專利名稱：用于治療th2介導(dǎo)的疾病的kim-1抗體的制作方法
專利說(shuō)明用于治療TH2介導(dǎo)的疾病的KIM-1抗體
背景技術(shù)：
特應(yīng)性疾病如過(guò)敏性哮喘(allergic asthma)和特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis)都被認(rèn)為涉及向優(yōu)勢(shì)Th2免疫(predominant Th2 immunity)方面進(jìn)行致病性轉(zhuǎn)變(Umetsu等，2002，Nat Immunol.3715-20)。
在哮喘中，Th2細(xì)胞因子的生成驅(qū)使嗜酸性粒細(xì)胞流入肺中、嗜酸性粒細(xì)胞活化、IgE生成且IgE介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化并脫顆粒、單核細(xì)胞在肺間隙(lung interstitial space)中積累，T細(xì)胞和活化的粒細(xì)胞在這里繼續(xù)分泌Th2細(xì)胞因子、趨化因子和效應(yīng)分子，從而造成(fostering)持續(xù)的肺部炎癥。含有KIM基因家族的TAPR基因座在小鼠中參與特應(yīng)性炎癥的發(fā)生，KIM-1等位基因變異在患病群體分析(patient population analyses)中被發(fā)現(xiàn)與特應(yīng)性(atopy)的發(fā)生率有關(guān)(McIntire等，2001，Nat Immunol 21109-16；McIntire等，2003，Nature 425576)。
發(fā)明概述 本發(fā)明是基于(至少是部分基于)以下發(fā)現(xiàn)與KIM-1的特定區(qū)域結(jié)合的試劑(agent)(如抗體分子)可以有差別的調(diào)節(jié)Th1和/或Th2介導(dǎo)的免疫。例如，與KIM-1柄區(qū)(stalk region)或與KIM-1的唾液酸結(jié)合區(qū)結(jié)合的試劑，可調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，并可用于治療Th2介導(dǎo)的疾病如哮喘；與KIM-1的粘蛋白(mucin)區(qū)中特定表位結(jié)合的試劑，可減弱致病性Th1應(yīng)答，并可用于治療Th1介導(dǎo)的疾病，如炎性疾病(inflammatory disorder)或自身免疫病，如炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、克隆病(Crohn’s disease)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病(psoriasis)、急性移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植(transplant)、胰腺炎(pancreatitis)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)。本發(fā)明還提供了可以用于治療Th2和Th1介導(dǎo)的疾病的組合物和方法。
本發(fā)明一個(gè)方面提供了治療疾病的方法，所述疾病是Th2介導(dǎo)的疾病，如哮喘(特別是過(guò)敏性哮喘)、過(guò)敏性鼻炎(allergic rhinitis)、變態(tài)反應(yīng)(allergy)、濕疹(eczema)、以及其它特應(yīng)性疾病。所述方法包括，對(duì)患有Th2介導(dǎo)的疾病的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)給藥與KIM-1柄區(qū)或與KIM-1的唾液酸結(jié)合基元結(jié)合的試劑。例如，所述方法可以包括給藥藥物組合物，所述組合物含有與KIM-1柄區(qū)或與KIM-1的唾液酸結(jié)合基元結(jié)合的單特異性抗體，如單克隆抗體(或其抗原結(jié)合片段)，給藥量和給藥時(shí)間導(dǎo)致足以治療所述疾病。本文中，KIM-1柄區(qū)是指，位于KIM-1的粘蛋白區(qū)和跨膜區(qū)之間的帶電荷區(qū)，且該區(qū)中含有高度保守的N連接糖基化位點(diǎn)。人KIM-1的柄區(qū)和唾液酸結(jié)合基元見(jiàn)圖1。應(yīng)理解，本文中提到這些區(qū)的N末端和C末端時(shí)，是模糊的概念，可以多幾個(gè)(如1、2或3個(gè))或少幾個(gè)來(lái)自KIM-1序列的鄰接殘基。
在一實(shí)施方案中，所述試劑是與人KIM-1柄區(qū)結(jié)合的抗體。例如，所述抗體與具有序列DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO1的氨基酸236-269)的肽結(jié)合。在一實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合具有序列LLTANTTKG(SEQ ID NO1的氨基酸262-270)、HSLLTANTTKG(SEQ ID NO1的氨基酸260-269)、FLEHSLLTANTTKG(SEQ ID NO1的氨基酸257-270)、或NQTQLFLEHSLLTANTTKG(SEQ IDNO1的氨基酸252-270)的肽。在另一些實(shí)施方案中，所述抗體與具有SEQID NO1的氨基酸236-250或236-258所示序列的肽結(jié)合。
在一實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合KIM-1的唾液酸結(jié)合基元。例如，所述抗體結(jié)合(至少部分結(jié)合)包含在具有序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO1的氨基酸29-42)的肽中、或與所述肽重疊的表位。在一實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合還原型和非還原型蛋白，即，它結(jié)合GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO1的氨基酸29-42)的至少4，5，6，7，8，9，或10個(gè)鄰接氨基酸殘基的線性表位。
在另一實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合由序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO1的氨基酸81-107)和RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO1的氨基酸29-42)之一或兩者組成的結(jié)構(gòu)性表位。在一實(shí)施方案中，所述表位可以是包含在與重組小鼠KIM-1 IgV-人IgG1 Fc融合蛋白的8kDa TPCK胰蛋白酶片段對(duì)應(yīng)的人KIM-1序列中的結(jié)構(gòu)性表位。
在一實(shí)施方案中，所述抗體干擾SEQ ID NO1的殘基R86、W92和F93中的一個(gè)或多個(gè)，這些殘基是唾液酸結(jié)合所必需的。
雖然可以理解，本文所述方法不局限于任何具體機(jī)制或理論，但所述抗體可以具有下列一或多個(gè)特征(a)它干擾KIM-1的IgV區(qū)中的唾液酸結(jié)合基元與KIM-1柄區(qū)的一或多個(gè)N糖基化位點(diǎn)上展示的糖分子之間的相互作用，(b)它結(jié)合所述柄區(qū)中的一或多個(gè)N連接糖基化位點(diǎn)，或者對(duì)所述位點(diǎn)產(chǎn)生空間阻礙，(c)它抑制對(duì)KIM-1信號(hào)傳遞的下調(diào)，(d)它是激動(dòng)劑抗體，例如，它通過(guò)結(jié)合來(lái)促進(jìn)或增加經(jīng)由KIM-1向下游傳遞信號(hào)，(e)它阻止KIM-1多聚化(multimerization)，(f)它結(jié)合所述柄區(qū)或者在空間上阻礙該柄區(qū)與共同受體(co-receptor)或配體的相互作用，從而破壞正常功能，(g)它干擾KIM-1的IgV區(qū)中的唾液酸結(jié)合基元與鄰接KIM-1柄區(qū)的粘蛋白區(qū)的一或多個(gè)O糖基化位點(diǎn)上展示的糖分子之間的相互作用，(h)它改變Ig區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，因而改變蛋白構(gòu)象，例如，通過(guò)改變或干擾二硫鍵或氫鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)這種改變，(i)它改變KIM-1 Ig-區(qū)的結(jié)構(gòu)特征或功能特征，因而改變與其它蛋白如KIM-1配體的結(jié)合。
在一實(shí)施方案中，所述抗體并不抑制KIM-1從細(xì)胞表面釋出，例如，它不抑制KIM-1從培養(yǎng)的293Ebna(E293)細(xì)胞中釋出。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體是單特異性抗體，例如，所述抗體是單克隆抗體，例如人源化或完全人化(fully human)的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。
在一實(shí)施方案中，所述疾病是過(guò)敏性哮喘。在該實(shí)施方案中，所述方法任選(optionally)還包括鑒定有患過(guò)敏性哮喘的風(fēng)險(xiǎn)或者已經(jīng)患有過(guò)敏性哮喘的受試者。任選地，所述方法還包括評(píng)估受試者中的哮喘癥狀，如IgE水平、氣道過(guò)度反應(yīng)(airway hyperresponsiveness)、咳嗽(coughing)、喘鳴(wheezing)、胸悶(chest tightness)、呼吸困難(dyspnea)、氣道平滑肌收縮(airwaysmooth muscle contraction)、支氣管粘液分泌(bronchial mucus secretion)、炎癥(inflammation)、血管舒張(vasodilation)、炎性細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞)募集、杯狀細(xì)胞增生(goblet cellhyperplasia)、肥大細(xì)胞或遷移中的炎性細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)。所述評(píng)估步驟可以在給藥步驟之前、期間和/或之后進(jìn)行。所述評(píng)估可以由醫(yī)師、其它提供健康護(hù)理服務(wù)者或者由該受試者進(jìn)行。所述評(píng)估可以進(jìn)行一次或多次，例如在給藥后一或多次，例如在給藥后的一周、一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月、六個(gè)月期間或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行至少兩次。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括，測(cè)定給藥所述試劑(或多次給藥)是否減輕所述受試者中氣道疾病的一或多個(gè)癥狀的嚴(yán)重程度或減少所述癥狀的發(fā)生。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體與第二種有效治療受試者哮喘的試劑一起給藥，所述第二種試劑例如皮質(zhì)類固醇(corticosteroid)、支氣管擴(kuò)張劑(bronchodilator)、白三烯調(diào)節(jié)劑(leukotriene modifier)、抗炎劑、抗IgE劑(如抗IgE抗體，如omalizumab(

))?！逡黄鸾o藥(co-administered)″或″聯(lián)用(administered in combination)″是指，同時(shí)給藥或有間隔地給藥，如隔周給藥，使這些物質(zhì)對(duì)患者的效果發(fā)生重疊。
在另一實(shí)施方案中，所述疾病是變態(tài)反應(yīng)，如食物變態(tài)反應(yīng)或季節(jié)性(如花粉)變態(tài)反應(yīng)。可以通過(guò)以下一或多種方法診斷變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行過(guò)敏原(allergen)皮膚測(cè)試；測(cè)定血清IgE濃度(如IgE＞300ng/ml)；以及測(cè)定血清中的過(guò)敏原特異性IgE或IgG抗體。
所述抗體可以在以下一或多個(gè)時(shí)期給藥在特應(yīng)性患者暴露于過(guò)敏原之前；在暴露于過(guò)敏原之后、但在出現(xiàn)癥狀之前；在出現(xiàn)癥狀之時(shí)；在出現(xiàn)癥狀之后。
在一實(shí)施方案中，所述試劑作為療程來(lái)給藥，如按預(yù)定的頻率(如每天一次、每周一次、兩周一次、或一個(gè)月一次)間歇給藥(in periodicadministration)。在一些實(shí)施方案中，抗體的給藥時(shí)間和/或給藥量足以在一段時(shí)間(如3個(gè)月、6個(gè)月、1年或更長(zhǎng)時(shí)間)內(nèi)，減少(如大大減少)喘鳴、咳嗽、氣促(shortness of breath)、胸悶(tightness in the chest)發(fā)作的頻率或嚴(yán)重程度。
本發(fā)明另一方面提供了分離的與KIM-1柄區(qū)特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。所述抗體不抑制KIM-1從培養(yǎng)的E293細(xì)胞中釋出。在一實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合人KIM-1柄區(qū)。例如，所述抗體結(jié)合具有序列DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO1的氨基酸236-269)的肽。在一實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合具有序列LLTANTTKG(SEQ ID NO1的氨基酸262-270)、HSLLTANTTKG(SEQ ID NO1的氨基酸260-270)、FLEHSLLTANTTKG(SEQ ID NO1的氨基酸257-270)或NQTQLFLEHSLLTANTTKG(SEQ ID NO1的氨基酸252-270)的肽。在另一些實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合具有SEQ ID NO1的氨基酸241-254、242-258、242-255所示序列的肽。
本發(fā)明另一方面提供了分離的、與KIM-1的唾液酸結(jié)合基元特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。例如，所述抗體結(jié)合(至少部分結(jié)合)包含在具有序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO1的氨基酸29-42)的肽中的表位，或者與該肽重疊的表位。在一實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合還原型和非還原型蛋白，即它結(jié)合GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ IDNO1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO1的氨基酸29-42)的至少4、5、6、7、8、9或10個(gè)鄰接氨基酸殘基的線性表位。在另一實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合由序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO1的氨基酸81-107)和RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO1的氨基酸29-42)之一或兩者構(gòu)成的結(jié)構(gòu)性表位。在一些實(shí)施方案中，所述表位是包含在與重組小鼠KIM-1 IgV-人IgG1 Fc融合蛋白的8kDa TPCK胰蛋白酶片段相對(duì)應(yīng)的人KIM-1區(qū)中的結(jié)構(gòu)性表位。在一實(shí)施方案中，所述抗體干擾SEQ ID NO1的殘基R86、W92和F93中的一個(gè)或多個(gè)，這些殘基是唾液酸結(jié)合所必需的。
所述分離的抗體可以具有下列一或多個(gè)特征(a)它干擾KIM-1的IgV區(qū)中的唾液酸結(jié)合基元與KIM-1柄區(qū)的一或多個(gè)N糖基化位點(diǎn)上展示的糖分子之間的相互作用，(b)它結(jié)合所述柄區(qū)中的一個(gè)或全部?jī)蓚€(gè)N連接糖基化位點(diǎn)，或者對(duì)所述位點(diǎn)產(chǎn)生空間阻礙，(c)它抑制對(duì)KIM-1信號(hào)傳遞的下調(diào)，(d)它是激動(dòng)劑抗體，例如，它通過(guò)結(jié)合來(lái)促進(jìn)或增加經(jīng)由KIM-1向下游傳遞信號(hào)，(e)它阻止KIM-1多聚化，(f)它結(jié)合所述柄區(qū)與共同受體或配體的相互作用，或者空間上阻礙該相互作用，從而破壞正常功能，(g)它干擾KIM-1的IgV區(qū)中的唾液酸結(jié)合基元與鄰接KIM-1柄區(qū)的粘蛋白區(qū)的一或多個(gè)O糖基化位點(diǎn)上展示的糖分子之間的相互作用，(h)它改變Ig區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，因而改變蛋白構(gòu)象，例如，通過(guò)改變或干擾二硫鍵或氫鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)這種改變，(i)它改變KIM-1 Ig-區(qū)的結(jié)構(gòu)特征或功能特征，因而改變與其它蛋白如KIM-1配體的結(jié)合。
本發(fā)明另一方面涉及治療Th1介導(dǎo)的疾病的方法，所述疾病例如以致病性或增強(qiáng)的Th1應(yīng)答為特征的疾病。所述疾病包括炎性疾病和/或自身免疫病，如炎性腸病(IBD)、克隆病、多發(fā)性硬化、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、急性移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植、胰腺炎、遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)。所述方法包括，對(duì)患有Th1介導(dǎo)的疾病的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)給藥與包含在序列VATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTT(SEQ IDNO1的殘基200-235)中的表位結(jié)合的試劑，所述試劑例如是抗體。例如，所述方法可以包括給藥藥物組合物，所述組合物含有與KIM-1的特定區(qū)域結(jié)合的單特異性抗體，如單克隆抗體(或其抗原結(jié)合片段)，給藥量和給藥時(shí)間導(dǎo)致足以治療所述疾病。所述KIM-1的特定區(qū)域被發(fā)現(xiàn)在小鼠的KIM-1另路剪接變體中。應(yīng)理解，本文中提到該區(qū)的N末端和C末端時(shí)，是模糊的概念，可以多幾個(gè)(如1或2個(gè))或少幾個(gè)來(lái)自KIM-1序列的鄰接殘基。
在一實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合還原型和非還原型蛋白。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體是單特異性抗體，如所述抗體是單克隆抗體，如人源化或完全人化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。
在一實(shí)施方案中，所述疾病是炎性腸病(IBD)、克隆病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、急性移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植、胰腺炎、或遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)。所述方法任選還包括鑒定有患上述任一種疾病的風(fēng)險(xiǎn)或者已患上述任一種疾病的受試者。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括，測(cè)定給藥所述試劑(或多次給藥)是否減輕該受試者中所述疾病的一或多個(gè)癥狀的嚴(yán)重程度或減少所述癥狀的發(fā)生。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體與第二種有效治療受試者中所述疾病的試劑一起給藥，所述第二種試劑例如皮質(zhì)類固醇、或其它抗炎劑、DMARD、抗TNF療法或抗CD20療法?！逡黄鸾o藥″或″聯(lián)用″是指，同時(shí)給藥或有間隔地給藥，如隔周給藥，使這些物質(zhì)對(duì)患者的效果發(fā)生重疊。
在一實(shí)施方案中，所述試劑作為療程來(lái)給藥，如按預(yù)定的頻率(如每天一次、每周一次、兩周一次、或一個(gè)月一次)間歇給藥。在一些實(shí)施方案中，抗體的給藥時(shí)間和/或給藥量足以在一段時(shí)間(如3個(gè)月、6個(gè)月、1年或更長(zhǎng)時(shí)間)內(nèi)，減少(如大大減少)癥狀的頻率或嚴(yán)重程度。
本文中，術(shù)語(yǔ)“治療”是指，實(shí)施療法，且治療量、治療方式(manner)和/或治療模式(mode)導(dǎo)致有效改進(jìn)病理性疾病(pathological condition)特有的癥狀或參數(shù)；降低病理性疾病特有的癥狀或參數(shù)的嚴(yán)重程度；阻止、延緩或逆轉(zhuǎn)該病理性疾病的進(jìn)展；或預(yù)防該病理性疾病的一或多個(gè)癥狀或參數(shù)。
本文中，與KIM-1的指定區(qū)域“結(jié)合的試劑”是指，與該指定區(qū)域以小于10-6 M的Kd結(jié)合的任何化合物。一例KIM-1結(jié)合試劑是KIM-1結(jié)合蛋白，如KIM-1結(jié)合抗體，優(yōu)選單特異性抗體。
本文中術(shù)語(yǔ)“唾液酸結(jié)合區(qū)”、“唾液酸結(jié)合基元”、和“唾液酸結(jié)合所需”、以及這些術(shù)語(yǔ)的變化形式是指，與在結(jié)合唾液酸的Ig類凝集素(涎免凝集素(Siglec))家族中鑒定出的、結(jié)合糖分子所需的氨基酸殘基、氨基酸序列、以及氨基酸二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)相似或同源的氨基酸殘基、氨基酸序列、以及氨基酸二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。
術(shù)語(yǔ)“抗體或其抗原結(jié)合片段”是指蛋白，其包括至少一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)，如提供足以特異性結(jié)合抗原的免疫球蛋白可變區(qū)或免疫球蛋白可變區(qū)序列的氨基酸序列。例如，該術(shù)語(yǔ)包括具有重鏈(H)可變區(qū)(縮寫VH)和輕鏈(L)可變區(qū)(縮寫VL)的抗原結(jié)合蛋白。在另一例中，該術(shù)語(yǔ)包括含有兩個(gè)重鏈(H)可變區(qū)和兩個(gè)輕鏈(L)可變區(qū)的抗原結(jié)合蛋白。該術(shù)語(yǔ)還包括抗體的抗原結(jié)合片段(如單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、和dAb片段)以及完整抗體，如IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(及其亞型)的完整幼稚(intact)免疫球蛋白。免疫球蛋白的輕鏈可以是kappa型或lambda型。在一實(shí)施方案中，抗體是糖基化抗體?？贵w可以具有抗體依賴性細(xì)胞毒活性和/或補(bǔ)體-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性，或者可以不具有上述一種或全部?jī)煞N活性。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”(“CDR”)的超變區(qū)，以及多個(gè)超變區(qū)之間間插的更為保守、被稱為“框架區(qū)”(FR)的區(qū)。FR和CDR的范圍是確定的(間Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，F(xiàn)ifth Edition，US Department of Health and人Services，NIH Publication No.91-3242；Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196901-917)。Kabat定義在本文中使用。每一個(gè)VH和VL通常由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，它們按以下順序從氨基端到羧基端排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。
以上概述和以下說(shuō)明都不對(duì)權(quán)利要求的發(fā)明構(gòu)成限制。



圖1是帶注解的人KIM-1多肽序列(SEQ ID NO1)(不含信號(hào)序列，也不含插入多態(tài)性(insertional polymorphism)MTTVP)，顯示了本文所述的各種區(qū)。
圖2顯示，用OVA進(jìn)行氣溶膠攻擊(aerosol challenge)、并用3A2進(jìn)行治療后，支氣管灌洗液(bronchial lavage fluid，BAL)中的嗜酸性粒細(xì)胞百分比(y軸)。
圖3顯示，洗出(draining)的(支氣管)淋巴結(jié)細(xì)胞用OVA抗原進(jìn)行體外(ex vivo)刺激、并用3A2進(jìn)行治療后的增殖。Y軸是滴定出的胸苷摻入量，以cpm表示。
圖4顯示洗出的(支氣管)淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)OVA抗原體外刺激的反應(yīng)。LN在經(jīng)OVA氣溶膠攻擊后收集，用OVA進(jìn)行體外培養(yǎng)并用3A2進(jìn)行治療。取這些培養(yǎng)物的上清液，分析TH2細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)的生成。Y軸是皮克(pg)/ml。
圖5顯示3A2與固相蛋白的結(jié)合曲線。MAb 3A2等效地結(jié)合mKIM-1-ECD-Fc(圓)、mKIM-1-137-216-Fc(三角)、和mKIM-1-196-216-Fc(菱形)，但不結(jié)合mKIM-1-IgV-Fc(正方形)。
圖6顯示，用OVA進(jìn)行氣溶膠攻擊、并用4A2進(jìn)行治療后，支氣管灌洗液(BAL)中嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比(y軸)。
圖7顯示洗出的(支氣管)淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)OVA抗原體外刺激及4A2治療的反應(yīng)。LN在經(jīng)OVA氣溶膠攻擊后收集，用OVA進(jìn)行體外培養(yǎng)。取這些培養(yǎng)物的上清液，分析TH2細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-10和IL-13)的生成。Y軸是皮克(pg)/ml。
圖8顯示，用OVA進(jìn)行氣溶膠攻擊、并用4A2進(jìn)行治愈性治療(therapeutic treatment)后，支氣管灌洗液(BAL)中嗜酸性粒細(xì)胞的百分比(y軸)。
圖9顯示mAb 4A2與純化的KIM-1蛋白的結(jié)合曲線。
發(fā)明詳述 如本文所述，用抗體療法靶定KIM-1的特定區(qū)域，可以對(duì)Th2和Th1細(xì)胞因子表達(dá)產(chǎn)生嚴(yán)格的控制，并提供了治療Th2介導(dǎo)的疾病和其它特應(yīng)性疾病，以及治療Th1介導(dǎo)的疾病的治療策略。
抗體生成(Antibody Generation) 與KIM-1柄區(qū)或KIM-1的唾液酸結(jié)合基元結(jié)合的抗體可以通過(guò)免疫(例如用動(dòng)物進(jìn)行免疫)、或通過(guò)體外方法如噬菌體展示方法而生成。包含KIM-1的靶表位(如KIM-1柄區(qū)或KIM-1的唾液酸結(jié)合基元)的多肽可以用作免疫原。在另一些實(shí)施方案中，KIM-1多肽的較大一部分，例如胞外區(qū)，可以用作免疫原，并可以對(duì)所得抗體篩選與目標(biāo)KIM-1區(qū)或結(jié)構(gòu)域的反應(yīng)性。
在一實(shí)施方案中，經(jīng)免疫的動(dòng)物含有產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞，這些細(xì)胞具有天然的、人化的或部分人化的免疫球蛋白基因座。在一實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物包含人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可以用人Ig基因座的大片段對(duì)抗體生成有缺陷的小鼠品系進(jìn)行改造?？梢杂秒s交瘤技術(shù)從具有所需特異性的基因生成并篩選出抗原特異性單克隆抗體。參見(jiàn)例如XenoMouseTM，Green等Nature Genetics 713-21(1994)，US2003-0070185，美國(guó)專利5,789,650以及WO 96/34096。
還可以在例如嚙齒類動(dòng)物中產(chǎn)生抗KIM-1的非人抗體?？梢詫⑦@種非人抗體人源化，例如參見(jiàn)美國(guó)專利6,602,503，EP 239 400，美國(guó)專利5,693,761，和美國(guó)專利6,407,213。
EP 239 400(Winter等)描述了通過(guò)將一個(gè)物種的抗體(指定可變區(qū)內(nèi))的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)用另一物種的CDR取代，從而改變抗體的方法。CDR-取代型抗體可比真正的嵌合抗體較少激發(fā)人的免疫應(yīng)答，因?yàn)镃DR-取代型抗體中的非人成分很少(Riechmann等，1988，Nature 332，323-327；Verhoeyen等，1988，Science 239，1534-1536)。通常利用重組核酸技術(shù)，將鼠抗體的CDR取代為人抗體的相應(yīng)區(qū)，產(chǎn)生編碼所需取代型抗體的序列?？梢蕴砑泳哂兴柰N型(isotype)的人恒定區(qū)基因節(jié)段(通常是CH的gamma I和CL的kappa)，并使人源化的重鏈基因和輕鏈基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一起表達(dá)，從而產(chǎn)生可溶性人源化抗體。
Queen等，1989和WO 90/07861描述了一種方法，其包括，通過(guò)利用計(jì)算機(jī)分析與原始鼠抗體的V區(qū)框架的最佳蛋白序列同源性，來(lái)選擇人V區(qū)框架區(qū)，并建立鼠V區(qū)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，從而顯示出很有可能與鼠CDR相互作用的框架氨基酸殘基。然后將這些鼠氨基酸殘基置于同源人框架之上。也參見(jiàn)美國(guó)專利5,693,762；5,693,761；5,585,089；和5,530,101。Tempest等(1991，Biotechnology 9266-271)利用分別源自NEWM和REI重鏈和輕鏈的V區(qū)框架作為標(biāo)準(zhǔn)，在不引進(jìn)小鼠殘基的情況下，進(jìn)行CDR-移植。用Tempest等的方法構(gòu)建基于NEWM和REI的人源化抗體的一個(gè)好處在于，NEWM和REI的可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)已通過(guò)X-線晶體成像技術(shù)弄清楚了，因而可以針對(duì)CDR和V區(qū)框架殘基之間的特異性相互作用建立模型。
非人抗體可以經(jīng)過(guò)修飾而包括插入人免疫球蛋白序列的取代，例如在具體位置的共有的人氨基酸殘基，例如以下一或多個(gè)(優(yōu)選至少5，10，12，或全部)位置(在輕鏈可變區(qū)的FR中)4L，35L，36L，38L，43L，44L，58L，46L，62L，63L，64L，65L，66L，67L，68L，69L，70L，71L，73L，85L，87L，98L，和/或(在重鏈可變區(qū)的FR中)2H，4H，24H，36H，37H，39H，43H，45H，49H，58H，60H，67H，68H，69H，70H，73H，74H，75H，78H，91H，92H，93H，和/或103H(遵循Kabat編號(hào))。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利6,407,213。
與目標(biāo)KIM-1區(qū)結(jié)合的完全的人單克隆抗體可以利用例如體外刺激(invitro-primed)的人脾細(xì)胞來(lái)制備，參見(jiàn)Boerner等，1991，J.Immunol.，147，86-95。它們可以通過(guò)所有組分克隆(repertoire cloning)來(lái)制備，參見(jiàn)Persson等，1991，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，882432-2436或Huang和Stollar，1991，J.Immunol.Methods 141，227-236；以及美國(guó)專利5,798,230。大型非致敏人噬菌體展示文庫(kù)也可以用于分離高親和力抗體，將它們研發(fā)為人類治療劑，這可以利用標(biāo)準(zhǔn)噬菌體技術(shù)(參見(jiàn)，例如Vaughan等，1996；Hoogenboom等(1998)Immunotechnology 41-20；Hoogenboom等(2000)Immunol Today2371-8；US 2003-0232333)。
本文中，“免疫球蛋白可變區(qū)序列”是指，可形成免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。例如，所述序列可包括天然可變區(qū)的全部或部分氨基酸序列。例如，所述序列可省略1個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)N-端或C-端氨基酸、內(nèi)部氨基酸，可包括一或多個(gè)插入或額外的末端氨基酸，或者可包括其它改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有免疫球蛋白可變區(qū)序列的多肽可以與另一免疫球蛋白可變區(qū)序列結(jié)合，形成靶結(jié)合結(jié)構(gòu)(或“抗原結(jié)合位點(diǎn)”)，例如與KIM-1的指定區(qū)域相互作用的結(jié)構(gòu)。
抗體的VH或VL鏈還可以包括重鏈恒定區(qū)或輕鏈恒定區(qū)的全部或部分，以分別形成免疫球蛋白重鏈或輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是具有兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈的四聚體。免疫球蛋白重鏈和輕鏈可以經(jīng)二硫鍵相連。重鏈恒定區(qū)一般包括三個(gè)恒定區(qū)CH1、CH2和CH3。輕鏈恒定區(qū)一般包括CL區(qū)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)。抗體恒定區(qū)一般介導(dǎo)抗體與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一種成分(Clq))的結(jié)合。
抗體的一或多個(gè)區(qū)可以是人的、被有效人化或人源化。例如，一或多個(gè)可變區(qū)可以是人的或被有效人化。例如，一或多個(gè)CDR，例如HC CDRl，HC CDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2，和LC CDR3可以是人的。每一輕鏈CDR可以是人的。HC CDR3可以是人的。一或多個(gè)框架區(qū)，例如HC或LC的FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3，和FR4可以是人的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所有框架區(qū)都已經(jīng)是人的，例如源自人的體細(xì)胞，例如生成免疫球蛋白的造血細(xì)胞、或非造血細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人的序列是種系(germline)序列，例如由種系核酸編碼的序列。一或多個(gè)恒定區(qū)可以是人的、被有效人化或人源化。在另一實(shí)施方案中，框架區(qū)(如FR1、FR2、和FR3一起，或FR1、FR2、FR3、和FR4一起)的至少70％，75％，80％，85％，90％，92％，95％，或98％或整個(gè)抗體可以是人的、被有效人化或人源化。例如，F(xiàn)R1，F(xiàn)R2，和FR3一起可以至少70％，75％，80％，85％，90％，92％，95％，98％，或99％與由人的種系節(jié)段(germline segment)編碼的人的序列相同。
“有效人化”免疫球蛋白可變區(qū)是，含有足夠數(shù)量的人框架氨基酸位置、因而在正常人體內(nèi)不激發(fā)免疫應(yīng)答的免疫球蛋白可變區(qū)?！坝行嘶笨贵w是，含有足夠數(shù)量的人氨基酸位置、因而不在正常人體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答的抗體。
“人源化”免疫球蛋白可變區(qū)是經(jīng)過(guò)修飾的免疫球蛋白可變區(qū)，所述修飾致使修飾后的形式在人體內(nèi)激發(fā)的免疫應(yīng)答比未經(jīng)修飾的形式激發(fā)的應(yīng)答弱，例如免疫球蛋白可變區(qū)經(jīng)過(guò)修飾含有足夠數(shù)量的人框架氨基酸位置、因而該免疫球蛋白可變區(qū)在正常人體內(nèi)不激發(fā)免疫應(yīng)答。對(duì)“人源化”免疫球蛋白的描述包括例如美國(guó)專利6,407,213和5,693,762。在一些情況中，人源化免疫球蛋白可以在一或多個(gè)框架氨基酸位置包含非人氨基酸。
抗體的全部或部分可以由免疫球蛋白基因或其節(jié)段編碼。人免疫球蛋白基因例如有kappa，lambda，alpha(IgA1和IgA2)，gamma(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，delta，epsilon和mu恒定區(qū)基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。全長(zhǎng)免疫球蛋白“輕鏈”(約25Kd或214個(gè)氨基酸)在NH2-末端(約110個(gè)氨基酸)由可變區(qū)基因編碼，在COOH-末端由kappa或lambda恒定區(qū)基因編碼。同樣，全長(zhǎng)免疫球蛋白“重鏈”(約50Kd或446個(gè)氨基酸)由可變區(qū)基因(約116個(gè)氨基酸)和上述其它恒定區(qū)基因之一，例如gamma(編碼約330個(gè)氨基酸)編碼。
術(shù)語(yǔ)全長(zhǎng)抗體的“抗原結(jié)合片段”是指，全長(zhǎng)抗體的一或多個(gè)保留與目標(biāo)靶特異性結(jié)合的能力的片段。由術(shù)語(yǔ)全長(zhǎng)抗體的“抗原結(jié)合片段”所涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，是單價(jià)片段，由VL，VH，CL和CH1區(qū)組成；(ii)F(ab′)2片段，是二價(jià)片段，包括兩個(gè)經(jīng)二硫橋在鉸鏈區(qū)相連的Fab片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1區(qū)組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂的VL和VH區(qū)組成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341544-546)，由VH區(qū)組成；和(vi)分離的保留功能的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的VL和VH區(qū)分別由不同基因編碼，但可以利用重組方法將它們用合成的連接子連接，使它們能夠形成單鏈蛋白，從而其中的VL和VH區(qū)配對(duì)形成已知為單鏈Fv(scFv)的單價(jià)分子。參見(jiàn)，例如Bird等(1988)Science242423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883。
抗體制備(Antibody Production) 抗體可以在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體(如scFv)在畢赤酵母(Pichia)(參見(jiàn)，例如Powers et al.(2001)J Immunol Methods.251123-35)、漢遜酵母(Hanseula)或糖酵母(Saccharomyces)等酵母細(xì)胞中表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體，尤其是全長(zhǎng)抗體，例如IgG，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生成。用于重組表達(dá)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞例如有，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO細(xì)胞)(包括dhfr-CHO細(xì)胞，見(jiàn)Urlauband Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，使用DHFR選擇標(biāo)記，例如見(jiàn)Kaufman and Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621)、淋巴細(xì)胞系例如NS0骨髓瘤細(xì)胞和SP2細(xì)胞、COS細(xì)胞、K562、以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物)的細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞。
重組表達(dá)載體除了攜帶編碼免疫球蛋白區(qū)的核酸序列，還可以攜帶其它核酸序列，如調(diào)節(jié)該載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的序列(如復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因有利于選出引入了所述載體的宿主細(xì)胞(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利4,399,216、4,634,665和5,179,017)。選擇標(biāo)記基因例如有，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(其利用氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增dhfr-宿主細(xì)胞)和neo基因(其用于G418篩選)。
在一例抗體(如全長(zhǎng)抗體或其抗原結(jié)合部分)重組表達(dá)系統(tǒng)中，將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈兩者的重組表達(dá)載體，通過(guò)磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，引入dhfr-CHO細(xì)胞。在該重組表達(dá)載體中，抗體的重鏈和輕鏈基因各自與增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件(如源自SV40、CMV、腺病毒等，諸如CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件或SV40增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件)可操作相連，以便驅(qū)動(dòng)所述基因的高水平轉(zhuǎn)錄。所述重組表達(dá)載體還可以攜帶DHFR基因，其允許用氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增轉(zhuǎn)染了所述載體的CHO細(xì)胞。對(duì)選出的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使之表達(dá)抗體重鏈和輕鏈，并從培養(yǎng)基中回收完整抗體。用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備所述重組表達(dá)載體，來(lái)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，選出轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中回收抗體。例如，一些抗體可以利用蛋白A或蛋白G通過(guò)親和層析進(jìn)行分離。
抗體還可以包含修飾，例如改變Fc功能的修飾，從而例如減弱或消除與Fc受體和/或與Clq的相互作用。例如，人IgG1恒定區(qū)可以突變一或多個(gè)殘基，例如殘基234和237的一或多個(gè)，編號(hào)例如見(jiàn)美國(guó)專利5,648,260。其它修飾例子可參見(jiàn)美國(guó)專利5,648,260。
對(duì)于一些含F(xiàn)c區(qū)的抗體，可以設(shè)計(jì)抗體制備系統(tǒng)，來(lái)合成含糖基化Fc區(qū)的抗體。例如，IgG分子的Fc區(qū)在CH2區(qū)的天冬酰胺297處糖基化。該天冬酰胺是用雙觸角型寡糖(biantennary-type oligosaccharide)進(jìn)行修飾的位置。這種糖基化參與Fcγ受體和補(bǔ)體Clq所介導(dǎo)的效應(yīng)器功能(Burton andWoof(1992)Adv.Immunol.511-84；Jefferis等(1998)Immunol.Rev.16359-76)。Fc區(qū)可以在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生，從而使對(duì)應(yīng)于天冬酰胺297的殘基適當(dāng)糖基化。Fc區(qū)也可以包含其它的真核細(xì)胞翻譯后修飾。
抗體也可以由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生。例如，美國(guó)專利5,849,992描述了在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳腺中表達(dá)抗體的方法。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因，使其含有乳特異性啟動(dòng)子、編碼目標(biāo)抗體(如本文所述抗體)的核酸序列、以及用于分泌的信號(hào)序列。由這類轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中的雌性動(dòng)物產(chǎn)出的乳汁含有分泌至其中的目標(biāo)抗體(如本文所述抗體)。所述抗體可以從乳汁中純化出來(lái)，或在一些應(yīng)用中，不經(jīng)純化而直接使用。
抗體還可以用例如改進(jìn)其在循環(huán)(如血液、血清、淋巴)、支氣管肺泡灌洗液或其它組織中的穩(wěn)定性和/或滯留時(shí)間的組分(moiety)進(jìn)行修飾，所述改進(jìn)例如是改進(jìn)至少1.5、2、5、10、或50倍。
在一例中，KIM-1結(jié)合抗體可以與聚合物結(jié)合，所述聚合物例如基本上無(wú)抗原性的聚合物，如聚環(huán)氧烷烴(polyalkylene oxide)或聚環(huán)氧乙烷(polyethylene oxide)。合適的聚合物分子量可以差別很大?？梢圆捎梅肿恿科骄s200-約35,000道爾頓(或約1,000-約15,000、以及2,000-約12,500)的聚合物。
在另一例中，KIM-1結(jié)合抗體可以與水溶性聚合物偶聯(lián)，所述聚合物例如親水聚乙烯聚合物，如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。這類聚合物的非限制性例子有，聚環(huán)氧烷烴均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylenated polyols)、它們的共聚物和嵌段共聚物，只要維持所述嵌段共聚物的水溶性即可。其它可用的聚合物包括，聚氧化烯(polyoxyalkylenes)如聚氧化乙烯(polyoxyethylene)、聚氧化丙烯(polyoxypropylene)、以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylates)；丙烯酸共聚物(carbomer)；含有以下單糖的分支或非分支多糖D-甘露糖、D-及L-半乳糖、巖藻糖(fucose)、果糖、D-木糖(xylose)、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸(glucuronic acid)、唾液酸(sialicacid)、D-半乳糖醛酸(galacturonic acid)、D-甘露糖醛酸(mannuronic acid)(如聚甘露糖醛酸或藻酸(alginic acid))、D-葡糖胺(glucosamine)、D-半乳糖胺(galactosamine)、D-葡萄糖和神經(jīng)氨酸(neuraminic acid)包括同多糖(homopolysaccharide)和雜多糖(heteropolysaccharide)如乳糖、支鏈淀粉(amylopectin)、淀粉(starch)、羥乙基淀粉、直鏈淀粉(amylose)、硫酸葡聚糖(dextrane sulfate)、葡聚糖(dextran)、糊精(dextrin)、糖原(glycogen)、或酸性粘多糖(acid mucopolysaccharide)的多糖亞基，如透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)；糖醇聚合物如聚山梨糖醇(polysorbitol)和聚甘露糖醇(polymannitol)；肝素(heparin)或heparon。
用途和給藥方法 在本文所述方法中，對(duì)受試者給藥與KIM-1具體區(qū)域結(jié)合的試劑(如抗體)，以治療Th2介導(dǎo)的疾病或Th1介導(dǎo)的疾病。接受治療的受試者是哺乳動(dòng)物，例如人。
“給藥(Administration)”不限于任何具體的配制劑(formulation)、遞送體系(delivery system)、或途徑，可以包括例如支氣管內(nèi)(intrabronchial)、非胃腸道(包括皮下、靜脈、髓內(nèi)(intramedullary)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intraarticular)、肌肉、或腹腔(intraperitoneal)注射)直腸、表面局部(topical)、經(jīng)皮(transdermal)、或口服(例如膠囊、懸液、或片劑)。給藥可以是，在單次劑量中或在重復(fù)多次劑量中，給藥含有生理可接受的鹽形式和/或可藥用賦形劑(excipient)的多種藥物組合物中的任一種。生理可接受的鹽形式、藥物配制劑、以及賦形劑是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)，例如2004 Physicians’Desk

(PDR)(2003)Thomson Healthcare，第58版；Gennado等，(2000)，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins)RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)。
有多種治療劑可以有效用于管理(management)和治療哮喘。它們包括但不限于，用于放松氣道的支氣管擴(kuò)張劑，如抗膽堿能的支氣管擴(kuò)張劑(如異丙托品(ipratropium bromide)，羥甲叔丁腎上腺素(albuterol)/異丙托品)；用于放松氣道肌肉的beta激動(dòng)劑(如腎上腺素(epinephrine)、間羥異丙腎上腺素(metaproterenol)、間羥叔丁腎上腺素(terbutaline)、甲磺酸乙基異丙腎上腺素(isoetharinemesylate)、乙基異丙腎上腺素(isoetharine)、異丙腎上腺素(isuprel)、吡布特羅(pirbuterol)、羥甲叔丁腎上腺素、沙美特羅(salmeterol)、比托特羅(bitolterol))；用于減少炎癥的口服型或吸入型皮質(zhì)類固醇(如氫化可的松(hydrocortisone)、可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、強(qiáng)的松龍(prednisolone)、強(qiáng)的松(prednisone)、甲基強(qiáng)的松龍(methylprednisolone)、氟尼縮松(flunisolide)、氟羥強(qiáng)的松龍(triamcinolone)、丙酸倍氯米松(beclomethosone)、地塞米松、氟替卡松(fluticasone)、布地縮松(budesonide))；用于防止氣道腫脹并減少粘液生成的白三烯調(diào)節(jié)劑(如扎魯司特(zafirlukast)、孟魯司特鈉(montelukast sodium)、棄白通(zileuton))；以及茶堿(theophylline)，在其多種用途中，包括幫助打開氣道并減少粘液釋放?？瓜瓌┻€包括治療性抗體(或其功能片段)，包括但不限于，抗IgE、抗IL-9、抗IL-3、抗IL-4、抗IL-5、抗IL-13、抗VLA蛋白、和抗移動(dòng)抑制因子(MIF)。本文所述抗體可以與一或多種上述試劑聯(lián)用而治療過(guò)敏性哮喘。
治療劑可以有效管理和治療Th1-介導(dǎo)的炎性疾病，包括抗炎性化合物，如類固醇(steroid)和NSAID。
在一個(gè)動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)有效治療的劑量，可以用已知的換算系數(shù)(conversion factor)換算后用于其它動(dòng)物(包括人)，所述系數(shù)參見(jiàn)例如Freireich等(1966)Cancer Chemother.Reports，50(4)219-244。
以下實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明實(shí)施方案。這些實(shí)施例無(wú)論如何都不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)可以進(jìn)行多種改良和變化。這些改良和變化因此都被本發(fā)明涵蓋。
實(shí)施例 實(shí)施例1鑒定抗小鼠KIM-1的大鼠單克隆抗體 鼠KIM-1的全長(zhǎng)胞外區(qū)表達(dá)構(gòu)建體和僅有IgV區(qū)的表達(dá)構(gòu)建體用標(biāo)準(zhǔn)PCR和克隆技術(shù)產(chǎn)生，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。這些融合蛋白通過(guò)蛋白A層析和SEC層析從CHO細(xì)胞系上清液中純化出來(lái)。與人IgG1-Fc區(qū)融合的全長(zhǎng)KIM-1看上去是雙聯(lián)體(doublet)，與差異糖基化(differentialglycosylation)一致。大鼠用由完整胞外區(qū)組成的全長(zhǎng)小鼠KIM-1-Ig融合蛋白免疫。一組抗mKIM-1的大鼠單克隆抗體用ELISA試驗(yàn)和FACS篩選法進(jìn)行鑒定，其中的一些抗體還通過(guò)Biacore(Biacore表面等離子共振儀)、以及通過(guò)區(qū)(domain)特異性ELISA和Western印跡分析進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，該組中包含結(jié)合不同表位的多種抗體。因此，有7種抗體在Biacore和ELISA分析中結(jié)合全長(zhǎng)蛋白，但其中有4種不與僅編碼IgV區(qū)的蛋白結(jié)合(表1)。在4種于Biacore模式中表現(xiàn)為需要粘蛋白-柄區(qū)的存在才能結(jié)合的抗體中，有3種進(jìn)一步經(jīng)ELISA和Western印跡分析確定與粘蛋白區(qū)結(jié)合，1種則在柄區(qū)結(jié)合(表1)。多種抗體識(shí)別粘蛋白區(qū)中由外顯子4編碼的特有區(qū)(表1)。因此，鑒定出識(shí)別IgV、粘蛋白、以及柄區(qū)的抗體。表1顯示了大鼠抗mKIM-1mAb的總體(gross)表位作圖結(jié)果。表1的數(shù)據(jù)是用KIM-1-Ig的全長(zhǎng)胞外區(qū)(ECD)、KIM-1-IgV-Ig、及KIM-1-Ig蛋白的水解片段進(jìn)行多項(xiàng)試驗(yàn)(Biacore、ELISA、Western印跡、和FACS)匯總得到的。
表1 *預(yù)測(cè)的結(jié)果 實(shí)施例2在高活性肺(hyperactive lung)中誘導(dǎo)KIM-1表達(dá) Balb/c小鼠用OVA/明礬(alum)進(jìn)行兩次引發(fā)免疫(prime)，休息3周后，用噴霧器(nebulizer)使該小鼠連續(xù)3天暴露于OVA氣溶膠。收集肺組織、洗出的(支氣管)淋巴結(jié)(LN)和脾臟，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)KIM-1表達(dá)的誘導(dǎo)情況。在支氣管LN和肺組織中，直到噴霧之后24小時(shí)，KIM-1訊息(message)都被誘導(dǎo)。與KIM-1mRNA水平不同的是，KIM-3mRNA水平在用OVA氣溶膠攻擊后未受到調(diào)節(jié)。KIM-2水平被上調(diào)，其方式與KIM-1相似。
實(shí)施例3抗KIM-1抗體對(duì)OVA-誘導(dǎo)的超反應(yīng)(hyper-responsiveness)的影響 用OVA氣溶膠模型，以及預(yù)防性劑量方案和治療性劑量方案，測(cè)試具有不同的表位特異性的抗KIM-1抗體影響肺部炎癥發(fā)展的能力。
在預(yù)防性研究中，OVA誘導(dǎo)的肺部炎癥和回憶試驗(yàn)(recall assay)如下進(jìn)行Balb/c小鼠在第1天和第7天腹腔(ip)注射100μl 0.5mg/ml OVA(Grade V，Sigma)與100μl ImjectAlum(Pierce，Rockford IL USA)的混合物。第二次注射的三周后，用超聲噴霧器(Devilbiss，Carlsbad CA USA)，使小鼠連續(xù)3天每天暴露于1％OVA-PBS氣溶膠20分鐘。mAbs劑量方案如下在第1，3，6和9天腹腔注射200μg，然后，在開始噴霧的當(dāng)天，腹腔注射500μg。
在治療性研究中，小鼠如上所述用OVA的明礬制劑免疫，但直到馬上要進(jìn)行一系列噴霧之前，一直都未給予mAb即，在第一次噴霧的前一天，給予250μg mAb 4A2，在第二次噴霧的當(dāng)天早上(morning)給予250μg mAb4A2。
在預(yù)防性研究和治療性研究中，都是在最后一次噴霧結(jié)束的兩天后，將小鼠處死，進(jìn)行分析。經(jīng)氣管切開術(shù)(tracheotomy)收集支氣管灌洗液(BAL)，用含0.1％BSA和0.02mM EDTA的PBS洗3次。BAL細(xì)胞用cytospin沉降(pellet)，用載玻片(Shandon，Pittsburgh，PA USA)覆蓋，然后在空氣中干燥，用Hema3染料(Fisher Scientific，Pittsburgh PA USA)染色，鑒別不同的細(xì)胞群。將肺組織收集在中性緩沖的福爾馬林溶液(neutral buffered formalin)中進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)檢查，或者在trizol中速凍(snap-frozen)，接著分離RNA。收集洗出的(支氣管)淋巴結(jié)和脾臟，分離單核細(xì)胞，將這些細(xì)胞放置在含有不同濃度的OVA的RPMI/10％FBS中進(jìn)行培養(yǎng)。72小時(shí)后，收集上清液，細(xì)胞則用1uCi氚標(biāo)記的胸苷(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ USA)脈沖8小時(shí)，平板用Microbetajet system(Wallac，Gaithersburg，MD USA)計(jì)數(shù)。上清液用CBA Th1/Th2及炎癥試劑盒(CBA Th1/Th2 and Inflammation kits，BD Biosciences)和IL-13 ELISA試驗(yàn)(R & D Systems，Minneapolis MN USA)進(jìn)行分析。
結(jié)果 小鼠在OVA引發(fā)免疫階段以及攻擊階段被給予抗體。攻擊后，收集支氣管灌洗液(BAL)、支氣管淋巴結(jié)、脾臟、和肺組織。算出BAL中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、和淋巴細(xì)胞的百分率。mAb 1H8在治療組小鼠的BAL中誘導(dǎo)出高活力(robust)嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，使嗜酸性粒細(xì)胞百分率比對(duì)照高出兩倍還多。另外還發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分率有中等程度的增加，這兩種細(xì)胞構(gòu)成了BAL細(xì)胞組成(cellularity)中的一小部分。與該結(jié)果一致，從經(jīng)1H8處理并經(jīng)OVA體外攻擊的小鼠中分離出的支氣管LN細(xì)胞，比對(duì)照培養(yǎng)物增殖更活躍，且表達(dá)更高水平的Th2相關(guān)細(xì)胞因子。尤其是，相對(duì)于對(duì)照而言，產(chǎn)生了非常高水平的IL-5和IL-13，而IL-4、IL-6、和IL-10的水平也有升高。有趣的是，IFN-γ水平也升高，但該細(xì)胞因子的總體水平較低。優(yōu)先誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子對(duì)于Th1細(xì)胞因子依賴性病理情況，如多發(fā)性硬化(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、克隆病，是有效的。
與1H8不同，在支氣管淋巴結(jié)回憶試驗(yàn)中，mAb 3A2減少BAL中的嗜酸性粒細(xì)胞百分率，并減少Th2相關(guān)細(xì)胞因子的生成(圖2)。即，抗體1H8和3A2在該試驗(yàn)中具有相反的效果。其它幾種抗體，包括識(shí)別IgV區(qū)中的表位的1H9，在該模型中對(duì)于肺部炎癥或細(xì)胞因子生成不產(chǎn)生影響。分析洗出的(支氣管)淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)OVA抗原和3A2體外刺激的反應(yīng)，結(jié)果表明，細(xì)胞對(duì)抗原刺激發(fā)生反應(yīng)而出現(xiàn)的增殖減少(圖3)。此外，分析這些培養(yǎng)物的上清液的結(jié)果表明，Th2細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5、和IL-10的表達(dá)明顯減少(圖4)。該試驗(yàn)中，IL-13的水平也減少。
用抗Ig區(qū)的mAb 4A2進(jìn)行治療，導(dǎo)致經(jīng)OVA致敏并經(jīng)噴霧處理后回流到BAL中的嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞大大減少(圖6)。BAL中的嗜酸性粒細(xì)胞百分率比對(duì)照平均減少84％(p＜0.0001，平均等值檢驗(yàn)(test of meanequivalence))，淋巴細(xì)胞百分率比對(duì)照平均減少90％(p＜0.001，平均等值檢驗(yàn))。當(dāng)支氣管淋巴結(jié)細(xì)胞用OVA再次進(jìn)行體外刺激時(shí)，Th2細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10、和IL-13的生成明顯減少(圖7)?？梢?jiàn)，用mAb 4A2進(jìn)行治療減少了肺部炎癥，并減少了與哮喘反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子的生成。
為了進(jìn)一步鑒定mAb 4A2的臨床效力，進(jìn)行治療性用藥實(shí)驗(yàn)。在該模型中，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，使之對(duì)OVA抗原敏感，但不給予任何mAb治療。然后，讓小鼠休息3周，也是不進(jìn)行任何治療，接下來(lái)，在用1％OVA進(jìn)行3輪噴霧的第1輪開始的前一天，給予4A2 mAb。在第二輪噴霧之前，反復(fù)給予mAb。該治療方案導(dǎo)致肺部炎癥減少，可通過(guò)測(cè)量嗜酸性粒細(xì)胞回流到BAL中的量來(lái)反映(圖8)。嗜酸性粒細(xì)胞百分率平均減少70％(p＜0.001，平均等值檢驗(yàn))?？梢?jiàn)，在OVA誘導(dǎo)肺部炎癥的模型中，mAb 4A2對(duì)于預(yù)防性劑量方案和治療性劑量方案都有效。這提示，4A2所識(shí)別的表位是治療Th2介導(dǎo)的疾病的相關(guān)治療目標(biāo)。
其它抗KIM-1 mAb經(jīng)證實(shí)也在OVA誘導(dǎo)肺部炎癥的模型中具有治療活性，這些抗體包括，例如mAb 2A7和mAb 2B3。在

試驗(yàn)中，結(jié)果顯示，mAb 2A7與4A2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相KIM-1，這表明它們分享相同或重疊的表位。
實(shí)施例4KIM-1抗體對(duì)CD4T細(xì)胞的抗原應(yīng)答的影響 抗KIM-1 mAb的活性用KLH抗原回憶試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。小鼠用抗KIM-1mAb、對(duì)照mAb、或PBS進(jìn)行處理，接著用KLH進(jìn)行免疫，6天后切出洗過(guò)的LN。分離出LN CD4+T細(xì)胞，在有從未處理的小鼠分離得到、并接受了輻射的全部脾細(xì)胞存在的條件下，LN CD4+T細(xì)胞用純化的OVA進(jìn)行體外再刺激。體外刺激的48小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子生成。在該試驗(yàn)中，多種抗KIM-1 mAb有明顯的效果。mAb 1H8大大增加T細(xì)胞對(duì)KLH體外攻擊產(chǎn)生反應(yīng)所導(dǎo)致的細(xì)胞增殖。相反，mAb 3A2在該試驗(yàn)中減少T細(xì)胞增殖。測(cè)定培養(yǎng)物中由接受mAb 1H8處理的細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)處理的培養(yǎng)物比對(duì)照含有更多的IFN-γ和TH2相關(guān)細(xì)胞因子。但TNF和IL-2的水平與對(duì)照相似。
該信息表明，1H8可以減少致病性Th1應(yīng)答。該信息還表明，1H8以及其它結(jié)合KIM-1中本文針對(duì)1H8所限定的區(qū)的抗體可以作為佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，例如增加疫苗效果的方法。上述的佐劑活性(adjuvancy)也可以用在免疫接種、免疫缺陷、以及抗腫瘤免疫中。
在Western印跡中，1H8結(jié)合Balb/C序列的KIM-1ECD但不結(jié)合Dba/2序列的KIM-1 ECD。這表明，該抗體結(jié)合另路剪接的、具有序列EPTTFCPHETTAEVTGIPSHTPT(SEQ ID NO2)的小鼠等位基因變體。所述序列與人KIM-1的序列VATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTT(SEQ ID NO1的氨基酸200-235)對(duì)應(yīng)。
實(shí)施例5鑒定mAb 3A2 鑒于3A2mAb在OVA模型中顯示治療效果，因此更詳細(xì)鑒定了它與KIM-1的結(jié)合。
在ELISA試驗(yàn)中，用多種純化蛋白測(cè)定mAb 3A2的表位(表2)。就3A2與固相蛋白的相互作用生成全部結(jié)合曲線(圖5)。MAb 3A2與下列小鼠蛋白等效結(jié)合鼠KIM-1胞外區(qū)(KIM-1-ECD-1-216)、mKIM-1-137-216和mKIM-1-196-216-Fc。相反，mAb 3A2不與單獨(dú)的mKIM-1-IgV區(qū)結(jié)合，該區(qū)缺乏完整的粘蛋白和柄區(qū)。該信息表明，3A2的表位在mKIM-1的196-216位所示21個(gè)氨基酸殘基中，該區(qū)域是KIM-1柄區(qū)的一部分。此表位等同于人KIM-1的247-272，見(jiàn)圖1。
表2 由于包含小鼠KIM-1的氨基酸196-216(對(duì)應(yīng)于人KIM-1的氨基酸247-272)的柄區(qū)含有N-糖基化位點(diǎn)，因此有興趣測(cè)定，是否糖分子與N-糖基化位點(diǎn)結(jié)合是3A2結(jié)合所必需的。對(duì)糖基化和去糖基化的KIM-1-196-216-Fc進(jìn)行Western印跡分析(圖2)。結(jié)果表明，去糖基化(deglycosylation)不影響3A2與KIM-1-196-216-Fc結(jié)合的能力。可見(jiàn)，糖分子并非3A2識(shí)別其表位時(shí)所必需的結(jié)構(gòu)。
為了確定3A2是否抑制KIM-1從細(xì)胞表面釋出，將經(jīng)過(guò)KIM-1轉(zhuǎn)染的E293細(xì)胞用5ug/mL 3A2、25ug/mL 3A2或無(wú)3A2的對(duì)照進(jìn)行處理。從兩組3A2處理組的細(xì)胞獲得的上清液表明，在用生物素化1H8抗體進(jìn)行的Western印跡中，KIM-1染色與對(duì)照無(wú)差別。這提示，3A2不阻止KIM-1的釋出。
實(shí)施例6.鑒定4A2 mAb 經(jīng)ELISA和Biacore分析證實(shí)，mAb 4A2識(shí)別鼠KIM-1的Ig-區(qū)(圖9，表1)。為進(jìn)一步鑒別mAb 4A2所識(shí)別的表位，將單獨(dú)的重組鼠KIM-1 IgV-人IgG1 Fc融合蛋白、或其與4A2的復(fù)合物，用TPCK胰蛋白酶消化。單獨(dú)的KIM-1產(chǎn)生8kDa的條帶，而與4A2結(jié)合時(shí)不產(chǎn)生該條帶。這表明，4A2與KIM-1結(jié)合封閉了產(chǎn)生該條帶所必需的裂解位點(diǎn)，使之不能被胰蛋白酶接近。該8kDa條帶在非還原條件下進(jìn)行消化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4A2保護(hù)與人KIM-1序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO1的氨基酸81-107)對(duì)應(yīng)的片段。因此，4A2抗體保護(hù)TPCK胰蛋白酶位點(diǎn)，所述位點(diǎn)至少部分位于SEQ ID NO1的氨基酸81-107中，或與該區(qū)域重疊。
用2A7進(jìn)行同樣的TPCK胰蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)，得到差不多相同分子量的條帶。用1H9進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)未得到該條帶，鑒于1H9是在哮喘模型中無(wú)效力但也與Ig區(qū)結(jié)合的mAb，上述結(jié)果表明，該表位與在哮喘中的效力有關(guān)(track with)。
本說(shuō)明書可參照文中引用的參考文獻(xiàn)的指教進(jìn)行最全面的理解。說(shuō)明書中的實(shí)施方案是對(duì)本發(fā)明的舉例說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地認(rèn)識(shí)到，多種其它的實(shí)施方案也被本發(fā)明覆蓋。本文中提到的所有出版物、專利以及生物序列都完整引入作參考。當(dāng)引入作為參考的信息與本說(shuō)明書沖突或者不一致時(shí)，本說(shuō)明書將取代任何這類信息。本文中對(duì)任何參考文獻(xiàn)的引用并不表示承認(rèn)這些文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
除非另外指明，本說(shuō)明書包括權(quán)利要求書中用到的表示成分含量、細(xì)胞培養(yǎng)、處理?xiàng)l件等等的所有數(shù)字，都應(yīng)被理解為在所有情況下可以用術(shù)語(yǔ)“約”進(jìn)行調(diào)整。相應(yīng)地，除非有相反指示，參數(shù)數(shù)字是近似值，可以根據(jù)需要由本發(fā)明進(jìn)行改變。除非另外指明，出現(xiàn)在一系列元素(element)之前的術(shù)語(yǔ)“至少”應(yīng)被理解為指該系列中的每一個(gè)元素。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，或者能夠確定，僅僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，就可以得到本文所述發(fā)明的具體實(shí)施方案的多種等價(jià)方案。這些等價(jià)方案都打算被權(quán)利要求書覆蓋。
<110>比奧根艾迪克MA公司(Biogen Idec MA Inc)
Rennert，Paul
McCoon，Patricia
Bailly，Veronique
Lugovskoy，Alexey
<120>用于治療TH2介導(dǎo)的疾病的KIM-1抗體
<130>P0643
<150>60/657,789
<151>2005-03-02
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>339
<212>PRT
<213>人
<400>1
Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val Thr Leu Pro Cys
1 5 10 15
His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn Arg Gly Ser Cys
20 25 30
Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr Asn Gly Thr His
35 40 45
Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Asp Leu Ser
50 55 60
Arg Arg Asp Val Scr Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala Val Ser Asp Scr
65 70 75 80
Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met
85 90 95
Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys Val Thr Thr Thr
100 105 110
Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val Arg Thr Ser Thr
115 120 125
Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr
130 135 140
Met Ser Ile Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Thr Val Ser
145 150 155 160
Thr Thr Thr Scr Val Pro Thr Thr Thr Ser Ilc Pro Thr Thr Thr Scr
165 170 175
Val Pro Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro Pro Met Pro Leu
180 185 190
Pro Arg Gln Asn His Glu Pro Val Ala Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gln
195 200 205
Pro Ala Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gln Gly Ala Ile Arg Arg Glu
210 215 220
Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr
225 230 235 240
Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn Gln Thr Gln Leu
245 250 255
Phc Leu Glu His Scr Leu Leu Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly Ilc Tyr
260 265 270
Ala Gly Val Cys Ile Ser Val Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Val
275 280 285
Ile Ile Ala Lys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val Gln Gln Leu Ser
290 295 300
Val Ser Phe Ser Ser Leu Gln Ile Lys Ala Leu Gln Asn Ala Val Glu
305 310 315 320
Lys Glu Val Gln Ala Glu Asp Asn Ile Tyr Ile Glu Asn Ser Leu Tyr
325 330 335
Ala Thr Asp
<210>2
<211>23
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
Glu Pro Thr Thr Phe Cys Pro His Glu Thr Thr Ala Glu Val Thr Gly
1 5 10 15
Ile Pro Ser His Thr Pro Thr
20
權(quán)利要求
1.治療哺乳動(dòng)物中Th2介導(dǎo)的疾病的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給藥與KIM-1柄區(qū)結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是特應(yīng)性。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是哮喘。
5.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗體與至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO1的氨基酸236-269)中的表位結(jié)合。
6.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗體是人源化抗體或者完全是人的單特異性抗體。
7.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗體是人源化抗體或者完全是人的單特異性抗體，且所述抗體與至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO1的氨基酸236-269)中的表位結(jié)合。
8.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中給藥了全長(zhǎng)抗體。
9.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中給藥了全長(zhǎng)抗體，且所述抗體與至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO1的氨基酸236-269)中的表位結(jié)合。
10.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中給藥了抗體的抗原結(jié)合片段。
11.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中給藥了抗體的抗原結(jié)合片段，且所述抗體與至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO1的氨基酸236-269)中的表位結(jié)合。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗原結(jié)合片段選自單鏈抗體，F(xiàn)ab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、以及dAb片段。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述抗原結(jié)合片段選自單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab′)2片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段，和dAb片段。
14.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與針對(duì)該疾病的第二種治療劑聯(lián)用。
15.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與針對(duì)該疾病的第二種治療劑聯(lián)用，且所述抗體與至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO1的氨基酸236-269)中的表位結(jié)合。
16.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段的用量為0.05-20mg/kg。
17.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段的用量為0.05-20mg/kg，且所述抗體與至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO1的氨基酸236-269)中的表位結(jié)合。
18.分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段與KIM-1柄區(qū)特異性結(jié)合，其中所述抗體不抑制KIM-1從培養(yǎng)的E293細(xì)胞中釋出。
19.權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗體與具有選自下組的序列的肽結(jié)合
(a)SEQ ID NO1的氨基酸262-270，
(b)SEQ ID NO1的氨基酸260-269，
(c)SEQ ID NO1的氨基酸257-270，
(d)SEQ ID NO1的氨基酸252-270，
(e)SEQ ID NO1的氨基酸236-250，和
(f)SEQ ID NO1的氨基酸236-258。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體是人源化抗體或者完全是人的單特異性抗體。
21.權(quán)利要求19的方法，其中給藥了全長(zhǎng)抗體。
22.權(quán)利要求19的方法，其中給藥了所述抗體的抗原結(jié)合片段。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與針對(duì)該疾病的第二種治療劑聯(lián)用。
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段的用量為0.05-20mg/kg。
25.在哺乳動(dòng)物中治療Th1介導(dǎo)的疾病或減弱致病性Th1應(yīng)答的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給藥與人KIM-1的序列VATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTT(SEQ ID NO1的氨基酸200-235)或覆蓋該序列的表位結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述抗體是人源化抗體或者完全是人的單特異性抗體。
28.權(quán)利要求25的方法，其中給藥了全長(zhǎng)抗體。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述給藥了所述抗體的抗原結(jié)合片段。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與針對(duì)該疾病的第二種治療劑聯(lián)用。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段的用量為0.05-20mg/kg。
32.治療哺乳動(dòng)物中Th2介導(dǎo)的疾病的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給藥與KIM-1的唾液酸結(jié)合基元結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述抗體與包含在具有序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO1的氨基酸29-42)的肽中或與所述肽重疊的表位至少部分地結(jié)合。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述抗體與連續(xù)氨基酸殘基GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO1的氨基酸29-42)的線性表位結(jié)合。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述抗體與由序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO1的氨基酸81-107)和RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO1的氨基酸29-42)之一或兩者組成的結(jié)構(gòu)性表位結(jié)合。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述抗體保護(hù)SEQ ID NO1的氨基酸81-107。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述抗體干擾SEQ ID NO1的殘基R86、W92和F93中的一個(gè)或多個(gè)。
38.權(quán)利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
39.權(quán)利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中所述疾病是特應(yīng)性。
40.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是哮喘。
41.權(quán)利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中所述抗體是人源化抗體或者完全是人的單特異性抗體。
42.權(quán)利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中給藥了全長(zhǎng)抗體。
43.權(quán)利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中給藥了所述抗體的抗原結(jié)合片段。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗原結(jié)合片段選自單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、以及dAb片段。
45.權(quán)利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與針對(duì)該疾病的第二種治療劑聯(lián)用。
46.權(quán)利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段的用量為0.05-20mg/kg。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療Th2-介導(dǎo)的疾病和Th1-介導(dǎo)的疾病的組合物和方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101166542SQ200680013989
公開日2008年4月23日 申請(qǐng)日期2006年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月2日
發(fā)明者保羅·D·倫納特, 帕特里夏·麥庫(kù)恩, 弗羅尼克·貝利, 亞歷克西·盧戈夫斯科伊 申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司