專利名稱：利用siv-pedf載體治療伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及一種使用攜帶有神經(jīng)營養(yǎng)因子的慢病毒載體治療青光眼 的方法。
背景技術(shù)：
青光眼是指視神經(jīng)乳頭以及視野的特征性變化至少出現(xiàn)了 一項(xiàng)，通常 情況下，通過充分降低眼內(nèi)壓可以改善視神經(jīng)損害或者阻止進(jìn)一步惡化的 眼部功能性結(jié)構(gòu)異常為特征的疾患。關(guān)于青光眼，如果不能夠得到適當(dāng)?shù)?治療，常常會(huì)導(dǎo)致失明，青光眼引起的失明占我國后天失明原因的第二位。
青光眼可以分為原發(fā)性青光眼(primary glaucoma)、續(xù)發(fā)性青光眼、 先天性青光眼三種，原發(fā)性青光眼又分為原發(fā)性開角型青光眼(廣義)、 原發(fā)性閉角型青光眼、原發(fā)性混合型青光眼。廣義上的原發(fā)性開角型青光 眼包括原發(fā)性開角型青光眼(狹義)及正常眼壓性青光眼，正常眼壓性青 光眼不論眼內(nèi)壓在正常范圍內(nèi)(21mmHg以下、平均15.5mmHg )與否，是 視神經(jīng)受到傷害的一種疾患。據(jù)報(bào)道40歲以上的人群中大約5.8。/。患有青光 眼，依據(jù)2000年的統(tǒng)計(jì)，我國的40歲以上的人口大約有6,500萬人來推算， 40歲以上的青光眼患者超過370萬人。
青光眼的視神經(jīng)損害的發(fā)生及惡化過程中，"目艮內(nèi)壓"為重要的風(fēng)險(xiǎn) 因素(Risk Factor),在以前認(rèn)為降低眼內(nèi)壓是唯一確實(shí)可行的治療方法。 作為降低眼內(nèi)壓的治療方法，眼藥水(卩受體阻滯劑、前列腺素類藥品、碳 酸脫水酶抑制劑藥品等)、內(nèi)服或注射藥品(碳酸脫水酶抑制劑藥品、高 滲透壓藥品)、手術(shù)(激光手術(shù)、外科手術(shù))等方法都很常見。
但是另一方面，表明青光眼也有所謂視神經(jīng)的微循環(huán)損害及脆弱等的 "眼內(nèi)壓"以外的因子參與，指出了眼內(nèi)壓降低療法的局限性。因此需要 開發(fā)與眼內(nèi)壓降低療法不同的青光眼治療方法。其中最受人們關(guān)注的一種 就是抑制青光眼最終病態(tài)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡(凋亡)的方法，即視 網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)療法。
一方面，神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類促進(jìn)未分化的成神經(jīng)細(xì)胞的增殖以及分 化，或者成熟的神經(jīng)細(xì)胞的生存以及功能維持的因子。色素上皮衍生因子 (Pigment epithelium derived factor: PEDF )是神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種。作為 PEDF的生物活性，目前為止，報(bào)道告有神經(jīng)分化保護(hù)和血管新生抑制兩種 作用。PEDF在最開始，1989年時(shí)作為促進(jìn)人視網(wǎng)膜神經(jīng)母細(xì)胞瘤Y-79細(xì) 胞株的神經(jīng)分化因子，從人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清中精制 而來(非專利文獻(xiàn)1 )。目前有報(bào)道在體外、體內(nèi)試驗(yàn)中對各種神經(jīng)細(xì)胞具 有抑制其分化誘導(dǎo)以及傷害導(dǎo)致的神經(jīng)凋亡性死亡的作用。關(guān)于其機(jī)理， 利用培養(yǎng)未成熟小腦顆粒細(xì)胞進(jìn)行了研究，報(bào)道指出與轉(zhuǎn)錄因子NFkB的活 性相關(guān)，而且誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-2、 Bcl-x、以及神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、 BDNF 的表達(dá)(非專利文獻(xiàn)2)。另一方面，同樣是以培養(yǎng)未成熟小腦顆粒細(xì)胞為 對象的點(diǎn)陣芯片研究中，雖然PEDF的添加誘導(dǎo)了各種神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF, Neurotrophin-3, GDNF )的表達(dá)，但是在利用中和抗體的分析報(bào)道中，被誘 導(dǎo)的神經(jīng)營養(yǎng)因子對PEDF的神經(jīng)保護(hù)效果沒有影響(非專利文獻(xiàn)3),表 明保護(hù)效果是PEDF直接作用的結(jié)果。另外在1999年，報(bào)道PEDF在體外 試驗(yàn)中，對FGF-2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移(migration)抑制是濃度依 賴性的，其效果比血管生成抑制素及內(nèi)皮抑素要高，另外在體內(nèi)試驗(yàn)中對 FGF-2誘導(dǎo)的角膜血管新生抑制具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(非專利文獻(xiàn)4)。之后， 關(guān)于抑制各種血管新生模型、腫瘤血管新生現(xiàn)象的報(bào)告也很多。其詳細(xì)的 機(jī)理雖然尚不清楚，但是可以認(rèn)為(1)PEDF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中FasL的表 達(dá)，而且在血管新生過程中的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Fas有高表達(dá)，也許是Fas/FasL 介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可以抑制血管新生(非專利文獻(xiàn)5) 、 (2)可能有細(xì)胞外 的磷酸化參與(非專利文獻(xiàn)6)、以及(3)可能涉及與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合。
通過上述的凋亡抑制作用研究了神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)方 法。目前為止，已知有二例利用視網(wǎng)膜缺血再灌注模型進(jìn)行的PEDF基因治 療的研究例子。在這些研究例中，與青光眼一樣，使用神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受到傷 害產(chǎn)生凋亡性死亡現(xiàn)象的"視網(wǎng)膜缺血再灌注模型"大鼠，來研究PEDF 對細(xì)胞損害的抑制效果。上述研究例中， 一個(gè)是PEDF蛋白(非專利文獻(xiàn)7 )、 一個(gè)是攜帶有PEDF的腺病毒載體(非專利文獻(xiàn)8 )對動(dòng)物的玻璃體內(nèi)進(jìn)行 給藥，在組織學(xué)上抑制了缺血再灌注引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞傷害。
然而，神經(jīng)營養(yǎng)因子的分子量很大。持續(xù)地使大分子量的蛋白質(zhì)到達(dá) 視網(wǎng)膜，用目前的藥物傳輸系統(tǒng)(drug delivery system )是很困難的。另夕卜， 腺病毒載體作為轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在細(xì)胞核內(nèi)作為游離體存在，不能被整合到染
色體DNA中，隨著細(xì)胞的增殖，作為不具自我復(fù)制功能的轉(zhuǎn)導(dǎo)基因被稀釋， 轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)只是暫時(shí)性的。考慮到青光眼為一種進(jìn)行性疾患，只期待 用暫時(shí)性效果的給藥方法作為青光眼的治療方法是不合適的。另一方面， 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一般通過穩(wěn)定地整合到分裂細(xì)胞的染色體中，可以長期進(jìn)
行基因表達(dá)，目前為止，尚無利用插入有PEDF的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行青光 眼治療的研究例。
專利文獻(xiàn)1 :國際申請序號PCT/JP2002/005225 國際公開序號 WO2002/101057
專利文獻(xiàn)2 :國際申請序號PCT/JP00/03955 國際公開序號 WO00/078987
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為鑒于上述狀況的發(fā)明，本發(fā)明要解決的問題是通過有效傳輸 PEDF,構(gòu)建用于治療青光眼等的伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的藥物。
本發(fā)明解決的是發(fā)現(xiàn)一種新的治療伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的 方法。
為解決上述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了銳意研究，著眼于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 ——來自猴子的慢病毒，特別是猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus: SIV)的載體，利用該載體作為PEDF給藥的方式。本發(fā)明人通過所 謂的猴免疫缺陷病毒(SIV)載體的視網(wǎng)膜下給藥的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)法，使治療基 因在視網(wǎng)膜內(nèi)長期穩(wěn)定地表達(dá)成為可能，還可以超越目前的藥物傳輸系統(tǒng) 的限制。也就是說，通過SIV載體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可以期待以下幾點(diǎn)(i)不 受血腦屏障(BRB)的影響，(ii)可以維持治療有效濃度，減輕副作用， (iii)可以降低治療制劑的多次給藥所產(chǎn)生的成本。另外，本發(fā)明人將加入 有PEDF的SIV載體給藥到視網(wǎng)膜色素變性模型動(dòng)物，并且驗(yàn)證了對視細(xì) 胞死亡(凋亡)具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的抑制効果(非專利文獻(xiàn)9) 綜上 所述，攜帶有神經(jīng)營養(yǎng)因子的SIV載體給藥可以成為有效的青光眼視網(wǎng)膜
神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡的神經(jīng)保護(hù)療法。
本發(fā)明人在研究應(yīng)用加入有PEDF的SIV載體(以下記述為"SIV-PEDF 載體")對青光眼進(jìn)行治療之際，使用了改造型的SIV載體。改造型的SIV 載體是對以前的SIV載體的安全性以及性能提高進(jìn)行改造的載體。改造點(diǎn) 有第一、在用于SIV載體制造的基因轉(zhuǎn)染換載體中轉(zhuǎn)導(dǎo)cPPT (central polypurine tract )序歹'J以及WPRE( woodchuck hepatitis vims posttranscriptional regulatory element)序列，以提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及表達(dá)效率。第二 、從包 裝載體除去輔助基因(vif， vpr, tat),然后通過將rev序列轉(zhuǎn)移到其它載體 以提高安全性。
本發(fā)明人，利用缺血再灌注模型動(dòng)物以及NMDA-誘導(dǎo)模型動(dòng)物，對上 述的改造型SIV-PEDF載體對青光眼的應(yīng)用進(jìn)行了研究。嚴(yán)格意義上來講， 對小動(dòng)物進(jìn)行青光眼造模是一件很困難的事情，通常來說，將由于青光眼 而受傷害的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行人為傷害的上述模型被用于對青光眼的研究。 缺血再灌注模型是通過提高眼內(nèi)壓造成缺血狀態(tài)后再灌注，使神經(jīng)節(jié)受到 急劇傷害的模型。NMDA -誘導(dǎo)模型是一種通過NMDA給藥，只對神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞選擇性地傷害的模型。研究如下進(jìn)行。將SIV-PEDF載體給藥到動(dòng)物(大 鼠)的視網(wǎng)膜下以后，通過缺血再灌注或者NMDA對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行傷害。 在這之后，將DAPI ( 4',6-diamidino-2-phenylindole， 4',6-二脒基-2-苯基吲哚) 注入到兩眼視上丘，對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，計(jì)數(shù)標(biāo)記神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量， 不論哪種才莫型式，在SIV-PEDF載體給藥組中，都可以觀察到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù) 量的減少受到了顯著的抑制。通過這些結(jié)果，首次證明SIV-PEDF載體可以 有效地保護(hù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，是一種有效的青光眼治療藥品。進(jìn)而，本發(fā)明的 SIV-PEDF對伴隨凋亡變性的其它眼科疾患與青光眼一樣有效。也就是說， 本發(fā)明涉及SIV-PEDF載體對伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的治療，更具 體的發(fā)明i兌明如下。用于治療伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的藥物，該藥物包含帶有 色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )基因的重組 猴免疫缺陷病毒載體、以及藥學(xué)可使用的介質(zhì)。項(xiàng)[1 ]中記述的藥物，其中所述的猴免疫缺陷病毒載體包括cPPT序列 和/或WPRE序列。項(xiàng)[1]或者[2]中記述的藥物，其中所述猴免疫缺陷病毒載體已用 VSV-G假型化。項(xiàng)[1]到[3]任意一項(xiàng)記述的藥物，其中所述猴免疫缺陷疫病毒載體來 自agm抹。項(xiàng)[1]到[4]中任意一項(xiàng)記述的藥物，其中所述伴隨著眼組織細(xì)胞凋亡 變性的疾患為青光眼、視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜缺血性疾患 中的任意一項(xiàng)。治療伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的方法，其包括用帶有PEDF 基因的重組猴免疫缺陷疫病毒載體進(jìn)行給藥。項(xiàng)[6]中記述的方法，包括用帶有PEDF基因的重組猴免疫缺陷病毒 載體進(jìn)行視網(wǎng)膜下給藥，玻璃體內(nèi)給藥，或者前房內(nèi)給藥的步驟。項(xiàng)[1]到項(xiàng)[5]任意一項(xiàng)中記述的藥物的制造方法，該方法使用基因轉(zhuǎn) 移載體，該載體包含在序列號1中記述的堿基序列中插入PEDF基因的堿 基序列。項(xiàng)[8]中記述的藥物的制造方法，該方法利用包含序列號2中記述 的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體。項(xiàng)[8]或者項(xiàng)[9]中記述的藥物的制造方法，包含向包裝細(xì)胞中導(dǎo)入所 述基因轉(zhuǎn)移載體的步驟，所述包裝細(xì)胞為已經(jīng)向其中導(dǎo)入了包含序列號3 的堿基序列的包裝載體的包裝細(xì)胞。編碼猴免疫缺陷病毒基因組RNA的載體，包含序列號1中記述 的堿基序列或者在該序列中插入了外源基因的序列。項(xiàng)[11]中記述的載體，其中所述外源基因是PEDF。猴免疫缺陷病毒，包含從項(xiàng)[11]或者[12]中記述的載體所轉(zhuǎn)錄的基因 組RNA。項(xiàng)[13]中記述的猴免疫缺陷病毒，其已用VSV-G假型化。


圖1:表示改造型基因轉(zhuǎn)移載體、改造型包裝載體、rev表達(dá)載體、VSV-G 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2A:說明從原始型基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建改造型基因轉(zhuǎn)移載體工藝的示 意圖。(a)為圖2B工藝的延續(xù)。
圖2B:為圖2A延續(xù)的示意圖。(a)表示圖2A工藝的延續(xù)。
圖3:說明從原始型包裝載體構(gòu)建改造型包裝載體工藝的示意圖。 圖4A:說明rev表達(dá)載體的構(gòu)建工藝的示意圖。((3)表示圖4B工藝
的延續(xù)。
圖4B:圖4A延續(xù)的示意圖。(卩)表示圖4A工藝的延續(xù)。
圖5: (a)說明單獨(dú)攜帶cPPT、單獨(dú)攜帶WPRE、同時(shí)攜帶cPPT以 及WPRE的原始型基因轉(zhuǎn)移載體的結(jié)構(gòu)示意圖。(b)利用單獨(dú)攜帶cPPT、 單獨(dú)攜帶WPRE、同時(shí)攜帶cPPT以及WPRE的各基因轉(zhuǎn)移載體，以MOI為 15感染細(xì)胞時(shí)，觀察到的SIV載體的產(chǎn)量的照片。左上原始型的無cPPT 和WPRE的載體(對照)(-cPPT， -WPRE )、右上單獨(dú)攜帶cPPT的載 體(+cPPT, -WPRE)、左下單獨(dú)攜帶WPRE的載體(-cPPT， +WPRE )、 右下同時(shí)攜帶cPPT以及WPRE的載體(+cPPT, +WPRE )。
圖6:利用單獨(dú)攜帶cPPT、單獨(dú)攜帶WPRE、同時(shí)攜帶cPPT以及WPRE 的各基因轉(zhuǎn)移載體時(shí)的SIV載體的產(chǎn)量對外源基因(EGFP)陽性細(xì)胞數(shù)量 之比的研究結(jié)果。(a)表中的MOI表示每1個(gè)細(xì)胞中感染的載體粒子數(shù)量， 0.3, 1.5,7.5, 15表示的是實(shí)際進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的MOI(載體粒子數(shù)/細(xì)胞數(shù))的 數(shù)值。在cPPT或者WPRE后面記述的(+ )表示載體中含有cPPT或者WPRE ， (陽)表示的是載體中不含cPPT或者WPRE。表中數(shù)字為EGFP陽性細(xì)胞的 比例(百分率％) 。 (b)圖為是(a)表數(shù)值的圖形化表示。圖的縱坐標(biāo)表 示的是EGFP陽性細(xì)胞的比例(百分率％ )。
圖7:表示的是利用單獨(dú)攜帶cPPT、單獨(dú)攜帶WPRE、同時(shí)攜帶cPPT 以及WPRE的各基因轉(zhuǎn)移載體，以MOI為15感染細(xì)胞時(shí)，相對細(xì)胞數(shù)量 的蛋白表達(dá)量的比較結(jié)果。數(shù)值表示的是熒光強(qiáng)度的相對值(為蛋白表達(dá) 量的比較尺度)。
圖8:是對缺血再灌注模型給予SIV-PEDF載體時(shí)所觀察到的標(biāo)記的神 經(jīng)節(jié)細(xì)胞的結(jié)果照片。無載體給藥/非缺血再灌注損害組(未進(jìn)行缺血再灌 注損害處理也未進(jìn)行載體給藥的大鼠)、無載體給藥/缺血再灌注損害組(未 進(jìn)行載體給藥的缺血再灌注損害大鼠)、SIV-空載體給藥組(載體對照組、 對缺血再灌注損害模型給予空載體的大鼠)、SIV-hPEDF給藥組(治療組、 對缺血再灌注損害模型給予SIV-hPEDF載體的大鼠)。
圖9:是對缺血再灌注模型給予SIV-PEDF載體時(shí)的標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 數(shù)量的示意圖。無載體給藥/缺血再灌注損害組(未接受載體給藥的缺血再 灌注損害大鼠)、SI.V -空載體給藥組(載體對照組、對缺血再灌注損害模
型給予空載體的大鼠)、SIV-hPEDF給藥組(治療組、對缺血再灌注損害 模型給予SIV-hPEDF載體的大鼠)。
圖10:對NMDA-誘導(dǎo)模型給予SIV-PEDF載體時(shí)，觀察標(biāo)記的神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞的結(jié)果照片。(a)為SIV-空載體視網(wǎng)膜下給藥組、(b)為SIV-hPEDF載
體視網(wǎng)膜下給藥組。
圖11:對NMDA-誘導(dǎo)模型給予SIV-PEDF載體時(shí)的標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 數(shù)量示意圖。無載體給藥/非NMDA-誘導(dǎo)組(未進(jìn)行NMDA處理也未進(jìn)行 載體給藥的大鼠)、無載體給藥/NMDA-誘導(dǎo)組(未進(jìn)行載體給藥的NMDA -誘導(dǎo)的大鼠)、SIV -空載體給藥組(載體對照組、NMDA -誘導(dǎo)模型給予 空載體的大鼠)、SIV-hPEDF給藥組(治療組、NMDA -誘導(dǎo)模型給予 SIV-hPEDF載體的大鼠)。
本發(fā)明涉及治療伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的藥品，特征在于包 含帶有色素上反衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )基因 的重組猴免疫缺陷病毒載體、以及藥學(xué)可使用介質(zhì)用醫(yī)。
病毒的生命周期大致可以分為感染和增殖兩個(gè)階段。特征在于， 一般 來講病毒載體利用病毒的感染系統(tǒng)，將基因有效地導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)。為了 確保安全性，去掉了多數(shù)病毒載體的增殖系統(tǒng)，使其缺乏自我復(fù)制能力， 防止在導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)增殖。
簡要地說明一下載體粒子的構(gòu)造，載體粒子中有被叫做衣殼的蛋白質(zhì) 外殼。衣殼是由gag基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成的。其衣殼的外側(cè)有被叫做 被膜的膜結(jié)構(gòu)。被膜具有決定所感染細(xì)胞種類的功能。在衣殼中，存在2 份載體基因組RNA拷貝和pol基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄酶。病毒載體一旦感染宿 主細(xì)胞、載體基因組RNA會(huì)通過自己的上述逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，之后整 合進(jìn)宿主染色體中，成為前病毒DNA，而具有感染能力。
一般來說病毒載體可以通過包裝載體和基因轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行制備。包裝 載體攜帶有除去了包裝信號的病毒DNA。病毒DNA中含有病毒蛋白質(zhì)序 列。將包裝載體導(dǎo)入宿主后，在宿主細(xì)胞(包裝細(xì)胞)中，由于沒有包裝 信號，所以形成空的病毒顆粒。另一方面，基因轉(zhuǎn)移載體攜帶有整合進(jìn)宿 主染色體DNA所必要的來源于病毒的基因序列及要轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源基因。將這 個(gè)基因轉(zhuǎn)移載體導(dǎo)入到包裝細(xì)胞中后，由基因轉(zhuǎn)移載體提供的載體基因組 DNA被整合進(jìn)宿主染色體，通過轉(zhuǎn)錄形成載體基因組RNA。該載體基因組
RNA被包埋進(jìn)包裝細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒中，生成具有導(dǎo)入核酸分子進(jìn)入宿
主內(nèi)部能力的病毒顆粒。
在本發(fā)明中的"病毒載體"是指缺乏自我復(fù)制能力，具有導(dǎo)入核酸分 子進(jìn)入宿主內(nèi)部能力的病毒顆粒。"重組"病毒載體是指通過基因重組技
術(shù)構(gòu)建的病毒載體而言的。利用編碼病毒基因組的DNA和包裝細(xì)胞構(gòu)建的 病毒載體包含在重組病毒載體中。
本發(fā)明中的"猴免疫缺陷病毒(SIV)載體"是指在病毒顆粒中的核酸 分子內(nèi)，作為病毒載體功能所必需的序列為SIV基因組由來序列的載體。 本發(fā)明中的"作為病毒載體功能所必需的序列"是指從5，端開始順次為 5，LTR的R區(qū)域、U5區(qū)域、包裝信號(cp) 、 RRE、 3'LTR的啟動(dòng)子區(qū)域 以外的U3區(qū)域、R區(qū)域的序列。從5，LTR區(qū)域開始到包裝信號的堿基序列 表示為序列號4、 RRE序列表示為序列號5、缺失3'LTR的啟動(dòng)子區(qū)域 的U3區(qū)域到R區(qū)域的石成基序列表示為序列號6。本發(fā)明中的SIV載體只 要與上述定義相符也可加以改造，例如，"作為病毒載體功能所必需的序 列"只要來自SIV,其他來自SIV的序列或者來自SIV以外的序列也可以 包含在內(nèi)。作為可包含的最適序列來講，例如可以列舉后面記述的cPPT、 內(nèi)部啟動(dòng)子(CMV) 、 WPRE。
在本發(fā)明中，猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus; SIV )包 括有SIV的所有;^朱系以及其亞型。作為SIV單離4朱來T^兌，可以例舉出 SIVagm、 SIVcpz、 SIVmac、 SIVmnd、 SIVsm、 SIVsnm、 SIVsyk等，但并 不僅限于這些病毒林。
浙吳免疫在夾陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)是作為浙吳子的 HIV樣病毒被發(fā)現(xiàn)的，與HIV —起構(gòu)成靈長類慢病毒(Primates Lentivims ) 群(井戶榮治，速水正憲，廿/k免疫不全々<^久0遺伝子七感染 病原性. 蛋白質(zhì)核酸酵素Vol.,39,No.8. 1994)。進(jìn)而這個(gè)群又大致分類為四個(gè)群 1)包含成為人類獲4尋性免疫在夾陷綜合癥(acquired immune deficiency syndrome, AIDS )病原的HIV-1和從黑猩猩分離的SIVcpz的HIV-1群、2)從 白頂白眉劣吳(Cercocebus atys )分離的SIVsmm和/人獼賓吳(Macaca mulatta)分 離的SIVmac、以及對人類感染頻率較低的，具有病原性的HIV-2 (Jaffar,S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retroviral" 16(5), 327-32, 1997 )構(gòu) 成的HIV-2群、3)由非洲綠猴(Cercopithecus aethiops)中分離出來的SIVagm 為代表的SIVagm群、4)由山魈(Papio sphinx)分離出來的SIVmnd為代表的 SIVmnd群組成。
其中，SIVagm以及SIVmnd沒有自然宿主的病原性報(bào)道(Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115-22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol., 18(3-4), 255-9, 1989;速水正憲，日本臨床，47， 1, 1989 )、特別是在本實(shí)施例 中使用的SIVagm中的一種TYO-l抹，據(jù)報(bào)道即使是在自然宿主中，對食 蟹猴(Macaca facicularis )、獼猴(Macaca mulatta)的感染實(shí)驗(yàn)中也未表現(xiàn) 出病原性(Ali， M. et al, Gene Therapy, 1(6)， 367-84， 1994; Honjo， S. et al., J. Med, Primatol., 19(1), 9-20, 1990 )。由于沒有關(guān)于SIVagm對人類感染、致 病的報(bào)道，對人類的病原性不得而知， 一般來說，靈長類的慢病毒的種特 異性很高，從自然宿主致使其他種類感染、致病的病例很少，并且具有其 致病頻率低或者進(jìn)程緩慢的傾向。(Novembre, F. J. et al., J. Virol., 71(5), 4086-91,1997 )。因此，以SIVagm、特別是SIVagm TYO-l抹為基礎(chǔ)制備 的病毒載體同以HIV-1以及其他慢病毒為基礎(chǔ)制備的載體相比，安全性更 高，最適合在本發(fā)明中使用。SIVagmTYO-1抹的基因組堿基序列用序列號 7來表示。
本發(fā)明的猴免疫缺陷病毒載體可以擁有其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組RNA 序列的 一部分。例如，具有將人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus; HIV)、貓免疫缺陷病毒(Feline Immunodeficiency Virus: FIV ) (Poeschla, E. M. et al" Nature Medicine, 4(3), 354-7, 1998 )、山羊關(guān)節(jié)炎腦 炎病毒(Caprine Arthritis Encephalitis Virus: CAEV ) ( Mselli-Lakhal, L. et al" Arch. Virol.， 143(4), 681-95, 1998 )等其他慢病毒的基因組序列的一部分與猴 免疫缺陷病毒基因組一部分相置換而成的嵌合序列的載體也包含在本發(fā)明 的猴免疫缺陷病毒載體中。
帶有本發(fā)明的色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )基因的重組猴免疫缺陷病毒載體(SIV-PEDF載體)是指攜帶PEDF 基因的重組SIV載體。將人類PEDF ( hPEDF )的cDNA序列用序列號8 表示。本發(fā)明的SIV-PEDF載體只要符合上述定義，是與種類以及結(jié)構(gòu)無關(guān) 的，最優(yōu)選的例子為利用含有在序列號1中記述的堿基序列中插入PEDF 基因的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體來制備的SIV載體，更優(yōu)選的例子是利用 含有序列號2中記述的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備的SIV載體。
本發(fā)明的SIV-PEDF載體可以進(jìn)行VSV-G假型化。VSV-G假型化是指， 寸吏載體的凈皮月莫包含水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis vims; VSV )的表面 糖蛋白質(zhì)VSV-G蛋白而言的。VSV-G蛋白可以是來源于任意VSV株的蛋 白質(zhì)。例如，可以使用來自Indiana血清型毒抹(J. Virology 39: 519-528 (1981))的VSV-G蛋白，但不僅限于此。另外，VSV-G蛋白可以是天然蛋 白質(zhì)的衍生物，通過一個(gè)或者多個(gè)氨基酸置換，缺失，和/或增加得到的 修飾蛋白質(zhì)。VSV-G假型化載體可以在病毒產(chǎn)生時(shí)通過與VSV-G蛋白共存 來制備。例如，通過VSV-G表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染、來自整合入宿主染色體DNA 的VSV-G基因的表達(dá)誘導(dǎo)、或者通過使VSV-G在包裝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)， 經(jīng)由這個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆?？梢员籚SV-G假型化。由于VSV-G蛋白是 一種糖蛋白會(huì)形成穩(wěn)定的3聚體，存在于細(xì)胞膜上，因此純化過程中不會(huì) 引起載體粒子的破壞，可以用離心進(jìn)行高濃度的濃縮(Yang, Y. et al., Hum Gene Then Sep, 6(9), 1203-13. 1995 )。
本發(fā)明的SIV-PEDF載體可以進(jìn)一步含有來自其它病毒的被膜蛋白質(zhì)。 例如，作為這種蛋白質(zhì)，最好的是來自感染人類細(xì)胞的病毒被膜蛋白質(zhì)。 對這種蛋白質(zhì)沒有特別的限定，可例舉出逆轉(zhuǎn)錄病毒兼嗜性病毒被膜蛋白 等。作為這種逆轉(zhuǎn)錄病毒的兼嗜性病毒被膜蛋白，例如可以使用來自小鼠 白血病病毒(MuLV)4070A抹的被膜蛋白。另外，也可以使用來自MuMLV 10A1的被膜蛋白(例如pCL-10Al(Imgenex)(Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996))。另外，作為皰滲病毒科的蛋白，可以舉出，例如單純性 皰滲病毒的gB、 gD、 gH、 gp85蛋白、EB病毒的gp350，gp220蛋白等。作 為嗜肝病毒科的蛋白,可以例舉出B型肝炎病毒的S蛋白等。
對于本發(fā)明的重組猴免疫缺陷病毒載體來說，可以對LTR( long terminal repeat)進(jìn)行改造。LTR為逆轉(zhuǎn)錄病毒特征性序列，位于病毒基因組的兩端。 5'LTR作為啟動(dòng)子發(fā)揮作用，促進(jìn)來自前病毒的mRNA的轉(zhuǎn)錄。因此，如 果將包裝在病毒顆粒內(nèi)的具有編碼病毒RNA基因組的基因轉(zhuǎn)移載體的5' LTR的啟動(dòng)子活性的部分置換為其它的強(qiáng)有力的啟動(dòng)子的話，可増加基因 轉(zhuǎn)移載體的mRNA轉(zhuǎn)錄量，提高包裝效率，使載體滴度提高。進(jìn)而，例如 慢病毒的情況下，已知5'LTR的轉(zhuǎn)錄活性被病毒蛋白質(zhì)tat促進(jìn)，將5'LTR 置換成不依賴tat蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子時(shí)，可以從包裝載體中刪除tat。另外，感 染細(xì)胞并侵入細(xì)胞內(nèi)的病毒RNA發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄之后，形成使兩端的LTR結(jié)合
在一起的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合部位與病毒的整合酶偶聯(lián)，而被整合進(jìn)細(xì)胞的染
色體中。由前病毒轉(zhuǎn)錄的mRNA是從5' LTR內(nèi)的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開始至下游3' LTRpolyA的序列，5'LTR的啟動(dòng)子部分未被包裝在病毒內(nèi)。因此，即使置 換啟動(dòng)子，插入靶細(xì)胞的染色體的部分也不發(fā)生變化。綜上所述，5' LTR 的啟動(dòng)子的置換實(shí)現(xiàn)了更高的滴度與更高安全性的載體制備。因此，可以 進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移載體的5'端啟動(dòng)子的置換以及提高被包裝載體的滴度。
另外，刪除部分3' LTR的序列，通過制備防止從靶細(xì)胞載體全長mRNA 轉(zhuǎn)錄的自我失活型載體(Self Inactivating Vector: SIN載體)，可以提高其 安全性。侵染到靶細(xì)胞染色體的慢病毒的前病毒，形成3' LTR的U3部分 與5'端結(jié)合的形式。因此，基因轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在逆轉(zhuǎn)錄后，處于整 合進(jìn)靶細(xì)胞染色體的狀態(tài)，U3定位于5'端，在此與來自基因轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物具有同樣結(jié)構(gòu)的RNA可以被轉(zhuǎn)錄。假設(shè)在靶細(xì)胞內(nèi)有慢病毒或者其 類似蛋白質(zhì)存在的情況下，轉(zhuǎn)錄的RNA被再次包裝，有可能對其它細(xì)胞進(jìn) 行再次感染。另外通過3'LTR的啟動(dòng)子，位于病毒基因組的3'端的來自宿 主的基因有可能:f皮表達(dá)(Rosenberg, N.， Jolicoeur, P., Retoroviral Pathogenesis-Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997 )。這種現(xiàn)象 在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中已經(jīng)被視為一種問題，作為回避方法，開發(fā)了 SIN載 體(Yu, S. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A， 83(10), 3194-8, 1986)。通過使 基因轉(zhuǎn)移載體上的3'LTR的U3部分缺失，令靶細(xì)胞內(nèi)沒有5'LTR及3'LTR 的啟動(dòng)子，就不會(huì)發(fā)生全長RNA及宿主基因的轉(zhuǎn)錄。然后，只有來自內(nèi)部 啟動(dòng)子的目的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，以實(shí)現(xiàn)安全性提高，以及載體表達(dá)提高。這 樣的載體最適用于本發(fā)明。SIN載體的構(gòu)建可以按照常規(guī)方法或者本發(fā)明人 的專利申請國際公開號WO2002/101057 (專利文獻(xiàn)1 )的實(shí)施例1-4中記 述的方法等進(jìn)行。
使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等在其基因組中包含LTR序列的病毒載體進(jìn)行基 因治療的問題之一是導(dǎo)入的基因表達(dá)逐漸下降。原因之一是這些載體一旦 被整合進(jìn)宿主基因組中，由于宿主的作用機(jī)理造成其LTR被曱基化，導(dǎo)入 基因的表達(dá)受到抑制。(Challita, P. M. and Kohn, D. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2567, 1994)。自我失活(SIN)型載體一旦被整合進(jìn)宿主基因組就 會(huì)丟失大部分LTR序列，優(yōu)點(diǎn)是不受LTR的曱基化引起的基因表達(dá)鈍化的 影響。本發(fā)明人通過將基因轉(zhuǎn)移載體的3'LTR的U3區(qū)域置換為其它啟動(dòng)子
序列制備的自我失活型載體在導(dǎo)入靈長類ES細(xì)胞之后，已證實(shí)可以維持兩
個(gè)月以上的穩(wěn)定表達(dá)(專利文獻(xiàn)l)。這樣，通過改造LTRU3區(qū)進(jìn)行自我 失活設(shè)計(jì)的SIN載體特別適用于本發(fā)明。具體來說，3'LTR的U3區(qū)域的1 或者多個(gè)堿基通過置換，缺失，和/或增加等進(jìn)行改造的載體歸屬于本發(fā) 明。這個(gè)U3區(qū)域既可以僅為缺失，也可以為在該區(qū)域內(nèi)插入其它的啟動(dòng)子。 作為這樣的啟動(dòng)子來說，例如可以列舉出CMV啟動(dòng)子、EF1啟動(dòng)子、或者 CAG啟動(dòng)子等。
另外，最優(yōu)選的設(shè)計(jì)為，通過LTR以外的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明載體 的PEDF基因。例如，如上所述，將LTR U3區(qū)域置換成非LTR啟動(dòng)子的 情況下，最優(yōu)選的是，通過這種改造的LTR驅(qū)動(dòng)PEDF基因的表達(dá)?；蛘?如實(shí)施例所示，在與LTR區(qū)域不同的位置上加入非LTR啟動(dòng)子，通過連接 其下游PEDF基因，可以誘導(dǎo)非LTR依賴的PEDF基因的表達(dá)。本發(fā)明人， 通過構(gòu)建非LTR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因表達(dá)的SIV載體表明在ES細(xì)胞中 的外源基因可以長期穩(wěn)定地表達(dá)(專利文獻(xiàn)1 )。同樣，在PEDF基因的上 游連接非LTR啟動(dòng)子，由該啟動(dòng)子導(dǎo)致的PEDF基因轉(zhuǎn)錄的載體特別適用 于本發(fā)明。作為非LTR啟動(dòng)子來說，例如可列舉出CMV啟動(dòng)子、EF1啟 動(dòng)子、或者CAG啟動(dòng)子，尤其是CMV啟動(dòng)子最好。在本實(shí)施例中使用的 CMV啟動(dòng)子的堿基序列用序列號9來表示。這種載體，尤其是在上述自 我失活(SIN)型載體構(gòu)建中會(huì)發(fā)揮較高的效果。
以HIV載體為首的慢病毒載體，在宿主基因組帶有全部HIV前病毒的 情況下，有報(bào)道指出外源載體和內(nèi)源性前病毒之間會(huì)發(fā)生重組，擔(dān)心會(huì)不 會(huì)出現(xiàn)可復(fù)制的病毒。這在將來實(shí)際給HIV感染患者使用HIV載體時(shí)確實(shí) 是一個(gè)很大的問題。這次使用的SIV載體由于幾乎沒有與HIV相同的序列， 是刪除掉80 %以上的病毒來源序列的不可復(fù)制病毒，因此這種危險(xiǎn)性極'J、， 與其他慢病毒載體相比安全性很高。本發(fā)明的SIV-PEDF載體是刪除了上述 "作為病毒載體功能所必需的序列"以外的一定百分比的SIV基因組序列 的載體，最優(yōu)選的是這個(gè)載體中來源自SIV的基因組序列的40%以上、或 者是50%以上、或者是60%以上、或者是70%以上、更優(yōu)選的是80%以 上被刪除掉的不可復(fù)制病毒。
在逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生中，使宿主細(xì)胞中包含包裝信號的基因轉(zhuǎn)移載體 DNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄，在gag, pol蛋白以及被膜蛋白質(zhì)存在的情況下，形成病毒
顆粒。包裝細(xì)胞內(nèi)的gag,pol蛋白可以使用包裝載體進(jìn)行提供。被膜蛋白也
可由包裝載體進(jìn)行提供，也可以由其它載體進(jìn)行提供。例如實(shí)施例所示，
可以由VSV-G表達(dá)載體進(jìn)行提供。
本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體最基本地要具有5'LTR、包裝信號序列、PEDF 基因或者FGF2基因和3'LTR序列。LTR序列也可以進(jìn)行上述的SIV載體 改造的LTR改造。另外，也可以加入上述的cPPT序列、CMV序列、RRE 序列等?；蜣D(zhuǎn)移載體DNA中編碼的包裝信號序列，為了能維持該序列形 成的結(jié)構(gòu)功能，最好盡可能長地加入進(jìn)去，另一方面，為了抑制該載體DNA 上的包裝信號與供給gag， pol蛋白的包裝載體之間發(fā)生重組出現(xiàn)的野生型 病毒的頻率，需要將這些載體間的重復(fù)序列控制在最小限度范圍內(nèi)。因此， 在基因轉(zhuǎn)移載體DNA的構(gòu)建中，為了使包裝效率以及安全性二者都得到滿 足，最好使用包含有盡可能短的包裝所必需的序列。
例如，使用來自SIVagm的包裝載體的情況下，由于來自HIV的基因 轉(zhuǎn)移載體未被包裝，因此，作為用于基因轉(zhuǎn)移載體DNA的包裝信號來源， 只受SIV的限制。但是，使用來自HIV的包裝載體的情況下，由于來自SIV 的基因轉(zhuǎn)移載體也會(huì)被包裝，使重組病毒的出現(xiàn)頻率下降，所以可以將來 自不同慢病毒的基因轉(zhuǎn)移載體和包裝載體進(jìn)行組合并形成載體粒子。如此 制備的SIV載體也包括在本發(fā)明的載體中。在這種情況下，最優(yōu)選的是靈 長類慢病毒之間產(chǎn)生的組合(例如，HIV和SIV )。
在基因轉(zhuǎn)移載體DNA中，最好將gag蛋白改造為非表達(dá)。病毒gag蛋 白對于生命體來說，被作為異物識別，有可能表現(xiàn)出抗原性。另外，也有 可能影響到細(xì)胞的功能。要使gag蛋白不表達(dá)，可以通過gag起始密碼子的 下游堿基的增加或者缺失等進(jìn)行框移改造。另外，最好是在gag蛋白的編碼 區(qū)域產(chǎn)生部分缺失。 一般來說，在病毒的包裝中，gag蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域的 5'端是必要的。因此，在基因轉(zhuǎn)移載體中，最好是使gag蛋白的C末端的編 碼區(qū)域缺失。在不對包裝效率產(chǎn)生很大影響的范圍內(nèi)，盡可能大范圍地刪 除gag編碼區(qū)域。另外，最好將gag蛋白的起始密碼子(ATG)置換成ATG 以外的密碼子。置換的密碼子應(yīng)適宜地選擇對包裝效率沒有影響的。具有 依此構(gòu)建的包裝信號的基因轉(zhuǎn)移載體DNA,通過導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞中， 就可以進(jìn)行病毒載體生產(chǎn)了 。生產(chǎn)的病毒載體比如可以從包裝細(xì)胞的培養(yǎng) 上清中進(jìn)行回收。
進(jìn)而，在基因轉(zhuǎn)移載體DNA中，最好進(jìn)行以提高PEDF基因的導(dǎo)入效 率以及表達(dá)效率的改造。比如進(jìn)行提高導(dǎo)入效率的改造例子，可以列舉cPPT (central polypurine tract) 序列的導(dǎo)入。cPPT原本是存在于SIV基因組的 一個(gè)序列。在HIV病毒中很久以前就有報(bào)道(P.Charneau et al. : J.Virol 65: 2415-2431,1991 )，報(bào)道指出，在HIV載體中導(dǎo)入cPPT后，載體基因組向 細(xì)胞核的移動(dòng)加快，基因?qū)胄侍岣?A.Sirven et al. : Blood 96:4103-4110, 2000)。在本實(shí)施例中使用的cPPT堿基序列用序列號IO來表示。另外作 為提高表達(dá)效率的改造例子，可以列舉WPRE ( woodchuck hepatitis vims posttranscriptional regulatory element) 序歹寸的轉(zhuǎn)導(dǎo)。WPRE是具有提高基因 表達(dá)效率功能的因子(US Patent 6284469 :脂A export element and methods of use)。有報(bào)道指出在其它的慢病毒載體中，同時(shí)導(dǎo)入cPPT和WPRE兩 個(gè)因子，最終可以進(jìn)一步提高各自的效果(SC. Barry et al. : Hum. Gene Ther. 12: 1103-1108,2001)。在本實(shí)施例中使用的WPRE堿基序列用序列號11 來表示。在本發(fā)明的SIV-PEDF載體中，cPPT可以采用與常見的慢病毒載 體的定位一樣的定位。例如、cPPT可以定位在啟動(dòng)子與外源基因之間，或 者定位在RRE序列的上游，最好是定位在驅(qū)動(dòng)PEDF轉(zhuǎn)錄的上述非LTR啟 動(dòng)子的上游。WPRE可以定位在PEDF基因的下游。作為這種基因轉(zhuǎn)移載體 最好的具體實(shí)例，可以舉出使用包含在序列號1中記述的堿基序列中插入 PEDF基因的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備的SIV載體，更好的例子為，使 用包含序列號2中記述的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體制備的SIV載體。
在本發(fā)明中，包裝載體可以使用刪除了 PEDF基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)非必需的序列 的載體。作為非必需序列，可以列舉出被稱作修飾基因的vif,vpr和調(diào)控基 因的tat,rev。有報(bào)道指出修飾基因產(chǎn)物在載體中是非必需的(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816， 1998),近年來，為了提高安全性，經(jīng)常使用刪除了修飾 基因的載體。另外，tat也可刪除，rev可用其它質(zhì)粒移走，使安全性進(jìn)一步 提高，是開發(fā)中的所謂第三代載體。從包裝載體中去除掉rev的情況下，可 以另外構(gòu)建rev表達(dá)載體，在本發(fā)明的SIV-PEDF載體的制備中可以使用該 rev表達(dá)載體。SIVagm TYO-1株的rev的堿基序列用序列號12來表示。 按上述方法構(gòu)建的包裝載體，例如，可以進(jìn)行包括啟動(dòng)子序列、病毒核心 蛋白質(zhì)序列(gag)、逆轉(zhuǎn)錄酶序列(pol) 、 polyA序列在內(nèi)的構(gòu)建，如實(shí) 施例所示，在上述構(gòu)建中再加上RRE序列。另外rev表達(dá)載體可以將調(diào)控 該序列的啟動(dòng)子放置在rev序列的上游、將polyA序列放置在rev序列的下 游進(jìn)4于構(gòu)建。
作為用于包裝細(xì)胞的細(xì)胞來說，通常來講只要是用于病毒生產(chǎn)的細(xì)胞 抹都可以?？紤]到應(yīng)用于人類的基因治療，細(xì)胞來源以人類的或者猴子的 較為適宜。可以用作包裝細(xì)胞使用的人類細(xì)胞抹，例如包括293細(xì)胞、293T 細(xì)月包、293EBNA細(xì)胞、SW480纟田月包、u87MG纟田月包、HOS細(xì)胞、C8166細(xì) 胞、MT-4細(xì)胞、Molt-4纟田胞、HeLa細(xì)胞、HT1080細(xì)胞、TE671纟田月包等。
來源于浙吳子的纟田月包才朱，例i口， COS1纟田月包、COS7纟田月包、CV-1纟田月包、BMT10 細(xì)胞等。
本發(fā)明的SIV-PEDF載體實(shí)質(zhì)上可以進(jìn)行完全純化。純化方法包括過濾 器過濾，離心分離，以及柱層析純化等已知的純化/分離方法來進(jìn)行。例如 將載體懸液通過0.45pm的過濾器進(jìn)行過濾后，42500xg、 90分鐘、4'C下進(jìn) 行離心，可以對載體進(jìn)行沉淀和濃縮。
本發(fā)明的SIV-PEDF載體可以用于伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的 治療以及預(yù)防。如實(shí)施例中所示，本發(fā)明人用疾病模型動(dòng)物確認(rèn)了 SIV-PEDF載體對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)極其有效。青光眼的最終病變是 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。也就是說，本發(fā)明的SIV-PEDF載體通過抑制視 網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，具有抑制青光眼的惡化、預(yù)防、治療等效果。另 外，除了青光眼之外，還可以廣泛應(yīng)用于伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患 的治療。本發(fā)明的SIV-PEDF載體可以根據(jù)需要在藥理學(xué)可使用的所希望的 載體材料或者介質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)組合，作為伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的 治療用藥品。"藥學(xué)可使用的介質(zhì)"是指可以與載體一起給藥，所述介質(zhì) 是對基因的導(dǎo)入沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的抑制的材料。具體來講，例如可以考 慮使用滅菌水、生理鹽水、培養(yǎng)液、血清、生理鹽水的磷酸鹽緩沖液(PBS) 等適當(dāng)?shù)慕M合。此外，其它的還可以含有穩(wěn)定劑、殺菌劑等。用含有本發(fā) 明的SIV-PEDF的伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患治療用醫(yī)藥品進(jìn)行給藥 的情況下，只要能得到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)的效果，對給藥途徑?jīng)]有特 別要求，最好是視網(wǎng)膜下給藥、玻璃體內(nèi)給藥、前房內(nèi)給藥、最優(yōu)選的是 視網(wǎng)膜下給藥、玻璃體內(nèi)給藥。包含本發(fā)明的SIV-PEDF的藥物的給藥量(每 一個(gè)眼球用量)，例如可以是2.5xl05TU-2.5xl08TU、最優(yōu)選用量是 5.0xl05TU-5.0xl07 TU。
另外，在本說明書中引用的全部前期技術(shù)文獻(xiàn)都作為參考編入本說明 書中。
實(shí)施例
以下實(shí)施例有助于理解本發(fā)明。但不限于本發(fā)明以下的實(shí)施例內(nèi)容。
實(shí)施例1 VSV-G假型SIV載體的構(gòu)建
載體的構(gòu)建使用了如圖1中所示的4種質(zhì)粒(基因轉(zhuǎn)移載體、包裝載 體、rev表達(dá)載體、VSV-G表達(dá)載體)。關(guān)于其中基因轉(zhuǎn)移載體、包裝載體、 及rev表達(dá)載體這3種，它們是通過改造原始型載體質(zhì)粒(PCT/JP00/03955 ) 而制備的。關(guān)于VSV-G表達(dá)載體使用沒有經(jīng)過改造的原始型載體。
在質(zhì)粒制備時(shí)，使用了市場上出售的各種試劑盒。限制性內(nèi)切酶使用 New England Biolabs公司的產(chǎn)品，質(zhì)粒DNA的提取，純化，回收使用 QIAGEN的試劑盒(QIAquick PCR purification kit, QIAquick Nucleotide Removal kit, QIAquick Gel extraction kit, Plasmid Maxi kit )。PCR使用TaKaRa 的EX Taq酶，所用引物對外委托SIGMA GENOSYS JAPAN合成。DNA末 端的脫磷酸化使用TaKaRa的堿性磷酸酶(來自E.coli C75)。連接時(shí)使用 TaKaRa的DNA Ligation kit ver.2 ， 轉(zhuǎn)化使用 TOYOBO的DH5a COMPETENT high感受態(tài)細(xì)胞。
1-1.基因轉(zhuǎn)移載體的改造
向原始型基因轉(zhuǎn)移載體中導(dǎo)入cPTT(中心多。票呤管道，central polypurine tract)以及WPRE(土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，woodchuck hepatitis vims posttranscriptional regulatory element),以改造基因碑爭移載體的性能(圖2A, B)。使用的原始型基因轉(zhuǎn)移載體為非病原性的非洲綠猴免疫缺陷病毒的克 隆抹SIVagm作為基本載體，順次具有5'LTR區(qū)域、RRE、 CMV (巨細(xì)胞 病毒，cytomegalovirus )啟動(dòng)子、EGFP (增強(qiáng)型纟錄色熒光蛋白，enhanced green fluorescent protein)基因、3'LTR。該原始型基因轉(zhuǎn)移載體是本發(fā)明人構(gòu)建 出來的載體，并已對構(gòu)建方法等進(jìn)行了報(bào)道(專利文獻(xiàn)2)。該原始型基因 轉(zhuǎn)移載體的堿基序列用序列號13來表示。
具體的載體改造方法如下。首先，用限制性內(nèi)切酶SacII酶切原始型的 基因轉(zhuǎn)移載體，樣品進(jìn)行電泳，去除CMV啟動(dòng)子和EGFP基因后，進(jìn)行自 我連接。其次，為了消除質(zhì)粒的NotI位點(diǎn)，用NotI酶切上述載體，將酶 切末端用T4DNA聚合酶平滑化處理，然后進(jìn)行自我連接。 接下來，將上述載體用限制性內(nèi)切酶Sac II酶切，進(jìn)行BAP處理，將 酶切末端脫磷酸化處理。以原始型的基因轉(zhuǎn)移載體作為模板，用引物1F(序 列號14)和1R(序列號15)進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物用SacII酶 切，制備成在CMV啟動(dòng)子(序列號9)的末端添加有SacII位點(diǎn)的片斷。 將該CMV啟動(dòng)子片斷連接到BAP處理過的上述載體的Sac II位點(diǎn)上。
將載體依次用Notl、 BamHI進(jìn)行酶切，在其酶切位點(diǎn)將兩種合成的寡 聚DNA2F (序列號16)和2R (序列號17)進(jìn)行退火制備好的接頭連接 上，以改變限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)。將載體用限制性內(nèi)切酶SacII酶切，進(jìn)行 BAP處理，將酶切末端進(jìn)行脫磷酸化處理。
為了得到導(dǎo)入用的cPTT片斷(序列號10),將含有SIVagmTYOl 基因組(序列號7)的質(zhì)粒pSA212作為模板，用引物3F(序列號18) 和3R(序列號19)進(jìn)行PCR反應(yīng)。將該P(yáng)CR擴(kuò)増片斷的末端用SAC II 酶切，制備成在cPPT的兩端添加有SAC II位點(diǎn)的片斷。將cPPT片斷連接 到BAP處理的上述載體的Sac II 4立點(diǎn)上。
將載體用BamHI酶切，進(jìn)行BAP處理，將酶切末端進(jìn)行脫磷酸化處 理。為了得到導(dǎo)入的WPRE片斷，以裝有WPRE cDNA (序列號11 )的 質(zhì)粒作為模板，用引物4F (序列號20)和4R (序列號21)進(jìn)行PCR 反應(yīng)。將得到的PCR擴(kuò)増產(chǎn)物的末端用BamH I和Bgl II酶切，制備成在 WPRE的末端添加有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的片斷。將上述WPRE片斷連接在 載體的BamHI位點(diǎn)上，最終得到無攜帶基因的改造型基因轉(zhuǎn)移載體(序列 號1)。
制備攜帶基因片斷，并加入到上述的改造型基因轉(zhuǎn)移載體Not I位點(diǎn)上。 EGFP片斷以裝有EGFP cDNA (序列號22 )的質(zhì)粒作為模板，用引物5F (序列號23)和5R(序列號24 )進(jìn)行PCR反應(yīng)，用NotI酶切后進(jìn)行 制備。PEDF片斷以裝有hPEDFcDNA (序列號8)的質(zhì)粒作為模板，用 引物7F (序列號25 )和7R (序列號26 )進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)行pGEM-T Easy vector載體(Promega公司)的TA克隆，用Not I酶切進(jìn)行制備。
另夕卜，在構(gòu)建含有cPPT， WPRE的質(zhì)粒的同時(shí)，為了確認(rèn)cPPT， WPRE 的效果，分別制備了單獨(dú)加入有cPPT或者單獨(dú)加入有WPRE的基因轉(zhuǎn)移載 體。
1-2.包裝載體的改造
在原始型包裝載體中除了 gag， pol之外，還包括被稱作修飾基因vif,vpr 和被稱作調(diào)控基因的tat,rev。然而，已知修飾基因產(chǎn)物在載體中是非必須的 (V.Kim etal.: J.Virol 72:811-816， 1998),近年來，為了提高安全性，使用刪 除了修飾基因的載體。另外，tat也被刪除，rev通過其它的質(zhì)粒移去，而更 加安全，開發(fā)了被稱作第三代的載體，目前，載體的第三代化成為當(dāng)務(wù)之 急。因此即使在本發(fā)明中，從原始型包裝載體(序列號27)中去除輔助 的基因(vif,vpr,tat)，將rev轉(zhuǎn)移至別的質(zhì)粒，提高了安全性(圖3)。方 法基本上為以前報(bào)道的HIV載體的方法(T. DulL et al.: J. Virol 72:8463-8471, 1998)。
具體來講，首先，將包裝載體的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NotI酶切，接著 用EcoT221酶切。樣品進(jìn)行電泳，除去EcoT221-Not I片斷，回收片斷較大 的載體片斷和作為pol基因一部分的EcoT22I-EcoT221片斷。
將這兩種合成寡聚DNA1F (序列號28)和1R(序列號29 )進(jìn)行退 火而制備好的接頭與上述載體的EcoT22I-Not I位點(diǎn)進(jìn)行連接。接下來將載 體用EcoT221酶切，進(jìn)行BAP處理，將酶切末端脫磷酸化處理，在BAP處 理的EcoT221位點(diǎn)加入回收好的pol基因的EcoT221片斷。
將上述載體用Notl酶切，進(jìn)行BAP處理，將酶切末端脫磷酸化處理。 為了得到RRE片斷，將原始型的包裝載體(序列號27)作為模板，用引 物8F(序列號30)和8R(序列號31)進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)行pGEM-T Easy vector載體(Promega公司)的TA克隆。用Not I將RRE片斷切出。連接 RRE片斷于脫磷酸化處理的載體NotI位點(diǎn)，最終得到改造型包裝載體(序 列號3)。
1-3. rev表達(dá)載體的構(gòu)建
rev蛋白目前為止依靠原始型的包裝載體供給，隨著上述包裝載體改造， 將rev蛋白以其它的表達(dá)質(zhì)粒的形式進(jìn)行供給，重新構(gòu)建了表達(dá)載體。Rev 在基因組上的內(nèi)含子被分成為兩部分，將它們連接在一起，加入到表達(dá)質(zhì) 粒中(圖4A, B)。
首先，以原始的包裝載體作為模板，通過PCR制備成兩條片斷。5，端 的片斷使用引物IF(序列號32)和IR(序列號33) , 3'端的片斷使 用引物2F (序列號34)和2R (序列號35)進(jìn)行擴(kuò)増?；厥諆煞NPCR 片斷，混合，作為PCR的模板，使用引物1F和2R進(jìn)行擴(kuò)増，得到以連接 兩個(gè)片斷為目的的rev基因斷片(序列號12)。將PCR擴(kuò)增的rev片斷 TA克隆到pGEM-T Easy vector載體。接下來，將該載體用EcoR I酶切，回 收添加有EcoRI位點(diǎn)的rev片斷。另一方面，將蛋白表達(dá)pCI載體(Promega 公司)用EcoRI酶切，對酶切位點(diǎn)進(jìn)行BAP處理。將回收的rev片斷和pCI 表達(dá)載體連接起來，作為rev表達(dá)載體備用。
實(shí)施例2對攜帶有cPPT, WPRE的SIV載體的功能評價(jià) 為了調(diào)查cPPT和WPRE的導(dǎo)入效果，除了 cPPT和WPRE同時(shí)攜帶的 載體外，還生產(chǎn)出單獨(dú)攜帶cPPT的載體，單獨(dú)攜帶WPRE的載體，與原始 型的對照進(jìn)行比較。所使用的全部基因轉(zhuǎn)移載體都攜帶EGFP。包裝載體使 用原始型(序列號27)。 2-1. SIV載體的制備
將來自人類胎兒腎細(xì)胞的細(xì)胞株293T細(xì)胞按照每一個(gè)15cm塑料培養(yǎng) 皿大約lxi07 (次日密度為70-80% )進(jìn)行接種，在20ml含〗0%胎牛血清 的D-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL )中進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)。24小時(shí)培養(yǎng)后,將 培養(yǎng)基用10ml的OPTI-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL )進(jìn)行置換，作為轉(zhuǎn)染細(xì) 胞備用。
按照每一個(gè)培養(yǎng)iDi基因轉(zhuǎn)移載體為6fig、包裝載體3叱、VSV-G表達(dá)載 體ljug溶解在1.5ml的OPTI-MEM培養(yǎng)基中，加入40^x1的PLUS Reagent 試劑(Invitrogen公司)進(jìn)行攪拌，在室溫下放置15分鐘?；蜣D(zhuǎn)移載體使 用cPPT和WPRE同時(shí)攜帶的載體，單獨(dú)攜帶cPPT的載體，單獨(dú)攜帶WPRE 的載體或者原始型(cPPT和WPRE都不攜帶)的載體。在其中加入1.5ml 的OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋的60jal的LIPOFECTAMINE Reagent試劑 (Invitrogen公司)進(jìn)行攪拌，在室溫下放置15分鐘。
將上述的DNA復(fù)合物滴加到15cm培養(yǎng)皿的細(xì)胞上，小心振蕩混合， 在37。C,5。/。C02的孵育器中進(jìn)行3小時(shí)的孵育。將育后，在培養(yǎng)皿中加入13ml 的含20%胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染的第二天，用新鮮的 含10 %胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基30ml換液后進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染2天后，回 收上清，用0.45pm的過濾器進(jìn)行過濾，作為載體懸液備用。
2-2. SIV載體的滴度測定
SIV載體滴度包括由表達(dá)所攜帶基因的蛋白的細(xì)胞數(shù)目計(jì)算出的功能
滴度(Functional titer : TU/ml)和由載體粒子數(shù)目計(jì)算出的數(shù)值(顆粒滴度 Particle titer :顆粒/ml)。因?yàn)閏PPT和WPRE的性能評價(jià)要在一致的顆粒 滴度條件下對細(xì)胞進(jìn)行感染和評價(jià)，因此，如下所示用斑點(diǎn)印跡法對顆粒 滴度進(jìn)行了測定。
首先，用市場上出售的試劑盒(QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA mini kit)從如上述生產(chǎn)出來的載體懸液抽取RNA。其次，利用狹隙雜交裝置在 HybondN+濾膜(Amersham公司)上對RNA加樣。同時(shí)通過定量曲線計(jì)算 出所用質(zhì)粒DNA的摩爾數(shù)量。另外，RNA的處理方法按照濾膜產(chǎn)品附帶 提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。將DNA加熱并迅速冷卻。將濾膜用堿固定后，進(jìn)行 雜交。雜交使用羅氏公司的DIG標(biāo)記的信號檢測系統(tǒng)。探針利用DIG標(biāo)記 的NTP進(jìn)行制備，雜交后的操作使用DIG Easy Hyb, DIG Wash and Block Buffer Set試劑盒(羅氏公司)。利用anti-DIG AP conjugate antibody抗體(羅 氏公司)以及CSPD (羅氏公司)，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，用魯米諾圖像分析儀(富 士寫真膠巻LAS-1000),對信號進(jìn)行檢測定量。
2-3. SIV載體對細(xì)胞的基因?qū)爰霸u價(jià)
測定好顆粒滴度的4種載體如以下所示以不同感染復(fù)數(shù)(MOI, multiplicity of infection)對細(xì)胞進(jìn)行感染，進(jìn)行FACS分析。將293T細(xì)胞按 照每1孔為lxl()S個(gè)接種到6孔塑料培養(yǎng)板上，在37。C、 5%032下培養(yǎng)過 夜。次日，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算培養(yǎng)板每1孔的細(xì)胞數(shù)量，除去培養(yǎng)板的培 養(yǎng)基，分別加入用新鮮的含10%胎牛血清的2ml D-MEM培養(yǎng)基稀釋的載 體，使MOI(病毒顆粒/細(xì)胞，Particles/cell)分別為0.3, 1.5, 7.5， 15。感染 l天后，將細(xì)胞的培養(yǎng)基用2ml的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行交換。感染2天后，在熒 光顯微鏡下觀察通過載體進(jìn)行基因?qū)氲腅GFP,測定EGFP陽性細(xì)胞的比 例，并測定熒光強(qiáng)度(作為EGFP蛋白量水平的數(shù)值)。
2-4.載體功能評價(jià)的結(jié)果
以原始型的基因轉(zhuǎn)移載體作為對照，生產(chǎn)了單獨(dú)攜帶cPPT,單獨(dú)攜帶 WPRE，同時(shí)攜帶cPPT和WPRE的4種載體。載體設(shè)計(jì)的模式圖如圖5-(a) 所示。
在測定生產(chǎn)出來的載體顆粒滴度的時(shí)候，未發(fā)現(xiàn)4種載體粒子產(chǎn)量的 差異。用載體粒子數(shù)對MOI值(每一個(gè)細(xì)胞所感染的載體粒子數(shù))進(jìn)行統(tǒng) 一，并將基因?qū)?93T細(xì)胞，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。MOI為15的情
況下，如圖5-(b)所示，不含cPPT和WPRE的原始型的對照(-cPPT, -WPRE ) 中，EGFP陽性細(xì)胞的數(shù)量少，焚光弱。單獨(dú)攜帶cPPT (+cPPT, -WPRE) 時(shí)EGFP陽性細(xì)胞的數(shù)量增加。單獨(dú)攜帶WPRE (-cPPT， +WPRE )時(shí)EGFP 陽性細(xì)胞的數(shù)量與對照相比僅稍有增加，但EGFP蛋白的熒光增強(qiáng)。同時(shí)攜 帶cPPT和WPRE (+cPPT, +WPRE)時(shí)，兩個(gè)因子發(fā)揮了協(xié)同效果，細(xì)胞 數(shù)量、熒光強(qiáng)度二者都比單獨(dú)攜帶cPPT或單獨(dú)攜帶WPRE時(shí)有大幅度的增 加，得到了超出預(yù)期的結(jié)果。
在用FACS調(diào)查EGFP陽性細(xì)胞比例時(shí)(圖6),所有的基因插入比例 均呈MOI依賴性的増加，而且同時(shí)攜帶cPPT和WPRE與對照相比，導(dǎo)入 效率大約上升了 10倍。也就是說，實(shí)際上的功能滴度(產(chǎn)量)上升了 10 倍。
另外，在調(diào)查EGFP陽性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度時(shí)，(圖7),表明同時(shí) 攜帶cPPT和WPRE的比單獨(dú)攜帶WPRE的要高出很多，細(xì)胞基礎(chǔ)的蛋白 表達(dá)量也大幅度增加。
實(shí)施例3 攜帶治療基因的SIV載體的大量制備及濃縮
如圖1中所示的以改造型基因轉(zhuǎn)移載體、包裝載體、rev表達(dá)載體、以 及VSV-G表達(dá)載體4種質(zhì)粒為基礎(chǔ)，對SIV載體進(jìn)行如下制備。攜帶PEDF 治療基因的載體以每20個(gè)15cm培養(yǎng)皿為單位進(jìn)行生產(chǎn)。
按照每一個(gè)15cm的塑料培養(yǎng)皿大約lxlO、次日密度為70-80% )接種 293T纟田胞，在20ml的含10 %胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行24個(gè)小時(shí) 培養(yǎng)。24小時(shí)培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基用10ml的OPTI-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行置換， 用于轉(zhuǎn)染。按照每一個(gè)培養(yǎng)皿基因轉(zhuǎn)移載體為IO嗎、包裝載體5嗎、rev表 達(dá)載體2昭、VSV-G表達(dá)載體2jig溶解在1.5ml的OPTI-MEM培養(yǎng)基后， 加入40iil的PLUS Reagent試劑(Invitrogen公司)進(jìn)行攪拌，在室溫下放 置15分鐘。在其中加入用1.5ml的OPTI-MEM培養(yǎng)基中稀釋的60)il的 LIPOFECTAMINE Reagent進(jìn)行攪拌，在室溫下放置15分鐘。將該DNA復(fù) 合物滴加到上述的15cm培養(yǎng)皿的細(xì)胞中，小心振蕩混合，在37匸，5%(:02 的孵育器中進(jìn)行3小時(shí)的孵育。在上述培養(yǎng)i中加入13mi的含20。/。胎牛血 清的D-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)染后的次日，用新鮮的30ml含10 %胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行 交換培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染兩天后，回收上清，加入20ml新鮮的培養(yǎng)基?；厥盏纳锨?br> 用0.45pm的過濾器進(jìn)行過濾，在4。C下保存。轉(zhuǎn)染三天后，回收上清，用 0.45pm的過濾器進(jìn)行過濾，與前一天回收的載體混合，利用高速離心機(jī)， 進(jìn)行濃縮操作。將回收的載體懸液加入到經(jīng)過滅菌處理的試管中分裝，在 42500G， 4。C下進(jìn)行1小時(shí)的離心。這種離心操作重復(fù)二次，將載體懸液濃 縮成500倍-1000倍。載體作為沉淀物進(jìn)行沉淀，沉淀物在含5 %胎牛血清 的PBS中進(jìn)行溶解。濃縮后的載體進(jìn)行小量分裝后，在-80'C下進(jìn)行保存， 一部分被用來進(jìn)行顆粒滴度測定。顆粒滴度的測定如前述方法同樣進(jìn)行。 實(shí)施例4 SIV-PEDF對缺血再灌注模型動(dòng)物青光眼治療效果的探討 把青光眼模型動(dòng)物進(jìn)行缺血再灌注模型建模，以探討SIV-PEDF載體對 青光眼治療的可能性。首先將本發(fā)明的載體SIV-hPEDF、或者不帶外源基 因的空載體SIV-空載體(2.5xl07TU/ml、 TU:轉(zhuǎn)導(dǎo)單位)懸液對4周齡的 Wistar系大鼠的視網(wǎng)膜下腔進(jìn)行給藥。載體轉(zhuǎn)導(dǎo)14天后，使上述大鼠眼內(nèi) 壓力置于UOmmHg壓力下進(jìn)行60分鐘缺血處理，對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn) 行傷害。損害4天后，利用腦立體定位儀，將熒光色素DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole )注入到兩眼視上丘，對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo) 記。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損害7天后(載體導(dǎo)入21天后)摘出眼球，鋪平用 熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)距離視神經(jīng)lmm處每lmn^被標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)細(xì) 胞數(shù)量。
作為對照，用BSS溶液替代載體懸液給藥于視網(wǎng)膜下腔，未進(jìn)行缺血 再灌注損害處置的「無載體給藥/非缺血再灌注損害組」、以及用BSS溶液 替代載體懸液給藥于視網(wǎng)膜下腔，缺血再灌注損害處置的「無載體給藥/缺 血再灌注損害組」，按照同樣的方法在焚光顯微鏡下進(jìn)行觀察，并對標(biāo)記 的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。
顯微鏡的觀察結(jié)果如圖8所示。另外標(biāo)記神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量如圖9所示。 計(jì)數(shù)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量為，無載體給藥/缺血再灌注損害組177.4/mm2、 SIV-空載體給藥組185.3/mm2、 SIV-hPEDF給藥組217.8/mm2。這些結(jié) 果表明，SIV-hPEDF對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)效果。
實(shí)施例5 SIV-PEDF對NMDA -誘導(dǎo)模型青光眼治療效果的探討
把青光眼模型動(dòng)物進(jìn)行NMDA -誘導(dǎo)模型的建模，以探討SIV-PEDF載 體對青光眼治療的可能性。首先，將本發(fā)明的載體SIV-hPEDF、或者不帶 有外源基因的空載體SIV -空載體(2.5xl07TU/ml、 TU:轉(zhuǎn)導(dǎo)單位)懸液對4 周齡的Wistar系大鼠的視網(wǎng)膜下腔給藥。載體轉(zhuǎn)導(dǎo)14天后，將NMDA 40mM, 5pl對玻璃體內(nèi)給藥，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層會(huì)受到選擇性傷害。損害4天 后，利用腦立體定位儀將螢光色素DAPI ( 4'，6-diamidino-2-phenylindole )注
入到兩眼視上丘，對神經(jīng)節(jié)進(jìn)行標(biāo)記。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損害7天后(載 體導(dǎo)入21天后)摘出眼球，鋪平用焚光顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)距離視神經(jīng) lmm 處每lmm2所標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量。
作為對照，用BSS溶液替代載體懸液給藥于視網(wǎng)膜下腔，沒有進(jìn)行 NMDA處置的「無載體給藥/非NMDA-誘導(dǎo)組」、以及用BSS溶液替代載 體懸液給藥于視網(wǎng)膜下腔，NMDA處置的「無載體給藥/NMDA -誘導(dǎo)組」 也按照同樣的方法在熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量。
熒光顯微鏡的結(jié)果如圖IO所示。另外，標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量如圖11 所示。所計(jì)數(shù)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量與缺血再灌注;溪型的情況相同，-在NMDA -誘導(dǎo)模型中證明SIV-hPEDF載體對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)效果。
工業(yè)化利用的可能性
通過本發(fā)明，提供了一種將PEDF有效地送達(dá)到眼組織細(xì)胞的載體。本 發(fā)明中的SIV-PEDF載體提供了一種伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的新 治療手段。也就是說，通過將本發(fā)明中的SIV-PEDF載體對伴隨眼組織細(xì)胞 凋亡變性的疾患的患者給藥，PEDF會(huì)在患者的細(xì)胞內(nèi)持續(xù)提供，同時(shí)可以 抑制青光眼等的最終狀變——視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡?？紤]到許多伴隨 凋亡變性的眼病為慢性病，本發(fā)明中的SIV-PEDF是一種針對上述疾患極其 有效的醫(yī)藥品，并已得到證實(shí)。
權(quán)利要求
1、用于治療伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的藥物，該藥物包含帶有色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factorPEDF)基因的重組猴免疫缺陷病毒載體、以及藥學(xué)可使用的介質(zhì)。
2、 權(quán)利要求1中記述的藥物，其中所述的猴免疫缺陷病毒載體包括 cPPT序列和/或WPRE序列。
3、 權(quán)利要求1或者2中記述的藥物，其中所述猴免疫缺陷病毒載體已 用VSV-G4i型化。
4、 權(quán)利要求1到3任意一項(xiàng)記述的藥物，其中所述猴免疫缺陷疫病毒 載體來自agm抹。
5、 權(quán)利要求1到4中任意一項(xiàng)記述的藥物，其中所述伴隨著眼組織細(xì) 胞凋亡變性的疾患為青光眼、視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜缺血 性疾患中的任意一項(xiàng)。
6、 治療伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的方法，其包括用帶有PEDF 基因的重組猴免疫缺陷疫病毒載體進(jìn)行給藥。
7、 權(quán)利要求6中記述的方法，包括用帶有PEDF基因的重組猴免疫缺 陷病毒載體進(jìn)行視網(wǎng)膜下給藥，玻璃體內(nèi)給藥，或者前房內(nèi)給藥的步驟。
8、 權(quán)利要求1到權(quán)利要求5任意一項(xiàng)中記述的藥物的制造方法，該方 法使用基因轉(zhuǎn)移載體，該載體包含在序列號1中記述的堿基序列中插入 PEDF基因的堿基序列。
9、 權(quán)利要求8中記述的藥物的制造方法，該方法利用包含序列號2 中記述的堿基序列的基因轉(zhuǎn)移載體。
10、 權(quán)利要求8或者權(quán)利要求9中記述的藥物的制造方法，包含向包 裝細(xì)胞中導(dǎo)入所述基因轉(zhuǎn)移載體的步驟，所述包裝細(xì)胞為已經(jīng)向其中導(dǎo)入 了包含序列3的堿基序列的包裝載體的包裝細(xì)胞。
11、 編碼猴免疫缺陷病毒基因組RNA的載體，包含序列號1中記述 的堿基序列或者在該序列中插入了外源基因的序列。
12、 權(quán)利要求11中記述的載體，其中所述外源基因是PEDF。
13、 猴免疫缺陷病毒，包含來自權(quán)利要求11或者12中記述的載體所 轉(zhuǎn)錄的基因組RNA。
14、 權(quán)利要求13中記述的猴免疫缺陷病毒，其已用VSV-G假型化。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過色素上皮衍生因子(PEDF)有效的給藥來治療眼組織細(xì)胞內(nèi)伴隨凋亡變性的疾患的新的治療方法。作為防止青光眼的最終病變即神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡的方法，本發(fā)明著眼于PEDF。并且，作為PEDF的有效的給藥方法，本發(fā)明著眼于SIV載體，并構(gòu)建了SIV-PEDF載體。將SIV-PEDF載體對缺血再灌注模型以及NMDA-誘導(dǎo)模型進(jìn)行視網(wǎng)膜下給藥，觀察到對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡有顯著的抑制效果，并且表明SIV-PEDF載體作為青光眼等伴隨眼組織細(xì)胞凋亡變性的疾患的治療用藥品是有效的。
文檔編號A61K48/00GK101180082SQ20068001290
公開日2008年5月14日 申請日期2006年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日
發(fā)明者上田泰次, 宮崎勝德, 居石克夫, 池田康博, 田畑壽晃, 米滿吉和, 長谷川護(hù), 飯?zhí)镎虏?申請人:生物載體株式會(huì)社