專利名稱：一種a、c型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種酶聯(lián)診斷試劑盒及其用途，具體說，是涉及一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟菌是一種革蘭氏陰性雙球菌，通過呼吸道傳染引起的流行性腦脊髓膜炎(簡(jiǎn)稱流腦)是一種對(duì)人類危害嚴(yán)重的傳染性疾病，此外還可引起菌血癥、肺炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、心肌炎、泌尿系統(tǒng)等多種炎癥，是一種常見和多發(fā)疾病。腦膜炎奈瑟球菌可分為A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E和W135共13個(gè)血清群，對(duì)人類致病的多屬A、B、C群，其他類群在帶菌者中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，但很少致病。我國的流腦流行菌群仍以A群為主，但近年來也發(fā)人群中的絕大多數(shù)人對(duì)腦膜炎奈瑟球菌易感，該菌可寄生于正常人的鼻咽腔內(nèi)，處于這種寄生狀態(tài)的細(xì)菌并不導(dǎo)致任何病理變化，亦不引起任何疾病癥狀；但這種帶菌狀態(tài)可以持續(xù) I周到數(shù)月之久，這種處于潛伏感染狀態(tài)的帶菌者在人群中的比例可高達(dá)50% 85%。人群中的帶菌者是造成流行性腦脊髓膜炎流行的最重要的傳染源，由于腦膜炎奈瑟菌的惟一自然宿主是人，因此，在人群較為密集的場(chǎng)所，容易造成細(xì)菌的高效率的傳播，特別是在兒童、中小學(xué)生為最易感人群，極易在短時(shí)間內(nèi)造成兒童發(fā)病流行，所以，控制人群中的帶菌者傳染源成為控制流腦流行的重要環(huán)節(jié)之一。目前國內(nèi)市場(chǎng)上腦膜炎奈瑟菌的各種免疫診斷試劑盒質(zhì)量參差不齊，既無統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，又在無序生產(chǎn)與應(yīng)用，給腦膜炎奈瑟菌的預(yù)防和診治造成嚴(yán)重障礙。目前雖有國外試劑商提供同類商品化診斷試劑盒用于檢測(cè)，但是此種試劑盒價(jià)格十分昂貴，限制了臨床的廣泛使用。

實(shí)用新型內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本實(shí)用新型的目的是提供一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述實(shí)用新型目的，本實(shí)用新型采用的技術(shù)方案如下一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)置有5個(gè)下凹瓶位，5瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶、一酶標(biāo)反應(yīng)板和封板膜構(gòu)成，所述試劑瓶?jī)?nèi)的試劑分別為標(biāo)本稀釋液、酶標(biāo)二抗、洗滌液、底物液和終止液，其中所述酶標(biāo)反應(yīng)板由A、C型腦膜炎奈瑟菌包被；所述標(biāo)本稀釋液為含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述洗滌液為含有0. 05%Tween20的磷酸鹽緩沖液；所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗； 所述底物液為TMB-H000尿素溶液；所述終止液為2mol/LH2S04溶液；[0013]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述下凹瓶位可由塑料或紙板制成。作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述酶標(biāo)反應(yīng)板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述酶標(biāo)反應(yīng)板相鄰；且所述封板膜與所述酶標(biāo)反應(yīng)板的大小一致。作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述酶標(biāo)反應(yīng)板包括支撐架，及放置在支撐架之上的數(shù)條可拆卸的微孔反應(yīng)板條，每條微孔反應(yīng)條上設(shè)有數(shù)個(gè)可拆卸的微反應(yīng)孔。作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述酶標(biāo)反應(yīng)板上共設(shè)有96個(gè)微反應(yīng)孔，且所述酶標(biāo)反應(yīng)板外設(shè)有封套。本實(shí)用新型提供的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒具有較好的特異性，檢測(cè)結(jié)果與美國R&D試劑盒腦膜炎奈瑟菌A+C型IgMELISA檢測(cè)試劑盒的一致性高，靈敏度為98%，特異度為99. 7%，因此具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

·圖I為本實(shí)用新型提供的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本實(shí)用新型提供的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒中的96孔酶標(biāo)版的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本實(shí)用新型。應(yīng)理解，下述實(shí)施例僅用于說明本實(shí)用新型而不用于限制本實(shí)用新型的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。
以下結(jié)合附圖及其實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例如圖I和圖2所示，本實(shí)用新型提供的一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，包括盒體(I)，盒體內(nèi)置有5個(gè)下凹瓶位(2 )，5瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶組(3 )、一塊酶標(biāo)反應(yīng)板(4)及一張封板膜(5)，其中所述的5個(gè)下凹瓶位內(nèi)分別相應(yīng)放置裝有樣品稀釋液
(31)、酶標(biāo)二抗(32)、濃縮洗液(33)、顯色液(34)和終止液(35)各一瓶，所述的酶標(biāo)反應(yīng)板包括數(shù)個(gè)底面封閉且頂面敞口的微反應(yīng)孔的內(nèi)壁包被有A、C型腦膜炎奈瑟菌；所述酶標(biāo)反應(yīng)板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述酶標(biāo)反應(yīng)板相鄰；且所述封板膜與所述酶標(biāo)反應(yīng)板的大小一致；所述酶標(biāo)反應(yīng)板包括支撐架(41)，及放置在支撐架之上的數(shù)條可拆卸的微孔反應(yīng)板條(42)，每條微孔反應(yīng)條上設(shè)有數(shù)個(gè)可拆卸的微反應(yīng)孔(43);所述酶標(biāo)反應(yīng)板上共設(shè)有96個(gè)微反應(yīng)孔，且所述酶標(biāo)反應(yīng)板外設(shè)有封套(6)。試劑盒的制備(I)、試劑包被液(0. 05mol/L, pH9. 6的碳酸鈉_碳酸氫鈉緩沖液)=Na2CO3 I. 5g、NaHCO3
2.9g、Na2N3 0. 2g,加雙蒸水至 1000ml,調(diào)至 pH9. 6 ；標(biāo)本稀釋液(含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7. 4)，PBS :由 NaCl 8. 0g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4. 12H20 2. 9g、KCl 0. 2g、硫柳汞 0. lg，加雙蒸水至lOOOmL，調(diào)至pH7. 4，即得；[0027]封閉液(10%小牛血清IPRS溶液)小牛血清100ml XPBS (pH7. 4) 900ml ；洗滌液(PBST,pH7. 4):由 NaCl 8. 0g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4. 12H20 2. 9g、KCl
0.2g、Tween200. 5ml、硫柳萊 0. lg、加雙蒸水至 1000ml,調(diào)至 pH7. 4 ；酶標(biāo)二抗(HRP*鼠抗人IGM單抗)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗；底物液(TMB-H202尿素溶液)①底物液A(3、3’、5、5’ -四甲基聯(lián)苯胺，TMB) :TMB200mg，無水乙醇100ml，加雙蒸水至 IOOOml ②底物液B緩沖液(0. Imol/L檸檬酸-0. 2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5. 0 5.4) Na2HP04 14. 60g，朽1檬酸9. 33g,0. 75%過氧化氫尿素6. 4ml,加雙蒸水至1000ml,調(diào)至pH5. 0-5. 5 ；⑧將底物液A和B按I : I或I : I. 5混合，即成TMB-H000尿素溶液。終止液(2mol/LH2S04溶液)雙蒸水600ml，濃硫酸IOOml (緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。(2)、主要儀器酶標(biāo)儀BI0_RADModel550；ELISA 反應(yīng)板Comning Incorporated costar 96Well EIA/RIA plate。(3)、方法酶標(biāo)二抗最適滴度的選擇取96孔酶標(biāo)板一塊，用100ng/ml人IgMlOOull孔4°C包被過夜，洗滌液洗板3次，350ul/孔，甩干；將酶標(biāo)抗人IgM單抗用稀釋液作一系列稀釋后分別加入己包被的孔中，IOOull孔，37°C孵育40min，后用洗板3次，350ul/孔，甩干；加底物顯色，每孔加入底物液IOOul，37°C或室溫避光顯色15分鐘；后加入終止液50U1終止反應(yīng)、，在酶標(biāo)儀上讀取450nm波長處吸光度，即A值，取A值在I. 0時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)二抗的最適滴度為 I 1000 1100。棋盤滴定法選擇包被抗原最適滴度取96孔酶標(biāo)板一塊；每孔加入0. lmol/L的NaHCO3稀釋的5%戊二醛200uL，37°C溫箱放置I小時(shí)；去離子水洗滌96孔酶標(biāo)板4次，甩干；將腦膜炎奈瑟菌A與C型(2X109cfu/mL)等體積混合后，用包被液將抗原作一系列稀釋后進(jìn)行包被，每孔IOOuL ;37°C溫箱過夜烘干；取過夜烘干的抗原包被板加200uLPBS稀釋的10%小牛血清37°C封閉I. 5小時(shí)，得到梯度稀釋抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板；將強(qiáng)陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用標(biāo)本稀釋液按I :100倍稀釋，加樣，保溫，洗滌。加按最適滴度稀釋的酶標(biāo)抗人IgM單抗，保溫，洗滌。加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后在酶標(biāo)儀上讀取450nm波長處吸光度，即A值；選擇強(qiáng)陽性參考血清的A值為0. 8 I. 0間、陰性參考血清的A值小于0. 2的包被抗原的稀釋度作為最適滴度，本試劑盒最適包被A、C型腦膜炎奈瑟菌的稀釋度為2X105cfu/ml, IOOul/ 孔。A、C型腦膜炎奈瑟菌包被反應(yīng)板的制備方法取96孔酶標(biāo)板一塊；每孔加入0. Imol/L的NaHCO3稀釋的5%戊二醛200ul，37°C溫箱放置I小時(shí)；去離子水洗滌96孔酶標(biāo)板4次，甩干；將腦膜炎奈瑟球菌A與C型(3X109cfu/ml)等體積混合后，用包被液I :1000 1100稀釋包板，每孔IOOuL ;37°C溫箱過夜烘干；取過夜烘干的抗原包被板加200ulPBS稀釋的10%小牛血清37°C封閉I. 5小時(shí)，得到抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板；腦膜炎奈瑟菌IgMELISA檢測(cè)試劑盒，由上述腦膜炎奈瑟球菌全菌包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)本稀釋液、洗漆液、酶標(biāo)二抗、底物液、終止液及參考血清構(gòu)成。具體分為標(biāo)本稀釋液含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 0IMpH7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)； 洗滌液含有0. 05%Tween20 的 0. 01mol/LpH7. 4 的磷酸鹽緩沖液(PBST)；酶標(biāo)二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗；底物液TMB-H000尿素溶液；終止液2mol/LH2S04溶液。利用上述試劑盒采用ELISA法檢測(cè)血清中腦膜炎奈瑟菌IgM抗體(I)待檢血清，加入用標(biāo)本稀釋液I :100稀釋的待檢血清到包被好的酶標(biāo)反虛板，IOOuL/孔，同時(shí)另設(shè)兩孔分別加入強(qiáng)陽性參考血清和陰性參考血清IOOuL/孔，37°C孵育I小時(shí)，洗滌液洗板3次，350ul/孔，甩干；(2)加酶標(biāo)物，加入HRP (辣根過氧化酶)標(biāo)記的鼠抗人IGM單抗，IOOuL/孔，37°C孵育40min，洗滌液洗板3次，350ul/孔，甩干；(3)顯色，用洗滌液洗板后每孔加入底物液lOOuL，37°C或室溫避光顯色15分鐘；(4)每孔加入終止液50UL，終止反應(yīng)；(5)結(jié)果判斷，空白孔調(diào)零，讀取450nm波長處吸光度，即0D450值，強(qiáng)陽性參考血清的A值需> 0. 9、陰性參考血清的A值需〈O. 2則證明試劑盒結(jié)果正確。(6)計(jì)算結(jié)果，將待檢標(biāo)本血清平均OD值(P)除以陰性血清平均OD值(N)，求得P/N值，P/N彡2. I為陽性，P/N<2. I為陰性。特異性實(shí)驗(yàn)以腦膜炎奈瑟菌A+C型標(biāo)準(zhǔn)IGM陽性血清、乙型腦炎病毒陽性血清、麻疹病毒IgM陽性血清、風(fēng)疹病毒IGM陽性血清、人巨細(xì)胞病毒陽性血清和腦膜炎奈瑟菌A+C型標(biāo)準(zhǔn)IgM ;陰性血清采用A、C型腦膜炎奈瑟菌抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板ELISA誡劑盒檢測(cè)，P/N值分別為
6.17、I. 13、I. 17、I. 16和I. 08，說明該試劑盒特異性良好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)隨機(jī)抽取20份腦膜炎奈瑟菌A+C型標(biāo)準(zhǔn)IgM陽性、陰性血清分別于不同的時(shí)間進(jìn)行ELISA重復(fù)檢測(cè)，同一份血清檢測(cè)結(jié)果的P/N值上下浮動(dòng)均不超過0. 05，變異系數(shù)均〈5%，證明該試劑盒具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。臨床標(biāo)本檢測(cè)采用美國R&D公司流腦A+C型IgM ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)576例正常人血清血清，其中IgM抗體陽性40例，陰性434例，采用A、C型腦膜炎奈瑟菌包被酶標(biāo)反應(yīng)板法檢測(cè)結(jié)果與R&D公司流腦A+C型IGMELISA檢測(cè)試劑盒相比靈敏度為95%，特異度為99. 5%，具體結(jié)果如表I所示。[0068]表I兩種試劑盒IgM檢測(cè)結(jié)果比較
權(quán)利要求1.一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于，包括盒體，盒體內(nèi)置有5個(gè)下凹瓶位，5瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶、一酶標(biāo)反應(yīng)板和封板膜構(gòu)成,所述試劑瓶?jī)?nèi)的試劑分別為標(biāo)本稀釋液、酶標(biāo)二抗、洗滌液、底物液和終止液，其中 所述酶標(biāo)反應(yīng)板由A、C型腦膜炎奈瑟菌包被； 所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗； 所述終止液為2mol/LH2S04溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于所述下凹瓶位可由塑料或紙板制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)反應(yīng)板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述酶標(biāo)反應(yīng)板相鄰；且所述封板膜與所述酶標(biāo)反應(yīng)板的大小一致。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)反應(yīng)板包括支撐架，及放置在支撐架之上的數(shù)條可拆卸的微孔反應(yīng)板條，每條微孔反應(yīng)板條上設(shè)有數(shù)個(gè)可拆卸的微反應(yīng)孔。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)反應(yīng)板上共設(shè)有96個(gè)微反應(yīng)孔，且所述酶標(biāo)反應(yīng)板外設(shè)有封套。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)置有5個(gè)下凹瓶位，5瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶、一塊A、C型腦膜炎奈瑟菌包被酶標(biāo)反應(yīng)板及一張封板膜，其中所述的5個(gè)下凹瓶位內(nèi)分別相應(yīng)放置裝有樣品稀釋液、酶標(biāo)二抗、濃縮洗液、顯色液和終止液各一瓶。本實(shí)用新型提供的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與美國R&D試劑盒腦膜炎奈瑟菌A+C型IgMELISA檢測(cè)試劑盒的一致性高，靈敏度為98%，特異度為99.7%，因此具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/569GK202794183SQ201220376670
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者劉昊智, 吳克, 史晉, 鮑路偉, 王文灝, 程超, 張愛暉 申請(qǐng)人:上海博沃生物科技有限公司