專利名稱：一種復(fù)方中藥外用制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥外用制劑及其制備方法，特別是一種用于治療燒傷的復(fù)方虎杖蜂房外用制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
燒傷一般系指由于熱力如沸液、熾熱金屬、火焰、蒸汽和高溫氣體等因素所致的皮膚組織損害，這一損傷在戰(zhàn)爭時期尤為常見。據(jù)統(tǒng)計，第一次世界大戰(zhàn)，燒傷約占戰(zhàn)傷總數(shù)的1％；第二次世界大戰(zhàn)，燒傷發(fā)生率平均上升至2％～3％。這只是對常規(guī)戰(zhàn)爭而言。如果發(fā)生核戰(zhàn)爭，則燒傷占戰(zhàn)傷的主要部分。第二次世界大戰(zhàn)，日本廣島被原子彈轟炸后，據(jù)估計在受傷人員中的燒傷發(fā)生率高達(dá)75％以上。在和平時期，許多較小面積燒傷，患者常在家中治療，未到門診就醫(yī)，還有一些嚴(yán)重大面積燒傷患者死于現(xiàn)場，燒傷發(fā)生率無較確切的統(tǒng)計數(shù)字。據(jù)美國燒傷傷情調(diào)查專局統(tǒng)計，每百萬人中每年約有1萬人燒傷。
燒傷創(chuàng)面是燒傷感染、臟器損害等并發(fā)癥的源頭，臨床醫(yī)生除對燒傷患者進(jìn)行全身治療外，對各種II度及小面積III度燒傷創(chuàng)面多采取藥物治療，促進(jìn)創(chuàng)面周圍殘存的上皮組織增生、修復(fù)。
但現(xiàn)在常用的治療燒傷、燙傷的藥物地主要成分多以西藥或單一的藥物為主，主要存在著創(chuàng)面疼痛、進(jìn)行性壞死、易感染和瘢痕愈合四大難題，且還存在二次感染等問題，因此，研制出一種使用方便，療效確切的復(fù)方中藥外用制劑已成為迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明提供一種復(fù)方中藥外用制劑及其制備方法，其目的在于解決現(xiàn)有的治療燒傷藥物多以西藥或單一的藥物為主，主要存在著創(chuàng)面疼痛、進(jìn)行性壞死、易感染和瘢痕愈合四大難題，且還存在二次感染等方面存在的問題。
2、技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種復(fù)方中藥外用制劑，其特征在于該外用制劑主要由下述配比關(guān)系的藥材制成虎杖0.01g/ml～0.6g/ml、蜂房0.01g/ml～0.5g/ml、冰片0.1mg/ml～20mg/ml，其它成分為乙醇溶液。
上述配方中各藥材優(yōu)選的劑量點如下虎杖為0.05g/ml、0.08g/ml、0.10g/ml；蜂房為0.05g/ml、0.10g/ml、0.20g/ml；冰片為5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml。
該外用制劑的劑型制備成噴霧劑或氣霧劑中的一種，優(yōu)選噴霧劑。
一種復(fù)方中藥外用制劑的制備方法，其特征在于它按下述步驟制備
a、按權(quán)利要求1所述的配方取各藥材原料；
b、對虎杖和蜂房進(jìn)行提取處理；
c、將步驟b中處理虎杖和蜂房后的提取液進(jìn)行混合，過濾，加入冰片，混勻后即得本發(fā)明的外用制劑。
上述對虎杖的提取處理為將虎杖藥材粉碎后，用20倍重量95％乙醇溶液提取3次，總提取時間為3h，具體操作如下第一次用8倍重量95％乙醇溶液提取1.5h，第二次、第三次各為用6倍重量95％乙醇溶液，分別提取1h和0.5h，提取液減壓濃縮后，加95％乙醇適量使提取液的乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容。
上述對蜂房的提取處理為將蜂房藥材剪碎后，用20倍量的水煎煮3次，總提取時間為4h，第一次2h，第二次、第三次各1h，水煎液濃縮后，用60％乙醇溶液沉淀，醇沉后將乙醇溶液濃縮，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容。
上述對虎杖的處理為稱取粉碎的虎杖藥材1kg，用20倍重量95％乙醇溶液提取3次，總提取時間為3h，提取的具體操作按權(quán)利要求4所述，提取液減壓濃縮后，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容至5L；上述對蜂房的處理為稱取剪碎的蜂房藥材1kg，每次用20倍重量的水煎煮3次，總提取時間為4h，提取的具體操作按權(quán)利要求5所述，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容至5L。將以上提取液混合，過濾，加入冰片50g，混勻后即得本發(fā)明外用制劑。
利用上述的復(fù)方中藥外用制劑作為制備燒傷、燙傷、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛及促進(jìn)傷口愈合藥物的應(yīng)用。
3、優(yōu)點及效果通過本發(fā)明技術(shù)方案的實施，能夠很好地解決現(xiàn)有的治療燒傷藥物多以西藥或單一的藥物為主，主要存在著創(chuàng)面疼痛、進(jìn)行性壞死、易感染和瘢痕愈合四大難題，且還存在二次感染等方面存在的問題。燒傷藥物多以膏劑為主，在臨床使用過程中存在許多問題，如涂抹藥膏時，操作不當(dāng)，會對已損傷皮膚造成進(jìn)一步損傷；當(dāng)膏劑中的有效成分滲透到表皮內(nèi)以后，殘留在外層的基質(zhì)難以除去，有時甚至成為細(xì)菌繁殖的保護(hù)膜，造成感染。本發(fā)明將虎杖、蜂房、冰片三味中藥配伍，制備成療效確切的燒傷噴霧劑或氣霧劑，其使用方便，使用時不會再次損傷創(chuàng)面，吸收好，不會在創(chuàng)面表面形成保護(hù)膜而造成細(xì)菌感染。本發(fā)明不僅對燒傷和燙傷有很好的療效，還對抗炎、抗菌及鎮(zhèn)痛也有很好的效果，特別對糖尿病人傷口破損后難愈合有很好的促進(jìn)愈合的作用。
四、說明書附圖附

圖1為各藥液組鼠爪腫脹百分率時程曲線附圖2為各藥液組痛閾提高百分率示意附圖3為燒傷后第3天燒傷創(chuàng)面組織HE染色(×200)圖片；
附圖4為燒傷后第14天燒傷創(chuàng)面組織HE染色(×200)圖片；
附圖5為用基質(zhì)組燒傷后第21天燒傷創(chuàng)面組織HE染色(×200)圖片；
附圖6為用本發(fā)明噴霧劑燒傷后第21天燒傷創(chuàng)面組織HE染色(×200)圖片；
附圖7為用基質(zhì)組燒傷后第35天燒傷創(chuàng)面組織HE染色(×200)圖片；
附圖8為用本發(fā)明噴霧劑燒傷后第35天燒傷創(chuàng)面組織HE染色(×200)圖片；
附圖9為用本發(fā)明噴霧劑高濃度組燒傷后第35天燒傷創(chuàng)面組織HE染色(×200)圖片；
附圖10為用燒傷靈酊組后燒傷后第35天燒傷創(chuàng)面組織HE染色(×200)圖片。
具體實施例方式
本發(fā)明一種復(fù)方中藥外用制劑，該外用制劑主要由下述重量的藥材制成虎杖0.01g/ml～0.6g/ml、蜂房0.01g/ml～0.5g/ml、冰片0.1mg/ml～20mg/ml，其它成分為乙醇溶液。
本發(fā)明一種復(fù)方中藥外用制劑的制備方法，它按下述步驟制備
a、按上述配方的比例取各藥材原料；
b、對虎杖和蜂房進(jìn)行前處理，稱取虎杖藥材1kg經(jīng)粉碎后，用20倍重量95％乙醇溶液提取3次，總提取時間為3h。具體操作如下第一次8倍重量(以虎杖1kg)95％乙醇溶液提取1.5h，第二次、第三次各為6倍重量(以虎杖1kg)95％乙醇溶液，分別提取1h和0.5h。提取液減壓濃縮后，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容至5L；稱取蜂房藥材1kg經(jīng)剪碎后，每次用20倍量的水煎煮3次，總提取時間為4h(第1次2h，第2次、第3次各1h)，水煎液濃縮后，用60％乙醇溶液沉淀，醇沉后將乙醇溶液濃縮，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容至5L。
c、將步驟b中處理虎杖和蜂房后提取液混合，過濾，加入冰片50g，混勻后即得本發(fā)明外用制劑。
上述配方的藥材藥理作用如下
虎杖為蓼科蓼屬多年生草本植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.etZucc.)的干燥根莖和根，其性微苦、微寒，為方中君藥；具有清熱解毒、散瘀定痛、活血通絡(luò)之功效?！度杖A子本草》記載其“排膿，主瘡癤癰毒，撲損瘀血，破風(fēng)毒結(jié)氣”?！顿F州民間方藥集》謂之“收斂止血，去風(fēng)濕，發(fā)表散寒，散瘀血，外用治火傷”。虎杖的清熱解毒作用主要表現(xiàn)在抗炎、抗病原微生物、解熱和抗氧化等方面。藥理研究表明虎杖的抗炎作用機(jī)制主要是抑制炎癥介質(zhì)PGE2合成，抑制細(xì)胞免疫及與影響垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)有關(guān)。用虎杖提取液治療家兔淺II度燒傷療效明顯。虎杖提取物組的創(chuàng)面干爽，炎癥少，結(jié)痂快，愈合快，上皮修復(fù)較完全。
蜂房為胡蜂科昆蟲果馬蜂Polistes olivaceous(DeGeer)、日本長腳胡蜂Polistes japonicus Saussure或異腹胡蜂Parapolybia varia Fabricius的巢，其性味甘平，為方中臣藥，具有祛腐生肌、消腫散結(jié)，助主藥發(fā)揮清熱解毒作用之功效?！侗静萸笳妗吩赋觥胺浞课犊嘞绦?，氣平有毒，為清熱軟堅散結(jié)要藥”。藥理實驗研究證明其具有抗炎及鎮(zhèn)痛作用；抗細(xì)菌、真菌、原蟲、病毒作用；促進(jìn)組織再生修復(fù)作用等。其水提物對巴豆油誘發(fā)小鼠的急性炎癥有明顯的抑制作用，在抗炎的同時，蜂房水提取對鈍痛有鎮(zhèn)痛作用，另外蜂房對葡萄球菌、痢疾桿菌有一定的抑制作用。臨床上，根據(jù)蜂房祛腐生肌、消炎收斂之功效，將蜂房提取物用于患者皮膚表面病變部位，具有殺菌、止癢、促進(jìn)局部血液循環(huán)功效，且可滋補(bǔ)營養(yǎng)皮膚、增進(jìn)受損皮膚組織自身修復(fù)的作用。對頑固性外傷感染、尤其對伴有糖尿病的患者更可促進(jìn)感染創(chuàng)口愈合。
冰片(Borneolum Syntheticum)為無色透明或白色半透明的片狀松脆結(jié)晶氣清香，辛苦微寒，清熱止痛，調(diào)和虎杖、蜂房之性，為佐使之品?！夺t(yī)林纂要》解其“主散郁火，能透骨除熱，性走而不守，亦能生肌止痛”。冰片臨床應(yīng)用廣泛，在抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等方面都有較好的療效。體外實驗表明其對金黃色葡萄球菌、綠色鏈球菌、大腸桿菌等均具有明顯的抑制作用；抗炎實驗研究表明其對大鼠足跖腫脹、巴豆油引起的小鼠耳廓腫脹均具有明顯的抑制作用；同時其對激光燒傷創(chuàng)面具有明顯的鎮(zhèn)痛作用及抗炎作用。
(一)、本發(fā)明復(fù)方中藥外用制劑的拆方試驗
1.1處方單劑量篩選-小鼠耳腫脹實驗
選體重18～22g的雄性小鼠，隨機(jī)分組，每組8只。在小鼠右耳前后兩面各涂15μl的藥物，給藥間隔為1h，給藥4次。第三次給藥前在小鼠右耳前后兩面各涂二甲苯10lμl，末次給藥1h后用溫水擦凈藥物，1h后小鼠脫頸椎處死。剪下雙耳用9mm直徑打孔器在同一部位打下圓耳片，分析天平稱重。并按下面公式計算腫脹度和腫脹抑制率。結(jié)果見表1、表2、表3。
腫脹度＝W右耳片-W左耳片
表1 虎杖劑量篩選(n＝8)
表2 蜂房劑量篩選(n＝8)
表3 冰片劑量篩選(n＝8)
在對虎杖從0.01g/ml～0.6g/ml劑量范圍進(jìn)行篩選，以腫脹抑制率為指標(biāo)，結(jié)合藥物的理化性質(zhì)，得出虎杖三個劑量點為0.05g/ml、0.08g/ml、0.10g/ml；
在對蜂房從0.01g/ml～0.5g/ml劑量范圍進(jìn)行篩選，以腫脹抑制率為指標(biāo)，結(jié)合藥物的理化性質(zhì)，得出蜂房三個劑量點為0.05g/ml、0.10g/ml、0.20g/ml；
在對冰片從0.1mg/ml～20mg/ml劑量范圍進(jìn)行篩選，以腫脹抑制率為指標(biāo)，結(jié)合藥物的理化性質(zhì)，得出冰片三個劑量點為5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml。
1.2本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑最優(yōu)處方篩選
1.2.1試驗方法
1.2.1.1小鼠耳腫脹試驗體重18～22g的雄性小鼠，隨機(jī)分組，每組8只。在小鼠右耳前后兩面各涂15μl的藥物，給藥間隔為1h，給藥四次。第三次給藥前在小鼠右耳前后兩面各涂二甲苯10μl，末次給藥1h后用溫水擦凈藥物，1h后小鼠脫頸椎處死。剪下雙耳用9mm直徑打孔器在同一部位打下圓耳片，分析天平稱重。按下面公式計算腫脹度及腫脹抑制率。
腫脹度＝W右耳片-W左耳片
1.2.1.2抑菌試驗-平皿擴(kuò)散法
取內(nèi)徑90mm，高16～17mm的平皿，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，并放置于水平臺上使其凝固。待冷凝后，用棉球蘸取金葡菌菌液均勻涂布于培養(yǎng)基。用6mm打孔器在每個含有菌液的培養(yǎng)基上打4個孔，然后向各孔加入不同藥液40μl，置37℃，培養(yǎng)24h。每種藥液平行操作8次，用游標(biāo)卡尺測定各藥抑菌圈半徑，計算平均數(shù)，進(jìn)行各均數(shù)比較。
實施例1
本發(fā)明的配方為虎杖0.01g/ml，蜂房0.01g/ml，冰片0.1mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為7.22％，抑菌圈半徑為4.25mm。
本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑的制備方法，它按下述步驟制備
a、按上述配方的比例取各藥材原料；
b、對虎杖和蜂房進(jìn)行前處理，稱取虎杖藥材1kg經(jīng)粉碎后，用20倍重量95％乙醇溶液提取3次，總提取時間為3h。具體操作如下第一次8倍量95％乙醇溶液提取1.5h，第二次、第三次各為6倍量95％乙醇溶液，分別提取1h和0.5h。提取液減壓濃縮后，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容至5L；稱取蜂房藥材1kg經(jīng)剪碎后，每次用20倍量的水煎煮3次，總提取時間為4h(第1次2h，第2次、第3次各1h)，水煎液濃縮后，用60％乙醇溶液沉淀，醇沉后將乙醇溶液濃縮，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容至5L。
c、將步驟b中處理虎杖和蜂房后提取液混合，過濾，加入冰片50g，混勻后即得本發(fā)明噴霧劑。
實施例2
本發(fā)明的配方為虎杖0.6g/ml，蜂房0.3g/ml，冰片1mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為19.47％，抑菌圈半徑為5.05mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例3
本發(fā)明的配方為虎杖0.01g/ml，蜂房0.5g/ml，冰片10mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為15.66％，抑菌圈半徑為5.68mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例4
本發(fā)明的配方為虎杖0.05g/ml，蜂房0.05g/ml，冰片5mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為15.46％，抑菌圈半徑為9.06mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例5
本發(fā)明的配方為虎杖0.05g/ml，蜂房0.10g/ml，冰片10mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為35.21％，抑菌圈半徑為7.38mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例6
本發(fā)明的配方為虎杖0.05g/ml，蜂房0.20g/ml，冰片20mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為10.98％，抑菌圈半徑為8.64mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例7
本發(fā)明的配方為虎杖0.08g/ml，蜂房0.05g/ml，冰片10mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為5.35％，抑菌圈半徑為10.25mm。
實施例8
本發(fā)明的配方為虎杖0.08g/ml，蜂房0.10g/ml，冰片20mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為26.42％，抑菌圈半徑為10.28mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例9
本發(fā)明的配方為虎杖0.08g/ml，蜂房0.20g/ml，冰片5mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為14.77％，抑菌圈半徑為10.44mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例10
本發(fā)明的配方為虎杖0.10g/ml，蜂房0.05g/ml，冰片20mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為33.37％，抑菌圈半徑為11.13mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例11
本發(fā)明的配方為虎杖0.10g/ml，蜂房0.10g/ml，冰片5mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為53.68％，抑菌圈半徑為10.75mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例12
本發(fā)明的配方為虎杖0.10g/ml，蜂房0.20g/ml，冰片10mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為47.05％，抑菌圈半徑為10.64mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例13
本發(fā)明的配方為虎杖0.20g/ml，蜂房0.3g/ml，冰片0.1mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為35.37％，抑菌圈半徑為9.62mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例14
本發(fā)明的配方為虎杖0.20g/ml，蜂房0.4g/ml，冰片0.5mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為41.23％，抑菌圈半徑為10.22mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例15
本發(fā)明的配方為虎杖0.4g/ml，蜂房0.01g/ml，冰片1mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為34.87％，抑菌圈半徑為11.56mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例16
本發(fā)明的配方為虎杖0.4g/ml，蜂房0.4g/ml，冰片0.5mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為45.36％，抑菌圈半徑為9.65mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例17
本發(fā)明的配方為虎杖0.6g/ml，蜂房0.5g/ml，冰片20mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的噴霧劑對鼠耳腫脹抑制率為28.43％，抑菌圈半徑為9.08mm。
除藥材用量按配方稱量外，其它制備方法同實施例1。
實施例18
本發(fā)明的配方為虎杖0.10mg/l，蜂房0.10g/ml，冰片5mg/ml，其它成分為乙醇溶液，制得的氣霧劑對鼠耳腫脹抑制率為51.82％，抑菌圈半徑為9.19mm。
本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房氣霧劑的制備方法，它按下述步驟制備
a、按上述配方的比例取各藥材原料；
b、對虎杖和蜂房進(jìn)行前處理，稱取虎杖藥材1kg經(jīng)粉碎后，用20倍重量95％乙醇溶液提取3次，總提取時間為3h。具體操作如下第一次8倍量95％乙醇溶液提取1.5h，第二次、第三次各為6倍量95％乙醇溶液，分別提取1h和0.5h。提取液減壓濃縮后，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容至5L；稱取蜂房藥材1g/經(jīng)剪碎后，每次用20倍量的水煎煮3次，總提取時間為4h(第1次2h，第2次、第3次各1h)，水煎液濃縮后，用60％乙醇溶液沉淀，醇沉后將乙醇溶液濃縮，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容至5L。
c、將步驟b中處理虎杖和蜂房后提取液混合，過濾，加入冰片50g，混勻后，分裝于氣霧劑容器中，安裝閥門，軋緊封帽后，充裝拋射劑氟利昂F12，即得本發(fā)明氣霧劑。
1.2.2正交試驗
1.2.2.1試驗因素水平選用L9(34)正交設(shè)計方案，系統(tǒng)篩選了虎杖、蜂房和冰片最優(yōu)處方的組成。因素水平表見表4。
表4 因素水平表
1.2.2.2數(shù)據(jù)分析以鼠耳腫脹抑制率和抑菌圈半徑二相考察指標(biāo)的綜合評分優(yōu)選最優(yōu)處方。評分標(biāo)準(zhǔn)鼠耳腫脹抑制率占70分，以55％為滿分；抑菌圈半徑占30分，以12mm為滿分。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用SPSS 11.5，結(jié)果見表5、表6。
表5 正交設(shè)計及數(shù)據(jù)處理表(n＝1)
表6 方差分析表
注F0.05(2，2)＝19.0；aP＞0.05，bP＜0.05
從表5中我們得出最優(yōu)處方組成為A3B2C1，即虎杖0.10g/ml，蜂房0.10g/ml，冰片5mg/ml。通過表6方差分析可知，三種藥材在處方中對小鼠耳腫脹抑制率和抑菌能力影響最大的是虎杖，其次是蜂房，冰片最小；同時虎杖的劑量在處方中有顯著性意義(P＜0.05)。
在進(jìn)行藥效學(xué)試驗時[下見(四).本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑的抗炎試驗、(五).鎮(zhèn)痛試驗、(六).抑菌試驗、(七).燒傷試驗、(八).III度燒傷大鼠皮膚創(chuàng)面羥脯氨酸(Hyp)含量測定、(九).病理組織學(xué)檢察]，分成四組進(jìn)行，基質(zhì)組采用45％乙醇溶液；本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組(虎杖0.20g/ml，蜂房0.20g/l，冰片10mg/ml)；本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組(虎杖0.10g/ml，蜂房0.10g/ml，冰片5mg/ml)；對照組采用燒傷靈酊，石家莊樂仁堂制藥有限責(zé)任公司，批號040301。
(二)、虎杖提取工藝研究
虎杖的主要化學(xué)成分為蒽醌類、芪類、酚性成分和黃酮類化合物，其中大黃素等蒽醌類衍生物是其抗炎、抑菌的主要成分。本試驗采用L9(34)正交設(shè)計，以虎杖出膏率和大黃素含量兩項指標(biāo)的綜合評分優(yōu)選虎杖的提取工藝。
2.1試驗因素水平
選用L9(34)正交方案，系統(tǒng)考察了乙醇濃度、乙醇用量、提取次數(shù)和提取時間四個因素對虎杖提取工藝的影響。正交表設(shè)計見表7。
表7 因素水平表
2.2浸膏提取
每次稱取粉碎的虎杖藥材25g，按正交試驗表8安排試驗(每個試驗重復(fù)2次)，提取時間以溶劑開始回流計算，整個提取過程保持溶劑回流狀態(tài)。提取液過濾后減壓濃縮，并將濃縮后的浸膏放入減壓干燥器中干燥，得干浸膏，稱重，得出膏率。
2.3數(shù)據(jù)分析
以提取物中出膏率和大黃素含量二項考察指標(biāo)的綜合評分優(yōu)選提取工藝。評分標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定虎杖出膏率15％時取滿分20分，大于等于40％取0分；大黃素含量為10.85％時取滿分80分，含量為0時取0分。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用SPSS11.5，方差分析結(jié)果見表9。
表8 正交設(shè)計及數(shù)據(jù)處理表(n＝2)
表9 方差分析表
注F0.05(2，9)＝4.26，F(xiàn)0.01(2，9)＝8.02；aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01
從表8中我們得出最適宜的提取工藝A3B2C3D1，即用20倍量95％乙醇溶液提取3次，總提取時間為3h。具體操作如下第一次8倍量95％乙醇溶液提取1.5h，第二次、第三次各為6倍量95％乙醇溶液，分別提取1h和0.5h。通過表9方差分析可知，四個因素對提取工藝影響程度依次為A＞D＞C＞B，其中乙醇濃度A和提取時間D對大黃素含量的影響具有顯著性(P＜0.05)，乙醇用量B和提取時間C無顯著性差異。
2.4驗證試驗
為確證該工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，據(jù)所篩選的最佳提取條件驗證三批，結(jié)果見表10。
表10驗證試驗結(jié)果
驗證試驗結(jié)果說明，所篩選的提取工藝條件基本穩(wěn)定。
(三)、蜂房提取工藝研究
在《中國藥典》以及既往有關(guān)蜂房的研究中，都未能指出蜂房的某一有效成分或者是指標(biāo)性成分，因此本試驗在對蜂房的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行考察時，對蜂房的水煎醇沉液在200nm～600nm處進(jìn)行紫外掃描，得最大吸收峰處的吸收波長為283.5nm。我們以283.5nm為檢測波長，對蜂房進(jìn)行了含量測定，并通過正交試驗篩選出了蜂房的最優(yōu)提取工藝。
3.1提取方法每次稱取剪碎的蜂房藥材25g，按正交試驗表11、12安排試驗(每個試驗重復(fù)2次)，水煎液用8層紗布過濾，所得濾液濃縮至約25ml；將濃縮液醇沉12h，之后過濾得醇沉液；醇沉液減壓濃縮至無醇味，用蒸餾水溶解，最后定容至25ml。
3.2供試品溶液制備及測定從蜂房水煎液中吸取10ml，加入10ml蒸餾水進(jìn)行稀釋。以蒸餾水為空白，測定稀釋液在283.5nm波長處的吸光度。
3.3試驗因素水平選用L9(34)正交方案，系統(tǒng)考察了加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)和醇沉濃度四個因素對蜂房提取工藝的影響。正交表設(shè)計見表11。
表11 因素水平表
3.4數(shù)據(jù)分析以水煎液的吸光度值為指標(biāo)優(yōu)選提取工藝。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用SPSS 11.5。
表12 正交設(shè)計及數(shù)據(jù)處理表(n＝2)
從表12中我們得出最適宜的提取工藝A2B2C3D2，即每次用20倍量的水煎煮3次，總提取時間為4h(第1次2h，第2次、第3次各1h)，醇沉濃度為60％。
(四)、本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑的抗炎試驗
4.1本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響
取體重18～22g雄性小鼠40只，隨機(jī)分成四組，即基質(zhì)組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組和燒傷靈酊組，每組10只。在小鼠右耳前后兩面各涂15μl，給藥四次，間隔為1h。第三次給藥前在右耳前后兩面各涂二甲苯10μl，末次給藥1h后用溫水擦凈藥物，1h后小鼠脫頸椎處死。剪下雙耳用9mm直徑打孔器分別在同一部位打下圓耳片，分析天平稱重。按下面公式計算腫脹度，結(jié)果經(jīng)成組t檢驗處理，并按公式求出腫脹抑制率，結(jié)果見表13。
腫脹度＝W右耳片-W左耳片
表13 各藥液對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響(n＝10 x±s)
注基質(zhì)組與各組間比較，*p＜0.05
表13表明，本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組和燒傷靈酊組與基質(zhì)組相比有顯著性差異，提示這兩種藥物對二甲苯所致的小鼠耳腫脹有抑制作用；由于個體差異較大，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組抑制率雖然較高，但與基質(zhì)組相比無顯著性差異。
4.2本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對雞蛋清所致大鼠足爪腫脹的影響
取體重140±10g健康大鼠32只，雌雄各半，隨機(jī)分成四組，即基質(zhì)組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組和燒傷靈酊組，每組8只。將各組藥物噴于大鼠右后足，每鼠以藥液不流失為宜(約0.02ml/cm2)，給藥四次，間隔30min。各組大鼠均在給藥前用軟尺測量右后足關(guān)節(jié)處周長。末次給藥20min后，將大鼠右后肢拉直，自足跖中部皮下向上注入新鮮蛋清0.1ml/只，分別于注射后5min，30min，1h，1.5h，2h，4h和6h測量每組大鼠右后足關(guān)節(jié)處周長。按下面公式計算腫脹度，取成組t檢驗，并按公式計算腫脹百分率，以腫脹百分率為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制各組時程曲線圖。結(jié)果見表14，圖1中坐標(biāo)橫軸為時間(單位h，即小時)，坐標(biāo)縱軸為腫脹百分率，帶菱形塊◆的曲線表示使用基質(zhì)組結(jié)果曲線，帶矩形塊■的曲線表示使用本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組結(jié)果曲線，帶三角形塊▲的曲線表示使用本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組結(jié)果曲線，帶圓形●的曲線表示使用燒傷靈酊組結(jié)果曲線。
腫脹度＝致炎后鼠爪周長-致炎前鼠爪周長
表14 各藥液對雞蛋清所致大鼠足爪腫脹的影響(cm)(n＝8 x±s)
注基質(zhì)組與各組間比較，*p＜0.05，**p＜0.01
各組與燒傷靈酊比較，#p＜0.05，##p＜0.01
表14表明，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在致炎后5min至6h，燒傷靈酊組在致炎后30min至6h與基質(zhì)組比較均有顯著性差異，提示這兩種藥物對雞蛋清所致大鼠足爪腫脹有抑制作用；復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在5min和6h時與燒傷靈酊組相比較有顯著性差異，提示復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對雞蛋清所致炎癥的抑制作用要優(yōu)于燒傷靈酊。
(五)、鎮(zhèn)痛試驗
5.1本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對雌性小鼠熱板致痛的影響
取體重18～22g雌性小鼠32只，于室溫18℃環(huán)境下，放入在恒溫水浴鍋已預(yù)熱到55±1℃的500ml玻璃燒杯中，每次1只，以小鼠舔后足為“疼痛”反應(yīng)指標(biāo)，秒表記錄出現(xiàn)時間為痛閾值(試驗前先篩選動物，將反應(yīng)潛伏期小于5s或大于30s的動物剔除)。按此方法測定2次，間隔10min，取平均值為給藥前痛閾值。以給藥前痛閾值隨機(jī)分成基質(zhì)組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組和燒傷靈酊組共四組，每組8只。隨即將小鼠兩只后足浸入各組藥液中2min，給藥四次，每次間隔30min。末次給藥后15min，30min，45min，60min，90min和120min測定痛反應(yīng)時間1次。若小鼠在熱板上60s，仍無痛反應(yīng)，立即取出，以免燙傷，其痛閾值以60s計算。對各組小鼠痛閾值進(jìn)行統(tǒng)計處理，取成組t檢驗，并按下面公式計算痛閾提高百分率，以痛閾提高百分率為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制各組柱形圖。結(jié)果見表15，圖2。圖2中橫軸為時間(單位分鐘)，縱軸為痛閾提高百分率，帶黑色背景疏白點的圖表柱表示使用基質(zhì)組的結(jié)果，帶白色背景疏黑點的圖表柱表示使用本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組的結(jié)果，帶黑色背景密白點的圖表柱表示使用本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組的結(jié)果，帶白色背景密黑點的圖表柱表示使用燒傷靈酊組的結(jié)果。
表15 各藥液對小鼠熱板致痛閾的影響(n＝8 x±s)
注基質(zhì)組與各組間比較，*p＜0.05；各組與燒傷靈酊比較，#p＜0.05
表15表明，與基質(zhì)組相比較，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組在60min，90min時；復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在90min，120min時；燒傷靈酊組在60min時有顯著性差異，提示上述各藥對熱板致痛小鼠具有鎮(zhèn)痛作用，其中燒傷靈酊起效速度較快。兩種濃度的復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑與燒傷靈酊相比較，在90min時有顯著性差異，提示復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時間較長。
5.2復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對小鼠醋酸致痛作用的影響
取體重20±2g小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分成四組，即基質(zhì)組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組和燒傷靈酊組，每組10只。實驗前24h腹部用8％Na2S脫毛，于室溫20±1℃環(huán)境中進(jìn)行試驗。先將藥物噴于脫毛區(qū)，每鼠以藥液不流失為宜(約0.02ml/cm2)，給藥四次，間隔30min，末次給藥20min后，腹腔注射0.7％醋酸生理鹽水溶液0.2ml，然后觀察每只小鼠的疼痛反應(yīng)，以腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高起等行為反應(yīng)為指標(biāo)，觀察記錄20min內(nèi)扭體出現(xiàn)時間(潛伏期)與扭體次數(shù)，結(jié)果進(jìn)行成組t檢驗處理，并按下面公式計算抑制率，結(jié)果見表16。
16各藥液對小鼠醋酸致痛作用的影響(n＝10 x±s)
注基質(zhì)組與各組間比較，*p＜0.05
表16表明，本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在扭體反應(yīng)次數(shù)上與基質(zhì)組相比有顯著性差異，提示復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑有一定的鎮(zhèn)痛作用。兩種濃度的復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組與燒傷靈酊組相比較，在疼痛潛伏期和扭體反應(yīng)次數(shù)上均無顯著性差異。
(六)、抑菌試驗
6.1平皿擴(kuò)散法
取內(nèi)徑90mm，高16～17mm的平皿，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，并放置于水平臺上使其凝固。待冷凝后，用棉球蘸取菌液均勻涂布于培養(yǎng)基。用6mm打孔器在每個含有菌液的培養(yǎng)基上打4個孔，然后向各孔加入不同藥液40μl，送37℃，培養(yǎng)24h。用游標(biāo)卡尺測定各藥抑菌圈半徑，計算平均數(shù)，進(jìn)行各均數(shù)比較，結(jié)果見表17。
表17 各藥液瓊脂平板上抑菌效果的比較(抑菌圈半徑mm n＝8 x±s)
注本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組與燒傷靈酊組比較，#p＜0.05
從表17可以看出，基質(zhì)組對金葡球菌和綠膿桿菌均無抑菌作用，其它三種藥液對這兩種菌均有一定抑菌作用。經(jīng)顯著性檢驗，兩種濃度的復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對金葡球菌的抑菌作用與燒傷靈酊相比較有顯著性差異，提示復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對金葡球菌的抑菌效果優(yōu)于燒傷靈酊。
6.2試管對倍稀釋法
取5ml大小的玻璃試管，加入一定量的肉湯液體培養(yǎng)基。將各藥液進(jìn)行對倍稀釋，各稀釋度分別為1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128(同時設(shè)不含菌液的陰性對照，含菌液不含藥液的陽性對照)。各管藥液培養(yǎng)基的最終量為2ml。將加入的藥液與培養(yǎng)基混勻，然后分別加入0.05ml待試菌液(用微量移液器加入，加樣時加樣器吸頭必須插到管內(nèi)液面下加菌并注意避免與管內(nèi)壁接觸。加好菌液后的試管應(yīng)避免晃動)。
37℃孵育箱內(nèi)孵育。孵育24h后，取一接菌環(huán)各不同濃度試管內(nèi)藥液、菌液混合物接種于固體培養(yǎng)基上，37℃繼續(xù)培養(yǎng)16h后，觀察固體培養(yǎng)基上肉眼觀察未長菌的最低藥液濃度為最低抑菌濃度(MIC)。測定各藥液的最低抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見表18。
表18 各藥液的最低抑菌濃度(MIC)(n＝2)
表18表明，除基質(zhì)組外，三種藥液對金葡球菌和綠膿桿菌均有一定的抑菌作用，其中燒傷靈酊對兩種菌的抑菌作用都要優(yōu)于兩種濃度的復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑。
(七)、燒傷試驗
7.1復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對大鼠深I(lǐng)I度蒸氣燒傷創(chuàng)面的影響
取體重210±30g Wistar大鼠12只，雌雄不拘，本實驗室飼養(yǎng)三天。實驗前24h用8％Na2S脫去大鼠后背臀部毛，約4×4cm2，禁食1天，自由飲水。用1％戊巴比妥鈉(30mg·kg-1)麻醉，取仰臥位將大鼠脫毛區(qū)置于帶側(cè)枝的圓底燒瓶口上(內(nèi)徑25mm，瓶口溫度98℃)，蒸氣熏蒸9s，造成深I(lǐng)I度蒸氣燙傷模型。造模24h后活檢取材，鑒定為深I(lǐng)I度燒傷。在每只大鼠背部中線兩側(cè)各制作一個直徑25mm的深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面。大鼠燙傷后立即腹腔注射5ml復(fù)蘇液，注意保持室溫在23℃～25℃，直至大鼠蘇醒。造模后，大鼠按體重、性別隨機(jī)分組，即基質(zhì)組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組和燒傷靈酊組，每組6個創(chuàng)面。造模后當(dāng)天分別涂上藥，每次以藥液不流失為宜(約0.02ml/cm2)，涂藥前如有必要用0.1％新潔爾滅溶液清創(chuàng)。每種藥前三天每天三次，三天后每天兩次，連續(xù)26天。于造模后、24h、6d、11d、16d、21d、26d用游標(biāo)卡尺測量創(chuàng)面縱長與橫長直徑，按πAB/4公式換算面積。按下式計算創(chuàng)面愈合百分率，數(shù)據(jù)經(jīng)成組t檢驗處理，結(jié)果見表19、表20。
表19 本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對大鼠深I(lǐng)I度蒸氣燒傷創(chuàng)面面積的影響 (cm2)(n＝6x±s)
表20 復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對大鼠深I(lǐng)I度蒸氣燒傷創(chuàng)面愈合百分率的影響(％) (n＝6x±s)
注基質(zhì)組與各組間比較，*p＜0.05
表19、20表明，與基質(zhì)組相比較，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在16d之后，燒傷靈酊組在21d之后有顯著性差異，提示高、低濃度的復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑和燒傷靈酊對大鼠深I(lǐng)I度蒸氣燙傷創(chuàng)面的愈合有一定促進(jìn)作用。
7.2復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對大鼠III度蒸氣燒傷創(chuàng)面的影響
取體重210±30g Wistar大鼠12只，雌雄不拘，本實驗室飼養(yǎng)三天。實驗前24h用8％Na2S脫去大鼠后背臀部毛，約4×4cm2，禁食1天，自由飲水。用1％戊巴比妥鈉(30mg·kg-1)麻醉，取仰臥位將大鼠脫毛區(qū)置于帶側(cè)枝的圓底燒瓶口上(內(nèi)徑25mm，瓶口溫度98℃)，蒸氣熏蒸13s，造成III度蒸氣燙傷模型。造模24h后活檢取材，鑒定為III度燒傷。在每只大鼠背部中線兩側(cè)各制作一個直徑25mm的III度燙傷創(chuàng)面。大鼠燙傷后立即腹腔注射5ml復(fù)蘇液，注意保持室溫在23℃～25℃，直至大鼠蘇醒。造模后，大鼠按體重、性別隨機(jī)分組，即基質(zhì)組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組和燒傷靈酊組，每組6個創(chuàng)面。造模后當(dāng)天分別涂上藥，每次以藥液不流失為宜(約0.02ml/cm2)，涂藥前如有必要用0.1％新潔爾滅溶液清創(chuàng)。每種藥前三天每天三次，三天后每天兩次，連續(xù)35天。于造模后、24h、6d、11d、16d、21d、26d、31d、35d用游標(biāo)卡尺測量創(chuàng)面縱長與橫長直徑，按πAB/4公式換算面積。按下式計算創(chuàng)面愈合百分率，數(shù)據(jù)經(jīng)成組t檢驗處理，結(jié)果見表21、表22。
表21 本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對大鼠III度蒸氣燒傷創(chuàng)面面積的影響 (cm2)(n＝6 x±s)
表22 本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對大鼠III度蒸氣燒傷創(chuàng)面愈合百分率的影響(％) (n＝6 x±s)
注基質(zhì)組與各組間比較，*p＜0.05
表21、22表明，與基質(zhì)組相比較，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在21天之后，燒傷靈酊組在31天之后有顯著性差異，提示不同濃度的復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑和燒傷靈酊能促進(jìn)大鼠III度蒸氣燙傷創(chuàng)面的愈合。
(八)、III度燒傷大鼠皮膚創(chuàng)面羥脯氨酸(Hyp)含量測定
8.1大鼠III度燙傷模型制作及分組 體重210±30g Wistar大鼠72只，雌雄不拘，本實驗室飼養(yǎng)三天。依照方法8.2制作大鼠III度燙傷模型。造模后，大鼠按體重、性別隨機(jī)分組，即基質(zhì)組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組和燒傷靈酊組，每組36個創(chuàng)面。創(chuàng)面制備好后，按照試驗分組分別在創(chuàng)面上用藥，每次以藥液不流失為宜(約0.02ml/cm2)，涂藥前如有必要用0.1％新潔爾滅溶液清創(chuàng)。每種藥前三天每天三次，三天后每天兩次。于燒傷后3d、7d、14d、21d、28d、35d進(jìn)行創(chuàng)面觀察，并活檢取材作羥脯氨酸含量測定。每個時相點每組各取6個創(chuàng)面，另取3只正常大鼠皮膚活檢作為正常對照組。
8.2羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
8.2.1原理 羥脯氨酸氧化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似吡咯，能與對二甲氨基苯甲醛縮合生成紅色產(chǎn)物，在560nm處有最大吸收，根據(jù)吸光度可測得羥脯氨酸含量。
8.2.2試劑配制(1)標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸儲存液(1mg/ml)將羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品置干燥器中使其恒重，準(zhǔn)確稱取100mg，用0.01mol/L鹽酸溶解并定容至100ml，置棕色瓶中于4℃保存。(2)標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸應(yīng)用液(6μg/ml)取標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸儲存液(1mg/ml)0.6ml，用蒸餾水定容至100ml，4℃可保存2周。(3)檸檬酸緩沖液稱取檸檬酸(C6H8O7·H2O)2.5g，冰醋酸0.6ml，醋酸鈉·3H2O 6g，NaOH 1.7g，蒸餾水溶解后定容至50ml，PH 6.0，4℃保存。(4)0.05mol/L氯胺T溶液稱取氯胺T 0.705g，甲醇溶解并定容至50ml。(5)3.15mol/L高氯酸溶液取70％高氯酸13.5ml，加蒸餾水定容至50ml。(6)10％對二甲氨基苯甲醛(PDAB)溶液稱取對二甲氨基苯甲醛5g，甲醇溶解并定容至50ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。
8.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 1.0ml蒸餾水為空白對照管，不同濃度(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μgml和10μg/ml)等體積(1.0ml)的標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸稀釋管，然后依次加入(1)檸檬酸緩沖液0.5ml，0.05mol/L氯胺T溶液1.0ml，混勻，室溫氧化4min。(2)3.15mol/L高氯酸溶液1.0ml，混勻，室溫下作用5min。(3)10％對二甲氨基苯甲醛溶液1.0ml，混勻，100℃沸水3min(顯色)。(4)冰浴冷卻，空白調(diào)零，測定A560nm。以吸光度(y)對濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為
y＝0.1027x+0.0032，r＝0.9993
羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在1～10μg/ml濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。
8.2.4精密度試驗 取低、中、高三種濃度分別為2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸溶液，按方法8.2.3操作。日內(nèi)精密度在1天內(nèi)完成，日間精密度測5天，用來考察方法的精密度及重復(fù)性，其RSD均小于2％。結(jié)果見表23。
表23 羥脯氧酸精密度試驗
8.3燒傷創(chuàng)面羥脯氨酸含量測定 取新鮮皮膚組織(或福爾馬林浸泡過的)流水沖洗過夜，剪碎，無水乙醇脫水30min×2次，丙酮脫脂30min×2次，60℃烘箱過夜。稱取10mg，置20ml具塞磨口刻度試管中，再加入6mol/L的HCl 10ml，置于溫度為120℃的烘箱內(nèi)水解6h。水解液用15mol/L NaOH中和酸，再用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調(diào)PH至6左右，最后用蒸餾水定容至20ml，離心。離心后取上清液1.0ml，用蒸餾水定容至10ml，混勻后取其1.0ml進(jìn)行測定。對照管為1.0ml蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)管為標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸應(yīng)用液(6μg/ml)1.0ml，測定方法見方法8.2.3。依照下式計算羥脯氨酸含量，結(jié)果見表24。
表24 大鼠燒傷后不同時間創(chuàng)面羥脯氧酸含量(μg/mg皮膚組織)
注基質(zhì)組與各組間比較，*p＜0.05
正常大鼠皮膚羥脯氨酸含量79.030±8.025
表24表明，大鼠在14天后羥脯氨酸含量逐步升高，提示III度燒傷大鼠創(chuàng)面皮膚膠原代謝在傷后14天啟動，膠原合成開始活躍。各藥液的羥脯氨酸含量與基質(zhì)組相比較，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑、燒傷靈酊在傷后21天，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組在傷后28天有顯著性差異，提示各藥液能促進(jìn)膠原合成，促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的愈合。
(九)病理組織學(xué)檢察 各組大鼠在活檢取材做羥脯氨酸含量測定時，同時取組織標(biāo)本一塊，做病理組織學(xué)檢查。將標(biāo)本置于福爾馬林中，石蠟包埋切片，HE染色，觀察皮膚各層的組織形態(tài)學(xué)變化。
早期皮膚外觀較白或棕黃，試驗組及基質(zhì)組創(chuàng)面均呈進(jìn)行性加深，形成半透明的褐色焦痂，質(zhì)地硬如皮革。透過焦痂可見粗大血管網(wǎng)，其間有些小血管與之相連。
傷后3天、7天，組織生長不明顯，表皮細(xì)胞缺如，大量組織細(xì)胞變性壞死，胞漿濃縮，胞核固縮。膠原纖維腫脹、融合，原纖維結(jié)構(gòu)消失。傷后10天左右，有壞死組織溶脫發(fā)生，但脫落范圍較小，創(chuàng)面未見新生表皮，肉芽組織裸露。自第14天起，細(xì)胞增殖漸趨活躍，有少量上皮開始生長，創(chuàng)緣處可見上皮從痂皮下向創(chuàng)面中央生長。21天時，創(chuàng)面已有多層上皮細(xì)胞覆蓋，新生上皮核大、染色深，周圍膠原成分增多。創(chuàng)面潔凈，可見新生上皮，但壞死組織仍不能完全溶脫，未脫落的硬痂覆蓋于創(chuàng)面，其與基底粘連較緊，后期硬痂自創(chuàng)面邊緣逐漸脫落，直至創(chuàng)面愈合。傷后35天，皮膚損害基本恢復(fù)，皮島形成，皮脂腺和毛囊均增生。
在各時相點，本發(fā)明噴霧劑組的新生上皮較基質(zhì)組快，本發(fā)明噴霧劑的成分對創(chuàng)面細(xì)胞增殖和移行有促進(jìn)作用，能加速燒傷創(chuàng)面的愈合。結(jié)果見圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9和圖10。
(十)、結(jié)論
10.1本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑最優(yōu)處方組成為A3B2C1，即虎杖0.10g/ml，蜂房0.10g/ml，冰片5mg/ml。
10.2虎杖最優(yōu)提取工藝為A3B2C3D1，即用20倍量95％乙醇溶液提取3次，總提取時間為3h。
10.3蜂房最優(yōu)提取工藝為A2B2C3D2，即每次用20倍量的水煎煮3次，總提取時間為4h，醇沉濃度為60％。
10.4通過二甲苯所致小鼠耳腫脹試驗，得出復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組和燒傷靈酊組與基質(zhì)組相比有顯著性差異，提示這兩種藥物對二甲苯所致的小鼠耳腫脹有抑制作用；由于個體差異較大，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組抑制率雖然較高，但與基質(zhì)組相比無顯著性差異。
10.5通過大鼠足爪腫脹試驗，得出復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在致炎后5min至6h，燒傷靈酊組在致炎后30min至6h與基質(zhì)組比較均有顯著性差異，提示這兩種藥物對雞蛋清所致大鼠足爪腫脹有抑制作用；復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在5min和6h時與燒傷靈酊組相比較有顯著性差異，本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對雞蛋清所致炎癥的抑制作用要優(yōu)于燒傷靈酊。
10.6通過雌性小鼠熱板致痛試驗，得出與基質(zhì)組相比較，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組在60min，90min時；復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在90min，120min時；燒傷靈酊組在60min時有顯著性差異，提示上述各藥對熱板致痛小鼠具有鎮(zhèn)痛作用，其中燒傷靈酊起效速度較快。兩種濃度的復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑與燒傷靈酊相比較，在90min時有顯著性差異，本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時間較長。
10.7通過小鼠醋酸致痛試驗，得出復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在扭體反應(yīng)次數(shù)上與基質(zhì)組相比有顯著性差異，提示復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑有一定的鎮(zhèn)痛作用。兩種濃度的本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑與燒傷靈酊相比較，在疼痛潛伏期和扭體反應(yīng)次數(shù)上均無顯著性差異。
10.8通過平皿擴(kuò)散試驗，得出基質(zhì)組對金葡球菌和綠膿桿菌均無抑菌作用，其它三種藥液對這兩種菌均有一定抑菌作用。經(jīng)顯著性檢驗，兩種濃度的復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對金葡球菌的抑菌作用與燒傷靈酊相比較有顯著性差異，本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑對金葡球菌的抑菌效果優(yōu)于燒傷靈酊。
10.9通過試管對倍稀釋試驗，得出除基質(zhì)組外，三種藥液對金葡球菌和綠膿桿菌均有一定的抑菌作用，其中燒傷靈酊對兩種菌的抑菌作用都要優(yōu)于兩種濃度的復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑。
10.10通過對大鼠深I(lǐng)I度蒸氣燒傷試驗，得出與基質(zhì)組相比較，本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑在16d之后，燒傷靈酊在21d之后有顯著性差異，提示高、低濃度的復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑和燒傷靈酊對大鼠深I(lǐng)I度蒸氣燙傷創(chuàng)面的愈合有一定促進(jìn)作用。
10.11通過對大鼠III度蒸氣燒傷試驗，得出與基質(zhì)組相比較，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組、復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組在21d之后，燒傷靈酊組在31d之后有顯著性差異，提示不同濃度的本發(fā)明復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑和燒傷靈酊能促進(jìn)大鼠III度蒸氣燙傷創(chuàng)面的愈合。
10.12通過對大鼠III度燒傷創(chuàng)面羥脯氨酸含量的測定，得出大鼠在14天后羥脯氨酸含量逐步升高，提示III度燒傷大鼠創(chuàng)面皮膚膠原代謝在傷后14天啟動，膠原合成開始活躍。各藥液的羥脯氨酸含量與基質(zhì)組相比較，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑、燒傷靈酊在傷后21天，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑高濃度組在傷后28天有顯著性差異，提示各藥液能促進(jìn)膠原合成，促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的愈合。
10.13病理組織學(xué)檢查表明，復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑組的新生上皮較基質(zhì)組快，提示復(fù)方虎杖蜂房噴霧劑的成分對創(chuàng)面細(xì)胞增殖和移行有促進(jìn)作用，能加速燒傷創(chuàng)面的愈合。
權(quán)利要求
1、一種復(fù)方中藥外用制劑，其特征在于該外用制劑主要由下述配比關(guān)系的藥材制成虎杖0.01g/ml～0.6g/ml、蜂房0.01g/ml～0.5g/ml、冰片0.1mg/ml～20mg/ml，其它成分為乙醇溶液。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)方中藥外用制劑，其特征在于上述配方中各藥材優(yōu)選的劑量點如下虎杖為0.05g/ml、0.08g/ml、0.10g/ml；蜂房為0.05g/ml、0.10g/ml、0.20g/ml；冰片為5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml。
3、根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種復(fù)方中藥外用制劑，其特征在于該外用制劑的劑型制備成噴霧劑或氣霧劑中的一種，優(yōu)選噴霧劑。
4、一種復(fù)方中藥外用制劑的制備方法，其特征在于它按下述步驟制備
a、按權(quán)利要求1所述的配方取各藥材原料；
b、對虎杖和蜂房進(jìn)行提取處理；
c、將步驟b中處理虎杖和蜂房后的提取液進(jìn)行混合，過濾，加入冰片，混勻后即得本發(fā)明的外用制劑。
5、根據(jù)權(quán)利要求4中所述的一種復(fù)方中藥外用制劑的制備方法，其特征在于上述對虎杖的提取處理為將虎杖藥材粉碎后，用20倍重量95％乙醇溶液提取3次，總提取時間為3h，具體操作如下第一次用8倍重量95％乙醇溶液提取1.5h，第二次、第三次各為用6倍重量95％乙醇溶液，分別提取1h和0.5h，提取液減壓濃縮后，加95％乙醇適量使提取液的乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容。
6、根據(jù)權(quán)利要求4中所述的一種復(fù)方中藥外用制劑的制備方法，其特征在于上述對蜂房的提取處理為將蜂房藥材剪碎后，用20倍量的水煎煮3次，總提取時間為4h，第一次2h，第二次、第三次各1h，水煎液濃縮后，用60％乙醇溶液沉淀，醇沉后將乙醇溶液濃縮，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容。
7、根據(jù)權(quán)利要求4中所述的一種復(fù)方中藥外用制劑的制備方法，其特征在于
上述對虎杖的處理為稱取粉碎的虎杖藥材1kg，用20倍重量95％乙醇溶液提取3次，總提取時間為3h，提取的具體操作按權(quán)利要求4所述，提取液減壓濃縮后，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容至5L；上述對蜂房的處理為稱取剪碎的蜂房藥材1kg，每次用20倍重量的水煎煮3次，總提取時間為4h，提取的具體操作按權(quán)利要求5所述，加95％乙醇適量使提取液乙醇濃度為45％，并用45％乙醇溶液定容至5L。將以上提取液混合，過濾，加入冰片50g，混勻后即得本發(fā)明外用制劑。
8、利用權(quán)利要求1的復(fù)方中藥外用制劑作為制備燒傷、燙傷、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛及促進(jìn)傷口愈合藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)方中藥外用制劑及其制備方法，該外用制劑主要由下述配比關(guān)系的藥材制成虎杖0.01g/ml～0.6g/ml、蜂房0.01g/ml～0.5g/ml、冰片0.1mg/ml～20mg/ml，其它成分為乙醇溶液。本發(fā)明的制備方法按下述步驟進(jìn)行a.按上述的配方取各藥材原料；b.對虎杖和蜂房進(jìn)行前處理；c.將步驟b中處理虎杖和蜂房后的提取液進(jìn)行混合，過濾，加入冰片，混勻后即得本發(fā)明的外用制劑。本發(fā)明復(fù)方中藥外用制劑具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛及促進(jìn)傷口愈合藥物的作用，很好的解決現(xiàn)有的治療燒傷藥物多以西藥或單一的藥物為主，主要存在著創(chuàng)面疼痛、進(jìn)行性壞死、易感染和瘢痕愈合四大難題，且還解決了二次感染等方面存在的問題。
文檔編號A61P31/00GK1839948SQ20061004569
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日
發(fā)明者趙慶春, 郭濤, 文金輝 申請人:趙慶春, 郭濤