專利名稱：：對(duì)腦膜炎奈瑟球菌所致疾病具有廣譜保護(hù)作用的gna1870囊泡疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及預(yù)防腦膜炎奈瑟球菌(A^^w^mem'"g"W/力所致疾病的廣譜疫苗。
背景技術(shù)：
：腦膜炎奈瑟球菌是寄居在人上呼吸道中的革蘭陰性細(xì)菌，最值得注意的是其導(dǎo)致腦膜炎和膿毒癥在世界范圍零星和周期性流行爆發(fā)。2歲以下兒童中發(fā)病和死亡率最高。與其它革蘭陰性細(xì)菌相同，腦膜炎奈瑟球菌通常具有細(xì)胞質(zhì)膜、肽聚糖層、與莢膜多糖一起構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁的外膜和突出在外環(huán)境中的菌毛。腦膜炎奈瑟球菌的有被膜菌株是兒童和年輕人細(xì)菌性腦膜炎和敗血癥的主要病因(Rosenstein等，JInfectDis1999;180:1894-卯1)。人是腦膜炎奈瑟球菌屬的已知唯一貯存宿主(reservoir)。因此，奈瑟球菌演化出各種高度有效的策略來(lái)逃避人免疫系統(tǒng)。這些策略包括表達(dá)結(jié)構(gòu)上與宿主聚唾液酸相同的莢膜多糖(即，血清群B)和抗原性高易變的免疫優(yōu)勢(shì)非莢膜表位，即較大量存在于表面、抗生素易于接近和能引發(fā)強(qiáng)烈抗體應(yīng)答的抗原表位。侵襲性腦膜炎奈瑟球菌感染的流行和經(jīng)濟(jì)上的重要性促使研究能賦予對(duì)各血清型，特別是B群血清型或血清亞型免疫力的有效疫苗。然而，開(kāi)發(fā)廣譜疫苗的許多工作受阻于奈瑟球菌可逃避人免疫系統(tǒng)的各種高度有效的策略?，F(xiàn)有的莢膜疫苗可預(yù)防A、C、Y和W-135群菌株所致疾病(綜述見(jiàn)Gmnoff等，MeningococcalVaccines(腦膜炎球菌疫苗)，刊于PlotkinSA，OrensteinWA編，Vaccines(《疫苗》)，第四版，Philadelphia:W.B.SaundersCompany,2003)。然而，美國(guó)或歐洲尚未批準(zhǔn)使用預(yù)防B群菌株所致疾病的疫苗，B群菌株所致疾病在北美占該疾病的約30%(Lingappa等，Vaccine2001;19:4566-75;Raghunathan等，AnnuRevMed2004，55:333-5)，在歐洲病例超過(guò)三分之二(Cartwright等，Vaccine2001，19:4347-56;Trotter等，Lancet2004，364:365-7)。缺乏B群莢膜疫苗的原因之一是B群莢膜能在人體中引發(fā)自身抗體應(yīng)答(Finne等，Lancet1983，2:355-7)，其多糖即使與載體蛋白綴合后其免疫原性亦很弱(Jennings等，JImmunol1981，127:1011-8)。能引發(fā)自身反應(yīng)性抗B群莢膜抗體的B群莢膜疫苗也有潛在的安全問(wèn)題。因此，近年來(lái)B群腦膜炎球菌疫苗的研究集中在利用非莢膜抗原。已證實(shí)外膜囊泡(OMV)疫苗能誘導(dǎo)人產(chǎn)生抗B群腦膜炎球菌疾病的保護(hù)性免疫力(綜述見(jiàn)Jodar等，Lancet2002，359:1499-1508)。近年來(lái)，為響應(yīng)公共健康干預(yù)，新西蘭許可并引入OMV疫苗來(lái)阻止己流行10年以上的B群(細(xì)菌)(Thomas等，NZMedJ2004，117:U1016;Desmond等，NursNZ2004，10:2;Baker等，JPaediatrChildHealth2001，37:S13-9)。免疫接種其它囊泡的方法已有描述(參見(jiàn)，例如CartwrightK等，1999,Vaccine,17:2612-2619;deKleinjn等，2000,Vaccine,18:1456-1466;RouupevanderVoortER,2000,Vaccine,18:1334-1343;Tappero等，1999,JAMA281:1520;RouupevanderVoortER,2000,Vaccine,18:1334-1343;US2002/0110569;WO02/09643)。兒童和成年人免疫接種腦膜炎球菌外膜囊泡(OMV)疫苗能誘導(dǎo)血清殺菌抗體，產(chǎn)生抵御疾病的血清學(xué)相關(guān)保護(hù)作用(Goldschneider等，1969，J.Exp.Med.129:1307)。采用隨機(jī)化前瞻性臨床試驗(yàn)和追溯性病例-對(duì)照研究，在年紀(jì)較大兒童和成年人中直接證實(shí)了OMV疫苗有預(yù)防腦膜炎球菌B疾病的效力。因此，外膜囊泡疫苗的臨床效力毋庸置疑。新西蘭已許可這種疫苗應(yīng)用于兒童，在挪威即將許可應(yīng)用于年紀(jì)較大的兒童和成人，在其它歐洲國(guó)家處于后期臨床開(kāi)發(fā)許可中。古巴的FinleyInstitute(芬利研究院)制備的OMV疫苗已可商品化購(gòu)得，已給予南美洲的數(shù)百萬(wàn)兒童。然而，針對(duì)OMV疫苗的血清殺菌抗體應(yīng)答有菌株特異性傾向(Tappero等，1999,JAMA281:1520;RouupevanderVoortER,2000,Vaccine,18:1334-1343)。此外，目前可用的OMV疫苗也受限于其殺菌抗體應(yīng)答主要定向針對(duì)其主要通道蛋白，PorA的表面暴露環(huán)(Tappero等，JAMA1999，281:1520-7)，該蛋白的抗原性可發(fā)生變異(Sacchi等，JInfectDis2000，182:1169-76)。由于PorA的免疫優(yōu)勢(shì)，所誘導(dǎo)的特異性免疫力主要針對(duì)獲得膜囊泡的菌株(Tappero等，1999,JAMA281:1520;MartinSL等，2000,Vaccine,18:2476-2481)。因此，OMV疫苗可用于預(yù)防流行區(qū)中由一種PorA血清亞型的優(yōu)勢(shì)腦膜炎球菌菌株，例如新西蘭的P1.4流行菌株所致疾病(Baker等，2001，同上)。然而，導(dǎo)致流行病的菌株，例如在美國(guó)發(fā)現(xiàn)的菌株中PorA有極大多樣性(Sacchi等，2000，同上)。此外，即使很少的氨基酸多態(tài)性也可能降低菌株對(duì)PorA抗體殺菌活性的敏感性(Martin等，Vaccine2000，18:2476-81)。幾種腦膜炎奈瑟球菌菌株基因組測(cè)序項(xiàng)目的完成提供了所有潛在的腦膜炎球菌蛋白抗原的目錄信息。聯(lián)用生物信息學(xué)、微陣列技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫篩選已鑒定了大量候選的新腦膜炎球菌疫苗(Pizza等，Science2000，287:1816-20;DeGroot等，ExpertRevVaccines2004，3:59-76)。這些大量候選對(duì)象中有源自基因組的奈瑟球菌抗原1870(GNA1870)。GNA1870也稱為NMB1870(WO2004/048404)或LP2086(參見(jiàn)，例如Fletcher等，InfectImmun200472:2088-2100)，它是在所測(cè)試的所有腦膜炎球菌菌株均表達(dá)的約27kDa的脂蛋白(Masig腿i等，JExpMed2003，197:789-99;Giuliani等，Infect.Immun2005，73:1151-60;Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15)。根據(jù)氨基酸序列的變異和免疫學(xué)交叉反應(yīng)性可將腦膜炎奈瑟球菌菌株亞分類為三種GNA1870變體群(v.、v.2和v.3)(Masignani等，JExpMed2003，197:789-99)。變體1菌株占致病性B群分離株的約60%(Masignani等，2003，同上)。在各變體群中，氨基酸序列保守性達(dá)約92%或更高。用重組GNA1870免疫的小鼠對(duì)表達(dá)同源變體群GNA1870蛋白的菌株產(chǎn)生了高度血清殺菌抗體應(yīng)答(Masignani等，2003，同上;Welsch等，2004，同上)。然而，表達(dá)各GNA1870蛋白亞變體的許多菌株對(duì)抗-GNA1870補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用耐受。雖然此現(xiàn)象的原因未知，據(jù)信可能是因?yàn)镚NA1870的少量多態(tài)性或細(xì)菌表面上GNA1870的關(guān)鍵性表位的可接近性存在菌株差異從而導(dǎo)致抗-GNA1870抗體的結(jié)合和/或補(bǔ)體激活降低。以上免疫原性研究中所用的重組GNA1870蛋白疫苗是在大腸桿菌中表達(dá)的缺乏前導(dǎo)肽的His-標(biāo)簽蛋白。該重組蛋白也缺乏翻譯后脂質(zhì)化所需的基序，可能會(huì)降低其免疫原性(Fletcher等，InfectImmun2004，72:2088-100)。研究了重組PorA和重組GNA1870混合疫苗的潛力(Fletcher等，InfectImmun2004,72:2088-1200)。將該混合疫苗給予小鼠時(shí)，對(duì)兩種抗原的抗體應(yīng)答沒(méi)有明顯干擾。然而，該重組混合物需要恢復(fù)PorA表位的構(gòu)象，這是引發(fā)抗-PorA殺菌抗體所需(參見(jiàn)，例如Christodoulides等，Microbiology,1998，144:3027-37和Muttilainen等，MicrobPathog1995，18:423-36)。該混合重組疫苗也未顯示能提高針對(duì)表達(dá)疫苗所用GNA1870蛋白亞變體的腦膜炎奈瑟球菌菌株的抗-GNA1870殺菌抗體。O'Dwyer等(InfectImmun2004，72:651l-80)描述了共生黃色奈瑟球菌(7V.y7avMce""菌株的外膜囊泡(OMV)疫苗制品，該菌株經(jīng)遺傳改造能表達(dá)奈瑟菌表面蛋白A(NspA)，該制品是一種黃色奈瑟球菌天然不表達(dá)的高度保守腦膜炎球菌膜蛋白候選疫苗。免疫的小鼠產(chǎn)生了NspA-特異性血清調(diào)理吞噬(opsonophagocytic)活性。另外，抗體經(jīng)OMV吸附后，殘留的抗-NspA抗體也能賦予用被囊腦膜炎奈瑟球菌菌株致死攻擊的小鼠被動(dòng)保護(hù)作用。然而，在此項(xiàng)研究中，修飾的黃色奈瑟球菌OMV疫苗引發(fā)的抗體保護(hù)作用顯示不優(yōu)于不表達(dá)該異源抗原的黃色奈瑟球菌引發(fā)的保護(hù)作用。修飾的黃色奈瑟球菌OMV也未引發(fā)血清殺菌抗體應(yīng)答，而在以前的研究中，用大腸桿菌囊泡中表達(dá)(Moe等，InfectImmun1999，67:5664-75;Moe等，InfectImmun2001，69:3762-71)或在月旨質(zhì)體中重建(Martin等，干U于ThirteenthInternationalPathogenicNeisseriaConference(第13屆國(guó)際病原性奈瑟球菌大會(huì))，Oslo:NordbergAksidenstrykkeriAS,2002)的重組NspA免疫的小鼠產(chǎn)生了血清殺菌抗體。PCT公布號(hào)WO02/09746和美國(guó)公布號(hào)US20040126389也描述了由經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)奈瑟球菌抗原的菌株制備的OMV，這種抗原的具體例子是NspA、Omp85、菌毛(PiIQ、PiIC)、PorA、PorB、Opa、Tbp2、TbpA、TbpB、Hsf、PldA、HasR、FrpA/C、FrpB、Hap、LbpA/LbpB、FhaB、Iipo02、MltA禾口ctrAi。本發(fā)明克服了該疫苗現(xiàn)有技術(shù)方法的缺點(diǎn)，可引發(fā)抗廣譜腦膜炎奈瑟球菌菌株，特別是(但不限于)包括屬于血清群B菌株的保護(hù)性免疫力。參考文獻(xiàn)Bjune等，NIPHAnn1991，14:125-30;討論130-2;Chen等，刊于ThirteenthInternationalPathogenicNeisseriaConference(第13屆國(guó)際病原性奈瑟球菌大會(huì))，NordbergAksidenstrykkeriAS，2002;Christodoulides等，Microbiology1998，144(第11部分):3027-37;Claassen等，Vaccine1996，14:1001-8;deKleijn等，Vaccine2000，18:1456-66;Frasch等，Meningococcalvaccines:methodsandprotocols(腦膜炎球菌疫苗方法與策略)，Totowa，新澤西HumanaPress,2001:81-107;Fukasawa等，F(xiàn)EMSImmunolMedMicrobiol2004，41:205-10;Hoist等，Vaccine2003，21:734-7;Humphries,Vaccine2004，22:1564-9;Jansen等，F(xiàn)EMSImmunolMedMicrobiol2000，27:227-33;Kijet等，刊于ThirteenthInternationalPathogenicNeisseriaConference(第13屆國(guó)際病原性奈瑟球菌大會(huì))，NordbergAksidenstrykkeri,2002;Martin等，Vaccine2000，18:2476-81;McGuinness等，Lancet1991，337:514-7;Morley等，Vaccine2001，20:666-87;Muttilainen等，MicrobPathog1995，18:423-36;Parmar等，BiochimBiophysActa1999，1421:77-90;Newcombe等，InfectImmun2004，72:338-44;O'Dwyer等，InfectImmun2004，72:6511-8;Oliver等，InfectImmun2002，70:3621-6;Peeters等,Vaccine1996，14:1009-15;Peeters等，Vaccine1999，17:2702-12;Rouppe■derVoort等，Vaccine2000，18:1334-43;Sanchez等，Vaccine2002，20:2964-71;Steeghs等，EMBOJ2001,20:6937-45;Steeghs等，JEndotoxinRes2004，10:113-9;Tro腦so等，F(xiàn)EMSImmunolMedMicrobiol2000，27:103-9;Vandeputte等，JBiolChem2003;vanderLeyP等，Vaccine1995，13:401-7;Claassen等，Vaccine1996，14:1001-8;Peeters等，Vaccine1996，14:1009-15;Cantini等，JBiolChem.2005年12月31日；[印刷前的電子版]。發(fā)明概述總體上，本發(fā)明提供能在對(duì)象中引發(fā)抵御奈瑟球菌屬細(xì)菌，特別是抵御腦膜炎奈瑟球菌血清群B菌株的免疫應(yīng)答的方法和組合物。一方面，本發(fā)明的特征在于含有由第一種奈瑟球菌制備的抗原性囊泡和藥學(xué)上可接受的載體的組合物，其中所述奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)能引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡產(chǎn)品。所述囊泡可以是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV和MV的混合物。奈瑟球菌可以是天然產(chǎn)生的細(xì)菌或其GNA1870多肽的產(chǎn)生經(jīng)遺傳改造(例如，由異源啟動(dòng)子表達(dá)GNA1870多肽，表達(dá)外源性GNA1870多肽等)。對(duì)于宿主細(xì)胞，該GNA1870多肽可以是內(nèi)源性的。在一些實(shí)施方式中，遺傳修飾該奈瑟菌種細(xì)菌以破壞其內(nèi)源性GNA1870多肽的產(chǎn)生并遺傳修飾產(chǎn)生該宿主細(xì)胞的外源性核酸(編碼)的GNA1870多肽。在其它實(shí)施方式中，遺傳修飾該奈瑟球菌以產(chǎn)生至少兩種不同的GNA1870多肽(例如，不同變體群(v.l、v.2和v.3)的GNA1870多肽)。在其它相關(guān)的實(shí)施方式中，該奈瑟球菌不產(chǎn)生莢膜多糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物還含有由第二種奈瑟球菌制備的抗原性囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌菌種細(xì)菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)能引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡產(chǎn)品，其中第二種奈瑟球菌在遺傳學(xué)上不同于所述第一種奈瑟球菌(例如，所述第一和第二種細(xì)菌所屬的血清群、血清型或血清亞型中至少有一個(gè)不同)。在其它相關(guān)的實(shí)施方式中，所述第二種奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一種奈瑟球菌的GNA1870多肽。在另一實(shí)施方式中，所述組合物還含有由第三種奈瑟球菌制備的抗原性囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)能引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡產(chǎn)品，其中所述第三種奈瑟球菌在遺傳學(xué)上不同于所述第一種奈瑟球菌(例如，所屬血清群、血清型或血清亞型中至少有一個(gè)不同)。在其它相關(guān)的實(shí)施方式中，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌的GNA1870多肽不同。在一特別感興趣的實(shí)施方式中，所述組合物含有由經(jīng)遺傳修飾而過(guò)量表達(dá)GNA1870多肽的第一種腦膜炎奈瑟球菌細(xì)菌制備的第一抗原性囊泡；由經(jīng)遺傳修飾而過(guò)量表達(dá)GNA1870多肽的第二種腦膜炎奈瑟球菌細(xì)菌制備的第二抗原性囊泡；和藥學(xué)上可接受的載體；其中所述第一和第二種細(xì)菌的GNA1870多肽屬于不同的GNA1870多肽變體群，所述第一和第二種細(xì)菌可產(chǎn)生不同的PorA多肽。在一相關(guān)實(shí)施方式中，所述組合物還含有由經(jīng)遺傳修飾而過(guò)量表達(dá)GNA1870多肽的第三種腦膜炎奈瑟球菌細(xì)菌制備的第三抗原性囊泡，其中所述第三種細(xì)菌的GNA1870多肽屬于不同于所述第一和第二種細(xì)菌的GNA1870多肽變體群，其中所述第三種細(xì)菌產(chǎn)生的PorA多肽不同于所述第一和第二細(xì)菌產(chǎn)生的PorA多肽。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，不利用洗滌劑制備所述囊泡。在另一方面，本發(fā)明的另一特征在于通過(guò)培養(yǎng)能產(chǎn)生GNA1870多肽的奈瑟球菌來(lái)制備抗原性組合物的方法，其中產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)能引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡產(chǎn)品；制備培養(yǎng)細(xì)菌的囊泡；混合該囊泡與藥學(xué)上可接受的載體來(lái)制備適合給予對(duì)象的抗原性組合物。所述第一和第二囊泡各自可以是外膜囊泡(OMV)或微囊泡(MV)。所述奈瑟球菌可以是天然產(chǎn)生的細(xì)菌，從而能表達(dá)內(nèi)源性GNA1870，或是在GNA1870多肽的產(chǎn)生經(jīng)遺傳改造(例如，由異源啟動(dòng)子表達(dá)GNA1870多肽，表達(dá)外源性GNA1870多肽等)的細(xì)菌。對(duì)于宿主細(xì)胞，該GNA1870多肽可以是內(nèi)源性的。在一些實(shí)施方式中，遺傳修飾奈瑟菌種細(xì)菌以破壞其內(nèi)源性GNA1870多肽的產(chǎn)生。在其它實(shí)施方式中，遺傳修飾奈瑟球菌以產(chǎn)生至少兩種不同的GNA1870多肽(例如，不同變體群(v.l、v.2和v.3)的GNA1870多肽)。在其它實(shí)施方式中，遺傳修飾奈瑟菌種細(xì)菌以破壞內(nèi)源性全長(zhǎng)GNA1870多肽的產(chǎn)生并由該宿主細(xì)胞的外源性核酸產(chǎn)生GNA1870多肽。在其它相關(guān)的實(shí)施方式中，所述奈瑟球菌不產(chǎn)生莢膜多糖。在另一方面，本發(fā)明的特征在于通過(guò)給予哺乳動(dòng)物免疫有效量的含第一抗原制品的組合物來(lái)引發(fā)抗奈瑟球菌的免疫應(yīng)答的方法，所述制品含有由第一奈瑟球菌制備的囊泡，其中所述奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)能引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡產(chǎn)品；其中所述給予足以引發(fā)針對(duì)囊泡中存在的GNA1870多肽的免疫應(yīng)答。所述囊泡各自可以是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV和MV的混合物。所述奈瑟球菌可以是天然產(chǎn)生的細(xì)菌，從而能表達(dá)內(nèi)源性GNA1870，或者是在GNA1870多肽產(chǎn)生中經(jīng)遺傳改造(例如，由異源啟動(dòng)子表達(dá)GNA1870多肽，表達(dá)外源性GNA1870多肽等)的細(xì)菌。對(duì)于宿主細(xì)胞，GNA1870多肽可以是內(nèi)源性的。在一些實(shí)施方式中，遺傳修飾奈瑟菌種細(xì)菌以破壞其內(nèi)源性GNA1870多肽的產(chǎn)生。在其它實(shí)施方式中，工程改造奈瑟球菌以過(guò)量表達(dá)GNA1870。在還有其它實(shí)施方式中，GNA1870多肽是嵌合型蛋白質(zhì)(融合蛋白)，其中所述嵌合型蛋白含有GNA1870以囊泡(例如，OMV、MV)形式呈遞至少一個(gè)抗原性部分。在其它相關(guān)的實(shí)施方式中，所述奈瑟球菌不產(chǎn)生莢膜多糖。在其它實(shí)施方式中，遺傳修飾奈瑟球菌產(chǎn)生至少兩種不同的GNA1870多肽(例如，不同變體群(v.l、v.2和v.3)的GNA1870多肽)。在其它實(shí)施方式中，遺傳修飾奈瑟菌種細(xì)菌以破壞內(nèi)源性全長(zhǎng)GNA1870多肽的產(chǎn)生并由宿主細(xì)胞的外源性核酸產(chǎn)生GNA1870多肽。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述方法給予的組合物含有免疫有效量的第二抗原制品，所述制品含有由第二種奈瑟球菌制備的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)能引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌與所述第一種奈瑟球菌在遺傳學(xué)上不同(例如，所述第一和第二種細(xì)菌屬于不同的血清群、血清型或血清亞型)。所述第二種奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一奈瑟球菌的GNA1870多肽。在其它相關(guān)的實(shí)施方式中，所述組合物還含有第三分離的抗原制品，所述制品含有由第三種奈瑟球菌制備的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)能引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第三種奈瑟球菌與所述第一或第二種奈瑟球菌在遺傳學(xué)上不同(例如，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌至少屬于不同的血清群、血清型或血清亞型之一)。所述第一、第二和第三種奈瑟球菌的GNA1870多肽可以不同。所述方法能在對(duì)象中引發(fā)抵御多種奈瑟球菌菌株，特別是腦膜炎奈瑟球菌，更具體說(shuō)是血清群B腦膜炎奈瑟球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答。本文所述的抗原性組合物能引發(fā)最佳的抗GNA1870、抗-PorA和/或抗-OpC殺菌抗體應(yīng)答組合，從而賦予抵御腦膜炎球菌疾病的廣泛保護(hù)作用。由本文所述過(guò)量表達(dá)GNA1870的菌株制備的疫苗能引發(fā)對(duì)以下奈瑟球菌菌株的殺菌抗體應(yīng)答與制備囊泡的菌株共享GNA1870變體和/或PorA的奈瑟球菌菌株，以及具有GNA1870亞變體和相對(duì)于囊泡產(chǎn)生菌株為異源的PorA的奈瑟球菌菌株。由過(guò)量表達(dá)GNA1870的菌株制備的疫苗也能降低(對(duì)象)群中選擇和出現(xiàn)PorA表達(dá)減少的致病腦膜炎奈瑟球菌菌株的可能性。如果在(對(duì)象)群中廣泛應(yīng)用常規(guī)OMV疫苗，應(yīng)特別關(guān)注這些突變株。因?yàn)镻orA的表達(dá)是階段可變的(vanderEnde等，J.Bacteriology1995，177:2475-2480)，不表達(dá)PorA的突變株較常見(jiàn)，不難用抗-PorA抗體和補(bǔ)體殺傷腦膜炎奈瑟球菌來(lái)選擇。不表達(dá)PorA的菌株也有毒性，能致病。與制備包含重組多肽的疫苗，或與摻有需要復(fù)性構(gòu)象表位才能引發(fā)殺菌抗體的多種單一抗原或重組蛋白(例如PorA)的組合疫苗制劑相比，本文也提供易于制備的有效疫苗組合物的優(yōu)選方法。閱讀本文內(nèi)容后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難明白本發(fā)明的各方面、特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡(jiǎn)述圖1A顯示了通過(guò)間接熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗-GNA1870抗體與有被囊腦膜炎奈瑟球菌菌株RM1090和RM1090突變體的活細(xì)胞表面結(jié)合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。行A.RM1090AGNA1870菌株。行B.RM10卯野生型菌株。行C.用含GNA1870基因的穿梭載體pFP12轉(zhuǎn)化的RM1090菌株。列l(wèi).單用磷酸鋁免疫的小鼠的陰性對(duì)照血清(l:10稀釋液)。列2.陽(yáng)性對(duì)照抗-C群多糖mAb(10ng/ml)。列3.陽(yáng)性對(duì)照抗-PorAmAb(抗-P1.2，1:500稀釋液)。列4.抗-GNA1870(v.l)mAb(2嗎/ml)。列5.制備的抗v.l、2和3重組蛋白的多克隆抗-GNA1870抗血清(l:10稀釋液)。列6.與列5相同，但血清稀釋1:250。圖1B顯示了通過(guò)間接熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗體與B群腦膜炎奈瑟球菌活細(xì)胞表面的結(jié)合。行1.野生型H44/76菌株(灰色區(qū)域)；過(guò)量表達(dá)GNA1870的H44/76突變體(黑色區(qū)域)。行2.H44/76AGNA1870。圖A，抗佐劑陰性對(duì)照抗血清，1:10稀釋液；圖B，抗-PorAmAb(P1.16)，1:500稀釋液；圖C，抗莢膜mAb10(ig/ml;圖D，抗-rGNA1870mAbJAR3，10|ig/ml;圖E，抗-rGNA1870多克隆抗血清，1:10稀釋液；圖F，與圖E相同，l:250稀釋液。圖2A提供了OMV的SDSPAGE和Western印跡分析結(jié)果。圖A是考馬斯染色SDSPAGE的照片。泳道l-5，OMV制品(各泳道加入約5pg蛋白，但泳道5加入10pg)。泳道l,野生型(WT)菌株RM1090;泳道2，用不含GNA1870基因的穿梭載體pFP12轉(zhuǎn)化的WT菌株；泳道3.RM1090△GNA1870敲除(KO);泳道4，用不含GNA1870基因的pFP12轉(zhuǎn)化的RM1090AGNA1870KO;泳道5，用含GNA1870基因的穿梭載體pFP12-GNA1870轉(zhuǎn)化的RM1090AGNA1870KO;泳道6，rGNA1870(約1pg)。圖B和C是利用變體1、2和3rGNA1870蛋白免疫小鼠的多克隆抗-GNA1870血清的Western印跡照片。圖B:與變體1重組GNA1870蛋白(v.l)相比，檢測(cè)到該抗血清的靈敏度對(duì)于變體2(v.2)重組GNA1870蛋白略高。圖C:泳道l，重組GNA1870v.l;泳道2，WTRM1090的OMV;泳道3，RM1090AGNA1870的OMV;泳道4，用含GNA1870基因的pFP12穿梭載體轉(zhuǎn)化的RM10卯的OMV。用pFP12穿梭載體轉(zhuǎn)化的RM1090AGNA1870菌株中GNA1870v.l的過(guò)量表達(dá)高于野生型菌株中GNA1870的天然表達(dá)水平(泳道2)。圖2B提供了用抗-rGNA1870多克隆抗體檢測(cè)OMV疫苗的Western印跡分析結(jié)果。野生型，從野生型H44/76菌株制備的OMV;AGNA1870，從編碼GNA1870的基因已滅活的突變型H44/76制備的OMV;OEGNA1870，經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)GNA1870的H44/76突變體的OMV;rGNA1870，大腸桿菌表達(dá)的純化的His-標(biāo)簽GNA1870。圖3A顯示檢測(cè)到的對(duì)以下四種代表性有被囊腦膜炎奈瑟球菌菌株的小鼠血清殺菌(抗體)滴度Cu385、M6190、Z1092和NZ98/254。疫苗組是柱l，單用磷酸鋁佐劑；柱2，RM1090野生型的OMV疫苗；柱3，RM1090AGNA1870的OMV疫苗；柱4，RM1090AGNA1870的OMV疫苗+重組GNA1870蛋白的混合物；柱5，過(guò)量表達(dá)GNA1870的RM1090的OMV疫苗；柱6，重組GNA1870蛋白。顯示幾何平均值有95%可信限的柱代表檢驗(yàn)了其中9-10只動(dòng)物個(gè)體的血清的各疫苗組。有星號(hào)(*)的柱代表各疫苗組的兩種混合血清(各為4-5只不同小鼠的血清混合物)的檢驗(yàn)結(jié)果幾何平均值。圖3B顯示用H44/76OMV疫苗免疫小鼠血清的血清殺菌活性(1/GMT±SD)。如圖3A中所述制備混合血清。各組小鼠用(1)佐劑，(2)rGNA1870，(3)H44/76野生型，(4)H44/76AGNA1870，(5)H44/76OEGNA1870免疫。雖然未在圖上顯示，但用補(bǔ)體+陽(yáng)性對(duì)照抗莢膜和/或抗-PorA單克隆抗體可殺傷所有菌株。圖4A的一系列圖顯示通過(guò)間接熒光流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定到活化的人C3b和iC3b補(bǔ)體沉積在有被囊腦膜炎奈瑟球菌活細(xì)胞表面。行A.菌株NZ98/254。行B.菌株M1390。列1，補(bǔ)體+陽(yáng)性對(duì)照B群抗莢膜MAb，25pg/ml(開(kāi)放區(qū)域)或單用磷酸鋁免疫的陰性對(duì)照小鼠混合血清1:40稀釋液(封閉區(qū)域)。列2，補(bǔ)體+抗-GNA1870MAbJAR3，1嗎/ml(開(kāi)放區(qū)域)或熱滅活的補(bǔ)體+抗-GNA1870MAb，5^g/ml(封閉區(qū)域)。列3、4和5，補(bǔ)體+列3(rGNA1870疫苗)、列4(RM1090WT菌株的OMV疫苗)或列5(rGNA1870疫苗和菌株RM10卯AGNA1870的OMV疫苗的混合物)免疫小鼠混合血清的1:100稀釋液。列6，補(bǔ)體+用過(guò)量表達(dá)GNA1870菌株RM10卯的OMV疫苗免疫小鼠混合血清稀釋液(開(kāi)放區(qū)域是1:IOO稀釋液，灰色區(qū)域是l:400稀釋液)。為進(jìn)行比較，列6的圖也顯示了補(bǔ)體+用菌株RM1090AGNA1870的OMV疫苗免疫小鼠混合血清的1:IOO稀釋液的數(shù)據(jù)(封閉區(qū)域)。圖4B的一系列圖顯示通過(guò)間接熒光流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定到活化的人C3b和iC3b補(bǔ)體沉積在有被囊腦膜炎奈瑟球菌活細(xì)胞表面。菌株NZ98/254、BZ198、Z1092和M6190。圖A，開(kāi)放區(qū)域補(bǔ)體+抗莢膜mAb(B群菌株NZ98/254、BZ198和M61903為25嗎/ml，A群菌株Z1092為1嗎/ml);填充區(qū)域補(bǔ)體+抗佐劑抗血清的1:IOO稀釋液。圖B，開(kāi)放區(qū)域補(bǔ)體+抗-rGNA1870mAbJAR325pg/ml;填充區(qū)域補(bǔ)體+多克隆抗rGNA1870抗血清的1:IOO稀釋液。圖C，補(bǔ)體+抗野生型H44/76的OMV的抗血清1:100稀釋液；圖D，開(kāi)放區(qū)域補(bǔ)體+已用陰性對(duì)照柱(只有Ni-NTA)吸附的過(guò)量表達(dá)GNA1870的制備的抗OMV抗血清1:IOO稀釋液；填充區(qū)域補(bǔ)體+用固相GNA1870柱吸附的過(guò)量表達(dá)GNA1870制備的抗OMV抗血清1:25稀釋液。圖5是顯示通過(guò)ELISA(GMT±SD)檢測(cè)血清抗-GNA1870抗體應(yīng)答的柱狀圖。平板上的抗原是rGNA1870變體l。第二抗體是堿性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠IgG+A+M。這些柱代表用(1)佐劑；(2)rGNA1870;(3)H44/76野生型OMV;(4)H44/76AGNA1870OMV;(5)H44/76OEGNA1870OMV免疫的各組小鼠兩份抗混合血清(各為4-5只小鼠的混合物)的各自幾何平均滴度。圖6提供的圖顯示了對(duì)乳大鼠腦膜炎球菌菌血癥模型被動(dòng)保護(hù)力分析的結(jié)果。在0時(shí)，用免疫小鼠的混合血清(N二每份混合物9-10只小鼠)稀釋液腹膜內(nèi)處理乳大鼠，兩小時(shí)后用B群菌株NZ98/294攻擊(腹膜內(nèi)給予約60,000CFU/大鼠)。細(xì)菌攻擊4-6小時(shí)后獲得定量的血液培養(yǎng)物。圖A:1:15血清稀釋液。圖B:1:60血清稀釋液。柱l:單用磷酸鋁免疫小鼠的血清；柱2:抗莢膜mAb(10pg/大鼠)；柱3:抗-GNA1870mAb(10ng/大鼠)；柱4:用RM1090AGNA1870的OMV疫苗免疫小鼠的血清；柱5:用RM1090AGNA的OMV疫苗+重組GNA1870蛋白疫苗混合物免疫小鼠的血清；柱6:用過(guò)量表達(dá)GNA1870的RM1090的OMV疫苗免疫小鼠的血清；柱7:用重組GNA1870蛋白免疫小鼠的血清。圖7分別是腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58、951-5945和M1239的GNA1870變體l、2和3的示范性氨基酸序列的比對(duì)。"1"表明成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸，負(fù)數(shù)表示的氨基酸是前導(dǎo)序列的一部分?；疑秃谏尘胺謩e表示保守和相同的氨基酸殘基。圖8A-8H提供本發(fā)明所用示范性GNA1870多肽的氨基酸序列，包括選出的示范性GNA1870多肽的氨基酸比對(duì)(圖8H)。圖9提供示范性PorAVR1家族原型(圖A)的氨基酸序列和示范性PorAVR2家族原型(圖B)的氨基酸序列的比對(duì)。在描述本發(fā)明和具體的示范性實(shí)施方式之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所述的具體實(shí)施方式，因?yàn)檫@些實(shí)施方式當(dāng)然可變。既然本發(fā)明的范圍僅受附加的權(quán)利要求書限制，則文中使用的術(shù)語(yǔ)也應(yīng)理解僅是為了描述具體的實(shí)施方式而非限制。除非文中另有明確指出，在提供數(shù)值范圍之處應(yīng)理解為本發(fā)明包括該范圍上下限之間的各中間值至下限單位的十分之一，或者也包括該范圍中其它任何所述或中間值。這些較小范圍的上下限可獨(dú)立包括在也屬于本發(fā)明所述范圍內(nèi)排除端點(diǎn)的任何具體較小范圍內(nèi)。當(dāng)所述范圍包括一邊或兩邊界限時(shí)，排除一邊或兩邊界限的范圍也屬于本發(fā)明。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然可用任何相似或等價(jià)于文中所述的方法和材料來(lái)實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但優(yōu)選方法和材料是本文所述的。文中提及的所有出版物均納入本文作為參考來(lái)公開(kāi)和描述與所引用出版物有關(guān)的方法和/或材料。必須注意，除非文中另有明確指出，文中和附加的權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式"一種"、"和"與"該"包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如，"一種抗原"包括多個(gè)這種抗原，"該囊泡"包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種囊泡及其等價(jià)物，等等。提供本文所述的出版物僅是因?yàn)槠湓诒旧暾?qǐng)?zhí)峤蝗掌谥肮_(kāi)。本文沒(méi)什么可解釋為承認(rèn)由于在先發(fā)明而使本發(fā)明不具資格早于該出版物。此外，提供出版物的發(fā)表日期可能不同于實(shí)際發(fā)表日期，這些日期可能需要獨(dú)立證實(shí)。發(fā)明詳述本發(fā)明的依據(jù)是發(fā)現(xiàn)與重組GNA1870(rGNA1870)蛋白疫苗，或由天然產(chǎn)生菌株制備的OMV或重組蛋白疫苗與OMV混合疫苗相比，用經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)GNA1870的突變型腦膜炎奈瑟球菌菌株制備的OMV疫苗能在小鼠中引發(fā)更廣泛的殺菌抗體應(yīng)答。OMV疫苗已安全地給予數(shù)百萬(wàn)人，并證明能有效抵御腦膜炎球菌疾病。如引言部分所述，它們的主要局限性在于引發(fā)的是菌株特異性殺菌抗體應(yīng)答。如果OMV疫苗廣泛用于(對(duì)象)群，也應(yīng)關(guān)注免疫應(yīng)答可能選擇腦膜炎奈瑟球菌菌株"逃逸突變體"(即，PorA的表面可接近環(huán)氨基酸序列中發(fā)生突變或PorA表達(dá)減少的菌株)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)選擇流行的PorA血清亞型和制備過(guò)量表達(dá)GNA1870的突變株，本發(fā)明可制備能引發(fā)最佳抗GNA1870和抗-PorA殺菌抗體應(yīng)答組合的囊泡疫苗(例如，OMV、MV)，從而賦予抵御腦膜炎球菌疾病的廣泛保護(hù)作用。對(duì)于選擇(對(duì)象)群中致病的PorA缺陷突變株，使用這種疫苗的風(fēng)險(xiǎn)也低于常規(guī)OMV疫苗。此外，與用GNA1870表達(dá)水平較低的菌株制備的囊泡相比，過(guò)量表達(dá)GNA1870的菌株制備的囊泡的蛋白分布概況有所改變。如實(shí)施例中詳述的，與由野生型疫苗RM1090菌株或RM1090AGNA1870敲除菌株制備的OMV相比，由過(guò)量表達(dá)GNA1870的菌株制備的OMV顯示許多其它包膜蛋白表達(dá)減少。雖然用過(guò)量表達(dá)GNA1870(菌株)的OMV免疫小鼠的抗血清能引發(fā)針對(duì)菌株Cu385的殺菌抗體，或活化C3b沉積在菌株NZ98/294上是GNA1870引發(fā)的抗體所致，但這些其它細(xì)胞外包膜蛋白減少可進(jìn)一步提高由過(guò)量表達(dá)GNA1870菌株制備的囊泡的免疫原性和引發(fā)的保護(hù)性免疫應(yīng)答(例如，因?yàn)?暴露"了囊泡中的其它抗原)。本發(fā)明提供的實(shí)施例說(shuō)明了由過(guò)量表達(dá)(例如，經(jīng)遺傳工程改造而過(guò)量表達(dá))GNA1870的腦膜炎奈瑟球菌菌株制備的OMV疫苗免疫所引發(fā)的保護(hù)作用幅度。過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV疫苗所引發(fā)的抗-GNA1870抗體功能活性高于重組GNA1870疫苗或重組GNA1870與野生型菌株制備的OMV的混合疫苗所引發(fā)的抗體。例如，雖然ELISA檢測(cè)到抗-GNA1870抗體應(yīng)答的數(shù)量級(jí)較低(表2)，但用經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)GNA1870的菌株制備的OMV疫苗免疫的小鼠血清顯示對(duì)菌株Z1092的殺菌活性高于用重組蛋白GNA1870疫苗，用野生型或GNA1870敲除RM1090菌株制備的OMV疫苗或用混合的重組GNA1870蛋白疫苗和OMV疫苗免疫的小鼠血清(圖3)。此外，即使沒(méi)有強(qiáng)殺菌活性，與其它疫苗產(chǎn)生的抗體相比，過(guò)量表達(dá)GNA1870(菌株制備)的OMV疫苗所引發(fā)的抗體能使更多的C3b沉積在菌株NZ98/254或M1390表面(圖4A，列6)，后者在用菌株NZ98/254攻擊的乳大鼠時(shí)能賦予對(duì)菌血癥更強(qiáng)的被動(dòng)保護(hù)作用(圖6，圖A-B)。抗-GNA1870抗體經(jīng)吸收后，活化C3b沉積到菌株NZ98/254上的能力喪失(表3)。簡(jiǎn)言之，修飾的OMV疫苗比GNA1870重組蛋白或野生型疫苗菌株的OMV疫苗能賦予更廣泛的保護(hù)作用，因?yàn)樾揎椀腛MV疫苗能引發(fā)的血清亞型特異性殺菌活性而抵御能表達(dá)與該疫苗菌株同源的PorA分子的菌株，同時(shí)與重組GNA1870疫苗所引發(fā)的抗體相比，所引發(fā)的抗-GNA1870抗體抵御表達(dá)GNA1870變體1蛋白亞變體的菌株的功能活性更強(qiáng)。對(duì)于抵御表達(dá)變體1GNA1870蛋白的亞變體和/或表達(dá)同源性PorA血清亞型的菌株，由過(guò)量表達(dá)GNA1870菌株制備的修飾OMV疫苗優(yōu)于重組GNA1870(疫苗)。有趣的是，與用編碼NspA的基因已滅活菌株RM1090制備的對(duì)照囊泡疫苗免疫的對(duì)照小鼠相比，用經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)NspA的腦膜炎奈瑟球菌菌株(RM10卯)制備的囊泡疫苗免疫的小鼠的ELISA抗-NspA抗體滴度高10倍，但對(duì)一些腦膜炎奈瑟球菌菌株，例如Cu385或Z1092的血清殺菌滴度較低(表5)。0'Dwyer等也觀察到用經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)NspA的黃色奈瑟球菌菌株制備的OMV疫苗免疫接種的小鼠血清缺乏殺菌活性(Infect.Innun.2004，72:6511-80)。因此，發(fā)現(xiàn)對(duì)過(guò)量表達(dá)GNA1870(的菌株制備)的OMV疫苗的殺菌和保護(hù)性抗體應(yīng)答提高是意外的。與由H44/76野生型菌株制備的OMV中天然GNA1870含量較高相比，菌株H44/76中GNA1870v.l過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致OMV中GNA1870增加約3倍。與我們以前用野生型菌株RM1090的OMV免疫小鼠研究相反，ELISA檢測(cè)到用野生型H44/76制備的OMV免疫小鼠產(chǎn)生了抗-GNA1870抗體(圖5)。然而，給予過(guò)量表達(dá)GNA1870菌株的OMV的小鼠組(抗體)滴度約高10倍。ELISA檢測(cè)的滴度與抗體功能活性不良好相關(guān)。例如，用重組GNA1870疫苗免疫的小鼠具有最高的血清抗-GNA1870滴度，但用重組蛋白免疫的小鼠血清殺菌活性和C3b沉積活性限于對(duì)菌株H44/76。預(yù)計(jì)該菌株(對(duì)該抗體)敏感，是因?yàn)閷?shí)際上具有ET5遺傳譜系的所有腦膜炎奈瑟球菌菌株都高度表達(dá)典型的GNA1870v.l蛋白(與MC58的氨基酸序列相同)，故這些菌株對(duì)抗-GNA1870抗體的補(bǔ)體介導(dǎo)殺菌活性高度敏感(Masignani等，2003，同上；Welsch等，2004，同上)。我們研究的其余五種腦膜炎奈瑟球菌測(cè)試菌株表達(dá)的GNA1870含量低于菌株H44/76，相應(yīng)的蛋白質(zhì)是GNA1870v.1的亞變體。這5種菌株也具有對(duì)H44/76疫苗菌株而言為異源性的PorA分子。這5種菌株對(duì)重組GNA1870疫苗所引發(fā)抗體或OMV疫苗所引發(fā)的抗-ProA抗體導(dǎo)致的殺菌活性和補(bǔ)體活化耐受。相反，這5種菌株的4種對(duì)用過(guò)量表達(dá)GNA1870的H44/76OMV疫苗免疫的小鼠血清的殺菌活性和/或補(bǔ)體沉積活性敏感。C3b在活細(xì)菌表面活化引起對(duì)乳大鼠產(chǎn)生預(yù)計(jì)的抵御腦膜炎球菌菌血癥的被動(dòng)保護(hù)力(Welsch等，JInfectDis2003，188:1730-40;Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15;Hou等，JInfectDis2005，192:580-90;Moe等，InfectImmun2002，70:6021-31)。含過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV疫苗由復(fù)雜的抗原混合物構(gòu)成，預(yù)計(jì)能引發(fā)針對(duì)許多靶抗原的抗體。然而，在吸收實(shí)驗(yàn)中，抵御這些菌株的抗體功能活性針對(duì)對(duì)照GNA1870的(表3)。與用選擇的GNA1870表達(dá)較高的野生型菌株制備的OMV疫苗相比，用GNA1870水平只有適度增加的突變型菌株制備的OMV疫苗引發(fā)了更高且更廣的GNA1870-特異性殺菌抗體應(yīng)答和/或更多的C3沉積。因此，OMV疫苗制品中GNA1870與總蛋白的比例即使只有少許變化看來(lái)也能決定對(duì)GNA1870是否會(huì)產(chǎn)生抗體應(yīng)答。此外，含過(guò)量表達(dá)的GNA1870的OMV疫苗所引發(fā)抗體的質(zhì)量?jī)?yōu)于重組GNA1870疫苗所引發(fā)的抗體。例如，該重組疫苗引發(fā)的ELISA抗體結(jié)合滴度高于含過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV疫苗引發(fā)的，但抗該重組蛋白(所引發(fā))抗體的殺菌和補(bǔ)體活化活性較低。要確定經(jīng)修飾的GNA1870-OMV疫苗通過(guò)何種機(jī)制引發(fā)比重組蛋白或?qū)φ誒MV疫苗更廣泛功能活性的抗體需要進(jìn)一步研究。因此，本發(fā)明提供引發(fā)能與各種致病性腦膜炎奈瑟球菌菌株起廣泛反應(yīng)的免疫應(yīng)答的方法和組合物。本發(fā)明通過(guò)提高對(duì)疫苗菌株中GNA1870和其它可能的共同抗原的抗體應(yīng)答克服了囊泡或PorA疫苗中PorA抗原可變結(jié)構(gòu)域所具有的免疫優(yōu)勢(shì)問(wèn)題。重要的是，本發(fā)明方法引發(fā)的血清殺菌抗體能抵御表達(dá)該疫苗制品中未使用的血清亞型表位的奈瑟球菌菌株，唯一經(jīng)證實(shí)的血清學(xué)與人體保護(hù)作用的相關(guān)性(Goldschneider等，1969，同上)。此外，所述方法引發(fā)的血清殺菌抗體能抵御針對(duì)保守性蛋白(例如奈瑟球菌表面蛋白A，一種候選腦膜炎球菌疫苗)(Martin等，2000.J.Biotechnol.83:27-31;Moe等，1999Infect.Immun.67:5664;Moe等，InfectImmun.200169:3762)的抗體無(wú)法殺傷的菌株。不希望受理論的束縛，本發(fā)明疫苗和免疫接種方案的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)引發(fā)保守和非保守抗原的特異性抗體來(lái)提供出乎意料的廣譜保護(hù)性免疫力。定義術(shù)語(yǔ)"保護(hù)性免疫力"表示給予哺乳動(dòng)物的疫苗或免疫接種方案能誘導(dǎo)預(yù)防、延遲腦膜炎奈瑟球菌所致疾病的發(fā)生或減輕其嚴(yán)重程度或降低或完全消除其癥狀的免疫應(yīng)答。短語(yǔ)"腦膜炎奈瑟球菌血清群B菌株所致疾病"包括存在腦膜炎奈瑟球菌血清群B某成員感染所致的任何臨床癥狀或臨床癥狀組合。這些癥狀包括但不限于腦膜炎奈瑟球菌血清群B病原菌株寄居上呼吸道(例如，鼻咽和扁桃體粘膜)，細(xì)菌穿過(guò)進(jìn)入粘膜和粘膜下血管床，敗血癥、膿毒性休克、炎癥、出血性皮膚病損、激活血纖蛋白溶解和血液凝結(jié)，器官功能失調(diào)，例如腎、肺和心力衰竭，腎上腺出血和肌肉梗死，毛細(xì)血管滲漏，水腫，外周肢體缺血(peripherallimbischaemia)，呼吸窘迫綜合征，心包炎和腦膜炎。短語(yǔ)"廣譜保護(hù)性免疫力"表示疫苗或免疫方案引發(fā)了針對(duì)至少一種或多種(或針對(duì)至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、針對(duì)至少8種或至少針對(duì)8種以上)腦膜炎奈瑟球菌菌株的"保護(hù)性免疫力"，其中所述各菌株屬于與制備疫苗所用菌株不同的血清亞型。本發(fā)明專門考慮并包括能抵御腦膜炎奈瑟球菌血清群B某成員所致疾病，也抵御其它血清群，特別是血清群A、C、Y和W-135保護(hù)力的疫苗或疫苗接種方案。當(dāng)短語(yǔ)"與某抗體特異性結(jié)合"或"特異性免疫反應(yīng)"指某抗原，例如多糖、磷脂、蛋白質(zhì)或肽時(shí)，表示根據(jù)樣品中存在的抗原和/或檢驗(yàn)其存在的結(jié)合反應(yīng)，所述樣品也可以是包含其它分子的異質(zhì)群體。因此，在指定的免疫測(cè)定條件下，所述一種或多種特異性抗體能與樣品中的一種或多種特定抗原結(jié)合，而不與樣品中存在的顯著含量的其它分子結(jié)合。在這種條件下某抗體的特異性結(jié)合可能需要選用對(duì)一種或多種特定抗原具有特異性的抗體或抗血清。短語(yǔ)"用量足以引發(fā)針對(duì)所述制品中存在表位的免疫應(yīng)答"表示在給予特定抗原制品前后檢測(cè)到的免疫應(yīng)答指示物之間存在可檢測(cè)的差異。免疫應(yīng)答指示物包括但不限于通過(guò)例如以下試驗(yàn)檢測(cè)的抗體滴度或特異性酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)、殺菌試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫沉淀、Ouchter-Lowny免疫擴(kuò)散、例如斑點(diǎn)、Western印跡或抗原陣列的結(jié)合檢測(cè)試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。"表面抗原"是存在于腦膜炎奈瑟球菌的表面結(jié)構(gòu)(例如，外膜、內(nèi)膜、周質(zhì)間隙、莢膜、菌毛等)中的抗原。在腦膜炎奈瑟球菌遺傳學(xué)多樣性菌株的說(shuō)明中所用的短語(yǔ)"遺傳學(xué)多樣性"指至少一種、通常至少兩種、更常見(jiàn)至少三種多肽，特別是抗原性多肽的氨基酸序列彼此不同的菌株。可通過(guò)選擇至少一種或以上、優(yōu)選至少兩種或以上血清群、血清型或血清亞型不同的菌株(例如，選自外膜、PorA和PorB蛋白的至少一種蛋白不同的兩種菌株稱為彼此遺傳學(xué)不同)而實(shí)現(xiàn)菌株的遺傳多樣性。也可通過(guò)，例如多個(gè)基因座序列分型和/或多個(gè)基因座酶分型(參見(jiàn)，例如Maiden等，1998,Proc.Natl.Acad.SciUSA95:3140;Pizza等，2000Science287:1816)、多個(gè)基因座酶電泳和本領(lǐng)域已知的其它方法確定遺傳學(xué)多樣性。本文所用的"血清群"指依靠莢膜多糖免疫學(xué)可檢測(cè)的差異進(jìn)行腦膜炎奈瑟球菌分類。已知約有12種血清群A、B、C、X、Y、Z、29-E、W-135、H、I、K和L。任何一種血清群可包括多種血清型和多種血清亞型。本文所用的"血清型"指根據(jù)單克隆抗體確定的外膜通道蛋白B的抗原差異進(jìn)行腦膜炎奈瑟球菌菌株分類。一種血清型可見(jiàn)于多種血清群和多種血清亞型中。本文所用的"血清亞型"指根據(jù)用抗體確定的稱為通道蛋白A的外膜蛋白的抗原性差異，或根據(jù)DNA測(cè)序推導(dǎo)的氨基酸序列的VR分型(Sacchi等，2000,J.Infect.Dis.182:1169;也可參見(jiàn)MultiLocusSequenceTyping(多基因座序列分型)網(wǎng)站)進(jìn)行腦膜炎奈瑟球菌菌株分類。PorA蛋白之間的大多數(shù)變異發(fā)生在8種推定的表面暴露環(huán)中的兩個(gè)(環(huán)I和IV)。可變環(huán)I和IV分別命名為VR1和VR2。一種血清亞型可見(jiàn)于多種血清群和多種血清亞型中。"富集的"表示經(jīng)實(shí)驗(yàn)人員或臨床醫(yī)師操作，某抗原組合物中的某抗原與獲得該抗原組合物的菌株中該抗原的濃度相比，其濃度以總重量計(jì)高至少三倍、通常至少五倍、更優(yōu)選至少十倍、更常見(jiàn)是至少一百倍。因此，如果某特定抗原的濃度是1微克/克細(xì)菌總制品(或細(xì)菌總蛋白)，則富集制品含有至少3微克/克細(xì)菌總制品(或細(xì)菌總蛋白)。術(shù)語(yǔ)"異源"指自然界中發(fā)現(xiàn)不在一起的兩種生物學(xué)組分。所述組分可以是宿主細(xì)胞、基因或調(diào)節(jié)區(qū)，例如啟動(dòng)子。雖然自然界中發(fā)現(xiàn)異源組分不在一起，它們可共同起作用，例如當(dāng)某基因的異源啟動(dòng)子與之操作性相連時(shí)。另一例子是某奈瑟球菌序列對(duì)不同菌株的奈瑟球菌宿主為異源。本文在兩種不同細(xì)菌菌株表達(dá)的蛋白質(zhì)，例如"異源PorA"或"異源GNA1870"的說(shuō)明中使用"異源"表明所述二蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同。例如，表達(dá)PorA1.5-2，10的第一種奈瑟球菌菌株對(duì)表達(dá)PorA7-2,4的第二種奈瑟球菌菌株而言稱為具有"異源PorA蛋白"或是"PorA異源"。術(shù)語(yǔ)"對(duì)于腦膜炎奈瑟球菌為免疫原初是"表示從未接觸過(guò)腦膜炎奈瑟球菌(通過(guò)感染或給予)或衍生自腦膜炎奈瑟球菌的抗原組合物(其含量足以引發(fā)保護(hù)性免疫力)，或者如果接觸過(guò)，未能引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的個(gè)體(例如，哺乳動(dòng)物，如人患者)。(后一情況的例子是接觸時(shí)太年幼而未產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的個(gè)體。Molages等，1994,Infect.Immun.62:4419-4424)。還需要(但不一定)包括"免疫學(xué)原初的"個(gè)體也未接觸過(guò)除腦膜炎奈瑟球菌以外的奈瑟球菌種(或用某奈瑟球菌種制備的抗原組合物)，特別是未接觸過(guò)奈瑟球菌種的交叉反應(yīng)性菌株(或抗原組合物)。已接觸過(guò)奈瑟球菌種(通過(guò)感染或給予)或衍生自該奈瑟球菌種的抗原組合物(其含量足以引發(fā)針對(duì)該種細(xì)菌所顯示表位的免疫應(yīng)答)的個(gè)體是"致敏的"，從而能對(duì)該種細(xì)菌所顯示的表位起免疫反應(yīng)。表達(dá)用于制備囊泡的GNA1870的奈瑟球菌菌株本發(fā)明總體上包括由天然產(chǎn)生的或遺傳修飾的奈瑟球菌種制備囊泡(微囊泡或外膜囊泡)，其中所述奈瑟球菌種產(chǎn)生的GNA1870蛋白水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)能引發(fā)血清抗-GNA1870抗體的囊泡。所產(chǎn)生的抗-GNA1870抗體有助于提供抵御l、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種奈瑟球菌菌株的免疫保護(hù)作用，對(duì)于例如血清群、血清型、血清亞型(如PorA蛋白所測(cè)定的)、序列類型、電泳類型、GNA1870變體和/或GNA1870亞變體，這些菌株可以存在遺傳學(xué)多樣性(或"異源的")。本發(fā)明方法可利用能產(chǎn)生或經(jīng)修飾能產(chǎn)生GNA1870，和任選能產(chǎn)生或經(jīng)修飾能產(chǎn)生感興趣的其它抗原，例如PorA的各種奈瑟球菌屬菌株。適合于產(chǎn)生GNA1870的菌株特征詳述于下文。特別感興趣的是病原性奈瑟球菌屬或源自病原性奈瑟球菌屬的菌株，特別是人的病原性或源自人的病原性或共棲菌株。示范性奈瑟球菌屬包括腦膜炎奈瑟球菌、黃色奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌(W.gowofr/zoefle)、乳糖奈瑟球菌(TV./actom/c。)、多糖奈瑟球菌(W.po/;;racc/2。rea)、灰色奈瑟球菌(W.c/朋"a)、粘液奈瑟球菌(W.mwccwa)、微黃奈瑟球菌(A^.si^/7avfl)、干燥奈瑟球菌(TV.s/cca)、長(zhǎng)奈瑟球菌(A^.e/owgato)等。細(xì)菌菌株說(shuō)明中的"源自"表示通過(guò)親代菌株的體內(nèi)傳代或體外培養(yǎng)獲得某菌株和/或是通過(guò)修飾親代菌株獲得的重組細(xì)胞。本發(fā)明特別感興趣的腦膜炎奈瑟球菌菌株?？筛鶕?jù)能與不同表面抗原相互反應(yīng)的多克隆(Frasch，C.E.和Chapman,1973，J.Infect.Dis.127:149-154)或單克隆抗體將腦膜炎奈瑟球菌菌株分為血清群、血清型和亞型。根據(jù)莢膜多糖中免疫學(xué)可檢測(cè)的變異進(jìn)行血清分群(serogrouping)。己知有約12種血清群(A、B、C、X、Y、Z、29-E和W-135)。血清群A、B、C、Y和W-135的菌株可導(dǎo)致幾乎所有的腦膜炎球菌疾病。可根據(jù)單克隆抗體確定的稱為通道蛋白B(PorB)的外膜蛋白的抗原性差異區(qū)分血清型。目前已知約有21種抗體確定的血清型(Sacchi等，1998,Clin.Diag.Lab.Immunol.5:348)?？筛鶕?jù)抗體確定的稱為通道蛋白A(PorA)的外膜蛋白的抗原性差異區(qū)分血清亞型(serosubtyping)。目前已知約有18種抗體確定的血清亞型。在免.疫力可能是血清亞型特異性時(shí)區(qū)分腦膜炎奈瑟球菌菌株血清亞型尤其重要。PorA蛋白之間的大多數(shù)變異發(fā)生在8個(gè)推定的表面暴露環(huán)中的兩個(gè)(環(huán)I和IV)中?？勺儹h(huán)I和IV分別命名為VR1和VR2。由于存在用特異性抗體不能確定的多個(gè)PorAVR1和VR2序列變體，有人根據(jù)從DNA序列推定的氨基酸序列的VR分型提出了替代術(shù)語(yǔ)(Sacchi等，2000,JInfect.Dis.182:1169;也參見(jiàn)MultiLocusSequenceTyping(多基因座序列分型)網(wǎng)站)。脂多糖也可用作分型抗原，從而得到所謂的免疫型Ll、L2等。也可采用能直接或間接特征鑒定細(xì)菌基因組的各種技術(shù)將腦膜炎奈瑟球菌分為克隆組或亞組。這些技術(shù)包括根據(jù)酶的電泳遷移率不同的多基因座酶電泳法(MLEE)，其變化能反映特定遺傳基因座的潛在多態(tài)性。通過(guò)特征鑒定許多這種蛋白質(zhì)的變體，可從錯(cuò)配比例推斷兩菌株間的遺傳"距離"。類似地，如果兩種分離物的多個(gè)基因座具有相同的電泳變化模式，則可推斷該二分離物之間具有克隆性(clonality)。近年來(lái)，多基因座序列分型(MLST)替代了MLEE作為特征鑒定微生物選用的方法。采用MLST，可從腦膜炎奈瑟球菌菌株11種持家基因的DNA序列的錯(cuò)配比例推斷兩種分離物之間的遺傳距離或克隆性(Maiden等，1998,Proc.NatlAcad.SciUSA95:3140)?？筛鶕?jù)許多不同的所需特征選擇用于產(chǎn)生囊泡的菌株。例如，除了根據(jù)GNA1870的產(chǎn)量水平來(lái)選擇外，可根據(jù)以下特征選擇菌株所需的PorA類型(如上述的"血清亞型")、血清群、血清型等；莢膜多糖產(chǎn)量低等。例如，生產(chǎn)菌株應(yīng)能產(chǎn)生任何所需的PorA多肽，可表達(dá)一種或多種PorA多肽(天然的或經(jīng)遺傳改造的)。示范性菌株包括產(chǎn)生以下PorA多肽的那些菌株能賦予血清亞型P1.7,16;Pl.19,15;P1.7，l;P1.5,2;P1.22a,14;P1.14;P1.5,10;P1.7,4;Pl.12,13的PorA多肽；以及保留或未保留與區(qū)分血清亞型所用常規(guī)血清學(xué)試劑反應(yīng)性的這種PorA多肽變體。根據(jù)PorA可變區(qū)(VR)分型特征鑒定的PorA多肽也是感興趣的多肽(參見(jiàn)，例如Russell等，EmergingInfectDis200410:674-678;SacchiCT等，ClinDiagnLabImmunol1998，5:845-55;Sacchi等，J.InfectDis2000，182:1169-1176)。已鑒定了許多不同的VR型，這些型可分為VR1和VR2家族"原型"。描述此術(shù)語(yǔ)及其與以前分型方案的關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)見(jiàn)neisseria.org/nm/typing/pora。Russell等(EmergingInfectDis200410:674-678)提供了示范性PorAVR1和VR2型的比對(duì)，為方便讀者起見(jiàn)圖9提供了這種比對(duì)。通過(guò)PorA血清亞型特征鑒定的示范性PorA多肽包括P1.5，2;P1.5a,2a;P1.5a,2c;P1.5a,2c;P1.5a,2c;P1.5b,10;P1.5b,10;Pl,5b,C;P1.7,16;P1.7d,l;P1.7d,l;P1.7d,l;P1.7d,l;P1.7b,3;P1.7b,4;P1.7b,4;Pl.12,16;P1.12a,13a;P1.22,9;P1.23,14;P1.23,14;Pl.19,15;P1,B,1;P1.C,1;P1.E,A;P1.E,A;P1.E，A;;P1.5,2;P1.5,2;P1.5a,10a;P1.5b,10;P1.5b，10;P1.5b,10b;P1.7,16;P1.7，16;P1.7b,l;P1.7b,13e;P1.7b,4;P1.7b,4;P1.7d,l;P1.7d,l;P1.7b,13a;P1.23，3;P1.23,3;P1.23,3;Pl.19,15;P1.19,l;P1.19,15;PU9,15;Pl.19,15;Pl.19,15;Pl.19,15;Pl.19,15;Pl.19,15;P1,E,A;P1，E,A;Pl.E，16a;Pl.E,4a;Pl.E,4a;Pl.Ea,3;Pl.Eb,9;Pl.Eb,9;Pl.Eb,9;Pl.Eb,9;Pl.Eb,9;P1.F，16;P1.7a,l;P1.7b,3;P1.7d,l;Pl.Ea,3;P1.5b,10;P1.5b,10;P1.5b,10;P1.5b,10;P1.5b,10;P1.5b,10;P1.5b,10b;P1.5b,10;P1.22,14a;;P1.F,16;Pl.D,2d;P1.D,2;Pl.D,2d;P1.19c,2c;PlD，10f;PlA,10e;PlA,10g;P1A,10;Pl.19,15;Pl.19,15;Pl.19,15;Pl.19,15;P1.7b，16;P1.7,16b;Pl,7，16;Pl.19,15;Pl.Eb,9;P1.5,2e;P1,E,A;P1.7b,13d;Pl.Ea，3;P1.7,16b;Pl,Ec,l;P1.7b，4;P1.7b,4;P1.7，9;Pl.19,15;Pl.19,15;P1.19,15;P1.19,15a;P1.19a,15b;Pl.19,15;P1.5b,16;Pl,19b,13a;P1.5,16;P1.5,2;P1.5，2b;P1.7b,16;P1.7,16b;P1.7b，3;Pl.Ea，3;P1.5a,2c;P1.F,16;P1.5a,9;P1.7c,10c;P1.7b,13a;P1.7,13a;P1.7a,10;P1.20,9;P1.22,B;P1.5b,del;P1.5b,10;P1.7,13a;P1.12a,13f;P1.12a，13;P1.12a,13a;P1.12a,13a;P1.12a,13;P1.12a,13;Pl.E，13b;P1.7b,13a;P1.7b,13;P1.5，2;P1.5,2;Pl.Ea,3;P1.22,9;P1.5,2;P1.5,2;P1.19,15;Pl,5,2;P1.12b,13a;P1.5c，10a;P1.7e,16e;Pl.B,16d;Pl.F,16e;Pl.F,16e;P1.7b,13e;Pl.B,16d;P1.7e,16e;P1.7b，13g;Pl.B,16f;;P1.7，16c;P1.22,14b;P1.22,14c;Pl.7,14;Pl.7,14禾卩P1.23,14。示范性PorA多肽的氨基酸序列見(jiàn)GenBank登錄號(hào):X57182、X57180、U92941、U92944、U92927、U92931、U92917、U92922、X52995、X57184、U92938、U92920、U92921、U92929、U92925、U92916、X57178、AF051542、X57181、U92919、U92926、X57177、X57179、U92947、U92928、U92915、X57183、U92943、U92942、U92939、U92918、U92946、U92496、U97260、U97259、AF042541、U92923、AF051539、AF051538、U92934、AF029088、U92933、U97263、U97261、U97262、U92945、AF042540、U92935、U92936、U92924、AF02卯86、AF020983、U94958、U97258、U92940、AF029084、U92930、U94959、U92948、AF016863、AF029089、U92937、AF02鄉(xiāng)7、U92932、AF02卯90、AF029085、AF051540、AF051536、AF052743、AF054269、U92495、U92497、U92498、U92499、U92500、U92501、U92502、U92503、AF051541、X12899、Z48493、Z48489、Z48485、Z48494、Z48487、Z48488、Z48495、Z48490、Z48486、Z48491、Z48492、X66478、X66479、X66477、X66480、X81110、X79056、X78467、X81111、X78802、Z14281/82、Z14273/74、Z14275/76、Z14261/62、Z14265/66、Z14277〃8、Z14283/84、Z14271〃2、Z14269"0、Z14263/64、Z14259/60、Z14257/58、Z14293/94、Z14291/92、Z14279/80、Z14289/90、Z14287/88、Z14267/68、Z14285/86、L02929、X77423、X77424、X77433、X77426、X77428、X77430、X77427、X77429、X77425、X77432、X77431、X77422、Z48024/25、Z48032/33、Z48020/21、Z48022/23、Z48028/29、Z48016/17、Z48012/13、Z48014/15、Z48018/19、Z48026/27、U31060、U31061、U31062、U31063、U31064、U31065、U31066、U31067、U93898、U93899、U93900、U93901、U93902、U93903、U93904、U93905、U93906、U93907和U93908?；蛘撸a(chǎn)菌株可以是莢膜缺陷型菌株。莢膜缺陷型菌株提供的囊泡疫苗給予對(duì)象時(shí)能降低引發(fā)顯著自身抗體應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)(例如，因?yàn)楫a(chǎn)生了能與宿主細(xì)胞表面的唾液酸交叉反應(yīng)的抗體)。本文所用的"莢膜缺陷"或"缺乏莢膜多糖"表示細(xì)菌表面莢膜多糖水平低于天然產(chǎn)生的菌株，或者菌株經(jīng)遺傳修飾時(shí)，細(xì)菌表面莢膜多糖水平低于衍生該莢膜缺陷型菌株的親代菌株。莢膜缺陷型菌株包括表面莢膜多糖產(chǎn)生降低至少10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%或以上的菌株，也包括細(xì)菌表面莢膜多糖不可檢測(cè)(例如，利用抗莢膜多糖抗體的全細(xì)胞ELISA)的菌株。莢膜缺陷型菌株包括因天然產(chǎn)生的或重組產(chǎn)生的經(jīng)遺傳修飾而缺乏莢膜的那些菌株。本領(lǐng)域已知天然產(chǎn)生的莢膜缺陷型菌株(參見(jiàn)，例如Dolan-Livengood等，J.Infect.Dis.(2003)187(10):1616-28)以及鑒定和/或產(chǎn)生莢膜缺陷型菌株的方法(參見(jiàn)，例如Fisseha等，(2005)Infect.Immun.73(7):4070-4080;Stephens等，(1991)InfectImmun59(11):4097-102;Frosch等，(1990)MolMicrobiol.19904(7):1215-1218)。修飾奈瑟球菌宿主細(xì)胞以降低莢膜多糖產(chǎn)生可包括修飾參與莢膜合成的一個(gè)或多個(gè)基因，與修飾前的親代細(xì)胞相比，修飾基因能降低莢膜多糖的水平。這種遺傳修飾包括改變一個(gè)或多個(gè)莢膜生物合成基因的核苷酸和/或氨基酸序列，使得該菌株缺乏莢膜(例如，因?yàn)橐粋€(gè)或多個(gè)莢膜生物合成基因中有一個(gè)或多個(gè)(核苷酸)插入、缺失、取代等)。莢膜缺陷型菌株可缺乏一個(gè)或多個(gè)莢膜基因或所述基因無(wú)功能。特別感興趣的是唾液酸生物合成有缺陷的菌株。這種菌株產(chǎn)生的囊泡可降低產(chǎn)生引發(fā)與人唾液酸抗原起交叉反應(yīng)的抗-唾液酸抗體的風(fēng)險(xiǎn)，還可改進(jìn)生產(chǎn)安全性。唾液酸生物合成缺陷(因天然產(chǎn)生的修飾或工程改造的修飾)菌株可以是唾液酸生物合成途徑的許多不同基因有缺陷。特別感興趣的是N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-差向異構(gòu)酶基因(稱為synXAAF40537.1或siaAAAA20475)編碼的基因產(chǎn)物有缺陷的菌株，尤其感興趣該基因滅活的菌株。例如，一個(gè)實(shí)施方式通過(guò)破壞功能性synX基因產(chǎn)物的產(chǎn)生來(lái)獲得莢膜缺陷型菌株(參見(jiàn)，例如Swartley等，(1994)JBacterid.176(5):1530-4)。也可采用非重組技術(shù)從天然產(chǎn)生的菌株獲得莢膜缺陷型菌株，例如用殺菌性抗-莢膜抗體來(lái)選擇莢膜多糖減少的菌株。當(dāng)本發(fā)明涉及采用兩種以上菌株時(shí)(例如，如下文詳述的那樣，為產(chǎn)生不同菌株囊泡的抗原性組合物)，例如，可選擇特征不同的一種或多種菌株來(lái)提供PorA類型不同和/或GNA1870變體群的囊泡。奈瑟球菌宿主細(xì)胞中GNA1870的產(chǎn)量如上所述，通?？砂凑毡景l(fā)明利用天然產(chǎn)生或經(jīng)修飾的非天然奈瑟球菌菌株制備囊泡，所述囊泡含有足夠的GNA1870蛋白，當(dāng)給予對(duì)象時(shí)能產(chǎn)生抗-GNA1870抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，與表達(dá)檢測(cè)不到或低水平GNA1870的菌株相比，用于制備本發(fā)明囊泡的奈瑟球菌菌株可以是表達(dá)較高水平GNA1870的天然菌株。RM1090是產(chǎn)生低水平GNA1870菌株的實(shí)例。特別感興趣的天然菌株是其產(chǎn)生的GNA1870水平比低GNA1870產(chǎn)生菌株，例如RM1090的GNA1870產(chǎn)量高1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍或更高的菌株。表達(dá)高水平GNA1870的天然菌株的實(shí)例包括ET-5菌株，例如H44/76、Cu385和MC58。表達(dá)低水平或檢測(cè)不到水平GNA1870、中間水平GNA1870或高水平GNA1870的菌株的討論可參見(jiàn)Masignani等，2003,JExpMed197:789-199。在具體實(shí)施方式中，所述菌株產(chǎn)生的GNA1870水平高于RM1090產(chǎn)生的，比RM1090產(chǎn)生的至少高1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或IO倍或更高。在另一實(shí)施方式中，通過(guò)重組或非重組技術(shù)修飾奈瑟球菌菌株來(lái)提供足夠高水平的GNA1870產(chǎn)生。與未修飾的親代細(xì)胞的GNA1870產(chǎn)量或菌株RM1090的GNA1870產(chǎn)量相比，這種修飾的菌株通常能提高GNA1870產(chǎn)量1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍或更高。該實(shí)施方式可利用任何合適的菌株，包括修飾前GNA1870產(chǎn)量低或水平檢測(cè)不到的菌株，和與GNA1870檢測(cè)不到或水平低的菌株相比，能天然產(chǎn)生高水平GNA1870的菌株。可通過(guò)非重組技術(shù)，例如接觸化學(xué)物質(zhì)、輻射或其它DNA修飾或破壞試劑等產(chǎn)生修飾的菌株。可通過(guò)篩選能產(chǎn)生所需GNA1870水平(例如，與未修飾的親代菌株或GNA1870產(chǎn)量低的細(xì)菌(如RM1090)相比，GNA1870水平高，或其水平類似于產(chǎn)生可接受高水平GNA1870的菌株的水平)的菌株來(lái)鑒定具有所需蛋白質(zhì)表達(dá)水平，特別是GNA1870產(chǎn)量的修飾菌株?；蛘?，更常是采用重組技術(shù)，一般通過(guò)引入編碼GNA1870多肽的核酸或操縱內(nèi)源性GNA1870基因來(lái)提高內(nèi)源性GNA1870表達(dá)從而產(chǎn)生修飾的菌株。本領(lǐng)域已知測(cè)定GNA1870產(chǎn)量水平的方法。這種方法包括，例如利用抗-GNA1870抗體的Western印跡(任選與光密度掃描輔助的分析聯(lián)用)、流式細(xì)胞術(shù)(例如，F(xiàn)ACS)分析、檢測(cè)GNA1870RNA水平等。本文有時(shí)將無(wú)論天然或經(jīng)遺傳修飾導(dǎo)致GNA1870產(chǎn)量水平較高的菌株稱為GNA1870"過(guò)量表達(dá)菌株"或稱為"過(guò)量表達(dá)"GNA1870。遺傳修飾的奈瑟球菌菌株的產(chǎn)量如上所述，通過(guò)引入編碼GNA1870多肽的核酸或操縱內(nèi)源性GNA1870基因來(lái)提高內(nèi)源性GNA1870表達(dá)。遺傳修飾奈瑟球菌宿主細(xì)胞來(lái)提高內(nèi)源性GNA1870的表達(dá)可通過(guò)原位改變控制GNA1870表達(dá)的調(diào)控區(qū)來(lái)提高內(nèi)源性GNA1870表達(dá)。本領(lǐng)域已知提高內(nèi)源性奈瑟球菌基因表達(dá)的方法(參見(jiàn)，例如WO02/09746)。此外，己知編碼基因組GNA1870變體和亞變體的基因核酸序列，從而不難應(yīng)用這些方法來(lái)上調(diào)內(nèi)源性GNA1870表達(dá)。內(nèi)源性GNA1870可以是GNA1870的任何所需變體組(例如，v.l、v.2、v.3等)或亞變體。對(duì)菌株MC58的"標(biāo)準(zhǔn)"v.lGNA1870多肽特別感興趣。對(duì)菌株NZ98/294的亞變體GNA1870多肽和菌株2996的v.2GNA1870多肽也感興趣。修飾奈瑟球菌宿主細(xì)胞來(lái)提高內(nèi)源性GNA1870產(chǎn)量可包括部分或完全取代控制GNA1870表達(dá)的所有或部分內(nèi)源性基因，與未修飾的親代菌株相比，這種修飾能提高轉(zhuǎn)錄活性?？衫脙?nèi)源性控制區(qū)域中的變異(點(diǎn)突變、缺失和/或插入)和天然產(chǎn)生或修飾的異源啟動(dòng)子或二者組合來(lái)提高轉(zhuǎn)錄活性。遺傳修飾一般能使轉(zhuǎn)錄活性高于未修飾的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄活性(例如，通過(guò)引入強(qiáng)啟動(dòng)子)，從而提高GNA1870表達(dá)?？捎糜谔岣逩NA1870轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量的典型強(qiáng)啟動(dòng)子可包括，例如porA、porB、lbpB、tbpB、p110、hpuAB、lgtF、Opa、p110、1st和hpuAB啟動(dòng)子。作為組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，PorA、RMp和PorB是特別感興趣的。PorB啟動(dòng)子的活性包含在對(duì)應(yīng)于porB起始密碼子上游的核苷酸-1到-250片段中。本領(lǐng)域可采用各種方法將啟動(dòng)子引入宿主細(xì)胞基因組中，使啟動(dòng)子與內(nèi)源性GNA1870編碼核酸操作性相連。例如，(可采用)雙跨越同源重組技術(shù)將某啟動(dòng)子引入編碼序列的上游區(qū)域，例如引入GNA1870編碼核酸的起始ATG密碼子上游(5，)約1000bp、約30-970bp、約200-600bp、約300-500bp或約400bp，從而上調(diào)(轉(zhuǎn)錄)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域可用的常規(guī)方法來(lái)確定最佳取代的啟動(dòng)子。例如，在靶基因上游引入高活性啟動(dòng)子(如PorA、PorB或Rmp啟動(dòng)子)。例如，按照vanderEnde等，InfectImmun2000，68:6685-90所述可優(yōu)化PorA啟動(dòng)子用于表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)以下方法插入啟動(dòng)子，例如PCR擴(kuò)增GNA1870靶基因上游區(qū)段、將該上游區(qū)段克隆入載體中以及在PCR擴(kuò)增期間插入合適的限制性位點(diǎn)，或利用天然的限制性位點(diǎn)插入PorA啟動(dòng)子區(qū)段。例如，可克隆GNA1870基因的約700bp上游區(qū)段。利用位于該克隆區(qū)段內(nèi)GNA1870啟動(dòng)子上游適當(dāng)距離(例如，約400bp)的天然限制性酶切位點(diǎn)插入PorA啟動(dòng)子區(qū)段。可將抗生素(例如，紅霉素)抗性盒插入PorA啟動(dòng)子再上游的區(qū)段內(nèi)，通過(guò)同源重組用該構(gòu)建物替代野生型上游GNA1870區(qū)段。另一方法包括將編碼GNA1870多肽的序列引入在宿主細(xì)胞基因組中顯示強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的內(nèi)源性啟動(dòng)子的下游。例如，可用GNA1870多肽的編碼序列取代Rmp基因的編碼區(qū)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是利用高活性的組成型Rmp啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)表達(dá)。遺傳修飾奈瑟球菌宿主細(xì)胞來(lái)表達(dá)內(nèi)源性GNA1870可通過(guò)將編碼GNA1870多肽的構(gòu)建物引入奈瑟球菌宿主細(xì)胞中來(lái)遺傳修飾奈瑟球菌菌株，從而過(guò)量表達(dá)GNA1870。本文將為表達(dá)而引入的GNA1870稱為"外源性"GNA1870。宿主細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性GNA1870，與該內(nèi)源性GNA1870相比，外源性GNA1870可具有相同或不同的氨基酸序列。在該實(shí)施方式中用作宿主細(xì)胞的菌株能產(chǎn)生任何水平的GNA1870(例如，高水平、中間水平或低水平GNA1870產(chǎn)量)。特別感興趣的是利用選擇的GNA1870產(chǎn)量低水平或檢測(cè)不到的菌株，或經(jīng)修飾而GNA1870產(chǎn)量檢測(cè)不到或水平低的菌株。例如，可遺傳修飾宿主細(xì)胞以破壞其內(nèi)源性GNA1870基因，從而使細(xì)胞被膜中不產(chǎn)生GNA1870或不存在(因此，從這種修飾的細(xì)胞制備的囊泡中不存在可檢測(cè)水平)。在其它實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞能產(chǎn)生中間水平或高水平的GNA1870(例如，與如RM10卯產(chǎn)生的GNA1870水平相比)。GNA1870多肽可遺傳修飾宿主細(xì)胞來(lái)表達(dá)任何合適的GNA1870多肽，包括GNA1870變體或亞變體。如下文所詳述的那樣，已知許多GNA1870多肽的氨基酸序列；這些序列比對(duì)指出變體中的保守殘基，從而能指導(dǎo)對(duì)氨基酸的修飾(例如，取代、插入、缺失)。因此，本文所用的"GNA1870多肽"包括天然產(chǎn)生與合成(非天然產(chǎn)生)的多肽，所述合成多肽與天然產(chǎn)生的GNA1870多肽在核苷酸或氨基酸水平有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的序列相同性，其引發(fā)的抗體能特異性結(jié)合奈瑟球菌細(xì)菌全細(xì)胞上存在的天然GNA1870多肽。"GNA1870多肽"也包括融合蛋白，例如在N-和/或C-末端連有異源多肽的GNA1870多肽?？蛇z傳修飾宿主細(xì)胞以表達(dá)至少1種GNA1870多肽，可修飾宿主菌從而在同一宿主細(xì)胞中表達(dá)2種、3種、4種或更多種GNA1870多肽。例如，可遺傳修飾一種宿主細(xì)胞來(lái)表達(dá)至少一種GNA1870多肽變體1、至少一種GNA1870多肽變體2和至少一種GNA1870多肽變體3。當(dāng)表達(dá)多種GNA1870多肽因?qū)λ拗骷?xì)胞的毒性而遇到困難時(shí)，可從不同啟動(dòng)子表達(dá)不同的GNA1870多肽，從而能進(jìn)行一系列表達(dá)。例如，改變PorA啟動(dòng)子的-10到-35之間區(qū)域的堿基組成和堿基數(shù)目應(yīng)能拓寬表達(dá)所需重組蛋白的范圍(vanderEnde等，InfectImmun2000，68:6685-90)。本領(lǐng)域已知編碼本發(fā)明所用GNA1870多肽的核酸。合適的GNA1870多肽描述于，例如WO2004/048404;Masignani等，2003JExpMed197:789-799;Fletcher等，InfectImmun20042088-2100;Welsch等，JImmunol2004172:5606-5615;和WO99/57280。GNA1870變體和亞變體的核酸(及氨基酸序歹U)在GenBank中也有提供，登錄號(hào)為NC—003112，GeneID:904318(NCBIRef.NP_274866)(腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58);AY548371(AAT01290.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株CU385);AY548370(AAT01289.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株H44/76);AY548377(AAS56920.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株M4105);AY548376(AAS56919.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株M1390);AY548375(AAS56918.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株N98/254);AY548374(AAS56917.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株M6190);AY548373(AAS56916.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株4243);和AY548372(AAS56915.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株BZ83)。圖7分別是腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58、951-5945和M1239的GNA1870變體1、2和3的示范性氨基酸序列的比對(duì)(WO2004/048404)。不成熟的GNA1870蛋白包含約19個(gè)殘基的前導(dǎo)序列，各變體通常含有共價(jià)連接于脂質(zhì)部分的N-末端半胱氨酸。在天然成熟的蛋白質(zhì)中該半胱氨酸殘基常脂質(zhì)化。"l"表明成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸，負(fù)數(shù)表示的氨基酸是前導(dǎo)序列的一部分?；疑秃谏尘胺謩e表示保守和相同的氨基酸殘基。GNA1870多肽，包括非天然產(chǎn)生的變體的其它氨基酸序列見(jiàn)圖8A-8H和9。GNA1870可以是脂質(zhì)化或非脂質(zhì)化的。通常優(yōu)選GNA1870是脂質(zhì)化的，從而能將該多肽安裝在膜中?？赏ㄟ^(guò)表達(dá)具有N-末端信號(hào)肽的GNA1870多肽(該信號(hào)肽可通過(guò)二酰基甘油基轉(zhuǎn)移酶直接脂質(zhì)化)，然后利用脂蛋白特異性(II型)信號(hào)肽酶切割來(lái)制備脂質(zhì)化的GNA1870。本發(fā)明所用的GNA1870多肽包括氨基酸序列與天然GNA1870多肽不同的非天然產(chǎn)生(人工或突變型)的GNA1870多肽，但這些多肽存在于奈瑟球菌宿主細(xì)胞的膜中，因而由該宿主制備的囊泡含有的GNA1870能呈遞感興趣的表位，最好是殺菌表位并能提供抗-GNA1870抗體應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方式中，GNA1870多肽是變體1(v.l)或變體2(v.2)或變體3(v.3)GNA1870多肽，包含感興趣的v.l、v.2和v.3的亞變體，包括v.l的亞變體(參見(jiàn)，例如Welsch等，JImmunol2004172:5606-5615)。在一個(gè)實(shí)施方式中，GNA1870含有需要疫苗接種(對(duì)象)群所在地菌株中最流行的GNA1870的氨基酸序列。本發(fā)明所用的GNA1870多肽也包括融合蛋白，所述融合蛋白包含在N-末端或C-末端連有融合伴侶的GNA1870多肽。感興趣的融合伴侶包括，例如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、His-標(biāo)簽等以及其它蛋白質(zhì)，特別是脂蛋白的前導(dǎo)肽(例如，可用感興趣的另一前導(dǎo)肽替代N-末端半胱氨酸前的氨基酸序列)?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)鑒定其它GNA1870多肽編碼核酸，其中可根據(jù)與己知GNA1870多肽的氨基酸序列相似性來(lái)鑒定GNA1870多肽。這些GNA1870多肽通常在核苷酸或氨基酸水平具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的序列相同性?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知的核酸或氨基酸序列比對(duì)和比較方法來(lái)測(cè)定序列相同性。比較較長(zhǎng)的序列可能需要更精密的方法來(lái)最佳比對(duì)兩條序列。為對(duì)齊比較窗口，可通過(guò)以下算法進(jìn)行序列的最佳比對(duì)Smith和Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch((1970)J.MoLBiol.48:443)的同源性比對(duì)算法，Pearson和Lipman((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444)的相似性方法檢索，這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行儀器(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI)或通過(guò)目測(cè)，選擇各種方法得到的最佳比對(duì)(即，導(dǎo)致比較窗口內(nèi)序列相似性百分比最高)。兩條或更多條核酸或多肽序列的說(shuō)明中所用的術(shù)語(yǔ)"相同"或"相同性"百分比指當(dāng)采用以下序列比較算法之一或通過(guò)目測(cè)檢測(cè)來(lái)比較和比對(duì)兩條或更多條序列或子序列的最大一致性時(shí)，所述序列相同或有特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸相同。當(dāng)釆用以下序列比較算法之一或通過(guò)目測(cè)檢測(cè)來(lái)比較和比對(duì)最大一致性時(shí)，感興趣的多肽包括至少有60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的核苷酸或氨基酸殘基相同的多肽。具有序列相同性的區(qū)域最好為序列長(zhǎng)度至少約10、20、30、40、50、60、70、80或100個(gè)連續(xù)殘基的區(qū)域。在一最優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)參比多肽編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的比較來(lái)測(cè)定序列相同性。對(duì)于序列比較，通常將一條序列用作與測(cè)試序列比較的參比序列(例如，天然產(chǎn)生的GNA1870多肽序列)。當(dāng)采用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，設(shè)定子序列坐標(biāo)(如果需要)，和設(shè)定序列算法程序參數(shù)。然后序列比較算法根據(jù)設(shè)定的程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列與參比序列的序列相同性百分比。為比較，可采用例如以下算法進(jìn)行序列的最佳比對(duì)Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2:482，(1981))的局部同源性算法，Needleman和Wunsch(J.MoLBiol.48:443，(1970))的同源性比對(duì)算法，Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444，(1988))的相似性方法檢索，這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行儀器(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA禾口TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI)，或通過(guò)目測(cè)(通?？蓞⒁?jiàn)CurrentProtocolsinMolecularBiology(《分子生物學(xué)最新方法》)，F(xiàn).M.Ausubel等編，CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.的合資公司，(1995增刊)(Ausubel))。適用于測(cè)定序列相同性和序列相似性百分比的算法實(shí)例是分別描述于Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschuel等，(1977)NucleicAcidsRes.25:3389-3402的BLAST和BLAST2.0算法。公眾可通過(guò)生物技術(shù)信息國(guó)家中心(http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov/)獲得進(jìn)行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過(guò)在查詢序列中鑒定長(zhǎng)度為W的短字符來(lái)鑒定高評(píng)分序列配對(duì)(HSP)，將這些字串與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字符比對(duì)時(shí)符合或滿足某些正閾值評(píng)分T。T稱為近鄰字符評(píng)分閾值(Altschul等，同上)。這些原始近鄰字符命中(wordhit)作為啟動(dòng)檢索的種子來(lái)找尋含有它們的較長(zhǎng)HSP。然后使這些字符命中沿著各序列雙向延伸，以使累積比對(duì)評(píng)分增加。對(duì)于核苷酸序列，用參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)評(píng)分；恒大于O)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；恒小于O)計(jì)算累積評(píng)分。對(duì)于氨基酸序列，用評(píng)分矩陣來(lái)計(jì)算累積評(píng)分。當(dāng)出現(xiàn)以下情況時(shí)各方向的字符選中延伸停止累積比對(duì)評(píng)分從其達(dá)到的最高值下降X;因累積了比對(duì)的一個(gè)或多個(gè)負(fù)評(píng)分殘基導(dǎo)致累積評(píng)分降至0或0以下；或者到達(dá)二列之一的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序(用于核苷酸序列)默認(rèn)字長(zhǎng)(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=-4，并進(jìn)行雙鏈比較。對(duì)于氨基酸序列，BLAST程序默認(rèn)字長(zhǎng)(W)為3、期望值(E)為10并采用BLOSUM62評(píng)分矩陣(參見(jiàn)Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:10915，(1989))。除計(jì)算序列相同性百分比外，BLAST算法也可對(duì)兩條序列間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見(jiàn)，例如Karlin和Altschul，Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA，90:5873-5787，(1993))。BLAST算法提供的相似性測(cè)量值之一是最小總概率(P(N))，其指示兩條核苷酸或氨基酸序列間發(fā)生隨機(jī)匹配的概率。例如，如果在測(cè)試核酸與參比核酸的比較中最小總概率小于約0.1，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，則可認(rèn)為該核酸與參比核酸相似。如下所述，兩條核酸序列或多肽具有序列相同性的另一表現(xiàn)是第一核酸編碼的多肽與第二核酸編碼的多肽能發(fā)生免疫學(xué)交叉反應(yīng)。因此，例如當(dāng)兩條多肽僅因保守性取代而不同時(shí)，一條多肽通常與第二條多肽具有序列相同性。兩條核酸序列具有序列相同性的另一表現(xiàn)是該兩分子在在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能彼此雜交?？砂凑毡绢I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法(參見(jiàn)，例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)，第二版，(1989)，冷泉港，紐約)選擇一組具體的雜交條件。嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件的實(shí)例是在5(TC或更高，用O.lXSSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)雜交。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的另一實(shí)例是42。C在含50%甲酰胺、5XSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5XDenhardt溶液，10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性的剪切鮭魚精子DNA的溶液中培育過(guò)夜，然后在65'C用0.1XSSC洗滌濾膜。嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件是嚴(yán)謹(jǐn)性至少與以上代表性條件相同的雜交條件，其中如果所述條件是至少約80%,通常是至少約90%嚴(yán)謹(jǐn)，則可認(rèn)為這些條件至少與上述的具體嚴(yán)謹(jǐn)性條件同樣嚴(yán)謹(jǐn)。也可采用本領(lǐng)域已知的其它嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件來(lái)鑒定本發(fā)明該具體實(shí)施方式的核酸。不同的殘基位置最好是因保守性氨基酸取代而不同。保守性氨基酸取代指具有相似側(cè)鏈的殘基的互換。例如，具有脂族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含巰基側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守性氨基酸取代分組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。將遺傳物質(zhì)引入奈瑟球菌宿主細(xì)胞的載體和方法本領(lǐng)域己知不難采納用于提供奈瑟球菌宿主細(xì)胞的遺傳修飾來(lái)表達(dá)外源性GNA1870多肽的方法和組合物。示范性方法和載體見(jiàn)WO02/09746和O'Dwyer等，InfectImmun2004，72:6511-80。將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移入奈瑟球菌宿主的方法包括，例如綴合、轉(zhuǎn)化、電穿孔、磷酸鈣方法等。轉(zhuǎn)移方法應(yīng)能穩(wěn)定表達(dá)引入的GNA1870編碼核酸。GNA1870編碼核酸可作為可遺傳附加型元件(例如，質(zhì)粒)提供，或可整合入基因組。根據(jù)所進(jìn)行的重組操作的類型，組合物中合適的載體可以不同。整合性載體可以是條件復(fù)制型或自殺性質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、轉(zhuǎn)座子或通過(guò)限制性水解或PCR擴(kuò)增獲得的線形DNA片段?？赏ㄟ^(guò)可選擇性遺傳標(biāo)記，例如賦予對(duì)抗生素(例如，卡那霉素、紅霉素、氯霉素或慶大霉素)抗性的基因、賦予對(duì)重金屬和/或毒性化合物抗性的基因或補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變的基因(例如，pur、leu、met、aro)來(lái)選擇重組體。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體是以能在大腸桿菌和腦膜炎奈瑟球菌中自發(fā)復(fù)制的含可選擇藥物抗性標(biāo)記的附加型質(zhì)粒為基礎(chǔ)的表達(dá)載體。這種"穿梭載體"的一個(gè)實(shí)例是質(zhì)粒pFP10(Pagotto等，Gene2000244:13-19)。制備腦膜炎奈瑟球菌囊泡本發(fā)明所用的抗原性組合物通常包含由天然或因遺傳修飾(例如，因表達(dá)重組GNA1870)而能表達(dá)可接受水平GNA1870的奈瑟球菌細(xì)胞制備的囊泡。本文所用的"囊泡"包括外膜囊泡以及微囊泡(也稱為細(xì)胞泡(bleb))。在一實(shí)施方式中，所述抗原性組合物包含由腦膜炎奈瑟球菌屬培養(yǎng)菌株的外膜制備的外膜囊泡(OMV)?？赏ㄟ^(guò)以下步驟獲得OMV:將腦膜炎奈瑟球菌培養(yǎng)在肉湯或固體培養(yǎng)基中，最好通過(guò)分離細(xì)菌細(xì)胞與培養(yǎng)基(例如，通過(guò)過(guò)濾或低速離心來(lái)沉淀細(xì)胞等)，裂解細(xì)胞(例如，通過(guò)加入洗滌劑、滲透休克、超聲波處理、空腔化、勻漿等)，分離外膜組分與細(xì)胞質(zhì)分子(例如，通過(guò)過(guò)濾；或通過(guò)差別性沉淀或使外膜和/或外膜囊泡凝聚；或通過(guò)利用能特異性識(shí)別外膜分子的配體的親和分離方法；或通過(guò)高速離心來(lái)沉淀外膜和/或外膜囊泡等)，利用外膜組分制備OMV。在另一實(shí)施方式中，所述抗原性組合物含有在所述腦膜炎奈瑟球菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)期間釋放的微囊泡(MV)或細(xì)胞泡?？赏ㄟ^(guò)以下步驟獲得MV:將腦膜炎奈瑟球菌培養(yǎng)在肉湯培養(yǎng)基中，分離完整的細(xì)胞與肉湯培養(yǎng)基(例如，通過(guò)過(guò)濾或低速離心從而只沉淀細(xì)胞但不沉淀較小的細(xì)胞泡等)、然后收集不含細(xì)胞培養(yǎng)基的MV(例如，通過(guò)過(guò)濾，差別性沉淀或使MV凝聚，或通過(guò)高速離心來(lái)沉淀細(xì)胞泡等)。通常可以根據(jù)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的細(xì)胞泡含量來(lái)選擇用于制備MV的菌株(例如，可培養(yǎng)數(shù)量合理的細(xì)菌來(lái)制備適合于本文所述方法中分離和給予的細(xì)胞泡)。能產(chǎn)生高水平細(xì)胞泡的示范性菌株描述于PCT公布號(hào)WO01/34642。除了根據(jù)細(xì)胞泡產(chǎn)量，也可根據(jù)NspA產(chǎn)量選擇用于MV制備的菌株，優(yōu)選能產(chǎn)生較高水平NspA的菌株(具有不同NspA產(chǎn)量水平的腦膜炎奈瑟球菌的實(shí)例可參見(jiàn)，例如Moe等，1999，Infect.Immun.，67:5664)。在另一實(shí)施方式中，所述抗原性組合物含有一種菌株，或2、3、4、5或更多種菌株的囊泡，對(duì)于GNA1870或PorA之一或二者，這些菌株彼此可以是同源的或異源的，通常是異源的。一個(gè)實(shí)施方式用表達(dá)l、2、3、4、5、6、7、8、9或10種或更多種GNA1870蛋白的菌株制備所述囊泡，這些蛋白可以是不同的變體(v.l、v.2、v.3)或亞變體(例如，v.l、v.2或v,3的亞變體)。在另一實(shí)施方式中，所述抗原性組合物包含相同或不同菌株的OMV和MV混合物。在這種實(shí)施方式中，可將不同菌株的囊泡作為混合物給予。此外，可將相同或不同菌株的OMV和MV作為混合物給予。除囊泡(OMV和/或MV)外，本發(fā)明抗原性組合物中可包含分離的抗原或抗原的特定組合。降低脂質(zhì)毒性需要時(shí)(例如，用于產(chǎn)生囊泡的菌株伴有內(nèi)毒素或特別高水平的內(nèi)毒素)，可任選處理這種囊泡以減少內(nèi)毒素，例如降低給藥后的毒性。如下文所述，雖然不理想，但可用合適的洗滌劑(例如，BRIJ-96、脫氧膽酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉(sodiumlauoylsarcosinate)、EmpigenBB、TritonX-IOO、吐溫20(聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯(sorbitanmonolauratepolyoxyethylene))、吐溫80，濃度0.1-10%，優(yōu)選0.5-2%和SDS)萃取來(lái)減少內(nèi)毒素。利用洗滌劑萃取時(shí)，最好利用除脫氧膽酸鹽以外的洗滌劑。在一些實(shí)施方式中，不利用洗滌劑制備囊泡，例如不用脫氧膽酸鹽或其它洗滌劑。在特別感興趣的實(shí)施方式中，不用洗滌劑制備抗原性組合物的囊泡。雖然可用洗滌劑處理除去內(nèi)毒素活性，但在囊泡制備期間萃取可能消除天然GNA1870脂蛋白。因此，采用無(wú)需洗漆劑的技術(shù)降低內(nèi)毒素活性特別理想。一個(gè)方法是利用內(nèi)毒素(脂多糖，LPS)產(chǎn)生較少的菌株，從而無(wú)需在用于人體前從最終制品中除去內(nèi)毒素。例如，可以用脂寡糖或在疫苗中可能有害的其它抗原(例如，Rmp)減少或消除的奈瑟球菌突變株來(lái)制備囊泡。例如，可用經(jīng)遺傳修飾而使脂質(zhì)A的毒性活性降低或檢測(cè)不到的腦膜炎奈瑟球菌菌株制備囊泡。例如，可遺傳修飾這種菌株的脂質(zhì)A生物合成(Steeghs等，InfectImmun1999，67:4988-93;窗derLey等，InfectImmun2001，69:5981-90;Steeghs等，JEndotoxinRes2004，10:113-9)。突變負(fù)責(zé)最終修飾步驟的基因?qū)е聹囟让舾?htrB)或容許的(msbB)表型。造成這些基因表達(dá)降低(或這些基因的產(chǎn)物減少或無(wú)活性)的突變可導(dǎo)致脂質(zhì)A毒性改變。非月桂?；?htrB突變體)或非肉豆蔻酰化(msbB突變體)的脂質(zhì)A毒性低于野生型脂質(zhì)A。脂質(zhì)A4'-激酶編碼基因(lpxK)的突變也能降低脂質(zhì)A的毒性活性。也可通過(guò)在參與多粘菌素B耐受(這種耐受與脂質(zhì)A的4'磷酸基上加入氨基阿拉伯糖有關(guān))的基因/基因座中引入突變來(lái)改變LPS的毒性活性。這些基因/基因座可以是編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的pmrE，或參與氨基阿拉伯糖合成和轉(zhuǎn)移的許多腸細(xì)菌共有的抗菌肽耐受基因的某區(qū)域。存在于該區(qū)域的基因pmrF編碼多砲醇-流速酯甘露糖基(dolicol-phosphatemanosyl)轉(zhuǎn)移酶(GunnJ.S,，Kheng，B.L.，KruegerJ.，KimK.，GuoL.，HackettM.，MillerS.I.，1998.Mol.Microbiol.27:1171-1182)。PhoP-PhoQ調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的突變可導(dǎo)致在4'磷酸上加入氨基阿拉伯糖和2-羥基肉豆蔻替代肉豆蔻(肉豆蔻羥基化)，所述系統(tǒng)是磷酸中繼兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(例如，PhoP組成型表型，PhoP。)或低]^§++環(huán)境或培養(yǎng)條件(該條件k激活PhoP-PhoQ調(diào)節(jié)系統(tǒng))。該修飾的脂質(zhì)A顯示刺激人內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)E-選凝素和人單核細(xì)胞分泌TNF-a的能力降低。多粘菌素B耐受菌株也適用于本發(fā)明，因?yàn)檫@些菌株顯示LPS毒活性降低(參見(jiàn)，例如vanderLey等，1994，干ll于ProceedingsoftheninthinternationalpathogenicNeisseriaconference(第9屆致病性奈瑟球菌大會(huì)論文集)，TheGuildhall,Winchester,英格蘭)?；蛘?，可將能模擬多粘菌素B結(jié)合活性的合成肽加入所述抗原性組合物以降低LPS毒性活性(參見(jiàn)，例如Rustici等，1993，Science259:361-365;Porro等，ProgClinBiolRes.，1998，397:315-25)。也可通過(guò)選擇培養(yǎng)條件來(lái)減少內(nèi)毒素。例如，將菌株培養(yǎng)在每升含0.1mg-100mg氨基阿拉伯糖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中來(lái)降低脂質(zhì)毒性(參見(jiàn)，例如WO02/097646)。制劑用作疫苗的免疫原性組合物含有免疫有效量的抗原，特別是免疫有效量的GNA1870以及任何其它相容組分(如果需要)。"免疫有效量"表示將該用量以單一劑量或連續(xù)劑量的一部分給予個(gè)體時(shí)能有效引發(fā)治療作用或預(yù)防作用。該用量根據(jù)待治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、待治療個(gè)體的分類學(xué)組(例如，非人靈長(zhǎng)類、靈長(zhǎng)類、人等)、個(gè)體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗制劑、主治醫(yī)師對(duì)醫(yī)學(xué)狀況的評(píng)估和其它相關(guān)因素而不同。預(yù)計(jì)該用量范圍較寬，能通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定。劑量方案可以是單劑量方案或在不同時(shí)間給予單位劑型的抗原性組合物的多劑量方案(例如，包括加強(qiáng)劑量)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"單位劑型"指適合人和動(dòng)物對(duì)象的單位劑量的物理上不連續(xù)的單位，各單位含有足以產(chǎn)生所需效果的預(yù)定含量的本發(fā)明抗原性組合物，提供的組合物可與藥學(xué)上可接受的賦形劑(例如，藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或運(yùn)載體)結(jié)合。該疫苗可與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合給予。用藥學(xué)上可接受的稀釋劑(例如水溶液，往往是鹽水溶液)、半固體形式(例如，凝膠)或粉末形式配制來(lái)提供待給予的抗原性組合物。這種稀釋劑可以是惰性的，雖然本發(fā)明組合物也可包含佐劑?？捎糜谌梭w的已知合適佐劑的實(shí)例包括但不一定限于明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁、MF59(4.3%w/v角鯊烯、0.5%w/v吐溫80、0.5%w/v司盤85)、含CpG的核酸(其中胞嘧啶未甲基化)、QS21、MPL、3DMPL、Aquilla提取物、ISCOMS、LT/CT突變體、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、QuilA、白介素等。對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可利用弗氏(佐劑)、N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11637，稱為正-MDP)、N-乙?；邗?L-丙氨酰-0-異谷氨?；鶃A-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰-511-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，稱為MTP-PE)和用2%角鯊烯/吐溫80乳液配制的RIBI，其含有提取自細(xì)菌的三種組分單磷酰脂質(zhì)A、海藻糖二霉菌酸酯和細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)針對(duì)免疫原性抗原的抗體量來(lái)測(cè)定佐劑的效力。能提高該組合物效力的其它示范性佐劑包括但不限于(1)水包油乳劑(含或不含其它特異性免疫刺激劑，例如胞壁酰肽(見(jiàn)下文)或細(xì)菌細(xì)胞壁組分)，例如(a)含5%角鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%司盤85(任選含有MTP-PE)的MF59(WO90/14837;Vaccinedesign:thesubunitandadjuvantapproach(《疫苗設(shè)計(jì)亞單位和佐劑方法》)第10章，Powell和Newman編，PlenumPress1995)，利用微流化儀配制為亞微米顆粒，(b)含10。/。角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普朗尼克嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP的SAF，利用微流化儀配制為亞微米乳液或旋振產(chǎn)生粒徑較大的乳液，和(c)含2%角鯊烯、0.2%吐溫80和一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，例如單磷脂酰脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(DETOXTM)的RIBI佐劑系統(tǒng)(RAS)，(RibiImmunochem，Hamilton,MT);(2)皂苷佐劑，例如可利用QS21或STIMULON(CambridgeBioscience,Worcester,MA)或由其產(chǎn)生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)，所述ISCOM可不含其它洗滌劑，例如見(jiàn)WO00/07621;(3)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA);(4)細(xì)胞因子，例如白介素(如，IL國(guó)1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(W099/44636)等)、干擾素(如干擾素力、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷酰脂質(zhì)A(MPL)或3-0-脫?；鵐PL(3dMPL)，例如見(jiàn)GB-2220221、EP-A-0689454，當(dāng)與肺炎球菌糖聯(lián)用時(shí)任選基本上不含明礬，例如WO00/56358;(6)3dMPL與，例如QS21和/或水包油乳液的混合物，如EP隱A誦0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231;(7)含有CpG基序的寡核苷酸[Krieg;Vaccine2000,19,618-622;Krieg;CurropinMolTher20013:15-24;Roman等，Nat.Med，1997，3，849-854;Weiner等，PNASUSA,1997，94，10833-10837;Davis等，J.Immunol,1998，160，870-876;Chu等，J.Exp.Med，1997，186，1623-1631;Lipford等，Ear,J,Immunol,1997，27，2340-2344;Moldoveami等，Vaccine,1988，16，1216-1224;Krieg等，Nature,1995，374，546-549;Klinman等，PNASUSA，1996，93，2879-2883;Ballas等，J.Immunol,1996，157，1840-1845;Cowdery等，J.Immunol,1996，156，4570-4575;Halpern等，CellImmunol,1996，167，72-78;Yamamoto等，Jpn.J.CancerRes.，1988，79，866-873;Stacey等，J.Immunol,1996，157，2116-2122;Messina等，J.Immunol,1991，147，1759-1764;Yi等，J.Immunol,1996，157，4918-4925;Yi等，J.Immunol,1996，157，5394-5402;Yi等，J,Immunol,1998，160，4755-4761;和Yi等，J.Immunol,1998，160，5898-5906;國(guó)際專利申i青WO96/02555、W098/16247、WO98/18810、WO98/40100、W098/55495、W098/37919和W098/52581],即含有至少一個(gè)CG二核苷酸，其中胞嘧啶未甲基化；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如見(jiàn)W099/52549;(9)聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性劑與辛苯聚醇的混合物(WO01/21207)或聚氧乙烯垸基醚或酯表面活性劑與至少一種其它非離子表面活性劑，例如辛苯聚醇的混合物(WO01/21152);(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)(WO00/62800);(11)免疫刺激劑和金屬鹽顆粒，例如見(jiàn)WO00/23105;(12)皂苷和水包油乳劑，例如見(jiàn)W099/11241;(13)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IM2(任選+類固醇)，例如見(jiàn)W098/57659;(14)用作免疫剌激劑來(lái)提高所述組合物效力的其它物質(zhì)。胞壁酰肽包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙?；?正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨?；?L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MIP-PE)等?？乖越M合物可與常規(guī)藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如藥物級(jí)的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等混合。如果需要，該組合物可含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)來(lái)模擬生理?xiàng)l件，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些制劑中抗原的濃度變化很大，基本上按照所選擇的具體給藥方式和患者的需要根據(jù)液體體積、粘度、體重等來(lái)選擇。得到的組合物可以是溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、凝膠、乳膏、洗劑、軟膏、氣溶膠等形式。該藥物制劑中本發(fā)明抗原性組合物的蛋白質(zhì)濃度變化很大，即以體重計(jì)，從小于約0.1%，通常是或至少是約2%到多達(dá)20%-50%或更高，基本上按照所選擇的具體給藥方式，根據(jù)液體體積、粘度等來(lái)選擇。免疫接種總體上，本發(fā)明提供將一種或多種本發(fā)明抗原性組合物給予哺乳動(dòng)物對(duì)象(例如，人)，從而引發(fā)抗奈瑟球菌種細(xì)菌多種菌株的保護(hù)性免疫應(yīng)答，進(jìn)而引發(fā)抵御這種細(xì)菌所致疾病的保護(hù)作用的方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明方法能提供抵御1、2、3、4或更多種腦膜炎奈瑟球菌種菌株的免疫保護(hù)性免疫應(yīng)答，所述菌株在血清群、血清型、血清亞型或GNA1870多肽的至少一種中有差異(例如，不同的GNA1870變體和/或亞變體)。特別感興趣的是誘導(dǎo)抵御血清群B腦膜炎奈瑟球菌多種菌株的保護(hù)性免疫應(yīng)答，特別是所述菌株在血清亞型上有差異(例如，含有異源PorA)。就PorA和/或GNA1870而言，誘導(dǎo)抵御彼此異源的菌株的保護(hù)性免疫應(yīng)答也是特別感興趣的。本發(fā)明抗原性組合物可含或不含添加的賦形劑，通過(guò)口服、鼻部、鼻咽部、胃腸外、腸道、胃部、局部、透皮、皮下、肌肉內(nèi)，以片劑、固體、粉末、液體、氣溶膠形式局部或全身性給予。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或明白的制備可胃腸外給藥的組合物的實(shí)際方法更詳細(xì)地描述于例如Remington'sPharmaceuticalScience(《雷明頓藥物科學(xué)》)，第15版，MackPublishingCompany，Easton，賓夕法尼亞，(1980)的出版物。口服給藥可能需要保護(hù)組合物以避免(被)消化是公認(rèn)的。一般通過(guò)將組合物與可使其耐受酸和酶水解的物質(zhì)結(jié)合或?qū)⑵浒b在適當(dāng)?shù)哪褪茌d體中來(lái)實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域熟知避免消化的保護(hù)方法。將該組合物給予處于患奈瑟球菌疾病風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物來(lái)預(yù)防或至少使該疾病的發(fā)生及其并發(fā)癥部分停止。足以實(shí)現(xiàn)此目的的用量定義為"治療有效量"。治療有效量取決于，例如抗原性組合物、給藥的方式、患者的體重和總體健康狀況和處方醫(yī)師的判斷。給予單一劑量還是多劑量該抗原組合物取決于患者所需和可能耐受的劑量和頻率以及給藥途徑。本文所述抗原性組合物可含有囊泡(例如，OMV和MV)的混合物，所述囊泡可以來(lái)自相同或不同菌株。在另一實(shí)施方式中，所述抗原性組合物可包含來(lái)自2、3、4、5或更多種菌株的囊泡混合物，所述囊泡可以是OMV、MV或二者。給予有效量的抗原性組合物以在宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答，特別是體液免疫應(yīng)答。所述混合物的免疫接種用量通常為約0.001mg-約1.0mg/70公斤患者，更常見(jiàn)約0.001mg-約0.2mg/70公斤患者?？捎玫膭┝渴?.001至約10mg/患者/天，特別是當(dāng)抗原給予至封閉部位并不進(jìn)入血流時(shí)，例如不進(jìn)入體腔或不進(jìn)入器官內(nèi)腔?？诜⒈遣炕蚓植拷o藥基本上可采用較高劑量(例如，10-100mg或更高)。初次給予混合物后可用相同或不同的混合物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，優(yōu)選至少加強(qiáng)一次，更常見(jiàn)加強(qiáng)兩次。在一個(gè)實(shí)施方式中，用含有變體免疫優(yōu)勢(shì)抗原(用已受奈瑟球菌感染的不同宿主動(dòng)物的抗血清常規(guī)檢測(cè)到的主要抗原；代表性例子包括通道蛋白A、通道蛋白B、菌毛蛋白、NspA、磷脂、多糖、脂多糖、菌毛蛋白、OmpA、Opa、Opc等)和/或變體GNA1870蛋白的奈瑟球菌菌株制備用于初免和加強(qiáng)免疫的抗原性組合物。這些菌株的莢膜分子也不同，如它們的血清群所反映的那樣。目前可通過(guò)檢測(cè)已知能特異性識(shí)別通道蛋白分子的一組己知單克隆(抗體)中的哪一種能與未知菌株結(jié)合來(lái)檢測(cè)區(qū)分血清型和血清亞型(Sacchi等，1998,Clin.Diag.Lab.Immunol.5:348)。也可能將來(lái)會(huì)鑒定到其它這樣的單克隆。本發(fā)明特別考慮了采用任何新單克隆(抗體)測(cè)定到任何新的血清型和血清亞型(菌株)的應(yīng)用。此外，不僅可通過(guò)與單克隆抗體相互作用，還可通過(guò)缺乏和/或存在所定義的肽殘基和肽表位從結(jié)構(gòu)上定義血清型和血清亞型(Sacchi等，2000，J.Infect.Dis.182:1169)。本發(fā)明特別包括根據(jù)通道蛋白(已知的或以后發(fā)現(xiàn)的)的結(jié)構(gòu)特征區(qū)分血清型和血清亞型。在另一實(shí)施方式中，所給予的抗原性組合物由2、3、4、5或更多種菌株制備，就GNA1870或PorA之一或二者而言，所述菌株彼此可以是同源或異源，通常是異源的。在一個(gè)實(shí)施方式中，由表達(dá)不同GNA1870蛋白的菌株制備囊泡，所述GNA1870蛋白可以是不同變體(v.1、v.2、v.3)或亞變體(例如，v.l、v.2或v.3的亞變體)產(chǎn)生的。在另一實(shí)施方式中，就PorA而言，由彼此異源的菌株制備囊泡。在特別感興趣的實(shí)施方式中，由在遺傳學(xué)上彼此不同的奈瑟球菌菌株(例如，所述菌株屬于不同血清型和/或血清亞型；表達(dá)不同的PorA蛋白；表達(dá)不同的GNA1870變體或亞變體；和/或也任選屬于不同的莢膜血清群)制備囊泡。可利用這種囊泡將抗原性組合物制備為至少2、3、4或更多種遺傳學(xué)多樣性菌株的囊泡混合物。例如，用于制備和給予抗原性組合物的第二種奈瑟球菌菌株的GNA1870蛋白質(zhì)和/或PorA不同于用于產(chǎn)生該囊泡的第一種菌株?？扇芜x由與第二種菌株遺傳學(xué)不同的奈瑟球菌菌株(例如，所述菌株屬于不同血清型和/或血清亞型；表達(dá)不同的GNA1870變體或亞變體；表達(dá)不同的PorA蛋白；和/或?qū)儆诓煌那v膜血清群)制備第二、第三和其它給予的抗原性組合物。例如，用于制備第三抗原性組合物的第三種菌株可以與用于制備第一和第二抗原性組合物的第一和第二種菌株在遺傳學(xué)上不同，但是在一些實(shí)施方式中，不必與第一菌株在遺傳學(xué)上不同。本發(fā)明也考慮了可從奈瑟球菌，特別是腦膜炎奈瑟球菌的一種或多種菌株獲得的抗原性組合物，所述菌株通過(guò)已知方法(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)6,013,267)經(jīng)遺傳工程改造能表達(dá)編碼GNA1870的一種或多種核酸。宿主細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)源性GNA1870多肽，或可(經(jīng))修飾或選擇，從而不表達(dá)任何可檢測(cè)的內(nèi)源性GNA1870多肽。通過(guò)重組技術(shù)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的GNA1870多肽(即，外源性GNA1870多肽)可以是與內(nèi)源性GNA1870多肽相同或不同變體類型。可進(jìn)一步修飾宿主細(xì)胞使其表達(dá)感興趣的其它抗原，例如通道蛋白A、通道蛋白B、NspA、菌毛蛋白或其它奈瑟球菌蛋白。此外，本發(fā)明抗原性組合物可含有其它奈瑟球菌抗原，例如PCT公布號(hào)WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280、WO00/22430和WO00/66791所例舉的以及這種蛋白的抗原性片段。所述抗原性組合物通常給予未接觸過(guò)奈瑟球菌，特別是腦膜炎奈瑟球菌的免疫學(xué)原初哺乳動(dòng)物。在一具體實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物是約5歲或更小的人類兒童，優(yōu)選約兩歲或更小，所述抗原組合物在一個(gè)或多個(gè)以下時(shí)間給予出生后兩周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個(gè)月，或1年或15、18或21個(gè)月，或在2歲、3歲、4歲或5歲時(shí)。一般最好在疾病癥狀的首次體征出現(xiàn)前，或在可能或?qū)嶋H接觸奈瑟球菌首次出現(xiàn)體征時(shí)給予任何哺乳動(dòng)物。被動(dòng)免疫力本發(fā)明也考慮了免疫接種本發(fā)明抗原性組合物產(chǎn)生的免疫保護(hù)性抗體及其應(yīng)用方法?？蓪⑦@種抗體給予個(gè)體(例如，人患者)來(lái)提供抵御奈瑟球菌疾病的被動(dòng)免疫力，預(yù)防感染或疾病發(fā)生，或作為改善己患疾病患者的臨床結(jié)局(例如，降低并發(fā)癥，例如休克的發(fā)生率，降低死亡率或降低發(fā)病率，例如耳聾)的治療劑。給予除產(chǎn)生抗體的物種以外物種的對(duì)象的抗體往往具有免疫原性。因此，例如將鼠源或豬源抗體給予人往往會(huì)誘導(dǎo)針對(duì)該抗體的免疫應(yīng)答。可通過(guò)將該抗體的一部分或全部改變?yōu)槿祟愄卣餍孕蛄卸謩e產(chǎn)生嵌合型或人抗體可降低該抗體的免疫原性。嵌合型抗體是含有人和非人部分的免疫球蛋白分子。更具體地說(shuō)，人源化嵌合抗體的抗原結(jié)合區(qū)(或可變區(qū))得自非人來(lái)源(例如，鼠)，嵌合型抗體的恒定區(qū)(賦予免疫球蛋白生物學(xué)效應(yīng)物功能)得自人源。嵌合型抗體應(yīng)具有非人抗體分子的抗原結(jié)合特異性和人抗體分子賦予的效應(yīng)物功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可產(chǎn)生嵌合型抗體的許多方法(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,502,167;5,500,362;5,491,088;5,482,856;5,472,693;5,354,847;5,292,867;5,231,026;5,204,244;5,202,238;5,169,939;5,081,235;5,075,431和4,975,369)。另一方法是通過(guò)重組DNA技術(shù)連接非人抗體的CDR區(qū)與人(抗體)恒定區(qū)來(lái)產(chǎn)生人源化抗體。參見(jiàn)Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)和WO90/07861。在一個(gè)實(shí)施方式中，用重組DNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系來(lái)產(chǎn)生抗本發(fā)明肽的抗體。新的重組DNA載體含有替代該細(xì)胞系中編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的全部或一部分基因(例如，替代基因可編碼人免疫球蛋白的全部或一部分恒定區(qū)，或編碼特定的免疫球蛋白類型)的"替代基因"，以及可與抗體產(chǎn)生細(xì)胞的免疫球蛋白序列靶向同源重組的"靶序列"。在另一實(shí)施方式中，用重組DNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系來(lái)產(chǎn)生具有所需效應(yīng)物功能的抗體(例如，人免疫球蛋白的恒定區(qū))，在此情況中，該重組載體中所含的替代基因可編碼抗體某區(qū)域的全部或一部分，該重組載體中所含的耙序列能在抗體產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組和耙向基因修飾。在任一實(shí)施方式中，當(dāng)只替代可變區(qū)或恒定區(qū)的一部分時(shí)，得到的嵌合型抗體可針對(duì)相同的抗原和/或具有相同的效應(yīng)物功能，但所述功能得到改變或改善，從而使得該嵌合型抗體顯示的抗原特異性更高、親和結(jié)合常數(shù)更大、效應(yīng)物功能提高或轉(zhuǎn)染的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系的(抗體)分泌和產(chǎn)量增加等。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供完全的人抗體。人抗體完全由特征性人多肽序列構(gòu)成?？赏ㄟ^(guò)各種方法(參見(jiàn)，例如Larrick等，美國(guó)專利號(hào)5,001,065)產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，首先在三重雜交瘤(trioma)細(xì)胞(從三種細(xì)胞，兩種人和一種小鼠細(xì)胞傳下)中產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。然后克隆編碼這些抗體的基因和在其它細(xì)胞，特別是非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)三重雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生人抗體的通用方法描述于Ostberg，(1983)，Hybridoma2:361-367;Ostberg，美國(guó)專利號(hào)4,634,664和Engelman等，美國(guó)專利號(hào)4,634,666。己發(fā)現(xiàn)三重雜交瘤產(chǎn)生的抗體比從人細(xì)胞制備的常規(guī)雜交瘤(產(chǎn)生的抗體)更穩(wěn)定。本領(lǐng)域熟知制備和配制適合給予對(duì)象(例如，人對(duì)象)的抗體的方法。例如，可以在含有有效量的抗體和藥物賦形劑(例如，鹽水)的藥物組合物中提供抗體。所述藥物組合物可任選包含其它添加劑(例如，緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等)?？贵w的有效量通常是能在所需時(shí)間內(nèi)(例如至少約2天-10天或1個(gè)月-2個(gè)月)有效提供抵御奈瑟球菌疾病或癥狀的保護(hù)作用的用量。診斷試驗(yàn)本發(fā)明的抗原性組合物或給予這種組合物所產(chǎn)生的抗體也可應(yīng)用于診斷目的。例如，可利用所述抗原組合物篩選免疫前和免疫血清來(lái)確保疫苗接種有效。也可將這些抗體應(yīng)用于免疫測(cè)定來(lái)檢測(cè)奈瑟球菌疾病有關(guān)的特定抗原分子是否存在。實(shí)施例應(yīng)該知道本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方式只是為說(shuō)明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒于這些實(shí)施例和實(shí)施方式可提出各種改進(jìn)或變化，這些改進(jìn)和變化應(yīng)包括在本申請(qǐng)的構(gòu)思和權(quán)限以及附加的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)出于所有目的全文納入本文作為參考。材料與方法以下方法和材料用于下文實(shí)施例中。細(xì)菌菌株.表1列出了本項(xiàng)研究所用的9種腦膜炎奈瑟球菌菌株(6種是莢膜血清群B、一種是莢膜血清群A、兩種是莢膜血清群C)。這些菌株是在25年期間從古巴、荷蘭、德國(guó)、新西蘭或美國(guó)的住院患者中收集的。根據(jù)電泳簇分析和/或測(cè)序分型，這些菌株具有遺傳學(xué)多樣性。表1.腦膜炎奈瑟球菌菌<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>a根據(jù)Russell等，EmergInfectDis2004,10:674-8提出的PorAVR類型命名的術(shù)語(yǔ)b女B(www.mlst.net)所述以多基因座測(cè)序進(jìn)行ST分型；NT二不可分型；血清學(xué)未檢測(cè)到莢膜c與菌株MC58的序列相比，氨基酸的相同性百分比d如Welsch等，JImmunol2004,172:5606-15,Hou等，J.InfectDis.(2005年8月15日)192(4):580-90(電子版2005年7月15日)所報(bào)道的用人補(bǔ)體檢測(cè)的滴度；也參見(jiàn)圖3A和3B。ND，未測(cè)定。菌株用作過(guò)量表達(dá)GNA1870和制備疫苗的宿主利用C群菌株RM1090(C:2a5-l，2)和下文所述得自該菌株的突變體，B群菌株H44/76和下文所述得自該菌株的突變體制備外膜囊泡(OMV)疫苗。菌株RM1090天然表達(dá)低水平的GNA1870變體2蛋白。利用GNA1870基因已滅活的RM1090菌株(下文所述的RM1090AGNA1870)過(guò)量表達(dá)GNA1870變體1。菌株H44/76表達(dá)較高水平的GNA1870變體1。其余7種菌株天然表達(dá)GNA1870變體1蛋白的亞變體，選擇這些菌株作為測(cè)試微生物來(lái)測(cè)定疫苗誘導(dǎo)的抗-GNA1870變體l保護(hù)性免疫力的廣度。如電泳類型和/或多基因座測(cè)序類型所測(cè)定的，這些菌株在遺傳學(xué)上具有多樣性，它們也表達(dá)幾種不同類型的PorAVR序列。選擇變體1菌株是因?yàn)樗鼈兗s占致病B群分離物的60。/。(Masignani等，JExpMed2003，197:789-99)。菌株Cu385和菌株H44/76表達(dá)GNA1870變體1，其氨基酸序列與菌株MC58相同(Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15)，用該基因在大腸桿菌中表達(dá)重組GNA1870變體1蛋白，也用于穿梭載體在腦膜炎奈瑟球菌疫苗菌株RM1090中過(guò)量表達(dá)GNA1870(見(jiàn)下文)。其余7種菌株表達(dá)GNA1870變體1的亞變體，其序列與菌株MC58基因編碼的GNA1870蛋白相比略有變異(Masignani等，2003，同上)。在以前的研究中，菌株Cu385在用重組GNA1870蛋白疫苗免疫的小鼠中對(duì)所引發(fā)抗體的補(bǔ)體介導(dǎo)殺菌活性高度敏感(表1)。相反，選擇腦膜炎奈瑟球菌BZ198、M1390、M6190和NZ98/294是因?yàn)樗鼈兛赡褪苤亟MGNA1870疫苗制備的抗血清殺菌活性(殺菌滴度<1:10)。pFP12-GNA1870穿梭載體的構(gòu)建物.利用穿梭載體FP12實(shí)現(xiàn)了在腦膜炎奈瑟球菌中過(guò)量表達(dá)GNA1870，所述載體含有在淋病奈瑟球菌中天然產(chǎn)生質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，顯示能穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大腸桿菌和腦膜炎奈瑟球菌(Pagotto等，Gene2000，244:13-9)。利用以下引物通過(guò)PCR從基因組DNA擴(kuò)增包含腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58的推定FUR盒啟動(dòng)子的變體1GNA1870基因GNA1870FURSphlF5',5"-ATCGGCATGCGCCGTTCGGACGACATTTG-3"和GNA1870FURStUIR3'5"-AAGAAGGCCTTTATTGCTTGGCGGCAAGGC-3"。然后用印W和Sfw/限制性內(nèi)切核酸酶消化PCR產(chǎn)物，連接入用印W和^w/消化除去了GFP基因的pFP12質(zhì)粒中。用得到的質(zhì)粒pFP12-GNA1870轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株TOP10感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)并增殖，該細(xì)胞于37'C氯霉素選擇(壓力)(501^g/ml)下土咅養(yǎng)在Luria扁Bertani培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)化腦膜炎奈瑟球菌.利用紅霉素選擇(5叫/ml)，用質(zhì)粒pBSUDGNA1870ERM轉(zhuǎn)化，通過(guò)同源重組制備其中GNA1870基因已滅活的RM1090菌株(RM1090AGNA1870)。為制備能過(guò)量表達(dá)GNA1870的突變株，從培養(yǎng)過(guò)夜的巧克力瓊脂平板上選擇RM10卯AGNA1870敲除菌株的3-4個(gè)菌落。將細(xì)菌菌落在20plEB緩沖液(Qiagen)中與3叫質(zhì)粒pFP12-GNA1870混合，接種到巧克力瓊脂平板上，在37'C培養(yǎng)5小時(shí)。在含有氯霉素(5pg/ml)的巧克力瓊脂平板上再培養(yǎng)該細(xì)菌的連續(xù)稀釋液。培養(yǎng)平板在37'C培育過(guò)夜，利用小鼠多克隆抗-rGNA1870抗體通過(guò)菌落印跡試驗(yàn)篩選菌落的GNA1870表達(dá)情況。選出各陽(yáng)性克隆，在含有氯霉素的巧克力瓊脂平板上再培養(yǎng)。在2%脫脂奶(重量/體積)中冷凍腦膜炎球菌細(xì)菌細(xì)胞，-80°(:保存。采用類似方法轉(zhuǎn)化菌株H44/76及其過(guò)量表達(dá)GNA1870的突變株。用pBSUDgnal870erm轉(zhuǎn)化滅活菌株H44/76中的染色體gnal870(Hou等，InfectImmun2003，71:6844-49)。然后用編碼菌株MC58的GNA1870變體1的質(zhì)粒pFP12-GNA1870轉(zhuǎn)化該突變株(H44/76△gnal870)。在含有氯霉素(5(ig/ml)的巧克力瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化株。膜制品.在巧克力瓊脂平板(Remel,Laztakas，Kans.)上從冷凍儲(chǔ)備物中傳代培養(yǎng)腦膜炎奈瑟球菌。37°C，5%(302培養(yǎng)過(guò)夜后，選出幾個(gè)菌落，在含5%C02的氣氛中，用含0.25%葡萄糖和0.02mMCMP-NANA的約6mlMueller-Hinton肉湯培育至620nm光密度(0062())為0.1。在5pg/ml氯霉素存在下培養(yǎng)含有引入的pFP12-GNAl870穿梭載體的所有菌株。37'C和5%(302振蕩培養(yǎng)接種的肉湯直至OD62o達(dá)至lJ0.6-0.7(2-3小時(shí))。利用6份6-ml初始培養(yǎng)液接種1LMueller-Hinton肉湯。較多的培養(yǎng)液在37。C劇烈振蕩培養(yǎng)至OD620為0.8-1.0。加入苯酚(0.5%重量/體積)，肉湯在4。C靜置過(guò)夜以殺死細(xì)菌。4。C離心(10,000Xg)30分鐘沉淀細(xì)菌細(xì)胞，冷凍并保存于-2(TC直至用于制備外膜囊泡疫苗。對(duì)于含菌株H44/76及其突變株的培養(yǎng)液，利用6份7ml初始培養(yǎng)液。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至未添加氯霉素的1LMueller-Hinton肉湯中，劇烈振蕩培養(yǎng)至OD620達(dá)到0.8-1.0。加入苯酚(0.5%重量/體積)，培養(yǎng)液在37r靜置2小時(shí)，4'C培育過(guò)夜以殺死細(xì)菌。4'C離心(11,000Xg)30分鐘沉淀細(xì)胞。如上所述制備用于OMV的腦膜炎奈瑟球菌膜組分，不用洗滌劑以免萃取出GNA1870脂蛋白(Moe等，2002，同上)。簡(jiǎn)言之，將冷凍的細(xì)菌細(xì)胞懸浮在40mlPBS中，在冰上用裝配了微針頭(microtip)的超聲波儀(Bmnson,Danbury,Conn)進(jìn)行4次15秒超聲處理，該處理足以釋放膜細(xì)胞泡，但不導(dǎo)致細(xì)菌完全裂解。各次超聲處理之間用冰冷卻細(xì)菌懸浮液。5,000Xg離心15分鐘除去細(xì)胞碎片，4'C以100,000Xg超離心1小時(shí)獲得保持在上清液中的膜組分，將其重懸在5mlPBS中。這些制品稱為OMV?；蛘?，如上所述(Moe等，2002，同上)可用細(xì)菌釋放入上清液中的細(xì)胞泡獲得的MV;也可參見(jiàn)WO02/09643。對(duì)于H44/76(及其突變株)，將冷凍的細(xì)菌細(xì)胞重懸在20mlPBS緩沖液中，進(jìn)行4次15秒超聲處理。4°C(16,000Xg)離心30分鐘除去細(xì)胞碎片，離心(100,000Xg)2小時(shí)收集可溶性組分中富含外膜蛋白的細(xì)胞膜。疫苗的特征鑒定.采用DC蛋白質(zhì)試驗(yàn)(Bio-Rad,Richmond,加利福尼亞.)和BCA蛋白質(zhì)試驗(yàn)試劑盒(Pierce,Rockford，IL)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。如Laemmli(Nature1970，227:680-5)所述，利用Mini-ProteanII電泳裝置(Bio-Rad)和Western印跡通過(guò)15%SDS-PAGE(H44/76制品用12.5%SDS-PAGE)分析OMV制品。將樣品懸浮于樣品緩沖液中(0.06MTris*HCl，pH6.8，10。/。(v/v)甘油，2%(w/v)SDS，5%(v/v)2-巰基乙醇，10|ag/ml溴酚藍(lán))，加熱至100°C，5分鐘，然后直接加樣到凝膠上。對(duì)于Western印跡，凝膠用緩沖液(48mMTris'HCl，39mM甘氨酸[pH9.0]20。/。(v/v)甲醇)平衡，利用Trans-Blot(Bio-Rad)半干式電泳轉(zhuǎn)移小室將凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Bio-Rad)。用PBS配制的2y。(w/v)脫脂奶封閉硝酸纖維素膜，使其與用含1%(w/v)BSA和1%(w/v)吐溫-20的PBS配制的抗rGNA1870-抗血清的1:20,000稀釋液反應(yīng)。利用家兔抗小鼠IgG+A+M-偶聯(lián)了辣根過(guò)氧化物酶的多克隆抗體(Zymed,SouthSanFrancisco,加利福尼亞)和"WesternLightning"化學(xué)發(fā)光試劑(PerkinElmerLifeSciences,Inc.,波士頓，馬里蘭)檢測(cè)結(jié)合的抗體。檢測(cè)用抗-GNA1870抗血清得自依次注射一劑量重組GNA1870v.l(腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58的基因)，然后一劑量重組v.3蛋白(菌株M1239的基因)，再一劑量重組v.2蛋白(菌株2996的基因)各IO嗎的免疫小鼠，各次注射間隔3-4周。免疫接種.如上所述利用編碼6個(gè)COOH-末端組氨酸(His標(biāo)簽)以及不含編碼推定的前導(dǎo)肽的N-末端序列的GNA1870DNA序列在大腸桿菌中表達(dá)該重組蛋白質(zhì)疫苗(Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15)。利用該非脂質(zhì)化的His標(biāo)簽GNA1870蛋白是因?yàn)樗戎亟M脂蛋白更易于制備，早先研究的數(shù)據(jù)表明與弗氏完全和不完全佐劑一起給予的非脂質(zhì)化抗原能在小鼠中引發(fā)針對(duì)大多數(shù)測(cè)試菌株的強(qiáng)烈殺菌抗體應(yīng)答。用PBS稀釋OMV制品或重組GNA1870蛋白，用與培育用PBS緩沖液等體積的磷酸鋁佐劑(1%Alhydrogel終濃度[重量/體積；SuperfosBiosector，F(xiàn)rederikssund,Denmark])吸附。腹膜內(nèi)(IP)免疫接種各組4-6周齡的雌性CD1小鼠(CharlesRiverBreedingLaboratories,Raleigh,NC)(N40/組)。各小鼠接受含有5嗎總蛋白的劑量(對(duì)于混合組，OMV和rGNA1870各2.5嗎)。共注射三次，每次間隔3周。給予第三次劑量?jī)芍芎?，通過(guò)心臟穿刺采血處死小鼠。分離血清，-20°0凍存。對(duì)于H44〃6制品，各小鼠接受的劑量為OMV中含有1.25|ig總蛋白和170嗎磷酸鋁。三次注射間隔3周。給予第三次劑量三周后，通過(guò)心臟穿刺采血。離心分離血清，-70°0凍存待用。吸附抗-GNA1870抗體.為測(cè)試抗-GNA1870抗體對(duì)抗體功能活性的貢獻(xiàn)，我們吸附合并血清以除去抗-GNA1870抗體。簡(jiǎn)言之，將用含10mM咪唑的PBS緩沖液作l:2稀釋的100i!l合并血清加入裝有250plNi-NTA瓊脂糖(Qiagen，Valencia,加利福尼亞)的柱中，所述瓊脂糖與200pg重組GNA1870-His標(biāo)簽蛋白或作為陰性對(duì)照的重組NadA-His標(biāo)簽蛋白絡(luò)合(Comanducci等，JExpMed2002，195:1445-54;Hou等，2005，同上)。4。C培育該柱過(guò)夜，用含10mM咪唑的500plPBS緩沖液洗滌。合并流出柱的5組份(每份100pl)，通過(guò)膜過(guò)濾(MicroconYM-IO，10,000MWCO，MilliporeCorp.,Bedford,MA)濃縮至原先的50|il血清體積。根據(jù)ELISA結(jié)果，GNA1870柱除去了98-99%以上的抗-GNA1870抗體。抗畫GNA1870抗體.如前所述(Welsch等，JImmunol2004，172:5606畫1)采用ELISA檢測(cè)針對(duì)GNA1870的血清抗體滴度。固相抗原由rGNA1870v.l或v.2蛋白構(gòu)成。第二抗體是偶聯(lián)堿性磷酸酶的家兔抗-小鼠IgM+G+A(Zymed)的1:2000稀釋液。血清滴度定義為與底物培育30分鐘后004()5為0.5時(shí)的稀釋度。補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌抗體活性.如前所述(Moe等，2002，同上)利用在補(bǔ)加了0.25%葡萄糖的MuellerHinton肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)菌進(jìn)行殺菌試驗(yàn)。最終的反應(yīng)混合物含有不同稀釋度的測(cè)試血清、20%(v/v)人補(bǔ)體和含1%BSA的Gey緩沖液。補(bǔ)體來(lái)源是檢測(cè)不到固有殺菌活性的健康成年人血清(Granoff等，JImmunol1998，160:5028-36;Welsch等，2003，同上)。血清殺菌滴度定義為細(xì)菌在反應(yīng)混合物中培育60分鐘后，與0時(shí)的對(duì)照CFU/ml相比，造成CFU/ml降低50%時(shí)的血清稀釋度。用陰性對(duì)照抗體和補(bǔ)體培育的細(xì)菌通常顯示培育60分鐘期間CFU/ml增加150-200%。抗體與有被囊的活腦膜炎奈瑟球菌表面結(jié)合.如前所述(Granoff等，JImmunol2001，167:3487-3496)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)間接熒光試驗(yàn)測(cè)定抗-GNA1870抗體與活的腦膜炎奈瑟球菌表面結(jié)合的能力。陽(yáng)性對(duì)照包括對(duì)C群莢膜多糖(1076.1(Garcia-Ojeda等，InfectImmun2000，68:239-46))、PorAP1.2(Granoff等，JImmunol2001,167:3487-3496)、GNA1870變體1(JAR3)(Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15)特異性小鼠單克隆抗體和FITC偶聯(lián)的山羊抗-小鼠(Fab')2IgG(H+L)的1:300稀釋液(JacksonImm腦ResearchLaboratories,WestGrove,PA)。激活人補(bǔ)體沉積在有被囊的活腦膜炎球菌表面.如前所述(Welsch等，JInfectDis2003，188:1730-40)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定C3b或iC3b抗-GNA1870抗體依賴性沉積到活腦膜炎奈瑟球菌細(xì)菌表面。在含5%(^/"人補(bǔ)體和用veranol緩沖液配制的合適血清稀釋液的反應(yīng)混合物中培育經(jīng)洗滌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌。利用能與C3b和iC3b反應(yīng)的FITC-偶聯(lián)綿羊抗-人補(bǔ)體C3c(BioDesignIntl.,Saco,ME)檢測(cè)補(bǔ)體沉積。補(bǔ)體來(lái)源于上述殺菌試驗(yàn)的同一人血清。乳大鼠中的被動(dòng)保護(hù)作用.在用B群菌株NZ98/254腹膜內(nèi)攻擊的乳大鼠中測(cè)試抗血清賦予抵御腦膜炎奈瑟球菌B群菌血癥的被動(dòng)保護(hù)作用的能力(Welsch等，2003，同上；Moe等，InfectImmun1999，67:5664-75;Moe等，InfectImmun2001，69:3762-71)。簡(jiǎn)言之，將遠(yuǎn)交Wistar大鼠的同窩后代4天乳大鼠隨機(jī)分配給哺乳母鼠。在0時(shí)，將用含1。/。BSA的PBS稀釋的抗血清或抗體腹膜內(nèi)給予各組的8只大鼠。兩小時(shí)后，用在補(bǔ)加0.25%葡萄糖和10mMCMP隱NANA的Mueller-Hinton肉湯(Sigma,St.Louis,MO)中培養(yǎng)的約6X104CFU個(gè)經(jīng)洗滌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌腹膜內(nèi)攻擊大鼠。細(xì)菌攻擊后4-6小時(shí)，通過(guò)心臟穿剌獲得血液樣品，將l、10和100pl等份血液接種到巧克力瓊脂平板上以確定CFU/ml。實(shí)施例1:腦膜炎奈瑟球菌菌株RM1090上GNA1870的表面可接近性為測(cè)定用pFP12-GNA1870轉(zhuǎn)化RM1090菌株所表達(dá)的GNA1870蛋白是否是外膜的整合部分并暴露在細(xì)胞表面上，為測(cè)定菌株H44/76中過(guò)量表達(dá)的GNA1870是否錨定在外膜且表面可接近，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗-GNA1870和對(duì)照抗體與有被囊活細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)合情況(圖1)。如圖1A所示，C群莢膜多糖(列2)或PorA(抗-P1.2，列3)特異性的陽(yáng)性對(duì)照mAb顯示能與親代RM1090菌株(行B)和以下兩個(gè)RM1090突變型菌株強(qiáng)烈結(jié)合用不含GNA1870基因的穿梭載體轉(zhuǎn)化的GNA1870敲除(菌株)(行A)和用編碼GNA1870變體1蛋白質(zhì)的穿梭載體轉(zhuǎn)化的敲除(菌株)(行C)。所有3種菌株均不與單用磷酸鋁免疫小鼠的陰性對(duì)照合并血清1:IO稀釋液顯著結(jié)合(列1)?？?GNA1870單克隆或多克隆抗體與GNA1870敲除菌株也不顯著結(jié)合(分別是行A、歹U5和6)。天然表達(dá)低水平GNA1870v.2蛋白的野生型RM1090菌株與v.l蛋白的特異性抗-GNA1870mAb沒(méi)檢測(cè)到結(jié)合(行B，列4)，其顯示結(jié)合略超過(guò)制備的抗重組v.l、2和3GNA1870蛋白(見(jiàn)下文)多克隆小鼠抗血清的背景結(jié)合(列5和6)。相反，用編碼GNA1870(變體l)的穿梭載體轉(zhuǎn)化的菌株顯示能與多克隆和單克隆抗-GNA1870抗體強(qiáng)烈結(jié)合。因此，GNA1870暴露于用pFP12-GNA1870穿梭載體轉(zhuǎn)化的RM1090菌株表面上。如圖1B所示，陽(yáng)性對(duì)照抗莢膜和抗-PorA(P1.16)單克隆抗體能與H44/76野生型菌株和過(guò)量表達(dá)GNA1870菌株H44/76的突變株結(jié)合(均顯示于行1)。陽(yáng)性對(duì)照抗體也能與H44/76AGNA1870結(jié)合(示于行2)。與估計(jì)的一樣，抗-GNA1870單克隆或多克隆抗體與編碼GNA1870的基因已滅活的突變型菌株H44/76不結(jié)合(列D-F)。野生型菌株與抗-GNA1870抗體培育顯示結(jié)合良好，該結(jié)果反映菌株H4476中天然GNA1870表達(dá)水平較高。免疫熒光向右稍許偏移證明與經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)GNA1870的突變型菌株的結(jié)合有適度增加。因此，GNA1870過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致外膜中該蛋白含量稍許增加，而所述蛋白暴露于表面。實(shí)施例2.OMV疫苗的分析通過(guò)SDS-PAGE分離菌株RM1090及各突變株OMV制品中的主要蛋白質(zhì)，用考馬斯藍(lán)染色目測(cè)觀察(圖2A，A圖)。與用腦膜炎奈瑟球菌制備的典型OMV一樣，在表觀質(zhì)量介于29kDa(Opa/Opc)和43kDa(PorA)之間可分辨的主要蛋白數(shù)量有限。野生型菌株(泳道l)和GNA1870敲除菌株(泳道3)制備的OMV顯示這些蛋白每種的各自含量相似。相反，用不含GNA1870編碼基因的pFpl2穿梭載體轉(zhuǎn)化的菌株的OMV(分別是泳道2和4)顯示遷移至表觀質(zhì)量介于38-43kDa之間的三種蛋白的相對(duì)表達(dá)降低。該結(jié)果可能部分反映了因生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在5lag/ml氯霉素的抗生素選擇(壓力)降低了通道蛋白的表達(dá)(Tommassen等，InfectImmun19卯，58:1355-9)。泳道5顯示了用編碼GNA1870的穿梭載體轉(zhuǎn)化菌株RM1090制備的OMV。為更好地目測(cè)觀察蛋白質(zhì)，該泳道加載的蛋白質(zhì)是泳道1-4的兩倍以上(約10pg)。與其它OMV制品相比，用含GNA1870基因的穿梭載體轉(zhuǎn)化菌株制備的OMV顯示29-32kDa之間可分辨的蛋白質(zhì)表達(dá)降低。采用SDSPAGE，在包含過(guò)量表達(dá)GNA1870的突變型菌株制備的OMV的任何OMV制品中均不易觀察到GNA1870(為比較，泳道6顯示了1嗎重組GNA1870變體蛋白)。在圖2A中，采用抗v.l、2和3GNA1870重組蛋白多克隆抗血清進(jìn)行Western印跡來(lái)評(píng)估不同疫苗制品中GNA1870的表達(dá)。如B圖所示，與v.l重組蛋白相比，該抗血清與rGNA1870v.2蛋白的反應(yīng)性略強(qiáng)。即使有這種偏差，Western印跡(檢測(cè)到)與從天然表達(dá)v.2蛋白的野生型RM1090菌株制備的OMV相比，用pFP12-GNA1870轉(zhuǎn)化RM1090制備的OMV顯示反應(yīng)性提高(圖2A，C圖)。相反，GNA1870敲除突變株(RM1090AGNA1870)的陰性對(duì)照OMV檢測(cè)不到反應(yīng)活性。光密度測(cè)量結(jié)果表明在用穿梭載體轉(zhuǎn)化的菌株中v.lGNA1870蛋白的表達(dá)比野生型親代RM1090菌株天然表達(dá)的v.2蛋白約高10倍。利用抗GNA1870多克隆抗血清通過(guò)Western印跡分析了H44/76OMV制品(圖2B)。根據(jù)該制品的總蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化加載到凝膠上的OMV量。與估計(jì)的一樣，在野生型菌株的膜制品中有GNA1870表達(dá)，其在經(jīng)工程改造而能過(guò)量表達(dá)該蛋白的突變株相應(yīng)制品中表達(dá)增加。然而，GNA1870的增加適中(約3倍)。實(shí)施例3:血清抗體應(yīng)答的分析表2和圖5總結(jié)了通過(guò)ELISA檢測(cè)的不同組小鼠的血清抗-GNA1870抗體應(yīng)答。表2顯示對(duì)變體1蛋白的最高抗體應(yīng)答是在單用重組GNA1870v.1疫苗或用含OMV疫苗的重組GNA1870v.l混合疫苗免疫的小鼠中產(chǎn)生(抗變體1蛋白的滴度分別是1:120,000和1:300,000)。用過(guò)量表達(dá)變體1GNA1870的菌株RM1090制備的OMV免疫的小鼠抗-GNA1870滴度(l:32,000)低4-10倍。令人感興趣的是，用變體1或2蛋白檢測(cè)以野生型RM1090菌株制備的OMV免疫的小鼠，抗-GNA1870抗體應(yīng)答檢測(cè)不到或可忽略。該結(jié)果提示不過(guò)量表達(dá)的話，野生型菌株的OMV中GNA1870的免疫原性不佳。用與磷酸鋁一起給予的H44/76OMV(1.25嗎總蛋白)或5嗎rGNA1870免疫各組小鼠。第三次劑量三周后獲得血清樣品，合并(每個(gè)疫苗組2份合并物，4-5只小鼠制備一份合并物)。如圖5所示，單用鋁佐劑免疫的對(duì)照小鼠沒(méi)有可檢測(cè)的抗-GNA1870抗體(GMT<1:10，柱1)，而用rGNA1870免疫的小鼠顯示最高的應(yīng)答(GMT1:23,500，柱2)。用過(guò)量表達(dá)GNA1870的H44/76制備的OMV免疫小鼠的抗-GNA1870抗體應(yīng)答比用野生型菌株OMV免疫的各組約高10倍(比較柱5和3)。用H44/76AGNA1870制備的OMV免疫小鼠的抗體應(yīng)答可忽略(GMT<1:10，柱4)。表2.ELISA檢測(cè)到的小鼠抗-GNA1870抗體應(yīng)答<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>圖3A總結(jié)了對(duì)4株測(cè)試菌檢測(cè)到的不同組小鼠的血清殺菌抗體應(yīng)答。單用重組GNA1870蛋白疫苗、或聯(lián)用重組GNA1870疫苗和OMV疫苗，或用過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV免疫的小鼠產(chǎn)生了彼此差異不顯著的抗菌株Cu385高殺菌滴度(比較上圖的柱4、5和6)。相反，用野生型RM1090或GNA1870敲除菌株制備的OMV疫苗免疫的對(duì)照小鼠血清中未檢測(cè)到抗菌株Cu385的殺菌活性。(分別是柱2和3;滴度<1:10)。注意菌株Cu385表達(dá)典型的GNA1870v.l蛋白(與菌株MC58的氨基酸序列相同，用該基因表達(dá)重組GNA1870蛋白)，我們以前的研究已知該菌株對(duì)重組GNA1870疫苗所引發(fā)的小鼠抗體的殺菌活性高度敏感(表1)。另外，Cu385具有對(duì)疫苗菌株RM1090的PorA血清亞型(P1.5,2)為異源的PorA血清亞型(Pl.19,15)，因此估計(jì)菌株Cu385能耐受不過(guò)量表達(dá)GNA1870變體1的對(duì)照OMV疫苗所產(chǎn)生抗體的殺菌活性(Tappero等，JAMA1999，281:1520-7;Moe等，2002，同上)。圖3A也顯示與工程改造的疫苗菌株的血清殺菌滴度相比，兩側(cè)到對(duì)表達(dá)v.lGNA1870蛋白亞變體菌株M6190(從上往下第二幅圖)的相應(yīng)血清殺菌滴度。在用重組GNA1870變體1蛋白免疫的小鼠血清中未檢測(cè)到殺菌活性(柱6，幾何平均滴度<1:10)，該結(jié)果與我們以前研究的結(jié)果(表l)一致。然而，由于菌株M6190的PorA血清亞型(P1.5,2)與RM1090疫苗菌株的同源，用任何含OMV疫苗免疫的小鼠血清有高度殺菌活性(柱2、3、4或5)。圖3A(從上往下第三和第四幅圖)分別顯示了抗菌株Z1092和NZ98/254的相應(yīng)殺菌應(yīng)答。這兩種菌株均表達(dá)對(duì)RM1090疫苗菌株的PorA分子為異源的PorA分子(表1)，用RM1090野生型或GNA1870敲除菌株制備的OMV疫苗免疫的小鼠血清不能殺傷二者(柱2和3，幾何平均滴度<1:10)。然而，用過(guò)量表達(dá)GNA1870的菌株RM1090制備的OMV疫苗免疫的小鼠(柱5)抗菌株Z1092的幾何平均血清殺菌抗體滴度明顯高于用重組GNA1870(柱6，P<0.02)或用重組GNA1870蛋白和OMV混合疫苗(柱4，P<0.04)免疫的小鼠。分別觀察到菌株NZ98/254(下圖)或?qū)闎Z198和M1390(數(shù)據(jù)未顯示)有血清殺菌應(yīng)答的類似傾向。然而，對(duì)于后三種菌株，用過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV疫苗免疫的小鼠血清殺菌應(yīng)答的強(qiáng)度低于檢測(cè)到的對(duì)菌株Z1092的應(yīng)答。與其它疫苗接種組小鼠的各幾何平均滴度相比，用過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV免疫小鼠的抗菌株NZ98/294、BZ198和M1390的幾何平均血清殺菌滴度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.10)。圖3B總結(jié)了抵御制備OMV疫苗所用的6種菌株(包括H44/76)的血清殺菌抗體應(yīng)答。6種菌株中5種的PorA血清亞型對(duì)H44/76的PorA為異源性。菌株H44/76表達(dá)的GNA1870變體1蛋白序列也與菌株MC58相同，該菌株含有用于克隆和表達(dá)重組GNA1870蛋白疫苗的基因。當(dāng)用H44/76疫苗菌株檢測(cè)時(shí)，除陰性對(duì)照鋁佐劑外，所有疫苗制品均引發(fā)高血清殺菌抗體應(yīng)答(圖3B，圖A)。相反，當(dāng)用異源菌株4243(圖B)，Z1092、NZ98/254和BZ198(圖C)或M61卯(圖D)檢測(cè)時(shí)，用rGNA1870疫苗或H44/76野生型或H4476AGNA1870菌株制備的OMV疫苗免疫的小鼠血清殺菌滴度低或檢測(cè)不到(分別見(jiàn)柱2、3和4)。用過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV疫苗免疫小鼠抗菌株4243的殺菌抗體應(yīng)答高，抗NZ98/254、BZ198和Z1092菌株的殺菌應(yīng)答低但可檢測(cè)，抗M6190的殺菌活性檢測(cè)不到(滴度<1:10)。雖然未在圖3B上顯示，但是用補(bǔ)體和分別針對(duì)PorA和/或多糖莢膜的陽(yáng)性對(duì)照抗體不難殺死所有菌株。實(shí)施例4:激活的C3b補(bǔ)體沉積在有被囊腦膜炎奈瑟球菌活細(xì)胞表面在以前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)缺乏殺菌活性的某些小鼠抗腦膜炎球菌抗體沒(méi)有殺菌活性但能賦予抵御腦膜炎球菌性菌血癥的被動(dòng)保護(hù)作用(Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15;Welsch等，2003，同上)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到這種保護(hù)作用與這些抗體激活C3補(bǔ)體組分沉積到有被囊活腦膜炎球菌表面上的能力相關(guān)。存在C3b為調(diào)理作用提供配體，該作用是沒(méi)有殺菌活性但能賦予保護(hù)作用最可能的機(jī)制。因此，研究了用不同OMV疫苗免疫的小鼠抗血清能否激活人C3b沉積(圖4)。這些實(shí)驗(yàn)利用了兩種測(cè)試的腦膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254(圖4A，行A)和M1390(圖4A，含B)，及四種測(cè)試的腦膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254、BZ198、Z1092和M6190(圖4B)。對(duì)于這些菌株，用過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV疫苗免疫的小鼠抗血清顯示殺菌滴度不高于其它疫苗菌株沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)將兩種測(cè)試菌株的細(xì)菌細(xì)胞與人源補(bǔ)體以及單用磷酸鋁免疫小鼠的陰性對(duì)照合并血清的1:40稀釋液一起培育時(shí)，未見(jiàn)補(bǔ)體沉積的證據(jù)(圖4A中的封閉區(qū)域，列1)。類似地，熱滅活補(bǔ)體加上5ng/ml抗GNA1870的小鼠單克隆抗體(JAR3)沒(méi)檢測(cè)到C3b沉積(圖4A中的封閉區(qū)，列2)。相反，用能識(shí)別C3b和iC3bi二者的抗-C3c抗體(檢測(cè))顯示強(qiáng)免疫熒光的細(xì)菌百分比增加證明，在25叫/ml陽(yáng)性對(duì)照B群?jiǎn)慰寺】骨v膜抗體中(圖4A中的開(kāi)放區(qū)，列l(wèi))，或l嗎/ml抗-GNA1870單克隆抗體中(圖4A中的開(kāi)放區(qū)，列2)加入活化補(bǔ)體引發(fā)C3b強(qiáng)烈沉積在兩種測(cè)試菌株的細(xì)菌表面。圖4A列3-6中的圖顯示了將補(bǔ)體加入用不同疫苗免疫小鼠組所獲得的合并血清稀釋液后的作用。將補(bǔ)體加入用重組GNA1870(列3)、或用RM1090野生型菌株制備的OMV(列4)或重組GNA1870與OMV(列5)化合物疫苗免疫的小鼠血清1:100稀釋液中未能激活C3b沉積在各測(cè)試菌株上。相反，用過(guò)量表達(dá)GNA1870菌株RM1090制備的OMV免疫小鼠的合并血清1:100或1:400稀釋液激發(fā)C3b強(qiáng)烈沉積在兩種測(cè)試菌株表面(列6)。如圖4B所示，陽(yáng)性對(duì)照抗莢膜mAb引發(fā)補(bǔ)體沉積在每種菌株上(列A的開(kāi)放區(qū))，而單用鋁佐劑免疫小鼠的陰性對(duì)照抗血清1:IOO稀釋液為陰性(列A的封閉區(qū))。用rGNA1870疫苗(列B中的封閉區(qū))、或用野生型菌株H44/76制備的OMV疫苗(列C中的封閉區(qū))免疫的小鼠血清1:100稀釋液也未引發(fā)補(bǔ)體明顯沉積到任何菌株上。相反，抗-rGNA1870mAb能引發(fā)補(bǔ)體沉積到菌株NZ98/254、BZ198和Z1092上，但不沉積到菌株M6190上(列B的開(kāi)放區(qū))。類似地，用含過(guò)量表達(dá)GNA1870的H44/76疫苗免疫的小鼠抗血清1:100稀釋液激活C3沉積到菌株Z1092、NZ98/254和BZ198上(列D的開(kāi)放區(qū))，但不沉積到菌株M6190上。實(shí)施例5.確定能殺菌或激活C3b沉積到異源菌株上的抗體的靶抗原利用加載了His-標(biāo)簽重組GNA1870的Ni-NTA親和柱來(lái)吸附用H44/76OMV(含過(guò)量表達(dá)的GNA1870)免疫小鼠制備的合并血清中的抗-GNA1870抗體。如表3所示，與用只含Ni-NTA基質(zhì)的陰性對(duì)照柱吸附血清中的抗體相比，ELISA(檢測(cè)到)該柱除去了98。/o的抗-GNA1870抗體。吸附到陰性對(duì)照柱上后，抗菌株4243的殺菌活性與原先未吸附的合并血清的殺菌活性相似，而抗-GNA1870抗體被吸附導(dǎo)致殺菌活性完全喪失。利用菌株Z1092、NZ98/254、BZ198和M6190分析了吸附抗-GNA1870抗體后對(duì)C3沉積的作用(表3和圖4B，行4)。如圖4B，列D所示，用H44/76OMV(含過(guò)量表達(dá)的GNA1870)免疫的小鼠血清中除去抗-GNA1870抗體后導(dǎo)致抗血清在對(duì)iC3b/c3b激活和沉積敏感的三種菌株中完全喪失激活補(bǔ)體沉積的能力(圖4B的封閉區(qū))。以上總結(jié)的這些結(jié)果以及吸附后血清的殺菌數(shù)據(jù)表明對(duì)于所含PorA蛋白對(duì)H44/76疫苗菌株是異源蛋白的菌株，用H44/76OMV(含過(guò)量表達(dá)的GNA1870)制備的抗血清激活C3沉積和殺菌活性受抗-GNA1870抗體所介導(dǎo)。表3:含過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV免疫的小鼠抗血清經(jīng)抗-GNA1870抗<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>用H44/76OMV(含過(guò)量表達(dá)的GNA1870)免疫制備的的小鼠合并血清吸附到含Ni-NTA基質(zhì)(Qiagen)的柱上，該基質(zhì)與50|ig/ml重組His-標(biāo)簽GNA1870培育過(guò)夜。收集流出液，濃縮至初始體積。對(duì)照柱含有Ni-NTA，但不含His-標(biāo)簽蛋白。實(shí)施例6.抗-GNA1870抗體的功能活性作用與用野生型疫苗RM1090菌株或RM1090AGNA1870敲除菌株制備的OMV中各蛋白質(zhì)相比(圖2A，A圖)，經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)GNA1870的RM1090腦膜炎奈瑟球菌菌株制備的OMV疫苗顯示其它幾種細(xì)胞包膜蛋白的表達(dá)降低。因此，除GNA1870以外的抗原所引發(fā)的抗體可能導(dǎo)致用過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV免疫的小鼠抗血清的功能活性較高。為研究這種可能性，利用抗-GNA1870親和柱吸附用過(guò)量表達(dá)GNA1870的RM1090OMV免疫的小鼠合并血清。ELISA(檢測(cè)至lj)除去了99。/。的抗-GNA1870抗體。得到的吸附后抗血清也喪失了激活人C3b沉積到腦膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/294上的所有能力(表4)。相反，用作為陰性對(duì)照的抗-NadA親和柱吸附合并血清對(duì)C3b沉積沒(méi)有作用(表4)。表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>a用菌株RM1090(經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)GNA1870)的OMV疫苗免疫的5只小鼠制備的合并血清?？寡褰?jīng)重組GNA1870親和柱或作為陰性對(duì)照的含重組NadA的親和柱吸附(參見(jiàn)方法)。合并流出組分，通過(guò)膜過(guò)濾濃縮至它們初始的血清體積(參見(jiàn)方法)。b與陰性對(duì)照血清相比，流式細(xì)胞術(shù)補(bǔ)體激活試驗(yàn)中能引發(fā)免疫熒光增加IO倍的血清稀釋度(參見(jiàn)圖4)。_表4也總結(jié)了用菌株Cu385和M6190檢測(cè)的經(jīng)吸附合并血清的殺菌滴度?？?GNA1870抗體吸附后完全消除了抗菌株Cu385的殺菌活性，但對(duì)菌株M6190的滴度沒(méi)有明顯作用。此后一結(jié)果估計(jì)是因?yàn)榫闙6190表達(dá)的PorA與RM1090疫苗菌株表達(dá)的PorA為同源血清亞型，故GNA1870或NadA親和柱未除去殺菌的抗-PorA抗體。實(shí)施例8.乳大鼠腦膜炎球菌菌血癥模型中的被動(dòng)保護(hù)作用用不同組小鼠的合并血清預(yù)先處理乳大鼠，2小時(shí)后用腦膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254攻擊。圖6顯示攻擊4-6小時(shí)后獲得的血液中CFU/ml的幾何平均值。單用磷酸鋁免疫的陰性對(duì)照小鼠合并血清的1:15稀釋液處理的所有10只大鼠患上菌血癥，CFU/ml的幾何平均值約為10、A圖，柱1)。相反，用10pg/大鼠的陽(yáng)性對(duì)照B群抗莢膜抗體(柱2)或抗-GNA1870單克隆抗體(柱3)預(yù)處理導(dǎo)致CFU/ml幾何平均值降低3-4-log(P<0.0001)。與用陰性對(duì)照血清處理的動(dòng)物相比，用RM1090AGNA1870敲除菌株制備的OMV疫苗(柱4)或用重組GNA1870與OMV的混合疫苗(柱5)免疫的小鼠合并血清沒(méi)有明顯的被動(dòng)保護(hù)作用。相反，用過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV疫苗(柱6)免疫的小鼠合并血清能賦予保護(hù)作用(CFU/ml幾何平均值降低4-log，P<0.0001))。單用重組GNA1870疫苗免疫的小鼠合并血清(柱7)能賦予適中的保護(hù)作用(降低約2log,P<0.0001)，但其保護(hù)活性低于用過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV免疫的小鼠合并血清(PO.OOOl，比較CFU/ml的各幾何平均值)。圖6，B圖顯示了用合并血清的l:60稀釋液預(yù)處理大鼠的相應(yīng)CFU/ml幾何平均值。在此較高稀釋度，用過(guò)量表達(dá)GNA1870的OMV疫苗免疫的小鼠合并血清(柱6)能賦予保護(hù)作用(PO.0002，與用陰性對(duì)照血清的1:15稀釋液處理大鼠的幾何平均值相比)，但用測(cè)試的其它3種疫苗組免疫的小鼠合并血清，包括重組GNA1870疫苗免疫的小鼠血清(柱7，P>O.IO)在此較高稀釋度時(shí)沒(méi)有明顯的保護(hù)活性。實(shí)施例9.用過(guò)量表達(dá)奈瑟球菌表面蛋白A(NspA)的菌株RM1090制備的囊泡疫苗免疫小鼠與血清殺菌抗體應(yīng)答提髙無(wú)關(guān)測(cè)定用經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)GNA1870的RM1090菌株制備的囊泡疫苗能誘導(dǎo)保護(hù)作用提高是GNA1870特異性的，還是用經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)另一種疫苗靶標(biāo)的菌株制備的囊泡疫苗也可能如此令人感興趣。因此，由野生型菌株的NspA基因已滅活的菌株RM1090制備微囊泡疫苗。用穿梭載體pFP12(含有菌株8047的NspA基因)轉(zhuǎn)化RM1090NspA-敲除菌株制備第二囊泡疫苗。SDSPAGE(顯示)，與RM10卯野生型菌株相比，用該穿梭載體轉(zhuǎn)化菌株得到的囊泡所含NspA蛋白的表達(dá)增加IO倍(數(shù)據(jù)未顯示)。用3次劑量的囊泡疫苗和磷酸鋁一起免疫各組小鼠，最后一次免疫3周后收集血清。ELISA檢測(cè)到過(guò)量表達(dá)NspA的疫苗能引發(fā)滴度高抗-NspA抗體(與用NspA敲除菌株制備的囊泡疫苗免疫的小鼠1:700滴度和單用磷酸鋁免疫小鼠<1:50滴度相比，滴度是1:19,000)。表5總結(jié)了用4種測(cè)試菌株BZ198、NZ98/254、Cu385和Z10卯檢測(cè)的血清殺菌抗體應(yīng)答。表5.用經(jīng)遺傳工程改造而過(guò)量表達(dá)奈瑟球菌表面蛋白A(NspA)的突變型菌株RM10卯制備的囊泡疫苗免疫小鼠<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>a如Moe等(InfectionImmunity2002，70:6021-6031)所述，用穿梭載體pFP12(含有菌株8047的NspA基因)轉(zhuǎn)化NspA-敲除菌株制備微囊泡疫苗。注射三次來(lái)免疫小鼠，最后一次注射約3周后放血。所示的滴度是各疫苗組9-10只小鼠的合并血清。ELISA檢測(cè)的各抗-NspA抗體滴度是〈l:50(磷酸鋁組)、1:700(RM1090NspA敲除菌株的囊泡)和1:19,000(過(guò)量表達(dá)NspA的RM1090菌株的囊泡)。b與人補(bǔ)體培育1小時(shí)后殺傷50%細(xì)菌的最低濃度。e與人補(bǔ)體培育1小時(shí)后殺傷50%細(xì)菌的血清最高稀釋度。d在NspA敲除背景中表達(dá)的。與疫苗菌株RM1090的PorA相比，所有4種菌株表達(dá)異源PorA。以前的數(shù)據(jù)顯示了對(duì)大腸桿菌囊泡中表達(dá)的重組NspA制備的抗-NspA抗血清殺菌活性高度敏感(Moe等，InfectionandImmunity1999，67:5664-5675)，根據(jù)該數(shù)據(jù)選擇菌株BZ198用于本實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試殺菌活性，有證據(jù)表明用源自過(guò)量表達(dá)NspA的菌株囊泡疫苗免疫的小鼠抗血清殺菌活性提高。然而，對(duì)于菌株NZ298/254，殺菌活性沒(méi)提高，對(duì)于菌株Cu385和Z1090,有證據(jù)表明用過(guò)量表達(dá)NspA的囊泡疫苗免疫誘導(dǎo)的血清殺菌抗體應(yīng)答比用相應(yīng)的NspA敲除菌株制備的對(duì)照囊泡疫苗誘導(dǎo)的低3-10倍。因此，與過(guò)量表達(dá)GNA1870的囊泡疫苗相反，過(guò)量表達(dá)NspA的囊泡疫苗未能始終如一地提高殺菌抗體應(yīng)答，而且看來(lái)抑制了對(duì)某些菌株的殺菌抗體應(yīng)答。權(quán)利要求1.一種組合物，所示組合物包含由第一種奈瑟球菌制備的分離的抗原性囊泡，其中所述奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽的水平足夠制備給予對(duì)象時(shí)引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡；和藥學(xué)上可接受的載體。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV與MV的混合物。3.如權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌是天然產(chǎn)生的。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述GNA1870多肽對(duì)所述奈瑟球菌是內(nèi)源性的。5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌就GNA1870多肽的產(chǎn)生進(jìn)行了遺傳修飾。6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而由異源啟動(dòng)子表達(dá)GNA1870多肽。7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而含有編碼外源性GNA1870多肽的核酸。8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而破壞了內(nèi)源性GNA1870多肽的產(chǎn)生。9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌缺乏莢膜多糖。10.如權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含由第二種奈瑟球菌制備的分離的抗原性囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠制備給予對(duì)象時(shí)引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌與所述第一種奈瑟球菌在遺傳學(xué)上不同。11.如權(quán)利要求IO所述的組合物，其特征在于，所述第一和第二種奈瑟球菌遺傳學(xué)上不同在于它們所屬的血清群、血清型或血清亞型中至少有一個(gè)不同。12.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述第二種奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一種奈瑟球菌的GNA1870多肽。13.如權(quán)利要求IO所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含由第三種奈瑟球菌制備的分離的抗原性囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠制備給予對(duì)象時(shí)引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第三種奈瑟球菌與所述第一種奈瑟球菌在遺傳學(xué)上不同。14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌遺傳學(xué)上不同在于它們所屬的血清群、血清型或血清亞型中至少有一個(gè)不同。15.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌的GNA1870多肽不相同。16.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述第一種奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而產(chǎn)生至少兩種不同的GNA1870多肽。17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述GNA1870多肽屬于不同的GNA1870多肽變體組，其中所述變體組是v.l、v.2和v.3。18.—種產(chǎn)生抗原性組合物的方法，所述方法包括培養(yǎng)產(chǎn)生GNA1870多肽的奈瑟球菌，其中所述GNA1870多肽產(chǎn)生的水平足夠制備給予對(duì)象時(shí)引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡；從培養(yǎng)的細(xì)菌制備囊泡；和混合所述囊泡與藥學(xué)上可接受的載體來(lái)產(chǎn)生適合給予對(duì)象的抗原性組合物。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)或微囊泡(MV)。20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是天然產(chǎn)生的。21.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述GNA1870多肽對(duì)所述奈瑟球菌是內(nèi)源性的。22.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌就GNA1870多肽的產(chǎn)生進(jìn)行了遺傳修飾。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而由異源啟動(dòng)子表達(dá)GNA1870多肽。24.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而含有編碼外源性GNA1870多肽的核酸。25.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而破壞了內(nèi)源性全長(zhǎng)GNA1870多肽的產(chǎn)生。26.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而產(chǎn)生至少兩種不同的GNA1870多肽。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述GNA1870多肽屬于不同的GNA1870多肽變體組，其中所述變體組是v.l、v.2和v.3。28.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌缺乏莢膜多糖。29.—種引發(fā)抗奈瑟球菌的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟給予哺乳動(dòng)物免疫有效量的含第一抗原性制品的組合物來(lái)引發(fā)抗GNA1870抗體，所述制品含有由第一種奈瑟球菌制備的囊泡，其中所述奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡；其中所述給予足以引發(fā)針對(duì)囊泡中存在的GNA1870多肽的免疫應(yīng)答。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV與MV的混合物。31.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是天然產(chǎn)生的或?qū)NA1870多肽的產(chǎn)生進(jìn)行了遺傳修飾。32.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述GNA1870多肽對(duì)所述奈瑟球菌是內(nèi)源性的。33.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而由異源啟動(dòng)子表達(dá)GNA1870多肽。34.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而含有編碼外源性GNA1870多肽的核酸。35.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而破壞了內(nèi)源性GNA1870多肽的產(chǎn)生。36.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含免疫有效量的第二抗原性制品，所述制品含有由第二種奈瑟球菌制備的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌與所述第一種奈瑟球菌在遺傳學(xué)上不同。37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述第二種奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一種奈瑟球菌的GNA1870多肽。38.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含由第三種奈瑟球菌制備的分離的抗原性制品，其中所述第二種奈瑟球菌產(chǎn)生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對(duì)象時(shí)引發(fā)抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第三種奈瑟球菌在遺傳學(xué)上不同于所述第一或第二種奈瑟球菌。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌的遺傳學(xué)上不同在于它們所屬的血清群、血清型或血清亞型中至少有一個(gè)不同。40.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌的GNA1870多肽不相同。41.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述第一種奈瑟球菌經(jīng)遺傳修飾而產(chǎn)生至少兩種不同的GNA1870多肽。42.如權(quán)利要求41所述的組合物，其特征在于，所述GNA1870多肽屬于不同的GNA1870多肽變體組，其中所述變體組是v.l、v.2和v.3。43.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述給予在對(duì)象中引發(fā)抗腦膜炎奈瑟球菌多種菌株的保護(hù)性免疫應(yīng)答。44.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是B群腦膜炎奈瑟球菌。45.—種引發(fā)抗奈瑟球菌免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物免疫有效量的含制品的組合物，所述制品含有由天然表達(dá)高含量GNA1870或經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)GNA1870的奈瑟球菌的菌株制備的囊泡；其中所述給予足以引發(fā)針對(duì)囊泡中存在的GNA1870多肽的免疫應(yīng)答。46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV與MV的混合物。47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌的菌株是H44/76。48.—種組合物，所述組合物包含由天然表達(dá)高含量GNA1870或經(jīng)工程改造而過(guò)量表達(dá)GNA1870的奈瑟球菌的菌株制備的抗原性囊泡;和藥學(xué)上可接受的載體。49.如權(quán)利要求48所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌的菌株是H44/76。50.—種組合物，其包含由經(jīng)遺傳修飾而過(guò)量表達(dá)GNA1870多肽的第一種腦膜炎奈瑟球菌細(xì)菌制備的第一抗原性囊泡；由經(jīng)遺傳修飾而過(guò)量表達(dá)GNA1870多肽的第二種腦膜炎奈瑟球菌細(xì)菌制備的第二抗原性囊泡；和藥學(xué)上可接受的載體；其中所述第一和第二種細(xì)菌的GNA1870多肽是不同的GNA1870變體組，所述第一和第二種細(xì)菌產(chǎn)生不同的PorA多肽。51.如權(quán)利要求50所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含由經(jīng)遺傳修飾而過(guò)量表達(dá)GNA1870多肽的第三種腦膜炎奈瑟球菌細(xì)菌制備的第三抗原性囊泡，其中所述第三種細(xì)菌的GNA1870多肽的GNA1870變體組不同于所述第一和第二種細(xì)菌的，其中所述第三種細(xì)菌產(chǎn)生的PorA多肽不同所述第一和第二種細(xì)菌的PorA多肽。52.如權(quán)利要求50所述的組合物，其特征在于，不用洗滌劑制備所述第一和第二抗原性囊泡。全文摘要本發(fā)明總體上提供在對(duì)象中引發(fā)抗奈瑟球菌屬細(xì)菌，具體地說(shuō)抗腦膜炎奈瑟球菌B血清群菌株的免疫應(yīng)答的方法和組合物。文檔編號(hào)A61K38/00GK101107007SQ200680002931公開(kāi)日2008年1月16日申請(qǐng)日期2006年1月23日優(yōu)先權(quán)日2005年1月27日發(fā)明者D·M·格拉諾夫,V·侯申請(qǐng)人:奧克蘭兒童醫(yī)院及研究中心