本發(fā)明屬于重組生物技術(shù)領(lǐng)域，特別屬于蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域。本發(fā)明一般涉及一種從宿主細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)蛋白(POI)的方法。本發(fā)明特別涉及改善宿主細(xì)胞表達(dá)和/或分泌目標(biāo)蛋白的能力，和宿主細(xì)胞在蛋白質(zhì)表達(dá)中的用途。本發(fā)明還涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，更具體地涉及培養(yǎng)細(xì)胞以生產(chǎn)用于醫(yī)學(xué)目的或食品的所需分子。

背景技術(shù)：

已經(jīng)采用原核和真核宿主完成了目標(biāo)蛋白(POI)的成功生產(chǎn)。最突出的實(shí)例是如大腸桿菌(Escherichia coli)的細(xì)菌，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)或多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)的酵母菌，如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或里氏木霉(Trichoderma reesei)的絲狀真菌，或如CHO細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。雖然一些蛋白質(zhì)的產(chǎn)量容易以高效率實(shí)現(xiàn)，但是很多其它蛋白質(zhì)僅以相對(duì)低的水平生產(chǎn)。

為了提高重組蛋白的分泌，一種策略是針對(duì)涉及蛋白質(zhì)折疊和加工的宿主分泌途徑。

在WO 93/25676中首次建議將編碼蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的cDNA和編碼異源二硫鍵鍵合蛋白質(zhì)的cDNA的共表達(dá)作為增加異源蛋白產(chǎn)量的方法。WO 93/25676報(bào)道了通過與PDI共表達(dá)可以提高安逖斯塔辛(antistasin)和蜱抗凝血蛋白的重組表達(dá)。

WO 94/08012提供了通過增加Hsp70伴侶蛋白(即KAR2/BiP，或PDI伴侶蛋白質(zhì))的表達(dá)來提高酵母菌中過表達(dá)的蛋白質(zhì)的分泌的方法。

WO 05/0617818和WO 06/067511提供了通過采用基于2μm的表達(dá)質(zhì)粒在酵母菌中生產(chǎn)所需的異源蛋白的方法。已證明，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)伴侶蛋白與異源蛋白的基因在同一質(zhì)粒上共表達(dá)時(shí)，異源蛋白的產(chǎn)量顯著提高。

WO 2008/128701A2描述了通過利用蛋白質(zhì)BMH2、BFR2、COG6、COY1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4和SSE1中的一個(gè)來增加POI從真核細(xì)胞中的分泌的表達(dá)系統(tǒng)。

另一種增加蛋白質(zhì)生產(chǎn)的方法基于激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的轉(zhuǎn)錄因子HAC1的過表達(dá)。轉(zhuǎn)錄分析表明超過330個(gè)基因受HAC1的調(diào)控，這些基因中的多數(shù)涉及分泌細(xì)胞器的分泌或生物發(fā)生(biogenesis)。WO 01/72783描述了通過誘導(dǎo)升高的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)來增加從真核細(xì)胞中分泌的異源蛋白質(zhì)的量的方法，其中所述UPR受選自HAC1、PTC2和IRE1的蛋白質(zhì)的共表達(dá)的調(diào)節(jié)。

Wentz等利用釀酒酵母的酵母菌表面展示基因文庫(kù)，以通過應(yīng)用合適的選擇壓力來鑒定分泌改善的菌株。發(fā)現(xiàn)酵母菌cDNA CCW12、SED1、CWP2、RPP0以溫度依賴的方式增強(qiáng)scTCR展示。當(dāng)在20℃下誘導(dǎo)時(shí)，ERO1增強(qiáng)蛋白分泌(Wentz等，Appl.Environ.Microbiol.(2007)73(4):1189-1198)。

Liu等(Biotechnol.Prog.(2006),22:1090-1095)證明在巴斯德畢赤酵母中Kar2的共過表達(dá)使rhG-CSF表達(dá)增加了5.6倍。將KAR2與Sec63、PDI1和YDJ1組合實(shí)現(xiàn)了2.8倍、6.5倍和5.94倍的增加。在Blatt等實(shí)施的實(shí)驗(yàn)中，KAR2(BiP)的共過表達(dá)使A33scFv在畢赤酵母中的表達(dá)增加了兩倍。將KAR2與PDI1組合幾乎消除了積極KAR2作用(Blatt等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,2007,74:381-389)。

Guerfall等探討了在巴斯德畢赤酵母(P.pastoris.)中過表達(dá)內(nèi)源性HAC1的作用。此外，HAC1被組成型地和誘導(dǎo)型地過表達(dá)。在所有的例子中，證實(shí)了誘導(dǎo)的UPR的結(jié)果是增加的KAR2表達(dá)。全長(zhǎng)HAC1的組成型過表達(dá)有很小或沒有作用，而在四分之一的例子中，HAC1的誘導(dǎo)形式的過表達(dá)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)分泌的增加，在四分之三的例子中，HAC1的誘導(dǎo)形式的過表達(dá)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)分泌的降低(Guerfall等，Microbial Cell Factories,(2010),9:49)。

Sleep等證明LHS1的共過表達(dá)增加了rHA的濃度。LHS1與SIL1、JEM1和SCJ1組合，但效價(jià)(titer)低于單獨(dú)與Jem1共過表達(dá)。在相同的時(shí)間，SIL1、LHS1和JEM1的共過表達(dá)使GM-CSF表達(dá)提高了1.45倍，而使rHA表達(dá)提高了近1.1和2倍，這取決于培養(yǎng)基(Sleep等，Applied and Environmental Microbiology,(2008)74(24):7759-7766)。

US 2009221030 A1描述了多種輔助蛋白(特別是BiP1)單獨(dú)地和與其它輔助蛋白(特別是LHS1)組合在里氏木霉中的共表達(dá)。單獨(dú)BiP1獲得了最高表達(dá)值，而BiP1與LHS1的組合導(dǎo)致了分泌的蛋白效價(jià)降低8％。

US 8,440,456提供了巴斯德畢赤酵母的基因組序列，并公開了編碼單一肽、分子伴侶和啟動(dòng)子的核酸序列。其公開了包含核酸序列的表達(dá)載體和能夠過表達(dá)14種分子伴侶的遺傳工程化的酵母菌。具體選擇ROT1、SHR3和SIL1來試驗(yàn)，然而，SIL1未觀察到表達(dá)，且ROT1或SHR3的過表達(dá)未能引起異源蛋白質(zhì)分泌的任何顯著增強(qiáng)。

在宿主細(xì)胞中高水平的蛋白產(chǎn)量可被一個(gè)或多個(gè)不同步驟，如折疊、二硫鍵的形成、糖基化、在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)或自細(xì)胞中釋放限制?；谀壳氨绢I(lǐng)域最先進(jìn)的知識(shí)，甚至當(dāng)宿主生物體的全部基因組的DNA序列可獲得時(shí)，許多涉及的機(jī)制仍然不能被完全理解且不能預(yù)測(cè)。

仍然需要改善宿主細(xì)胞生產(chǎn)和/或分泌目標(biāo)蛋白的能力的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供提高重組蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中的產(chǎn)量的新方法，所述方法是簡(jiǎn)單且有效的并適用于工業(yè)方法。本發(fā)明的另一目的是提供實(shí)現(xiàn)上述目的的宿主細(xì)胞。又一目的是識(shí)別可用于提供所述宿主細(xì)胞的新的輔助蛋白及編碼該輔助蛋白的序列。

必須指出的是，除非上下文另有明確指示，本文所用單數(shù)形式“一(a)”、“一種(an)”和“所述/該(the)”包括所提及的復(fù)數(shù)且反之亦然。因此，例如，提及的“一種宿主細(xì)胞”或“一種方法”分別包括一種或多種所述宿主細(xì)胞或方法，并且提及的“所述方法”包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的可被修飾或置換的等效步驟和方法。類似地，例如，提及的“方法(methods)”或“宿主細(xì)胞(host cells)”分別包括“一種宿主細(xì)胞”或“一種方法”。

除非另有說明，一系列元素之前的術(shù)語“至少”將被理解為是指該系列中的每一元素。本領(lǐng)域技術(shù)人員將承認(rèn)或采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定，本文所述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等價(jià)方案。這種等價(jià)方案意圖被本發(fā)明所涵蓋。

術(shù)語“和/或”無論在本文何處使用均包括“和”、“或”和“由所述術(shù)語連接的元素的全部或任意其它組合”的含義。例如，A、B和/或C的含義是A、B、C，A+B、A+C、B+C和A+B+C。

本文所用術(shù)語“約(about)”或“大約(approximately)”的含義是在給定值或范圍的20％內(nèi)，優(yōu)選地10％內(nèi)，和更優(yōu)選地5％內(nèi)。其還包括具體數(shù)目，如，約20包括20。

術(shù)語“少于”、“多于”或“大于”包括具體數(shù)目。例如，少于20的含義是≤20，多于20的含義是≥20。

本說明書及權(quán)利要求或項(xiàng)目全文中，除非上下文有其它要求，詞語“包括/包含(comprise)”以及變形詞語諸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”將被理解為意指包括陳述的整數(shù)(或步驟)、或整數(shù)(或步驟)的集合。其并不排除任何其它的整數(shù)(或步驟)、或整數(shù)(或步驟)的集合。當(dāng)本文使用時(shí)，術(shù)語“包括/包含(comprising)”能夠以術(shù)語“含有(containing)”、“由…組成(composed of)”、“包含(including)”、“具有(having)”或“攜帶(carrying)”替代。當(dāng)本文使用時(shí)，“由…組成”排除了未在權(quán)利要求/項(xiàng)目中規(guī)定的任何整數(shù)或步驟。當(dāng)本文使用時(shí)，“本質(zhì)上由…組成”并不排除實(shí)質(zhì)上不影響權(quán)利要求/項(xiàng)目的基本特征的和新特征的整數(shù)或步驟。本文的每一個(gè)實(shí)例中，術(shù)語“包括/包含”、“本質(zhì)上由…組成”和“由…組成”中任意一個(gè)可被其它兩個(gè)術(shù)語中的任意一個(gè)替代。

另外，在描述本發(fā)明的代表性實(shí)施方案時(shí)，本說明書可能將本發(fā)明的方法和/過程體現(xiàn)為特定的步驟順序。然而，就方法或過程并不依賴于本文所陳述的特定步驟順序來說，該方法或過程不應(yīng)限于所描述的特定步驟順序。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解，其他步驟的順序也是可能的。因此，在本說明書中所描述的步驟的具體順序不應(yīng)被解釋為對(duì)權(quán)利要求的限制。此外，涉及本發(fā)明的方法和/或過程的權(quán)利要求也不應(yīng)被限制于字面所記載的其步驟的操作，而且本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地理解，這些順序可以是變化的并且仍然被包含在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。

應(yīng)該理解的是，本發(fā)明并不限于本文所述的具體的方法學(xué)、方案、材料、試劑和物質(zhì)等。本文所使用的名詞只用于描述特定實(shí)施方案的目的，其并不意在限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求/項(xiàng)目限定。

本說明書全文所引用的所有的出版物和專利(包括所有的專利、專利申請(qǐng)、科學(xué)出版物、制造商的說明書、指導(dǎo)書等)，無論在前還是在后，均以其全文并入本文。本文無任何內(nèi)容能被解釋為承認(rèn)由于在先發(fā)明，本發(fā)明不早于這樣的公開內(nèi)容。就通過引入并入的材料與本說明書矛盾或不一致來說，本說明書將取代任何這樣的材料。

發(fā)明概述

本發(fā)明部分地基于對(duì)多核苷酸序列(“本發(fā)明的多核苷酸”)的驚人的發(fā)現(xiàn)，該多核苷酸的表達(dá)、優(yōu)選地過表達(dá)使得目標(biāo)蛋白(POI)的產(chǎn)量增加。這一公開提供了這樣的方法和材料：所述方法和材料可用于通過將宿主細(xì)胞工程化使得其能夠過表達(dá)一種或多種新鑒定的多核苷酸序列以編碼一種或多種輔助蛋白，改善POI的產(chǎn)量。

術(shù)語“產(chǎn)量”是指本文所述的POI或模型蛋白，特別是SDZ-Fab(SEQ ID NO:25和26)和HyHEL-Fab(SEQ ID NO:29和30)的量，其分別是例如從工程化宿主細(xì)胞中收獲的，并且增加的產(chǎn)量可歸因于宿主細(xì)胞生產(chǎn)或分泌的POI的量增加。產(chǎn)量可以以mg POI/g生物質(zhì)(以干細(xì)胞重量或濕細(xì)胞重量來度量)的宿主細(xì)胞呈現(xiàn)。當(dāng)本文使用時(shí)，術(shù)語“效價(jià)”同樣地指生產(chǎn)的POI或模型蛋白的量，以mg POI/L培養(yǎng)上清液呈現(xiàn)。當(dāng)從工程化宿主細(xì)胞中獲得的產(chǎn)量與從工程化之前的宿主細(xì)胞(即未工程化的宿主細(xì)胞)中獲得的產(chǎn)量相比較時(shí)，可以測(cè)定產(chǎn)量的增加。

優(yōu)選地，當(dāng)將“產(chǎn)量”用于本文所述的模型蛋白的上下文中時(shí)，其是按照實(shí)施例5c的描述測(cè)定的。因此，當(dāng)將所述“產(chǎn)量”用于本文所述的模型蛋白的上下文中時(shí)，其還指“Fab產(chǎn)量”或“Fab效價(jià)”。Fab效價(jià)以mg/L表示，F(xiàn)ab產(chǎn)量以mg/g生物質(zhì)(以干細(xì)胞重量或濕細(xì)胞重量來度量)表示。

簡(jiǎn)言之，用編碼本文所述的輔助蛋白或其功能同系物的多核苷酸工程化分別表達(dá)模型蛋白HyHEL-Fab和SDZ-Fab的巴斯德畢赤酵母菌株CBS7435mut^S pPM2d_pAOX HyHEL和/或CBS7435mut^S pPM2d_pAOX SDZ(它們的產(chǎn)生參見實(shí)施例1)。對(duì)于共過表達(dá)，將編碼輔助蛋白的基因克隆在巴斯德畢赤酵母GAP啟動(dòng)子的控制下，然后轉(zhuǎn)化至實(shí)施例4中所述的生產(chǎn)Fab的菌株中。對(duì)于低表達(dá)，將編碼KO靶標(biāo)或其功能同系物的基因從生產(chǎn)Fab的菌株的基因組中敲除(參見實(shí)施例6)。在25℃下，將工程化的細(xì)胞于含有10g/L甘油和50μg/mL博來霉素(Zeocin)的YP-培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過夜(參見實(shí)施例5a)。將這種培養(yǎng)物的等分試樣(對(duì)應(yīng)終OD₆₀₀為2.0)轉(zhuǎn)移至包含20g/L葡萄糖和葡萄糖料片的合成培養(yǎng)基M2中(描述于實(shí)施例5a)，并在25℃下培養(yǎng)25小時(shí)。將培養(yǎng)物洗滌并重懸浮于合成培養(yǎng)基M2中，并將等分試樣(對(duì)應(yīng)終OD₆₀₀為4.0)轉(zhuǎn)移至用5g/L甲醇補(bǔ)充的合成培養(yǎng)基M2中。每12小時(shí)再添加3次的甲醇(5g/L)。48小時(shí)后，通過離心收獲細(xì)胞。通過測(cè)量源于1mL細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞團(tuán)塊的重量來測(cè)定生物質(zhì)。所述上清液用于通過ELISA的SDZ-Fab或HyHEL-Fab的相應(yīng)地定量(描述于實(shí)施例5c)。具體而言，抗-人IgG抗體(如ab7497，Abcam)用作包被抗體，如山羊抗-人IgG(Fab特異性)抗體(如堿性磷酸酶綴合的Sigma A8542)用作檢測(cè)抗體。將商業(yè)的人Fab/κ，IgG片段用作起始濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，相應(yīng)地稀釋上清液樣品。基于細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多肽之前和之后的POI產(chǎn)量的比較，可測(cè)定產(chǎn)量的增加。示于實(shí)施例中的與模型蛋白SDZ-Fab和/或HyHEL-Fab相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)可以用于確定產(chǎn)量差異。

第一方面，本發(fā)明涉及一種或多種新發(fā)現(xiàn)的輔助蛋白及它或它們提高POI產(chǎn)量的用途。本發(fā)明基于、但不限于輔助蛋白HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9或HP10或其功能同系物。功能同系物的定義在本申請(qǐng)的后面部分限定。輔助蛋白HP1至HP9的氨基酸序列分別列于SEQ ID NO:1-9和162。本文使用的這種蛋白是指在本發(fā)明中，其復(fù)數(shù)形式或單數(shù)形式可互換，但是除非另有明確規(guī)定外，應(yīng)當(dāng)理解為單數(shù)形式。

本發(fā)明還涉及編碼所述輔助蛋白的多核苷酸(以下稱為“本發(fā)明的多核苷酸)和它們提高POI產(chǎn)量的單獨(dú)的或組合的用途?？蓪⑺龆嗪塑账嵋胨拗骷?xì)胞，或若已經(jīng)存在于所述細(xì)胞中，以使得該多核苷酸被過表達(dá)的方式操作它們。本發(fā)明的多核苷酸編碼SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162或其功能同系物中的任一個(gè)。所述多核苷酸序列的實(shí)例示于SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或163。

本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含以下、本質(zhì)上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:163，并且可選地，所述多核苷酸可操作地連接至與該多核苷酸序列可為異源的啟動(dòng)子。此外，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:1-9或162中任一個(gè)的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:1的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:2的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:3的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:4的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:5的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:6的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:7的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:8的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:9的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:162的多肽序列或其功能同系物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列與選自SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或163的多核苷酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。更優(yōu)選地，所述分離的多核苷酸序列與SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:163具有100％的序列同一性。

本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列在其染色體中或以質(zhì)粒、微型質(zhì)粒、YAC、BAC、黏?；蚱渌魏屋d體等整合至宿主細(xì)胞中的用途。所述根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列可以通過如轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染引入至宿主細(xì)胞中。另外，本發(fā)明提供這種多核苷酸序列在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的用途。

此外，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1-9或162中任一個(gè)的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:2的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:3的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:4的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:5的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:6的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:7的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:8的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:9的多肽序列或其功能同系物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:162的多肽序列或其功能同系物。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多肽，所述多肽具有的多肽序列與選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

第二方面，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與工程化為過表達(dá)所述輔助蛋白之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab(重鏈SEQ ID NO:25和輕鏈SEQ ID NO:26；圖2)或HyHEL-Fab(重鏈SEQ ID NO:29和輕鏈SEQ ID NO:30；圖2)的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。工程化之前的宿主細(xì)胞不會(huì)過表達(dá)本發(fā)明的輔助蛋白，而工程化之后的宿主細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下能夠過表達(dá)所述輔助蛋白。已驚奇地發(fā)現(xiàn)，在實(shí)施例中描述的示例性重組細(xì)胞都能夠使模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab產(chǎn)量增加至少20％(1.2倍改變)。在一些情況下，產(chǎn)量增加140％，如實(shí)施例7所示。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:1具有至少30％的序列同一性，其中，與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:2具有至少30％的序列同一性，其中，與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:3具有至少30％的序列同一性，其中，與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:4具有至少30％的序列同一性，其中，與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:5具有至少30％的序列同一性，其中，與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:6具有至少30％的序列同一性，其中，與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:7具有至少30％的序列同一性，其中，與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:8具有至少30％的序列同一性，其中，與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:9具有至少30％的序列同一性，其中，與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:162具有至少30％的序列同一性，其中，與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，可以使宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

第三方面，本發(fā)明提供所述工程化宿主細(xì)胞在制備目標(biāo)蛋白中的用途。所述宿主細(xì)胞可有利地用來引入編碼一種或多種POI的多核苷酸，然后可以將該宿主細(xì)胞在適宜條件下培養(yǎng)以表達(dá)所述POI。

第四方面，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

優(yōu)選地，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:1具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:2具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:3具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:4具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:5具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:6具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:7具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:8具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:9具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

優(yōu)選地，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與SEQ ID NO:162具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

第五方面，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

在用于增加蛋白產(chǎn)量的方法的上下文中，所述“工程化步驟”和“重組步驟”的順序可以互換，使得“重組步驟”位于“工程化步驟”之前。尤其，如本文所述，當(dāng)輔助蛋白過表達(dá)和/或KO蛋白低表達(dá)時(shí)，目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量增加。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或所述功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或所述功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或所述功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或所述功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或所述功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或所述功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或所述功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或所述功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或所述功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)由多核苷酸編碼的輔助蛋白，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或所述功能同系物和一種或多種所述目標(biāo)蛋白。

第六方面，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

附圖說明

圖1示出了HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9、HP10、KO1、KO2和KO3的氨基酸和多核苷酸序列。

圖2示出了模型蛋白SDZ-Fab和HyHEL-Fab各自的重鏈和輕鏈的氨基酸和多核苷酸序列。

本發(fā)明的項(xiàng)目

1)一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

2)項(xiàng)目 1的宿主細(xì)胞，其中與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白或所述其功能同系物，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，使模型蛋白SDZ-Fab(SEQ ID NO.25和26)和/或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加，優(yōu)選地至少20％(SEQ ID NO.29和30)。

3)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述過表達(dá)通過在所述宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)拷貝的所述編碼輔助蛋白或其功能同系物的多核苷酸實(shí)現(xiàn)。

4)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸整合在所述宿主細(xì)胞的基因組中。

5)項(xiàng)目4的宿主細(xì)胞，其中所述整合是異位地和/或在天然基因座上。

6)項(xiàng)目5的宿主細(xì)胞，其中至少一種所述多核苷酸被整合在所述宿主細(xì)胞基因組的AOX1、GAP、ENO1、TEF、HIS4、TYR1、HIS3、LEU2、URA3、LYS2、ADE2、TRP1、GAL1或ADH1基因座上。

7)項(xiàng)目1、2或3的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸包含在載體或質(zhì)粒中。

8)項(xiàng)目7的宿主細(xì)胞，其中所述載體為YIp型載體、YEp型載體、YRp型載體、YCp型載體、pGPD-2、pAO815、pGAPZ、pGAPZα、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ、pPICZα、pPIC3K、pHWO10、pPUZZLE或2μm質(zhì)粒。

9)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述過表達(dá)通過采用驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸表達(dá)的重組啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。

10)項(xiàng)目9的宿主細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子為PAOX1、PTPI、PPGK、PGAPDH、PLAC、PGAL、PPGI、PGAP、PTEF、PENO1、PTPI、PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1、PFLD、PICL、PTHI、PSSA1、PHSP90、PKAR2、PGND1、PGPM1、PTKL1、PPIS1、PFET3、PFTR1、PPHO8、PNMT1、PMCM1、PUBI4、PRAD2、PPET9、PFMD、PGAL1、PADH1、PADH2/GAP、PCUP1或PMAL。

11)項(xiàng)目9的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸的過表達(dá)通過采用增強(qiáng)子以增強(qiáng)所述啟動(dòng)子的活性來實(shí)現(xiàn)。

12)項(xiàng)目11的宿主細(xì)胞，其中所述增強(qiáng)子為酵母菌上游激活序列UAS/GAL。

13)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)、和Komagataella和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

14)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中2、3、4、5、6、7、8、或更多個(gè)選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、162或其功能同系物的輔助蛋白過表達(dá)。

15)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為低表達(dá)編碼蛋白的多核苷酸，所述蛋白具有與示于SEQ ID NO:10、11或12的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸。

16)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼所述目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸序列。

17)項(xiàng)目16的宿主細(xì)胞，其中所述目標(biāo)蛋白為酶、治療性蛋白、食品添加劑或飼料添加劑，優(yōu)選地為解毒酶。

18)項(xiàng)目17的宿主細(xì)胞，其中所述治療性蛋白包括抗體或抗體片段。

19)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中過表達(dá)通過修飾可操作地連接至所述多核苷酸的調(diào)控序列實(shí)現(xiàn)，所述多核苷酸編碼輔助蛋白或其功能同系物。

20)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為：

(i)過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物和示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白；

(ii)過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物和示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白；

(iii)過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物和示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，并進(jìn)一步被工程化為低表達(dá)編碼具有示于SEQ ID NO:10的氨基酸或其功能同系物的蛋白質(zhì)的多核苷酸，或

(iv)過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物和示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，并進(jìn)一步被工程化為低表達(dá)編碼具有示于SEQ ID NO:10的氨基酸或其功能同系物的蛋白質(zhì)的多核苷酸。

21)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞在制備目標(biāo)蛋白中的用途。

22)增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

23)一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括：

—將宿主細(xì)胞工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；

—在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或其功能同系物和所述目標(biāo)蛋白，和可選地

—從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離目標(biāo)蛋白。

24)一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；

—在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白或其功能同系物，和表達(dá)目標(biāo)蛋白，和可選地

—從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離目標(biāo)蛋白。

25)項(xiàng)目22-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為低表達(dá)至少一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有與示于SEQ ID NO:10、11和/或12的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸。

26)項(xiàng)目25的方法，其中所述低表達(dá)通過以下實(shí)現(xiàn)：

a)修飾SEQ ID NO:10、11和/或12的啟動(dòng)子或其它基因調(diào)控序列，和/或

b)修飾SEQ ID NO:10、11和/或12的編碼序列，從而降低由所述SEQ ID編碼的蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期/穩(wěn)定性。

27)項(xiàng)目22-25中任一項(xiàng)的方法，其中，所述過表達(dá)通過在所述宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)拷貝的所述編碼輔助蛋白或其功能同系物的多核苷酸實(shí)現(xiàn)。

28)項(xiàng)目22-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述多核苷酸整合在所述宿主細(xì)胞的基因組中。

29)項(xiàng)目28的方法，其中所述整合是異位地或在天然基因座上。

30)項(xiàng)目28的方法，其中所述多核苷酸被整合在所述宿主細(xì)胞基因組的AOX1、GAP、ENO1、TEF、HIS4、TYR1、HIS3、LEU2、URA3、LYS2、ADE2、TRP1、GAL1或ADH1基因座上。

31)項(xiàng)目22至27中任一項(xiàng)的方法，其中所述多核苷酸包含在載體或質(zhì)粒中。

32)項(xiàng)目31的方法，其中所述載體為YIp型載體、YEp型載體、YRp型載體、YCp型載體、pGPD-2、pAO815、pGAPZ、pGAPZα、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ、pPICZα、pPIC3K、pHWO10、或2μm質(zhì)粒。

33)項(xiàng)目22至32中任一項(xiàng)的方法，其中所述過表達(dá)通過采用驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸表達(dá)的重組啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。

34)項(xiàng)目33的方法，其中所述啟動(dòng)子為PAOX1、PTPI、PPGK、PGAPDH、PLAC、PGAL、PPGI、PGAP、PTEF、PENO1、PTPI、PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1、PFLD、PICL、PTHI、PSSA1、PHSP90、PKAR2、PGND1、PGPM1、PTKL1、PPIS1、PFET3、PFTR1、PPHO8、PNMT1、PMCM1、PUBI4、PRAD2、PPET9、PFMD、PGAL1、PADH1、PADH2/GAP、PCUP1或PMAL。

35)項(xiàng)目33的方法，其中所述多核苷酸的過表達(dá)通過采用增強(qiáng)子以增強(qiáng)所述啟動(dòng)子的活性來實(shí)現(xiàn)。

36)項(xiàng)目35的方法，其中所述增強(qiáng)子為酵母菌上游激活序列UAS/GAL。

37)項(xiàng)目22至26中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)、和Komagataella和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

38)項(xiàng)目22至37中任一項(xiàng)的方法，其中2、3、4、5、6、7、8、或更多個(gè)選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、162或其功能同系物的輔助蛋白過表達(dá)。

39)項(xiàng)目22至38中任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)蛋白為酶、治療性蛋白、食品添加劑或飼料添加劑，優(yōu)選地為解毒酶。

40)項(xiàng)目39的方法，其中所述治療性蛋白包括抗體或抗體片段。

41)項(xiàng)目22至40中任一項(xiàng)的方法，其中與工程化之前的宿主細(xì)胞相比，所述輔助蛋白，優(yōu)選地當(dāng)過表達(dá)時(shí)，使模型蛋白SDZ-Fab和/或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加至少20％。

42)一種分離的多核苷酸序列，所述分離的多核苷酸序列編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

43)項(xiàng)目42的分離的多核苷酸，其與SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或163中任一核苷酸序列具有100％的序列同一性。

44)根據(jù)項(xiàng)目42或43的分離的多核苷酸序列在整合至宿主細(xì)胞中的用途。

45)一種分離的多肽，所述分離的多肽包含與選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的多肽序列。

46)根據(jù)項(xiàng)目45的分離的多肽在制備目標(biāo)蛋白中的用途。

47)根據(jù)項(xiàng)目42或43的多核苷酸在制備目標(biāo)蛋白中的用途。

48)根據(jù)項(xiàng)目42或43的多核苷酸在制備宿主細(xì)胞中的用途。

49)一種組合物，所述組合物包括至少10％、20％、30％、40％或50％的目標(biāo)蛋白和根據(jù)項(xiàng)目42或43的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地與異源啟動(dòng)子連接。

發(fā)明詳述

本發(fā)明部分地基于對(duì)輔助蛋白HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9和HP10的表達(dá)能增加目標(biāo)蛋白的分泌這一驚人的發(fā)現(xiàn)。每一輔助蛋白的氨基酸序列及其在實(shí)施例中對(duì)應(yīng)的命名列于下表1：

表1

特別地，在對(duì)巴斯德畢赤酵母中的分泌輔助因子的篩選中，鑒定了55個(gè)候選基因，通過濕-室表達(dá)實(shí)驗(yàn)(wet-lab expression experiment)驗(yàn)證這些候選基因以便選擇最佳候選基因。最佳候選基因是這樣的候選基因：與未過表達(dá)所述最佳候選基因的巴斯德畢赤酵母菌株(即，如本文所述的工程化之前的宿主細(xì)胞)相比，最佳候選基因使本文所描述的兩種模型蛋白SDZ-Fab#9和/或HyHEL-Fab#8的產(chǎn)量增強(qiáng)20％或更高程度。為此，從55個(gè)基因中鑒定了9個(gè)最佳候選基因。當(dāng)過表達(dá)時(shí)，分別地，4個(gè)最佳候選基因即PP7435_Chr3-0607、PP7435_Chr3-0933、PP7435_Chr2-0220(SBH1)、PP7435_Chr3-0639(CPR6)對(duì)模型蛋白SDZ-Fab和HyHEL Fab都顯示出了大于20％的分泌和/或表達(dá)增強(qiáng)，另外5個(gè)候選基因(PP7435_Chr4-0108(MXR2)、PP7435_Chr1-1232、PP7435_Chr1-1225(MDR1)、PP7435_Chr1-0667、PP7435_Chr4-0448)對(duì)兩種模型蛋白SDZ-Fab和HyHEL Fab中的一種顯示出了>20-30％分泌產(chǎn)量增強(qiáng)。

然而，進(jìn)一步鑒定了3個(gè)候選基因，即KO1(FLO8)、KO2(HCH1)、KO3(SCJ1)，為了增強(qiáng)分泌和/或表達(dá)，這3個(gè)候選基因的表達(dá)必須如通過敲除來降低或優(yōu)選地消除，由此deltaKO1增強(qiáng)了兩種模型蛋白的產(chǎn)量，deltaKO3和deltaKO2增強(qiáng)了HyHEL-Fab的產(chǎn)量。

篩選的依據(jù)是巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)菌株與巴斯德畢赤酵母非生產(chǎn)菌株的轉(zhuǎn)錄譜之間的直接比較，這導(dǎo)致55個(gè)基因的鑒定。這些基因?qū)儆诙喾N代謝途徑并具有不同的功能，或甚至可具有未知功能。因此，從基因或由其編碼的蛋白中沒有明顯針對(duì)由此獲得的輔助因子的性質(zhì)的教導(dǎo)。因此，為了驗(yàn)證潛在分泌輔助因子是否確實(shí)是實(shí)際條件下的輔助因子，必須進(jìn)行試驗(yàn)。然而，顯然潛在輔助因子確實(shí)是輔助因子并不是顯而易見的，僅僅因?yàn)槠涫峭ㄟ^在生產(chǎn)菌株中增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)來確定的。事實(shí)上，潛在輔助因子對(duì)蛋白分泌可能沒有積極作用或可能甚至具有負(fù)面作用。發(fā)明人確實(shí)觀察到了上述事實(shí)，因?yàn)閺?5個(gè)基因中鑒定的兩個(gè)編碼伴侶蛋白的基因(SCJ1、HCH1)本應(yīng)可以合理預(yù)期增強(qiáng)分泌，但卻是相反的。因此，針對(duì)每一基因進(jìn)行試驗(yàn)是必須的，且不存在由所述約60個(gè)基因中的任一個(gè)編碼的蛋白確實(shí)是分泌輔助因子的教導(dǎo)。

因此，“真正的”分泌輔助因子的發(fā)現(xiàn)不是簡(jiǎn)單的事，而是創(chuàng)造性選擇，因?yàn)閮H從本發(fā)明的發(fā)明人自篩選中鑒定的蛋白的基因/蛋白序列或功能，無可獲得的教導(dǎo)或所述教導(dǎo)不是顯而易見的。

關(guān)于本文描述的必須過表達(dá)的最佳候選基因的其它不尋常之處在于，這些最佳候選基因不是典型的分泌輔助因子，即，其編碼的蛋白所具有的功能不被視為在蛋白質(zhì)分泌中發(fā)揮作用或甚至具有未知功能的基因。

對(duì)于必須從伴侶蛋白(KO2、KO3)中敲除的基因，人們?cè)A(yù)料過表達(dá)是有益的，但事實(shí)上，是所述缺失具有積極作用。對(duì)于在面包酵母(baker’syeast)中的絮凝中起作用的KO1，人們不曾預(yù)料其缺失增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分泌。面包酵母中的絮凝是當(dāng)二倍體面包酵母絲狀生長(zhǎng)或當(dāng)單倍體細(xì)胞擴(kuò)散性生長(zhǎng)時(shí)，然后這些細(xì)胞聚集的一種現(xiàn)象。然而，技術(shù)人員很可能不會(huì)假設(shè)敲除絮凝基因會(huì)增強(qiáng)蛋白質(zhì)分泌。

本發(fā)明所用“輔助蛋白”是指增強(qiáng)目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的蛋白。這一術(shù)語應(yīng)被廣泛理解且不應(yīng)被局限于伴侶蛋白或伴侶樣蛋白。本發(fā)明的公開內(nèi)容明顯呈現(xiàn)出，本發(fā)明的輔助蛋白的功能是變化的。本發(fā)明的輔助蛋白包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一個(gè)的氨基酸序列或其功能同系物。本發(fā)明的輔助蛋白還可包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。本發(fā)明的輔助蛋白可以分別是由SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20或21編碼的，或者是由編碼SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或9的功能同系物的SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20或21的變體中任一個(gè)的核苷酸序列編碼的。本發(fā)明的輔助蛋白還可以是由SEQ ID NO:163或者編碼SEQ ID NO:162的功能同系物的SEQ ID NO:163的變體的核苷酸序列編碼的。對(duì)于本發(fā)明的目的，術(shù)語“輔助蛋白”還旨在分別包括HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9和HP10的功能同系物。例如，輔助蛋白HP1包含編碼SEQ ID NO:4或編碼SEQ ID NO:4的功能同系物的氨基酸序列。本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

如本文所用，多肽的“同系物”或“功能同系物”是指在其一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)位置具有相同或保守性殘基的多肽。該術(shù)語還延伸至兩個(gè)或更多個(gè)編碼同源多肽的核苷酸序列。特別地，與本發(fā)明的輔助蛋白同源的多肽對(duì)于全長(zhǎng)天然序列或其任何片段具有至少約30％的氨基酸序列同一性。優(yōu)選地，同源多肽與天然化合物或全長(zhǎng)化合物的任何其它具體限定的片段具有至少約35％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約40％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約45％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約50％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約55％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約60％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約65％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約70％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約75％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約80％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約85％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約90％的氨基酸序列同一性，如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約95％的氨基酸序列同一性。當(dāng)這種同系物作為輔助蛋白的功能被驗(yàn)證時(shí)，該同系物稱為“功能同系物”。功能同系物與其所源自的輔助蛋白履行相同或基本相同的功能，即該功能同系物使本文描述的模型蛋白SDZ-Fab和/或HyHEL-Fab的產(chǎn)量增加。所述功能可以通過本領(lǐng)域已知的實(shí)驗(yàn)，或優(yōu)選地用如實(shí)施例7或?qū)嵤├?C描述的，特別是在上文“Fab效價(jià)”或“Fab產(chǎn)量”的上下文中描述的，采用模型蛋白的實(shí)驗(yàn)測(cè)定。本發(fā)明提供的多核苷酸序列編碼SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162或SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的功能同系物。

一般而言，可采用本領(lǐng)域已知的任何突變程序，如定點(diǎn)突變、合成基因構(gòu)建、半合成基因構(gòu)建、隨機(jī)突變、改組(shuffling)等等，來制備同系物。定點(diǎn)突變是一項(xiàng)在編碼親本的多核苷酸上的一個(gè)或多個(gè)限定的位點(diǎn)引入一個(gè)或多個(gè)(如若干)突變的技術(shù)。可以通過涉及包含所需突變的寡核苷酸引物的應(yīng)用的PCR在體外完成定點(diǎn)突變。還可通過盒式突變?cè)隗w外來實(shí)施定點(diǎn)突變，所述盒式突變涉及通過限制性酶在包含編碼親本的多核苷酸的質(zhì)粒的位點(diǎn)上的切割和隨后在該多核苷酸上的包含所述突變的寡核苷酸的連接。通常，消化所述質(zhì)粒和所述寡核苷酸的限制性酶是相同的，從而允許質(zhì)粒的粘性末端和插入物彼此相連。參見，如Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton等,1990,Nucleic Acids Res.18:7349-4966。還可通過本領(lǐng)域已知的方法在體內(nèi)完成定點(diǎn)突變。參見，如美國(guó)專利申請(qǐng)公開文本No.2004/0171 154；Storici等，2001,Nature Biotechnol.19:773-776；Kren等，1998,Nat.Med.4:285-290；和Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。合成基因構(gòu)建需要體外合成設(shè)計(jì)的多核苷酸分子來編碼目標(biāo)多肽?？衫枚喾N技術(shù)，如由Tian等(2004,Nature 432:1050-1054)描述的基于多路微芯片的技術(shù)及其中將寡核苷酸合成并裝配至電流可編程的微流體芯片(photo-programmable microfluidic chip)上的類似技術(shù)來實(shí)施基因合成。采用已知的突變、重組和/或改組的方法，隨后是相關(guān)的篩選程序，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413或WO 95/22625公開的那些，可以完成并測(cè)定單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失和/或插入。其它可用的方法包括易出錯(cuò)(error-prone)PCR、噬菌體展示(如，Lowman等，1991,Biochemistry 30:10832-10837；美國(guó)專利No.5,223,409；WO 92/06204)和定區(qū)域突變(Derbyshire等，1986,Gene 46:145；Ner等，1988,DNA 7:127)?？梢詫⑼蛔?改組方法與高通量、自動(dòng)篩選方法組合，以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、突變的多肽的活性(Ness等，1999,Nature Biotechnology 17:893-896)?？勺运拗骷?xì)胞中回收編碼活性多肽的突變的DNA分子并采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)其快速測(cè)序。這些方法允許快速確定單個(gè)氨基酸殘基在多肽中的重要性。通過將合成基因構(gòu)建、和/或定點(diǎn)突變、和/或隨機(jī)突變、和/或改組的各個(gè)方面組合來完成半合成基因構(gòu)建。半合成構(gòu)建以利用合成的多核苷酸片段的過程與PCR技術(shù)組合為特征。因此，限定區(qū)域的基因可以被從頭合成，而其它區(qū)域可以采用位點(diǎn)特異性突變引物擴(kuò)增，而還有其它區(qū)域可以經(jīng)受易出錯(cuò)PCR或無錯(cuò)PCR擴(kuò)增。然后，將多核苷酸子序列改組?？蛇x地，可以從自然來源，如通過篩選近親或遠(yuǎn)親微生物的cDNA文庫(kù)獲得同系物。

可通過提供已經(jīng)插入了同源序列的表達(dá)盒，轉(zhuǎn)化攜帶編碼測(cè)試蛋白如用于實(shí)施例部分的模型蛋白的一種或特定POI的序列的宿主細(xì)胞，和測(cè)定在相同條件下模型蛋白或POI的產(chǎn)量差異，來測(cè)試SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的同系物的功能。

功能同系物還可以是所述輔助蛋白的生物活性片段。通常，一種蛋白的生物活性片段是指與全長(zhǎng)蛋白發(fā)揮類似的或相當(dāng)?shù)纳镒饔玫钠?。可以通過如氨基-和或羧基-端缺失以及內(nèi)部缺失生產(chǎn)這種片段或變體。

第一方面，本發(fā)明提供分離的多核苷酸序列，所述分離的多核苷酸序列編碼SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162或者SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的功能同系物。所述分離的多核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或163中的任一個(gè)。優(yōu)選地，所述分離的多核苷酸序列由SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或163中任一個(gè)核苷酸序列組成。

另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多肽，所述分離的多肽序列包含與選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

術(shù)語“分離的”是指處于自然界中未出現(xiàn)的形式或環(huán)境的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括：(1)任何非天然存在的物質(zhì)；(2)至少部分地從自然界中與其相關(guān)的天然存在的成分的一種或多種或全部中取出的任何物質(zhì)，包括但不限于，任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔助因子；(3)相對(duì)于自然界中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，經(jīng)由人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過相對(duì)于與其天然相關(guān)的其他組分增加物質(zhì)的量來修飾的任何物質(zhì)(如，在宿主細(xì)胞中的重組生產(chǎn)；編碼所述物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；和使用與編碼所述物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟動(dòng)子相比更強(qiáng)的啟動(dòng)子)。

本發(fā)明提供上述分離的多核苷酸中的任一個(gè)在整合至宿主細(xì)胞中的用途?？蛇x地，若一種或多種所述多核苷酸已經(jīng)存在于所述宿主細(xì)胞中，可以以使得其過表達(dá)的方式操作該宿主細(xì)胞，如稍后所描述的。再一方面，本發(fā)明涉及所述多核苷酸在增加宿主細(xì)胞中的POI產(chǎn)量中的用途，其中所述編碼POI的核苷酸序列與所述多核苷酸共表達(dá)。

“序列同一性”或“％同一性”是指使用標(biāo)準(zhǔn)化算法比對(duì)的至少兩個(gè)多肽或多核苷酸序列之間的殘基匹配的百分?jǐn)?shù)。為了使得兩條序列之間的比對(duì)最佳，這種算法可以以標(biāo)準(zhǔn)化的和可重現(xiàn)的方式在比較的序列中插入間隙(gap)，由此達(dá)到兩條序列的更加有意義的比較。對(duì)于本發(fā)明的目的，采用NCBI BLAST程序2.2.29版本(2014年1月6日)(Altschul等，Nucleic Acids Res.(1997)25:3389-3402)測(cè)定兩條氨基酸序列或核苷酸之間的序列同一性?？梢圆捎迷O(shè)定如下參數(shù)的blastp測(cè)定兩條氨基酸序列的序列同一性：矩陣：BLOSUM62，字長(zhǎng)：3；期望值：10；空位權(quán)重：存在＝11，延伸＝1；過濾＝低復(fù)雜性激活的；過濾字符串：L；組合調(diào)整(Compositional adjustments):有條件的組合評(píng)分矩陣調(diào)整。對(duì)于本發(fā)明的目的，采用設(shè)定如下示例性參數(shù)的blastn的NCBI BLAST程序2.2.29版本(2014年1月6日)測(cè)定兩條核苷酸序列的序列同一性：字長(zhǎng)：11；期望值：10；空位權(quán)重：存在＝5，延伸＝2；過濾＝低復(fù)雜性激活的；匹配/失配得分：2，-3；過濾字符串：L；m。

第二方面，本發(fā)明提供一種工程化為過表達(dá)編碼本發(fā)明的輔助蛋白的多核苷酸的宿主細(xì)胞。所述輔助蛋白分別包括HP1至HP9(SEQ ID NO:1-9)和HP10(SEQ ID NO:162)中的任一個(gè)或其功能同系物。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，該多核苷酸編碼具有與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162具有至少30％的序列同一性的氨基酸的輔助蛋白。

術(shù)語“表達(dá)多核苷酸”是指當(dāng)將多核苷酸轉(zhuǎn)錄成mRNA且將mRNA翻譯成多肽時(shí)。術(shù)語“過表達(dá)”通常是指大于或等于參考標(biāo)準(zhǔn)品顯示的表達(dá)水平的任何量。在本發(fā)明中術(shù)語“過表達(dá)(的)”是指基因產(chǎn)物或多肽以高于宿主細(xì)胞遺傳改變之前的或在限定條件下未被遺傳改變的相當(dāng)?shù)乃拗髦械南嗤虍a(chǎn)物或多肽的表達(dá)的水平表達(dá)。若宿主細(xì)胞不包含給定基因產(chǎn)物，將該基因產(chǎn)物引入所述宿主細(xì)胞用于表達(dá)是可能的；在這種情況下，術(shù)語“過表達(dá)”包括任何可檢測(cè)的表達(dá)。

如本文所用，術(shù)語“工程化的”宿主細(xì)胞為已經(jīng)用遺傳工程(即，通過人為干預(yù))操作了的宿主細(xì)胞。當(dāng)宿主細(xì)胞被“工程化為過表達(dá)”給定蛋白時(shí)，操作該宿主細(xì)胞從而使該宿主細(xì)胞具有表達(dá)、優(yōu)選地過表達(dá)輔助蛋白或其功能同系物的能力，由此與操作之前的相同條件下的宿主細(xì)胞相比，給定蛋白如POI或模型蛋白的表達(dá)增加。

當(dāng)將“工程化之前”用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞的上下文中時(shí)，是指這種宿主細(xì)胞沒有被編碼輔助蛋白或其功能同系物的多核苷酸工程化。因此，該術(shù)語還指不過表達(dá)編碼輔助蛋白或其功能同系物的多核苷酸的宿主細(xì)胞或沒有被工程化為過表達(dá)編碼輔助蛋白或其功能同系物的多核苷酸的宿主細(xì)胞。

本文所用術(shù)語“重組”是指用編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸裝備本發(fā)明的宿主細(xì)胞，即，本發(fā)明的宿主細(xì)胞被工程化為包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸。這可以通過如轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或用于將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的任何其它本領(lǐng)域已知的適宜技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。

過表達(dá)

正如將在后面詳細(xì)描述的，以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式都可實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。一般而言，可通過提高基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯，如通過提高所述基因的拷貝數(shù)或者改變或修飾與基因表達(dá)相關(guān)的調(diào)控序列或位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。例如，通過引入可操作地連接至調(diào)控序列(如啟動(dòng)子)的編碼輔助蛋白或功能同系物的多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。例如，為了達(dá)到高表達(dá)水平，可將所述基因可操作地連接至強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子和/或強(qiáng)的廣譜表達(dá)型(ubiquitous)啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以是內(nèi)源性啟動(dòng)子或重組啟動(dòng)子?？蛇x地，可以將調(diào)控序列移除從而使表達(dá)變?yōu)榻M成型的。人們可以用增加給定基因表達(dá)的或?qū)е陆o定基因組成型表達(dá)的異源啟動(dòng)子替換給定基因的天然啟動(dòng)子。例如，與工程化之前的并在相同條件下培養(yǎng)的宿主細(xì)胞相比，所述宿主細(xì)胞可以過表達(dá)所述輔助蛋白大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或大于300％。額外地使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可使宿主細(xì)胞培養(yǎng)過程中的表達(dá)增加。此外，還可通過以下方式實(shí)現(xiàn)過表達(dá)，例如修飾特定基因的染色體位置；改變與特定基因相鄰的核酸序列，所述特定基因如核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止子；修飾與所述基因轉(zhuǎn)錄和/或與所述基因產(chǎn)物的翻譯相關(guān)的蛋白(如，調(diào)控蛋白、抑制子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活因子等等)；或任何其它本領(lǐng)域常規(guī)的使特定基因表達(dá)失調(diào)的常規(guī)技術(shù)(包括但不限于，反義核苷酸分子的應(yīng)用，例如以阻斷阻遏蛋白的表達(dá)，或者缺失或突變通常抑制需要過表達(dá)的基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的基因。延長(zhǎng)mRNA的壽命也可提高表達(dá)水平。例如，某些終止子區(qū)可用于延長(zhǎng)mRNA的半衰期(Yamanishi等，Biosci.Biotechnol.Biochem.(2011)75:2234和US 2013/0244243)。若包括多個(gè)拷貝的基因，這些基因既可以位于可變拷貝數(shù)的質(zhì)粒中，也可以是在染色體中整合并擴(kuò)增的。若所述宿主細(xì)胞不包含編碼輔助蛋白的基因產(chǎn)物，則可以將基因產(chǎn)物引入宿主細(xì)胞用于表達(dá)。此時(shí)，“過表達(dá)”是指采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法表達(dá)所述基因產(chǎn)物。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將在Martin等(Bio/Technology 5,137-146(1987))、Guerrero等(Gene 138,35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))、Eikmanns等(Gene 102,93-98(1991))、EP 0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer和(Bio/Technology 9,84-87(1991))、Reinscheid等(Applied and Environmental Microbiology 60,126-132(1994))、LaBarre等(Journal of Bacteriology 175,1001-1007(1993))、WO 96/15246、Malumbres等(Gene 134,15-24(1993))、JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))和Makrides(Microbiological Reviews 60,512-538(1996))中，特別是在公知的遺傳和分子生物教科書中發(fā)現(xiàn)相關(guān)說明。

輔助蛋白

本發(fā)明的輔助蛋白最初是從巴斯德畢赤酵母CBS7435菌株中分離的。該甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母畢赤酵母(Pichia pastoris)(Komagataella phaffii)CBS7435菌株是常用的畢赤酵母重組蛋白生產(chǎn)宿主的親本菌株。其完整的基因組序列描述于Küberl等(J Biotechnol.(2011)154(4):312-20)中。編碼本文所鑒定的輔助蛋白的這些基因迄今尚未與對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量的有益作用相關(guān)聯(lián)。

由于輔助蛋白在其它微生物中的存在，因此，設(shè)想其能夠在廣泛的宿主細(xì)胞中過表達(dá)。因此，輔助蛋白的序列可取自或源自其它原核或真核生物體，而不是采用對(duì)于其種或?qū)俣詾樘烊坏男蛄??？梢詮亩喾N來源，如從植物、昆蟲、真菌或哺乳動(dòng)物物種，優(yōu)選地從酵母綱，優(yōu)選地從酵母目，優(yōu)選地從酵母科，優(yōu)選地從Komagataella屬中獲得編碼輔助蛋白的外源(foreign)DNA序列。

HP1-HP10

特別地，本發(fā)明涉及一種基因修飾的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞能夠過表達(dá)輔助蛋白HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9或HP10或它們的組合，或者HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9或HP10或它們的組合的功能同系物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中設(shè)想了被工程化為反映這種組合的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地將這些宿主細(xì)胞用于本文描述的方法和用途中。該組合包括選自HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9、HP10的2種或更多種，如2、3、4、5、6、7、8或更多種輔助蛋白或功能同系物。

同樣地，該組合包括一種或多種選自HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9、HP10或其功能同系物的輔助蛋白與選自KO1、KO2、KO3的KO蛋白的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中設(shè)想了被工程化為反映這種組合的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地將這些宿主細(xì)胞用于本文描述的方法和用途中?！胺从场笔侵父鶕?jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道輔助蛋白過表達(dá)，而KO蛋白低表達(dá)。

然而，輔助蛋白HP3(SEQ ID NO:2)或其功能同系物與HP1(SEQ ID NO:4)或其功能同系物，或者輔助蛋白HP10(SEQ ID NO:162)或其功能同系物與HP3(SEQ ID NO:2)或其功能同系物的具體組合是優(yōu)選地用于本發(fā)明的方法和用途中的本發(fā)明的宿主細(xì)胞的優(yōu)選的實(shí)施方案。

此外，輔助蛋白HP2(SEQ ID NO:1)或其功能同系物與HP3(SEQ ID NO:2)或其功能同系物和KO蛋白KO1(SEQ ID NO:10)，或者輔助蛋白HP2(SEQ ID NO:1)或其功能同系物與HP1(SEQ ID NO:4)或其功能同系物和KO蛋白KO1(SEQ ID NO:10)的具體組合是優(yōu)選地用于本發(fā)明的方法和用途中的本發(fā)明的宿主細(xì)胞的優(yōu)選的實(shí)施方案。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于制備目標(biāo)蛋白的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，該多核苷酸編碼具有與SEQ ID NO:1具有至少40％的序列同一性、與SEQ ID NO:2具有至少45％的序列同一性、與SEQ ID NO:3具有至少50％的序列同一性、與SEQ ID NO:4具有至少45％的序列同一性、與SEQ ID NO:5具有至少50％的序列同一性、與SEQ ID NO:6具有至少45％的序列同一性、與SEQ ID NO:7具有至少40％的序列同一性、與SEQ ID NO:8具有至少40％的序列同一性、與SEQ ID NO:9具有至少40％的序列同一性或與SEQ ID NO:162具有至少45％的序列同一性的氨基酸的輔助蛋白。這種宿主細(xì)胞用于本文所述的方法和用途中。

目標(biāo)蛋白

本文所用術(shù)語“目標(biāo)蛋白”(POI)是指在宿主細(xì)胞中通過重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白。更具體地，所述蛋白既可以是非天然地存在于宿主細(xì)胞中的多肽，即異源蛋白，也可以是對(duì)于所述宿主細(xì)胞而言天然的，即是宿主細(xì)胞的同源蛋白，但通過例如用含有編碼POI的核酸序列的自我復(fù)制載體的轉(zhuǎn)化、或通過重組技術(shù)將編碼POI的核酸序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝整合至宿主細(xì)胞的基因組、或通過控制編碼POI的基因表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列(如啟動(dòng)子序列)的重組修飾而生產(chǎn)的。一般而言，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組表達(dá)方法生產(chǎn)本文提及的目標(biāo)蛋白。

宿主細(xì)胞

如本文所用，“宿主細(xì)胞”是指一種能夠表達(dá)蛋白和可選地分泌蛋白的細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞用于本發(fā)明的方法。針對(duì)使宿主細(xì)胞表達(dá)一種多肽這一目的，使編碼該多肽的核苷酸序列存在于該細(xì)胞或?qū)⑵湟朐摷?xì)胞。本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞可以是原核生物或真核生物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，原核細(xì)胞無核膜，而真核細(xì)胞具有核膜。真核細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于：脊椎動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、無脊椎動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、線蟲細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、干細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。

酵母細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于：酵母屬(如釀酒酵母、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)、葡萄汁酵母菌(Saccharomyces uvarum))、Komagataella屬(Komagataella pastoris、Komagataella pseudopastoris或Komagataella phaffii)、克魯維酵母屬(如乳酸克魯維酵母、馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus))、假絲酵母屬(如產(chǎn)朊假絲酵母(Candina utilis)、可可假絲酵母(Candida cacaoi))、地霉屬(如，發(fā)酵地霉(Geotrichum fermentans))、以及多形漢森酵母和解脂耶氏酵母。

畢赤酵母屬是特別感興趣的。畢赤酵母屬包含許多種，包括巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)種、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)種、克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)種和安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)種。最優(yōu)選的是巴斯德畢赤酵母種。

已將前種巴斯德畢赤酵母分類并重新命名為Komagataella pastoris和Komagataella phaffii。因此巴斯德畢赤酵母與Komagataella pastoris和Komagataella phaffii是同義詞。

用于本發(fā)明的巴斯德酵母菌株的實(shí)例是X33及其亞型GS115、KM71、KM71H；CBS7435(mut+)及其亞型CBS7435mut^s、CBS7435mut^sΔArg、CBS7435mut^sΔHis、CBS7435mut^sΔArg、ΔHis、CBS7435mut^s PDI⁺、CBS 704(＝NRRL Y-1603＝DSMZ 70382)、CBS 2612(＝NRRL Y-7556)、CBS 9173-9189和DSMZ 70877及其突變體。

大腸桿菌的實(shí)例包括源自大腸桿菌K12菌株的那些，具體為，HMS 174、HMS174(DE3)、NM533、XL1-Blue、C600、DH1、HB101、JM109，以及源自B-菌株的那些，具體為BL-21、BL21(DE3)等。

根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，所述宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)、和Komagataella和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。其也可以是來自玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)的宿主細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述由宿主細(xì)胞表達(dá)的輔助蛋白是來自相同的細(xì)胞或是由相同的種、屬或科的細(xì)胞重組的。如本文所用，“重組(的)”是指通過人為干預(yù)的遺傳材料的改變。通常，重組是指通過分子生物(重組DNA技術(shù))方法(包括克隆和重組)對(duì)病毒、細(xì)胞、質(zhì)?；蜉d體中DNA或RNA的操作。借助參考重組細(xì)胞、多肽或核酸與天然存在的對(duì)應(yīng)物(“野生型”)的區(qū)別來描述重組細(xì)胞、多肽或核酸?！爸亟M細(xì)胞”或“重組宿主細(xì)胞”是指這樣一種細(xì)胞或宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞或宿主細(xì)胞已經(jīng)被遺傳改變從而包含了對(duì)所述細(xì)胞而言為非天然的核酸序列。

本文所用術(shù)語“制備”是指目標(biāo)蛋白表達(dá)的過程?！坝糜谥苽淠繕?biāo)蛋白的宿主細(xì)胞”是指可引入編碼目標(biāo)蛋白的核酸序列的宿主細(xì)胞。本發(fā)明中的重組宿主細(xì)胞并不一定包含編碼目標(biāo)蛋白的核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可以例如在試劑盒中提供所述宿主細(xì)胞，用于將所需核苷酸序列插入該宿主細(xì)胞中。

本文所用術(shù)語“核苷酸序列”或“核酸序列”是指DNA或RNA?！昂怂嵝蛄小被颉岸嗪塑账嵝蛄小被蚝?jiǎn)單地“多核苷酸”是指從5’至3’端讀出的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。其包括自復(fù)制質(zhì)粒、DNA或RNA的感染性聚合物和非功能DNA或RNA。

術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸類似的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物(analog)和氨基酸模擬物(mimetic)。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及之后修飾的那些氨基酸，如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即，將碳連接至氫、羰基、氨基和R基，如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸的甲基锍。這些類似物具有修飾的R基(如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但是保留與天然存在的氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但是以與天然存在的氨基酸類似的方式發(fā)揮功能的化學(xué)化合物。

術(shù)語“多肽”與“蛋白”互換使用。術(shù)語“多肽”是指一種含有兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸，典型地至少3個(gè)，優(yōu)選地至少20個(gè)，更優(yōu)選地至少30個(gè)，諸如至少50個(gè)氨基酸的蛋白或肽。因此，多肽包含氨基酸序列，和因此，有時(shí)包含氨基酸序列的多肽在本文中稱為“包含多肽序列的多肽”。因此，本文中術(shù)語“多肽序列”與術(shù)語“氨基酸序列”互換使用。如所提及的，可通過插入一個(gè)或大于一個(gè)額外的所選輔助蛋白的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，編碼輔助蛋白的多核苷酸可以以每個(gè)細(xì)胞中單一拷貝或多個(gè)拷貝的形式呈現(xiàn)。這些拷貝可以是彼此毗鄰的或彼此遠(yuǎn)離的。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的方法使用編碼輔助蛋白的重組核苷酸序列，所述重組核苷酸序列以每個(gè)細(xì)胞中單一拷貝或多個(gè)拷貝的形式提供在一個(gè)或多個(gè)適于整合入宿主細(xì)胞基因組的質(zhì)粒中。這些拷貝可以是彼此毗鄰的或彼此遠(yuǎn)離的。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過每個(gè)宿主細(xì)胞表達(dá)多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝，如2、3、4、5、6或更多個(gè)所述多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。優(yōu)選地，所述多核苷酸可操作地連接至在宿主細(xì)胞中提供多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。本文所用術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列”是指與基因核酸序列有關(guān)的并調(diào)控該基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。本文所用術(shù)語“翻譯調(diào)控序列”是指與基因核酸序列有關(guān)的并調(diào)控該基因翻譯的核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控序列既可以位于質(zhì)?；蜉d體中，也可以整合至宿主細(xì)胞的染色體。轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控序列可以位于該序列所調(diào)控的基因的相同的核酸分子中。優(yōu)選地，可以通過在每個(gè)宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)編碼HP1或其功能同系物的多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。

優(yōu)選地，可以通過在每個(gè)宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)編碼HP2或其功能同系物的多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。

優(yōu)選地，可以通過在每個(gè)宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)編碼HP3或其功能同系物的多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。

優(yōu)選地，可以通過在每個(gè)宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)編碼HP4或其功能同系物的多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。

優(yōu)選地，可以通過在每個(gè)宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)編碼HP5或其功能同系物的多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。

優(yōu)選地，可以通過在每個(gè)宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)編碼HP6或其功能同系物的多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。

優(yōu)選地，可以通過在每個(gè)宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)編碼HP7或其功能同系物的多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。

優(yōu)選地，可以通過在每個(gè)宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)編碼HP8或其功能同系物的多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。

優(yōu)選地，可以通過在每個(gè)宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)編碼HP9或其功能同系物的多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。

優(yōu)選地，可以通過在每個(gè)宿主細(xì)胞中具有1、2、3、4或更多個(gè)編碼HP10或其功能同系物的多核苷酸的拷貝來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。

優(yōu)選地，將編碼輔助蛋白的多核苷酸和/或編碼POI的多核苷酸整合至宿主細(xì)胞的基因組中。術(shù)語“基因組”通常是指以DNA(或?qū)τ谀承┎《疚锓N以RNA)編碼的生物體的全部遺傳信息?；蚪M可存在于染色體中、質(zhì)?；蜉d體中或兩者兼有。優(yōu)選地，將編碼輔助蛋白的多核苷酸整合至所述細(xì)胞的染色體中。

可以將編碼輔助蛋白或其功能同系物的多核苷酸整合在其天然基因座上?！疤烊换蜃笔侵冈谔囟ㄈ旧w上的位置，其中編碼輔助蛋白的多核苷酸位于例如如表1所示HP1至10的天然基因座。然而，在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在于宿主細(xì)胞的基因組中的編碼輔助蛋白的多核苷酸未在它們的天然基因座上，而是被異位地整合。術(shù)語“異位的整合”是指在微生物基因組中不是其通常染色體基因座的位點(diǎn)的核酸的插入，即預(yù)定的或隨機(jī)的整合?？蛇x地，可以將所述編碼輔助蛋白或其功能同系物的多核苷酸整合在其天然基因座上和異位地整合。

對(duì)于酵母細(xì)胞，可以將編碼輔助蛋白的多核苷酸和/或編碼POI的多核苷酸插入所需的基因位，如AOX1、GAP、ENO1、TEF、HIS4(Zamir等，Proc.NatL Acad.Sci.USA(1981)78(6):3496-3500)、HO(Voth等，Nucleic Acids Res.2001June 15；29(12):e59)、TYR1(Mirisola等，Yeast 2007；24:761–766)、His3、Leu2、Ura3(Taxis等，BioTechniques(2006)40:73-78)、Lys2、ADE2、TRP1、GAL1、ADH1或在5S核糖體RNA基因的整合上。

在其它實(shí)施方案中，可以將編碼輔助蛋白的多核苷酸和/或編碼POI的多核苷酸整合在質(zhì)?；蜉d體中。術(shù)語“質(zhì)粒”和“載體”包括自主復(fù)制的核苷酸序列以及基因組整合的核苷酸序列。技術(shù)人員能夠依據(jù)所使用的宿主細(xì)胞選用適宜的質(zhì)粒或載體。

優(yōu)選地，所述質(zhì)粒是真核表達(dá)載體，優(yōu)選為酵母表達(dá)載體。

質(zhì)?？捎糜谠谶m宜的宿主生物體中克隆的重組核苷酸序列(即重組基因)的轉(zhuǎn)錄和它們mRNA的翻譯。質(zhì)粒還可用于通過本領(lǐng)域已知的方法，如J.Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001)描述的方法，將靶多核苷酸整合至宿主細(xì)胞基因組中?！百|(zhì)?！蓖ǔ０ㄓ糜谠谒拗骷?xì)胞中自主復(fù)制的起點(diǎn)、選擇標(biāo)記、多個(gè)限制性酶切割位點(diǎn)、適宜的啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)錄終止子，所述組份可操作地連接在一起。將編碼多肽的目標(biāo)序列可操作地連接至在宿主細(xì)胞中提供多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。

當(dāng)核酸被置于與相同核酸分子上的另一核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，該核酸是“可操作地連接”的。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠作用于重組基因的編碼序列的表達(dá)時(shí)，該啟動(dòng)子與該重組基因的編碼序列是可操作地連接的。

在每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中，大多數(shù)質(zhì)粒以僅一個(gè)拷貝存在。但是，一些質(zhì)粒以較多拷貝數(shù)存在。例如，對(duì)于大腸桿菌的每條染色體，質(zhì)粒ColE1通常以10至20個(gè)質(zhì)?？截惔嬖?。如果質(zhì)粒中包含本發(fā)明的核苷酸序列，則每個(gè)宿主細(xì)胞中，該質(zhì)?？删哂?0-30、30-100或更多的拷貝數(shù)。使用高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，可以通過細(xì)胞過表達(dá)輔助蛋白。

本領(lǐng)域技術(shù)人員已知大量適宜的質(zhì)?；蜉d體，并且很多質(zhì)?；蜉d體是商購(gòu)可獲得的。Sambrook等編輯，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)，和Ausubel等編輯，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York(1997)提供了適宜的載體的實(shí)例。

本發(fā)明的載體或質(zhì)粒涵蓋包含端粒(telomeric)、著絲粒(centromeric)和復(fù)制的起點(diǎn)(復(fù)制起點(diǎn))序列的酵母人工染色體，所述酵母人工染色體是指可以被遺傳修飾為含有異源DNA序列(如，大到3000kb的DNA序列)的DNA構(gòu)建體。

本發(fā)明的載體或質(zhì)粒還涵蓋包含復(fù)制的起點(diǎn)序列(Ori)并可包含一個(gè)或多個(gè)解旋酶(如parA、parB和parC)的細(xì)菌人工染色體(BAC)，所述細(xì)菌人工染色體是指可以被遺傳修飾為含有異源DNA序列(如，大到300kb的DNA序列)的DNA構(gòu)建體。

將酵母作為宿主的質(zhì)粒的實(shí)例包括YIp型載體、YEp型載體、YRp型載體、YCp型載體、pGPD-2、pAO815、pGAPZ、pGAPZα、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ、pPICZα、pPIC3K、pHWO10、pPUZZLE和2μm質(zhì)粒。這些載體是已知的，并且例如，這些載體描述在Cregg等，Mol Biotechnol.(2000)16(1):23-52中。

將大腸桿菌作為其宿主的質(zhì)粒的實(shí)例包括pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pVC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)和pBluescript KSTM(Stratagene)。適于在大腸桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒的實(shí)例包括pAS、pKK223(Pharmacia)、pMC1403、pMC931和pKC30。

啟動(dòng)子

可通過修飾轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，包括例如提供宿主細(xì)胞中多核苷酸序列表達(dá)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)等等，來實(shí)現(xiàn)重組細(xì)胞中內(nèi)源多肽的過表達(dá)。這種序列特異性地與涉及轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞蛋白相互作用(Maniatis等，Science,236:1237-1245(1987))。示例性序列描述于，例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。

例如，可通過修飾啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)重組細(xì)胞中內(nèi)源性輔助蛋白的過表達(dá)，例如，為了實(shí)現(xiàn)高表達(dá)水平，通過用另一個(gè)更強(qiáng)的啟動(dòng)子替換可操作地連接至輔助蛋白的內(nèi)源性啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的或組成型的?？梢酝ㄟ^采用本領(lǐng)域已知的方法的突變或同源重組來實(shí)施內(nèi)源性啟動(dòng)子的修飾。

可通過本領(lǐng)域已知的其它方法，例如通過如Marx等，2008(Marx,H.,Mattanovich,D.和Sauer,M.Microb Cell Fact 7(2008):23)和Pan等，2011(Pan等，F(xiàn)EMS Yeast Res.(2011)May；(3):292-8.)描述的遺傳修飾輔助蛋白的內(nèi)源性調(diào)控區(qū)域來實(shí)現(xiàn)編碼輔助蛋白的多核苷酸的過表達(dá)，這種方法包括，例如增加輔助蛋白表達(dá)的重組啟動(dòng)子的整合。轉(zhuǎn)化描述于Cregg等，(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376-3385?！爸亟M”啟動(dòng)子是指針對(duì)其驅(qū)動(dòng)表達(dá)的序列。如本文所用，重組啟動(dòng)子的含義是，當(dāng)該啟動(dòng)子對(duì)于給定序列而言不是天然啟動(dòng)子時(shí)，即，當(dāng)該啟動(dòng)子與天然存在的啟動(dòng)子(“天然啟動(dòng)子”)不同時(shí)。有時(shí)這種啟動(dòng)子在本文中還稱為異源啟動(dòng)子。

文本所用術(shù)語“啟動(dòng)子”是指有助于特定基因轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。與無啟動(dòng)子存在時(shí)所表達(dá)的重組產(chǎn)物的量相比，啟動(dòng)子通常使從核苷酸序列表達(dá)的重組產(chǎn)物的量增加?？衫迷醋砸粋€(gè)生物體的啟動(dòng)子來增強(qiáng)從源自另一生物體的序列的重組產(chǎn)物表達(dá)?？梢酝ㄟ^采用本領(lǐng)域已知的方法的同源重組來將啟動(dòng)子整合至宿主細(xì)胞染色體中(如，Datsenko等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97(12):6640-6645(2000))。此外，一個(gè)啟動(dòng)子元件能夠增加串聯(lián)連接的多條序列所表達(dá)的產(chǎn)物的量。因此，一個(gè)啟動(dòng)子元件能夠增強(qiáng)一種或多種重組產(chǎn)物的表達(dá)。

可以通過啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率來評(píng)估啟動(dòng)子活性。可通過測(cè)量從該啟動(dòng)子的mRNA轉(zhuǎn)錄的量來直接地測(cè)定啟動(dòng)子活性，如通過RNA印跡法、定量PCR，或通過測(cè)量自該啟動(dòng)子表達(dá)的基因產(chǎn)物的量來間接地測(cè)定啟動(dòng)子活性。

啟動(dòng)子可以是“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”或“組成型啟動(dòng)子”?！罢T導(dǎo)型啟動(dòng)子”是指可以被某些因子的存在或缺少誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，“組成型啟動(dòng)子”是指允許啟動(dòng)子的一種或多種相關(guān)基因連續(xù)轉(zhuǎn)錄的不受調(diào)控的啟動(dòng)子。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼輔助蛋白和POI的核苷酸序列都被誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼輔助蛋白和POI的核苷酸序列都被組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼輔助蛋白的核苷酸序列被組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，編碼POI的核苷酸序列被誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼輔助蛋白的核苷酸序列被誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，編碼POI的核苷酸序列被組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。例如，HP可以被組成型GAP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，POI可以被誘導(dǎo)型AOX1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼輔助蛋白和POI的核苷酸序列被相同啟動(dòng)子或就啟動(dòng)子活性和/或表達(dá)行為而言的相似啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

本領(lǐng)域已知很多誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在Gatz,Curr.Op.Biotech.,7:168(1996)(還參見Gatz,Ann.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol.,48:89(1997))的綜述中描述了許多誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。實(shí)例包括四環(huán)素抑制子系統(tǒng)(tetracycline repressor system)、Lac抑制子系統(tǒng)、銅誘導(dǎo)系統(tǒng)、水楊酸誘導(dǎo)系統(tǒng)(如PR1系統(tǒng))、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型(Aoyama等，1997)、醇誘導(dǎo)系統(tǒng)(如AOX啟動(dòng)子)和蛻皮激素誘導(dǎo)系統(tǒng)(ecdysome-inducible system)。還包括苯磺酰胺誘導(dǎo)型(美國(guó)專利No.5,364,780)和醇誘導(dǎo)型系統(tǒng)(WO 97/06269和WO 97/06268)以及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子。

在Mattanovich等，Methods Mol.Biol.(2012)824:329-58中描述了與酵母宿主細(xì)胞一起使用的適宜的啟動(dòng)子序列，包括如磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH或GAP)的糖酵解酶及其變體、乳糖酶(LAC)和半乳糖苷酶(GAL)、巴斯德酵母(P.pastoris)葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶啟動(dòng)子(PPGI)、3-磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(PPGK)、甘油醛磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(PGAP)、翻譯延伸因子啟動(dòng)子(PTEF)和巴斯德酵母烯醇酶1啟動(dòng)子(PENO1)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(PTPI)、核糖體亞基蛋白(PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1)、醇氧化酶啟動(dòng)子(PAOX)或其具有修飾特性的變體、甲醛脫氫酶啟動(dòng)子(PFLD)、異檸檬酸裂合酶啟動(dòng)子(PICL)、α-酮異己酸脫羧酶啟動(dòng)子(PTHI)、熱休克蛋白家族成員的啟動(dòng)子(PSSA1、PHSP90、PKAR2)、6-磷酸葡糖酸脫氫酶(PGND1)、磷酸甘油酸變位酶(PGPM1)、轉(zhuǎn)酮酶(PTKL1)、磷脂酰肌醇合成酶(PPIS1)、鐵-O2-氧化還原酶(ferro-O2-oxidoreductase)(PFET3)、高親和力鐵通透酶(PFTR1)、抑制性堿性磷酸酶(PPHO8)、N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶(PNMT1)、信息素應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子(PMCM1)、泛素(PUBI4)、單鏈DNA核酸內(nèi)切酶(PRAD2)、線粒體內(nèi)膜的主要ADF/ATP載體的啟動(dòng)子(PPET9)(WO2008/128701)和甲酸脫氫酶(FMD)啟動(dòng)子。GAP啟動(dòng)子、AOX啟動(dòng)子或源自GAP或AOX啟動(dòng)子的啟動(dòng)子是特別優(yōu)選的。AOX啟動(dòng)子可被甲醇誘導(dǎo)和例如被葡萄糖抑制。

適宜的啟動(dòng)子的進(jìn)一步實(shí)例包括釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)、和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、和麥芽糖酶基因啟動(dòng)子(MAL)。

Romanos等，1992,Yeast 8:423-488描述了酵母宿主細(xì)胞的其它有用啟動(dòng)子。

與大腸桿菌一起使用的適宜的啟動(dòng)子序列包括質(zhì)粒中的T7啟動(dòng)子、T5啟動(dòng)子、色氨酸(trp)啟動(dòng)子、乳糖(lac)啟動(dòng)子、色氨酸/乳糖(tac)啟動(dòng)子、脂蛋白(lpp)啟動(dòng)子和λ噬菌體PL啟動(dòng)子。

優(yōu)選地，相對(duì)于輔助基因的啟動(dòng)子而言，驅(qū)動(dòng)編碼輔助蛋白的多核苷酸表達(dá)的啟動(dòng)子不是內(nèi)源性的。優(yōu)選地，采用重組啟動(dòng)子而不是輔助蛋白基因的內(nèi)源性啟動(dòng)子。

增強(qiáng)子

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過采用增強(qiáng)子來增強(qiáng)驅(qū)動(dòng)輔助蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子活性來實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子相對(duì)不依賴于方向和位置，已在轉(zhuǎn)錄單位的5’和3’、內(nèi)含子中以及其自身的編碼序列中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以在編碼序列的5’或3’位置被剪接入表達(dá)載體，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5’位。大多數(shù)酵母基因含有僅一個(gè)UAS，其通常位于帽位的幾百個(gè)堿基對(duì)中，并且當(dāng)位于啟動(dòng)子的3’時(shí)，大多數(shù)酵母增強(qiáng)子(UAS)無法發(fā)揮功能，但是高等真核生物中的增強(qiáng)子在啟動(dòng)子的5’和3’都能發(fā)揮功能。

目前已知很多增強(qiáng)子序列來自于哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、RSV、SV40、EMC、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素)。人們也可使用來自于真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子，如SV40晚期增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。酵母增強(qiáng)子，也稱為上游激活序列(UAS)，如來自于釀酒酵母的UAS/Gal系統(tǒng)，可有利地與酵母啟動(dòng)子一起使用(描述于歐洲專利No.0317254和Rudoni等，TheInternational Journal of Biochemistry and Cell Biology,(2000),32(2):215-224)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的2、3、4、5、6、7、8、9或更多類型的輔助蛋白過表達(dá)。例如，宿主細(xì)胞可被工程化為過表達(dá)2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162或其功能同系物的輔助蛋白，其中其功能同系物具有與SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162具有至少30％的序列同一性的氨基酸。

目標(biāo)蛋白

設(shè)想可以將宿主細(xì)胞培養(yǎng)在對(duì)于輔助蛋白和目標(biāo)蛋白的共表達(dá)適宜的條件下，該宿主細(xì)胞將表達(dá)目標(biāo)蛋白并過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的輔助蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

本文所用術(shù)語“目標(biāo)蛋白”(POI)是指在宿主細(xì)胞中通過重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白。更具體地，所述蛋白既可以是非天然地存在于宿主細(xì)胞中的多肽，即異源蛋白，也可以是對(duì)于所述宿主細(xì)胞而言天然的，即是宿主細(xì)胞的同源蛋白，但通過例如用含有編碼POI的核酸序列的自我復(fù)制載體的轉(zhuǎn)化、或通過重組技術(shù)將編碼POI的核酸序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝整合至宿主細(xì)胞的基因組、或通過控制編碼POI的基因表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列(如啟動(dòng)子序列)的重組修飾而生產(chǎn)的。一般而言，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組表達(dá)方法生產(chǎn)本文提及的目標(biāo)蛋白。

本文對(duì)目標(biāo)蛋白(POI)沒有限制。通常，POI是真核或原核多肽，其變體或衍生物。POI可以是任何真核或原核蛋白。Schmidt,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2004),65:363-372或Kirk等，Curr.Opin.Biotechnol.(2002),13:345-351中描述了POI的實(shí)例。Schmidt的表1和表2中以及Kirk等的表1中提到的任何蛋白都涵蓋在本文所用術(shù)語“POI”中。所述蛋白可以是天然分泌蛋白，也可以是細(xì)胞內(nèi)蛋白(即非天然分泌的蛋白)。本發(fā)明還包括蛋白的生物活性片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，POI可以是氨基酸鏈或以復(fù)合物如二聚體、三聚體、異-二聚體、多聚體或寡聚體存在。

目標(biāo)蛋白可以是用作營(yíng)養(yǎng)的、膳食的(dietary)、消化的、補(bǔ)充劑的蛋白，如用在食品、飼料或化妝品中。所述食品可以是，例如，肉湯、甜點(diǎn)、谷物棒、糕餅(confectionery)、運(yùn)動(dòng)飲料、膳食產(chǎn)品或其他營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品。優(yōu)選地，所述目標(biāo)蛋白是食品添加劑。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白可用在動(dòng)物飼料中。所述POI可以是如真菌毒素(mycotoxin)降解酶的解毒酶。解毒酶是指分解毒素，如降低其毒性的酶。真菌毒素是由容易定殖于作物的真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，并且真菌毒素經(jīng)常以能夠傷害作物并引起人和動(dòng)物的健康難題為特征。真菌毒素降解酶包括黃曲霉毒素降解酶、玉米赤霉烯酮酯酶(zearalenone esterase)、玉米赤霉烯酮內(nèi)酯酶(zearalenone lactonase)、玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase)、伏馬菌素羧酸酯酶(fumonisin carboxylesterase)、伏馬菌素轉(zhuǎn)氨酶(fumonisin aminotransferase)、氨基多元醇胺氧化酶(aminopolyol amine oxidase)、脫氧雪腐鐮刀菌醇環(huán)氧化物水解酶(deoxynivalenol expoxide hydrolase)。所述POI還可以是降解赭曲霉毒素衍生物或麥角生物堿的酶。赭曲霉毒素是由曲霉或青霉家族的幾種真菌作為次級(jí)代謝產(chǎn)物而產(chǎn)生的一組霉菌毒素，是由異香豆素的衍生物組成的弱有機(jī)酸。有三種公認(rèn)的赭曲霉毒素，指定為A、B和C。赭曲霉毒素A是赭曲霉毒素家族最豐富的成員，并且因此是最常檢測(cè)到的，但也是毒性最大的。赭曲霉毒素A(ochratoxin A)是存在于谷物及其它富含淀粉的食物中的腎毒性、致畸性、肝毒性和致癌性霉菌毒素。麥角生物堿是含有酰胺鍵的化合物，并包括，例如，麥角柯寧堿(ergocornine)、麥角異柯寧堿(ergocorninine)、麥角克堿(ergocristine)、麥角異克堿(ergocristinine)、麥角隱亭(ergocryptine)、麥角隱寧堿(ergocryptinine)、麥角新堿(ergometrine)、麥角辛(ergosine)、麥角胺(ergotamine)和麥角異胺(ergotaminine)。這些化合物對(duì)包括人和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物的活的生物體是有毒性的。這些酶的實(shí)例包括赭曲霉毒素酰胺酶、麥角胺水解酶、麥角胺淀粉酶。動(dòng)物飼料中的真菌毒素降解酶對(duì)控制飼料的真菌毒素污染是有用的。

POI的進(jìn)一步實(shí)例包括抗微生物蛋白，如乳鐵蛋白、溶菌酶、乳鐵素(lactoferricin)、lactohedrin、κ-酪蛋白、咕啉結(jié)合蛋白(haptocorrin)、乳過氧化物酶、牛奶蛋白、急性期蛋白(例如在生產(chǎn)動(dòng)物中響應(yīng)感染而正常產(chǎn)生的蛋白)和如溶菌酶和乳鐵蛋白的小抗微生物蛋白。其它實(shí)例包括抗菌蛋白、抗病毒蛋白、急性期蛋白(在生產(chǎn)動(dòng)物中響應(yīng)感染而誘導(dǎo)的)、益生菌蛋白、抑菌蛋白和陽離子抗微生物蛋白。

“飼料”是指旨在或適合用于非人動(dòng)物食用、攝入、消化的任何天然或人工飲食、膳食等或這些膳食的組份?！帮暳咸砑觿蓖ǔＪ侵柑砑釉陲暳现械奈镔|(zhì)。飼料添加劑通常包括如維生素、礦物質(zhì)、酶和合適的載體和/或賦形劑的一種或多種化合物。對(duì)于本發(fā)明而言，食品添加劑可以是酶或其它蛋白?？捎米黠暳咸砑觿┑拿傅膶?shí)例包括植酸酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶?！笆称贰笔侵钢荚诨蜻m合用于人食用、攝入、消化的任何天然或人工飲食膳食等或這些膳食的組份。

“食品添加劑”通常是指添加在食物中的物質(zhì)。食品添加劑通常包括如維生素、礦物質(zhì)、酶和合適的載體和/或賦形劑的一種或多種化合物。對(duì)于本發(fā)明而言，食品添加劑可以是酶或其他蛋白質(zhì)?？捎米魇称诽砑觿┑拿傅膶?shí)例包括蛋白酶、脂酶、乳糖酶、果膠甲基酯酶(pectin methyl esterase)、果膠酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、乙酰乳酸脫羧酶和漆酶。

在一些實(shí)施方案中，所述食品添加劑是抗微生物蛋白，所述抗微生物蛋白包括：例如，(i)抗微生物牛奶蛋白(人或非人)乳鐵蛋白、溶菌酶、乳鐵素(lactoferricin)、lactohedrin、κ-酪蛋白、咕啉結(jié)合蛋白(haptocorrin)、乳過氧化物酶、α-1-抗胰蛋白酶和如IgA的免疫球蛋白；(ii)急性期蛋白，如C-反應(yīng)蛋白(CRP)、乳鐵蛋白、溶菌酶、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白(Hp)、補(bǔ)體(complement)2-9(特別是補(bǔ)體-3)、血清粘蛋白、銅藍(lán)血漿蛋白(Cp)、15-酮-13,14-二氫-前列腺素F2α(PGFM)、纖維素原(Fb)、α(1)-酸性糖蛋白(AGP)、α(1)-抗胰蛋白酶、甘露糖結(jié)合蛋白、脂多糖結(jié)合蛋白(lipoplysaccharide binding protein)、α-2巨球蛋白和各種防御素；(iii)抗微生物肽，如殺菌肽、爪蟾抗菌肽(magainin)、防御素、速普肽(tachyplesin)、parasin l.buforin I、PMAP-23、moronecidin、anoplin、gambicin和SAMP-29；和(iv)其它抗微生物蛋白，包括CAP37、粒溶蛋白、分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制劑、CAP18、ubiquicidin、?？刮⑸锏鞍?1、Ace-AMP1、速普肽(tachyplesin)、大防御素(big defensin)、Ac-AMP2、Ah-AMP1和CAP18。

酶：

POI可以是酶。優(yōu)選的酶是可用于如制備洗滌劑、淀粉、燃料、紡織品、紙漿和紙、油、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品，或烘烤、有機(jī)合成等工業(yè)應(yīng)用的那些。這些酶的實(shí)例包括用于污漬去除和清潔的蛋白酶、淀粉酶、脂酶、甘露聚糖酶和纖維素酶(cellulose)；用于淀粉液化和糖化的支鏈淀粉酶淀粉酶和淀粉葡糖苷酶；用于葡萄糖向果糖轉(zhuǎn)化的葡萄糖異構(gòu)酶；用于環(huán)糊精生產(chǎn)的環(huán)糊精-糖基轉(zhuǎn)移酶；用于燃料和淀粉中粘度降低(xiscosity reduction)的木聚糖酶；用于烘烤中面團(tuán)的穩(wěn)定性和調(diào)整的淀粉酶、木聚糖酶、脂酶、磷脂酶、葡萄糖酶(glucose)、氧化酶、脂氧合酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶；在紡織品制備中用于牛仔布整理和棉花軟化的纖維素酶；用于紡織品的脫漿的淀粉酶；用于精練的果膠裂解酶；用于漂白終止的過氧化氫酶；用于漂白的漆酶；用于過量染料去除的過氧化物酶；用在紙漿和紙制造中的脂酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶(cellulose)；用于酯交換反應(yīng)的脂酶和用于脂肪和油的脂肪加工時(shí)脫膠的磷脂酶；用于有機(jī)合成中手性醇和酰胺的分辨的脂酶；用于半合成青霉素的合成的?；D(zhuǎn)移酶，用于對(duì)應(yīng)異構(gòu)體羧酸的合成的腈水解酶；用于皮革生產(chǎn)的蛋白酶和脂酶；用于制備個(gè)人護(hù)膚品的淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶和過氧化物酶(參見Kirk等，Current Opinion in Biotechnology(2002)13:345-351)。

治療性蛋白

POI可以是治療性蛋白。如本文更詳細(xì)的描述，POI可以是但不限于，適合作為如抗體或抗體片段、生長(zhǎng)因子、激素、酶、疫苗等的生物制藥物質(zhì)的蛋白。

所述POI可以是天然分泌的蛋白或細(xì)胞內(nèi)蛋白(即非天然分泌的蛋白)。本發(fā)明還提供天然分泌或非天然分泌的蛋白的功能同系物、功能等價(jià)變體、衍生物和生物活性片段的重組生產(chǎn)。優(yōu)選地，功能同系物是與序列相同或相應(yīng)的并具有序列的功能特征。

所述POI可以與天然蛋白結(jié)構(gòu)類似，和可以通過在C-和/或N-末端或者天然蛋白的側(cè)鏈上添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在天然氨基酸序列上置換一個(gè)或數(shù)個(gè)不同位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在天然蛋白的任一個(gè)或兩個(gè)末端或者在氨基酸序列的一個(gè)或若干位點(diǎn)上缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或在天然氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，從天然蛋白質(zhì)衍生。上述若干蛋白質(zhì)的這些修飾是熟知的。

優(yōu)選地，所述目標(biāo)蛋白是哺乳動(dòng)物多肽，或甚至更優(yōu)選地是人多肽。特別優(yōu)選的治療性蛋白是指可施用于哺乳動(dòng)物的任何多肽、蛋白、蛋白質(zhì)變體、融合蛋白和/或其片段。設(shè)想但不是必須的，根據(jù)本發(fā)明的治療性蛋白是細(xì)胞異源的?？赏ㄟ^本發(fā)明的細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白的實(shí)例是但不限于，酶、調(diào)控蛋白、受體、肽激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、支架結(jié)合蛋白(如anticalin)、結(jié)構(gòu)蛋白、淋巴因子、粘附分子、受體、膜或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，和可作為激動(dòng)劑或拮抗劑和/或具有治療或診斷用途的任何其他多肽。此外，所述目標(biāo)蛋白可以是用于接種的抗原、疫苗、抗原結(jié)合蛋白、免疫刺激蛋白。其還可以是可包括本領(lǐng)域已知的任何合適的抗原結(jié)合抗體片段的抗體的抗原結(jié)合片段。例如，抗體片段可包括但不限于：Fv(一種包含VL和VH的分子)、單鏈Fv(scFV)(一種包含由肽連接子連接的VL和VH的分子)、Fab、Fab'、F(ab')₂、單結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb)(包含單可變結(jié)構(gòu)域和3CDR的分子)和他們的多價(jià)呈現(xiàn)形式(presentation)。所述抗體或其片段可以是鼠、人、人源化或嵌合的抗體或其片段。治療性蛋白的實(shí)例包括抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體、抗體片段，如Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、di-scFv、bi-scFv、串聯(lián)scFv、雙特異性串聯(lián)scFv、sdAb、納米抗體、V_H和V_L，或人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、IgA抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgG抗體、IgM抗體、胞內(nèi)抗體、微抗體或單抗體(monobody)。

這些治療性蛋白包括但不限于：胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、hGH、tPA、細(xì)胞因子，例如如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18的白細(xì)胞介素、干擾素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω或IFNτ、腫瘤壞死因子(TNF)TNFα和TNFβ、TRAIL；G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1和VEGF。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白是抗體。術(shù)語“抗體”旨在包括含有具有適合并識(shí)別表位的特異性形狀的分子結(jié)構(gòu)的任何多肽鏈，其中一個(gè)或多個(gè)非共價(jià)結(jié)合相互作用穩(wěn)定該分子結(jié)構(gòu)與所述表位之間的復(fù)合物。原型的抗體分子是免疫球蛋白，且來自所有來源(如人、嚙齒動(dòng)物、兔、牛、羊、豬、狗、其它哺乳動(dòng)物、雞、其它禽類等)的所有類型的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)都被認(rèn)為是“抗體”。已經(jīng)描述了多個(gè)編碼抗體的序列；其它抗體可通過本領(lǐng)域熟知的方法提出。

例如，可通過本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)抗體或抗原結(jié)合片段。通?？贵w生產(chǎn)細(xì)胞對(duì)所需抗原或免疫原敏感。從抗體生產(chǎn)細(xì)胞中分離的信使RNA用作采用PCR擴(kuò)增制備cDNA的模板。通過將擴(kuò)增的免疫球蛋白cDNA的合適區(qū)段插入表達(dá)載體中來生產(chǎn)載體文庫(kù)，其中每一個(gè)載體含有保留了原始抗原特異性的一個(gè)重鏈基因和一個(gè)輕鏈基因。通過將重鏈基因文庫(kù)與輕鏈基因文庫(kù)組合構(gòu)建組合文庫(kù)。這得到了共表達(dá)重鏈和輕鏈(類似于抗體分子的Fab片段或抗原結(jié)合片段)的克隆文庫(kù)。將攜帶這些基因的載體共轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞。當(dāng)在轉(zhuǎn)染的宿主中誘導(dǎo)抗體基因合成時(shí)，所述重鏈和輕鏈蛋白自組裝以生產(chǎn)能夠通過用抗原或免疫原篩選而檢測(cè)的活性抗體。

編碼抗體的目標(biāo)序列包括由天然序列編碼的那些，以及借助于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性在序列上與已公開的核酸不同的核酸和它們的變體。變體多肽可包括氨基酸(aa)置換、添加或缺失。所述氨基酸置換可以是保守性氨基酸置換或消除非必須氨基酸的置換，例如以改變糖基化位點(diǎn)，或通過置換或缺失一個(gè)或多個(gè)對(duì)功能而言非必需的半胱氨酸殘基來使錯(cuò)誤折疊最少?？蓪?duì)變體進(jìn)行設(shè)計(jì)從而使其保留或具有蛋白特定區(qū)域(如，功能結(jié)構(gòu)域、起催化作用的氨基酸殘基等)的增強(qiáng)的生物活性。變體還包括本文所公開的多肽的片段，特別是生物活性片段和/或?qū)?yīng)于功能結(jié)構(gòu)域的片段。克隆基因的體外誘變技術(shù)是已知的。本發(fā)明的主題還包括采用一般分子生物技術(shù)修飾從而改善了它們對(duì)蛋白質(zhì)降解的抵抗的或優(yōu)化了溶解性能的或使它們更適合作為治療劑的多肽。

可通過將可變輕鏈和重鏈區(qū)(VK和VH)組合的重組方式來制備嵌合的抗體，所述可變輕鏈和重鏈區(qū)從一個(gè)物種的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中獲得，而恒定輕鏈和重鏈區(qū)來自另一物種。通常，為了生產(chǎn)主要是人結(jié)構(gòu)域的抗體，嵌合的抗體利用嚙齒動(dòng)物或兔可變區(qū)和人恒定區(qū)。這些嵌合的抗體的生產(chǎn)是本領(lǐng)域熟知的，并且可通過標(biāo)準(zhǔn)手段實(shí)現(xiàn)(如，例如在美國(guó)專利No.5,624,659中所描述的)。

人源化抗體被工程化為含有甚至更多人樣免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，并僅結(jié)合(incorporate)動(dòng)物來源抗體的互補(bǔ)決定區(qū)。這一過程通過仔細(xì)檢查單克隆抗體的可變區(qū)的高變環(huán)序列，并使這些高變環(huán)序列與人抗體鏈的結(jié)構(gòu)相裝配來完成。盡管從表面上看是復(fù)雜的，但是這一過程已被直接實(shí)踐。參見例如美國(guó)專利No.6,187,287。

除了完整的免疫球蛋白(或它們的重組對(duì)應(yīng)物)，可合成包含表位結(jié)合位點(diǎn)(如Fab’、F(ab’)2或其他片段)的免疫球蛋白片段。可利用重組免疫球蛋白技術(shù)設(shè)計(jì)“片段”或最小免疫球蛋白。比如可通過合成可變輕鏈區(qū)和可變重鏈區(qū)生產(chǎn)本發(fā)明所用的“Fv”免疫球蛋白。還對(duì)抗體的組合感興趣，如包含兩個(gè)不同F(xiàn)v特異性的雙抗體。

可在翻譯后修飾免疫球蛋白，如添加化學(xué)連接子、可檢測(cè)部分(例如熒光染料)、酶、作用物(substrate)、化學(xué)發(fā)光部分等，或在本發(fā)明的方法和組合物中使用特異性結(jié)合部分，例如鏈霉親和素、抗生物素蛋白或生物素等。

治療性蛋白的進(jìn)一步實(shí)例包括凝血因子(VII、VIII、IX)、鐮刀菌屬堿性蛋白酶、降鈣素、CD4受體達(dá)貝泊汀(darbepoetin)、DNA酶(囊性纖維化)、促紅細(xì)胞生成素、eutropin(人生長(zhǎng)激素衍生物)、促卵泡激素(促濾泡素)、明膠、胰高血糖素、葡糖腦苷脂酶(戈謝病)、源自黑曲霉(A.niger)的葡糖淀粉酶、源自黑曲霉的葡萄糖氧化酶、促性腺激素、生長(zhǎng)因子(GCSF、GMCSF)、生長(zhǎng)激素(生長(zhǎng)激素(somatotropine))、乙肝疫苗、水蛭素、人抗體片段、人載脂蛋白AI、人降鈣素前體、人膠原酶IV、人表皮生長(zhǎng)因子、人胰島素樣生長(zhǎng)因子、人白細(xì)胞介素6、人層粘連蛋白、人前脫脂蛋白AI、人血清白蛋白胰島素、胰島素和突變蛋白、胰島素、干擾素α和突變蛋白、干擾素β、干擾素γ(突變蛋白)、白細(xì)胞介素2、促黃體生成激素、單克隆抗體5T4、小鼠膠原蛋白、OP-1(成骨的，神經(jīng)保護(hù)因子)、奧普瑞白介素(白細(xì)胞介素11-激動(dòng)劑)、有機(jī)磷酸水解酶(organophosphohydrolase)、PDGF-激動(dòng)劑、肌醇六磷酸酶、血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)、重組血纖溶酶原激活劑G、葡萄球菌激酶、干細(xì)胞因子、破傷風(fēng)毒素片段C、組織型纖溶酶原激活物和腫瘤壞死因子(參見Schmidt,Appl Microbiol Biotechnol(2004)65:363-372)。

前導(dǎo)序列

可將目標(biāo)蛋白與引發(fā)POI自宿主細(xì)胞中分泌的前導(dǎo)序列連接。當(dāng)旨在重組表達(dá)和分泌的POI是這樣一種蛋白時(shí)，即其是非天然分泌的并因此缺乏天然分泌前導(dǎo)序列，或其核苷酸序列已經(jīng)被克隆而不含其天然分泌前導(dǎo)序列時(shí)，使所述分泌前導(dǎo)序列存在于表達(dá)載體中是必須的。一般而言，任何對(duì)引發(fā)POI自宿主細(xì)胞中分泌有效的分泌前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明中。所述分泌前導(dǎo)序列可以來自于酵母源(如來自如釀酒酵母的MFa的酵母α-因子，或酵母磷酸酶)，來自于哺乳動(dòng)物或植物源，或其它。對(duì)技術(shù)人員而言，適宜的分泌前導(dǎo)序列的選擇是顯而易見的。可選地，可以在將核苷酸序列克隆在表達(dá)載體中之前，通過技術(shù)人員已知的常規(guī)克隆技術(shù)，將所述分泌前導(dǎo)序列融合至編碼旨在重組表達(dá)的POI的核苷酸序列，或者將包含天然分泌前導(dǎo)序列的編碼POI的核苷酸序列克隆在表達(dá)載體中。在這些情況下，無需使表達(dá)載體中存在分泌前導(dǎo)序列。

也可以以每個(gè)細(xì)胞單一拷貝或多拷貝形式在一個(gè)或多個(gè)自主復(fù)制質(zhì)粒中提供所述編碼一種或多種POI的重組核苷酸序列，以及編碼輔助蛋白的重組核苷酸序列。

可選地，所述編碼POI的重組核苷酸序列和編碼輔助蛋白的重組核苷酸序列以每個(gè)細(xì)胞單一拷貝或多拷貝的形式存在于相同質(zhì)粒中。

KO蛋白的低表達(dá)

發(fā)明人還鑒定了幾種所觀察到的表達(dá)對(duì)自宿主細(xì)胞中POI的產(chǎn)量具有負(fù)面作用的蛋白(本文稱為敲除(KO)蛋白，包括KO1、KO2、KO3及其功能同系物)。KO蛋白是指具有SEQ ID NO 10、11或12的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO 10、11或12的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，編碼KO蛋白的基因的修飾(如突變或缺失)能夠增加POI的產(chǎn)量。這一發(fā)現(xiàn)提供了通過將宿主細(xì)胞工程化為使得其低表達(dá)由發(fā)明人鑒定的基因來可用于進(jìn)一步改善POI產(chǎn)量的方法和材料。若宿主細(xì)胞中存在KO1、KO2、KO3基因或功能同系物，則可將它們進(jìn)行修飾以改善POI的產(chǎn)量?；诒疚奶峁┑男蛄?，可采用本領(lǐng)域已知的任何方法來鑒定KO蛋白的存在。

所述蛋白列于表2：

表2

優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞可被工程化為低表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有示于SEQ ID NO 10、11或12的氨基酸序列或其功能同系物的KO蛋白，其中所述功能同系物與示于SEQ ID NO 10、11或12的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。例如，所述宿主細(xì)胞被工程化為低表達(dá)多核苷酸，該多核苷酸編碼具有與示于SEQ ID NO 10的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的蛋白質(zhì)。例如，所述宿主細(xì)胞可被工程化為低表達(dá)多核苷酸，該多核苷酸編碼具有與示于SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的蛋白質(zhì)。例如，所述宿主細(xì)胞可被工程化為低表達(dá)多核苷酸，該多核苷酸編碼具有與示于SEQ ID NO 12的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，與工程化為低表達(dá)KO蛋白之前的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)?shù)捅磉_(dá)KO1、KO2和/或KO3時(shí)，宿主細(xì)胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量可以增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或至少300％。

術(shù)語“低表達(dá)”通常是指小于參考標(biāo)準(zhǔn)顯示的表達(dá)水平的任何量，所述參考標(biāo)準(zhǔn)是工程化為低表達(dá)KO蛋白之前的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的術(shù)語“低表達(dá)(的)”是指基因產(chǎn)物或多肽以小于宿主細(xì)胞遺傳改變之前的或未經(jīng)遺傳改變的可比宿主中的相同基因產(chǎn)物或多肽的表達(dá)的水平表達(dá)。所述術(shù)語“低表達(dá)”還涵蓋基因產(chǎn)物或多肽的無表達(dá)。

可通過阻止KO1、KO2和KO3或其功能同系物中一個(gè)或多個(gè)的功能表達(dá)的任何方法來實(shí)施低表達(dá)。低表達(dá)的結(jié)果是不能發(fā)揮其功能。低表達(dá)的手段可包括基因沉默(如，RNAi基因反義)、敲除、改變表達(dá)水平、改變表達(dá)形式、通過誘變基因序列、破壞(disrupt)序列、插入、添加、突變、修飾表達(dá)調(diào)控序列等。

優(yōu)選地，通過敲除宿主細(xì)胞中編碼KO蛋白的多核苷酸來實(shí)現(xiàn)低表達(dá)?？赏ㄟ^缺失全部或部分編碼序列來敲除基因。本領(lǐng)域已知使基因敲除的方法，如參見Kuhn和Wurst(Eds.)Gene Knockout Protocols(Methods in Molecular Biology)Humana Press(March 27,2009)。還可通過移除所述基因序列的部分或全部來敲除基因?？蛇x地，通過如抗性基因的核苷酸序列的插入來敲除或滅活基因?？蛇x地，通過滅活基因的啟動(dòng)子可使該基因敲除或滅活。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過破壞宿主細(xì)胞中編碼所述基因的多核苷酸來實(shí)現(xiàn)低表達(dá)。

“破壞”是一種在核苷酸或氨基酸序列中的改變，與破壞之前的原始序列相比，其導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的添加、缺失或置換。

“插入”或“添加”是一種在核酸或氨基酸序列中的改變，與破壞之前的原始序列相比，所述核酸或氨基酸序列中加入了一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基。

“缺失”定義為一種在核苷酸或氨基酸序列中的改變，在所述核苷酸或氨基酸序列中相應(yīng)地移除(即，缺失)了一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基。缺失涵蓋了全部序列的缺失、所述編碼序列的部分的缺失或者單一核苷酸或氨基酸殘基的缺失。

“置換”通常是指核苷酸或氨基酸殘基被其它核苷酸或氨基酸殘基替代。可通過定點(diǎn)突變、隨機(jī)突變的產(chǎn)生和缺口雙鏈體方法(gapped-duplex approach)(參見，如美國(guó)專利No.4,760,025；Moring等，Biotech.(1984)2:646；和Kramer等，Nucleic Acids Res.,(1984)12:9441)來實(shí)施“置換”。

優(yōu)選地，破壞導(dǎo)致了移碼突變、早期終止密碼(early stop codon)、關(guān)鍵殘基的點(diǎn)突變、無義的翻譯或其它非功能蛋白產(chǎn)物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過破壞可操作地與所述多肽連接的啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)低表達(dá)。啟動(dòng)子指導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄。所述啟動(dòng)子是必須的，其與其他表達(dá)控制序列如增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強(qiáng)子或激活子序列一起表達(dá)給定基因。因此，還可以破壞任何所述表達(dá)控制序列以阻礙所述多肽的表達(dá)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)來實(shí)現(xiàn)低表達(dá)。作為本領(lǐng)域常用的技術(shù)，PTGS通過異源RNA序列(對(duì)需要破壞的基因而言，往往是反義的)的表達(dá)降低基因的表達(dá)水平(Lechtreck等，J.Cell Sci(2002).115:1511-1522；Smith等，Nature(2000).407:319-320；Furhmann等，J.Cell Sci(2001).114:3857-3863；Rohr等，Plant J(2004).40(4):611-21)。

可通過本領(lǐng)域已知的減少基因表達(dá)的任何技術(shù)來實(shí)現(xiàn)“低表達(dá)”。例如，與所述多肽可操作地連接的啟動(dòng)子可被具有較低啟動(dòng)子活性的另一啟動(dòng)子替代?？梢酝ㄟ^啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率來評(píng)估啟動(dòng)子活性?？赏ㄟ^測(cè)量從該啟動(dòng)子的mRNA轉(zhuǎn)錄的量來直接地測(cè)定啟動(dòng)子活性，如通過RNA印跡法、定量PCR，或通過測(cè)量自該啟動(dòng)子表達(dá)的基因產(chǎn)物的量來間接地測(cè)定啟動(dòng)子活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過干預(yù)表達(dá)的KO蛋白的折疊，從而使該KO蛋白不能正確折疊成為功能性蛋白來實(shí)現(xiàn)低表達(dá)。例如，可引入突變以移除所述KO蛋白的二硫鍵的形成或破壞α螺旋和β折疊的形成。

又一方面，本發(fā)明提供所述工程化宿主細(xì)胞在制備目標(biāo)蛋白中的用途。所述宿主細(xì)胞可有利地用于引入編碼一種或多種POI的多肽，之后可將該宿主細(xì)胞在適宜的條件下培養(yǎng)以表達(dá)所述POI。在之后的關(guān)于本發(fā)明的方法部分描述了這一用途的細(xì)節(jié)。

可以通過將相關(guān)基因各自連接(ligating)至一個(gè)載體中，使編碼輔助蛋白和POI的多核苷酸重組于所述宿主細(xì)胞中?？梢詷?gòu)建攜帶所述基因的單一載體，或兩個(gè)獨(dú)立的載體，其中一個(gè)攜帶輔助蛋白基因而另一個(gè)攜帶POI基因?？赏ㄟ^采用一種或多種所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，將這些基因整合至所述宿主細(xì)胞的基因組中。在一些實(shí)施方案中，將編碼POI的基因整合至所述基因組中，而將編碼輔助蛋白的基因整合至質(zhì)?；蜉d體中。在一些實(shí)施方案中，將編碼輔助蛋白的基因整合至所述基因組中，而將編碼POI的基因整合至質(zhì)粒或載體中。在一些實(shí)施方案中，將編碼POI和輔助蛋白的基因均整合至所述基因組中。在一些實(shí)施方案中，將編碼POI和輔助蛋白的基因整合至質(zhì)?；蜉d體中。若采用編碼POI的多個(gè)基因，則將編碼POI的一些基因整合至所述基因組中，而將另一些基因整合至相同或不同的質(zhì)?；蜉d體中。若采用編碼輔助蛋白的多個(gè)基因，則將編碼輔助蛋白的一些基因整合至所述基因組中，而將另一些基因整合至相同或不同的質(zhì)?；蜉d體中?？稍诒旧暾?qǐng)的以下部分找到更多教導(dǎo)。

通常，可采用重組宿主細(xì)胞，通過在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，自培養(yǎng)物中分離表達(dá)的POI，并通過適合表達(dá)產(chǎn)物的方法將POI純化，特別是將POI自細(xì)胞中分離，生產(chǎn)目標(biāo)蛋白。

又一方面，本發(fā)明涉及增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法，所述方法包括過表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。所述多核苷酸編碼具有與示于SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的輔助蛋白。

如本文所用，術(shù)語“增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量”是指與在相同培養(yǎng)條件下表達(dá)相同POI但是編碼輔助蛋白的多核苷酸未過表達(dá)的相同細(xì)胞相比，目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量增加了。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的輔助蛋白的過表達(dá)已經(jīng)表明增加了POI的產(chǎn)物產(chǎn)量。因此，對(duì)于表達(dá)具有應(yīng)當(dāng)被增加的水平的POI的給定宿主細(xì)胞，如果輔助蛋白不存在于該宿主細(xì)胞中，則可通過在該宿主細(xì)胞中表達(dá)任一種或若干種輔助蛋白而應(yīng)用本發(fā)明，或者如果編碼輔助蛋白的基因已經(jīng)存在于該宿主細(xì)胞中，則可通過進(jìn)一步增加該宿主細(xì)胞中輔助蛋白的表達(dá)水平而應(yīng)用本發(fā)明。

再一方面，本發(fā)明提供一種增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量的方法。所述方法包括(i)將宿主細(xì)胞工程化為表達(dá)或過表達(dá)輔助蛋白，(ii)在所述宿主細(xì)胞中重組編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸，和(iii)在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)所述輔助蛋白和目標(biāo)蛋白。應(yīng)當(dāng)注意，在(i)和(ii)中所述的步驟無需按照所述的順序?qū)嵤??？梢允紫葘?shí)施(ii)中所述的步驟然后實(shí)施(i)中所述的步驟。在步驟(i)中，所述宿主細(xì)胞可被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的輔助蛋白。

本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于操作如編碼輔助蛋白和/或POI的多核苷酸序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、前導(dǎo)區(qū)(leader)等的程序，如J.Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001)描述的。

可通過多種手段，如通過同源重組或通過采用特異性靶向在整合位點(diǎn)的序列的混合重組酶(hybrid recombinase)，將外源或靶多核苷酸(如編碼輔助蛋白或POI的多核苷酸)插入染色體中。典型地，所述外源或靶多核苷酸存在于載體(“插入載體”)中。典型地，在用于同源重組之前，這些載體是環(huán)狀的和線性的。作為一種選擇，所述外源或靶多核苷酸可以是稍后被重組至宿主細(xì)胞中的通過融合PCR連接的DNA片段或合成構(gòu)建的DNA片段。除了同源臂之外，載體還含有適于選擇或篩選的標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)和其它元件。還可以采用導(dǎo)致隨機(jī)或非靶向整合的異源重組。異源重組是指DNA分子與顯著不同的序列之間的重組。本領(lǐng)域已知重組的方法，例如在Boer等，Appl Microbiol Biotechnol(2007)77:513–523中所描述的。對(duì)于酵母細(xì)胞的遺傳操作還可參考Primrose和Twyman的Principles of Gene Manipulation and Genomics(第七版，Blackwell Publishing 2006)。

編碼輔助蛋白和/或POI的多核苷酸還可存在于表達(dá)載體上。這些載體是本領(lǐng)域已知的并已經(jīng)在上文描述過。在表達(dá)載體中，啟動(dòng)子置于編碼異源蛋白的基因的上游，并調(diào)控所述基因的表達(dá)。由于多克隆載體的多克隆位點(diǎn)，其是特別有用的。對(duì)于表達(dá)，通常將啟動(dòng)子置于多克隆位點(diǎn)的上游。既可通過首先制備含有編碼輔助蛋白和/或POI的完整DNA序列的DNA構(gòu)建體，并隨后將這一構(gòu)建體插入適宜的表達(dá)載體中，也可以通過順序地插入含有個(gè)體元件(如，前導(dǎo)序列、靶DNA序列)遺傳信息的DNA片段，然后連接，來構(gòu)建用于編碼輔助蛋白和/或POI的多核苷酸的整合的載體。作為片段的限制和連接的替代，可把基于附著位點(diǎn)(att)的重組方法和重組酶用于將DNA序列插入載體中。這些方法由例如Landy(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913-949描述，并是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

可通過將包含靶多核苷酸序列的載體或質(zhì)粒引入細(xì)胞來獲得根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域熟知用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞或者轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞的技術(shù)。這些技術(shù)可以包括脂囊泡介導(dǎo)的攝取、熱休克介導(dǎo)的攝取、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(磷酸鈣/DNA共沉淀)、病毒感染(特別是使用經(jīng)修飾的病毒諸如例如經(jīng)修飾的腺病毒)、顯微注射和電穿孔。對(duì)于原核轉(zhuǎn)化，技術(shù)可以包括熱休克介導(dǎo)的攝取、與完整細(xì)胞的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、顯微注射和電穿孔。用于植物轉(zhuǎn)化的技術(shù)包括土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(諸如通過根瘤土壤桿菌(A.tumefaciens)實(shí)現(xiàn)的)、被快速推進(jìn)的鎢或金微彈、電穿孔、顯微注射和聚乙二醇介導(dǎo)的攝取。DNA可以是單鏈的或雙鏈的、線性的或環(huán)狀的、松弛的或超螺旋的DNA。對(duì)于用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種技術(shù)，參見例如Keown等(1990)Processes in Enzymology185:527-537。

又一方面，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中制備目標(biāo)蛋白的方法，所述方法包括(i)提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被工程化為過表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有與示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的輔助蛋白，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼目標(biāo)蛋白的異源多核苷酸；和(ii)在適宜條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以過表達(dá)所述輔助蛋白和表達(dá)目標(biāo)蛋白。

應(yīng)當(dāng)理解，本文公開的方法可進(jìn)一步包括在允許所述POI和輔助蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述重組宿主細(xì)胞。然后，根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)的蛋白的性質(zhì)，例如所述蛋白能否融合為單一肽和所述蛋白是可溶的還是膜結(jié)合的，可以從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基中分離重組生產(chǎn)的POI。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，根據(jù)包括宿主細(xì)胞(特別是所采用的表達(dá)載體)的類型的因素，培養(yǎng)條件將改變。通常，信號(hào)肽含有帶正電的N-末端，隨后是疏水內(nèi)核，隨后是用于稱為信號(hào)肽酶的酶的識(shí)別位點(diǎn)。在易位期間，這種酶從所述蛋白切割信號(hào)肽。將所述蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，然后根據(jù)該蛋白質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行分泌途徑中多個(gè)路線的一個(gè)。所述蛋白可分泌至培養(yǎng)基中或可例如保留在細(xì)胞表面。某些包含胞外、跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的受體是可被保留在細(xì)胞膜上的蛋白的實(shí)例，其中僅胞外結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞外。某些分泌的蛋白的前導(dǎo)序列包含位于信號(hào)肽C-末端的肽，并在信號(hào)肽的切割后自成熟目標(biāo)蛋白加工。這種前導(dǎo)區(qū)常常是指前原肽(prepro peptide)，其中前區(qū)(pre region)是信號(hào)序列，原區(qū)(pro region)是指前導(dǎo)區(qū)的剩余部分。

一個(gè)實(shí)例是酵母α-因子前導(dǎo)區(qū)，其含有信號(hào)肽(包括C-末端信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)AlaLeuAla)，隨后是含有構(gòu)成KEX2蛋白酶加工位點(diǎn)的堿性氨基酸對(duì)LysArg的原區(qū)，緊隨其后的是在原區(qū)的C-末端的肽GluAlaGluAla。這一前導(dǎo)區(qū)的加工涉及通過信號(hào)肽酶的信號(hào)肽的移除，隨后是KEX2蛋白酶對(duì)Lys和Arg殘基之間的切割。之后，通過是STE13基因的產(chǎn)物的肽酶將GluAlaGluAla殘基移除(Julius等，Cell(1983)32:839)。在美國(guó)專利4,546,082中描述了所述酵母α-因子前導(dǎo)區(qū)。已經(jīng)在用于酵母中異源蛋白的生產(chǎn)的重組表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用了衍生自由酵母細(xì)胞天然分泌的蛋白的信號(hào)肽。盡管某些哺乳動(dòng)物信號(hào)肽在促進(jìn)酵母中異源蛋白的分泌方面不是有效的，但是也已經(jīng)報(bào)道了哺乳動(dòng)物信號(hào)肽在酵母表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。

短語“在適宜的條件下培養(yǎng)，使得所需多肽表達(dá)”是指在適合或足夠獲得所需化合物的生產(chǎn)或獲得所需多肽的條件(如溫度、壓力、pH、持續(xù)時(shí)間等)下維持和/或生長(zhǎng)(growing)微生物。

通過用一種或多種輔助蛋白基因和/或POI基因轉(zhuǎn)化獲得的根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞可優(yōu)選首先在這樣的條件下培養(yǎng)，所述條件允許宿主細(xì)胞在沒有表達(dá)異源蛋白的負(fù)擔(dān)下高效生長(zhǎng)至大的細(xì)胞數(shù)量。當(dāng)細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行POI表達(dá)時(shí)，選擇并優(yōu)化適宜的培養(yǎng)條件以產(chǎn)生POI。

作為示例，使用針對(duì)一種或多種輔助基因和/或一種或多種POI的不同啟動(dòng)子和/或拷貝和/或整合位點(diǎn)，可關(guān)于與一種或多種POI的表達(dá)有關(guān)的時(shí)間點(diǎn)和誘導(dǎo)強(qiáng)度來控制輔助基因的表達(dá)。例如，在POI表達(dá)的誘導(dǎo)之前，可首先表達(dá)一種或多種輔助蛋白。這樣做具有如下優(yōu)勢(shì)：在POI翻譯開始時(shí)所述一種或多種輔助蛋白已經(jīng)存在。可選地，可在同一時(shí)間誘導(dǎo)一種或多種輔助蛋白和一種或多種POI。

一旦施加誘導(dǎo)刺激就會(huì)被激活的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可用于在該啟動(dòng)子控制下的基因的直接轉(zhuǎn)錄。在有誘導(dǎo)刺激的生長(zhǎng)條件下，細(xì)胞通常比在正常條件下生長(zhǎng)得慢，但因?yàn)榕囵B(yǎng)物已經(jīng)在前一階段生長(zhǎng)至大的細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)系統(tǒng)整體產(chǎn)生大量的異源蛋白。誘導(dǎo)刺激優(yōu)選是適當(dāng)試劑(如針對(duì)AOX-啟動(dòng)子的甲醇)的添加或適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物(如針對(duì)MET3-啟動(dòng)子的甲硫氨酸)的消耗。此外，乙醇、甲胺、鎘或銅的添加以及熱或滲透壓增加劑也可誘導(dǎo)表達(dá)。

優(yōu)選將根據(jù)本發(fā)明的宿主在生物反應(yīng)器中在優(yōu)化的生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)以獲得至少1g/L、更優(yōu)選至少10g/L細(xì)胞干重、更優(yōu)選至少50g/L細(xì)胞干重的細(xì)胞密度。不僅在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模中，而且在中試或工業(yè)規(guī)模中，實(shí)現(xiàn)這樣的生物分子產(chǎn)量是有益的。

根據(jù)本發(fā)明，由于輔助蛋白的共表達(dá)，即使在生物質(zhì)保持較低的情況下都可高產(chǎn)量地獲得POI。因此，在實(shí)驗(yàn)室、中試和工業(yè)規(guī)模中達(dá)到高單位產(chǎn)量(specific yield)是可行的，其中單位產(chǎn)量以mg POI/g干生物質(zhì)衡量，可以在1至200的范圍，如50至200，如100至200。當(dāng)與無輔助蛋白過表達(dá)情況下的產(chǎn)物表達(dá)相比時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)宿主的單位產(chǎn)量?jī)?yōu)選提供至少1.1倍，更優(yōu)選至少1.2倍，至少1.3或至少1.4倍的增加，在一些情況下，可以顯示超過2倍的增加。

根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞可通過以下標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來測(cè)試其表達(dá)/分泌能力或產(chǎn)量：如ELISA、活性檢驗(yàn)、HPLC、表面等離子體共振(Biacore)、蛋白質(zhì)印跡法、毛細(xì)管電泳(Caliper)或SDS-Page。

優(yōu)選將細(xì)胞培養(yǎng)在含有合適碳源的礦物質(zhì)培養(yǎng)基中，由此進(jìn)一步顯著地簡(jiǎn)化分離過程。作為示例，所述礦物質(zhì)培養(yǎng)基含有可利用碳源(例如葡萄糖、甘油、乙醇或甲醇)、含有常量元素(鉀、鎂、鈣、銨、氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽)和痕量元素(銅、碘、錳、鉬酸鹽、鈷、鋅和鐵鹽以及硼酸)的鹽。

在酵母細(xì)胞的情況下，可以用上述一種或多種表達(dá)載體的一種或多種轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞，使這些細(xì)胞交配(mated)以形成二倍體菌株，并在被修飾為適合誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼所需序列的基因的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本領(lǐng)域已知許多適于酵母菌生長(zhǎng)的最低限度培養(yǎng)基。根據(jù)需要，可向這些培養(yǎng)基的任一種中補(bǔ)充鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES、檸檬酸和磷酸鹽緩沖液)、核苷(如腺嘌呤和胸腺嘧啶)、抗生素、痕量元素、維生素和葡萄糖或等效能源。還可包括以適當(dāng)濃度的任何其它必須的補(bǔ)充物，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述培養(yǎng)條件(如溫度、pH等)是之前選擇用于宿主細(xì)胞表達(dá)的條件，這是普通技術(shù)人員已知的。針對(duì)其它類型宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件也是已知的并可由技術(shù)人員容易地確定。對(duì)各種微生物的培養(yǎng)基的描述例如涵蓋在美國(guó)微生物學(xué)會(huì)(American Society for Bacteriology)的“一般細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)”的指南(華盛頓D.C,USA,1981)中。

可以通過常規(guī)的培養(yǎng)方法，例如靜止培養(yǎng)、試管培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)(例如旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)等)、摻氣旋動(dòng)培養(yǎng)(aeration spinner culture)或發(fā)酵，優(yōu)選地連續(xù)或間歇地在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(例如維持和/或生長(zhǎng))細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在搖瓶或深孔板中培養(yǎng)細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，在生物反應(yīng)器(例如在生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程)中培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)過程包括、但不限于，分批培養(yǎng)、進(jìn)料分批培養(yǎng)和連續(xù)方法培養(yǎng)。術(shù)語“分批過程”和“分批培養(yǎng)”是指一個(gè)封閉的系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的培養(yǎng)基組成、營(yíng)養(yǎng)物、補(bǔ)充添加劑等在培養(yǎng)開始時(shí)已設(shè)定，并在培養(yǎng)期間不經(jīng)受改變；但是，可嘗試控制如pH和氧濃度的因素來阻止過度培養(yǎng)基酸化和/或細(xì)胞死亡。術(shù)語“進(jìn)料分批過程”和“進(jìn)料分批培養(yǎng)”是指具有以下例外的一種分批培養(yǎng)：隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，添加(例如，以增量或連續(xù)方式添加)一種或多種底物或補(bǔ)充物。術(shù)語“連續(xù)過程”和“連續(xù)培養(yǎng)”是指一種系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中將限定的培養(yǎng)基連續(xù)地添加至生物反應(yīng)器，并同時(shí)將等量的所采用的或“條件化”的培養(yǎng)基移除，例如用于回收所需產(chǎn)物。已經(jīng)開發(fā)了多種這樣的過程并且這些過程是本領(lǐng)域熟知的。

在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)約12至24小時(shí)，在另一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)約24至36小時(shí)，約36至48小時(shí)，約48至72小時(shí)，約72至96小時(shí)，約96至120小時(shí)，約120至144小時(shí)，或培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間大于144小時(shí)。在又一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)持續(xù)一段足以達(dá)到POI的所需生產(chǎn)產(chǎn)量的時(shí)間。

上述提及的方法可進(jìn)一步包括分離表達(dá)的POI的步驟。若所述POI是從細(xì)胞中分泌出來的，則該P(yáng)OI可采用現(xiàn)有技術(shù)從培養(yǎng)基中分離并純化。POI從細(xì)胞中分泌出來通常是優(yōu)選的，因?yàn)榭梢詮呐囵B(yǎng)上清液中回收產(chǎn)物，而不是從當(dāng)細(xì)胞被破壞以釋放胞內(nèi)蛋白時(shí)產(chǎn)生的復(fù)雜蛋白混合物中回收。蛋白酶抑制劑，如苯基甲基磺酰氟(PMSF)，在抑制純化過程中的蛋白質(zhì)降解可能是有益的，且可包括抗生素以阻止外來污染物的生長(zhǎng)?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的方法將組合物濃縮、過濾、透析等?？蛇x地，培養(yǎng)的宿主細(xì)胞也可以通過超聲波或機(jī)械法、酶法或化學(xué)法來破裂以得到含有所需POI的細(xì)胞提取物，從該細(xì)胞提取物中可以分離和純化到POI。

對(duì)于獲得POI的分離和純化方法，可以使用利用溶解度差異的方法，比如鹽析和溶劑沉淀；利用分子量差異的方法，比如超濾和凝膠電泳；利用電荷差異的方法，比如離子交換層析；利用特異親和性的方法，比如親和層析；利用疏水性差異的方法，比如反相高效液相層析；以及利用等電點(diǎn)差異的方法，比如等電點(diǎn)聚集。優(yōu)選采用特異的純化步驟來移除同時(shí)表達(dá)的并會(huì)對(duì)POI制品造成污染的任何輔助蛋白。

分離和純化的POI可以通過常規(guī)方法，比如蛋白質(zhì)印跡法或?qū)ζ浠钚缘奶禺愋詸z驗(yàn)來鑒定。純化POI的結(jié)構(gòu)可以通過氨基酸分析、氨基-末端分析、一級(jí)結(jié)構(gòu)分析等來定義。優(yōu)選可以大量和高純度水平獲得POI，這樣即可滿足作為藥物組合物中的活性成分或者作為飼料或食品添加劑的必要要求。

應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不受描述的特殊方法、規(guī)程、細(xì)胞系、動(dòng)物的種或?qū)?、?gòu)建體和試劑限制，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可以變化。也理解的是本文使用的術(shù)語只是用于描述特定實(shí)施方案，并不意欲限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求限定。

除非另有說明，本文所使用的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。盡管與本文所述的那些類似或等同的任何方法、裝置和材料都可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，但是目前描述了優(yōu)選的方法、裝置和材料。

本文所提及的所有公開文本都用于描述和披露公開文本中所描述并且可能與目前描述的本發(fā)明結(jié)合使用的例如細(xì)胞系、構(gòu)建體和方法的目的。上面以及本文全文討論的公開文本單獨(dú)提供，因?yàn)樗鼈兊墓_早于本申請(qǐng)的申請(qǐng)日。本文無任何內(nèi)容能被解釋為承認(rèn)由于在先發(fā)明，本發(fā)明不早于這樣的公開內(nèi)容。

提出下述實(shí)施例以向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和使用本發(fā)明的完整公開和描述，并且不是要限制權(quán)利要求中的被認(rèn)為是本發(fā)明的且限定的范圍。已經(jīng)嘗試保證所使用的數(shù)字(例如量、溫度、濃度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另外說明，份是重量份，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度，并且壓力是大氣壓或接近大氣壓。

實(shí)施例

以下實(shí)施例將證明，基于重組蛋白的過表達(dá)，新鑒定的輔助蛋白分別增加了重組蛋白的效價(jià)(以mg/L表示的每體積的產(chǎn)物)和產(chǎn)量(以mg/g生物質(zhì)表示的每生物質(zhì)的產(chǎn)物，生物質(zhì)以干細(xì)胞重量或濕細(xì)胞重量來度量)。作為實(shí)例，在巴斯德畢赤酵母中重組抗體Fab片段和重組酶的產(chǎn)量增加。在振蕩培養(yǎng)(在搖瓶或深孔板中進(jìn)行)和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的進(jìn)料-分批培養(yǎng)中顯示出了積極作用。

實(shí)施例1 巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)菌株的產(chǎn)生

a)分泌抗體Fab片段HyHEL的巴斯德畢赤酵母菌株的構(gòu)建

將巴斯德畢赤酵母CBS7435(CBS，由Küberl等，2011對(duì)其基因組測(cè)序)mut^s變體用作宿主菌株。pPM2d_pGAP和pPM2d_pAOX表達(dá)載體是WO2008/128701A2中描述的pPuzzle_ZeoR載體骨架的衍生物，其包含pUC19細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和博來霉素(Zeocin)抗生素抗性盒。異源基因的表達(dá)分別由巴斯德畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)啟動(dòng)子或醇氧化酶(AOX)啟動(dòng)子和釀酒酵母CYC1轉(zhuǎn)錄終止子介導(dǎo)。采用表3中HyHEL-HC和HyHEL-LC的引物，將抗體Fab片段HyHEL(圖2)的輕鏈(LC)和重鏈(HC)從載體DNA模板(攜帶具有N-末端釀酒酵母α交配因子信號(hào)前導(dǎo)序列的目的基因)中擴(kuò)增，并且將每一條鏈都連接到由SbfI和SfiI消化的載體pPM2d_pGAP和pPM2d_pAOX上。將所述LC片段連接到pPM2d_pGAP和pPM2d_pAOX變體上，其中啟動(dòng)子區(qū)中的一個(gè)限制性酶位點(diǎn)被換為另一個(gè)，以允許隨后的線性化(在pPM2d_pGAP中是NdeI而不是AvrII，在pPM2d_pAOX中是Bsu36I而不是Bpu1102I)；將所述HC片段連接到所述載體的未修飾版本中。在LC和HC的序列驗(yàn)證之后，通過采用相容性限制性酶MreI和AgeI將兩條鏈的表達(dá)盒組合到一個(gè)載體上。

在電穿孔(采用描述于Gasser等，2013.Future Microbiol.8(2):191-208中的標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化方案)至巴斯德畢赤酵母中之前，分別采用NdeI限制性酶(針對(duì)pPM2d_pGAP)或Bsu36I限制性酶(針對(duì)pPM2d_pAOX)將質(zhì)粒線性化。在含有50μg/mL博來霉素(Zeocin)的YPD板(每升：10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g葡萄糖、20g瓊脂)上實(shí)施陽性轉(zhuǎn)化體的篩選。使用菌落PCR(Colony PCR)來確保轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的存在。因此，通過將巴斯德畢赤酵母菌落蒸煮(cook)和冷凍各5分鐘獲得基因組DNA，并將其直接用于采用適當(dāng)引物的PCR。

b)分泌抗體Fab片段SDZ的巴斯德畢赤酵母菌株的構(gòu)建

采用表3中SDZ-HC和SDZ-LC的引物，將抗體Fab片段SDZ(圖2)的輕鏈(LC)和重鏈(HC)從載體DNA模板(攜帶具有N-末端α交配因子信號(hào)前導(dǎo)序列的目的基因)中擴(kuò)增，并且將每一條鏈都連接到分別由SbfI和SfiI消化的pPM2d_pAOX或具有Bsu36I限制性位點(diǎn)的pPM2d_pAOX的變體上。在LC和HC的序列驗(yàn)證之后，通過采用相容性限制性酶MreI和AgeI將兩條鏈的表達(dá)盒組合到一個(gè)載體上。

在電穿孔(采用描述于Gasser等，2013.Future Microbiol.8(2):191-208中的標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化方案)至巴斯德畢赤酵母中之前，采用Bsu36I限制性酶將質(zhì)粒線性化。在含有50μg/mL博來霉素(Zeocin)的YPD板(每升：10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g葡萄糖、20g瓊脂-瓊脂)上實(shí)施陽性轉(zhuǎn)化體的篩選。使用菌落PCR(Colony PCR)來確保轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的存在。因此，通過將巴斯德畢赤酵母菌落蒸煮(cook)和冷凍各5分鐘獲得基因組DNA，并將其直接用于采用適當(dāng)引物的PCR。

表3示出了HyHEL LC和HC以及SDZ LC和HC的PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(α-交配因子_上游是所有Fab鏈的擴(kuò)增的上游引物)。

表3

實(shí)施例2 恒化器(chemostat)培養(yǎng)用最大工作容積為1.0L的1.4LDASGIP反應(yīng)器(Eppendorf，德國(guó))實(shí)施培養(yǎng)。

采用了如下培養(yǎng)基：

PTM₁痕量鹽儲(chǔ)備溶液(每升)含有：6.0g CuSO₄·5H₂O、0.08g NaI、3.36g MnSO₄·H₂O、0.2g Na₂MoO₄·2H₂O、0.02g H₃BO₃、0.82g CoCl₂、20.0g ZnCl₂、65.0g FeSO₄·7H₂O和5.0mL H₂SO₄(95％-98％)。

甘油分批培養(yǎng)基(每升)含有：2g檸檬酸一水合物(C₆H₈O₇·H₂O)、39.2g甘油、20.8g NH₄H₂PO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、1.6g KCl、0.022g CaCl₂·2H₂O、0.8mg生物素和4.6mL PTM1痕量鹽儲(chǔ)備溶液。加入HCl以將pH設(shè)定至5。

葡萄糖恒化器培養(yǎng)基(每升)含有：2.5g檸檬酸一水合物(C₆H₈O₇·H₂O)、55.0g葡萄糖一水合物、21.8g NH₄H₂PO₄、1.0g MgSO₄·7H₂O、2.5g KCl、0.04g CaCl₂·2H₂O、4.0mg生物素和2.43mL PTM1痕量鹽儲(chǔ)備溶液。加入HCl以將pH設(shè)定至5。

甲醇/甘油恒化器培養(yǎng)基(每升)含有：2.5g檸檬酸一水合物(C₆H₈O₇·H₂O)、8.5g甲醇、50.0g甘油、21.8g NH₄H₂PO₄、1.0g MgSO₄·7H₂O、2.5g KCl、0.04g CaCl₂·2H₂O、4.0mg生物素和2.43mL PTM1痕量鹽儲(chǔ)備溶液。加入HCl以將pH設(shè)定至5。

通過攪拌器速度(400-1200rpm)和通氣率(12-72標(biāo)準(zhǔn)升/小時(shí)(sL/h))空氣將溶解氧控制在DO＝20％，將溫度控制在25℃和通過NH₄OH(25％)的添加來控制pH設(shè)定值為5。根據(jù)需要通過消泡劑(5％Glanapon 2000)的添加來控制起泡。

為了開始培養(yǎng)，將0.4L的分批培養(yǎng)基無菌過濾并轉(zhuǎn)移到無菌工作臺(tái)下的發(fā)酵罐中，并以1的起始光密度(OD₆₀₀)接種(從在含有50μg/mL博來霉素(Zeocin)的、180rpm、28℃的YPG的巴斯德畢赤酵母過夜預(yù)先培養(yǎng)物中)。約24h的分批階段達(dá)到了約20g/L的干生物質(zhì)濃度，然后用恒化器培養(yǎng)基以40mL/h(μ＝D＝0.1/h)恒定進(jìn)料，同時(shí)恒定地移除培養(yǎng)物以保持總體積恒定。在7次停留時(shí)間(70小時(shí))后達(dá)到約25g/L的干生物質(zhì)濃度，此時(shí)取用于微陣列實(shí)驗(yàn)的樣品并終止培養(yǎng)。對(duì)每種生產(chǎn)菌株(采用葡萄糖恒化器培養(yǎng)基的CBS7435pGAP HyHEL-Fab和采用甲醇/甘油恒化器培養(yǎng)基的CBS7435mut^S pAOX HyHEL-Fab)和非生產(chǎn)性野生型對(duì)照菌株(分別為CBS7435pGAP對(duì)照和CBS7435mut^S pAOX對(duì)照)實(shí)施該恒化器培養(yǎng)三次，從而獲得可靠的微陣列分析所需的生物學(xué)復(fù)制品。

在恒化器的穩(wěn)態(tài)條件下約70小時(shí)后取樣。在每一培養(yǎng)過程中進(jìn)行常規(guī)取樣作為光密度或酵母干質(zhì)量的測(cè)定，定性顯微鏡檢查和細(xì)胞活力分析。對(duì)于微陣列分析，按照如下取樣并處理：為了最佳淬滅，將9mL細(xì)胞培養(yǎng)液(broth)立即與4.5mL冰冷的5％苯酚(Sigma)溶液(在無水乙醇中)混合，并等分。將每2mL在預(yù)冷卻的收集管(GE healthcare,NJ)中離心(13,200rpm 1分鐘)，完全移除上清液并將含有細(xì)胞沉淀的試管保存在-80℃直至RNA分離。

實(shí)施例3 轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)的微陣列&數(shù)據(jù)評(píng)估

a)RNA分離及用于微陣列雜交的樣品制備

采用TRI試劑，根據(jù)供應(yīng)商的說明(Ambion,US)，自恒化器樣品細(xì)胞中分離RNA。將細(xì)胞沉淀物重懸浮于TRI試劑中并采用FastPrep 24(M.P.Biomedicals，CA)以5m s^-1用玻璃珠勻化40秒。添加氯仿后，離心樣品，并通過加入異丙醇從水相中沉淀出總RNA。將團(tuán)塊用70％乙醇洗滌，干燥并重懸浮于無RNA酶的水中。通過使用Nanodrop 1000分光光度計(jì)(NanoDrop products,DE)測(cè)量OD₂₆₀來測(cè)定RNA濃度。使用無DNA試劑盒(Ambion,CA)從樣品中移除剩余的DNA。將等于10μg RNA的樣品體積在無RNA酶的水中稀釋至50μL，然后加入DNA酶緩沖液I和rDNA酶I，并在37℃下溫育30分鐘。在加入DNA酶滅活試劑后，將樣品離心并將上清液轉(zhuǎn)移至新的試管中。如上所述再次測(cè)定RNA濃度。此外，采用RNA納米芯片(Agilent)分析RNA的完整性。為了監(jiān)測(cè)從擴(kuò)增和標(biāo)記到樣品雜交的微陣列工作流程，使用Spike In Kit(Agilent，產(chǎn)品編號(hào)：5188-5279)作為陽性對(duì)照。它包含來自腺病毒的10種不同的聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄物，這些聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄物與自身RNA樣品一起擴(kuò)增、標(biāo)記和共雜交。采用Quick Amp標(biāo)記試劑盒(Agilent，產(chǎn)品編號(hào)5190-0444)用Cy 3和Cy 5標(biāo)記樣品。因此，將500ng純化的樣品RNA在8.3μL無RNA酶的水中稀釋，加入2μL Spike A或B和1.2μL T7啟動(dòng)子引物。將混合物在65℃下變性10分鐘，并在冰上保持5分鐘。然后加入8.5μL cDNA mastermix(每個(gè)樣品：4μL 5×第一鏈緩沖液、2μL 0.1M DTT、1μL 10mM dNTP mix、1μL MMLV-RT、0.5μL RNA酶out)，在40℃下溫育2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至65℃溫育15分鐘，并置于冰上5分鐘。制備轉(zhuǎn)錄mastermix(每個(gè)樣品：15.3μL無核酸酶水、20μL轉(zhuǎn)錄緩沖液、6μL 0.1M DTT、6.4μL 50％PEG，0.5μL RNA酶抑制劑、0.6μL無機(jī)磷酸酶、0.8μL T7RNA聚合酶、2.4μL花青素苷3或花青素苷5)并將其加至每一試管中，然后在40℃下溫育2小時(shí)。為了純化獲得的被標(biāo)記cRNA，采用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen，貨號(hào)74104)。在-80℃下保存樣品。在Nanodrop分光光度計(jì)上進(jìn)行cRNA濃度和標(biāo)記效率的定量。

b)微陣列分析

將基因表達(dá)雜交試劑盒(Agilent，貨號(hào)5188-5242)用于被標(biāo)記樣品cRNA的雜交。為了制備雜交樣品，用無核酸酶水將每300ng cRNA(Cy3和Cy5)和6μL 10倍封閉劑稀釋至最終體積為24μL。加入1μL 25倍片段化緩沖液(fragmentation buffer)后，將混合物在60℃下溫育30分鐘。然后加入25μL GEx雜交緩沖液HI-RPM來停止反應(yīng)。采用13,200rpm離心1分鐘后，將樣品在冰上冷卻并立即用于雜交。使用內(nèi)部設(shè)計(jì)的巴斯德畢赤酵母特異性寡核苷酸陣列(AMAD-ID：034821，8x15K定制陣列，Agilent)。根據(jù)微陣列雜交腔室用戶指南(Agilent G2534A)進(jìn)行微陣列雜交。首先，將襯墊載玻片(gasket slide)打開并放在腔室底座上，Agilent標(biāo)簽面朝上。將樣品(每個(gè)陣列40μL)裝載在8個(gè)方格中的每一個(gè)的中間。然后將微陣列載玻片仔細(xì)放置到襯墊載玻片上(Agilent標(biāo)簽面朝下)并放上腔室蓋然后用夾具固定。所有樣品以染料交換方式與參考池樣品雜交。所述池RNA樣品是通過將來自各種培養(yǎng)物的RNA等量混合產(chǎn)生的。在雜交爐中于65℃下雜交17小時(shí)。掃描前，洗滌微陣列芯片。因此，將腔室拆開，并將夾心載玻片(sandwich slide)彼此分離，同時(shí)浸沒在洗滌緩沖液1中。將微陣列直接轉(zhuǎn)移到另一個(gè)具有洗滌緩沖液1的器皿中，洗滌1分鐘，轉(zhuǎn)移到洗滌緩沖液2(溫度至少30℃)中并再洗滌1分鐘。通過用紙巾接觸載玻片邊緣使微陣列載玻片干燥后，將其放入載玻片保持器(Agilent，標(biāo)簽面朝上)中。將載玻片保持器放入轉(zhuǎn)盤(carousel)中并開始掃描。

c)微陣列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)

使用G2565AA微陣列掃描儀(Agilent)以50nm的分辨率掃描圖像，并將這些圖像導(dǎo)入Agilent Feature Extraction 9.5軟件。Agilent Feature Extraction 9.5用于定量點(diǎn)強(qiáng)度。然后將原始平均點(diǎn)強(qiáng)度數(shù)據(jù)導(dǎo)入開源軟件R中，用于進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)分析。

在計(jì)算差異表達(dá)值之前，將強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(無背景校正，采用載玻片內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化方法Loess和載玻片間標(biāo)準(zhǔn)化方法Aquantile)。使用線性模型擬合(limma R package)來計(jì)算與差異表達(dá)值相關(guān)聯(lián)的p值，隨后使用Benjamini和Yekutieli的方法(limma R package的BY方法)針對(duì)多重檢驗(yàn)調(diào)整p值。對(duì)于HyHEL-Fab生產(chǎn)菌株與其各自對(duì)照相比，計(jì)算Log2倍的變化。

瀏覽微陣列數(shù)據(jù)以獲得產(chǎn)生HyHEL-Fab的CBS7435和其非生產(chǎn)性宿主對(duì)照的一式三份的恒化組之間的表達(dá)水平(倍數(shù)改變＞1.5)上的顯著差異(調(diào)整的p值＜0.05)。

表4顯示了來自生產(chǎn)HyHEL-Fab的巴斯德畢赤酵母的微陣列分析的上調(diào)基因。

表4

實(shí)施例4 過表達(dá)鑒定的基因的菌株的產(chǎn)生

為了研究對(duì)Fab分泌的陽性效應(yīng)，在兩種不同的Fab生產(chǎn)菌株中過表達(dá)所鑒定的基因：CBS7435pPM2d_pAOX HyHEL，其是微陣列數(shù)據(jù)的來源(參見實(shí)施例3)和CBS7435pPM2d_pAOX SDZ(產(chǎn)生參見實(shí)施例1)。

a)所鑒定的潛在分泌輔助基因的擴(kuò)增和向pPM2aK21表達(dá)載體中的克隆

采用示于表5的引物，通過PCR(Phusion Polymerase，New England Biolabs)從起始到終止密碼子擴(kuò)增在實(shí)施例3中鑒定的基因。將序列克隆至具有兩個(gè)限制性酶SbfI和SfiI的pPM2aK21表達(dá)載體的MCS中。pPM2aK21是pPM2d(描述于實(shí)施例1a)的衍生物，其包含AOX終止子序列(用于整合入天然AOX終止子基因座)、大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(pUC19)、用于大腸桿菌和酵母中選擇的抗生素抗性盒(kanMX，賦予對(duì)卡那霉素和G418的抗性)、用于目標(biāo)基因(GOI)的表達(dá)盒，其由GAP啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)(MCS)和釀酒酵母CYC1轉(zhuǎn)錄終止子組成。通過Sanger測(cè)序驗(yàn)證基因序列。

表5

b)鑒定的基因在巴斯德畢赤酵母Fab生產(chǎn)菌株中的共-過表達(dá)

將巴斯德畢赤酵母Fab過生產(chǎn)菌株CBS7435mut^S pAOX HyHEL-Fab和CBS7435mut^SpAOX SDZ-Fab用作宿主菌株以進(jìn)行在實(shí)施例3中鑒定的和在實(shí)施例4a中克隆的基因的共-過表達(dá)。在轉(zhuǎn)化至Fab生產(chǎn)菌株之前，所述含有在實(shí)施例3中鑒定的分泌輔助基因的pPM2aK21載體在AOX終止子序列中用限制性酶AscI線性化。在含有G418的YPD瓊脂平板上選擇陽性轉(zhuǎn)化體。

實(shí)施例5 Fab表達(dá)的篩選

在小規(guī)模篩選中，與非工程化的親本宿主相比，測(cè)試每個(gè)分泌輔助基因的8至12個(gè)轉(zhuǎn)化體，并基于它們對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、Fab效價(jià)和Fab產(chǎn)量的影響進(jìn)行排名。在所有測(cè)試的克隆中，發(fā)現(xiàn)PP7435_Chr3-0933、PP7435_Chr2-0220、PP7435_Chr3-0639、PP7435_Chr1-1232、PP7435_Chr1-1225、PP7435_Chr3-0607、PP7435_Chr4-0448、PP7435_Chr4-0108、PP7435_Chr1-0667顯示最好的結(jié)果(使Fab效價(jià)或Fab產(chǎn)量增加至少1.2倍)。

在實(shí)施例7中，之后將所有這些克隆(除了PP7435_Chr1-0667)在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)以驗(yàn)證在受控生產(chǎn)過程中菌株的改進(jìn)。

a)巴斯德畢赤酵母Fab生產(chǎn)菌株的小規(guī)模培養(yǎng)

將巴斯德畢赤酵母菌株的單一菌落接種于2mL含有10g/L甘油和50μg/mL博來霉素(Zeocin)的YP-培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨)，并在25℃下生長(zhǎng)過夜。將這些培養(yǎng)物的等分試樣(對(duì)應(yīng)于終OD₆₀₀為2.0)轉(zhuǎn)移到2mL補(bǔ)充有20g/L葡萄糖和葡萄糖飼料片(Kuhner,Switzerland；CAT#SMFB63319)的合成篩選培養(yǎng)基M2(在下面給出該培養(yǎng)基的組成)中，并于25℃下，以170rpm在24深孔板中溫育25小時(shí)。通過離心洗滌培養(yǎng)物一次，然后將沉淀重懸于合成篩選培養(yǎng)基M2中，將等分試樣(對(duì)應(yīng)于終OD₆₀₀為4.0)轉(zhuǎn)移到新鮮24深孔板中的2mL合成篩選培養(yǎng)基M2中。每12小時(shí)重復(fù)加入甲醇(5g/L)共48小時(shí)，然后在室溫下以2500xg離心10分鐘而收獲細(xì)胞并準(zhǔn)備用于分析。通過測(cè)量1mL細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞重量來測(cè)定生物質(zhì)，而在上清液中重組分泌蛋白的測(cè)定在以下實(shí)施例5b-6c中描述。

每升合成篩選培養(yǎng)基M2含有：22.0g檸檬酸一水合物、3.15g(NH₄)₂PO₄、0.49g MgSO₄*7H₂O、0.80g KCl、0.0268g CaCl₂*2H₂O、1.47mL PTM1痕量金屬、4mg生物素；用KOH(固體)將pH設(shè)定至5。

b)SDS-PAGE&蛋白質(zhì)印跡分析

采用Bis-Tris系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠分析，其使用12％Bis-Tris或4-12％Bis-Tris凝膠和MOPS運(yùn)行緩沖液(均來自Invitrogen)。電泳后，蛋白質(zhì)或是通過銀染色而顯色，或是被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜用于蛋白質(zhì)印跡分析。因此，采用用于濕(槽(tank))轉(zhuǎn)移的XCell II^TM印跡模塊(Invitrogen)，根據(jù)制造商的說明，將蛋白質(zhì)電印跡至硝酸纖維素膜上。在封閉后，用以下抗體探測(cè)蛋白質(zhì)印跡：對(duì)于Fab輕鏈：抗-人κ輕鏈(結(jié)合的和游離的)-堿性磷酸酶(AP)綴合的抗體，Sigma A3813(1:5,000)；對(duì)于Fab重鏈：以1:1,000稀釋的小鼠抗人IgG抗體(Ab7497，Abcam)和以1:5,000稀釋的在山羊中產(chǎn)生的抗小鼠IgG(Fc特異性)-堿性磷酸酶抗體(A1418，Sigma)作為第二抗體。

基于用于AP-綴合物的NBT/BCIP系統(tǒng)或用于HRP綴合物的化學(xué)發(fā)光Super Signal West Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)，使用比色AP檢測(cè)試劑盒(BioRad)進(jìn)行檢測(cè)。

c)通過ELISA的Fab的定量

采用抗-人IgG抗體(ab7497,Abcam)作為包被抗體和山羊抗-人IgG(Fc特異性)-堿性磷酸酶綴合的抗體(Sigma A8542)作為檢測(cè)抗體，通過ELISA進(jìn)行完整Fab的定量。人Fab/κ、IgG片段(Bethyl P80-115)用作標(biāo)準(zhǔn)品，起始濃度為100ng/mL，相應(yīng)地稀釋上清液樣品。用pNPP(Sigma S0942)進(jìn)行檢測(cè)。包被-、稀釋-和洗滌緩沖液是基于PBS(2mM KH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄.2H₂O、2.7mM g KCl、8mM NaCl，pH 7.4)的，并相應(yīng)地用BSA(1％(w/v))和/或吐溫20(0.1％(v/v))來完成。

實(shí)施例6 低表達(dá)所選擇的鑒定的基因的菌株的產(chǎn)生

一些在實(shí)施例3中鑒定的基因在生產(chǎn)HyHEL-Fab的巴斯德畢赤酵母宿主菌株中過表達(dá)時(shí)導(dǎo)致了較少分泌的Fab(實(shí)施例4和5中)。這些基因中的兩個(gè)編碼伴侶蛋白，即胞質(zhì)伴侶蛋白PP7435_Chr3-1062(KO2)和ER-定位的伴侶蛋白PP7435_Chr1-0176(KO3)。由于通常認(rèn)為伴侶蛋白具有表達(dá)/分泌增強(qiáng)作用，因此，上述這一發(fā)現(xiàn)是非常令人驚奇的。令發(fā)明人驚奇的是，PP7435_Chr1-0176的過表達(dá)是不利的，其使Fab的效價(jià)和產(chǎn)量降低至小于親本非工程化的HyHEL-Fab或SDZ-Fab生產(chǎn)菌株的80％。PP7435_Chr3-1062的過表達(dá)也使HyHEL Fab的效價(jià)和產(chǎn)量降低至小于親本非工程化菌株的80％。因此，在兩種宿主菌株中，這些基因(PP7435_Chr1-0176/SCJ1、PP7435_Chr3-1062/HCH1)被破壞。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例3)中發(fā)現(xiàn)許多絮凝相關(guān)基因被強(qiáng)烈下調(diào)(倍數(shù)變化<0.66)之后，另外選擇絮凝轉(zhuǎn)錄因子PP7435_Chr4-0252/FLO8作為敲除靶標(biāo)。

將巴斯德畢赤酵母Fab過生產(chǎn)菌株CBS7435mut^S pAOX HyHEL-Fab和CBS7435mut^SpAOX SDZ-Fab用作宿主菌株。按照Heiss等(2013)[Appl Microbiol Biotechnol.97(3):1241-9.]所描述的，采用分裂標(biāo)記盒方法來產(chǎn)生具有被破壞基因座的轉(zhuǎn)化體。使用能夠在G418上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體的基因組DNA和在破壞盒外的引物(表6)，通過PCR進(jìn)行陽性敲除菌株的驗(yàn)證。

表6列出了所有用于敲除盒(每個(gè)敲除靶標(biāo)2個(gè)重疊的分裂標(biāo)記盒)的構(gòu)建的引物：通過PCR(Phusion聚合酶，New England Biolabs)，將引物對(duì)A_正向/A_反向、B_正向/B_反向、C_正向/C_反向、D_正向/D_反向用于擴(kuò)增片段A、B、C和D。片段A從巴斯德畢赤酵母基因組DNA擴(kuò)增，在相應(yīng)ATG(靶基因的)的5起始(prime)方向上的1700bp開始，直到ATG的5起始方向的200bp。片段D從巴斯德畢赤酵母基因組DNA擴(kuò)增，在相應(yīng)ATG(靶基因的)的3起始方向上的200bp開始，直到ATG的3起始方向的1700bp。片段B由KanMX選擇標(biāo)記盒的前三分之二組成，并從pPM2aK21載體DNA模板中擴(kuò)增。片段B由KanMX選擇標(biāo)記盒的后三分之二組成，并從pPM2aK21載體DNA模板中擴(kuò)增。采用引物A_正向和B_反向通過重疊PCR使片段A和B退火在一起(AB)。采用引物C_正向和D_反向通過重疊PCR使片段C和D退火在一起(CD)。為了產(chǎn)生敲除菌株，用總共0.5μg的片段AB和CD的DNA轉(zhuǎn)化生產(chǎn)Fab的宿主菌株，其中片段AB和CD也是重疊的。在含有500μg/mL G418的YPD瓊脂平板上選擇細(xì)胞。通過PCR，采用引物對(duì)檢驗(yàn)(check)_正向(在靠近引物序列A_正向的5起始區(qū)域上結(jié)合)和檢驗(yàn)_反向(在靠近引物序列D_反向的3起始區(qū)域上結(jié)合)驗(yàn)證陽性敲除克隆。由于用KanMX盒替代了400bp區(qū)域(ATG周圍)，陽性敲除菌株的PCR產(chǎn)物條帶(band)比野生型序列的PCR產(chǎn)物條帶大。

表6

實(shí)施例7 進(jìn)料分批培養(yǎng)

在進(jìn)料分批生物反應(yīng)器培養(yǎng)中分析在小規(guī)模培養(yǎng)中具有最佳性能(使模型蛋白的產(chǎn)量增加了至少1.2倍改變)的實(shí)施例5和6的輔助因子工程化菌株，用于驗(yàn)證生產(chǎn)宿主菌株的改進(jìn)。使用了兩種方案。

a)進(jìn)料分批方案A

在具有1.0L的最大工作體積的1.4L DASGIP反應(yīng)器(Eppendorf,Germany)中進(jìn)行進(jìn)料分批。培養(yǎng)溫度控制在25℃，通過25％的氫氧化銨的添加將pH控制在5.0，通過控制攪拌器速度在400至1200rpm之間和空氣流量在24至72sL/h之間將溶解氧濃度維持在20％飽和度以上。

將用于進(jìn)料分批培養(yǎng)的接種物在含有100mL的YP培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)，并在28℃和108rpm下溫育約24小時(shí)，所述YP培養(yǎng)基含有20g/L甘油和50μg/mL博來霉素(Zeocin)。將培養(yǎng)物用于接種生物反應(yīng)器中0.4L的起始體積至1.0的起始光密度(600nm)。在約24小時(shí)后完成分批，并給出第一(10mL)鹽液(salt shot)。

然后將甘油進(jìn)料分批溶液以5mL/h的恒定速率進(jìn)料5小時(shí)。然后，向培養(yǎng)物中給予甲醇脈沖(2g)和鹽液(10mL)。在通過培養(yǎng)物中溶解氧濃度的增加指示甲醇脈沖消耗后，以1.0g/h的進(jìn)料速率開始用甲醇進(jìn)料分批溶液的恒定進(jìn)料。每10g新形成的生物質(zhì)給出10mL的鹽液，其對(duì)應(yīng)于～43g甲醇進(jìn)料培養(yǎng)基。隨著生物質(zhì)濃度的增加，當(dāng)短時(shí)間關(guān)閉甲醇進(jìn)料時(shí)培養(yǎng)物中溶解氧突然增加而導(dǎo)致甲醇累計(jì)能夠被消除時(shí)，甲醇進(jìn)料速率適當(dāng)?shù)卦黾?。最終甲醇進(jìn)料速度為2.5g/h。

經(jīng)常采集樣品用于生物質(zhì)的測(cè)定和Fab的定量(如實(shí)施例6中所述)。在約100小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到大于100g/L細(xì)胞干重時(shí)收獲培養(yǎng)物。

培養(yǎng)基如下：

分批培養(yǎng)基(每升)含有：2g檸檬酸、12.4g(NH₄)₂HPO₄、0.022g CaCl₂·2H₂O、0.9g KCl、0.5g MgSO₄·7H₂O、40g甘油、4.6mL PTM1痕量鹽儲(chǔ)備溶液。用25％的HCl將pH設(shè)定至5。

甘油進(jìn)料分批溶液(每升)含有：623g甘油、12mL PTM1痕量鹽儲(chǔ)備溶液和40mg生物素。PTM1的組成在實(shí)施例1中給出。

純甲醇的甲醇進(jìn)料分批溶液(每升)含有：12mL PTM1痕量鹽儲(chǔ)備溶液和40mg生物素。

鹽液溶液(每升)含有：20.8g MgSO₄·7H₂O、41.6KCl、1.04g CaCl₂·2H₂O

b)進(jìn)料分批方案B

將相應(yīng)的菌株接種到裝有50mL YPhyG的寬頸、帶擋板(baffled)、有蓋的300mL振蕩搖瓶中，并在28℃下以110rpm振蕩過夜(預(yù)培養(yǎng)物1)。從預(yù)培養(yǎng)物1中以O(shè)D₆₀₀(在600nm處測(cè)量的光密度)在下午晚些時(shí)候(倍增時(shí)間：約2小時(shí))達(dá)到約20(針對(duì)YPhyG培養(yǎng)基測(cè)量)的方式接種預(yù)培養(yǎng)物2(寬頸、帶擋板、有蓋的1000mL振蕩搖瓶中的100mL YPhyG)。預(yù)培養(yǎng)物2的溫育也在28℃，110rpm下進(jìn)行。

進(jìn)料分批在1.0L工作體積的生物反應(yīng)器(Minifors,Infors,Switzerland)中進(jìn)行。將所有生物反應(yīng)器(裝有400mL pH約為5.5的BSM-培養(yǎng)基)從預(yù)培養(yǎng)2分別接種至OD600為2.0。一般而言，巴斯德畢赤酵母在甘油上生長(zhǎng)以產(chǎn)生生物質(zhì)，并且所述培養(yǎng)物隨后經(jīng)受甘油進(jìn)料，隨后是甲醇進(jìn)料。

在初始分批階段，將溫度設(shè)定為28℃。在開始生產(chǎn)階段之前的最后一小時(shí)期間，將其降至25℃并在整個(gè)剩余過程中保持在該水平，同時(shí)pH降至5.0并保持在該水平。將整個(gè)過程(級(jí)聯(lián)控制：攪拌器，流量，氧補(bǔ)充)的氧飽和度設(shè)定為30％。以700至1200rpm施加攪拌并選擇1.0-2.0L/min的流量范圍(空氣)。使用25％銨實(shí)現(xiàn)pH在5.0的控制。根據(jù)需要通過加入消泡劑Glanapon 2000控制發(fā)泡。

在分批階段，生成生物質(zhì)(μ～0.30/h)直至約110-120g/L的濕細(xì)胞重量(WCW)。經(jīng)典的分批階段(生物質(zhì)產(chǎn)生)將持續(xù)約14小時(shí)。在11小時(shí)后開始以6g/(L*h)的恒定甘油進(jìn)料，并持續(xù)5小時(shí)。第一取樣點(diǎn)選為16小時(shí)(在下文中稱為誘導(dǎo)時(shí)間的“0小時(shí)”)。

在約95小時(shí)的時(shí)間內(nèi)供應(yīng)總共290g的甲醇(其具有由方程1+0.04*t(g/L)定義的線性增加的進(jìn)料速率)。

采用以下程序，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣：將取樣的培養(yǎng)液(broth)的第一個(gè)3mL(用注射器)棄去。將1mL的新鮮采集樣品(3-5mL)轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，并在13,200rpm(16,100g)下旋轉(zhuǎn)5分鐘。將上清液迅速轉(zhuǎn)移至一個(gè)單獨(dú)的小瓶中。

將1mL的培養(yǎng)液在稱量去皮的Eppendorf小瓶中以13,200rpm(16,100g)離心5分鐘，然后將所得的上清液準(zhǔn)確地移除。將小瓶稱重(精確度0.1mg)，并減去空瓶的皮重以獲得濕細(xì)胞重量。

培養(yǎng)基如下：

YPhyG預(yù)培養(yǎng)基(每升)含有：20g植物蛋白胨、10g細(xì)菌酵母提取物、20g甘油

分批培養(yǎng)基：修飾的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(BSM)(每升)含有：13.5mL H₃PO₄(85％)、0.5g CaCl·₂H₂O、7.5g MgSO₄·7H₂O、9g K₂SO₄、2g KOH、40g甘油、0.25g NaCl、4.35mL PTM1、8.7mg生物素、0.1mL Glanapon 2000(消泡劑)

進(jìn)料-溶液甘油(每kg)含有：600g甘油、12mL PTM1

進(jìn)料-溶液甲醇含有：純甲醇。

c)結(jié)果

表7列出了一些基因，與未工程化Fab生產(chǎn)對(duì)照菌株相比，這些基因的過表達(dá)顯示出增加在進(jìn)料分批生產(chǎn)過程中的巴斯德畢赤酵母中的Fab分泌。所述Fab產(chǎn)物效價(jià)通過ELISA定量(實(shí)施例5c)。生物質(zhì)被測(cè)定為濕細(xì)胞重量或干細(xì)胞重量。產(chǎn)物效價(jià)和產(chǎn)量的改變以相對(duì)于相應(yīng)對(duì)照菌株的倍數(shù)改變值表示。相對(duì)于平行地生長(zhǎng)和取樣的用于直接比較的AOX HyHEL和AOX SDZ親本宿主，進(jìn)料分批生產(chǎn)過程的倍數(shù)改變值表明了效價(jià)和產(chǎn)物產(chǎn)量的改善。

表7

如上所示，所有所列的基因在過表達(dá)后都成功地使模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的產(chǎn)量(mg/生物質(zhì))增加了至少20％(倍數(shù)改變＞1.2)。

表8列出了一些基因，與未工程化Fab生產(chǎn)對(duì)照菌株相比，這些基因的缺失顯示出增加在進(jìn)料分批生產(chǎn)過程中的巴斯德畢赤酵母中的Fab分泌。所述Fab產(chǎn)物通過ELISA定量(實(shí)施例5c)。產(chǎn)物效價(jià)和產(chǎn)量的改變以相對(duì)于相應(yīng)對(duì)照菌株的倍數(shù)改變值表示。

表8

如上所示，所有所列的基因在低表達(dá)時(shí)能夠使模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的Fab效價(jià)(mg/L)或Fab生產(chǎn)(mg/生物質(zhì))的產(chǎn)量增加至少28％(倍數(shù)改變＞1.28)。

實(shí)施例8：HP和HP與KO蛋白的組合

對(duì)于過表達(dá)靶標(biāo)的組合，使用在組成型pGAP啟動(dòng)子(如實(shí)施例4a和b中描述的方法產(chǎn)生)控制下的過表達(dá)HP3(‘3’)或HP10(‘34’)的CBS7435mutS pAOX SDZ-Fab菌株。對(duì)于過表達(dá)與低表達(dá)靶標(biāo)的組合，使用具有破壞的KO1基因座的CBS7435mutS pAOX SDZ-Fab菌株(在實(shí)施例6中描述)。在所有這些菌株中，編碼模型蛋白SDZ-Fab的質(zhì)?；诓﹣砻顾?Zeocin)作為選擇標(biāo)記，而共表達(dá)HP的質(zhì)粒或盒用于攜帶兩側(cè)為共定向loxP識(shí)別位點(diǎn)的KanMX抗性盒的KO基因座的破壞。

在用另外的HP或KO盒轉(zhuǎn)化之前，Cre重組酶再循環(huán)標(biāo)記基因表達(dá)盒(KanMX–兩側(cè)為loxP位點(diǎn))。因此，用附加型pTAC_Cre_HphMX4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化背景菌株，該附加型pTAC_Cre_HphMX4質(zhì)粒在釀酒酵母TPI啟動(dòng)子的控制下表達(dá)Cre重組酶，并且只要培養(yǎng)基中存在潮霉素(Hyg)的選擇壓力，該質(zhì)粒就短暫地保持在巴斯德畢赤酵母中。在28℃下，將轉(zhuǎn)化體在YPD/Zeo/Hyg瓊脂平板上生長(zhǎng)2天，然后在選擇性瓊脂平板上復(fù)印平板并在28℃下再生長(zhǎng)2天。僅選擇那些在2-3涂板輪次后喪失了在G418和Hyg上生長(zhǎng)的能力的克隆用于24深孔板(DWP)篩選(在實(shí)施例5a中描述)。按照實(shí)施例5c中的描述測(cè)定Fab的效價(jià)和產(chǎn)量。用另一過表達(dá)HP蛋白(在實(shí)施例4a和b中描述)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Fab產(chǎn)量和/或效價(jià)最佳的菌株。在選擇性瓊脂平板(含有Zeo和G418)上選擇具有兩個(gè)組合的HP或KO的轉(zhuǎn)化體，并按照實(shí)施例5中的描述篩選Fab分泌。對(duì)于進(jìn)一步的組合步驟，重復(fù)上述程序，從而得到具有三種組合等等的菌株。在所有篩選實(shí)驗(yàn)中，親本(＝前)菌株用作參照。

結(jié)果如下—表9：

“起源菌株”是指相應(yīng)地?zé)oHP或無敲除的巴斯德畢赤酵母菌株pAOX-SDZ-Fab#9。

“親本菌株”是指表達(dá)SDZ-Fab的巴斯德畢赤酵母菌株，其作為宿主菌株用于分別用下一HP或KO的轉(zhuǎn)化(例如，僅過表達(dá)HP3的菌株用于HP3和HP1的組合、過表達(dá)HP2的具有KO1敲除的菌株用于KO1HP2與HP3或HP1的組合)?？梢钥闯?，無論是與起源菌株相比還是與親本菌株相比，每一組合都導(dǎo)致了模型蛋白SDZ-Fab的Fab效價(jià)的增加。與親本菌株相比，F(xiàn)ab效價(jià)的增加表明HP或HP和KO蛋白的組合甚至可以進(jìn)一步提高由模型蛋白SDZ-Fab例示的POI的產(chǎn)量。

序列表

<110> 貝林格爾·英格海姆RCV兩合公司

山德士股份公司

VTU技術(shù)股份有限公司

隆薩有限公司

<120> 被工程化為過表達(dá)輔助蛋白的重組宿主細(xì)胞

<130> LC16310017P

<150> EP14165186.9

<151> 2014-04-17

<160> 163

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 95

<212> PRT

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740 745 750

Leu Gln Asp Phe Gly Asp Gly Thr Gly Pro Pro Thr Gly Thr Asp Asp

755 760 765

Met Glu Phe Asp Phe Asn Ser Phe Leu Asn Asn Glu Thr Gly Glu Pro

770 775 780

Asn Ser Ser Thr Ile His Phe Asp Asn Val Phe Asn Trp Gly Glu Gly

785 790 795 800

Thr Glu Ala Gly Asp Leu

805

<210> 11

<211> 149

<212> PRT

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 11

Met Val Val His Asn Pro Asn Asn Trp His Trp Val Asp Lys Asn Cys

1 5 10 15

Leu Pro Trp Ala Lys Ser Tyr Phe Gln Glu Val Leu Pro Asn Thr Thr

20 25 30

Gln Lys Asn Asp Ala Tyr Glu Ile Val Val Thr Ser Val Asp Leu Val

35 40 45

Asp Gly Asp Cys Asp Val Thr Gln Arg Lys Gly Val Thr Lys Cys Ile

50 55 60

Phe Asp Leu Lys Ile Gln Val Ser Ala Thr Val Lys Val Asn Thr Asn

65 70 75 80

Ser Glu Val Glu Glu Ile Ser Tyr Thr Val Thr Leu Pro Glu Leu Val

85 90 95

His Asp Gln Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Tyr Val Ile Glu Gly Asn Leu

100 105 110

Asp His Lys Ser Gln Ile Arg Lys Leu Leu Thr Pro Leu Leu Thr Glu

115 120 125

Lys Leu Ser Lys Phe Gln Gln Ala Leu Ile Asp Ala His Thr Gln Asp

130 135 140

Val Gln His Ser Thr

145

<210> 12

<211> 354

<212> PRT

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 12

Met Lys Ile Trp Leu Val Leu Leu Leu Val Phe Ala Thr Val Phe Ala

1 5 10 15

Glu Thr Asp Tyr Tyr Lys Val Leu Gly Val Ala Lys Asn Ala Asp Glu

20 25 30

Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Ser Leu Ser Lys Lys Phe His Pro

35 40 45

Asp Lys Asn Pro Gly Asp Asp Glu Ala Ala Gln Lys Phe Ile Gln Val

50 55 60

Gly Glu Ala Tyr Asp Val Leu Gly Asp Pro Glu Lys Arg Gln Arg Tyr

65 70 75 80

Asp Arg Phe Gly Ala Glu Gly Leu Asp Ser Arg Gln Glu Gln Phe His

85 90 95

Asp Pro Phe Asp Met Phe Gln Gln Phe Phe Gly Gly Gly Gly Gln Gln

100 105 110

His Arg Gly Lys Pro Lys Gly Lys Ser Ser Leu Leu His Leu Glu Phe

115 120 125

Ser Leu Gln Asp Phe Tyr Asn Gly Ala Ser Asn Asp Phe Arg Ile Glu

130 135 140

Met Gln Asn Ile Cys Glu Thr Cys Ser Gly Ser Gly Ser Gln Asp Gly

145 150 155 160

Lys Val His Gln Cys Asp Thr Cys Lys Gly His Gly Arg Val Val Gln

165 170 175

Thr Arg Gln Phe Gly Gly Gly Met Gln Gln Arg Phe Glu Thr Ile Cys

180 185 190

Pro Lys Cys Ser Gly Thr Gly Asn Leu Ile Thr His Lys Cys Lys Lys

195 200 205

Cys Gln Gly Asn Arg Val Val Arg Gly Pro Arg Ile His Asn Val His

210 215 220

Leu Gly Ala Gly Thr Ser Arg Asn His Val Glu Ile Leu Glu Gly Gln

225 230 235 240

Gly Asp Gln Ser Pro Asp Trp Ile Ala Gly Asp Leu Gln Ile Met Phe

245 250 255

Lys Glu Lys Ala Glu Gly Asn Met Gly Tyr Arg Arg Ile Gly Asn Asn

260 265 270

Leu Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Thr Leu Lys Glu Ala Leu His Gly Gly

275 280 285

Trp Glu Arg Gln Ile Ala Phe Leu Asp Lys Ile Glu Asn Thr Ile Thr

290 295 300

Leu Ser Lys Lys Lys Gly Glu Val Val Val Asp Gly Gln Val Asp Thr

305 310 315 320

Ile Lys Gly Arg Gly Met Pro Leu His Asp His Tyr Asp Glu His Gly

325 330 335

Asp Leu Phe Ile Lys Tyr His Ile Ile Tyr Pro Gln Gln Ile Arg Asp

340 345 350

Glu Leu

<210> 13

<211> 288

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 13

atgttaaaca agctgttcat tgcaatactc atagtcatca ctgctgtcat aggcgagacg 60

actacgtcat ctaccactgc cagtctctcc gaaagcccta ctctggtttg ggtgactggc 120

actgatgcaa gtgggagatt ggcaactaca cagtctgctt acactcaaca gttttcacag 180

ttatactcat ccatagcatc tccatcaagt ggtagcatag gcctgggtac tatccagggg 240

actgttggaa ttgtcagaac atatgagaca attacccttg ccagctaa 288

<210> 14

<211> 261

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 14

atgtctacag caattccagg aggacagaga acgttagcta aaagaagagc agcaaacttg 60

gataagaaac aggatgaacc aacctccgcc agatctgccg gtgctggagg ttcttcgtct 120

accatgctaa agttgtacac agacgaggcc caaggtttga aagttgatcc tttaattgtt 180

cttgttcttg ctgttggttt cattttcagt gtcattggtt tgcacgttgt tgctaagctg 240

acaggaaagt tgatcaacta a 261

<210> 15

<211> 1086

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 15

atgactcccc gttctcatat tttctttgac atctccatca acaaccagcc agctggcaga 60

ataatctttg agctcttcaa tgacattgtt cctaagacag cagagaattt tagagcttta 120

tctactggtg agaaaggtat aggtaagtct gggaaaccat tgcactacaa gggttctact 180

ttccatagga tcattaagga ttttatggta caaggtggtg actttaccaa cggtaacggt 240

actggaggcg aatccatata tggagaaaaa tttgaagatg aaaatttcca attgactcat 300

gacaaaccgt tccttctctc tatggcaaac gctggaccag gaactaatgg atcccagttt 360

tttatcacca ccgttcctac tcctcatctg gataacaagc atgtagtgtt tggaaaagta 420

attgctggta aagccacagt tagaaagatt gaaagaaact ccgaaggtga agctccaatt 480

gaacccgttg tcattgagga ctgtggtgaa cttccagaag acgcagattt gaccatctcc 540

gacgagactg gagacaagta tgaggaagtt ctgaaagata atgagaacat agacatcgat 600

gactttgaac aggtctacca ggccatcact gaaatcaaag aattgggtac aaagtatttc 660

aaaaatggtg acaccaaaat cgccttcgaa aagtatcaaa aggctgctaa ttatttgctg 720

gaatacatac catcagattt atcagaggaa cagagctcta agttggagct gctaaaaaca 780

tctgtcttct ccaacgtggc attggctgga ctgaaagttt ccaagttcaa agacacgatt 840

aagtatgcca cattggtcat tgaggatgaa tctgcggatg caaaggccaa gtccaaaggc 900

tactaccgta gaggaagtgc ttacagctca ctgaaagacg aagattcagc catctcagat 960

ttccagaaag cacttgaatt atccccaggt gatcctgcaa ttagccaatc tctacaaaga 1020

accacgaagg ccagaaaaga ccgtcttgcc aaagagaaag ctgctttgtc taagttcttt 1080

gagtag 1086

<210> 16

<211> 825

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 16

atgtcgtctg atgctgtgga gcaacttgaa aacttccagt tgatcaagtt cgacagattc 60

gatccttcaa cgcaatcgac tatcagaata gcgcgatctc ccaaaccaat tccagtcaag 120

gttgtgatag tgggagatgg tggatgtgga aagacatgtc ttctcaatgt ctttgccact 180

ggaacgtttc ctgaggcgta tgtccccaca atcatagaaa atgtggttat tacattggtg 240

accccaactg gccagatagc tgccgttact ctgtgggata ctgcagggca agaagagtac 300

gacagattga gacccctaag ctactccgac gttgacgtgg tcttgctgtg ctacagcata 360

gacaatctgt ccacctttca taatgtggcc gacaaatggt acccagaagt ggcacatttt 420

tgtccaaaca caccgatcat cttggtaggt accaaatctg atatgcggcg tcatcagaag 480

agtcagccgc actttgtatc tccccaggat tcgtcgcagt tggcaaggca gatgggggca 540

gtgatgaaca tcgagtgttc tgcgaaggag gtttcaaacg tcaatatcgt ttttgatgct 600

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gcaataatac cggacagaaa gaaacgcaaa tgtagcatta tttga 825

<210> 17

<211> 384

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 17

atgactaact ggaaagcgat attgactccc gctcaatacc aagtcctccg tttgggcgga 60

acagaaagac cgtataccgg acagtatgtg aacttcaaga aaaatggaac ctacttgtgt 120

agtgggtgtc aaactccgct ttacaaaagt ggcacaaaat ttgattcatc ttgtggttgg 180

cctgcattct atgaagcatt acctggagca gttaaacgaa tagaagacaa ttcgcttgga 240

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ggtgagggat ttgacactcc aacagattcc agacattgtg tcaacagcat cagcctaaaa 360

tttcaaggtg aagaagagaa ctaa 384

<210> 18

<211> 3084

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 18

atgactacaa acggccagaa aagacaaaaa actcgcaaac cacttttgat caacgcattt 60

gtcatgggat gtgctgggtt acagaatcct ggtttatgga agcatcccaa ggactcatcc 120

catagattta atcagattga tcactggact tatttggcca agttagccga aaaggggaag 180

tttaatgcgc tcttcattgc cgacgtcttg ggtggctatg atgtctacaa aggacctgag 240

aatttagcca ctcctgctgt ggctggagcc cagtggcctg tcaccgagcc cagtgctgtg 300

gtctccgcca tggctgcagt cacaactaac ttggcgtttg gagtgacgtt ctctactatc 360

agcgaagccc cctatcattt tgccagaaga ctgtccactt tagaccactt gaccaagggt 420

agaataggat ggaatgttgt ttcatcttac ttggagagtg ctgctcgtaa cctcttgaat 480

ggtgaaaaat tggacgagca tgaccaaaga tacttgaaag ctgaagagta cattcaaata 540

gtttatgagc tgttgttatc gtcttggaga gatgatgcag tagttttaga caagaaagct 600

ggtgtttata ctgacccaac aagatttcga aagatcaact ttgaaggtaa atttttcaaa 660

gttccgggac cacatattgt tgaccccacc cctcaaagac tgcctgtgat tcttcaagct 720

ggtacttcta aagttggtaa ggagtttgct gctaagcatg ccgagattgt gtttgtcatt 780

tcattttctc cagatgattt gaaacccaag attgcagaag ttcgtcaact ggccaaagaa 840

aagtttggta gaaaccacga cgatattaag tttgttgccc ttgcaacccc tgttattgga 900

gccacacatg aactagctga agaaaagtac caagagttac taagttatgg tgatattgaa 960

ggtgctcaag ccttatttgg agggtggact ggcattgacc tctctcaata tggcgaagat 1020

gaagaactag gaaatgttag ttccaatgct atgcgtggcg ctgtacaaaa ctggactaaa 1080

gcaattccaa atgagaagcg ttggacacgt aaggttattg ctaaacagat taccgttggt 1140

ggtctaggtc cagctttcgt tggaacccca gaagaaatcg ccgatgagct ggaacactgg 1200

tccgaccacg ctggtttgga cggattcaac ttcacttatg ctgtcaaccc gctttctttc 1260

gaagagatag tggaagactt gattccagtt cttcagcgaa gagggttggc ccaaaaggaa 1320

tacccaaatc cagaaactgg aagcacattc cgtaaaaacc tttttggaac agactttgta 1380

ccatctaccc acccagctta taacttaaga tggagggctg gtgtgtccaa ggaagaattc 1440

gaaaagtccc taaacgccac aacaaattgg tattccagtt tcgctaggtc aggtgctcta 1500

ggtgaattgc ataatacatg caggattctc tatctccaaa tagtgaaata taaatatagg 1560

cttcgagtcc gttcagaagg gaatagcatc cccttcgcca aaatgaccaa ggaaaatgaa 1620

gccaagaggc agaaaacctc tcaaccaaaa gcgaagaagc aattgattat caatgctttc 1680

atgtcaggct cttcgggtaa ccaatcgcca ggactgtggt cgtaccctgg agacaaatca 1740

acagagtata ctaccctaga ttactgggtg gagttagctc aaaagctgga aaaggccaaa 1800

ttccattcta tcttcattgc cgatgttctg ggtggatatg acgtttacaa tggacctgga 1860

aactacagtg ctgctgcaaa atctggtgcc caatttccaa tgattgaacc aagtgctgca 1920

gttactgcca tggctgctgc taccaagtca ataacgttcg gagtgacttt ttccactata 1980

agtgaggcac cttatcattt tgcaagaaga ttgggaactt tagatctgct gacaaacgga 2040

agagtcggct ggaatatcgt ctcttcgtat cttgacagtg ccgccagaaa tcttttgaat 2100

ggagaaccac tccctctcca tgcagaccgt tataagagag ccgaagaatt cctacaagtt 2160

gtatatcggt tattcctttc ttcatggaga gacgatgctt ataaattgga taagaaaacc 2220

agaacctttg ctgacccaaa acttattaga actatcgacc acgttggaga gttcttcaat 2280

gtcccaggcc cccagttcct accacccact cctcagagac taccgctgat tttgcaggct 2340

ggtacttcca aggttggtat ggattatgct gcaaaacatg cagaggttgt ctttttagct 2400

tcatttgacc cagagtcact ccaagaaaaa atcaaaacag tgagagatat cgctgaaacc 2460

aagtacaaca gaccaagaga ttcaatcaaa ttcttaattt tgataacagt agtcatagct 2520

gatacacacg aagatgccgt gaagagatac gaagatctcg ccagttatgc tgatctggaa 2580

ggggcccaag cactgttcag tggttggact ggaatagata ttggaaagta tggtgaagat 2640

gaacctcttg agcatgtgga atctaacgct attaagagcc atgttaagaa ctggactaag 2700

ttcaaggaca ataagcctag agccagaaaa gatatcgcta aacagattgg agttggaggc 2760

tcaggtccct tacttgttgg atctgtacaa gagatagccg acgagcttga gagatgggca 2820

gaagtctctg acctcgatgg ctttaacttc gcttacgcag attaccccca aacttttgat 2880

gatatcattg aaaaactgct tccagagttg aacaagagag gtgtgttctg ggatgattat 2940

aaaattccag gtggaacctt cagagagagc gtgtttggaa gaaagttcgt tgataaggat 3000

catcctgctt atgatctgag atggagaagt gaccaaacta gggaggagtt tgaaaagaaa 3060

ctggctgaat tggagaaaaa ataa 3084

<210> 19

<211> 1641

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 19

atgtctcatc tattactgcg tgacagcttt tggggaagga ccatctacca tctgagtaaa 60

cacaggtatt tctcttttcc tgaagagaaa gatggtttca ttgctcctga aaagtactac 120

ctgaatatgg accaagtatc gatacatgct gaatctgaga aaaatatagt ggaaggtttg 180

gtagacactt caaattcttc gttggaggaa gtaaagacca ctagagtcat agtcgactgg 240

gatgaatatg atcagaaaga aaatccccaa aactggagct cgcttttaaa gtgcttcgtt 300

gtttttgaag tgggaatctt aaccgtagct gtttatatgg gatctgcaat ttacactccc 360

ggtatagaag atattatgag agatctcaat gttagcagaa cggtggcaac acttccatta 420

accttgtttg tgattggata cgctgtgggt ccaatgatat tctcccccat gtctgagcat 480

cccgctatcg gaaggacaac gatatatgtg tggaccctgt tcatatttgc tatactacaa 540

atcccaacgg ccctgaccac taacattgct ggattttgca ttttgaggtt tattggaggg 600

ttttttgcgt caccagcatt agctacaggt ccagcttctg taggtgatgt tattgcaatc 660

ccgcacttgc ctgtagggtt aggcctttgg agtatctgtg ctgtttgtgg tccttctcta 720

ggaccacttt ttggagccat attttcccaa cttgtgagtt ggaggtggtg cttctggttt 780

ctgttaatta cctctgggac actatttata gttcttggct tcactttacc agaaacgtat 840

gtaccaaccc ttctttacag aaaggctagg aggctacgag cattaacaaa aaacgaactg 900

attatcagca aaggggagtt agatattcag gacagaactg ccaaggaagt tttgattgaa 960

tgcttatgga ggccagtcga catatcattc agagaccccg ttgtcttgat gataaatctt 1020

tacatttcaa tggtttattc tatttggtac atttggtttg aagcgtttcc tattgtattc 1080

ttagagatat atggattcag ccttattgga atgggagcta gttttgccgg aatcttaatt 1140

ggtgtcttaa tatgctctgc gtgctattgc tatgcgtgtc atgttacttt tgcaagaaga 1200

ataattgcaa acgaaaccat tcatcctgag ttctttgtac cgggcgctat tattggaggt 1260

tgcataatgc ccactggaat ctttattttg ggatggactg ccaccaaaag tgtccactgg 1320

attgtaccta taataggtag cggtttattt gctgctggtg gttatctcat tttccagaca 1380

ctcttcaact accttgcaat gtctttccct agatacatgg catcagcttt tgccggaaat 1440

gatcttttca ggtccttttc tgccagtgtt ttcccactgt ttggacatgc actatatgcc 1500

aacttgggat ccgaaaagtt ccctgttggt tggggttctt ctgtactggg gttcatcact 1560

gttgcaatga tcgcaattcc agtaactttc atgagatatg gtccaagatt gcgtgcaaat 1620

tctagatatg ccgggccatg a 1641

<210> 20

<211> 1068

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 20

atgacggact atgtcacttc taagcggcca gataacgtgc tcaattggac aagtattcat 60

gtatcgtcct ggatagggga gactattcct gagatcgatc caagtctact ccaaaatttt 120

ttagaacatg acattgcggg agatgttcta ccctacttga agtctgaaga tctgaaggaa 180

attgggatca acgagctcaa gcacagaatc tctataaaaa agaacattca tgaacttctt 240

gtgagcaatg aaaagcacat tgataccagt attctatcag acaccgctac cgagctagga 300

actttgatac tgactaataa attcataacc cagatggcga acagaaagaa tgttgtagat 360

gattccactc atcattcgaa taacagaagg ctcactgaac agtttaataa gcttcgcaaa 420

gatcttttgc cgatattcaa atggatcaag gagacccaac cattacccac tccagagaat 480

acacatttcg caaatatggg ttcagtacca gcatctcctg tggagcatac ttcaggtgag 540

tcaacattgt ctaaccccag tctaagcacc atcaatgctg gcgaaggagt gaactctgca 600

gttgcagggc aatctctcgg gaggaaacct acattatcct ccagaagaca atcacatgct 660

ttgtctccaa ctggtgaaca cctgaatgtg tcatcatcat ctccttcgac ggggaatttt 720

gaaactctga atggagaaag acccaatctt agatctgctt cgtcaggatc acaggaacat 780

actgagaacg aactattgaa gccgttgaga gttaaagcag atgagccttg ctataaggtg 840

attcagaatg ccatgaaaag acatggctta tcggtagatg attggcgcaa gtatgctttg 900

gtcatctgct atggagatga agaacgagta ctaggcttac atgaaaaacc tgggagtatc 960

ttcaaggaac tcaaagatca gaaacagaat cctgcaatca tgcttcgtca aattgacact 1020

aataatgacg atcagaacca tattgaaacc cctggaggga gattatga 1068

<210> 21

<211> 585

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 21

atgagatttt ctaacgtcgt tttaactgca attgccgctg ccggcgtaca ggcagatgaa 60

gccctttaca ctgtgttcta caatgatgtc actgagaacg cccaagagta tctgtcttac 120

atccaggcca atactgcggc tggtttcact gacctcttga gtctgtacac tgaactggcc 180

acttacaccg acgattctta cacaagtatc tttactgagg aggatttccc tgcgagcgaa 240

ctttcatcgt tcgttgttaa cctgccatgg tattcctcca gaattgagcc acaagttgcg 300

gctgctgaaa ctggtgaaag tgaggaggaa tcagagactg gtgaaagtga ggaagaatca 360

gagactggtg aggagacaga aactgagact ggatctgagt ctgaatctga gtctgaatcg 420

gagacctccg ctactggcac tggcactggc acctccgcct ctgagagcgc ggagactgaa 480

acttctaccg acgctgctgt gtctatcgat cacccaaagt ccaccttatt gatgggtttg 540

actgccgcag ttgtcagtat cactttcgga gtctttgcct tgtaa 585

<210> 22

<211> 2421

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 22

atgaacaagc caaacgggtc tgaacaacaa ccaccgtcac gcggaatgaa gcaagagtca 60

ggaggcccag ttacttcatc tacgacgccg ggtaccaata ctggcctaga aaactctcat 120

tccatggggg cggatatgga gcctgatgtt ggtgctacct ctcctcgcca tcttcttaat 180

gggtacattt acgattattt agtcaaatct aacatgcaaa atttggctga tcaatttgcc 240

caagagacgg agctcttaga aacagacttg acagtaccaa tggatacgcc ttcaggctat 300

cttctagaat ggtggatggt attctgggac cttttcaatg cccgcctaaa gcaacggggt 360

tcacagaagg cccaccagta tattcagttg aacatgctac gacaacagca acagaggacc 420

atgcgaaata cagcccgtgt tcaaaaagtc ccgttgaggc cacacaccca atcatctcct 480

tcaatgtcac agacttttat tccacagcag cctcaacagc aagcacaggg acaacagcac 540

gcccaggctc aagcccaagt gcaagcacat cagcaagccc aacaccacgc gcaggcacaa 600

gtgccagtgc aaccgcaaca gcaccagcta ggaggccaaa ctcaacagca gcaatccatt 660

aacactgggt ctcctgcggg tccaaatgct atcaactcgc gtgttcaaca cttagcacaa 720

caacagatga atcaccttcg ccagcaggcg actgccacta cgcaacaacc tatcccgcaa 780

cagaatatcc catcaaacca acagggtcct acaggccctt atcctacttc cccttcaaga 840

agaccgagat tactgtctaa cgaatcgggt gcaagtgcac cctctgtaat gacaaagtca 900

cagctccaag gagtccctcc ctcacaacaa ccacaccagc agcaaggtca gcaggtaggc 960

ccccctaatc aacatcaagg tcaatcttct tccttttatt cgggcatgcc tcctcaaggg 1020

gtcgtggttc ctcatcagtt caatcctcag cagtatgcca atatgctagc aagacaacag 1080

catgtacaag ctcaacaaca ggttcagtta caacaggtcc aacatgtaca acagagacaa 1140

cagcaagacc aacaacaaca ccgcctgtcc gccggttcac cggggcaccc ttcatttggc 1200

gtttttcaac aacctcctcc gatgtcaaac cataatcagg tcatgatcaa tcagcaggga 1260

gaaacttttt ttgatccaca ttctccatat gctcaaccta acgggtaccc ccagccacag 1320

caacaacaac aacaacagca acaacaacaa caacagcagc aaccgcaaca gcagcagcag 1380

cagcagcagc aacagaagca gcaaccacca ccaccaccac gacagcctca gcgccaacaa 1440

gcgatggcca tggctcctct gcctcactct acttctgccg ccggtactcc tcactcgtcc 1500

accacaccta gattctcgca acctggtcct gtttatcagc agcctttacc tgcatctcaa 1560

ccgcaacatt ctccgccttc ttctattcag cagccggagc tagttccaac tccagggtca 1620

caacatcagc aaatagcaca accacaatca cagagccaac accagcaatc gcaacagtct 1680

caatcaagtg cttctaaaat tgtaggtata caggagtatc agaaagagct aatgatgctt 1740

gagaaacaga acaaacagcg tcatgacatg gcatgtaaga agggaagcgg gcatttttct 1800

aactttgatc caattccaga gcacacaccg cccgaaccaa aatttaatgt gaatgtaatg 1860

ctccctcccc agaactctgc agtggtcacg aagaatactc ccggaacttc acctggtaca 1920

caaactcaaa acactgcaca tagtactggt aacacttctg cggggtctac accaaataat 1980

gtcgcacctg tacgaaagaa aaaggagcca gctaaaaaga aggcaaagaa agctactgag 2040

cccccgactc ccactactcc acagactcca attgcagcta ggacacatca aaactctaca 2100

ggcggcattc ctggtaataa tgctgctact aagcgacgaa aacgggagcc gctggttgat 2160

caaactgttt cacctaacct taacgaagct tccaagtcaa caaagaccgg aaaaatttca 2220

tctcaaactg actttacagg ttctgacaat ggattcttac aggattttgg cgatggaact 2280

ggtcctccca ctggaaccga tgatatggaa tttgatttta acagttttct taataacgaa 2340

actggcgaac ctaatagttc aaccattcat tttgacaatg tattcaattg gggagaaggt 2400

accgaagccg gagatttata g 2421

<210> 23

<211> 450

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 23

atggtggtgc acaaccctaa taactggcac tgggtcgaca agaactgcct tccttgggcc 60

aaaagctact ttcaggaagt ccttccaaac accactcaga agaatgacgc ctatgaaata 120

gtggtaacat ctgtggacct tgtagatgga gactgcgatg tcactcaacg taaaggtgtt 180

accaaatgta tttttgatct gaagatacag gtatctgcaa ccgtcaaagt caacacgaac 240

agtgaagtag aggagatcag ttatacagtg acattacctg aactggtgca cgaccaggac 300

gaggatgaat atgaatacgt aatagaggga aatttggatc acaagtctca aattagaaag 360

ctactcactc ctctgttgac cgagaagtta tcaaagtttc aacaagcttt gatagacgct 420

catactcagg atgttcagca tagtacctag 450

<210> 24

<211> 1065

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 24

atgaagatat ggctggtact tcttttagtt tttgccacgg tgtttgccga gacagattat 60

tataaagttc ttggagtagc taaaaatgcg gatgaaaaag atatcaagaa ggcctacaga 120

tcgttgagta agaagtttca tccagataag aacccgggtg atgatgaagc cgctcaaaag 180

ttcattcaag ttggagaagc ttatgatgtg cttggtgatc ccgagaagcg tcaaaggtat 240

gacagatttg gagcagaagg actggactca agacaggaac aattccatga tccatttgac 300

atgtttcaac agttcttcgg aggaggtgga cagcaacaca gaggcaaacc aaagggtaag 360

agttccttgt tacatttaga attcagtcta caagactttt acaatggtgc tagtaacgac 420

tttagaatcg aaatgcagaa tatctgtgaa acttgttctg gatcaggttc acaagacggg 480

aaagttcatc aatgtgacac ttgcaaaggg cacgggcgtg ttgttcaaac gagacagttt 540

ggtggtggca tgcaacagag gtttgaaaca atttgcccaa aatgttcagg aacaggaaat 600

ctgatcactc acaagtgtaa gaaatgccaa ggaaaccgtg tagttagagg acccagaatt 660

cacaatgtgc atttgggggc gggaactagt aggaaccatg ttgagatcct ggaaggtcag 720

ggagaccagt ctccagactg gattgcaggt gatctacaaa tcatgttcaa ggagaaagcc 780

gaaggcaaca tggggtatag aagaatagga aacaacctgt acagagacga agcattaacg 840

ctgaaagagg cattgcatgg tggctgggag agacaaattg cgtttttgga taaaatagag 900

aacacgatta ctctttccaa gaagaaagga gaggtggtag ttgacggcca agtagacacc 960

atcaagggta gagggatgcc attacatgac cactatgacg aacatggtga tctctttatc 1020

aagtaccata tcatttaccc gcaacaaatt agagacgaat tgtga 1065

<210> 25

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 25

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu

85 90 95

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

100 105 110

Thr Phe Ser His Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

115 120 125

Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr

130 135 140

Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

145 150 155 160

Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

165 170 175

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly

180 185 190

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

195 200 205

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

210 215 220

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

225 230 235 240

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

245 250 255

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

260 265 270

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

275 280 285

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

290 295 300

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

305 310

<210> 26

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 26

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln

100 105 110

Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

115 120 125

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro

130 135 140

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile

145 150 155 160

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

180 185 190

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

195 200 205

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

210 215 220

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

225 230 235 240

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

245 250 255

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

260 265 270

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

275 280 285

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

290 295

<210> 27

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 27

atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60

cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120

tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180

aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240

tctctcgaga agagagaggt ccaattggtc caatctggtg gaggattggt tcaaccaggt 300

ggatctctga gattgtcttg tgctgcttct ggtttcacct tctctcacta ctggatgtca 360

tgggttagac aagctcctgg taagggtttg gaatgggttg ctaacatcga gcaagatgga 420

tcagagaagt actacgttga ctctgttaag ggaagattca ctatttcccg tgataacgcc 480

aagaactcct tgtacctgca aatgaactcc cttagagctg aggatactgc tgtctacttc 540

tgtgctagag acttggaagg tttgcatggt gatggttact tcgacttatg gggtagaggt 600

actcttgtca ccgtttcatc tgcctctacc aaaggacctt ctgtgttccc attagctcca 660

tgttccagat ccacctccga atctactgca gctttgggtt gtttggtgaa ggactacttt 720

cctgaaccag tgactgtctc ttggaactct ggtgctttga cttctggtgt tcacaccttt 780

cctgcagttt tgcagtcatc tggtctgtac tctctgtcct cagttgtcac tgttccttcc 840

tcatctcttg gtaccaagac ctacacttgc aacgttgacc ataagccatc caataccaag 900

gttgacaaga gagttgagtc caagtatggt ccaccttaa 939

<210> 28

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 28

atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60

cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120

tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180

aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240

tctctcgaga agagagctat ccagttgact caatcaccat cctctttgtc tgcttctgtt 300

ggtgatagag tcatcctgac ttgtcgtgca tctcaaggtg tttcctcagc tttagcttgg 360

taccaacaaa agccaggtaa agctccaaag ttgctgatct acgacgcttc atcccttgaa 420

tctggtgttc cttcacgttt ctctggatct ggatcaggtc ctgatttcac tctgactatc 480

tcatcccttc aaccagaaga ctttgctacc tacttctgtc aacagttcaa ctcttaccct 540

ttgacctttg gaggtggaac taagttggag atcaagagaa ctgttgctgc accatcagtg 600

ttcatctttc ctccatctga tgagcaactg aagtctggta ctgcatctgt tgtctgctta 660

ctgaacaact tctacccaag agaagctaag gtccaatgga aggttgacaa tgccttgcaa 720

tctggtaact ctcaagagtc tgttactgag caagactcta aggactctac ttactccctt 780

tcttccacct tgactttgtc taaggctgat tacgagaagc acaaggttta cgcttgtgag 840

gttactcacc aaggtttgtc ttctcctgtt accaagtctt tcaacagagg tgaatgctaa 900

<210> 29

<211> 303

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 29

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu

85 90 95

Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp

100 105 110

Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn

115 120 125

Arg Leu Glu Tyr Met Gly Tyr Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr

130 135 140

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys

145 150 155 160

Asn Gln Tyr Tyr Leu Asp Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala

165 170 175

Thr Tyr Tyr Cys Ala Asn Trp Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

180 185 190

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

195 200 205

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

210 215 220

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

225 230 235 240

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

245 250 255

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

260 265 270

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

275 280 285

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

290 295 300

<210> 30

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 30

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu

85 90 95

Ser Val Thr Pro Gly Asn Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

100 105 110

Ser Ile Gly Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser

115 120 125

Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro

130 135 140

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile

145 150 155 160

Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser

165 170 175

Asn Ser Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

180 185 190

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

195 200 205

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

210 215 220

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

225 230 235 240

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

245 250 255

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

260 265 270

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

275 280 285

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

290 295

<210> 31

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 31

atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60

cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120

tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180

aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240

tctctcgaga agagagacgt tcaattgcaa gaatctggtc catccttggt taagccatcc 300

cagactttgt ccttgacttg ttccgttact ggtgactcca tcacttctga ctactggtcc 360

tggatcagaa agttcccagg taacagattg gagtacatgg gttacgtttc ttactccggt 420

tccacttact acaacccatc cttgaagtcc agaatctcca tcactagaga cacttccaag 480

aaccagtact acttggactt gaactccgtt actactgagg acactgctac ttactactgt 540

gctaactggg acggtgacta ttggggtcaa ggtactttgg ttactgtttc ctccgcttcc 600

actaagggtc catctgtttt tccattggct ccatcctcca agtctacttc aggtggtact 660

gctgctttgg gttgtttggt taaggactac ttcccagagc cagttactgt ttcttggaac 720

tccggtgctt tgacttccgg tgttcacact ttcccagctg tcttgcaatc ctccggtctg 780

tactccttgt cctccgttgt tactgttcct tcttcctcct tgggtactca aacttacatc 840

tgtaacgtta accacaagcc atccaacact aaggttgaca agagagttga gccaaagtcc 900

tgtgacaagt aatag 915

<210> 32

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 32

atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60

cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120

tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180

aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240

tctctcgaga agagagacat cgttttgact caatccccag ctactttgtc cgttactcca 300

ggtaactccg tttccttgtc ctgtagagct tcccagtcca tcggtaacaa cttgcactgg 360

tatcagcaga agtctcacga gtccccaaga ctgttgatca agtacgcttc ccaatccatc 420

tccggtatcc catctagatt ctctggttct ggttccggta ctgacttcac tttgtccatc 480

aactccgttg agactgagga cttcggtatg tacttctgtc agcaatccaa ctcctggcca 540

tacacttttg gtggtggtac taagttggag atcaagagaa ctgttgctgc tccatccgtt 600

ttcatcttcc caccatctga cgagcagttg aagtctggta ctgcttccgt tgtttgtttg 660

ttgaacaact tctacccaag agaagctaag gttcagtgga aggttgacaa cgccttgcaa 720

tccggtaact cccaagagtc cgttactgaa caagactcca aggactctac ttactccttg 780

tcctccactt tgactttgtc caaggctgac tacgagaagc acaaggttta cgcttgtgag 840

gttactcacc agggtttgtc ctccccagtt actaagtcct tcaacagagg tgagtgttaa 900

tag 903

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 33

actacctgca ggcgaaacga tgagattccc atc 33

<210> 34

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 34

tcatggccga ggcggcccta ttacttgtca caggactttg gctc 44

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 35

ctatggccga ggcggcccta ttaacactca cctctgttg 39

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 36

tatcggccga ggcggcccta ttacttacct ggggacaag 39

<210> 37

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 37

ctatggccga ggcggcccta ttaacactca cctctgttg 39

<210> 38

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 38

cttgcctgca ggatgctaac ggccagttgg tc 32

<210> 39

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 39

gatcggccga ggcggcctca gcagtattcc caccagaatc 40

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 40

cttgcctgca ggatgtcagt tcatttcgtt atagcagc 38

<210> 41

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 41

gatcggccga ggcggcctca tataaaaggt ttatcataat tctcatcctc ag 52

<210> 42

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 42

gaaacctgca ggatgtctga atttgttgct aaaattaaca ttc 43

<210> 43

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 43

gatcggccga ggcggcctta ggcggttgga acgttc 36

<210> 44

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 44

gaaacctgca ggatgtctca tctattactg cgtgacagc 39

<210> 45

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 45

gatcggccga ggcggcctca tggcccggca tatctag 37

<210> 46

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 46

gacacctgca ggatgtctga atcctccagt atctctctag ttg 43

<210> 47

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 47

gatcggccga ggcggcccta gatacatccc aaaagtgcac cg 42

<210> 48

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 48

gatacctgca ggatgatcct gggttcagtt tggg 34

<210> 49

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 49

gatcggccga ggcggcccta aaagtttgct gcagcatttg aag 43

<210> 50

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 50

cttgcctgca ggatgggttg ctttagattt tgtctgg 37

<210> 51

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 51

gatcggccga ggcggcccta tttgtatacg tgctgtggag cc 42

<210> 52

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 52

cttgcctgca ggatgttaaa caagctgttc attgcaatac tc 42

<210> 53

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 53

gatcggccga ggcggcctta gctggcaagg gtaattgtct c 41

<210> 54

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 54

gacacctgca ggatggctcc tcaaacacca agg 33

<210> 55

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 55

gatcggccga ggcggcctca aaaaaacaat ctcaaaatct ccag 44

<210> 56

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 56

gtaccctgca ggatgaccaa ggaaaatgaa gcc 33

<210> 57

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 57

gatcggccga ggcggcctta ttttttctcc aattcagcca g 41

<210> 58

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 58

gaaacctgca ggatgctgtt gtcacatacc atgatacttc 40

<210> 59

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 59

gatcggccga ggcggcctta agattgcttc tttttgagat tgg 43

<210> 60

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 60

gaaacctgca ggatgacgga ctatgtcact tctaagcg 38

<210> 61

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 61

gatcggccga ggcggcctca taatctccct ccagggg 37

<210> 62

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 62

gaaacctgca ggatgtcgtc tgatgctgtg gag 33

<210> 63

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 63

gatcggccga ggcggcctca aataatgcta catttgcgtt tctttc 46

<210> 64

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 64

cttgcctgca ggatgtctta tacgtcggac aacaaagag 39

<210> 65

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 65

gatcggccga ggcggcctta cgtgtatccg cttcctctgt ac 42

<210> 66

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 66

gatacctgca ggatgaactt gtacctaatt acattactat tcgc 44

<210> 67

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 67

gatcggccga ggcggcctta gaacccacat tgatttggat actg 44

<210> 68

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 68

gaaacctgca ggatgtcgtt atcaaccttt ctaggcg 37

<210> 69

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 69

gatcggccga ggcggcctca gactctactc atcattttgt cttcctc 47

<210> 70

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 70

gaaacctgca ggatgatgta caggaactta ataattgcta ctgc 44

<210> 71

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 71

gatcggccga ggcggcccta acactctatg aggtctacaa tgtccaac 48

<210> 72

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 72

catgcctgca ggatgtctac agcaattcca ggaggac 37

<210> 73

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 73

gatcggccga ggcggcctta gttgatcaac tttcctgtca gcttag 46

<210> 74

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 74

gacacctgca ggatgagtgg tgaccataag agctttacg 39

<210> 75

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 75

gatcggccga ggcggcctta ctgtgtacca taccgatcca atcc 44

<210> 76

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 76

cttgcctgca ggatgactaa ctggaaagcg atattgactc c 41

<210> 77

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 77

gatcggccga ggcggcctta gttctcttct tcaccttgaa attttaggc 49

<210> 78

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 78

gcaacctgca ggatgtctta tcgccctcag tttcaac 37

<210> 79

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 79

gatcggccga ggcggcctca atagatcttt ttcttttcat caaaactcaa c 51

<210> 80

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 80

gatacctgca ggatggtggt gcacaaccct aataac 36

<210> 81

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 81

gatcggccga ggcggcccta ggtactatgc tgaacatcct gagtatgag 49

<210> 82

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 82

gaaacctgca ggatgagatt ttctaacgtc gttttaactg c 41

<210> 83

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 83

gatcggccga ggcggcctta caaggcaaag actccgaaag tg 42

<210> 84

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 84

gacacctgca ggatgactgt gcctgatctg aaagaaac 38

<210> 85

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 85

gatcggccga ggcggcctca ggccagcgca acg 33

<210> 86

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 86

cttgcctgca ggatgaagat atggctggta cttcttttag tttttg 46

<210> 87

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 87

gatcggccga ggcggcctca caattcgtct ctaatttgtt gcg 43

<210> 88

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 88

cttgcctgca ggatggagca ggttccagtc g 31

<210> 89

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 89

gatcggccga ggcggcctta ttcatcataa acttcttcta tggtggc 47

<210> 90

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 90

cttgcctgca ggatggatcc tttttcaatt cttctcac 38

<210> 91

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 91

gatcggccga ggcggcccta ctttggagac agatcttcca ccttaac 47

<210> 92

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 92

gaaacctgca ggatgaccag tcaaggattt ttggatc 37

<210> 93

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 93

gatcggccga ggcggcccta tatgctatca accatctcca tcaaataac 49

<210> 94

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 94

gacacctgca ggatgactcc ccgttctcat attttc 36

<210> 95

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 95

gatcggccga ggcggcccta ctcaaagaac ttagacaaag cagctttctc 50

<210> 96

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 96

gatccctgca ggatggcaga agaagaacc 29

<210> 97

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 97

gatcggccga ggcggcccta attagtaata cttgcttcta tttcctggta caac 54

<210> 98

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 98

gaaccctgca ggatgatttt gagcaagctg tcgtttagac 40

<210> 99

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 99

gatcggccga ggcggcctta tttattaaca atgacatcat cttcaaactc g 51

<210> 100

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 100

cttgcctgca ggatgggtgc cattggaatg 30

<210> 101

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 101

gatcggccga ggcggcccta ttgcagaaca ttcgatatcc aatc 44

<210> 102

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 102

gatacctgca ggatgctacc attttcgtac gacgtg 36

<210> 103

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 103

gatcggccga ggcggcccta taactctcca ttctcctcgt cgatc 45

<210> 104

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 104

gatccctgca ggatgaaaat attaagtgca ttgcttcttc tttttac 47

<210> 105

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 105

gatcggccga ggcggcctta tagctcttgg tgtaataact gggg 44

<210> 106

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 106

cttgcctgca ggatgtctaa accctacaag ctgataggtg ag 42

<210> 107

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 107

gatcggccga ggcggcctta atcttctcca gcaggtatct catcc 45

<210> 108

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 108

cttgcctgca ggatgaatca attttctcta gcttcacaag taaac 45

<210> 109

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 109

gatcggccga ggcggcccta ctcggttaat ggtccgagtg c 41

<210> 110

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 110

gacacctgca ggatgagtta taggaaagac aacaaacaaa ag 42

<210> 111

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 111

gatcggccga ggcggcctta gaaggcagct tcatcatcg 39

<210> 112

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 112

cttgcctgca ggatgagcag cttcagagtt ctagacttgg 40

<210> 113

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 113

gatcggccga ggcggcctta cagatcaacg aatcc 35

<210> 114

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 114

gatacctgca ggatgaacat ctttagaatc ctaggtaagt ttcc 44

<210> 115

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 115

gatcggccga ggcggcctca ttctggcagc ttgaatttc 39

<210> 116

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 116

cttgcctgca ggatgtccac aactactaag aaaaacaaga acagg 45

<210> 117

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 117

gatcggccga ggcggcctta ccatgcaccc tttcctctc 39

<210> 118

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 118

cttgcctgca ggatgtcaga ggagtaagaa ccacaaacag 40

<210> 119

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 119

gatcggccga ggcggcctca atttattcta ggttttttgg ttcgg 45

<210> 120

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 120

gtaccctgca ggatgatggc aagtccaacc g 31

<210> 121

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 121

gatcggccga ggcggcccgc aacaacgctg gttg 34

<210> 122

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 122

cttgcctgca ggatgagtaa ccagtataat ccgtatgagc ag 42

<210> 123

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 123

gatcggccga ggcggcccta tcttccccag tttccgacac 40

<210> 124

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 124

gttacctgca ggatgtctac agagaacaaa gcagagacaa aac 43

<210> 125

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 125

gatcggccga ggcggcccta tttctttgct tcagcgtttg c 41

<210> 126

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 126

cttgcctgca ggatgttaaa cttaatatcc acaataagtg ggtg 44

<210> 127

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 127

gatcggccga ggcggcctta agcaggagca gataaccaag c 41

<210> 128

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 128

cttgcctgca ggatgggtag aaggaaaata gagataaatc cg 42

<210> 129

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 129

gatcggccga ggcggcctca gctcttctta gtcacactgc ttg 43

<210> 130

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 130

cttgcctgca ggatgtcact tcaactgtcc attatcttcg 40

<210> 131

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 131

gatcggccga ggcggcccta ctcgtccttc ttgttgctct tctc 44

<210> 132

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 132

cgaacatcca tcaccaaaac ac 22

<210> 133

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 133

gttgtcgacc tgcagcgtac ggtgttgccg cgaaatg 37

<210> 134

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 134

catttcgcgg caacaccgta cgctgcaggt cgacaac 37

<210> 135

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 135

cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24

<210> 136

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 136

aagcccgatg cgccagagtt g 21

<210> 137

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 137

cgtctcttgg gcaaattgat cagtggatct gatatcacct a 41

<210> 138

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 138

taggtgatat cagatccact gatcaatttg cccaagagac g 41

<210> 139

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 139

gactgttgcg attgctggtg 20

<210> 140

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 140

atccaggaca cgctcatcaa g 21

<210> 141

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 141

gtgtgtgctc tggaattgga tc 22

<210> 142

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 142

agaggaggtt gaatgcgaag aag 23

<210> 143

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 143

gttgtcgacc tgcagcgtac ttctggtgag cttatatggc agtagttac 49

<210> 144

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 144

gtaactactg ccatataagc tcaccagaag tacgctgcag gtcgacaac 49

<210> 145

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 145

cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24

<210> 146

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 146

aagcccgatg cgccagagtt g 21

<210> 147

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 147

ctcgggatca ccaagcacaa gtggatctga tatcaccta 39

<210> 148

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 148

taggtgatat cagatccact tgtgcttggt gatcccgag 39

<210> 149

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 149

tcaaagtatg ctgggaagaa tgg 23

<210> 150

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 150

tggattgtct cggaggcg 18

<210> 151

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 151

tactatgact atgggagacc tgggtg 26

<210> 152

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 152

tgaagcatcc cacccactg 19

<210> 153

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 153

gttgtcgacc tgcagcgtac ccttcgcaga ctgtaattat tggc 44

<210> 154

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 154

gccaataatt acagtctgcg aagggtacgc tgcaggtcga caac 44

<210> 155

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 155

cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24

<210> 156

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 156

aagcccgatg cgccagagtt g 21

<210> 157

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 157

gttgactttg acggttgcag atacagtgga tctgatatca ccta 44

<210> 158

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 158

taggtgatat cagatccact gtatctgcaa ccgtcaaagt caac 44

<210> 159

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 159

ttctctcctt gattatcggt ctctttc 27

<210> 160

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 160

tggcagatga cttcacaaac g 21

<210> 161

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的構(gòu)建體

<400> 161

gtggcatctt tcataacgac atctc 25

<210> 162

<211> 478

<212> PRT

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 162

Met Ser Ser Phe Arg Val Leu Asp Leu Val Lys Pro Phe Thr Pro Phe

1 5 10 15

Leu Pro Glu Val Ile Ser Pro Glu Arg Lys Val Pro Phe Gln Gln Lys

20 25 30

Leu Met Trp Thr Gly Val Thr Leu Leu Ile Phe Leu Val Met Ser Glu

35 40 45

Ile Pro Leu Tyr Gly Ile Thr Ser Ser Asp Ser Ser Asp Pro Leu Phe

50 55 60

Trp Leu Arg Met Met Leu Ala Ser Asn Arg Gly Thr Leu Met Glu Leu

65 70 75 80

Gly Ile Ser Pro Ile Val Thr Ser Gly Met Val Phe Gln Leu Leu Gln

85 90 95

Gly Ile Gln Ile Leu Asp Val Asn Met Glu Asn Lys Ala Asp Arg Glu

100 105 110

Leu Phe Gln Thr Ala Gln Lys Val Phe Ala Ile Leu Leu Ser Ile Gly

115 120 125

Gln Ala Thr Val Tyr Val Leu Thr Gly Met Tyr Gly Pro Pro Gly Glu

130 135 140

Leu Gly Val Gly Val Cys Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu Val Phe Ala

145 150 155 160

Gly Ile Val Val Ile Leu Leu Asp Glu Leu Leu Gln Lys Gly Tyr Gly

165 170 175

Leu Gly Ser Gly Ile Ser Leu Phe Met Ala Thr Asn Ile Cys Glu Gln

180 185 190

Ile Phe Trp Lys Thr Phe Ala Pro Thr Thr Val Asn Arg Gly Arg Gly

195 200 205

Lys Glu Phe Glu Gly Ala Phe Ile Ser Phe Phe His Leu Ile Leu Thr

210 215 220

Lys Lys Asp Lys Lys Arg Ala Leu Leu Glu Ser Phe Tyr Arg Asp Asn

225 230 235 240

Ala Pro Asn Met Phe Gln Val Ile Ala Thr Leu Val Val Phe Phe Thr

245 250 255

Val Val Tyr Leu Gln Gly Phe Arg Leu Glu Ile Pro Val Lys Ser Thr

260 265 270

Arg Gln Arg Gly Pro Tyr Gly Thr Tyr Pro Ile Arg Leu Phe Tyr Thr

275 280 285

Ser Asn Met Pro Ile Met Leu Gln Ser Ala Leu Thr Ser Asn Ile Phe

290 295 300

Ile Ile Ser Gln Met Leu Tyr Ser His Phe Pro Asp Asn Ala Phe Val

305 310 315 320

Lys Leu Ile Gly Thr Trp Glu Ala Gln Pro Gly Ser Ala Gln Leu Phe

325 330 335

Ala Ala Ser Gly Leu Ala Tyr Tyr Met Gln Pro Pro Met Ser Leu Ser

340 345 350

Gln Ala Leu Leu Asp Pro Ile Lys Thr Val Val Tyr Val Val Phe Val

355 360 365

Leu Thr Thr Cys Ala Ile Phe Ser Lys Thr Trp Ile Glu Ile Ser Gly

370 375 380

Ser Ser Pro Arg Asp Val Ala Lys Gln Phe Lys Asp Gln Gly Leu Val

385 390 395 400

Ile Ala Gly His Arg Asp Ala Thr Val Tyr Lys Glu Leu Lys Lys Ile

405 410 415

Ile Pro Thr Ala Ala Ala Phe Gly Gly Ala Thr Ile Gly Ala Leu Ser

420 425 430

Val Val Ser Asp Leu Leu Gly Thr Leu Gly Ser Gly Thr Ser Ile Leu

435 440 445

Leu Ala Val Thr Thr Ile Tyr Gly Tyr Tyr Glu Leu Ala Val Lys Glu

450 455 460

Gly Gly Phe Ser Lys Gly Gly Pro Ser Gly Phe Val Asp Leu

465 470 475

<210> 163

<211> 1437

<212> DNA

<213> 巴斯德畢赤酵母

<400> 163

atgagcagct tcagagttct agacttggta aagcccttta ccccatttct gcctgaggtt 60

atctctccag agagaaaggt cccctttcaa cagaagttga tgtggactgg agtcactctt 120

ctgatcttct tggtcatgag tgaaattccc ctgtatggta tcacttcaag tgactcctct 180

gaccctttgt tttggctgcg tatgatgttg gcctctaaca gaggaacgct gatggagtta 240

ggtatctctc ctattgtcac ttctggaatg gtgttccaac tgttgcaggg aatccaaatc 300

ttggacgtga acatggaaaa caaagcagac agagagttgt tccaaactgc tcaaaaagtg 360

ttcgccattt tgctgagtat cggacaagct actgtttatg ttttaactgg aatgtatggc 420

ccccctggtg aactaggagt tggtgtctgt cttttgttgg ttcttcaatt ggtgtttgca 480

ggtattgtgg tcattttgtt ggatgaactc ttacaaaaag gttacggttt aggaagtgga 540

atttctcttt tcatggccac caacatttgt gagcagattt tttggaagac ttttgctcct 600

accaccgtta accgtggaag aggtaaggaa tttgaaggag ctttcatttc tttctttcac 660

ctgatcttga ccaagaagga caagaagaga gctctgttgg aatcatttta cagagacaac 720

gctccaaaca tgttccaagt tattgctact cttgtcgtct ttttcaccgt tgtctatctt 780

cagggcttcc gtttggagat tccagttaag tctacccgtc aaagaggtcc ttacggaact 840

tacccaatca gattgttcta cacatccaac atgccaatca tgttacaatc cgctttgacc 900

tcaaacattt tcattatttc ccagatgttg tattcacact tccctgacaa tgcctttgtt 960

aagctcattg gaacttggga agctcaacct ggttcagcac aactgtttgc tgcctcggga 1020

ttagcctact acatgcagcc tccaatgtcc ctgagtcaag ctttattaga ccctatcaag 1080

actgtcgtct acgttgtgtt tgttttgacc acttgtgcca tcttctccaa gacatggatt 1140

gagatttcgg gatcttcccc aagagacgtt gctaagcaat tcaaagacca aggattggtt 1200

attgctggac acagagatgc tactgtttac aaggagttga agaagattat accaacagcc 1260

gctgcatttg gaggtgccac aattggtgca ctttccgttg tttccgacct tttgggtact 1320

ttaggttcgg gaacctccat ccttttggct gttacaacca tctatggtta ctacgagttg 1380

gctgttaagg aaggtggttt ttcaaagggt ggaccctctg gattcgttga tctgtaa 1437