專利名稱：一種殼聚糖納米粒的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非病毒基因轉(zhuǎn)移載體——殼聚糖納米粒，尤其涉及一種殼聚糖納米粒的制備方法和應(yīng)用。本納米粒安全無毒，來源經(jīng)濟(jì)，具有轉(zhuǎn)染效率高，易操作等優(yōu)點，且可攜帶多種目的基因。
背景技術(shù)：
限制基因治療發(fā)展一個很重要的原因就是缺乏安全有效的基因遞呈系統(tǒng)，即基因轉(zhuǎn)移載體。
目前有十余種基因轉(zhuǎn)移技術(shù)可將外源基因轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，一般分為物理方法，化學(xué)方法及生物學(xué)(病毒)方法三大類。
物理和化學(xué)方法近年發(fā)展迅速，常用的有電擊法、顆粒轟擊法、磷酸鈣轉(zhuǎn)移法及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移法等。這些方法較安全，不存在野生型病毒污染及免疫反應(yīng)等問題，但基因轉(zhuǎn)移效率低。
生物學(xué)方法介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率高，是當(dāng)前基因治療的主要手段，但其安全性問題需要注意。糖尿病基因治療中常用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒及腺相關(guān)病毒等。
逆轉(zhuǎn)錄病毒感染分裂細(xì)胞效率高，且能穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的基因組中而不丟失，但不能感染非分裂細(xì)胞，有引起野生型病毒感染及癌變的可能。
腺病毒用于糖尿病基因轉(zhuǎn)移的載體具有以下優(yōu)點①既可感染分裂細(xì)胞，也可感染非分裂細(xì)胞，且感染率高；②由于不整合到宿主基因組中故不引起插入突變；③易于制備、純化及濃縮。其主要缺點是外源基因表達(dá)短暫且多次輸入易引起免疫反應(yīng)。
腺相關(guān)病毒是一種缺陷前病毒，對人類無致病性，其中一種B19病毒能夠特異性地整合到人類第19號染色體上，從而提高基因的安全性；但其載體容量小，不能超過5kb，且包裝效率低，制備較復(fù)雜，因此其應(yīng)用受到限制。
病毒系統(tǒng)，包括RNA病毒和DNA病毒載體，雖然轉(zhuǎn)移效率很高，但存在感染、免疫異常和可能癌變而限制在人體應(yīng)用。非病毒性基因遞呈系統(tǒng)由于安全和易于操作是未來基因治療發(fā)展的方向。完全人工合成的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可以避免產(chǎn)生重組病毒的潛在致癌性和免疫反應(yīng)，而且人工合成的基因遞呈系統(tǒng)比病毒性系統(tǒng)更容易操作。
殼聚糖納米粒是一種多聚陽離子試劑，和DNA的相互作用是通過靜電結(jié)合的，這種結(jié)合相當(dāng)牢固，只有當(dāng)它們進(jìn)入細(xì)胞后才會解離，而且與其它基因治療載體相比，殼聚糖納米粒有以下幾個優(yōu)點①具有良好的生物相容性，安全無毒，來源經(jīng)濟(jì)；②通過改變殼聚糖納米粒的分子量、質(zhì)粒的濃度、質(zhì)粒與殼聚糖納米粒的比例、血清濃度以及培養(yǎng)基的pH值，可以調(diào)整轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞的攝取量；③殼聚糖納米粒能有效包埋DNA，防止DNA被DNA酶降解，提高轉(zhuǎn)染效率；④殼聚糖納米粒遇酸膨脹形成凝膠，可以阻滯藥物或質(zhì)粒釋放，可作為緩釋、控釋的骨架材料；⑤可抑制細(xì)菌的代謝，有一定的抗菌活性。
因此，殼聚糖納米粒是一種非常有前途的基因轉(zhuǎn)移載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種殼聚糖納米粒的制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一、殼聚糖納米粒殼聚糖(Chitosan，CS)是甲殼素(Chitin)部分或全部脫乙?；漠a(chǎn)物，是自然界中唯一大量存在的陽離子聚合物，具有良好的生物降解性和生物相容性，來源經(jīng)濟(jì)，價格低廉。通過控制合成的條件和方法就能得到不同脫乙酰度和平均相對分子量的CS。
殼聚糖納米粒是一種非病毒基因轉(zhuǎn)移載體。它作為載體的機(jī)制集中于它的助滲作用、生物粘附性。它增加細(xì)胞的滲透力是通過影響上皮細(xì)胞的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)途徑，前者是由于它能瞬時打開細(xì)胞之間的緊密連接，細(xì)胞內(nèi)途徑則是依靠細(xì)胞的內(nèi)吞作用。其生物粘附性的機(jī)制在于粘膜上的粘液具有陰性電荷，而殼聚糖納米粒是一種聚陽離子，能與粘液之間通過靜電作用而使殼聚糖納米粒具備生物粘附性。
我們主要研究將分子量在15～30萬，脫乙酰度在90～95％的殼聚糖制備成殼聚糖納米粒在糖尿病基因治療方面的應(yīng)用。我們通過改變實驗條件，可以實現(xiàn)最佳轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞攝取量。按照我們的條件制備的殼聚糖納米粒在1型糖尿病的基因治療中可以發(fā)揮出色的效果。
二、殼聚糖納米粒的制備方法如圖1，殼聚糖納米粒的制備方法包括下列步驟1)殼聚糖處理①取殼聚糖1取殼聚糖1為0.05～0.15g；②溶于醋酸2將上述步驟①的殼聚糖溶于0.5～1.5％的醋酸100mL，攪拌至全部溶解；③調(diào)節(jié)pH值3將氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至5.0～6.0；④濾膜除菌4用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，4℃儲存?zhèn)溆?；⑤無菌純化水稀釋5臨用前用無菌純化水稀釋至0.01～0.03％，溶液最終含殼聚糖納米粒為0.01～0.03％(W/V)、乙酸4～6mmol/L；2)DNA溶液處理①取DNA溶液7取DNA溶液7為50～150mg/LDNA溶液100μL；②溶于硫酸鈉溶液將上述步驟①的溶液加入20～40mmol/L的硫酸鈉溶液100μL中，共200μL；3)水浴、混合
①水浴6將上述無菌純化水稀釋至0.01-0.03％的殼聚糖納米粒溶液200μL和上述DNA硫酸鈉溶液200μL，各在50-60℃水浴加熱12～18min；②混合，渦流震蕩9將上述步驟①的溶液迅速混合，渦流震蕩0.8～1.2min，反應(yīng)終體積≤500μL；③制備完后，于室溫下靜置2h，分裝，冷凍抽干備用。
上述百分比是質(zhì)量百分比。
三、殼聚糖納米粒的應(yīng)用殼聚糖納米粒能攜帶多種目的基因，用于糖尿病基因轉(zhuǎn)移載體的制備。
現(xiàn)在大約80％的基因載體是病毒性的載體。這類載體是通過改造病毒使其具有良好的跨膜特性。它們可以定向地將目的基因?qū)爰?xì)胞，且轉(zhuǎn)染效率高。但是，由于人體自身具有抗病毒的免疫系統(tǒng)，因而病毒極易引起人的免疫反應(yīng)。另外病毒具有自我復(fù)制的功能，故人們對使用病毒的安全性也深有顧慮。病毒載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(retroviral vectors，RV)、腺病毒載體(adenoviralvectors，AV)、腺相關(guān)病毒載體(adeno-associatedviral vectors，AAV)、單純皰疹病毒載體(herps simplex viral vectors，HSV)，以及目前正在興起的慢病毒載體(lent iviral vectors)等，如人類免疫缺陷病毒載體(humanimmuno deficency viral vectors，HIV vector)。這些病毒載體雖各有自身的優(yōu)點，但也都各自存在著難以克服的缺陷。RV不能感染非分裂細(xì)胞，比如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞。AV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移不能穩(wěn)定整合于宿主基因組內(nèi)，難以獲得轉(zhuǎn)基因的長期、穩(wěn)定表達(dá)。同時，其最大的缺陷還在于AV可引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。人類基因治療史上首例被確認(rèn)為因基因治療而死亡的病例就是采用的AV。AAV是目前被公認(rèn)的最理想的基因治療載體之一。然而，AAV制備困難，同時載體容量小，難以為大片段基因，比如D因子的基因治療所利用。HSV與AV相似，極易引發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，臨床應(yīng)用困難很多。目前正在開發(fā)之中的慢病毒載體-HIV載體，雖然有許多優(yōu)點，但由于艾滋病的可怕陰影，以HIV為載體進(jìn)行基因治療，其安全問題仍令人心有余悸。
殼聚糖納米粒是一種非病毒載體。它作為載體的機(jī)制集中于它的助滲作用、生物粘附性。它增加細(xì)胞的滲透力是通過影響上皮細(xì)胞的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)途徑，前者是由于它能瞬時打開細(xì)胞之間的緊密連接，細(xì)胞內(nèi)途徑則是依靠細(xì)胞的內(nèi)吞作用。其生物粘附性的機(jī)制在于粘膜上的粘液具有陰性電荷，而殼聚糖納米粒是一種聚陽離子，能與粘液之間通過靜電作用而使殼聚糖納米粒具備生物粘附性。非病毒載體主要有脂質(zhì)體、復(fù)合物、微球和納米粒等。但脂質(zhì)體有細(xì)胞毒性，易泄露，體內(nèi)應(yīng)用有限；微球粒直徑較大，不適合血管給藥，適于作為肌肉注射免疫基因藥物和口服基因藥物的載體；復(fù)合物結(jié)構(gòu)松散、不穩(wěn)定。比較而言，殼聚糖納米粒是理想的體內(nèi)靶向基因遞送載體，應(yīng)用前景看好。我們選擇殼聚糖納米粒作為載體材料，制備殼聚糖納米粒并遞送人胰島素基因。
我們的轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到38.67％，由于國內(nèi)外均未見與本研究相同的研究，只能與國外的相關(guān)研究進(jìn)行近似比較，脂質(zhì)體法及電化學(xué)穿孔法轉(zhuǎn)染效率約為15～30％，病毒載體轉(zhuǎn)染效率為35～60％.
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和積極效果1、生物相容性好，無毒，來源經(jīng)濟(jì)；2、可控制轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞的攝取量；3、可抵抗各種補(bǔ)體以及酶的破壞，轉(zhuǎn)移效率高；4、可作為緩釋、控釋的骨架材料；5、容易操作。


圖1—殼聚糖納米粒制備流程圖。
其中1—殼聚糖；2—溶于醋酸；3—調(diào)節(jié)pH值；4—濾膜除菌；5—無菌純水稀釋；6—水浴；7—DNA溶液；8—溶于硫酸鈉溶液；
9—混合，渦流震蕩。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如分子克隆實驗指南(第三版)，D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2005；細(xì)胞實驗指南，呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982；或按照制造廠商所建議的條件。
制備方法最佳條件步驟1)①中，取殼聚糖1為0.1g；步驟1)②中，溶于1％的醋酸100mL；步驟1)③中，將氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至5.5；步驟1)⑤中，用無菌純化水稀釋至0.02％；步驟2)①中，取DNA溶液7為100mg/L DNA溶液100μL；步驟2)②中，加入30mmol/L的硫酸鈉溶液100μL中；步驟3)①中，各在55℃水浴加熱15min；步驟3)②中，渦流震蕩1min。
實施例1用殼聚糖納米粒制備非病毒型載體介導(dǎo)人胰島素基因的表達(dá)主要試劑E.Coli TOP10F’菌株購自美國Invitrogen公司；超純質(zhì)粒小量制備試劑盒及超純質(zhì)粒中量制備試劑盒均購自杭州V-Gene公司；NIH3T3細(xì)胞購自武漢大學(xué)典型作物保藏中心；6孔培養(yǎng)板購自丹麥Dunk公司；殼聚糖購自上海伯奧生物科技有限公司；卡那霉素、氨芐青霉素購自Promega公司；G418購自美國ALEXIS公司；玻璃奶快速DNA純化回收試劑盒購自上海博大生物工程公司；小牛血清及DMEM、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；鼠抗人胰島素抗體購自福建省福州市邁新公司；胰蛋白胨和酵母提取物購自美國Difco公司。
主要實驗方法1、感受態(tài)細(xì)菌制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(1)配制LB培養(yǎng)基取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加去離子水900ml，溶解后調(diào)PH值到7.0(5M NaOH)，定容到1L，高壓滅菌。
(2)取出-70℃保存的E.Coli TOP10F’菌種，用接種環(huán)挑取少量菌液在LB瓊脂板上劃線，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
(3)次日挑取單個菌落，接種于3ml不含抗生素LB培養(yǎng)基中，置37℃搖床280～300rpm振搖過夜；(4)第3日取上述菌液0.5ml接種于50ml LB培養(yǎng)基中，37℃搖床280～300rpm振搖至菌液OD值A(chǔ)600達(dá)到0.4～0.6時取出；(5)4℃5000rpm離心10min，棄上清，用20ml預(yù)冷CaCl2(0.1mol/L)重懸細(xì)菌，冰浴30min后4℃5000rpm離心10min，同樣棄上清，再用2ml預(yù)冷CaCl2(0.1mol/L)重懸細(xì)菌；(6)分別取pBAT16.hInsG1.M2質(zhì)粒、pCMV.eGFP質(zhì)粒各0.5μg，各加入200μl感受態(tài)細(xì)菌中，輕輕旋轉(zhuǎn)搖動，冰浴30min，42℃熱休克90sec，再冰浴2min，加入不含抗生素的LB培養(yǎng)基1ml，37℃搖床150～200rpm，緩慢搖動45min～1h；(7)將含pBAT16.hInsG1.M2質(zhì)粒的菌液100μl均勻涂布于含100μg/ml氨芐青霉素、1.5％瓊脂的LB固體培養(yǎng)平板上，含pCMV.eGFP質(zhì)粒的菌液100μl均勻涂布于含100μg/ml卡那霉素、1.5％瓊脂的LB固體培養(yǎng)平板上，室溫放置數(shù)分鐘，待接種物吸收后，置于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12h～16h，直至有菌落長出。
2、質(zhì)粒的鑒定(1)取含有pBAT16.hInsG1.M2質(zhì)粒的單菌落接種于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床280～300rpm振搖過夜至飽和狀態(tài)。
(2)取含pCMV.eGFP的單菌落接種于含100μg/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床280～300rpm振搖過夜至飽和狀態(tài)。
(3)用小量制備試劑盒制備各種質(zhì)粒。
(4)各種質(zhì)粒的鑒定。
酶切體系如下①pBAT16.hInsG1.M2 5μlBglII 0.5μl
Not I 0.5μl10×buffer 1μlH2O 3μl總體積 10μl②pCMV.eGFP 5μlBgl II 0.5μlNot I 0.5ul10×buffer 1μlH2O 3μl總體積 10μl每一種酶切體系37℃下反應(yīng)1小時。
瓊脂糖電泳消化完成后，加入1/6體積凝膠上樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)，40％甘油)，1.2％瓊脂糖凝膠電泳(50～100mA)1h～2h，然后在紫外燈下觀察結(jié)果。
3、重組質(zhì)粒pCMV.Ins的構(gòu)建(1)酶切產(chǎn)物的純化和回收在紫外燈下切取所需條帶，放入1.5ml Eppendorf管中。用DNA快速純化回收試劑盒回收DNA片段。步驟如下①在上述Eppendorf管中加入3倍膠條體積的溶膠液(約300μl)，室溫放置5min，其間輕搖Eppendorf管幾次，使膠完全熔化.
②加入混勻的玻璃奶10μl，輕輕顛倒混勻，置冰浴10min。間隔2～3分鐘輕輕顛倒混勻一次。12000rpm離心30sec，吸棄上清。
③加入新配制的漂洗液250μl(濃縮漂洗液使用前，與無水乙醇按3∶7比例配成工作濃度)，用加樣器吹打漂洗液，輕輕將玻璃奶懸浮混勻，12000rpm離心30sec，吸棄上清。
④用懸浮液250μl重復(fù)上述操作一次。吸取完漂洗液后再離心10sec，用Tip頭盡量吸盡管內(nèi)殘留液體。然后置37℃烘箱干燥15～20min，使沉淀干燥呈白色。
⑤加入洗脫緩沖液20μl，輕輕將玻璃奶吹散混勻，置60℃水浴5min。12000rpm離心1min，回收上清，即得到所需DNA片段的溶液。置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> (2)連接反應(yīng)連接反應(yīng)體系如下2×Rapid Buffer5.0μlDNA(Insulin) 1.25μlDNA(PCMV) 1.25μlT4 DNA Ligase(3U/μl) 1.0μlddH2O 1.5μl總體積 10μl混勻，置4℃冰箱連接過夜(14～16h)，最好連接48h。
(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒的鑒定制備含卡那霉素100μg/ml、1.5％瓊脂的LB培養(yǎng)基平板。取TOP10F′感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化，輕彈混勻，冰浴30min，42℃水浴熱休克90sec(勿振搖)，馬上置冰浴2min，然后加入LB培養(yǎng)液160μl，37℃，150rpm振蕩1.5h。取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有卡那霉素、1.5％瓊脂的的LB平板上，室溫放置數(shù)分鐘，待接種物吸收后，置于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12h～16h，直至有菌落長出。
取含有pCMV.Ins的單菌落接種于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床280～300rpm振搖過夜至飽和狀態(tài)。用小量制備試劑盒制備質(zhì)粒pCMV.Ins，將質(zhì)粒pCMV.Ins酶切鑒定。酶切體系如下pCMV.Ins 5 μlBgl II0.5μlNotI 0.5μl10×buffer1μlH2O 3μl總體積10μl37℃下反應(yīng)1小時瓊脂糖電泳消化完成后，加入1/6體積凝膠上樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)，40％甘油)，1.2％瓊脂糖凝膠電泳(50～100mA)1h～2h，然后在紫外燈下觀察結(jié)果。
4、中量制備超純質(zhì)粒(1)挑取酶切鑒定正確的陽性克隆單菌落，接種于5ml含100μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床280-300rpm振搖培養(yǎng)過夜，再將此菌液加入含40ml LB培養(yǎng)基(含100μg/ml卡那霉素)的1L燒瓶中，37℃搖床280-300rpm振搖培養(yǎng)至飽和狀態(tài)；(2)收集40ml在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的質(zhì)粒菌液?！?000×g離心8分鐘，棄上清，將離心管倒置紙巾上1分鐘，除盡上清。
(3)用4.5ml已加入RnaseA1的BufferS1充分懸浮細(xì)菌。
(4)加入4.5ml BufferS2，溫和但充分地上下反轉(zhuǎn)混合6～8次，此步驟不宜超過5分鐘。
(5)加入8ml預(yù)冷的BufferN，溫和并充分地上下旋轉(zhuǎn)10次。
(6)加入12ml 4℃預(yù)冷的BufferP1，溫和地上下翻轉(zhuǎn)10次，再稍用力上下混合數(shù)次使溶液形成混濁的乳濁液。4℃≥10000×g離心8分鐘。
(7)吸棄藍(lán)色上相，將下相轉(zhuǎn)入Filter中，將溶液推注過濾到50ml離心管，速度不宜太快。
(8)用力振搖裝有BufferB-R的試劑瓶，充分懸浮其中的Silica樹脂，加8ml BufferB-R到濾液中，混合均勻。
(9)吸取步驟8中的混合液轉(zhuǎn)移到DNA-Prep Tube中，插入注射器芯，垂直向下緩慢推注，以每秒約兩滴的流速排盡管中溶液。
(10)旋轉(zhuǎn)取下DNA-prepe Tube底部含Silica樹脂的純化柱，退出注射器芯，再將純化柱重新安裝到注射器上，加9ml BufferW1，插入注射器，垂直向下推注，排盡液體。
(11)以同樣方法，用9ml已加入無水乙醇的BufferW2洗滌DNA-prepe Tube。
(12)旋轉(zhuǎn)取下純化柱，置于隨試劑盒攜帶的Microfuge Tube中，12000×g離心1分鐘。
(13)將純化柱置于隨試劑盒攜帶的另一潔凈的1.5ml Microfuge Tube中，在Silica樹脂上加入500μl 0.25N NaAc，用Tip頭攪拌懸浮樹脂，室溫靜置1分鐘，12000×g離心1分鐘。
(14)棄純化柱，在洗脫的質(zhì)粒DNA中加入350μl異丙醇，混合均勻，12000×g離心10分鐘。
(15)仔細(xì)倒置1.5ml Microfuge Tube丟棄上清，加入500ul-20℃預(yù)冷的70％乙醇，12000×g離心2分鐘。
(16)仔細(xì)倒置1.5ml Microfuge Tube棄盡上清，倒置在紙巾上5分鐘，以便吸盡上清。(小心丟棄上清，以免丟失質(zhì)粒DNA沉淀)。
(17)加100μl去離子水或Eluent，旋渦振蕩以充分溶解DNA。
BufferS1細(xì)菌懸浮液BufferS2細(xì)菌裂解液BufferN 中和緩沖液BufferP1分相溶液BufferB-R DNA結(jié)合溶液BufferW1洗滌液BufferW2洗滌液，使用前加無水乙醇0.25N NaAc 洗脫溶液Eluent 2.5mlTris-HCl，PH8.55、殼聚糖納米粒的制備將純化的殼聚糖輕微加熱溶于1％的乙酸，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的PH值到5.5。溶液最終含殼聚糖納米粒為0.02％(W/V)、乙酸5mmol/L。使用前通過0.22μm無菌過濾口。
6、NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染(1)配制含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，56℃滅活FBS30min，取DMEM粉劑以去離子水溶解后，加入NaHCO33.7g至90ml，并加入1N稀鹽酸將DMEM PH值調(diào)至6.8，加FBS至濃度為10％，過濾除菌。
(2)NIH3T3細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代取液氮凍存的NIH3T3細(xì)胞一管，置37℃快速融化，接種于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長成均勻單層細(xì)胞并達(dá)90％以上聚集度時傳代。吸出培養(yǎng)基，加入0.25％胰蛋白酶，室溫下短暫消化，置于顯微鏡下觀察至細(xì)胞皺縮、變圓時，立即吸棄胰蛋白酶，加入含10％FBS的培養(yǎng)基，反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液后，按1∶3比例分瓶傳代。
(3)NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)到90％以上聚集度時，傳入1個35mm六孔培養(yǎng)板中，37℃，5％CO2培養(yǎng)，每孔加入1mm厚的蓋玻片(經(jīng)121℃、高壓滅菌20分鐘)1張，待細(xì)胞生長到60％-70％聚集度時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
(4)將10μl的0.02％殼聚糖納米粒溶液，分別與溶于25mmol/L的硫酸鈉溶液中的pCMV.eGFP和pCMV.Ins質(zhì)粒，各在55℃水浴加熱15min，迅速混合，渦流震蕩1min后，逐滴加入孔中，滴加同時震動、混勻混合液，將其分為未轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組和胰島素基因轉(zhuǎn)染組，37℃，5％的CO2培養(yǎng)至72h。
(5)G418溶液的配制將100mgG418粉劑溶于無菌去離子水中，終體積為10ml，過濾除菌。
(6)G418篩選陽性細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)染后72h，取出蓋玻片，除第一孔外，各孔加G418(終濃度為700μg/ml)，每日在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，且每72h更換一次培養(yǎng)基(含10％FBS的DMEM)和G418(終濃度為700μg/ml)，兩周后將G418改為終濃度400μg/ml維持，每72h更換一次培養(yǎng)基(含10％FBS的DMEM)和G418(終濃度為400μg/ml)，篩選后第6d，各孔出現(xiàn)不同的細(xì)胞生長情況。轉(zhuǎn)染后4w，將篩選出的陽性細(xì)胞克隆分別轉(zhuǎn)移至兩個50ml培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
7、細(xì)胞樣品的收集和檢測(1)轉(zhuǎn)染后72h，取出各孔中的蓋玻片，用無菌PBS溶液簡單沖洗，滴加1％中性福爾馬林固定10min后，用PH7.4的PBS溶液簡單沖洗3次，每次3min，用濾紙輕輕吸去PBS液，每張蓋玻片加50μl的過氧化酶溶液，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10min。
(2)PBS(PH7.4)沖洗(3次×3min)。
(3)甩去PBS液，每張蓋玻片加50μl的非免疫性動物血清，室溫下孵育10min。
(4)甩去血清，每張蓋玻片加50μl的鼠抗人胰島素抗體，放置于4℃過夜。
(5)PBS沖洗3次×5min。
(6)甩去PBS液，每張蓋玻片加50μl生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育10min。
(7)PBS沖洗3次×3min。
(8)甩去PBS液，每張蓋玻片加50μl鏈親和素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10min。
(9)PBS沖洗3次×3min。
(10)甩去PBS液，每張蓋玻片加100μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3-10min。
(11)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。
(12)蓋玻片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察。8.細(xì)胞培養(yǎng)液的收集轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后，每隔3d，每孔取培養(yǎng)液各1ml，至轉(zhuǎn)染后第24d，共38份，放置于-20℃冰箱保存，待38份收集滿后，同時測定38份標(biāo)本的胰島素水平，操作步驟如下①按標(biāo)本數(shù)用無菌去離子水以1∶25比例將清洗濃縮液稀釋，室溫保存。
②用前按標(biāo)本數(shù)用酶結(jié)合物稀釋液以1∶50比例將抗生蛋白鏈菌素-酶結(jié)合物濃縮液稀釋。
③用前所有試劑室溫平衡并混勻，將微孔標(biāo)記待用，在相應(yīng)孔中加入25μl的標(biāo)準(zhǔn)品A及C-F、質(zhì)控品和樣本。
④準(zhǔn)備抗體-酶結(jié)合物溶液。
⑤用移液器將100μl的酶結(jié)合物溶液加入到每個孔中，室溫25℃左右將反應(yīng)板在設(shè)置為500-700轉(zhuǎn)/分的振蕩器上振蕩60min。
⑥控干，每次取0.35ml洗液清洗酶標(biāo)反應(yīng)板5次，扣干。
⑦用加樣器向每個孔中加入100μl TMB顯色液。
⑧室溫25℃將酶標(biāo)孔在設(shè)置為500-700rpm的振蕩器上振蕩10min。注意避光。
⑨取100μl的終止液加入所有微孔。
⑩在450nm波長讀取吸光度。使用對數(shù)-對數(shù)坐標(biāo)紙，吸光度讀數(shù)為縱軸，濃度為橫軸。
實施例2 用殼聚糖納米粒制備非病毒型載體介導(dǎo)人胰島素基因的表達(dá)1、表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、增殖將編碼人胰島素的cDNA片段用Bgl II/NotI從PBAT16，hlnsG1.M2切下，以粘末端插入表達(dá)載體pCMV，轉(zhuǎn)化TOPI0F/菌株(Invitrogen公司產(chǎn)品)，篩選重組子，重組質(zhì)粒標(biāo)記為pCMV.Ins。將pCMV和pCMV.Ins質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌Top10F′并增殖。
2、質(zhì)粒提取、純化pCMV和pCMV.Ins質(zhì)粒用堿裂解法大量制備，并用聚乙二醇沉淀法純化。
3.殼聚糖納米粒載體的制備將殼聚糖(上海伯奧生物科技有限公司純化后輕微加熱溶于1％的乙酸，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值到5.5。溶液最終含殼聚糖納米粒為0.02％(W/V)，乙酸5mmol/L。使用前通過0.22μm無菌過濾口。將殼聚糖納米粒分別與溶于25mmol/L的硫酸鈉溶液中的pCMV.eGFP和pCMV.Ins質(zhì)粒，各在55℃水浴加熱1min，迅速混合，渦流震蕩1min。
4、動物模型選用180～220g的健康雄性Wistar大鼠30只，，隨意飲水，將大鼠禁食10h，用鏈脲佐菌素(Sigma公司)溶于0.1mol/L檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(PH4.4)，配成1％的溶液，按60mg/kg體重單次腹腔注射，3d后取尾靜脈血，用OneTouch(Lifescan)血糖儀測定血糖，血糖≥16.7mmol/L為糖尿病大鼠，共成模27只。
5、體內(nèi)轉(zhuǎn)染27只糖尿病大鼠隨機(jī)分為3組(1)人胰島素基因轉(zhuǎn)移組(9只)，(2)質(zhì)粒pCMV對照組(9只)(3)生理鹽水對照組(9只)。將殼聚糖納米粒載體與pCMV.Ins或pCMV質(zhì)粒形成的復(fù)合物按照每只大鼠100μg質(zhì)粒的劑量，通過尾靜脈注射糖尿病大鼠，對照采用生理鹽水注射，分別于轉(zhuǎn)染4、8、12、16、20、24、28d測定體重及剪尾取血測血糖，第8d靜脈取血測空腹胰島素(放射性免疫測定試劑盒北京北方生物技術(shù)研究所)。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于包括下列步驟1)殼聚糖處理①取殼聚糖(1)取殼聚糖(1)為0.05～0.15g；②溶于醋酸(2)將上述步驟①的殼聚糖溶于0.5～1.5％的醋酸100mL，攪拌至全部溶解；③調(diào)節(jié)pH值(3)將氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至5.0～6.0；④濾膜除菌(4)用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，4℃儲存?zhèn)溆?；⑤無菌純化水稀釋(5)臨用前用無菌純化水稀釋至0.01～0.03％，溶液最終含殼聚糖納米粒為0.01～0.03％(W/V)、乙酸4～6mmol/L；2)DNA溶液處理①取DNA溶液(7)取DNA溶液(7)為50～150mg/L DNA溶液100μL；②溶于硫酸鈉溶液(8)將上述步驟①的溶液加入20～40mmol/L的硫酸鈉溶液100μL中，共200μL；3)水浴、混合①水浴(6)將上述無菌純化水稀釋至0.01-0.03％的殼聚糖納米粒溶液200μL和上述DNA硫酸鈉溶液200μL，各在50-60℃水浴加熱12～18min；②混合，渦流震蕩(9)將上述步驟①的溶液迅速混合，渦流震蕩0.8～1.2min，反應(yīng)終體積≤500μL；③制備完后，于室溫下靜置2h，分裝，冷凍抽干備用；上述百分比是質(zhì)量百分比。
2.按權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于步驟1)①中，取殼聚糖(1)為0.1g；步驟1)②中，溶于1％的醋酸100mL；步驟1)③中，將氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至5.5；步驟1)⑤中，用無菌純化水稀釋至0.02％；步驟2)①中，取DNA溶液(7)為100mg/L DNA溶液100μL；步驟2)②中，加入30mmol/L的硫酸鈉溶液100μL中；步驟3)①中，各在55℃水浴加熱15min；步驟3)②中，渦流震蕩1min。
3.一種殼聚糖納米粒的應(yīng)用，其特征在于殼聚糖納米粒能攜帶多種目的基因，尤其適合用于糖尿病基因治療載體的制備。
4.按權(quán)利要求3所述的一種殼聚糖納米粒的應(yīng)用，其特征在于用殼聚糖納米粒制備非病毒型載體介導(dǎo)人胰島素基因的表達(dá)。
5.按權(quán)利要求3所述的一種殼聚糖納米粒的應(yīng)用，其特征在于用殼聚糖納米粒制備非病毒型載體介導(dǎo)人胰島素基因的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殼聚糖納米粒的制備方法和應(yīng)用，涉及一種非病毒基因轉(zhuǎn)移載體——殼聚糖納米粒。制備方法包括1)殼聚糖處理取殼聚糖；溶于醋酸；調(diào)節(jié)pH值；濾膜除菌；無菌純化水稀釋；2)DNA溶液處理取DNA溶液為50～150mg/LDNA溶液100μL；溶于硫酸鈉溶液；3)水浴、混合水?。换旌?，渦流震蕩；制備完后，于室溫下靜置2h，分裝，冷凍抽干備用。殼聚糖納米粒能攜帶多種目的基因，尤其適合用于糖尿病基因治療載體的制備。本發(fā)明生物相容性好，無毒，來源經(jīng)濟(jì)；可控制轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞的攝取量；可抵抗各種補(bǔ)體以及酶的破壞，轉(zhuǎn)移效率高；可作為緩釋、控釋的骨架材料；容易操作。
文檔編號A61K47/36GK1986608SQ20061012549
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月18日
發(fā)明者徐焱成, 朱宜蓮, 孫家忠, 牛力 申請人:武漢大學(xué)