專利名稱：一種與TNF－α表達(dá)相關(guān)的蛋白及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白及其編碼基因。
背景技術(shù)：
TNF在一個(gè)世紀(jì)以前就以具有抗腫瘤活性而被報(bào)道，所以被稱為腫瘤壞死因子，但直到1984年才克隆和重組出了人的TNF-α(Sugarman B.J.et al.，1985，Science，230943-945)，自此之后有關(guān)TNF-α及其受體的研究迅速發(fā)展。研究者發(fā)現(xiàn)，TNF-α不僅引起特定腫瘤細(xì)胞的凋亡，而且介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫功能。TNF的異常表達(dá)或持續(xù)激活是許多人類疾病病理過程中的重要標(biāo)志，包括膿血癥、糖尿病、慢性腎炎、心血管疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松、移植排異反應(yīng)以及各種自身免疫性疾病(Hotamisligil G.S.et al，1993，Science，25987-91；Chen G.and Goeddel D，2002，Science；)。因此，目前TNF-α更多的是以炎性細(xì)胞因子而被備受關(guān)注(EugeneE.et al.，2004，Cell，116491-497)。也由此，多種基于TNF的抑止劑或抗炎藥物應(yīng)運(yùn)而生(He，et al.Science，2005，3101022-1025；Christopher.A.et al.，2006Nature Reviews Drug Di scovery，5864-876)。
腎臟是人體中一個(gè)很重要的調(diào)節(jié)器官，它能夠分泌腎臟激素，比如腎素、紅細(xì)胞生成素、鈣調(diào)素、前列腺素等。2005年研究者在人的腎臟中發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白，即renalase蛋白，它是由腎臟分泌的依賴于FAD的單胺氧化酶，在血液中循環(huán)。進(jìn)一步研究結(jié)果表明renalase具有調(diào)節(jié)心臟功能和血壓的作用，被認(rèn)為是目前有望用于臨床上的一個(gè)很有前途的藥物。雖然該蛋白由腎臟分泌，但在晚期腎臟病人的血液中該蛋白的含量明顯減少(Xu，J，2005，The Journal of Clinical Investigation，115，51275-1280；Friedrich C.，2005，Cell Metabolism 1，6358-60)。同源性以及結(jié)構(gòu)分析表明renalase是一個(gè)新型的依賴于FAD的氨基氧化酶，與已知的單胺氧化酶(MAO-A和MAO-B)僅有很少的氨基酸相似性，并且具有不同的特異性底物和拮抗劑。MAO-A和MAO-B都是線粒體酶，通過C端錨定在線粒體的外膜上，主要代謝細(xì)胞內(nèi)的兒茶酚胺，而renalase則是由腎臟分泌入血液，在血液中循環(huán)，調(diào)節(jié)體內(nèi)兒茶酚胺的代謝，從而調(diào)節(jié)人體的心臟功能和血壓。
體外研究結(jié)果表明，人源renalase代謝多巴胺的能力很強(qiáng)，其次是腎上腺素和去甲腎上腺素。用提純的大腸桿菌表達(dá)的人源renalase蛋白注射大鼠后，發(fā)現(xiàn)大鼠的心肌收縮能力、心率和血壓都明顯下降。又由于renalase是分泌性蛋白，在血液中可以檢測到其活性，是血液中自然存在的一種蛋白(Xu，J，2005，The Journal ofClinical Investigation，115，51275-1280)，預(yù)示著renalase在臨床上將有廣闊的應(yīng)用前景，對腎病及心血管疾病的治療將產(chǎn)生巨大的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)相關(guān)的蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白，命名為mMAO-C，來源于小鼠屬小家鼠(Mus musculus)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與TNF-α表達(dá)相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的序列2由342個(gè)氨基酸殘基組成。自序列2的氨基端第1-17位氨基酸殘基為信號肽序列，自序列2的氨基端第1-172位氨基酸殘基為FAD結(jié)合區(qū)，自序列2的氨基端第3-332位氨基酸殘基為氨基氧化酶(Amino oxidase)結(jié)構(gòu)域。
為了使(a)中的mMAO-C便于純化和檢測，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
表1.標(biāo)簽的序列

上述(b)中的mMAO-C可人工合成，也可先合成其編碼基因，再按照下述方法進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的mMAO-C的編碼基因可通過將序列表中序列1的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
上述與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白編碼基因(mMAO-C)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白編碼基因，其核苷酸序列優(yōu)選為編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
所述與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白編碼基因的編碼序列(ORF)為序列表中序列1的自5′端第第1-1029位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。
所述與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白的cDNA基因，具體可為如下1)或2)的基因1)序列表中序列1的DNA序列；2)在嚴(yán)格條件下與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述嚴(yán)格條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。
序列表中序列1是由1038個(gè)脫氧核苷酸組成，自5′端第1-1029位核苷酸序列為編碼序列，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
mMAO-C的基因組序列位于小鼠的19號染色體上(19C1，33.2M-33.9M)，其基因組序列號為NW_000143或NT_039687或NW_001030643，編碼區(qū)有7個(gè)外顯子，編碼342aa，與人源MAO-C基因的編碼區(qū)及其蛋白序列的同源性分別為81.7％和72.2％。其編碼區(qū)的7個(gè)外顯子包含了254,518bp，在基因組Contig(NT_039687)上的位置分別是331910-331792(外顯子1)、331025-330918(外顯子2)、329897-329752(外顯子3)、322246-322205(外顯子4)、142486-142313(外顯子5)、108337-108158(外顯子6)、78115-77952(外顯子7)。
含有上述基因的重組表達(dá)載體、工程菌和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明(a)或(b)的mMAO-C可經(jīng)大腸桿菌及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，如將(a)或(b)的mMAO-C的編碼序列克隆至原核表達(dá)載體上，通過轉(zhuǎn)入大腸桿菌株表達(dá)；將(a)或(b)的mMAO-C的編碼序列構(gòu)建到真核表達(dá)載體上，通過轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。
生物信息學(xué)分析結(jié)果表明MAO-C廣泛存在于高等動(dòng)物中，具有高度的同源性，說明在進(jìn)化上是一個(gè)高度保守的基因，且多數(shù)蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列含有信號肽。組織分布研究結(jié)果表明mMAO-C基因在小鼠不同組織中的表達(dá)分布具有明顯的差異，該基因在腎臟和睪丸中有大量表達(dá)，在心臟、腦、肝、胚胎中等組織也有一定量的表達(dá)。本發(fā)明的小鼠mMAO-C在腎和睪丸中高表達(dá)，可望在解析生殖機(jī)理以及促進(jìn)或抑制精子形成的藥物中得到應(yīng)用。本發(fā)明的mMAO-C可以通過注射腎病模型小鼠，檢測mMAO-C作為藥物的效果，還可以用于構(gòu)建小鼠研究模型，作為MAO-C作用機(jī)理研究以及潛在的臨床應(yīng)用前的實(shí)驗(yàn)平臺。由于mMAO-C具有在睪丸中大量表達(dá)的特性，預(yù)示著該基因可能在解析生殖機(jī)理以及促進(jìn)或抑制精子形成的藥物中得到應(yīng)用。本發(fā)明的mMAO-C為抗體的制備、蛋白的相互作用以及基因調(diào)控機(jī)理等方面的研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為在臨床上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。本發(fā)明中另外一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)是mMAO-C具有顯著抑制胚腎細(xì)胞293T中內(nèi)源性炎癥因子TNF-α表達(dá)的功能，這是mMAO-C在作用機(jī)理研究方面的首次證據(jù)和重要突破。說明MAO-C蛋白可以通過抑制TNF-α的表達(dá)從而提高腎臟抗炎癥的能力，預(yù)示著MAO-C蛋白在腎炎治療方面將發(fā)揮重要的作用。


圖1為本發(fā)明mMAO-C的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果及克隆到pCDNA3.1載體上的酶切鑒定結(jié)果。
圖2為本發(fā)明mMAO-C染色體定位及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
圖3為本發(fā)明mMAO-C與其它物種MAO-C家族成員的進(jìn)化樹比較。
圖4為本發(fā)明mMAO-C與GST融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)圖，L-MAO-C表示帶有信號肽的mMAO-C，S-mMAO-C表示沒有信號肽的mMAO-C。
圖5為本發(fā)明mMAO-C的RT-PCR組織分布檢測結(jié)果。
圖6為本發(fā)明mMAO-C基因與GFP融合蛋白在胚腎細(xì)胞293T中的表達(dá)圖。
圖7為本發(fā)明mMAO-C基因過量表達(dá)對胚腎細(xì)胞293T中TNF-α表達(dá)的影響。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、mMAO-C基因的獲得通過NCBI BLASTn工具(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)以人源基因序列(BC005364.1)為模板，BLAST得到有較高同源性的小鼠cDNA序列片段，再利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網(wǎng)站以及Bioedit等生物學(xué)軟件進(jìn)行基因信息分析。搜索得到的具有較高同源性的小鼠cDNA序列片段。與其他物種蛋白序列比較具有很高的同源性，但在N端缺均少一段肽段。根據(jù)序列的比對結(jié)果，選擇了小鼠的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1(XM_619582.2)為參考序列，依據(jù)其他物種的保守閱讀框架，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上游引物為JF1M5’CG AGA ATT CAG ATGTCC CGG GTA CTG GTC G 3(帶下劃線的序列為EcoRI識別位點(diǎn))，下游引物為JR15’CCGCTC GAGCAC AGA CAC TAA ATA TAA CGC 3’(帶下劃線的序列為XhoI識別位點(diǎn))。以提取的昆明小鼠(北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)腎臟總RNA為模板，用TaKaRa公司的One Step RNA PCR Kit(AMV)擴(kuò)增目的片段。PCR擴(kuò)增條件為先94℃ 4min；然后94℃ 45sec，65℃ 45sec，72℃ 50sec，30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到了特異性的1038bp片段(圖1中A，1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為RT-PCR產(chǎn)物)。將該片段克隆到pGEM-T-Easy(PromegaCorporation)載體上，經(jīng)酶切鑒定后進(jìn)行測序。三個(gè)樣品重復(fù)測序。測序結(jié)果表明，此序列具有一個(gè)與其他物種MAO-C基因相似的閱讀框架，編碼序列為1029bp，編碼342個(gè)氨基酸殘基(序列表中的序列2)，與人源MAO-C基因的編碼區(qū)及其蛋白序列的同源性分別為81.7％和72.2％。經(jīng)預(yù)測(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)，自序列2的氨基端第1-17位氨基酸殘基為信號肽序列，第1-172位氨基酸殘基為FAD結(jié)合區(qū)，第3-332位氨基酸殘基為氨基氧化酶(Amino oxidase)結(jié)構(gòu)域(圖2)。預(yù)測的等電點(diǎn)為7.93，分子量為37.6kDa(http://cn.expasy.org/cgi-bin/pi_tool).
mMAO-C的cDNA基因的序列是序列表中的序列1。
mMAO-C的基因組序列位于小鼠的19號染色體上(19C1，33.2M-33.9M)，其基因組序列號為NW_000143或NT_039687或NW_001030643，編碼區(qū)有7個(gè)外顯子，編碼342aa，與人源MAO-C基因的編碼區(qū)及其蛋白序列的同源性分別為81.7％和72.2％(圖3)。其編碼區(qū)的7個(gè)外顯子包含了254,518bp，在基因組Contig(NT_039687)上的位置分別是331910-331792(外顯子1)、331025-330918(外顯子2)、329897-329752(外顯子3)、322246-322205(外顯子4)、142486-142313(外顯子5)、108337-108158(外顯子6)、78115-77952(外顯子7)。
用小鼠和人的MAO-C BLAST NCBI GenBank，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAO-C廣泛存在于不同動(dòng)物物種中，MAO-C在不同物種之間存在很高的同源性，符合進(jìn)化上的分類關(guān)系。
實(shí)施例2、mMAO-C基因在大腸桿菌中的表達(dá)按照實(shí)施例1的方法獲得小鼠的mMAO-C基因(含有信號肽及不含有信號肽的編碼序列的核苷酸片段)，經(jīng)瓊脂糖凝電泳分別純化后，再用EcoR I和Xho I雙酶切并經(jīng)凝膠回收目的片段，以T4DNA連接酶連接到經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切的pGEX-4T-2(Amersham Pharmacia)上，經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切鑒定得到構(gòu)建正確的含有信號肽的重組載體pGEX-4T-2-mMAO-C(自序列1的5′端第1-1037位核苷酸序列)和不含有信號肽的編碼序列片段(自序列1的5′端第127-1037位核苷酸序列)重組載體pGEX-4T-2-ΔmMAO-C。將pGEX-4T-2-mMAO-C和pGEX-4T-2-ΔmMAO-C分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，氨芐青霉素(50μg/mL)篩選陽性克隆。再將pGEX-4T-2-mMAO-C和pGEX-4T-2-ΔmMAO-C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，37℃過夜培養(yǎng)，然后以1∶100的體積比接種于6ml含有氨芐青霉素(50μg/mL)的LB試管中，培養(yǎng)至OD600＝0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.1mM，37℃振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后分別取200μl和100μl菌液，離心后去除上清，加入50μl去離子水和50μl 2倍的蛋白上樣緩沖夜，取25μl混合液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明表達(dá)出了正確的GST-mMAO-C和GST-ΔmMAO-C融合蛋白，大小分別約為64kDa和60kDa。圖4中泳道2和3的L-mMAO-C是指帶有信號肽的GST-mMAO-C融合蛋白，包括IPTG誘導(dǎo)前(泳道2)和誘導(dǎo)后(泳道3)的表達(dá)產(chǎn)物。泳道5和6的S-mMAO-C是指不帶有信號肽的GST-ΔmMAO-C融合蛋白，包括IPTG誘導(dǎo)前(泳道5)和誘導(dǎo)后(泳道6)的表達(dá)產(chǎn)物。
實(shí)施例3、mMAO-C在小鼠組織中的表達(dá)分布將小鼠(同實(shí)施例1)處死后，迅速取出其不同組織，將這些組織以及12.5天的小鼠(同實(shí)施例1)整胚胎分別在液氮中研磨，至粉末狀后，按照Trizol(Invitrogen)試劑使用說明書的操作方法提取組織總RNA，用分光光度計(jì)測定RNA的濃度，1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。以相同量的小鼠不同組織總RNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR，結(jié)果如圖5所示，表明mMAO-C基因在小鼠的腎臟和睪丸中表達(dá)量最大，在小鼠心和肝以及胚胎中也有一定的表達(dá)，說明該基因從小鼠胚胎期到成年期均有表達(dá)，是一個(gè)在生殖與發(fā)育中具有重要作用的基因。
實(shí)施例4、mMAO-C基因在293T真核細(xì)胞中的表達(dá)將mMAO-C含有信號肽的全蛋白編碼序列(自序列1的5′端第1-1037位核苷酸序列)從pGEX-4T-2-mMAO-C上經(jīng)EcoRI和XhoI酶切和凝膠純化后，克隆到經(jīng)EcoRI和SalI兩種酶處理過的pEGFP-N1載體上(BD Biosciences Clontech)，用EcoRI和BamHI進(jìn)行酶切鑒定，構(gòu)建成含有信號肽的編碼序列片段的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-mMAO-C質(zhì)粒，然后將pEGFP-N1-mMAO-C質(zhì)粒按照常規(guī)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲細(xì)胞后裂解，離心后的上清液用以兔GFP抗體為一抗(Santa Cruz)進(jìn)行Western Blot檢測，結(jié)果如圖6所示，獲得了正確的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，箭頭示GFP以及GFP與mMAO-C的融合蛋白GFP-mMAO-C。泳道1是以GFP抗體為第一抗體的與GFP蛋白的雜交結(jié)果，泳道2是以GFP抗體為第一抗體的與GFP-mMAO-C融合蛋白雜交的結(jié)果。圖6結(jié)果還進(jìn)一步表明細(xì)胞質(zhì)裂解物中有大量的GFP蛋白表達(dá)，這與以往的報(bào)道相一致，因?yàn)镚FP蛋白是定位在細(xì)胞質(zhì)中，是非分泌性的，而當(dāng)與帶有信號肽的mMAO-C蛋白構(gòu)建成融合蛋白后，細(xì)胞質(zhì)裂解物中檢測到的GFP融合蛋白的量明顯降低，說明已有部分蛋白質(zhì)分泌出細(xì)胞外。
實(shí)施例5、mMAO-C基因過量表達(dá)對胚腎細(xì)胞293T中TNF-α表達(dá)的影響。
將mMAO-C含有信號肽的全蛋白編碼序列(自序列1的5′端第1-1037位核苷酸序列)經(jīng)EcoRI和XhoI酶切和凝膠純化后，克隆到pcDNA3.1-Myc(+)載體(Invitrogen)的EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)間，用EcoRI和XhoI進(jìn)行酶切鑒定(圖1中B)，構(gòu)建成重組的pcDNA3.1-Myc-mMAO-C質(zhì)粒(含有信號肽的編碼序列片段)，然后分別將pcDNA3.1-Myc(+)(對照組)和pcDNA3.1-Myc-mMAO-C質(zhì)粒按照常規(guī)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后12小時(shí)進(jìn)行LPS(脂多糖內(nèi)毒素，30μg/ml)處理，12小時(shí)后收集細(xì)胞，并裂解，離心后的上清液分別以兔TNF-α和β-actin抗體為一抗(Santa Cruz)進(jìn)行Western Blot檢測，結(jié)果如圖7所示。圖7中，泳道1和2為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myc(+)空質(zhì)粒的293T細(xì)胞(作為對照)，泳道3和4為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myc-mMAO-C質(zhì)粒的293T細(xì)胞，其中泳道2和4進(jìn)行LPS處理。上圖是以TNF-α抗體為第一抗體的雜交結(jié)果，下圖是以β-actin抗體為第一抗體的雜交結(jié)果，作為上樣量的對照。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染含有mMAO-C基因的293T細(xì)胞中內(nèi)源TNF-α的表達(dá)明顯減少，說明mMAO-C表達(dá)產(chǎn)物具有抑制內(nèi)源性炎癥因子TNF-α蛋白表達(dá)的功能，這是一個(gè)非常重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)門NF-α在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫功能方面起著重要作用，TNF-α的異常表達(dá)與很多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在LPS處理轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的293T細(xì)胞時(shí)，同一組內(nèi)TNF-α的表達(dá)沒有變化，說明293T細(xì)胞對LPS不應(yīng)答，這與以往的報(bào)道是一致的。
序列表<160>2<210>1<211>1038<212>DNA<213>小鼠屬小家鼠(Mus musculus)<400>1atgtcccggg tactggtcgt gggcgctggg ctaaccggaa gtctgtgtgc cgcgctgctg 60aggaaggaaa taaccgcccc cctgtacctc gccctgtggg acaaggctgg ggatataggg 120ggaagaatga ttactgccag cagtcctcat aatccccgat gcacagctga cttgggagct 180cagtacatca cctgctctcc tcattatgtc aaagagcacc aaaattttta tgaggaactg 240ttagctcatg gaattttgaa gcctctgaca tcccccattg aaggaatgaa agggaaggaa 300ggagattgca actttgtggc acctcaagga ttttcttcag ttatcaagta ctacttgaaa 360aagtcaggtg cagaagtctc cctcaagcac tgtgtgactc agatccacct gaaagataac 420aagtgggaag tctccacaga cactggctct gctgagcagt ttgaccttgt catcctcacc 480atgccagctc ctcagattct ggaacttcaa ggtgacattg tgaacttaat tagtgaacgc 540cagagggagc aactgaaatc tgtgagctac tcctctcgct atgctctggg cctcttttat 600gaagtaggca tgaagattgg tgtcccttgg tcctgccgct acctcagcag tcacccctgc 660atatgcttca tctccattga taataagaag cgcaatatag agtcatcaga atgtggtcca 720tccgtggtga tccaaaccac tgtcccattt ggagttcaac acttggaggc cagtgaggcg 780gatgtgcaga agttaatgat ccagcaattg gaaaccattc tgccgggttt gcctcagcca 840gttgctacca tatgccataa atggacatat tcacaggtta caagctcagt ttccgacaga 900cctggtcaga tgactcttca tctcaagcct ttcctggtgt gcggagggga tggatttact 960cactccaact tcaatggctg catctcctct gccctgagtg tcatgaaagt tttaaagcgt1020tatatttagt gtctgtgc 1038<210>2<211>342<212>PRT<213>小鼠屬小家鼠(Mus musculus)
<400>2Met Ser Arg Val Leu Val Val Gly Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Cys1 5 10 15Ala Ala Leu Leu Arg Lys Glu Ile Thr Ala Pro Leu Tyr Leu Ala Leu20 25 30Trp Asp Lys Ala Gly Asp Ile Gly Gly Arg Met Ile Thr Ala Ser Ser35 40 45Pro His Asn Pro Arg Cys Thr Ala Asp Leu Gly Ala Gln Tyr Ile Thr50 55 60Cys Ser Pro His Tyr Val Lys Glu His Gln Asn Phe Tyr Glu Glu Leu65 70 75 80Leu Ala His Gly Ile Leu Lys Pro Leu Thr Ser Pro Ile Glu Gly Met85 90 95Lys Gly Lys Glu Gly Asp Cys Asn Phe Val Ala Pro Gln Gly Phe Ser100 105 110Ser Val Ile Lys Tyr Tyr Leu Lys Lys Ser Gly Ala Glu Val Ser Leu115 120 125
Lys His Cys Val Thr Gln Ile His Leu Lys Asp Asn Lys Trp Glu Val130 135 140Ser Thr Asp Thr Gly Ser Ala Glu Gln Phe Asp Leu Val Ile Leu Thr145 150 155 160Met Pro Ala Pro Gln Ile Leu Glu Leu Gln Gly Asp Ile Val Asn Leu165 170 175Ile Ser Glu Arg Gln Arg Glu Gln Leu Lys Ser Val Ser Tyr Ser Ser180 185 190Arg Tyr Ala Leu Gly Leu Phe Tyr Glu Val Gly Met Lys Ile Gly Val195 200 205Pro Trp Ser Cys Arg Tyr Leu Ser Ser His Pro Cys Ile Cys Phe Ile210 215 220Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile Glu Ser Ser Glu Cys Gly Pro225 230 235 240Ser Val Val Ile Gln Thr Thr Val Pro Phe Gly Val Gln His Leu Glu245 250 255
Ala Ser Glu Ala Asp Val Gln Lys Leu Met Ile Gln Gln Leu Glu Thr260 265 270Ile Leu Pro Gly Leu Pro Gln Pro Val Ala Thr Ile Cys His Lys Trp275 280 285Thr Tyr Ser Gln Val Thr Ser Ser Val Ser Asp Arg Pro Gly Gln Met290 295 300Thr Leu His Leu Lys Pro Phe Leu Val Cys Gly Gly Asp Gly Phe Thr305 310 315 320His Ser Asn Phe Asn Gly Cys Ile Ser Ser Ala Leu Ser Val Met Lys325 330 335Val Leu Lys Arg Tyr Ile340
權(quán)利要求
1.一種與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與TNF-α表達(dá)相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白的編碼基因，其特征在于所述與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白編碼基因，其核苷酸序列為編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白的編碼基因，其特征在于所述與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白編碼基因的編碼序列為序列表中序列1的自5′端第1-1029位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白的編碼基因，其特征在于所述與TNF-α表達(dá)相關(guān)的蛋白的cDNA基因，為如下1)或2)的基因1)序列表中序列1的DNA序列；2)在嚴(yán)格條件下與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求2-5中任一所述基因的重組表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求2-5中任一所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和工程菌。
8.權(quán)利要求2-5中任一所述的基因在篩選和/或制備促進(jìn)或抑制精子形成的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2-5中任一所述的基因在建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型和/或藥物篩選模型中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2-5中任一所述的基因在篩選和/或制備抗腎臟炎癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與TNF－α表達(dá)相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該與TNF－α表達(dá)相關(guān)的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與TNF－α表達(dá)相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。該與TNF－α表達(dá)相關(guān)的蛋白的編碼基因可用于篩選和/或制備促進(jìn)或抑制精子形成的藥物、篩選和/或制備抗腎臟炎癥的藥物以及用于建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型和/或藥物篩選模型。
文檔編號A61P15/00GK1986568SQ20061016545
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月20日
發(fā)明者張淑平, 王建, 戚少玲, 王甫, 李英姿 申請人:清華大學(xué)