專利名稱：改進(jìn)的基于紫杉醇的抗腫瘤制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于紫杉醇和白蛋白納米顆粒的抗腫瘤制劑，它能產(chǎn)生具有很高的不隨時(shí)間改變性的可注射的重制水性混合物。
背景技術(shù)：
紫杉醇是在文獻(xiàn)中已知的天然物質(zhì)，具有重要的抗腫瘤活性。其弱水溶性使其難于對(duì)人給藥，由于此原因，已開發(fā)了多種能使其可注射的系統(tǒng)。
Bristol Myers Squibb(BMS)設(shè)計(jì)了一種組合物，并獲得了專利，它的名稱是TAXOL，在此組合物中，用克列莫佛(cremophor)使紫杉醇乳化，這樣會(huì)使病人產(chǎn)生多種副作用(Lorenz等，藥物作用(Agents Action)7，63-67(1987)；Weiss等，J.Clin.Oncol.8，1263(1990))。由于活性成分的稀釋，BMS制劑還涉及給藥時(shí)間長的問題。
為了克服所述的缺點(diǎn)，BMS對(duì)有同樣劑量的紫杉醇但使用其他能避免強(qiáng)過敏性反應(yīng)的賦形劑的TAXOL制劑進(jìn)行了專利保護(hù)(EP-A-0584001，EP-A-0783885，EP-A-0783886，US 5641803，US5670537)。然而，在所有情況下，必須非常緩慢地對(duì)病人給藥，超過約3小時(shí)。
為防止TAXOL的副作用，鑒于人血清白蛋白(HSA)的生物相容性及其很強(qiáng)的與紫杉醇結(jié)合的能力，用它代替cremophor(Kumar等，Res.Comm.in Chem.Path.and Pharm.，80(3)，337-343(1993)；Paal等，Eur.J.Biochem.268，2187-2191(2001))。HSA形成含有溶解在水不溶性有機(jī)溶劑中的活性成分的微球的性質(zhì)(Kramer等，J.Pharm.Sci.63，1646-1647(1974)；Grinstaff和Suslick，J.Am.Chem.Soc.112，7807-7809(1990)；Grinstaff和Suslick，Polym.Prepr.32，255-256(1991))，也使得開發(fā)以高于TAXOL的濃度給藥紫杉醇的系統(tǒng)成為可能。
可以通過已知的超聲波、高壓勻化和微流化技術(shù)得到紫杉醇和HSA的可注射的納米乳劑。
基于這些要素，并通過使用上述超聲波、高壓勻化技術(shù)，美國VivoRx藥物公司已開發(fā)了含有紫杉醇和HSA的制劑CAPXOL(R)。
在US 5439686、US 5498421、US 5560933和相應(yīng)的WO94/18954中，VivoRx要求保護(hù)用超聲波技術(shù)制備的紫杉醇和HSA的微粒，得到平均粒徑(MPS)＜10微米的顆粒。在這些專利中記載的制備方法不能用于工業(yè)化規(guī)模，并且如此得到的微粒有太高的MPS，這使其不適于和不能用于對(duì)病人給藥。
VivoRx很清楚這一點(diǎn)，因此它在US 5916596和US 6096331及WO98/14174和WO99/00113中記載并要求保護(hù)通過用無菌0.9％NaCl水溶液重制紫杉醇和HSA的冷凍干燥粉末而得到的無菌納米乳劑，其MPS＜0.2微米。如引證的專利所述的，這些用高壓勻化方法得到的納米乳劑據(jù)稱有高的穩(wěn)定性，此處術(shù)語“穩(wěn)定性”的意義既表示MPS不隨時(shí)間而改變，也表示不出現(xiàn)納米顆粒沉淀(US6096331，實(shí)施例11)。
用最大的細(xì)心，本發(fā)明人已許多次重復(fù)了前述專利的實(shí)施例，特別是US 5916596的實(shí)施例1、5和6，不曾得到在此專利的實(shí)施例和權(quán)利要求書中說明的結(jié)果。本發(fā)明人制備了所記載的混合物，然后在US 5916596推薦的壓力范圍內(nèi)用Avestin勻化器對(duì)其處理，得到pH＝6.7的納米乳劑，當(dāng)如所述專利報(bào)道的，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)除溶劑時(shí)，總產(chǎn)生MPS約0.2微米(蒸發(fā)后MPS的增加＞0.02微米)的納米顆粒，它們?cè)诳勺⑸涞纳砣芤褐行纬傻闹苿┎环€(wěn)定(MPS的增加約為0.05微米，在約12小時(shí)內(nèi)傾向于沉積)，并難于過濾通過0.22微米濾器進(jìn)行滅菌，這與所述專利中聲稱的不同。
本申請(qǐng)人已付出最大耐心的努力以用US 5916596記載的膜進(jìn)行過濾，但這些結(jié)果總是失敗，造成濾器堵塞并且紫杉醇產(chǎn)率總是低于30％，與聲稱的70-100％不同。另外，用剛剛描述的方法制備，然后按US 5916596和US 6096331報(bào)道的方法冷凍干燥并重制的產(chǎn)品的穩(wěn)定性(按US 6096331的實(shí)施例11的技術(shù)評(píng)價(jià))從未達(dá)到24小時(shí)(因此大大少于在專利中所公開的72小時(shí))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種由紫杉醇和人血清白蛋白的納米顆粒構(gòu)成的抗腫瘤制劑，它可以用生理溶液重組成可注射的混合物，所述顆粒在其中具有顯著大于在現(xiàn)有技術(shù)中可能的穩(wěn)定性，特別是超過24小時(shí)的穩(wěn)定性。
通過由紫杉醇和人血清白蛋白的納米顆粒的冷凍干燥粉末構(gòu)成的制劑達(dá)到了這一目的和進(jìn)一步的目的，在制劑中紫杉醇的量在1％-20％之間，白蛋白的量在60％-98％之間，百分?jǐn)?shù)是按重量計(jì)，納米顆粒的平均粒徑小于0.2微米，其特征在于所述冷凍干燥的粉末含有1％-20％重量之間的生物相容性鹽，此鹽由至少一種生物相容性酸成鹽或由于存在至少一種生物相容性酸性緩沖物質(zhì)而得到的，酸或酸性緩沖物質(zhì)的存在的量是使粉末重制形成的水性可注射混合物的pH在5.4和5.8之間。
鹽的存在是由于酸及其鹽形成了酸性緩沖物質(zhì)(如化學(xué)家已知的)，并且白蛋白中的一些堿性基團(tuán)與酸成鹽，因此得到了其pH低于白蛋白的典型pH(即根據(jù)墨克索引13版第1519頁記載為6.79-6.89)的混合物。
實(shí)驗(yàn)已顯示如果使用酸性緩沖物質(zhì)(例如檸檬酸和檸檬酸鈉的混合物)，在關(guān)于上述穩(wěn)定性方面，結(jié)果不如僅使用酸好(檸檬酸或其它生物相容性酸)。
顯然，在加入水并與冷凍干燥粉末形成水性混合物后，可以容易地測定冷凍干燥粉末的pH。研究已顯示，酸性納米顆粒中也存在水粉末中水的量至高為5％(W/W)，通常約2％-4.5％(W/W)。因此，上述含有水的納米顆粒也形成了本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還涉及此制劑的可注射的重組水性混合物，其中，紫杉醇的濃度在0.1-3mg/ml之間，優(yōu)選0.5-2.5mg/ml。
也可以通過將人血清白蛋白(HSA)的無菌水溶液與紫杉醇的無菌溶液混合，并按前述Vivorx專利的教導(dǎo)處理此混合物，得到本發(fā)明的制劑，但與這些教導(dǎo)的不同之處在于，在與紫杉醇混合之前，向HSA的水溶液中加入至少一種生物相容性酸或酸性緩沖物質(zhì)，其加入量足以將溶液的pH調(diào)節(jié)到5.4-5.8，優(yōu)選5.5-5.7之間。
生物相容性酸可以選自鹽酸、檸檬酸、磷酸、醋酸、生物相容性有機(jī)或無機(jī)酸。
也可以通過以下方法得到同樣的制劑將0℃-40℃的含有紫杉醇和白蛋白的水性混合物在9000-40000psi的高壓下經(jīng)過勻質(zhì)化處理，得到納米乳劑，將其在-20℃和-80℃之間冷凍，并最終在+20℃和+35℃之間的溫度下加熱凍干，在無菌條件下通過將白蛋白溶解在無菌水中達(dá)到2％-3％(W/V)的濃度，然后向此溶液中加入2％-4％(V/V)的氯仿，然后加入占溶液中白蛋白重量5.40％-15.0％，優(yōu)選5.60％-13.7％的無菌粉末狀的紫杉醇，在加入紫杉醇之前向所述白蛋白溶液中加入足夠量的至少一種生物相容性酸或酸性緩沖物質(zhì)以將混合物的pH調(diào)節(jié)到5.4-5.8，優(yōu)選5.5-5.7之間，以得到所述的水性混合物。
可以注意到的是在后一方法中使用無菌粉末狀的紫杉醇不僅大大簡化了流程本身，也使此方法能與現(xiàn)有技術(shù)相比，還使在勻化處理前完成各種組分的混合所需的時(shí)間大大縮短，而也能得到更好的最終產(chǎn)率，并簡化了為得到所需的無菌冷凍干燥粉末所遵循的條件。
用根據(jù)本發(fā)明所述的制劑得到的結(jié)果是完全意外并令人驚奇的，因?yàn)樗鼈兣c現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于使用由于稀釋符合FDA規(guī)范的白蛋白可注射溶液而產(chǎn)生的pH值在pH＝6.9±0.5的HSA溶液提供的教導(dǎo)不同(見US 5916596的實(shí)施例1、5和6)。與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)不同的是，已發(fā)現(xiàn)pH值在5.4和5.8之間時(shí)，對(duì)于重組的冷凍干燥產(chǎn)品，可以得到大于24小時(shí)的穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式
為闡明對(duì)本發(fā)明特征的理解，現(xiàn)在描述其實(shí)施的一些非限定性的實(shí)施例。
實(shí)施例1用HCl和溶解在氯仿中的紫杉醇制備制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液(pH＝6.9±0.5)稀釋到3％(w/v)，用1M HCl將其pH調(diào)節(jié)到5.6，HCl與白蛋白中的某些堿性基團(tuán)成鹽。將40ml預(yù)先滅菌的所述溶液與1.2ml紫杉醇的氯仿無菌溶液(59.0mg/ml)混合，然后將混合物在高壓下(9000-40000psi)在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，將其在無菌條件下冷凍到-25℃，并凍干60小時(shí)，同時(shí)升溫至+20℃。
將得到的含有4.25％(W/W)紫杉醇和3.6％(w/w)水的粉末，用0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.16微米的MPS，pH＝5.6，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
用磷酸代替鹽酸得到同樣的結(jié)果。
實(shí)施例2用檸檬酸和溶解在氯仿中的紫杉醇制備制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液(pH＝6.9±0.5)稀釋到2.5％(w/v)，用無菌檸檬酸將其pH調(diào)節(jié)到5.5，檸檬酸與白蛋白中的某些堿性基團(tuán)成鹽。將60ml所述溶液與1.7ml濃度為60.0mg/ml的紫杉醇的氯仿無菌溶液混合，然后將混合物在高壓下(9000-40000psi)在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，將其在無菌條件下迅速冷凍到-40℃，并凍干55小時(shí)，同時(shí)升溫至+35℃。
將得到的含有5.2％(W/W)紫杉醇和4.9％(w/w)水的粉末，用0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.17微米的MPS，pH＝5.5，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
實(shí)施例3
用鹽酸和溶解在氯仿中的紫杉醇制備制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液稀釋到3％(w/v)，用1M HCl將其pH調(diào)節(jié)到5.6，鹽酸與白蛋白中的某些堿性基團(tuán)成鹽。將60ml所述溶液與1.5ml濃度為75mg/ml的紫杉醇的氯仿無菌溶液混合，然后將混合物在高壓下(9000-40000psi)在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，將其在無菌條件下迅速冷凍到-50℃，并凍干50小時(shí)，同時(shí)升溫至+30℃。
將得到的含有4.41％(W/W)紫杉醇和3.8％水的粉末，用0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2.5mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.175微米的MPS，pH＝5.6，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
通過重復(fù)同樣的過程但不加鹽酸，因而在大約pH6.5進(jìn)行，得到有0.24微米MPS且穩(wěn)定性約10小時(shí)的制劑。
實(shí)施例4用檸檬酸從紫杉醇溶液制備制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液稀釋到3％(w/v)，用檸檬酸將其pH調(diào)節(jié)到5.4，檸檬酸與白蛋白中的某些堿性基團(tuán)成鹽。
在強(qiáng)力攪拌下，將50ml所述溶液與1.25ml紫杉醇的氯仿無菌溶液(75mg/ml)混合至少40分鐘。。
將混合物在高壓下(9000-40000psi)在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，將其在無菌條件下迅速冷凍到-30℃，并凍干57小時(shí)，同時(shí)升溫至+35℃。
將得到的含有5.00％(W/W)紫杉醇和4.3％(w/w)水的粉末，用0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.19微米的MPS，pH＝5.4，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
用醋酸代替檸檬酸得到同樣的結(jié)果。
實(shí)施例5用鹽酸和粉末狀的紫杉醇制備制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液(pH＝6.9±0.5)稀釋到3％(w/v)，用1M鹽酸將其pH調(diào)節(jié)到5.6，鹽酸與白蛋白中的某些堿性基團(tuán)成鹽。
將預(yù)先滅菌的57ml所述溶液，在強(qiáng)力攪拌下與1.40ml氯仿，并與108mg粉末狀的無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合至少30分鐘。
將混合物在高壓下(9000-40000psi)在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，將其在無菌條件下迅速冷凍到-80℃，并凍干55小時(shí)，同時(shí)升溫至+30℃。
將得到的含有4.83％(W/W)紫杉醇和4％(w/w)水的粉末，用0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.175微米的MPS，pH＝5.6，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
用磷酸代替鹽酸得到同樣的結(jié)果。
重要的是注意用粉末狀的無菌紫杉醇能實(shí)現(xiàn)重要的優(yōu)勢僅需要一種反應(yīng)器形成含有HSA和紫杉醇的液體混合物，而降低完成此工藝必需的花費(fèi)和時(shí)間。
實(shí)施例6用檸檬酸和粉末狀的紫杉醇制備制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液稀釋到3％(w/v)，用檸檬酸將其pH調(diào)節(jié)到5.4，檸檬酸與白蛋白中的某些堿性基團(tuán)成鹽。
將預(yù)先滅菌的50ml所述溶液，在強(qiáng)力攪拌下與1.23ml無菌氯仿，并與98mg粉末狀的無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合至少40分鐘。
將混合物在高壓下(9000-40000psi)在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，將其在無菌條件下迅速冷凍到-30℃，并凍干57小時(shí)，同時(shí)升溫至+35℃。
將得到的含有4.80％(W/W)紫杉醇和3.8％(w/w)水的粉末，用0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.19微米的MPS，pH＝5.4，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
用醋酸代替檸檬酸得到同樣的結(jié)果。
實(shí)施例7用無菌檸檬酸和粉末狀的紫杉醇制備制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液稀釋到3％(w/v)，用檸檬酸將其pH調(diào)節(jié)到5.5，檸檬酸與白蛋白中的某些堿性基團(tuán)成鹽。
將37ml所述溶液，在強(qiáng)力攪拌下與0.91ml無菌氯仿和71mg粉末狀的無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合至少40分鐘，然后將混合物冷卻到5-8℃。
將混合物在高壓下(9000-40000psi)在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，將其在無菌條件下迅速冷凍到-80℃，并凍干58小時(shí)，同時(shí)升溫至+30℃。
將得到的含有4.70％(W/W)紫杉醇和4.5％(w/w)水的粉末，用0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.185微米的MPS，pH＝5.5，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
實(shí)施例8制備含有9.36％紫杉醇的制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液稀釋到3％(w/v)，用1M鹽酸將其pH調(diào)節(jié)到5.6，鹽酸與白蛋白中的某些堿性基團(tuán)成鹽。60ml所述溶液適當(dāng)滅菌，在強(qiáng)力攪拌下與2.15ml濃度為110mg/ml的紫杉醇氯仿無菌溶液混合，然后將混合物在高壓下(9000-40000psi)在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，將其在無菌條件下迅速冷凍到-50℃，并凍干50小時(shí)，同時(shí)升溫至+30℃。
將得到的含有9.36％紫杉醇和3.9％(W/W)水的粉末再與0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2.5mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.175微米的MPS，pH＝5.6，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
實(shí)施例9制備pH 5.5的制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的20％(w/v)HSA水溶液(pH＝6.9±0.5)稀釋到3％(w/v)，用檸檬酸將其pH調(diào)節(jié)到5.5，檸檬酸與白蛋白中的某些堿性基團(tuán)成鹽。
將110ml所述溶液，在強(qiáng)力攪拌下與4.10ml無菌氯仿和639mg粉末狀的無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合，然后將混合物在高壓勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS約0.2微米)，真空蒸發(fā)除去溶劑，冷凍并凍干48小時(shí)。
將得到的含有10.8％(W/W)紫杉醇的粉末，用0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.15微米的MPS，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種含有紫杉醇和人血清白蛋白的納米顆粒的冷凍干燥粉末的抗腫瘤制劑，其中紫杉醇的量在1％-20％之間，白蛋白的量在60％-98％之間，百分?jǐn)?shù)是按重量計(jì)，納米顆粒的平均粒徑小于0.2微米，其特征在于所述冷凍干燥的粉末含有1％-20％重量之間的的生物相容性鹽，它是由至少一種生物相容性酸成鹽或由于存在至少一種生物相容性酸緩沖物質(zhì)而得到的，酸或酸性緩沖物質(zhì)存在的量是使粉末重制形成的可注射水性混合物的pH在5.4和5.8之間。
2.權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于所述pH在5.5和5.7之間。
3.權(quán)利要求1和2所述的制劑，其特征在于所述冷凍干燥粉末含有至高為5％(W/W)的水。
4.權(quán)利要求1至3所述的制劑，其特征在于當(dāng)重新形成生理學(xué)可注射的混合物時(shí)，其含有濃度為0.1-3mg/ml的紫杉醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的制劑的可注射水性混合物，其特征在于其含有濃度為0.1-3mg/ml的紫杉醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的可注射水性混合物，其特征在于其含有濃度為0.5-2.5mg/ml的紫杉醇。
7.能從根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的抗腫瘤制劑得到的生理學(xué)可注射的混合物。
全文摘要
一種基于紫杉醇和人血清白蛋白的納米顆粒的抗腫瘤制劑，它是在納米顆粒制備過程中，將白蛋白水溶液與紫杉醇混合前，通過向白蛋白水溶液中加入生物相容性酸而得到的，此制劑的可注射的溶液具有在5.4－5.8之間的pH，并具有穩(wěn)定性和不隨時(shí)間改變性。
文檔編號(hào)A61K31/337GK1935121SQ20061009125
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者M·澤諾尼, S·瑪施奧 申請(qǐng)人:阿布拉西斯生物科學(xué)公司