專利名稱：鹿胎盤生理活性多肽的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鹿胎盤生理活性多肽的制備方法，屬于醫(yī)療、保健領域。
背景技術：
胎盤(Placenta)，中醫(yī)稱為“紫河車”、“人胞”或“胞衣”，其應用可追溯到遠古時代。胎盤被有理有據的正式納入醫(yī)藥治療領域還是在進入本世紀后。胎盤對胎兒具有很強的保護和滋養(yǎng)等作用，具備利于胎兒發(fā)育的最佳環(huán)境。現代醫(yī)學通過生物監(jiān)測得出結論，胎盤中不僅含有多種治療疾病的激素、酶，還有防病健身及美容的多肽、細胞生長因子等物質，因此現代胎盤制劑研究的成果不僅用于治療疾病，還被廣泛應用到美容領域。
在日本，胎盤制劑可分為兩種一種用于臨床治療，屬于這一類的胎盤制劑來源幾乎均為人的胎盤另一種胎盤制劑用于美容或保健品，這種胎盤制劑的原料多為動物胎盤，如牛、豬胎盤等。通過對人、動物胎盤中有效成分的對比研究表明，同屬于哺乳動物的這兩種胎盤無論在治療上還是在美容、保健食品上的效果均無明顯的差異。在我國，鹿胎盤有著悠久的藥用和保健制品歷史，鹿胎盤可用于婦女內分泌紊亂類婦科疾病治療，在保健品方面可用于抗衰老延年益壽、化妝品等領域。中醫(yī)臨床經驗表明鹿胎盤不同于其他動物胎盤和人胎盤，鹿胎盤有著它特有的臨床療效，是其他動物胎盤不能替代的，而人胎盤由于來源和性病等因素受到很大的限制。艾滋病病毒等人源性病可通過制品傳染。對于牛胎盤來說，由于歐洲瘋牛病的原因也逐漸加大了法制管制。因此，開發(fā)鹿胎盤制品受到了醫(yī)療和保健業(yè)界的普遍重視。
胎盤制劑抗衰老、美容機制在于胎盤中的生理活性蛋白、細胞生長因子、多種酶和活性多肽等有效成分的抗細胞脂質過氧化作用、促進皮膚新陳代謝作用、細胞分裂促進作用、內分泌調節(jié)作用、抗炎作用、抗過敏作用、安眠作用以及保濕作用等。胎盤含有各種氨基酸、礦物質及維生素等成分，尤其含有與細胞生長有關的各種生長因子，如上皮細胞生長因子(EGF)、內皮細胞生長因子(ECGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經細胞營養(yǎng)因子等，因此胎盤制品對于抗衰老和皮膚具有明顯的功效。
鹿胎盤的最佳應用并不是簡單的磨成粉摻入產品中，而是應當通過嚴格的生化處理過程“去其糟粕，取其精華”，去掉其中沒有用的、對人體有害的成份，保留有益成份。胎盤提取物(Placental Extracts)包括胎盤水解液、胎盤球蛋白、胎盤酶、短肽和胎盤脂質等。有研究表明胎盤提取液中的有效成分，可加速細胞的有絲分裂，促進細胞代謝，加強血液循環(huán)等作用，它還可用于各類護膚制品，防止皮膚粗糙、小皺紋、黑色素、雀斑，能增加皮膚營養(yǎng)。因此，研究和開發(fā)鹿胎盤保健制品等工作是當前中藥現代化研發(fā)的一個重要課題。目前，一些國外公司對于動物組織、臟器的藥用制品研發(fā)經驗告訴我們動物組織、臟器水解物，如心水解物、腦水解物、肝臟水解物、胎盤水解物等制品的藥用效果遠比這些組織、臟器的簡單處理制品好的多，已受到制藥業(yè)的高度重視。動物組織、臟器水解物的生產主要以酸解和酶解為主。采用酶法生產是當前研究的熱點，因其安全性極高、價廉、易于推廣而引起人們的極大興趣。
生理活性肽是指具有生物活性的多肽，這些多肽小到只有2個氨基酸的雙肽，也可以大到復雜的長鏈或環(huán)狀多肽，而且常經過糖苷化、磷酸化或?；苌?，在細胞生理及代謝功能的調節(jié)上具有重要的作用。特別是短肽的發(fā)現已經成為多肽類藥物和功能性食品添加劑的開發(fā)熱點。以數個氨基酸結合生成的低肽比氨基酸有更好的消化吸收性能，且營養(yǎng)和生理效果更為優(yōu)越。不僅如此，其中許多肽還具有原蛋白質或其組成氨基酸所沒有的新功能。這些生物活性肽都以非活性狀態(tài)存在于蛋白質的長鏈之中，當用適當的蛋白酶水解時，它們的活性就被釋放出來。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決的技術問題是去除鹿胎盤中的膽固醇物質，降低了膽固醇對人體的危害；并且分離掉胎盤中分子量較大的蛋白質和等電點為酸性和堿性的雜肽類物質，多肽分子量小，在低溫條件下操作，確保了生理活性物質不因溫度過高而遭到破壞，整個工藝過程無有害物質混入，工藝簡單，生產成本低的一種鹿胎盤生理活性多肽的制備方法。
本發(fā)明技術解決方案本發(fā)明采用以下步驟(1)將鹿胎盤絞碎，每100kg加入丙酮100-150升，充分攪拌3-6小時，過濾，濾餅真空干燥，粉碎制成脫脂鹿胎盤粉；(2)每千克鹿胎盤粉中加水3-6kg，緩慢攪拌，加熱至40℃-60℃攪拌2-5小時，制成鹿胎盤漿；(3)待鹿胎盤漿冷卻到40-48℃，加入胰酶，加入NaOH溶液調pH至8.5，在40-48℃條件下水解8小時，并不斷攪拌；(4)水解完畢之后，加鹽酸調pH至5.5終止消化，過濾；(5)濾液中按600克/L加入硫酸氨攪拌使其溶解，在4℃條件下靜置過夜，離心；(6)取上清液調pH至10，在4℃條件下靜置過夜，離心；(7)取離心上清液，調pH至7.0，用201X7樹脂和001X7樹脂，按201X7樹脂和001X7樹脂＝3∶1的比例，攪拌吸附15-30分鐘，至無硫酸氨為止；
(8)濾過樹脂，脫鹽液，超濾，低溫干燥制得成品。
采用如下方法制備胰酶，新鮮動物胰臟絞碎，加入25％乙醇攪拌后靜置12小時，然后再加3倍量的水，攪拌，靜置12小時，即可。
胰酶的最適pH值為8-9；最適溫度為43℃。
所含胰酶的量為每10個胎盤加1個新鮮動物胰臟所含的胰酶量。
本發(fā)明的優(yōu)點(1)、本工藝使用丙酮脫脂可除去鹿胎盤中的膽固醇物質，由此降低了膽固醇對人體的危害。
(2)、與以往的工藝相比，在低溫條件下操作，取消了煮沸過程，確保了生理活性物質不因溫度過高而遭到破壞。
(3)、由于采用低溫方法用動物胰酶作為胎盤水解的酶制劑，沒有有害物質的混入，對人體的健康沒有任何不良影響，屬于健康綠色生產工藝。
(4)、我們用高濃度硫酸氨在酸性和堿性條件下分步沉淀，去除了分子量較大的蛋白質和等電點為酸性和堿性的雜肽類物質，工藝簡單，生產成本低，此工藝也是我們的獨創(chuàng)。
(5)、更重要的是本工藝制備的多肽為具有鎮(zhèn)靜作用的有效成分，還具有抗衰老和美容保健作用，屬國內外首創(chuàng)，生產的多肽分子量很小，而且耐胃蛋白酶和胰蛋白酶分解，適合于口服和外用化妝品的制備。
(6)、本工藝生產的多肽產品是醫(yī)藥、保健品和化妝品等領域的重要原材料，使用此原料可制備一系列貴重商品，能為國家創(chuàng)造巨大的經濟財富和帶來不可估量的社會性效益。
本發(fā)明對鹿胎盤生理活性多肽的檢測1.1分子量檢測
1.1.1分子量檢測方法(1)SDS-PAGE凝膠電泳①小分子量的多肽SDS-PAGE凝膠配制如下配制分離膠(T＝15％，C＝5％，8.0M尿素，0.025％SDS，0.2M Tris-SO4，pH7.8)5mL尿素2.3克，試劑A(1M Tris，0.2％SDS用濃硫酸調pH至7.8)0.96mL，試劑C[分離膠聚丙烯酰胺貯存液(T＝36％，C＝5％)]2.16mL，加水到5.0mL，試劑E(2.4％過硫酸銨溶液)0.1mL，TEMED3μL。如下配制濃縮膠(T＝3.125％，C＝20％，0.025％SDS，0.2M Tris-SO4，pH7.8)5mL試劑A1.0mL，試劑D[濃縮膠聚丙烯酰胺貯存液(T＝6.25％，C＝20％)]2.5mL，水1.4mL，試劑E0.1mL，TEMED5μL。
②SDS-PAGE條件條件同常規(guī)的SDS-PAGE，樣品緩沖液用0.139mol/LTris，0.5％SDS，20％蔗糖，0.01％溴酚蘭，用冰醋酸調pH至7.8。下槽用A液(1mol/L Tris，0.2％SDS用濃硫酸調pH至7.8)用1∶5稀釋，上槽用B液(0.074mol/L Tris，0.1％SDS用HCl調pH至7.8)。
③凝膠染色用常規(guī)電泳的考馬司亮蘭染色多肽。
(2)質譜分析(MALDI-TOF MS)為了確定我們制備的混合多肽分子大小，使用德國Bruker公司的ReflexIII進行了分析。
1.1.2分子量檢測結果我們希望獲得分子量較小的多肽，通過SDS-PAGE凝膠電泳分析和質譜分析，確定了這些多肽大小在3KD以下，即小于30個氨基酸。為了獲得有效的單肽成分，我們用HPLC方法分離含量較大的多肽，即0.8、1.0、1.5、2.2和2.4KD的5個成分。
1.2氨基酸的檢測
1.1.2氨基酸的檢測方法稱取25mg樣品于水解管底部，加入6mol/L鹽酸20mL，加入1滴正辛醇(去泡劑)；將水解管放入干冰-丙酮液或液氮中，冷凍2min后將水解管和真空泵相連，抽至基本無氣泡時，一邊繼續(xù)抽氣，一邊用噴燈將管口封死；然后置烘箱內于110℃水解22-24小時。取出冷卻后，切開水解管，將水解液定量地過濾至50mL容量瓶中，然后用水定容至刻度；取濾液10mL至燒瓶中，在減壓蒸干裝置上蒸干；殘留物用10mL無離子水解并再次蒸干。如此反復加水蒸干2-3次，最后一次蒸干后放4℃冰箱中保存待分析用。分析前，準確加0.02mol/L鹽酸1-5mL，使每毫升含0.15mg左右粗蛋白，即得到樣品液。然后用日立L-8800全自動氨基酸分析儀進行分析。
1.2.2氨基酸的檢測結果共檢測出18種常見氨基酸，它們是Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg、Pro和NH3，其中有8中人體必需氨基酸，它們是Thr、Val、Met、Ile、Leu、Lys、His和Pro。
1.3活性檢測1.3.1活性檢測方法(1)小鼠灌腸實驗選擇8周齡的大小、外形、營養(yǎng)程度一致的BARB/c小白鼠，分成5只一小組，除對照組，用制備的多肽混合物水溶劑200微克/只灌腸，并在飲水中加入50毫克/L多肽混合物，觀察一個月。
(2)大白鼠神經原細胞的培養(yǎng)①神經原細胞的制備取出生后1-3天內的大鼠腦組織后，先仔細剝除腦膜和血管等纖維成分，置入Hanks液中漂洗1～2次后，置于30～50倍的Hanks液中，腦組織比較柔軟，反復吹打即可制成細胞懸液。為排除脂肪成分和其它碎塊，把懸液注入離心管中，在室溫直立5～10分鐘后，細胞或細胞團塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復二三次可獲得較多的細胞成分。向末次沉淀物中加入適量營養(yǎng)液，通過紗網或紗布濾過，計數細胞并調整好細胞密度，接種入培養(yǎng)瓶或皿中，置5％CO2溫箱中培養(yǎng)。細胞生長匯合后，可用0.25％胰蛋白酶消化法做傳代處理，加消化液的量以能覆蓋細胞層即可，待細胞開始從瓶壁脫離(平均5～10分鐘)，加入含有血清培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。
②培養(yǎng)用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，向細胞培養(yǎng)液中加入1微克/毫升的鹿胎盤多肽混合物，對照組不加，培養(yǎng)觀察一周。
(3)人皮膚細胞的培養(yǎng)全層正常背部皮膚，來自外科整形術患者，局部未經任何處理(經患者知情同意)。
①人皮膚汗腺組織的分離獲取離體10min內手術區(qū)全層皮膚，0.5cm×2.0cm，無菌操作下去除皮下脂肪，置于含雙抗的Dulbecco磷酸鹽緩沖液(PBS)中反復漂洗。轉置培養(yǎng)皿中，用眼科剪將皮膚剪成小于1mm×1mm的組織塊，加入適量含膠原酶II型(2g/L)的Hank平衡鹽溶液(HBSS)，在孵箱中靜置過夜。次日晨在倒置顯微鏡下觀察皮膚消化情況。在細胞超凈臺中操作。用微量移液器吸取游離汗腺組織，移入另一盛有DMEM/F 12液(1∶1，內含體積分數為5％胎牛血清)的培養(yǎng)皿中，37℃、體積分數5％CO2、飽和濕度為95％條件下靜置孵育30min，重復該步驟2次。
②培養(yǎng)用5％的胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基，向細胞培養(yǎng)液中加入1微克/毫升的鹿胎盤多肽混合物，對照組不加，培養(yǎng)觀察一周。
1.3.2活性檢測結果(1)小鼠灌腸實驗結果
小鼠灌腸實驗表明這種短肽的確具備鎮(zhèn)靜作用，顯示灌腸小鼠比對照組明顯安靜，一段時間的觀察還發(fā)現實驗組的小鼠的毛色比對照組光亮，運動也比對照組活潑。為了確定這種具有鎮(zhèn)靜作用的物質是肽類物質而不是其它具有鎮(zhèn)靜作用的有機化合物成分，我們用黃曲霉蛋白酶進行了過消化處理，使多肽徹底降解成氨基酸，用這種酶處理的液體再給小鼠灌腸檢測，發(fā)現灌腸小鼠與對照組沒有明顯區(qū)別，表明這種具鎮(zhèn)靜作用的物質是由氨基酸組成的肽類物資，由此排除了化學鎮(zhèn)靜物質的作用。
為了更進一步確定這種具靜眠作用的小肽物質成分，我們用分離的其中5個含量較大的成分也同樣進行實驗測試。令我們失望的是它們都不具備明顯的靜眠作用。有意思的是如果除去了這幾個含量較大成分的其它物質其靜眠作用也不明顯，表明具有這種具靜眠作用的多肽是一種混合肽，只有這些多肽相互協調作用才能明顯地發(fā)揮它們的生理活性，這也說明以前其他的研究一直不能分離出這種作用的多肽的一個重要理由，也說明發(fā)揮同種作用的物質需要協同作用，這種現象在中藥藥效更為明顯，往往一種有效的中成藥需要很多藥物配伍。
(2)大白鼠神經原細胞的培養(yǎng)及人皮膚細胞的培養(yǎng)的結果這種鹿胎盤生理活性多肽很可能同時具備其它的生理活性，為此我們使用大白鼠神經原細胞和人皮膚細胞培養(yǎng)液中加入鹿胎盤生理活性多肽進行培養(yǎng)，發(fā)現它能促進神經細胞和皮膚細胞的生長，表明這種多肽在抗衰老和美容方面具有重要的應用前景。
1.4穩(wěn)定性檢測因為我們計劃使用這種生理活性多肽制成口服保健品，口服后許多蛋白和多肽會被胃蛋白酶和胰蛋白酶分解，為此我們進行了這兩個酶的消化實驗，發(fā)現鹿胎盤生理活性多肽對胃蛋白酶和胰蛋白酶也非常穩(wěn)定。
四

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；圖2為本發(fā)明SDS-PAGE凝膠電泳分析圖；圖3為本發(fā)明SDS-PAGE質譜分析圖；圖4為本發(fā)明大白鼠神經原細胞未加制備的多肽培養(yǎng)情況圖；圖5為本發(fā)明大白鼠神經原細胞加制備的多肽培養(yǎng)情況6本發(fā)明人皮膚細胞未加制備的多肽培養(yǎng)情況圖；圖7本發(fā)明人皮膚細胞加制備的多肽培養(yǎng)情況圖；五具體實施方式
取鹿胎盤100kg絞碎，加丙酮120升，充分攪拌4.5小時，過濾，濾餅真空干燥，粉碎制成脫脂鹿胎盤粉。加丙酮的目的在于脫去鹿胎盤中的脂肪，使其不含膽固醇。取鹿胎盤粉28kg，加水150kg，緩慢攪拌，加熱至60℃攪拌3小時，制成鹿胎盤漿。待鹿胎盤漿冷卻到42-45℃，加入胰酶；胰酶的制備將新鮮豬胰絞碎，加入25％乙醇攪拌后靜置12小時，然后再加3倍量的水，攪拌，靜置12小時，即可。每10個胎盤加1個新鮮豬胰臟所含的胰酶量。加NaOH溶液，調pH至8.5，在42-45℃條件下水解8小時，并不斷攪拌。水解完畢之后加鹽酸調pH至5.5終止消化，過濾。濾液按600克/L加硫酸氨攪拌使其溶解，在4℃條件下靜置過夜，離心。取上清調pH至10，在4℃條件下靜置過夜，離心。取離心上清液，調pH至7.0，用201X7樹脂和001X7樹脂(按201X7樹脂和001X7樹脂＝3∶1的比例)攪拌吸附20分鐘，至無硫酸氨為止。濾過樹脂，脫鹽液，超濾，低溫干燥制得成品。
注意胰酶的最適pH值為8-9；最適溫度為43℃，過高會導致酶失活，過低會影響酶的消化效率，因此應嚴格把握消化條件。本發(fā)明的胰酶還可采用牛、羊胰臟替代。
權利要求
1.鹿胎盤生理活性多肽的制備方法，其特征在于采用以下步驟(1)將鹿胎盤絞碎，每100kg加入丙酮100-150升，充分攪拌3-6小時，過濾，濾餅真空干燥，粉碎制成脫脂鹿胎盤粉；(2)每千克鹿胎盤粉中加水3-6kg，緩慢攪拌，加熱至40℃-60℃攪拌2-5小時，制成鹿胎盤漿；(3)待鹿胎盤漿冷卻到40-48℃，加入胰酶，加入NaOH溶液調pH至8.5，在40-48℃條件下水解8小時，并不斷攪拌；(4)水解完畢之后，加鹽酸調pH至5.5終止消化，過濾；(5)濾液中按600克/L加入硫酸氨攪拌使其溶解，在4℃條件下靜置過夜，離心；(6)取上清液調pH至10，在4℃條件下靜置過夜，離心；(7)取離心上清液，調pH至7.0，用201X7樹脂和001X7樹脂，按201X7樹脂和001X7樹脂＝3∶1的比例，攪拌吸附15-30分鐘，至無硫酸氨為止；(8)濾過樹脂，脫鹽液，超濾，低溫干燥制得成品。
2.根據權利要求1所述的鹿胎盤生理活性多肽的制備方法，其特征在于采用如下方法制備胰酶，新鮮動物胰臟絞碎，加入25％乙醇攪拌后靜置12小時，然后再加3倍量的水，攪拌，靜置12小時，即可。
3.根據權利要求1或2所述的鹿胎盤生理活性多肽的制備方法，其特征在于胰酶的最適pH值為8-9；最適溫度為43℃。
4.根據權利要求3所述的鹿胎盤生理活性多肽的制備方法，其特征在于所含胰酶的量為每10個胎盤加1個新鮮動物胰臟所含的胰酶量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鹿胎盤生理活性多肽的制備方法，屬于醫(yī)療、保健領域。特點是鹿胎盤絞碎加丙酮充分攪拌，干燥后制成胎盤粉，加水制成胎盤漿；加胰酶水解，加鹽酸調pH至5.5終止消化，過濾，濾液加入硫酸氨攪拌使其溶解，在4℃條件下靜置過夜，離心；調pH至10，在4℃條件下靜置過夜，離心；取離心上清液，調pH至7.0，攪拌吸附20分鐘，至無硫酸氨為止；濾過樹脂，脫鹽液，超濾，低溫干燥得成品。本發(fā)明降低膽固醇對人體的危害，確保了生理活性物質不因溫度過高而遭到破壞。工藝簡單，生產成本低，本發(fā)明生產的多肽分子量小，具有鎮(zhèn)靜作用的有效成分，具有抗衰老和美容保健作用，且耐胃蛋白酶和胰蛋白酶分解，適于口服和外用化妝品的制備。
文檔編號A61K38/17GK1891711SQ20061005516
公開日2007年1月10日 申請日期2006年2月22日 優(yōu)先權日2006年2月22日
發(fā)明者鄭彬 申請人:鄭彬