價(jià)為8USPu/mg。
(3)、取步驟(2)所得的硫酸皮膚素粗品5g，溶于45ml水中，調(diào)節(jié)pH2.8，加入0.2g NaNO2，攪拌，通過滴加HCl或NaOH，使反應(yīng)溶液pH維持在2.5～3.0，用淀粉碘化鉀試紙測(cè)試溶液，觀察試紙顏色，直至試紙不變蘭，即為反應(yīng)完成；調(diào)節(jié)pH6.5，加入乙醇至體積含量達(dá)41.2％，過夜，收集沉淀，用乙醇脫水，干燥，得硫酸皮膚素2.7g。
測(cè)得硫酸皮膚素旋光為-57.5度，效價(jià)為7USPu/mg。
(4)、步驟(3)所得的上清液補(bǔ)中加乙醇，使體積含量達(dá)52％，過夜，收集沉淀，用乙醇脫水，干躁，得低分子硫酸乙酰肝素0.50g。
測(cè)得低分子硫酸乙酰肝素粗品的旋光為+35度，效價(jià)為45USPu/mg。
實(shí)施例二(1)原料為肝素鈉生產(chǎn)的副產(chǎn)品100g，測(cè)得旋光為+1.55度，效價(jià)為30USPu/mg。將原料溶于3％的NaCl溶液1200ml中，調(diào)節(jié)pH中性，加入乙醇至體積含量達(dá)36.0％，靜置4小時(shí)，收集沉淀，脫水干燥，得硫酸乙酰肝素粗品44.4g。
測(cè)得硫酸乙酰肝素粗品的旋光為+27.25度，抗凝血效價(jià)40USPu/mg。
(2)步驟(1)所得上清液中補(bǔ)加乙醇至體積含量達(dá)51％，過夜，收集沉淀，用乙醇脫水，干燥，得硫酸皮膚素粗品49.9g。
測(cè)得硫酸皮膚素粗品的旋光為-26.25度，效價(jià)為10USPu/mg。
(3)取硫酸皮膚素粗品5g，溶于45ml水中，調(diào)節(jié)PH2.7，加入0.03克分子重量的亞硝酸異戊酯，攪拌，并使反應(yīng)溶液pH維持2.5～3.0，用淀粉碘化鉀試紙測(cè)試溶液，觀察試紙顏色，直至試紙不變蘭，即為反應(yīng)完成；調(diào)節(jié)pH6.5，加入乙醇至體積含量達(dá)44.1％，過夜，收集沉淀，用乙醇脫水，干燥，得硫酸皮膚素產(chǎn)品2.3g。
測(cè)得硫酸皮膚素旋光-60.25度，效價(jià)5USPu/mg。
(4)上清液中補(bǔ)加乙醇至體積含量達(dá)53％，過夜，收集沉淀，用乙醇脫水干燥，得低分子硫酸乙酰肝素粗品0.45g。
測(cè)得低分子硫酸乙酰肝素粗品的旋光為+37度，效價(jià)為47USPu/mg。
權(quán)利要求
1.肝素鈉副產(chǎn)物中分離提純硫酸皮膚素和低分子硫酸乙酰肝素的方法，其特征是按以下步驟①.以生產(chǎn)肝素鈉獲取的副產(chǎn)物為原料，溶于1～3％w/w的NaCl溶液中，原料的濃度為5～12％w/v，加入乙醇，使乙醇體積含量達(dá)30～40％v/v，靜置數(shù)小時(shí)，收集沉淀，經(jīng)干燥處理后即為硫酸乙酰肝素粗品；②.上清液中補(bǔ)加乙醇至體積含量達(dá)37～53％v/v，收集沉淀，經(jīng)干燥處理得硫酸皮膚素粗品；③.將硫酸皮膚素粗品溶于水，加入氧化劑亞硝酸鹽或亞硝酸酯類化合物，在pH值2.5～3.0條件下進(jìn)行氧化降解反應(yīng)；④.反應(yīng)完成后調(diào)節(jié)pH至中性，加入乙醇至體積含量達(dá)37～47％，靜置使沉淀完全泄出，分離出沉淀即為硫酸皮膚素；⑤.上清液中補(bǔ)加乙醇至其體積含量達(dá)45～57％，收集沉淀，經(jīng)乙醇脫水，干燥后得低分子硫酸乙酰肝素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為步驟②中的亞硝酸鹽按硫酸皮膚素粗品重量的0.5～5％加入；亞硝酸酯類化合物按相應(yīng)克分子重量加入。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從肝素鈉副產(chǎn)物中分離提純硫酸皮膚素和低分子硫酸乙酰肝素的方法，以生產(chǎn)肝素鈉的副產(chǎn)物為原料，該原料是含有硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素的混合物，原料通過乙醇分級(jí)沉淀，得到硫酸皮膚素粗品；然后采用亞硝酸鹽或亞硝酸酯類化合物為氧化劑，使該粗品中含有的硫酸乙酰肝素被降解成高溶解度的低分子硫酸乙酰肝素，再通過乙醇分級(jí)沉淀分離得到高純度的硫酸皮膚素和低分子硫酸乙酰肝素。本發(fā)明解決了長期以來硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素以混合物形式存在而難以分離的問題，制得的高純度硫酸皮膚素及低分子硫酸乙酰肝素可作為抗栓、抗炎、降血脂及糖尿病患者腎臟保護(hù)的口服或注射用藥物原料。
文檔編號(hào)A61K31/726GK1850864SQ20061004070
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月29日
發(fā)明者唐明龍, 吳桂萍 申請(qǐng)人:南京健友生物化學(xué)制藥有限公司