專利名稱：使用熱休克治療眼睛疾病的制作方法
使用熱休克治療眼睛疾病 與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)主張以下美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案；第60/703,068號(hào)，申請(qǐng)于2005 年7月27日，及第60/729， 182號(hào)申請(qǐng)于2005年10月21日的權(quán)益。 這些申請(qǐng)的完整內(nèi)容于此并入本案作為參考。 聯(lián)邦政府贊助研究下完成本發(fā)明的權(quán)利申明這個(gè)成果是由國(guó)家眼科研究所資金贊助，資金號(hào)EY016070-01。 政府可擁有本發(fā)明的權(quán)利。 發(fā)明背景在西方國(guó)家，與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變(ARMD)是致盲的最 普遍原因。因此，ARMD是一種非常重要的公共健康問題。約有85%至 90%的病人患有非滲出性(干)形式ARMD。其由視網(wǎng)膜色素上皮萎縮、 去色素及視網(wǎng)膜色素上皮損失所組成。干性ARMD好發(fā)于老年人群，嚴(yán) 重影響其生活質(zhì)量。而可選擇的治療有限。除了營(yíng)養(yǎng)與維他命的補(bǔ)充 外，對(duì)此形式的疾病并無(wú)特效治療。目前，對(duì)于ARMD的治療手段是無(wú) 效的。所以，迫切需要改進(jìn)的治療方法。 發(fā)明概括如下文所述，本發(fā)明特別記載治療眼睛疾病的方法，其通過引發(fā) 熱休克反應(yīng)，聚集干細(xì)胞至眼睛以修復(fù)損傷組織。在第一方面，本發(fā)明特別記載一種改善對(duì)象的眼睛疾病的方法。 該方法包括在眼睛組織的至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)引發(fā)熱休克；及聚集干細(xì)胞 至該眼睛組織，從而改善眼睛失調(diào)。在一個(gè)具體例中，在眼睛組織內(nèi) 使用低于可見閾激光(sub-visible threshold, SVL)刺激來(lái)引發(fā)熱 休克。在另一具體例中，熱休克的引發(fā)是使用一種小分子化合物，其 選自由格爾德霉素、雷公藤紅素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉 素、EC102、根赤殼菌素、二牛龍牛兒基丙酮(geranylgeranylacetone)、 芍藥苷、PU-DZ8及H-71組成的群組。在又一具體例中，熱休克的引發(fā)是使用熱休克多肽，或是使用含有編碼熱休克多肽(如Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40)的多核苷酸的表達(dá)載體。在又一個(gè)具體例中， 熱休克多肽是Hsp70或Hsp90。在又另一個(gè)具體例中，干細(xì)胞是骨髓衍 生細(xì)胞，如造血干細(xì)胞。在又另一個(gè)具體例中，該方法降低至少該眼 睛疾病或失調(diào)的一種癥狀。在更進(jìn)一步的具體例中，該眼睛疾病或失 調(diào)是糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管化、青光眼視網(wǎng)膜色素病變、 與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變、青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜先天 性裂(retinoschises)、斯特格病變(Stargardt's Disease)、常染色 體顯形玻璃膜疣、及貝斯特黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(Best' s macular dystr叩hy)、黃斑囊樣水腫、視網(wǎng)膜脫離、光損傷、缺血性視網(wǎng)膜病 變、炎癥引發(fā)的視網(wǎng)膜病變、X伴性青年性視網(wǎng)膜先天性裂、青光眼、 莫拉蒂致拉分提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂巢狀視網(wǎng) 膜萎縮的任何一種或更多種。在另一方面，本發(fā)明提供一種聚集干細(xì)胞至需要它們的對(duì)象眼睛 組織的方法。該方法包括以閾下激光刺激眼睛組織，其中刺激程度是 足夠使至少一個(gè)干細(xì)胞聚集至該組織。在多個(gè)具體例中，激光治療特 載的工作期(duty cycle)為10%或15%;閾下激光具有波長(zhǎng)自至少約 100nm至2000nm (如100、 200、 250、 300、 500、 750、 1000、 1250、 1500、1750、2000)。在又一個(gè)具體例中，閾下激光能是自約5mW至200mW (如5、 10、 25、 50、 75、 100、 125、 50、 175、 200mW)并于具有持續(xù) 時(shí)間為自約0, OOlmsec至1. Omsec (如0.001、 0.005、 0.01、 0.025、 0.5、 0. 75或1.0msec)的微脈沖進(jìn)行。在其他具體例中，激光能是自 約10mW至100mW (如5、 10、 25、 50、 75、 100、 125、 50、 175、 200mW) 且微脈沖持續(xù)時(shí)間為0. lmsec。在又一個(gè)具體例中，該刺激提高熱休克 蛋白質(zhì)的表達(dá)或生物活性，該熱休克蛋白選自由Hspl00、Hsp90、Hsp70、 Hsp60及Hsp40組成的群組。在另一個(gè)具體例中，該提高為至少約為5、 10、 20、 25、 50、 75或100%或更多。在又一個(gè)具體例中，該刺激改變 一種蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性，該蛋白質(zhì)選自由SDF-1 、 VEGF、 HIF-lci、 晶狀球體蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子I- a (HIF-la)及CXCR-4所組成的群組。 在另外其它的具體例中，該方法提高Hsp70或Hsp90多肽的表達(dá)為至 少10倍、20倍、40倍、50倍或更多。在又另一方面，本發(fā)明提供一種聚集干細(xì)胞至需要它們的對(duì)象眼 睛組織的方法。該方法包括向?qū)ο笸队米銐蛄康脑噭┮栽谘劬M織內(nèi) 引發(fā)熱休克；及聚集干細(xì)胞至該眼睛組織。在又另一方面，本發(fā)明提供一種改善需要的對(duì)象的眼睛疾病或失 調(diào)的方法。該方法包括向?qū)ο笸队米銐蛄康脑噭┮栽谘劬M織內(nèi)引發(fā) 熱休克；及聚集千細(xì)胞至該眼睛組織，從而改善該眼睛疾病或失調(diào)。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種使需要的對(duì)象視網(wǎng)膜再生的方 法。該方法包括向?qū)ο笸队米銐蛄康脑噭┮栽谘劬M織內(nèi)弓i發(fā)熱休克； 及聚集千細(xì)胞至該眼睛組織，從而使視網(wǎng)膜再生。在另一相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種修復(fù)需要的對(duì)象視網(wǎng)膜色素上 皮損失的方法。該方法包括向?qū)ο笸队米銐蛄康脑噭┮栽谘劬M織內(nèi) 引發(fā)熱休克；及聚集干細(xì)胞至該眼睛組織，從而修復(fù)視網(wǎng)膜色素上皮。在另一相關(guān)方面，本發(fā)明特載一種改善需要的對(duì)象眼睛疾病或失 調(diào)的方法。該方法包括向?qū)ο笸队脛?dòng)員對(duì)象體內(nèi)骨髓衍生干細(xì)胞的試 劑；在眼睛組織內(nèi)引發(fā)熱休克；及聚集干細(xì)胞至該眼睛組織，從而改 善該眼睛疾病或失調(diào)。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明特載一種改善需要的對(duì)象黃斑退行性改 變的方法。該方法包括向?qū)ο笸队肎M-CSF及/或干細(xì)胞因子，其中該 投用動(dòng)員對(duì)象體內(nèi)骨髓衍生干細(xì)胞；通過投用閾下激光治療或藥學(xué)試 劑來(lái)引發(fā)熱休克；及聚集該骨髓衍生干細(xì)胞至該眼睛組織，從而改善 黃斑退行性改變。在另一方面，本發(fā)明特載一種聚集干細(xì)胞的藥學(xué)組合物，該組合 物含有為眼睛投藥而配制在藥學(xué)可接受的賦形劑內(nèi)的有效量的小分子 化合物，其選自由格爾德霉素、雷公藤紅素、17-丙烯胺基-17-去甲氧 基格爾德霉素、EC102、根赤殼菌素、二牛龍牛兒基丙酮、芍藥苷、PU-DZ8 及H-71組成的群組。在另一方面，本發(fā)明特載一種于眼睛組織聚集干細(xì)胞的藥學(xué)組合 物，該組合物含有為眼睛投藥而配制在藥學(xué)可接受的賦形劑內(nèi)的含有 編碼熱休克多肽(如Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40)的多 核苷酸的表達(dá)載體。在另一方面，本發(fā)明特載一種于眼睛組織聚集干細(xì)胞的藥學(xué)組合物，該組合物含有為眼睛投藥而配制在藥學(xué)可接受的賦形劑內(nèi)的多肽(如Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40)。在又另一方面，套組包括能在眼睛組織引發(fā)熱休克的有效量試劑 (如多肽、多核苷酸或小分子化合物)，及使用該套組提高干細(xì)胞聚集 的說明指導(dǎo)。在不同的具體例中，該多肽是Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40。在另外的具體例中，該多核苷酸編碼Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40。在其它具體例中，該小分子化合物選自由格 爾德霉素、雷公藤紅素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素、EC102、 根赤殼菌素、二牛龍牛兒基丙酮(geranylgeranylacetone)、芍藥苷、 PU-DZ8及H-71組成的群組。在另一方面，本發(fā)明特載一種識(shí)別于眼睛組織內(nèi)提高干細(xì)胞聚集 的試劑的方法，該方法包括將一眼睛細(xì)胞與一測(cè)試化合物接觸；相對(duì) 于未處理眼睛細(xì)胞，識(shí)別熱休克多肽的表達(dá)或活性的提高，由此識(shí)別 提高干細(xì)胞聚集的化合物。在又一方面，本發(fā)明特載一種識(shí)別于眼睛組織內(nèi)提高干細(xì)胞聚集 的試劑的方法，該方法包括將眼睛細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；及識(shí)別該 組織內(nèi)干細(xì)胞數(shù)目的增加。在任何以上方面的不同具體例中，該對(duì)象患有的眼睛疾病或失調(diào) 為選自糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管化、青光眼視網(wǎng)膜色素病 變、與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變、青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜 先天性裂(retinoschises)、斯特格病變(Stargardt， s Disease)、 常染色體顯形玻璃膜疣及貝斯特黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(Best' s macular dystrophy)、黃斑囊樣水腫、視網(wǎng)膜脫離、光損傷、缺血性視網(wǎng)膜病 變、炎癥引發(fā)的視網(wǎng)膜病變、X伴性青年性視網(wǎng)膜先天性裂、青光眼、 莫拉蒂致拉分提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂巢狀視網(wǎng) 膜萎縮。在任何以上方面的其它具體例中，該試劑提高一種熱休克蛋 白質(zhì)的表達(dá)或生物活性，該熱休克蛋白選自由Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40組成的群組。在其它具體例中，該刺激改變?nèi)我环N或 更多種下述蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性，這些蛋白質(zhì)為SDF-1 、 VEGF 、 HIF-1 a 、晶狀球體蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子1-a (HIF-la)及CXCR-4。在以 上方面的其它具體例中，該方法提高Hsp70或Hsp90多肽的表達(dá)為至少10倍或?yàn)橹辽?0倍。在任何以上方面的其它具體例中，在熱休克反應(yīng)引發(fā)之前，向?qū)ο笸队锰岣咴煅杉?xì)胞動(dòng)員作用(如GM-CSF及/ 或SCF)的試劑。在任何以上方面的其它具體例中，該方法更進(jìn)一歩包 括投用抗炎劑或抗血管生成劑。在其它具體例中，該方法更進(jìn)一步包 括投用一試劑，其支持造血干細(xì)胞的存活，增生，或轉(zhuǎn)分化 (transdifferentiation)。在任何以上方面的其它具體例中，該方法更進(jìn)一步包括投用全反式維甲酸以增加干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜色素上 皮細(xì)胞。在任何以上方面的其它具體例中，干細(xì)胞動(dòng)員劑是巨噬細(xì)胞 集落剌激因子或千細(xì)胞因子。在任何以上方面的其它具體例中，熱休 克的引發(fā)是使用閾下激光處理或使用試劑，其為小分子化合物、多肽， 或置于適當(dāng)位置以于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的核苷酸分子。在任何以上方面的其 它具體例中，該多肽是熱休克多肽。在另一具體例中，該核苷酸編碼 熱休克多肽(如Hsp70或Hsp90)或編碼治療性多肽(如，抗炎多肽或 抗血管生成調(diào)節(jié)劑)。在任何以上方面的其它具體例中，該藥學(xué)試劑是 選自格爾德霉素、雷公藤紅素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素、 EC102、根赤殼菌素、二牛龍牛兒基丙酮(geranylgeranylacetone)、 芍藥苷、PU-DZ8及H-71。在任何以上方面的不同具體例中，該試劑通 過玻璃體腔(intravitreal)或眼球后注射而投用。在任何以上方面的 其它具體例中，該投用引發(fā)RPE層的細(xì)胞修復(fù)。在任何以上方面的另 外其它具體例中，該方法進(jìn)一步包括投用編碼治療性多肽的載體。在 任何以上方面的另外其它具體例中，該方法進(jìn)一步包括向?qū)ο笸队脤?shí) 質(zhì)上純化的干細(xì)胞(如骨髓衍生細(xì)胞或造血干細(xì)胞)。在任何以上方面 的另外其它具體例中，該干細(xì)胞是通過局部地玻璃體腔或眼球后感染 而投用或是全身性地投用。本發(fā)明提供治療多種眼睛疾病的方法。通過詳細(xì)說明書與權(quán)利要 求本發(fā)明的其它特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)將屬明顯。定義「試劑」是指任何小分子化合物、抗體、核酸分子或多肽，或相 似體片段?！父淖儭故侵竿ㄟ^如上文描述的標(biāo)準(zhǔn)習(xí)知技術(shù)所偵測(cè)的基因或多 肽的表達(dá)水平的變化(升高或降低)。如這里所使用的，改變包括表達(dá)水平的10%的變化，優(yōu)選為25%的變化，更優(yōu)選為40%的變化，及最優(yōu) 選為50%或更大的表達(dá)水平變化?！父纳啤故侵附档?、抑制、削弱、消除、阻止、或穩(wěn)定疾病的發(fā) 展(development)或進(jìn)行(progression)。「相似體(analog)」是指具有參考性多肽或核酸分子功能的結(jié)構(gòu) 相關(guān)多肽或核酸分子?！笩嵝菘说鞍踪|(zhì)的生物活性」是指伴侶活性或干細(xì)胞聚集活性?！富衔铩故侵溉魏涡》肿踊衔?、抗體、核酸分子或多肽，或 其片段。在本揭示內(nèi)容中，「包括」、「含有」及「具有」及其相似者的意義 可具有美國(guó)專利法中歸屬于它們的意義，可意指「包含」及其相似者； 「本質(zhì)上由…所組成」與「本質(zhì)上組成」其含義同樣具有美國(guó)專利法 中歸屬于它們的意義且該術(shù)語(yǔ)為開放式的，以允許多于所述內(nèi)容的出 現(xiàn)，只要其基本或新穎特性并未由其存在而改變，但排除先前技術(shù)的 具體例?！缚蓚蓽y(cè)的標(biāo)簽(label)」是指一組合物，其結(jié)合于感興趣的分子 并賦予后者可偵測(cè)性，該可偵測(cè)性是通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、 免疫化學(xué)或化學(xué)手段偵測(cè)。例如，有用的標(biāo)簽包括放射性同位素、磁 珠、金屬珠、膠粒、螢光染料、電子密度試劑、酶(例如，通常使用 于ELISA者)，生物素、地高辛(Digoxigenin)或半抗原?！笜?biāo)記的(labeled)核酸或多肽」是指一種要么就共價(jià)地通過連接 子或化學(xué)鍵，不然就是非共價(jià)地通過離子鍵、范德華力、靜電吸引、 疏水作用或氫鍵而與探針結(jié)合者，以使得可通過偵測(cè)標(biāo)簽結(jié)合至核酸 或探針的出現(xiàn)而可偵測(cè)核酸或探針的出現(xiàn)?！副磉_(dá)載體」是指由重組或合成產(chǎn)生的核酸結(jié)構(gòu)(construct),其 具有一系列特定核酸元素，可使宿主細(xì)胞內(nèi)特定基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄。通常， 基因表達(dá)受到特定調(diào)節(jié)元素所控制，該調(diào)節(jié)元素包含組成型或誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子、組織優(yōu)先調(diào)節(jié)元素及增強(qiáng)子?！钙巍故侵付嚯幕蚝怂岱肿拥囊徊糠?。該部分含有，優(yōu)選為參 考核酸分子或多肽的完整長(zhǎng)度的至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 600/0、 70%、 80%或90%。片段可含有10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90或100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900或1000個(gè)核苷酸 或氨基酸?！笩嵝菘恕故侵笇?duì)于熱應(yīng)力(heat stress)的任何細(xì)胞反應(yīng)。通常， 細(xì)胞透過提高熱休克多肽(如Hsp70或90)的轉(zhuǎn)錄或翻譯對(duì)熱休克作 出反應(yīng)?！笩嵝菘硕嚯摹故侵讣?xì)胞對(duì)熱應(yīng)力做出反應(yīng)所表達(dá)的任何多肽。 示范性的熱休克多肽包括但不局限于，HsplOO、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60 及Hsp40?；驇?kù)存取號(hào)(GenBankAccession No.) AAA02807提供了示 范性Hsp70氨基酸序列?；驇?kù)存取號(hào)P08238 ， NP 005339, NP 001017963及P07900提供了例式性Hsp90氨基酸序列樣例。「熱休克反應(yīng)激活物」是指化合物，其提高熱休克途徑成分的伴 侶活性或表達(dá)。熱休克途徑成分包含但不局限于Hspl00、Hsp90、Hsp70、 Hsp60、 Hsp40及小HSP家族成員。引發(fā)熱休克的試劑或治療通常提高 Hsp70或Hsp90的至少其中之一的表達(dá)或活性?！冈煅杉?xì)胞」是指能夠成為造血系統(tǒng)(hematopoietic lineage) 中一種或更多種分化的細(xì)胞的骨髓衍生細(xì)胞。「造血干細(xì)胞動(dòng)員」是指增加可用于聚集至需要的治療器官或組 織的骨髓細(xì)胞數(shù)量?！秆劬膊』蚴д{(diào)」是指影響眼睛正常功能的病變?！缚刹倏v地連接」是指第一個(gè)多核苷酸被放在與第二個(gè)多核苷酸 相鄰的位置，而當(dāng)恰當(dāng)?shù)姆肿?如轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì))結(jié)合至第二多核 苷酸時(shí)，其第二個(gè)多核苷酸指示第一個(gè)多核苷酸轉(zhuǎn)錄?！付嚯摹故侵覆还苕滈L(zhǎng)或翻譯后修飾的任何氨基酸鏈?！笧楸磉_(dá)而定位」是指本發(fā)明的多核苷酸(如DNA分子)是位于 與一種DNA序列相鄰的位置，其指示該序列轉(zhuǎn)錄及翻譯(如促進(jìn)，例 如本發(fā)明的重組多肽，或RNA分子的生成)?！竼?dòng)子」是指足以指示轉(zhuǎn)錄的多核苷酸。示范性啟動(dòng)子包含為 翻譯起始位點(diǎn)上游(如，緊接上游)的長(zhǎng)度為100、 250、 300、 400、 500、 750、 900、 1000、 1250及1500個(gè)核苷酸的核酸序列?！妇奂故侵肝⑷胫两M織?！附档汀够颉柑岣摺故侵肛?fù)向或正向改變，各自為至少10%、 25。/。、50%、 75%或100%?！甘挂暰W(wǎng)膜再生」是指增加視網(wǎng)膜或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的數(shù)目、 存活或增生?！感迯?fù)視網(wǎng)膜色素上皮損傷(damage)」是指改善視網(wǎng)膜色素上皮 傷害(injury)、損傷或細(xì)胞死亡?！父杉?xì)胞」是指能生成一種或更多種分化細(xì)胞類型的祖細(xì)胞。「對(duì)象」是指哺乳動(dòng)物，包含但不局限于，人類或非人類哺乳動(dòng) 物，如牛科動(dòng)物、馬科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、綿羊或貓科動(dòng)物?！搁撓录す狻故侵敢环N激光治療，其引發(fā)于治療過程中或之后在 視網(wǎng)膜內(nèi)的不可偵測(cè)或勉強(qiáng)可偵測(cè)的損害(lesion)。當(dāng)少量或沒有術(shù) 中可見組織反應(yīng)出現(xiàn)，或當(dāng)少量或是沒有細(xì)胞由于機(jī)光治療而死亡(如 于處理過的組織中少于10°/。、 5%、 2. 5%或1%的細(xì)胞死亡或凋亡)則損害 為不可偵測(cè)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)「治療」、「治療法」及其相似者是指降低 或改善失調(diào)及/或與其相關(guān)征狀。盡管并未排除，但是治療失調(diào)或狀況 (condition)并不要求該失調(diào)、狀況或與其相關(guān)征狀被完全地消除。如同本文所使用的，術(shù)語(yǔ)「預(yù)防」，「預(yù)防疾病治療」及其相似者 是指降低在并未患有，但存在發(fā)展失調(diào)或狀況的風(fēng)險(xiǎn)或易受影響而發(fā) 展失調(diào)或狀況的對(duì)象發(fā)展失調(diào)或狀況的可能性。 「參考」是指標(biāo)準(zhǔn)或控制狀況?！皋D(zhuǎn)分化」是指改變細(xì)胞，以使其表達(dá)至少一種特性上由另一個(gè) 不同類型細(xì)胞所表達(dá)的多肽。 圖示簡(jiǎn)要說明

圖1顯示一系列眼睛組織載片。圖1中黑色區(qū)域表示GFP+細(xì)胞，其 已并入于RPE層內(nèi)接收到激光的區(qū)域。通過對(duì)側(cè)(未影響)的眼睛所決 定的值，移除背景螢光。圖2顯示定量并入于視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的造血干細(xì)胞(HSC) 的圖表。圖3顯示得自接受眼球下GFP+HSC注射及使用格爾德霉素衍生物 D28或H71而藥學(xué)上引發(fā)熱休克的組合的老鼠的眼睛組織載片；接受 HSP70多肽注射的一系列面板圖。發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明特載適用于治療或預(yù)防眼睛疾病的組合物或方法。本發(fā)明 至少部分基于發(fā)現(xiàn)激光或藥學(xué)上引發(fā)視網(wǎng)膜色素上皮層與脈絡(luò)膜內(nèi)的熱休克所引起的造血千細(xì)胞聚集于RPE，其中該造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為表 達(dá)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異標(biāo)記的細(xì)胞。為了不被理論束縛，此歸路 (homing)反應(yīng)是至少部分歸因于熱休克反應(yīng)的活化。如下文詳細(xì)敘述，視網(wǎng)膜色素上皮及脈絡(luò)膜的低于可見閾下激光 刺激是用來(lái)將HSC聚集至RPE層。GFP標(biāo)記的HSC的過繼轉(zhuǎn)移及GFP 嵌合動(dòng)物用于證實(shí)HSC細(xì)胞可遷移至RPE層。SVL引發(fā)熱休克蛋白質(zhì)的 表達(dá)，及后續(xù)HSC吸引因子(chemoattractants)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 (SDF-1)及VEGF的表達(dá)?？赏ㄟ^于玻璃體內(nèi)投用化學(xué)引發(fā)熱休克反 應(yīng)的化合物來(lái)再現(xiàn)激光引發(fā)效果。聚集的HSC獲得成熟RPE細(xì)胞的形 態(tài)特征，并表達(dá)RPE特異性蛋白質(zhì)。從而，本發(fā)明提供治療患有眼睛 疾病的對(duì)象的方法，其中該眼睛疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新 生血管化、青光眼視網(wǎng)膜色素病變、與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變、 青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜先天性裂(retinoschises)、斯特格病 變(Stargardt' s Disease)、常染色體顯形玻璃膜疣及貝斯特黃斑營(yíng) 養(yǎng)不良(Best' s macular dystrophy)、黃斑囊樣水腫、視網(wǎng)膜脫離、 光損傷、缺血性視網(wǎng)膜病變、炎癥引發(fā)的視網(wǎng)膜病變、X伴性青年性視 網(wǎng)膜先天性裂、青光眼、莫拉蒂致拉分提那斯(MalattiaLeventinese， ML)及多恩蜂巢狀視網(wǎng)膜萎縮。 造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞是骨髓衍生細(xì)胞，以其修復(fù)潛力及可塑性而扮演為人 所知的內(nèi)生性來(lái)源。骨髓衍生造血干細(xì)胞(HSC)能修復(fù)受損組織，包 括心臟、肝臟、大腦、肌肉及腎臟。如同本文所述，造血干細(xì)胞亦可 用于修復(fù)視網(wǎng)膜。視網(wǎng)膜的閾下激光(STL)刺激會(huì)引發(fā)HSC聚集，其 后續(xù)會(huì)轉(zhuǎn)分化為RPE樣細(xì)胞。為了不被理論束縛，此過程至少部分通 過包括趨化因子的分子作用而受中介(mediated)，該趨化因子如基質(zhì) 衍生生長(zhǎng)因子-l (SDF-1)及趨化因子受體，如SDF-l受體(CXCR-4)， 其可通過閾下激光活化。干細(xì)胞聚集于受傷害區(qū)域而產(chǎn)生受傷害組織的修復(fù)。若想要的話， 出現(xiàn)在對(duì)象的循環(huán)中的造血干細(xì)胞數(shù)目可在熱休克弓1發(fā)之前、期間或 之后增加。在一個(gè)具體例中，造血干細(xì)胞數(shù)目的增加是通過動(dòng)員對(duì)象 骨髓內(nèi)出現(xiàn)的造血千細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，該動(dòng)員是通過投用任一種或更多種的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、干細(xì)胞因子(SCF)、 IL-8、 SDF-1 (基 質(zhì)衍生因子)、白介素-l(IL-1)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、 白介素-7 (IL-7)、白介素-8 (IL-8)、白介素-ll (IL-ll)、白介素-12 (IL-12)及NIP-la、干細(xì)胞因子(SCF)、樣酪氨酸激酶3 (fit-3)、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子e (TGF-e )、早期作用造血因子，描述于，如W091/05795， 及血小板生成素(Tpo)、 FLK-2配體、FLT-2配體、Epo、抑瘤素 (Oncostatin M)及MCSF。 SDF-1是一種有效引發(fā)干細(xì)胞聚集的細(xì)胞因 子。SDF-1是由處于壓力的R PE細(xì)胞所表達(dá)。G-CSF及/或SDF-1的投用 將增加外周血液中HSC的數(shù)目，并可能增強(qiáng)后續(xù)HSC向視網(wǎng)膜及RPE層的 聚集。優(yōu)選地，本發(fā)明的造血干細(xì)胞不能表達(dá)或降低水平地表達(dá)任一 種或更多種的下列標(biāo)記Lin—、 CD2一、 CD3_、 CD7—、 CD8一、 CD10-、 CD14—、 CD15_、 CD16-、 CD19一、 CD20一、 CD33—、 CD38—、 CD71-、 HLA-DR—及糖蛋白 A_。眼科激光眼科激光是一種治療多種視網(wǎng)膜失調(diào)的重要的工具，其通常用于 產(chǎn)生激光引發(fā)的光化學(xué)灼傷。相比下，據(jù)信，由于能量能為RPE所吸 收，二極體810納米(nanometer)激光對(duì)于神經(jīng)感覺視網(wǎng)膜造成較少的 損傷。本發(fā)明提供應(yīng)用閾下激光以動(dòng)員造血干細(xì)胞及將其聚集至視網(wǎng) 膜色素上皮層的方法。在本方法中，所使用的紅外(810nm)激光為微 脈沖模式以治療視網(wǎng)膜失調(diào)。通過在單一次的曝光中使用重復(fù)地且短 暫的激光脈沖，其限制了熱傳導(dǎo)量及隨即的RPE損傷。在一種方法中， 對(duì)激光的投用作控制以降低或消除光熱損傷，例如，對(duì)激光治療作控 制以降低或消除術(shù)中可見的組織反應(yīng)(如激光凝固壞死)及或晚期細(xì) 胞死亡(凋亡)。在其它例子中，對(duì)非致命熱傷和的閾值作控制以降低 或消除術(shù)中可見的組織反應(yīng)、降低或消除晚期細(xì)胞死亡及出現(xiàn)穩(wěn)定的 正HSC的聚集。優(yōu)選地，相對(duì)于接受常規(guī)激光治療的病人，該光熱損 傷降低至少10%、 25%或30%;更優(yōu)選，光熱損傷降低至少50%、 75%、85%、 95%100%。更優(yōu)選，基本上保持了病人的視銳度(如保持于或接近病人目前視銳度的水平)。使用閾下激光引發(fā)熱休克的方法包括，例如，投用40-50良好間 隔的810nm激光點(diǎn)的格網(wǎng)圖案，其點(diǎn)直徑為5um、 10um、 35um或50um?？勺兓鋸?qiáng)度及供給形式以降低或消除光熱損傷。例如，可使用連續(xù) 波(cw)供給模式；微脈沖(mP)供給模式(如使用20%、 15%、 10% 及5%工作期)；或長(zhǎng)脈沖供給模式。在特定具體例中，本方法特載應(yīng)用具有波長(zhǎng)自至少約100nm至 2000nm的閾下激光，其中閾下激光能量是至少約10mW至100mW(如10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90或100)。激光應(yīng)用為期至少0. 001、 0.005、 0.1、 0. 2或l.Omsec。在其它具體例中，10mW用于0. lmsec 脈沖，或100mW用于0. lmsec脈沖。適于激光治療的眼睛組織包括脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜色素上皮或任何其 它欲以干細(xì)胞修復(fù)組織損傷的眼睛組織。當(dāng)本文描述關(guān)于使用激光引 發(fā)熱休克的特定例子時(shí)，熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)者可理解本發(fā)明并非如此局 限的。實(shí)質(zhì)上任何能在至少眼睛組織的一個(gè)細(xì)胞引發(fā)熱休克反應(yīng)的能 量供給方法可被使用。這類方法包括，可使用例如，使用輻射的刺激、 跨瞳熱像法或具有足夠刺激干細(xì)胞聚集的量的任何其它形式的能量， 如光能。在不同具體例中，足夠聚集干細(xì)胞的激光刺激是指光束或具 有波長(zhǎng)從約100nm至2000nm的光子。通常該波長(zhǎng)是介于約500nm至約 900nm。熱休克反應(yīng)活化物熱休克反應(yīng)活化物包含在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)熱休克反應(yīng)的試劑(如小分 子化合物、多肽及核酸分子)。這類試劑提高，例如熱休克蛋白質(zhì)的表 達(dá)或生物活性，該蛋白質(zhì)如HsplOO、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60、 Hsp40及 小HSP家族成員。更優(yōu)選，該試劑提高Hsp90或Hsp70的表達(dá)或生物 活性。熱休克蛋白質(zhì)90 (Hsp90)是一種涉及細(xì)胞傳信、增生及存活的 伴侶分子，且其在許多蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及功能上是必要的。Hsp90 的調(diào)節(jié)物對(duì)于本發(fā)明為有用的，這類調(diào)節(jié)物提高Hsp90的表達(dá)或生物 活性。Hsp90的調(diào)節(jié)物包含苯醌安莎霉素抗生素，如格爾德霉素及17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG)，其特異性地結(jié)合Hsp90，并改變其功能。其它HsP90的調(diào)節(jié)物包含但不局限于根赤殼菌素、新生霉素(novobiotin)及任何結(jié)合于Hsp90 ATP/ADP袋(pocket)的Hsp90 抑制劑。其它引發(fā)熱休克的試劑包含但不局限于格爾德霉素(InvivoGen， San Diego， California; Chang et al. ， J Cell Biochem. 2006 Jan 1; 97(1): 156-65)、雷公藤紅素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德 霉素(InvivoGen， San Diego, California)、 EC102、根赤殼菌素(Chang et al.， J Cell Biochem. 2006 Jan 1; 97(1): 156-65)、 二牛龍牛 兒基丙酉同(Eisai， Tokyo, Japan)、茍藥昔(Axxora， San Diego， CA)、 PU-DZ8及H-71 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) 及任何這些化合物的相似物或類似物。雷公藤紅素是一種苯醌甲基三 萜，其活化人類熱休克反應(yīng)。雷公藤紅素與其它熱休克反應(yīng)活化物適 用于治療眼睛疾病。熱休克反應(yīng)活化物包含但不局限于雷公藤紅素、 雷公藤紅素甲酯、二醋酸二氫雷公藤紅素(dihydrocelastrol diacetate)、雷公藤紅素丁酯、二氫雷公藤紅素及它們的鹽或相似物。眼睛疾病本發(fā)明可用于治療眼睛疾病，其包含增生前期視網(wǎng)膜病變，糖尿 病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管化、青光眼、視網(wǎng)膜色素病變、與年 齡相關(guān)的黃斑退行性改變、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜先天性裂 (retinoschises)、其萬(wàn)特格病變(Stargardt， s Disease)、常染色體 顯形玻璃膜疣及貝斯特黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(Best' s macular dystrophy)。特別地，本發(fā)明提供關(guān)于增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變與脈絡(luò)膜新生 血管化的新生血管化的治療。第I型糖尿病伴隨患增生性糖尿病視網(wǎng) 膜病變的高風(fēng)險(xiǎn)(Jacobsen， N. et al. ， 2003 Ugeskr Laeger 165: 2953-6)。長(zhǎng)期處于糖尿病背景通常導(dǎo)致增生前期視網(wǎng)膜病變。增生前 期視網(wǎng)膜病變伴隨病灶區(qū)域的缺血。被普遍接受的觀點(diǎn)為新生血管化 伴隨著連同降低的抗血管生成因子的表達(dá)，如內(nèi)皮抑制素及色素上皮 衍生因子(PEDF) (F,tsu， H. ， et al. 2003 Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 1042-7; Noma, H. ， et al. 2002 Arch Ophthalmol 120: 1075-80; Dawson, D. W. et al. ， 1999 Science 285: 245-8; Spranger， J. ， et al" 2001 Diabetes 50: 2641-5; Holekamp， N. M. et al 2002 Am JOphthalmol 134: 220-7; Boehm， B. 0., et al. 2003 Horm Metab Res 35: 382-6)的促血管生成因子的表達(dá)的增加，如內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。 促血管生成因子與抗血管生成因子間平衡的變化引起新生血管化 (neovascularization)并弓l發(fā)毛細(xì)血管滲漏(Funatsu， H. ， et. al. 2002 Am J Ophthalmol 133: 70—7; Caldwell, R. B. ， et al. 2003 Diabetes Metab Res Rev 19: 442_55; Antcliff， R.J. et al.， 1999 Semin Ophthalmol 14: 223-32)。數(shù)年后，患有增生前期視網(wǎng)膜病變 的病人遭受視網(wǎng)膜病變，其特征為視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的大范圍損失及棉 絮斑，并隨后發(fā)展新血管，其從視網(wǎng)膜生長(zhǎng)入正常無(wú)血管的玻璃體。 該脆弱的血管易滲漏，會(huì)造成黃斑水腫及視力模糊。這些非正常血管 的易斷裂，破損可導(dǎo)致立即的視力損失。若允許生長(zhǎng)，新生血管化可形成致盲維管膜并造成視網(wǎng)膜剝離。 目前可行的治療方案中，對(duì)增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療是在這個(gè) 病癥的增生階段通過放置柵激光灼燒視網(wǎng)膜。此破壞性的治療引起大 量視力損失。在患有糖尿病20年后，33%年輕成人接受這類激光治療， 且伴隨視銳度及視角的降低(Kokkonen， J. et al. ， 1994 Acta Paediatr 83: 273_8; Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Research Group 1991 Ophthalmology 98: 766-85; Davies， R 1999 Eye 13 ( Pt4) : 531-6; Dosso， A.A. et al. 2000 Diabetes Care 23: 1855)?？衫帽景l(fā)明的方法治療的另一種狀況是脈絡(luò)膜新生血管化。例 如伴隨與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變的嚴(yán)重視力損失是歸因于脈絡(luò)膜 新生血管化。在非正常脈絡(luò)膜新生血管化中，新血管從脈絡(luò)膜生長(zhǎng)入 視網(wǎng)膜下空間。存在脈絡(luò)膜新生血管化高風(fēng)險(xiǎn)的視網(wǎng)膜通過出現(xiàn)多重 或大且軟的玻璃疣、網(wǎng)狀玻璃疣及/或色素變化的存在而被識(shí)別 (Macular Photocoagulation Study Group 1997， Arch Ophthalmol 115:741-7; Arnold, J.J. et al. 1995 Retina 15: 183—91)。 VEGF 是缺氧調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，其伴隨脈絡(luò)膜新生血管化(Frank, R.N. et al.， 1996 Am J Ophthalmol 122: 393-403; Ishibashi， T. et al. ， 1997 Arch Clin Exp Ophthalmol 235: 159-67; Kwak， N. et al. 2000 Invest Ophthalmol Vis Sci 41: 3158—64)。視網(wǎng)膜變性是另一種可使用本發(fā)明的方法治療改善的狀況。視網(wǎng) 膜變性疾病包含為視網(wǎng)膜神經(jīng)元傷害或視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞死亡的疾 病。視網(wǎng)膜神經(jīng)元包含但不局限于光受體及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。視網(wǎng) 膜變性疾病包含遺傳、后天及炎癥引發(fā)的視網(wǎng)膜變性疾病。遺傳的視 網(wǎng)膜變性疾病包含例如，所有形式的黃斑退行性改變(如，干性及滲 出性的與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變)、斯特格病變、貝斯特病、青光 眼、視網(wǎng)膜色素病變及視神經(jīng)變性。后天的視網(wǎng)膜變性疾病包含那些 伴隨黃斑囊樣水腫、視網(wǎng)膜剝離、光損傷、由靜脈或動(dòng)脈閉塞或其它 血管疾病引起的缺血性視網(wǎng)膜病變、由眼睛外傷，手術(shù)或穿透損害所 引起的視網(wǎng)膜病及外周玻璃體視網(wǎng)膜病變的疾病。炎癥引發(fā)的視網(wǎng)膜 病變包含哪些伴隨由病毒、細(xì)菌及毒性所引發(fā)的視網(wǎng)膜變性，及/或眼 色素層炎的疾病，及那些導(dǎo)致視祌經(jīng)炎的疾病。其它使用本發(fā)明的方法治療的疾病或失調(diào)包含X伴性青年性視網(wǎng) 膜先天性裂、青光眼、莫拉蒂致拉分提那斯(ML)、多恩蜂巢狀視網(wǎng)膜萎縮(D服D)及角膜營(yíng)養(yǎng)不良。本發(fā)明亦提供預(yù)防視網(wǎng)膜神經(jīng)元的細(xì)胞損傷的方法，包含伴隨術(shù) 后外傷及后續(xù)在保護(hù)形式下暴露于傷害性亮光的幷發(fā)癥。篩選試驗(yàn)如同本文所討論的，引發(fā)熱休克或聚集干細(xì)胞至視網(wǎng)膜色素上皮 的化合物對(duì)于本發(fā)明的方法是有用的?？墒褂迷S多方法進(jìn)行篩選試驗(yàn)以識(shí)別這類化合物。在一種方法中，對(duì)細(xì)胞內(nèi)HSP多肽或核酸分子的表 達(dá)作監(jiān)測(cè)(如，眼睛細(xì)胞，如活體內(nèi)或活體外脈絡(luò)膜或視網(wǎng)膜色素上 皮的細(xì)胞)；將該細(xì)胞與測(cè)試化合物相接觸；及使用本領(lǐng)域已知或如同 本文所述的方法來(lái)試驗(yàn)化合物于HSP多肽或核酸分子表達(dá)的效果。 一種 化合物其提高所接觸細(xì)胞相對(duì)于未與化合物接觸的控制細(xì)胞的HSP多 肽或核酸分子的表達(dá)，則視為適用于本發(fā)明的方法。另外，進(jìn)行化合 物篩選以識(shí)別出那些提高干細(xì)胞聚集至視網(wǎng)膜的化合物。在一個(gè)具體 例中，干細(xì)胞聚集是在被局部或全身注射表達(dá)GFP+的干細(xì)胞的嵌合老鼠 內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。GFP+細(xì)胞的出現(xiàn)與否，例如，通過使用螢光顯微鏡檢測(cè)視 網(wǎng)膜平面載片而試驗(yàn)。干細(xì)胞聚集至視網(wǎng)膜的化合物對(duì)本發(fā)明是有用 的。在其它具體例中，這些細(xì)胞的存活或分化是使用細(xì)胞特異性標(biāo)記而試驗(yàn)。在相關(guān)方法中，篩選是在11-順式-視黃醛、9-順式-視黃醛或 其相似物或衍生物存在下進(jìn)行。適用的化合物提高聚集至視網(wǎng)膜的干細(xì)胞數(shù)目為至少10%、 15%或20%或優(yōu)選為25%、 50%或75%;或最優(yōu)選 為至少100%。若需要的話，已識(shí)別化合物的功效會(huì)在患有眼睛疾病(如眼視網(wǎng) 膜色素病變的動(dòng)物模型)或患有糖尿病的動(dòng)物模型內(nèi)試驗(yàn)。 測(cè)試化合物及萃取物通常，能在引發(fā)細(xì)胞的熱休克反應(yīng)或提高干細(xì)胞向眼睛組織聚集 的化合物是根據(jù)本領(lǐng)域己知方法從天然產(chǎn)物或合成(或半合成)萃取 物的大型文庫(kù)或化學(xué)文庫(kù)中被確認(rèn)。熟習(xí)藥物發(fā)現(xiàn)及發(fā)展領(lǐng)域技術(shù)者 將可理解測(cè)試萃取物或化合物的確切來(lái)源并非本發(fā)明的篩選步驟的關(guān) 鍵。因此，實(shí)質(zhì)上任何化學(xué)萃取物或化合物可通過如同本文所述的方 法而篩選。這類萃取物或化合物的例子包含但不局限于植物性、真菌 性、原生性或動(dòng)物性基礎(chǔ)的萃取物、發(fā)酵液及合成化合物，也包含現(xiàn) 存化合物的修飾形式。多種方法亦可用于產(chǎn)生任何化學(xué)化合物的隨機(jī) 性或針對(duì)性的合成(如，半合成或全部合成)，該化學(xué)化合物包含但不 局限于以糖、脂、肽及核酸為基礎(chǔ)的化合物。合成化合物文庫(kù)可購(gòu)自 Brandon Associates (Merrimack, N. H.) 及 Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis)。另外，以細(xì)菌、真菌、植物及動(dòng)物萃取物形式存 在的天然化合物文庫(kù)可自數(shù)個(gè)來(lái)源購(gòu)得，包含Biotics (Sussex, UK)、 Xenova (Slough， UK) 、 Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fla.)及PharmaMar， USA (Cambridge, Mass.)。另夕卜，若需 要的話，可依照本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生天然及合成產(chǎn)生的文庫(kù)，如，通 過標(biāo)準(zhǔn)萃取及分級(jí)(fractionation)方法。更進(jìn)一步，如果需要的話， 任何文庫(kù)或化合物可使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)、物理或生化方法而立即修飾。另外，可于每當(dāng)需要時(shí)使用那些熟習(xí)藥物發(fā)現(xiàn)及發(fā)展領(lǐng)域技術(shù)者 可立即理解去冗余方法(如分類學(xué)去冗余、生物去冗余及化學(xué)去冗余 或其任意組合)或?qū)σ阎鼈冊(cè)诰奂杉?xì)胞或引發(fā)熱休克活性的物質(zhì) 的復(fù)寫或副本的消除法。若發(fā)現(xiàn)粗萃取物可聚集干細(xì)胞或引發(fā)熱休克，更進(jìn)一步正向萃取 的分級(jí)是有必要地，以分離引起觀測(cè)到作用的化學(xué)成分。因此，萃取、分級(jí)及純化過程的目的在于對(duì)粗萃取物中引發(fā)熱休克或干細(xì)胞聚集的 化學(xué)實(shí)體仔細(xì)特性化及識(shí)別。這類異質(zhì)萃取物的分級(jí)與純化的方法為 本領(lǐng)域己知。若有需要的話，表明適用于任何需要修復(fù)或使眼睛組織 再生的眼睛病變的治療的化合物可依照本領(lǐng)域已知方法而經(jīng)化學(xué)修 飾。藥學(xué)組合物本發(fā)明特載藥學(xué)制備物，其包括可在眼睛組織與藥學(xué)上可接受的載體一起引發(fā)或復(fù)制熱休克(如，通過提高Hsp70或Hsp90表達(dá)或活 性)的試劑。這類制備物包含同時(shí)具有治療與預(yù)防應(yīng)用的多肽、多核 苷酸或小分子化合物。適用于如同本文所述的方法的試劑包含那些提 高Hsp90多肽或HSP70的表達(dá)或生物活性的試劑，或是那些另外在眼 睛組織引發(fā)熱休克反應(yīng)從而聚集干細(xì)胞至組織的試劑。若需要的話， 本發(fā)明的組合物是與增加存在于對(duì)象循環(huán)中造血干細(xì)胞數(shù)目的試劑共 同配方，例如，通過動(dòng)員存在于對(duì)象骨髓內(nèi)的造血干細(xì)胞。提高干細(xì)胞的動(dòng)員作用或聚集的試劑包含但不局限于抑制生長(zhǎng)藥 物及G-CSF或GM-CSF、白介素-1 (IL-1)、白介素-3 (IL-3)、白介素 -6 (IL-6)、白介素-7 (IL-7)、白介素-8 (IL-8)、白介素-ll (IL-11)、 白介素-12 (IL-12)及NIP-la 、干細(xì)胞因子(SCF)、類魚酪氨酸激酶 -3 (fit-3)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P (TGF-P)、早期作用造血因子，描述于 如W091/05795、及血小板生成素(Tpo)、 FLK-2配體、Epo、抑瘤素、 及MCSF。若想要的話，本發(fā)明的組合物可與增強(qiáng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜色 素上皮細(xì)胞的化合物共同配方。這類化合物包含反式視黃酸、11-順式 -視黃醛或9-順式-視黃醛。本發(fā)明的化合物可作為藥學(xué)組合物的一部分投用。該組合物應(yīng)為 無(wú)菌且含有治療有效量的本發(fā)明的試劑，該組合物為合適投藥于對(duì)象 的重量或體積單元。本發(fā)明的多個(gè)組合物及組合可為藥學(xué)包裝的一部 分，其中每一化合物以單獨(dú)劑量存在。本發(fā)明用于預(yù)防或治療投用的藥學(xué)組合物應(yīng)為無(wú)菌的。無(wú)菌可輕 易地通過以無(wú)菌過濾膜(如，0.2um膜)過濾、通過Y放射或任何為 熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)者所知的適當(dāng)方法而實(shí)現(xiàn)。治療性多肽組合物通常被放入含有無(wú)菌進(jìn)出口的容器內(nèi)，如，靜脈溶液袋，或是具有可由皮下 注射針頭刺穿的塞子的小瓶。這些組合物一般被儲(chǔ)存于單劑或多重劑 量的容器內(nèi)，如密封的針劑或小瓶，為水溶液或干凍配方的重建物?；衔锟蛇x擇性地與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合。如同本文所使 用的的術(shù)語(yǔ)「藥學(xué)上可接受的賦形劑」是指一種或更多種適合于投用 人體的可相容固體或液體填充物、稀釋物或膠囊物質(zhì)。賦形劑優(yōu)選含 有少量添加劑，如增強(qiáng)等滲性及化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這類物質(zhì)在使用 劑量與濃度上對(duì)于接受者是無(wú)毒且包含緩沖溶液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、 琥珀酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽及其它有機(jī)酸或它們的鹽；三 羥甲基氨基甲烷(TRIS)、重碳酸鹽、碳酸鹽及其它有機(jī)酸或它們的鹽； 抗氧化劑，如抗壞血酸；低分子量(如少于約10殘基)多肽，如、聚 精氨酸、聚賴氨酸聚谷氨酸鹽及聚天冬氨酸；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、 明膠、或免疫球蛋白；親水聚合體、如聚乙烯吡咯垸酮(PVP)、聚丙 二醇(PPG)、及聚乙二醇(PEG);氨基酸、如氨基乙酸、谷氨酸、天 冬氨酸、組氨酸、賴氨酸、或精氨酸；單糖、雙糖、及其它碳水化合 物包含纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精或硫酸化碳 水化合物衍生物、如肝磷脂、硫酸軟骨素或硫酸右旋糖苷；多價(jià)金屬 離子、如二價(jià)金屬，例子包含鈣離子、鎂離子及錳離子；螯合劑、如 乙二胺四乙酸(EDTA);糖醇、如甘露醇或山梨糖醇；反離子(Coimterions)，如鈉或銨；及/或非離子表面活性劑、如聚山梨醇酯 或白洛沙姆(poloxamers)。其它添加劑亦可被包含，如穩(wěn)定劑、抗菌 劑、惰性氣體、液體或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物(如、林格式右旋糖(Ringer's dextrose))、電解質(zhì)補(bǔ)充物及其相似物，其皆以常規(guī)量存在。如上文所述的組合物，能以有效量投用。該有效量將取決于投用 模式、欲治療的特定狀況及所需結(jié)果。其亦可取決于對(duì)象的狀況階段、 對(duì)象的年齡及生理狀況、共同治療的性質(zhì)(如果有的話)及其為醫(yī)藥人 員所知的相似因素。作為治療應(yīng)用，其是能夠達(dá)到醫(yī)藥上所需結(jié)果的對(duì)于具有眼睛疾病或失調(diào)的對(duì)象，有效量是指足夠在眼睛組織的 至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)引發(fā)熱休克、足夠吸引至少一個(gè)干細(xì)胞至該組織或足 夠以穩(wěn)定、減緩或降低伴隨著眼睛病癥的征狀。通常，本發(fā)明的化合物劑量是自約每天0. Olmg/kg至約每天1000mg/kg。預(yù)期劑量范圍為自 約50至約2000mg/kg將合適。某些形式的投藥，如靜脈注射將導(dǎo)致較 低劑量。若初始應(yīng)用劑量于對(duì)象的反應(yīng)為不足夠，可在病人容忍性允 許的范圍內(nèi)使用更高劑量(或通過不同或更局部給藥路線的更高有效 劑量)。每天的多重劑量是預(yù)計(jì)達(dá)到本發(fā)明組合物的適當(dāng)?shù)娜硭?。多種投藥路徑是可用的。通常來(lái)說，本發(fā)明的方法可使用任何醫(yī) 藥上可接受的投藥模式進(jìn)行實(shí)踐，意指任何產(chǎn)生活性化合物的有效水 平而不引起臨床上不可接受副作用的模式。在一個(gè)較佳具體例中，本 發(fā)明的組合物為眼內(nèi)投藥。其它投藥模式包含口腔、直腸、局部、眼 內(nèi)、口部(buccal)、陰道內(nèi)、腦池內(nèi)、側(cè)腦室內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、透 皮、移植內(nèi)/上、或腸胃外的路線。術(shù)語(yǔ)「腸胃外」包含皮下、脊管內(nèi)、 靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、或灌輸。包括本發(fā)明一種組合物的多種組 合物可被加入生理液內(nèi)，如至玻璃體液中。因?yàn)椴∪说姆奖阈约坝盟?計(jì)劃，預(yù)防治療優(yōu)選使用口腔投藥。本發(fā)明的藥學(xué)組合物可選擇性地更進(jìn)一步含有一種或更多種想要 的額外的蛋白質(zhì)。合適的蛋白質(zhì)或生物物質(zhì)可通過本領(lǐng)域已知且可用 的純化技術(shù)而得自人類或哺乳動(dòng)物血漿；得自含有己依照標(biāo)準(zhǔn)重組DNA 技術(shù)引入的表達(dá)人類或哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的基因的重組組織培養(yǎng)、病毒、 酵母、細(xì)菌或其相似物的上清液、萃取物或溶解物；或得自人類生物 液(如，血液、？L、淋巴、尿液或其相似物)或得自含有已依照標(biāo)準(zhǔn) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入并表達(dá)人類蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明的藥學(xué)組合物可活一種或更多種pH緩沖化合物以保持配方 的pH在一個(gè)預(yù)定水平，該預(yù)定水平反應(yīng)生理pH，如在約5. 0至約8. 0 的范圍內(nèi)。用于水性液體配方的該pH緩沖化合物可為氨基酸或氨基酸 混合物，如組氨酸或氨基酸混合物，如組氨酸或氨基乙酸。另外，該 pH緩沖化合物優(yōu)選是保持該配方pH于一個(gè)預(yù)定水平的試劑，如在約 5.0至約8.0的范圍內(nèi)，且其并不螯合鈣離子。這類pH緩沖化合物的 示范性例子包含但不局限于，咪唑及醋酸鹽離子。該pH緩沖化合物可 以任何合適量存在以保持該配方pH于一個(gè)預(yù)定水平。本發(fā)明的藥學(xué)組合物亦可包括一種或更多種調(diào)節(jié)滲透試劑，如， 調(diào)節(jié)配方滲透性質(zhì)(如張力、滲透性及/或滲透壓)至接受個(gè)體血液流及血液細(xì)胞可接受的一個(gè)水平的化合物。該滲透調(diào)節(jié)劑可為不螯合鈣 離子的試劑。給滲透調(diào)節(jié)試劑可為任何熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)者所知與可用 且調(diào)節(jié)配方的滲透性質(zhì)的化合物。熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)者可憑借經(jīng)驗(yàn)決定 一種給定滲透調(diào)節(jié)劑是否用于本發(fā)明配方的適合度。合適的滲透調(diào)節(jié) 劑類型的示范性例子包含但不局限于鹽，如氯化鈉及醋酸鈉；糖， 如蔗糖、右旋糖及甘露醇；氨基酸，如氨基乙酸；及一種或更多種這 些試劑及/或試劑類型的混合物。該滲透調(diào)節(jié)劑可以任何足夠調(diào)節(jié)配方 滲透性質(zhì)的濃度存在。包括本發(fā)明的一種化合物的組合物可含有多價(jià)金屬離子，如鈣離 子、鎂離子及/或錳離子。可使用任何有助于穩(wěn)定該組合物并不引起接 受個(gè)體副作用的多價(jià)金屬。熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)者基于這二種標(biāo)準(zhǔn)可憑借 經(jīng)驗(yàn)決定合適的金屬離子，且這類金屬離子的來(lái)源為已知并包含有機(jī) 與無(wú)機(jī)鹽。本發(fā)明的藥學(xué)上組合物亦可為一非水性配方?？墒褂萌魏魏线m的 非水性液體，假如其提供內(nèi)含活性劑的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，非水性液體 是親水性液體。合適的非水性液體的示范性例子包含甘油；二甲基 亞砜(DMS0);聚二甲基硅烷(PMS);乙二醇，如乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(「PEG」)200、 PEG300及PEG400;及丙二醇，如 二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(「PEG」)425、 PPG725、PPG1000、PPG2000、 PPG3000及PPG4000.本發(fā)明的藥學(xué)組合物亦可為混合的水性/非水性液體配方。任何合 適的非水性配方，例如如上所述者，可與任何上述水性液體配方，例 如如上所述者， 一起使用，假如混合的水性/非水性液體配方提供其內(nèi) 所包含的化合物的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，在這類配方中非水性液體是親水 性液體。適當(dāng)?shù)姆撬砸菏痉缎岳影视?；DMS0; PMS;乙二醇， 如PEG 200、PEG300及PEG400;及丙二醇，如PPG 425、PPG725、PPG1000、 PPG2000、 PPG3000及PPG4000.合適的穩(wěn)定配方可允許活性劑以冰凍或未冰凍狀態(tài)儲(chǔ)存。穩(wěn)定的 液體配方儲(chǔ)存于至少為-7(TC的溫度，但亦可儲(chǔ)存于較高溫度為至少 0°C，或介于約O. rc與約42'c，其取決于組合物的性質(zhì)。熟習(xí)本領(lǐng)域 技術(shù)者一般皆知蛋白質(zhì)與多肽對(duì)于PH、溫度及可影響療效的其它多種因素的變化敏感。其它給藥系統(tǒng)可包含時(shí)間釋放、延遲釋放或緩釋給藥系統(tǒng)。這類 系統(tǒng)可避免本發(fā)明的組合物的重復(fù)投用，增加對(duì)象及醫(yī)生的方便性。 多種類型的釋藥系統(tǒng)已為熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)者所使用且知曉。它們包含 基于聚合體的系統(tǒng)，如聚乳酸(美國(guó)專利第3， 773， 919號(hào)；歐洲專利第58， 481號(hào))聚(乳酸-乙交酯)、共聚草酸鹽(c叩olyoxalates)、 聚己內(nèi)酉旨(polycaprolactones) 、 F菱酉旨酉先月安(polyesteramides)、蘿《原 酸酯(polyorthoesters)、聚羥基丁酸，如聚-D (-) -3-羥基丁酸(歐洲 專利第133， 988號(hào))、L-谷氨酸酸與Y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚體 (Sidman， K. R. et al. ， Biopolymers 22: 547—556)、聚(2-羥基乙 基丙烯酸甲酯)或乙烯醋酸乙烯酯(Langer， R. et al. ， J. Biomed. Mater. Res. 15: 267-277; Langer， R. Chem. Tech. 12: 98-105)及 聚酸酐。其它緩釋組合物包含以物件形式成型的半滲透聚合體基材，如膜或微膠囊。給藥系統(tǒng)亦包含非聚合體系統(tǒng)，它們?yōu)榘檀嫉闹?如膽固醇、膽固醇酯及脂肪酸或中性脂肪，如單、雙及三甘油酯；水 凝膠釋放系統(tǒng)如生物來(lái)源的生物可再吸收水凝膠(也就是，甲殼素水 凝膠或殼聚糖水凝膠)；硅橡膠(sylastic)系統(tǒng)；以肽為基礎(chǔ)系統(tǒng)；臘 覆蓋；使用常規(guī)黏截劑與賦形劑的壓縮藥片；部分熔合的植入；及其 相似物。特定例包含但不局限于(a)侵蝕系統(tǒng)，其中試劑以一種形式 包括于基材內(nèi)，例如那些描述于美國(guó)專利第4.452. 775、 4， 667， 014、 4， 748， 034及5， 239， 660號(hào)者及(b)擴(kuò)散系統(tǒng)，其中活性成分從聚 合體以經(jīng)控制的速率滲透出，如描述于美國(guó)專利第3， 832， 253，及3， 854， 480號(hào).另一類可與本發(fā)明的組合物及方法一起使用的給藥系統(tǒng)是膠體分 散系統(tǒng)。膠體分散系統(tǒng)包含以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的系統(tǒng)其包含水中油乳劑 (emulsion)、膠束(micelles)、混合膠束及脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是人工膜 管，其用于作為活體外或活體內(nèi)給藥載體。單層大微脂粒(LUV)，其 大小范圍從0.2-0.4um，可將大的高分子封于水性內(nèi)部，并可以生物上 活性開》式而運(yùn)送給細(xì)胞(Fraley， R.，及Papahadjopoulos， D. ， Trends Biochem. Sci. 6: 77—80)。脂質(zhì)體可通過將其與特異性配體如單株抗體、糖、糖脂或蛋白質(zhì)結(jié)合而定位至特定組織。脂質(zhì)體可購(gòu)自GibcoBRL，例如LIPOFECHNTM及 LIPOFECTACET"，其由陽(yáng)離子脂質(zhì)如N-[1- (2， 3 二油基氧基) -丙 基]-N，N，N-三甲基氯胺(DOTMA)及二甲基雙十八烷基溴銨(DDAB)所 形成。制備脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域已知，并己描述于許多刊物如DE3， 218， 121; Epstein et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 3688-3692 (1985) ; Hwang eal.， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP88，046; EP143'949; EP 142,641; 日本專利申請(qǐng)第83-118008號(hào)；美國(guó)專利第4， 485， 045及4， 544， 545號(hào);及EP102， 324。脂質(zhì)體亦已由Gregoriadis， G. ， Trends Biotechnol.， 3: 235-241)回顧。另一種類型的載體是生物上可兼容的微顆?；蜻m合移植如哺乳動(dòng) 物接受者的植入物。根據(jù)本方法的適用的示范性生物可侵蝕性植入物 已記述于PCT國(guó)際申請(qǐng)第PCT/US/03307號(hào)(公開號(hào)W095/24929,標(biāo)題 為「Polymeric Gene Delivery System」)。PCT/US/0307描述了生物可 兼容的，優(yōu)選為生物可降解的聚合基材，其用來(lái)容納在合適的啟動(dòng)子 控制下的外生性基因。該聚合基材可用于達(dá)到在對(duì)象中緩釋該外生性 基因或基因產(chǎn)物。聚合基材優(yōu)選是以微顆粒形式存在，如微球(其中試劑分散通過 固體聚合基材)或微膠囊(其中試劑儲(chǔ)存于聚合殼芯內(nèi))。上述含有藥 物的聚合體的微膠囊已描述于，例如，美國(guó)專利第5， 075， 109號(hào)。其 它用來(lái)容納試劑的聚合基材形式包含膜覆蓋(coating)、凝膠、植入物 及支架(stwnt)。對(duì)聚合基材裝置的大小與組成作選擇以有利于在基材 引入處組織的釋放動(dòng)力學(xué)根據(jù)所使用的給藥方式進(jìn)一步對(duì)聚合基材的 大小作選擇。優(yōu)選地，當(dāng)使用浮質(zhì)路徑(aerosol route),聚合基材與 組合物是包圍于表面活性載體內(nèi)。可選擇聚合基材組合物使其兼具有 促進(jìn)降解率及形成物質(zhì)，其為生物可粘合的，以更進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)移效 果。亦可選擇基材組合物為不降解，而是在一段時(shí)間內(nèi)通過擴(kuò)散釋放。 給藥系統(tǒng)亦可為適于局部，位點(diǎn)特異給藥的生物上可兼容的微球。這 類微球是揭露于Chickering， D. E. ， et al. ， Biotechnol. Bioeng. 52: 96-101; Mathiowitz， E. ， et al. ， Nature 386: 410-414。非生物可降解的及生物可降解的聚合基材皆可用于將本發(fā)明的組合物給藥(deliver)至對(duì)象。這類聚合體可為天然或合成聚合體。聚合體的選擇是基于一段時(shí)間，希望其經(jīng)過這段時(shí)間才釋放， 一般為幾 小時(shí)至一年或更長(zhǎng)而被。通常，最為理想的釋放時(shí)間范圍介于數(shù)小時(shí) 與三至十二個(gè)月間。該聚合體可選擇地以水明膠形式存在，其可在水中吸收高達(dá)約其重量的90%的重量，及更進(jìn)一步，可選擇地，與多價(jià)離 子或其它聚合體交聯(lián)?？捎糜谛纬缮锷峡山到饨o藥系統(tǒng)的合成聚合體的示范性例子包 含聚酰胺、聚碳酸酯、聚伸乙基(polyalkylene)、聚乙二醇聚烯烴氧 化物、聚對(duì)苯二酸烯烴酯(polyalkylene ter印thalates)、聚乙烯醇、 聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯鹵化物、聚乙烯吡咯酮垸、聚乙交酯、 聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、垸基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素 醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸與甲基丙烯酸酯聚合體、甲基纖 維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基 纖維素、醋酸纖維素、丙酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、醋酸鄰苯二甲 酸纖維素、羧乙基纖維素、三醋酸纖維素、纖維素硫酸鈉鹽、聚(甲 基丙烯酸甲酯)、聚(乙基丙烯酸甲酯)、聚(丁基丙烯酸甲酯)、聚(異 丁基丙烯酸甲酯)、聚(己基丙烯酸甲酯)、聚(異癸基丙烯酸甲酯)、 聚(月桂醇丙烯酸甲酯)、聚(苯基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、 聚(異丙基丙烯酸酯)、聚(異丁基丙烯酸酯)、聚(十八垸基丙烯酸 酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚對(duì)苯二甲酸 乙二酯、聚(乙烯醇)、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯 吡咯酮垸、及乳酸及乙醇酸的聚合體、聚酸酐、聚(原酸)酯、聚(丁 酸)、聚(戊酸)、及聚(乳酸-共己內(nèi)酯)、及天然聚合體如藻酸鹽及 其它多糖，包含右旋糖酐及纖維素、膠原蛋白、其化學(xué)衍生物(取代 物、化學(xué)基團(tuán)加成、如垸基、烯烴、羥基化、氧化、及熟習(xí)本領(lǐng)域技 術(shù)者常規(guī)使用的其它修飾)、白蛋白及其它親水性蛋白、玉米蛋白、及 其它醇溶谷蛋白及疏水性蛋白、共聚體及其混合物。 一般來(lái)說，這些 材質(zhì)通過表面或分散侵蝕而在酶水解作用或是于活體內(nèi)暴露于水而遭 降解。眼睛給藥方法本發(fā)明的組合物通常于給藥至眼睛以治療眼睛疾病(如糖尿病視 網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管化、青光眼視網(wǎng)膜色素病變、與年齡相關(guān) 的黃斑退行性改變、青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜先天性裂(retinoschises)、斯特格病變(Stargardt， s Disease)、常染色體 顯形玻璃膜疣及貝斯特黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(Best， s macular dystrophy)、 黃斑囊樣水腫、視網(wǎng)膜脫離、光損傷、缺血性視網(wǎng)膜病變、炎癥引發(fā) 的視網(wǎng)膜病變、X伴性青年性視網(wǎng)膜先天性裂、青光眼、莫拉蒂致拉分 提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂巢狀視網(wǎng)膜萎縮)。在一 個(gè)具體例中，本發(fā)明的組合物通過適于直接植入眼睛玻璃體的眼睛裝 置而投用。本發(fā)明的組合物可提供為緩釋(sustained release)組合物， 如描述于美國(guó)專利第5， 672， 659及5， 595， 760號(hào)的那些。這類裝 置的發(fā)現(xiàn)是為了提供多種組合物的控制緩釋以治療眼睛，而沒有局部 及全身傷害的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明眼睛給藥方法的一個(gè)目的為最大化在眼內(nèi) 裝置含有藥物量或植入物，并最小化其尺寸，由此延長(zhǎng)植入的持續(xù)時(shí) 間。參閱，如美國(guó)專利第5， 378, 475、 6， 375， 972及6， 756， 058 號(hào)及美國(guó)公開本第20050096290及200501269448號(hào)。這類植入物可 為生物可降解的及/或生物可兼容的植入物，或可為非生物可降解的植 入物。生物可降解的眼睛植入物已描述于，例如，美國(guó)專利公開本第 20050048099號(hào)。植入物對(duì)活性試劑可為可滲透或不滲透，及可嵌入眼 睛腔室內(nèi)，如前方或后方腔室或可植入于鞏膜、跨脈絡(luò)膜空間，或玻 璃體外無(wú)血管區(qū)域。另外，作為本發(fā)明組合物的儲(chǔ)存庫(kù)的隱形鏡片， 亦可用于藥物給藥。在一個(gè)較優(yōu)選具體例中，植入物可置于無(wú)血管區(qū)域上，如在鞏膜 上，以使藥物跨越鞏膜擴(kuò)散至治療所需位置，如眼內(nèi)空間及眼睛黃斑。 侵入式跨鞏膜給藥最低限度可用于給藥有效劑量的活性化合物至視網(wǎng) 膜而可忽略的全身吸收?？珈柲そo藥利用了鞏膜大且可進(jìn)入的表面積、 使其可傳導(dǎo)水溶性物質(zhì)的高度水和作用、伴隨少量蛋白水解酶及蛋白 質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞增生低下(hypocellularity)、及不因年齡顯著降低 的滲透性。填充有活性化合物的滲透泵可被植入于對(duì)象，以使活性化 合物跨鞏膜地以緩釋模式而給藥至視網(wǎng)膜。(Ambati， etal.， Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. ， 41: 1186-91 (2000))。更進(jìn)一步，跨鞏膜擴(kuò)散位點(diǎn)優(yōu)選為臨近黃斑。用于組合物給藥的植入物示范例包含但不局限于，描述于美國(guó)專利第3，416，530、 3,828,777、 4,014,335、 4,300,557、4,327,725、 4,853,224、5， 147， 647 、 5,164,188 、5， 403， 901、 5,443,505、5,632,984、 5， 679'666 、5， 766， 242、 5,766,619、5， 824， 073、 5, 904， 144、 6， 126， 687 、5， 830， 173、 5， 916， 584、 6, 146, 366 、5， 178， 635 、 5， 466， 466、 5， 710， 165、 5， 770, 592 、 5， 836， 935、 6， 001, 386、4， 946， 450、 5， 300， 114 、 5， 476， 511、 5， 725， 493、4' 997, 652、 5， 322， 691 、 5， 516， 522、 5， 743， 274、5， 773， 019、 5,824,072、 5,869,079， 5,902,598、 6,074,661、 6,110,485、6， 251， 090號(hào)；及 6， 299， 895及在W001/30323與W001/28474內(nèi)的那些裝置，其所有皆并入本案作為參例子包含但不局限于以下緩釋藥物給藥系統(tǒng)，其包括內(nèi)部存儲(chǔ) 容器，內(nèi)部存儲(chǔ)容器包括有效量的試劑，該試劑有效取得所需局部或 全身生理或藥學(xué)效果；對(duì)試劑為不可滲透的內(nèi)部試管，其具有第一端 及第二端，并覆蓋該內(nèi)部存儲(chǔ)容器的至少一部分，內(nèi)部試管依照尺寸 制作并由一種物質(zhì)形成以使該內(nèi)部試管可承受其自身重量；置放于內(nèi) 部試管第一端的非滲透性成員，該非滲透性成員可防止該試劑經(jīng)由內(nèi) 部試管的第一端而流出存儲(chǔ)容器外；及置放于內(nèi)部試管的第二端的滲 透性成員，該滲透性成員允許該試劑經(jīng)由內(nèi)部試管的第二端流出存儲(chǔ) 容器外； 一種將本發(fā)明化合物投藥至眼睛部分的方法，該方法包括下 列步驟植入緩釋裝置以將本發(fā)明的化合物投于眼睛玻璃體，或以不 可植入的緩釋裝置將本發(fā)明的化合物投藥于眼睛部分； 一種緩釋藥物 投藥裝置包括a)藥核，其包括治療有效量的至少一種第一試劑，該 第一試劑有效地獲得診斷作用或有效地獲得所需局部或全身的生理或 藥學(xué)效果；b)至少一個(gè)單元杯，其實(shí)質(zhì)上對(duì)于將其環(huán)繞的試劑為不可 滲透，并定義一個(gè)內(nèi)部空間，以接受藥核，該單元杯包括開放式頂部 端，其具有環(huán)繞該單元杯開放式頂部端的至少一些部分的至少一個(gè)凹 槽；c)滲透性塞，其對(duì)于試劑為可滲透的，該滲透性塞是置放于該單 元杯的該開放式頂部端，其中，該凹槽與將其保持再適當(dāng)位置的該滲 透性塞反應(yīng)，并關(guān)閉該開放式頂部端，該滲透性塞允許試劑流出藥核，通過滲透性塞，并流出單元杯開放式頂部端；及d)至少一種第二試劑， 其有效地獲得診斷效果或有效地獲得所需局部或全身生理或藥學(xué)作 用；或一種緩釋藥物給藥裝置，其包括包括有效量試劑的內(nèi)核，該 試劑具有所需溶解度及聚合體覆蓋層，該聚合體層對(duì)該試劑為可滲透， 其中該聚合體覆蓋層完全地覆蓋該內(nèi)核。眼睛給藥的其他方法包含使用脂質(zhì)體標(biāo)的將本發(fā)明化合物至眼， 并優(yōu)選為至視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、脈絡(luò)膜細(xì)胞，及/或布魯赫氏(Bruch' s)膜。例如，可以上述方法將該化合物與脂質(zhì)體復(fù)合，且將該化合物/脂質(zhì)體復(fù)合物注入患有眼疾的病人，使用靜脈注射以指引化 合物至需要的眼組織或細(xì)胞。直接將脂質(zhì)體復(fù)合物注入視網(wǎng)膜色素上 皮細(xì)胞或布魯赫氏膜的臨近區(qū)域亦可提供用于復(fù)合物的標(biāo)的。在一個(gè)特定具體例中，該化合物通過眼內(nèi)緩釋給藥投用(如VITRASERT或 ENVISION)。在一個(gè)特定具體例中，該化合物通過后部結(jié)膜下注射而投 用。在另一個(gè)特定具體例中，含有本發(fā)明組合物的微乳劑顆粒被給藥 至眼睛組織以吸收來(lái)自布魯赫膜、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或兩者的脂質(zhì)。 納米顆粒是膠狀載體系統(tǒng)，已顯示其可通過延長(zhǎng)血清半衰期而改 善封裝藥物的效力。聚氰基丙烯酸垸基酯(PACA)納米顆粒是臨床發(fā)' 展中的一種共聚體膠狀藥物給藥系統(tǒng)，如描述于Stella et al. ， J. Pharm. Sci. ， 2000. 89: p. 1452-1464; Brigger et al. ， Int. J. Pharm. ， 2001. 214: p. 37-42; Calvo et al. , Pharm. Res., 2001. 18: p. 1157—1166;及Li et al. ， Biol. Pharm. Bull. ， 2001. 24: p. 662-665。生物可降解的聚(羥基酸)，如聚(乳酸)(PLA)及聚(乳 酸共交乙酯)(PLGA)的共聚物是廣泛地使用于生物醫(yī)藥應(yīng)用且通過某 些FDA臨床應(yīng)用認(rèn)證。另外，PEG-PLGA納米顆粒具有許多所欲載體特 色包含(I)被封裝的試劑包含總載體系統(tǒng)的合理的重量分?jǐn)?shù)(負(fù)載)； (II)用于封裝過程第一步驟的試劑量以合理的高水平而并入于最終 載(捕獲效率)；(in)該載體具有可被干凍并可于溶液中重組而不會(huì) 聚集(aggregation); (IV)該載體為生物可降解的；(V)該載體系統(tǒng) 為小尺寸的；及(VI)該載體提高顆粒持久性。納米顆粒通過實(shí)質(zhì)上任何本領(lǐng)域已知的可降解外殼而合成。在一 個(gè)具體例中，可使用的聚合體，如聚(乳酸)(PLA)或聚(乳酸共交乙酯)(PLGA)。這類聚合體是生物可兼容的且生物可降解的，且可通 過修飾，該修飾理想地增加光化學(xué)效率及納米顆粒的循環(huán)壽命。在一 個(gè)具體例中，該聚合體經(jīng)羧酸基團(tuán)(C00H)修飾，其增加顆粒負(fù)電荷， 由此局限與帶有負(fù)電荷的核酸適體的相互作用。納米顆粒亦可經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾，其亦可增加循環(huán)中顆粒的半衰期與穩(wěn)定性。另外， C00H基團(tuán)可轉(zhuǎn)變?yōu)镹-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯以共價(jià)地結(jié)合經(jīng)氨基 修飾的適體。適用于本發(fā)明組合物及方法的生物可兼容聚合體包含但不局限于 聚酰胺、聚碳酸酯、聚伸乙基(polyalkylene)、聚乙二醇聚烯烴氧化 物、聚對(duì)苯二酸烯烴酯(polyalky;[ene ter印thalates)、聚乙烯醇、 聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯鹵化物、聚乙烯吡咯酮烷、聚乙交酯、 聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、垸基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素 醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸與甲基丙烯酸酯聚合體、甲基纖 維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基 纖維素、醋酸纖維素、丙酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、醋酸鄰苯二甲 酸纖維素、羧乙基纖維素、三醋酸纖維素、纖維素硫酸鈉鹽、聚(甲 基丙烯酸甲酯)、聚(乙基丙烯酸甲酯)、聚(丁基丙烯酸甲酯)、聚(異 丁基丙烯酸甲酯)、聚(己基丙烯酸甲酯)、聚(異癸基丙烯酸甲酯)、 聚(月桂醇丙烯酸甲酯)、聚(苯基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、 聚(異丙基丙烯酸酯)、聚(異丁基丙烯酸酯)、聚(十八烷基丙烯酸 酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚對(duì)苯二甲酸 乙二酯、聚(乙烯醇)、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯 吡咯酮烷、聚透明質(zhì)酸、酪蛋白、明膠、明膠蛋白聚酸酐、聚丙烯酸、 海藻酸、殼聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙基丙烯酸甲酯)、聚 (丁基丙烯酸甲酯)、聚(異丁基丙烯酸甲酯)、聚(己基丙烯酸甲酯)、 聚(異癸基丙烯酸甲酯)、聚(月桂醇丙烯酸甲酯)、聚(苯基丙烯酸 甲酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(異丙基丙烯酸酯)、聚(異丁基丙烯 酸酯)、聚(十八烷基丙烯酸酯)及任何這些的組合。在一具體例中， 本發(fā)明的納米顆粒包含PEG-PLGA聚合物。本發(fā)明的組合物亦可局部給藥。為局部給藥，組合物是以任何藥 學(xué)上可接受的賦形劑提供，該賦形劑已證用于眼睛給藥。優(yōu)選，該組合物以滴的形式由眼球表面給藥。對(duì)于一些應(yīng)用，組合物的給藥依賴 化合物通過角膜至眼內(nèi)部的擴(kuò)散。那些熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)者將知道使用本發(fā)明化合物治療眼睛疾病的 最佳方案可直接決定。這并非實(shí)驗(yàn)問題，而是一種優(yōu)化問題，其可在 醫(yī)藥技術(shù)上常規(guī)地進(jìn)行?；铙w內(nèi)裸鼠研究通常提供一個(gè)起始點(diǎn)，自其 可開始最優(yōu)化劑量及給藥方案。如同已在一些老鼠實(shí)驗(yàn)中所作的，初 始注射頻率將為一周一次。然而，這頻率可視需要地調(diào)整，自每天至 每?jī)芍苤撩吭?，這是取決于初始臨床試驗(yàn)所得到的結(jié)果及特定病人的 需要。一開始人類劑量值可由老鼠用化合物量推算而得到，因?yàn)槭炝?xí)本 領(lǐng)域技術(shù)者可知這在技術(shù)中比較動(dòng)物模型來(lái)修飾人類使用的劑量為常 規(guī)程序。在某些具體例中，構(gòu)想劑量變化可介于約每公斤體重lmg化合物至約每公斤體重5000mg化合物；或自約每公斤體重5fflg化合物至 約每公斤體重4000mg化合物或自約每公斤體重10mg化合物至約每公 斤體重3000mg化合物或自約每公斤體重50mg化合物至約每公斤體重 2000mg化合物體重；或自約每公斤體重lOOmg化合物至約每公斤體重 1000mg化合物;或自約每公斤體重150mg化合物至約每公斤體重500mg 化合物。在其它具體例中，該劑量可為約l、 5、 10、 25、 50、 75、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 1250、 1300、 1350、 1400、 1450、 1500、 1600、 1700、 1800、 1900、 2000、 2500、 3000、 3500、 4000、 4500、 5000 mg/Kg體重。在其它具體例中，設(shè)想可使用更高劑量，這類劑量 可在約每公斤體重5mg化合物至約每公斤體重20mg化合物的范圍內(nèi)。 在其它具體例中，該劑量可為約8、 10、 12、 14、 16或18mg/kg體重。 當(dāng)然，該劑量可如同這類治療規(guī)則常規(guī)所作般地往上或往下調(diào)整，其 取決于初始臨床試驗(yàn)的結(jié)果及特定病人的需要。 組合治療本發(fā)明的組合物與方法可與任何已知技術(shù)中標(biāo)準(zhǔn)療法組合投用。 若想要的話，在眼睛組織引發(fā)熱休克的試劑或閾下激光方案(如同本 文所述)可與促進(jìn)干細(xì)胞(如造血干細(xì)胞)聚集、存活、增生或轉(zhuǎn)分化的試劑共同投用。這類試劑包含膠原質(zhì)、纖連蛋白、層黏蛋白、整合素、新生血管因子、抗炎因子、糖胺聚糖、生長(zhǎng)因子(vitrogen)、抗體及其片段，這些試劑的等功效物，及其組合。在其它具體例中，本發(fā)明的在眼睛組織引發(fā)熱休克的試劑或閾下 激光方案(如同本文所使用的所述)是與一抗炎化合物組合投用，該 化合物是常規(guī)投用以治療眼睛疾病。這類抗炎化合物包含但不局限于，任何一種或更多種的固醇及非固醇化合物，其例包含阿氯芬酸(Alclofenac)、阿氯米松二丙酸酉旨(Alclometasone Dipropionate)、 醋苯阿爾孕酮(Algestone Acetonide) 、 ot淀粉酶、安西法爾 (Amcinafal)、安西非特(Amcinaf ide)、氨芬酸鈉(Amfenac Sodium)、 鹽酸氨普立糖(Amiprilose Hydrochloride)、阿纟內(nèi)白滯素(Anakinra)、 阿尼羅酸(Anirolac)、阿尼扎芬(Anitrazafen)、阿扎丙宗(Apazone)、 巴柳氮二鈉(Balsalazide Disodium)、 節(jié)達(dá)酸(Bendazac)、苯惡洛芬 (Benoxaprofen)、鹽酸節(jié)達(dá)明(Benzydamine Hydrochloride)、 菠蘿蛋 白酶(Bromelains)、溴哌莫、布地奈德(Budesonide)、卡洛芬 (Carprofen)、環(huán)洛芬(Cicloprofen)、辛噴他宗(Cintazone)、克利洛 芬(Cliprofen)、丙酸氯倍他索(Clobetasol Propionate) 、 丁酸氯倍 他松(Clobetasone Butyrate)、氯砒酸(Clopirac)、丙酸氯硫卡松 (Cloticasone Propionate、酉昔酉愛克敏阿松(Cormethasone Acetate)、 可托多松(Cortodoxone)、地夫可特(Def lazacort)、地索奈德 (Desonide)、 去羥米松(Desoximetasone) 、 二丙酸地塞米松 (Dexamethasone Dipropionate)、 雙氯芬酸鉀 (Diclofenac Potassium)、雙氯芬酸鈉(Diclofenac Sodium)、醋酸雙氟拉私、 (Dif lorasone Diacetate) 、 二氣米酉同納(Diflumidone Sodium) 、 二氣 尼柳(Diflunisal) 、 二氟孕甾丁酯(Dif luprednate)、地氟它酮 (Diftalone) 、 二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide)、羥西奈德 (Drocinonide)、恩甲羥松(Endrysone)、 恩莫單抗(Enlimomab)、 依 諾利康鈉(Enolicam Sodium)、依匹唑(Epirizole)、依托度酸 (Etodolac)、依托芬那酯(Etofenamate)、 聯(lián)苯乙酸(Felbinac)、非 那莫(Fenamole)、苯布芬(Fenbuf en)、芬氯酸(Fenclof enac)、苯克洛 酸(Fenclorac)、芬度柳(Fendosal)、芬吡哌隆(Fenpipalone)、芬替酸(Fentiazac)、夫拉扎酮(Flazalone)、氟扎可特(Fluazacort)、氟 芬那酸(Flufenamic Acid)、氟米唑(Flumizole)、醋酸氟尼縮松 (Flunisolide Acetate)、氟尼辛(Flunixin)、 氟尼辛葡甲月安(Flimixin Meglumine)、氟可丁 丁基(Fluocortin Butyl)、氟米龍醋酸酯 (Fluorometholone Acetate)、 氟喹宗(Fluquazone)、 氟比洛芬 (Flurbiprofen)、氟瑞托芬(Fluretofen)、丙酸氟替卡松(Fluticasone Propionate)、呋喃洛芬(Furaprof en)、呋羅布芬(Furobuf en)、氯氟 輕松(Halcinonide)、卣倍他索丙酸酉旨(Halobetasol Propionate)、醋 酸鹵潑尼松(Halopredone Acetate)、異丁芬酸、布洛芬、布洛芬銨、 布洛芬砒甲酯(IbuprofenPiconol)、伊洛達(dá)普(ilonidap)、吲哚美辛、 吲哚美辛鈉、吲哚洛芬、吲哚克索、吲四唑(Intrazole)、醋酸異氟潑 尼松(Isofl叩redone Acetate)、伊索克酸(Isox印ac)、伊索昔康 (Isoxicam)、酉同、7各芬、鹽酸 各一^詠挫(Lofemizole Hydrochloride)、 氯諾昔康、氯替潑諾、甲氯胺苯酸鈉、甲氯芬那酸、甲氯松二丁酯 (Meclorisone Dibutyrate)、 甲芬夷隨、氨基水楊酸(Mesalamine)、 美西拉宗、磺庚甲潑尼龍(Methylprednisolone Sul印tanate)、嗎尼 氟酯、萘丁美酮、萘普生、萘普生鈉、萘普索、尼馬宗(Nimazone)、 奧沙拉嗪鈉(01salazine Sodium)、奧古蛋白(0rgotein)、奧帕諾辛、 惡丙嗪(0xaprozin)、羥基保泰松(Oxyphenbutazone)、鹽酸瑞尼托林 (Paxanyline Hydrochloride)、 木聚硫鈉(Pentosan Polysulfate Sodium)、 保泰松甘油酸鈉(Phenbutazone Sodium Glycerate)、哌非 尼酮(Pirfenidone)、砒羅昔康、砒羅昔康硅酸酯、砒羅昔康奧拉敏、 砒丙芬(Pirprof en)、潑那唑琳(Prednazate)、普利非酮(Prif elone)、 普羅度酸(Prodolic Acid)、普羅奎松(Proquazone)、普羅沙唑 (Proxazole)、檸檬酸普羅沙唑、利美索龍(Rimexolone)、氯馬扎利 (Romazarit)、柳膽來(lái)司(Salcolex)、沙那西定(Salnacedin)、雙水楊 酸酯(Salsalate)、血根氯胺(Sanguinarium Chloride)、司克拉宗 (Seclazone)、絲美辛(Sermetacin)、舒多昔康(Sudoxicam)、舒林酸 (Sulindac)、舒洛芬、他美辛(Talmetacin)、他尼氟酯(Talnif lumate)、 他洛沙酯(Talosalate)、特丁非隆(Tebuf elone)、替尼達(dá)普(Tenidap)、 替尼達(dá)普鈉、替諾昔康(Tenoxicam)、替昔康(Tesicam)、替昔麥(Tesimide)、 特準(zhǔn)達(dá)明(Tetrydamine)、硫平酸(Tiopinac)、锍氫考 的松(Tixocortol Pivalate)、托爾米汀(Tolmetin)、托爾米汀鈉、三 氯奈德(Triclonide)、三氟米酯(Triflumidate)、齊多美辛 (Zidometacin)或佐美酸納(Zomepirac Sodium).在其它具體例中，本發(fā)明在眼睛組織引發(fā)熱休克的試劑或閾下激 光方案(如同本文所述)是與一種在眼睛組織提高或降低血管新生的 試劑組合投用，這類試劑能調(diào)節(jié)血管新生因子的表達(dá)或活性，如血小 板來(lái)源生長(zhǎng)因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維生 長(zhǎng)因子(bFGF)、 bFGF-2、痩素、纖溶酶原激活劑(tPA， uPA)、血管生成素、脂蛋白a、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-e、緩激肽、血管新生寡糖(如透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素)、凝血栓蛋白、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(亦名分散因 子)及CXC吸引因子受體家族。在其它具體例中，試劑與方法是與化學(xué)治療試劑共同投用，該化 學(xué)治療試劑增強(qiáng)骨髓衍生干細(xì)胞動(dòng)員，包含環(huán)磷酰胺(Cytoxan) 、 VP-16 及細(xì)胞因子如GM-CSF， G-CSF或其組合。本發(fā)明的組合可彼此同時(shí)，或于幾小時(shí)內(nèi)，或幾周內(nèi)投用。在一 方法中，本發(fā)明在眼組織引發(fā)熱休克的試劑或閾下激光方案(如同本 文所述)是在如同本文所描述的投用常規(guī)治療劑之前、同時(shí)或之后投 用。在一些具體例中，于熱休克引發(fā)前動(dòng)員骨髓衍生干細(xì)胞是理想的， 其中這類動(dòng)員提高聚集至眼睛組織干細(xì)胞的數(shù)目。在其它具體例中， 優(yōu)選為在引發(fā)熱休克之后(如在1、 2、 3、 5或10小時(shí)內(nèi))或同時(shí)投 用動(dòng)員骨髓細(xì)胞試劑。 提高干細(xì)胞聚集至眼睛組織的方法如同本文所述，在眼睛組織引發(fā)熱休克有效地聚集干細(xì)胞(如造 血干細(xì)胞)至該組織，其中干細(xì)胞改善眼睛疾病或失調(diào)。若想要的話， 實(shí)質(zhì)純化的干細(xì)胞(或其前體或是其它祖細(xì)胞)可與試劑或治療方案 (如閾下激光治療)結(jié)合而投用病人，該試劑或該治療方案在眼睛組 織引發(fā)熱休克以促進(jìn)眼睛組織的修復(fù)。這類方法可通過聚集干細(xì)胞至 該組織而用于增強(qiáng)眼睛組織的修復(fù)。單離造血干細(xì)胞的方法已為本領(lǐng)域所知曉。在一個(gè)具體例中，使 用去除法將造血干細(xì)胞從血液中單離。當(dāng)總白細(xì)胞的計(jì)數(shù)為約500-2000細(xì)胞/ul及血小板的計(jì)數(shù)為約50， 000/ul時(shí)，開始總白細(xì)胞 去除法。可監(jiān)視日常白細(xì)胞分離樣品的CD34+及/或Thy-r細(xì)胞出現(xiàn)與否 來(lái)確定干細(xì)胞動(dòng)員峰值以及，由從這時(shí)起的最佳采集外周血干細(xì)胞時(shí) 間。若想要的話，通過初始移除專用細(xì)胞(「譜系定性」細(xì)胞)可使用 多種技術(shù)來(lái)分離細(xì)胞，。單克隆抗體對(duì)于識(shí)別與特定細(xì)胞譜系及/或分 化狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)記是特別有用的?？贵w可附著于固體支持物以進(jìn)行粗 分離。使用的分離技術(shù)應(yīng)使收集的分級(jí)的存活率最大化。使用的分離技術(shù)包含基于不同的物理性質(zhì)(如密度梯度離心及逆 流淘析離心)、細(xì)胞表面性質(zhì)(血凝素(lectin)及抗體親和性)及活體 染色性質(zhì)(線粒體結(jié)合染料若丹明123及DNA結(jié)合染料Hoechst33342)。 其它可使用的分離步驟包含磁分離'使用涂附有抗體的磁珠、親和層 析連接單克隆抗體或用于結(jié)合單克隆抗體的細(xì)胞毒素試劑，包含補(bǔ)體 及細(xì)胞毒素，及附著于固體基材的抗體的「淘洗」或其它便捷方法。 提供精確分離的方法包含流式細(xì)胞儀(如使用多個(gè)色彩通道、小角及 鈍角光分散偵測(cè)通道，阻抗通道的流式細(xì)胞儀)?？赏ㄟ^相對(duì)粗分離從樣品中移除大部分分化的細(xì)胞，其中造血系 統(tǒng)的主要細(xì)胞群系，如淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞，，以及淋巴群，如巨核細(xì) 胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性紅細(xì)胞及嗜堿細(xì)胞可被移除。通常，至少約百 分之70至90的造血干細(xì)胞可被移除。伴隨提供正選擇的粗分離，例如使用CD34標(biāo)記，或是接在正選擇 的粗分離后，可實(shí)施負(fù)選擇，其中可使用針對(duì)存在于專用細(xì)胞上的族 系特異性標(biāo)記的抗體。作為最大部分，這些標(biāo)記包含CD2—、 CD3—、 CD7—、 CD8—、 CD10-、 CD14—、 CD15—、 CD16_、 CD19-、 CD20-、 CD33—、 CD38-、 CD71—、 HLA-DR—及血型糖蛋白A;優(yōu)選包含至少CD2—、 CD14_、 CD15—、 CD16—、 CD19_ 及血型糖蛋白A;及通常包含至少CD14—及CD15—。如同本文所用的Lin—是 指缺乏至少一種族系特異性標(biāo)記的細(xì)胞群。純化的千細(xì)胞通過FACS試驗(yàn)具有低側(cè)分散及低至中前分散圖譜。 細(xì)胞離心涂片機(jī)(cytospin)制備物顯示了經(jīng)濃縮的干細(xì)胞具有介于成 熟淋巴細(xì)胞及成熟粒細(xì)胞之間的大小。細(xì)胞可通過基于光分散性質(zhì)及 其多種細(xì)胞表面抗原的表達(dá)而被選擇。優(yōu)選地，細(xì)胞最初通過粗分離而分離，隨后以與干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記的正選擇及與族系定型細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記的負(fù)選擇進(jìn)行細(xì)部分離?？赏ㄟ^ 此方法實(shí)現(xiàn)高度濃縮干細(xì)胞的組合物。接著將純化的或部分純化的干細(xì)胞投用病人。投藥可為局部(如 通過直接投于玻璃體液或供給感興趣眼睛組織的血管)或全身。 多核苷酸治療以引發(fā)熱休克特載編碼HSP蛋白質(zhì)、變異體或其片段，或是可激活熱休克的蛋 白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸治療是另一種治療眼睛疾病的治療手段。 另外，該多核苷酸編碼治療多肽，其增強(qiáng)干細(xì)胞聚集、存活、增生或 分化或另外改善與眼睛疾病相關(guān)的癥狀(如，降低炎癥、新生血管或 細(xì)胞死亡)。若想要的話，本發(fā)明的干細(xì)胞的基因經(jīng)過修飾以表達(dá)生物 活性分子或外源性蛋白質(zhì)，或是過度表達(dá)內(nèi)生性蛋白質(zhì)。該細(xì)胞可攜 帶細(xì)胞、組織或是器官的長(zhǎng)期存活所需，或是偵測(cè)或是監(jiān)控細(xì)胞所需 的基因信息。在一個(gè)例子中，該細(xì)胞的基因經(jīng)過修飾以表達(dá)促進(jìn)血管 新生的生物活性分子。在另一個(gè)例子中，該細(xì)胞的基因經(jīng)過修飾以表 達(dá)螢光蛋白標(biāo)記。標(biāo)記示范例包含GFP、 EGFP、 BFP、 CFP、 YFP及 RFP。這類多核苷酸可被投送至患有眼睛疾病的對(duì)象細(xì)胞，其中該重組 蛋白質(zhì)的表達(dá)將具有療效。例如，編碼治療性多肽的核酸分子被投送 至干細(xì)胞，如骨髓衍生干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、其前體或祖細(xì)胞。在其 它方法中，核酸分子被投至眼睛組織的細(xì)胞中，如視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜色 上皮或脈絡(luò)膜。核酸分子必須以其可被吸收的一種形式投送至對(duì)象細(xì) 胞內(nèi)以產(chǎn)生治療性多肽(如HSP蛋白質(zhì)，如HSP70、 HSP90)或其片段 的有效水平?，F(xiàn)存多種制造本發(fā)明的多肽的表達(dá)系統(tǒng)。產(chǎn)生這類多肽的有用的 表達(dá)載體包含，但不局限于，染色體型、附加型及病毒衍生性的載體， 例如由細(xì)菌質(zhì)粒、由噬菌體、由轉(zhuǎn)位子、由酵母附加體、由插入元素 (element)、由酵母染色體元素、由病毒，如桿狀病毒、乳頭狀多瘤空 泡病毒，如SV40、牛痘病毒、腺病毒、雞痘病毒、偽狂犬病病毒及逆 轉(zhuǎn)錄酶病毒所衍生的載體，及由上述組合所衍生的載體。一種產(chǎn)生多肽的特定細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌PET表達(dá)系統(tǒng)(如， pET-28) (Novagen， Inc. ， Madison， Wis)。依照這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，編碼 多肽的DNA以設(shè)計(jì)來(lái)允許其表達(dá)的方向插入pET載體中。由于編碼該多肽的基因是在T7調(diào)節(jié)信號(hào)的控制下，多肽的表達(dá)是通過在宿主細(xì)胞內(nèi)引發(fā)T7 RNA聚合酶表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。其通常使用表達(dá)對(duì)IPTG誘導(dǎo)有反 應(yīng)的T7 RM的宿主株實(shí)現(xiàn)。 一旦產(chǎn)生，隨后重組多肽依照本領(lǐng)域已知 方法，例如，本文所使用的的那些方法而單離。另一種制造多肽的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)是PGEX表達(dá)系統(tǒng)(Pharmacia)。 該系統(tǒng)使用GST基因融合系統(tǒng)，該系統(tǒng)是為了作為融合蛋白的的基因 或其片段的高效表達(dá)且快速純化及復(fù)原功能性基因產(chǎn)物而設(shè)計(jì)。感興 趣的蛋白質(zhì)是融合于來(lái)自Sc力^^w細(xì)J邵朋icwz;的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移 酶蛋白質(zhì)的羧基末端，且可通過谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析而很容易 地從細(xì)菌溶菌液中純化感興趣的蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)可在溫和條件下 通過谷胱甘肽洗脫而恢復(fù)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶區(qū)域上游能為位點(diǎn)特異 性蛋白酶所識(shí)別的辨識(shí)位點(diǎn)的存在可加速?gòu)娜诤霞?xì)胞上將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶區(qū)域裂解。例如，在pGEX-2T質(zhì)粒中表達(dá)的蛋白質(zhì)可由凝血酶 裂解；在pGEX-3X中表達(dá)的蛋白質(zhì)可由Xa因子裂解。另外，本發(fā)明的 重組多肽是表達(dá)于甲醇酵母(？J'c力j'a，Worj's人其為甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母。 可代謝甲醇作為其唯一碳源。甲醇代謝的第一步驟為通過醇氧 化酶使甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛的氧化。該酶的表達(dá)是由甲醇所誘導(dǎo)，該酶由 A0X1基因編碼。A0X1啟動(dòng)子可用于可誘導(dǎo)多肽表達(dá)或用于感興趣基因 組成型表達(dá)的GAP啟動(dòng)子。一旦表達(dá)本發(fā)明的重組多肽，則使用例如，親和層析將重組多肽 單離。在一個(gè)例子中，可將抗本發(fā)明多肽的抗體(如如同本文所述般 產(chǎn)生)附著至管柱，并用于單離重組多肽?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(參 閱，如Ausubel etal. ， supra)于親和層析前對(duì)寄宿著多肽的細(xì)胞進(jìn) 行溶解及分級(jí)。另外，可使用序列標(biāo)簽，如結(jié)合于鎳柱的六組氨酸標(biāo) 簽來(lái)單離該多肽。一旦單離，若想要的話，該重組蛋白質(zhì)可更進(jìn)一步純化，如，通 過高效^夜相層析(參閱，如Fisher， Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology, eds.， Work and Burdon， Elsevier, 1980)。本發(fā)明的多肽，尤其短肽片段也可通過化學(xué)合成產(chǎn) 生(如，描述于Solid Phase P印tide Synthesis, 2nd ed. ， 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, III的方法)。這些多肽表達(dá)及純化的一般方法也可用于產(chǎn)生及單離有用的肽片段或相似體(如同本文所 描述般)。若想要的話，可投用表達(dá)干細(xì)胞聚集因子的載體至眼睛組織，如視網(wǎng)膜色素上皮層。SDF-1 (亦稱為PBSF) (Campbell et al. (1998) Science 279 (5349) : 381-4)、 6-C-kine (亦稱為Exodus-2)及MIP-3 P (亦稱為ELC或Exodus-3)誘導(dǎo)大多數(shù)循環(huán)淋巴細(xì)胞的黏附，包含大 多數(shù)CD4+T細(xì)胞；且MIP-3a (亦稱為L(zhǎng)ARC或Exodus-1)觸發(fā)記憶T細(xì)胞 而非原態(tài)、CD4+ T細(xì)胞的粘附。Tangemann et al. (1998) J. I讀,l. 161: 6330-7揭露次級(jí)淋巴組織吸引因子因子(SLV)的作用，其為高 內(nèi)皮微靜脈(HEV)相關(guān)吸引因子，引導(dǎo)淋巴細(xì)胞至次級(jí)淋巴器官。 Campbell et al. (1998) J. Cell Biol 141(4): 1053-9描述SLC受 體如CCR7，及其配體，SLC可于生理剪力滾動(dòng)下觸發(fā)淋巴細(xì)胞的快速整 合素依賴性阻滯。在其它方法中，投用表達(dá)抗血管生成多肽的載體以降低眼睛組織 內(nèi)新生血管化。這類抗血管生成多肽包含，但不局限于，白介素a， 白介素P 。在又另一些方法中，編碼特征性表達(dá)于眼睛細(xì)胞的多肽的載體被 引入本發(fā)明的干細(xì)胞。在視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞表達(dá)的多肽包含視網(wǎng)膜色素 上皮標(biāo)記，RPE65，及內(nèi)皮組織標(biāo)記，如RPCA-1。若想要的話干細(xì)胞組 成型地表達(dá)CNS內(nèi)皮特異性標(biāo)記(如P-糖蛋白、GLUT-1及轉(zhuǎn)鐵蛋白)。 轉(zhuǎn)染這些載體的干細(xì)胞優(yōu)選展示視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形態(tài)特性及抗原 表達(dá)特性(如，平鋪形態(tài)及RET-PE2及細(xì)胞角蛋白的表達(dá))。視網(wǎng)膜包 含已知的SAGE標(biāo)記的多個(gè)特異性蛋白質(zhì)的例子顯示于表1。表1視網(wǎng)膜特異性/濃縮(enriched) SAGE標(biāo)簽 SAGE標(biāo)簽 基因 視網(wǎng)膜疾病 TGTGCTGAAC轉(zhuǎn)鐵蛋白 -GTAGGAGCTGHRG4 -TACGTGAATT y傳導(dǎo)素 -AGAAGGCCTGROM 1 ADRP GCCCTGTGCT恢復(fù)蛋白(recoverin) -CTGGGTAGCA GAAAAATAAATAACACATTCCGGGGTAGCA GATTTGGATG AGAGCGCAGC GACAATAAAT CTCACCACCA CAGATGGTTT CACCCTCAGCAGAAAATAAATTGCTTTTATATCTTTTTAAGTACATTAGT GGCCCCAGTT CTAACTGCGA CTTTCTCCTT ATGGGTCTGG AGAGCACAGC GACCACAAAAY磷酸二酯酶1. ABCR2. 丙酮酸脫氫酶激酶，同工酶1. 假想蛋白質(zhì)(hypothetical -protein)2. Hs. 1517103. 鈉鈣交換蛋白Y磷酸二酯酶 -Hs.35493 -晶體蛋白，a A MT-原鈣粘蛋白視紫紅質(zhì) Hs. 21299 阻抑素(arrestin)斯特格、CRD、 ARRP白內(nèi)障ADRP、 ARRP、 cSNB小口氏病(Oguchi) ARRP1. 分泌載體膜蛋白12. 光導(dǎo)蛋白3. Hs. 580331. 絨毛膜生長(zhǎng)激素2 (chorionic somatomammotropin hormone 2)2. Hs. 2566351. MAGUK p55亞族成員42. 細(xì)胞色素b-5 簇樣蛋白1 (視網(wǎng)膜) 視紫紅質(zhì)Hs. 13768fH專導(dǎo)素 Hs. 145068 晶體蛋白，a A CACNA1FADRP、 ARRP、 cSNB白內(nèi)障 CSNBACGTGCGCCAGTCAGGAATT TATACCATTT GATGGAGGACACTAGCACGC GGAGCCCTCT TAACAAAACCACAATGTTGT AAGTCTGTTG AGGTCTGCCT TACATCATAT TGATCACGCC TTAACTGTAC ACCCAAGCATTAGTAGGCAC CTGTTACCAG TTTCAAAGGG TACAGTAGTC GTACTTTTAA GAAAATGAGATGGTTGCTGG AGGCCGCTAG TAAAATGCAGCAAGGGGTTC1. a傳導(dǎo)素 CSNB2. 溶質(zhì)運(yùn)載蛋白家族210磷酸二酯酶 CSNB免疫球蛋白超級(jí)家族，成員4 -1. RNA結(jié)合蛋白質(zhì)S1 -2. 0通道 ADRP NRL ADRP NR2E3 ESCS1. 鈣結(jié)合蛋白質(zhì)5/3 -2. Hs. 578983. Hs. 5801細(xì)胞內(nèi)視黃酸結(jié)合蛋白1 _Hs. 300880 _紅/綠視蛋白 色盲a通道 ARRP烯醇酶2 -Hs. 66803 -蛋白磷脂酶，EF手形鈣結(jié)合區(qū)域-2 (rdgC同族體)謹(jǐn)4 _巻曲相關(guān)蛋白質(zhì) _Hs. 98927 -Hs. 239444 -Hs. 261526 _ 絲氨酸蛋白酶抑制劑分支B，成員-6Hs. 33792 -X-阻抑素 -1. 神經(jīng)分化因子D -2. Hs. 271341a通道 ARRPTATATACACA TTTTTGTGTT GGCTGCAATC1. IRBP2. 紡錘體蛋白1. Hs. 1270192. Hs. 503401. 磷酸甘油酸變位酶2. 尿嘧啶二磷酸半乳糖PN-乙酰葡萄糖胺beta 1， 3-半乳糖TATGTATCCT TGCCTGCTAA CTTGTTTTGTTCTACCTATGAGCCGGAGGT ATTTTCAGTT TTGGGCAGGC AACTTCAAGG TGGTAAATGT GGGGACCCTT CTCTTCTGGA GGAAGGAAAATCCAAACTAA GGGTGGGGGATGCTTCTTCT(UDP-GEil:betaGlcNAc beta 1， 3- galactosyltransferaseSH3區(qū)域結(jié)合富含谷氨酸類蛋白2Hs. 988811. 視網(wǎng)膜同源盒蛋白質(zhì)2. Hs. 127991. 谷胱甘肽過氧化酶32. 鈣蛋白酶9 雙特異性磷酸酶6 Hs. 250591Hs. 213731 Hs. 154131鳥苷酸環(huán)化酶激活因子1C HT017鳥苷酸環(huán)化酵激活因子IA1. 三磷酸腺苷酶，H+傳送，溶酶 體，成員D2. Hs. 43112 YPDE1. 囊泡相關(guān)膜蛋白22. Hs. 2206563. Hs. 340046 NDRG家族，成員4TGTCAGTCTT AAGTTTGGCC TCCCTGGTGCTTTTATTGCA ATACTCATTG AGAGACCCTCHs. 310689 轉(zhuǎn)鐵蛋白1. 突角蟲回蛋白 l(sy卿togyrin 1)2. Hs. 279307 蛋白激酶錨定蛋白 Hs. 122245Hs. 113689轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒(如逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、腺病毒及腺相關(guān)病毒)載體可用于 體細(xì)胞基因療法，尤其是因?yàn)槠涓咝У母腥拘约胺€(wěn)定的整合性及表達(dá)(參閱，如Cayouette et al. ， Human Gene Therapy 8:423-430， 1997; Kido et al. ， Current Eye Research 15:833-844， 1996; Bloomer et al.， 了o訓(xùn)al of Virology 71 :6641-6649， 1997; Naldini et al.， Science 272:263-267， 1996; and Miyoshi et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319， 1997)。例如，可將編碼HSP蛋白質(zhì)、變異體 或其片段的多核苷酸克隆至逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載活體內(nèi)，而表達(dá)可由其內(nèi) 生性啟動(dòng)子、由逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)或由組織或感興趣細(xì)胞的特異 性啟動(dòng)子(如眼睛組織，如脈絡(luò)膜或視網(wǎng)膜色素上皮層)所驅(qū)動(dòng)。其 它可用的病毒載體包含，例如，牛痘病毒、牛刺瘤病毒或孢疹病毒， 如Epstein-Barr病毒(亦參閱，如Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244: 1275—1281， 1989; Eglitis et al.， BioTechniques 6: 608-614， 1988; Tolstoshev et al. ， Current Opinion in Biotechnology 1: 55—61, 1990; Sharp, The Lancet 337: 1277—1278， 1991; Cornetta et al. ， Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36: 311-322， 1987; Anderson, Science 226: 401-409， 1984; Moen， Blood Cells 17: 407-416， 1991; Miller et al.， Biotechnology 7: 980-990， 1989; Le Gal La Salle et al.， Science 259:988-990， 1993;及Johnson, Chest 107: 77S-83S, 1995 的那些病毒)。逆轉(zhuǎn)錄病毒的發(fā)展特別完善并已用于臨床設(shè)置(Rosenberg et al. ， N. Engl. J". Med 323: 370， 1990; Anderson etal.，美國(guó)專利號(hào)5， 399， 346)。最優(yōu)選，病毒載體用于將HSP多核苷 酸投用至眼。也可使用非病毒方法以將有療效的多核苷酸引入病人細(xì)胞內(nèi)(如 眼睛細(xì)胞或組織)。例如，核酸分子可通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(Feigner et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413， 1987; Ono et al.， Neuroscience Letters 17: 259， 1990; Brigham et al. ， Am. J". Med. Sci. 298: 278， 1989; Staubinger et al. ， Methods in Enzymology 101: 512， 1983 )、通過脫唾液酸血清類粘蛋白-聚賴氨酸共軛 (asialoorosomucoid-polylysine conjugation) (Wu et al. ， Journal of Biological Chemistry 263: 14621， 1988; Wu et al. ， Journal of Biological Chemistry 364: 16985， 1989)或是通過外科微注射(Wolff et al.， Science 247: 1465， 1990)而引入細(xì)胞。優(yōu)選地，核酸是與 脂質(zhì)體及精蛋白組合投用。基因轉(zhuǎn)移也可通過非病毒手段，包含活體外轉(zhuǎn)染而實(shí)現(xiàn)。這類方 法包含使用磷酸鈣、DEAE右旋糖、電穿孔及原生質(zhì)體融合。脂質(zhì)體對(duì) 投送DNA進(jìn)入細(xì)胞具有潛在好處。將正?；蛞浦踩氩∪耸芮忠u組織 也可通過轉(zhuǎn)移正常核酸至活體外可培養(yǎng)細(xì)胞類型(如自體或外源初級(jí) 細(xì)胞或其子代)，隨后將該細(xì)胞(或其子代)注射于目標(biāo)組織而實(shí)現(xiàn)。用于多核苷酸治療方法的cDNA表達(dá)可由任何合適的啟動(dòng)子(如人 類巨細(xì)胞病毒(CMV)猴病毒40 (SV40)或金屬硫蛋白啟動(dòng)子)所指示， 且可被任何恰當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物調(diào)節(jié)元素調(diào)節(jié)。組成型啟動(dòng)子的示范例包 含下列基因的啟動(dòng)子，該基因編碼組成型或「持家」功能的基因次 黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)、 二氫葉酸還原酶(DHFR) (Scharfmann et al.， Proc. Natl Acad. Sci. USA 88: 4626-4630 (1991))、腺苷 脫氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、肌 動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Lai et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989))， 及熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)者所知的其它組成型啟動(dòng) 子。另外，許多病毒啟動(dòng)子組成性地作用于真核細(xì)胞內(nèi)。這些中尤其 包含SV40的早期與晚期啟動(dòng)子、莫羅尼白血病病毒及其它逆轉(zhuǎn)錄酶 病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)及單純孢疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子。據(jù)此， 上述任何組成型啟動(dòng)子可用于控制外源性插入基因的轉(zhuǎn)錄。在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的基因，其在引發(fā)劑存在下僅或達(dá)很大程 度地表達(dá)(如在某些金屬離子的存在下金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn) 錄顯著提高)?？烧T導(dǎo)啟動(dòng)子包含應(yīng)答元素(RE)，當(dāng)它與它的誘導(dǎo)因 子結(jié)合后刺激轉(zhuǎn)錄。例如，存在血清因子、甾類激素、視黃酸及環(huán)AMP的應(yīng)答元素。為了獲得可誘導(dǎo)反應(yīng)，可選擇含有特定RE的啟動(dòng)子，在 一些情況中，RE本身可附于不同啟動(dòng)子，以提供重組基因誘導(dǎo)性。因 此，通過選擇合適的啟動(dòng)子(組成型相對(duì)可誘導(dǎo)的；強(qiáng)相對(duì)弱)可控制基因經(jīng)過修飾的干細(xì)胞及/或視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)治療劑的存在及表達(dá)量。據(jù)認(rèn)為，為了投送有效量的特定治療劑對(duì)這些因子做選擇及最佳化，是落在熟系本領(lǐng)域技術(shù)人員于考量上述揭露的因子及病人臨床試驗(yàn)下不需過度實(shí)驗(yàn)即可實(shí)施的范疇內(nèi)。在至少一個(gè)啟動(dòng)子及一個(gè)編碼治療劑外源性核酸之外，表達(dá)載體優(yōu)選包含選擇基因，例如，抗新霉素基因，以加速選擇已轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)誘 導(dǎo)表達(dá)載體的干細(xì)胞。若想要的話，已知在特定細(xì)胞類型優(yōu)先指示基因表達(dá)的增強(qiáng)子可 被用于指示核酸表達(dá)。所使用的增強(qiáng)子包含，但不局限于，特征為組 織或細(xì)胞特異性的那些增強(qiáng)子。另外，若使用基因組克隆作為治療構(gòu) 造，介導(dǎo)調(diào)節(jié)可通過同源調(diào)節(jié)序列，或若想要的話，衍生自外源性來(lái) 源的調(diào)節(jié)序列，包含任何上述啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元素。包含于本發(fā)明的其它治療方法包括投用重組治療劑，如重組HSP蛋白，變異體，或其片段，要么直接投用至潛在或確實(shí)感染疾病的組 織位點(diǎn)，要么投用至全身(例如，通過任何常規(guī)重組蛋白質(zhì)投用技術(shù))。 投用蛋白質(zhì)的劑量取決于一些因素，包含個(gè)體病人的體型大小及健康 狀況。于任何特定對(duì)象，特殊計(jì)量方案應(yīng)依照個(gè)體需要及作出投用或 指示投用組合物的人的專業(yè)判斷于一段時(shí)間后調(diào)整。眼睛途徑是引發(fā)干細(xì)胞及/或載體定位至眼睛組織的較佳藥物接 種途徑。然而，其作為較佳投用途徑并非意圖排除任何其它投用途徑。 較佳的載體投用途徑是通過玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下途徑。眼睛途徑包含 但不局限于，結(jié)膜下注射、表面滴液緩釋裝置如膠原保護(hù)層、水凝膠隱形眼鏡或ALZA 「毛果蕓香堿控釋膜(Ocusert)」。結(jié)膜下接種的實(shí)現(xiàn) 是在注射0.2-0.5ml載體前使用丙美卡因麻醉，注射劑量為10-1000ug/接種，以胰島素注射器及小規(guī)(small gauge)針給藥。注射 于下部閉塞以確保疫苗物質(zhì)維持在下結(jié)膜內(nèi)并不外漏。表面滴液接種包括放置結(jié)合或不結(jié)合輔佐劑及/或干細(xì)胞運(yùn)輸藥 物的載體于結(jié)膜閉塞處，隨后閉眼輕揉30秒。該過程可每天重復(fù)二到 三次，共五天以延長(zhǎng)暴露，其皆包含單一接種。為了更佳的保持，淚 排泄管可暫時(shí)使用膠原質(zhì)或其它裝置阻塞。另外，載體及/或裸露DNA 可封裝于微膠囊中并移植入眼以易于其持續(xù)釋放。套組本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防眼睛疾病、失調(diào)或其癥狀的套組。在 一個(gè)具體例中，該套組包含藥學(xué)包，其包含有效量HSP90伴侶調(diào)節(jié)物 (如格爾德霉素)或熱休克反應(yīng)激活物(如雷公藤紅素)。優(yōu)選地，組 合物以單元?jiǎng)┬痛嬖凇Ｔ谝恍┚唧w例中，該套組包含無(wú)菌容器，該無(wú) 菌容器含有治療性或預(yù)防性組合物；這類容器可為盒、針劑、瓶、封 閉小瓶、試管、袋、小袋、泡沬包裝，或其它本技藝領(lǐng)域中已知的合 適容器形式。這類容器可由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔或其它合適 保存藥物的物質(zhì)制成。若想要的話，指導(dǎo)說明可與本發(fā)明的多個(gè)組合物或其組合共同提 供，該指導(dǎo)說明為投用組合物或其組合至患有或存在發(fā)展眼睛疾病或 失調(diào)，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管化、青光眼視網(wǎng)膜色素 病變、與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變、青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng) 膜先天性裂、斯特格病變、常染色體顯形玻璃膜疣及貝斯特氏黃斑營(yíng) 養(yǎng)不良。指導(dǎo)說明一般包含關(guān)于治療或預(yù)防眼睛疾病或是失調(diào)化合物 使用的資訊。在其它具體例中，指導(dǎo)說明包含至少以下一項(xiàng)化合物 或其組合的描述；治療眼睛疾病或其癥狀的劑量計(jì)劃及投用方法；注 意事項(xiàng)；警告；適應(yīng)癥；反向指示語(yǔ)；用藥過量資訊；副作用；動(dòng)物 藥理；臨床研究；及/或參考。該指導(dǎo)說明可直接印刷于容器上(若有 容器的話)，或作為容器的標(biāo)簽，或?yàn)閱为?dú)的紙、小冊(cè)子、卡片或文件 夾，于容器內(nèi)或與其一同提供。 實(shí)施例l:通過激光聚集干細(xì)胞以GFP+干細(xì)胞構(gòu)建嵌合小鼠，該小鼠接受接近致命輻射并移植入該 GFP+干細(xì)胞。以來(lái)自GFP純合基因轉(zhuǎn)植供給體的表達(dá)GFP造血干細(xì)胞制造嵌合小鼠。此些細(xì)胞被移植入接受接近致命輻射的受體內(nèi)。所有后續(xù)的激光都是使用這些gfp嵌合小鼠(C57B16.gfp)。使用具有點(diǎn)半徑為 75um的810nm兩極管激光，多種能量程度被投于視網(wǎng)膜，包含在視網(wǎng)膜 不產(chǎn)生可見激光組織反應(yīng)(激光發(fā)光1130W/cra")的5mJ (50mW， 0. lmsec) 的能量。這被視為低于可見閾下。激光后三周，無(wú)痛致死動(dòng)物并收集 其眼球。準(zhǔn)備眼杯并移除感覺祌經(jīng)視網(wǎng)膜。接受閾下激光能的眼球證實(shí)其有力的聚集造血干細(xì)胞(HSC)至視 網(wǎng)膜色素上皮層而呈擴(kuò)散模式。此變化發(fā)生于兩周內(nèi)。如圖1與2所 示，閾下激光引發(fā)成熟干細(xì)胞遷移并修復(fù)視網(wǎng)膜色素上皮。圖1顯示 了在RPE量上顯著的依靠工作期的gfp+細(xì)胞定位。圖1中黑色區(qū)域表明 并入接受過激光的RPE區(qū)域的GFP+細(xì)胞。將以對(duì)側(cè)(未受襲)眼確定的 背景螢光從此圖像中移除。圖2為定量人干細(xì)胞(HSC)合并入RPE的 量的圖表。實(shí)施例2:聚集至視網(wǎng)膜的HSC表達(dá)視網(wǎng)膜特異性標(biāo)記共聚焦免疫螢光顯微鏡法顯示GFP+細(xì)胞與RPE特異性蛋白質(zhì)RPE65 共位，這表明聚集的造血干細(xì)胞具有后天RPE特性。也證實(shí)這些眼球同 時(shí)擴(kuò)及內(nèi)皮細(xì)胞聚集。接受高能激光(150mW， 0.1 sec)的眼球(具有 視網(wǎng)膜渾濁)表明GFP+的HSC與內(nèi)皮細(xì)胞一起病灶聚集至疤痕區(qū)域。閾下 激光引發(fā)HSC遷移至并并入RPE。合并的程度與激光工作期相關(guān)聯(lián)。15% 工作期可導(dǎo)致最大程度的HSC合并。實(shí)施例3:閾下激光增加hsp70， hsp90，及引發(fā)熱休克反應(yīng)導(dǎo)致SDF-1 與VEGF的釋放眼睛激光是治療多種視網(wǎng)膜失調(diào)的重要工具。在大多數(shù)情況中， 作用歸因于視網(wǎng)膜可見變化(也就是，激光引發(fā)光化學(xué)灼燒)。據(jù)信810 納米兩極體激光對(duì)于感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜造成較小傷害，這是因?yàn)榧す饽?為RPE所吸收。圖2證實(shí)在RPE量上顯著的依靠工作期的GFP+細(xì)胞定位。 在10%工作期時(shí)有最大反應(yīng)。其通過使用與細(xì)胞療法非常相似的過繼轉(zhuǎn) 移方法另外確認(rèn)。過繼轉(zhuǎn)移包括全身投用HSC并導(dǎo)致這些細(xì)胞快速歸路 (homing)至產(chǎn)生化學(xué)趨化物的區(qū)域。微脈沖激光臨床發(fā)展已減小視網(wǎng)膜的光裂解傷害。用于微脈沖模 式的紅外(810nm)激光是一種潛在治療視網(wǎng)膜失調(diào)來(lái)說相對(duì)新的模式。在單一次暴露下重復(fù)地使用簡(jiǎn)短的激光脈沖將限制熱傳導(dǎo)量及之后的 RPE傷害。在臨床上，最近因?yàn)檫@點(diǎn)而被采納。據(jù)認(rèn)為，熱休克反應(yīng)是 細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)，這是基于熱休克蛋白質(zhì)整體限制蛋白質(zhì)錯(cuò)折迭的能力。 為了確定使用微脈沖激光(其通過熱力效果作用而引發(fā)熱休克反 應(yīng)及/或引發(fā)細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子)是否吸引HSC至眼，使用具有可變 工作期的紅外激光來(lái)檢測(cè)感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜以及含有RPE與脈絡(luò)膜復(fù)合物的后杯內(nèi)hsp70， hsp90的mRNA表達(dá)時(shí)間過程。Hsp70峰值提高可 于激光后兩小時(shí)在神經(jīng)視網(wǎng)膜觀測(cè)到，于激光后四小時(shí)在后眼杯內(nèi)觀 測(cè)到。Hsp90的mRNA于兩小時(shí)時(shí)峰值明顯地都出現(xiàn)于神經(jīng)視網(wǎng)膜及后 眼杯。亦在后眼杯觀測(cè)到激光所引發(fā)的SDF-1及其受體CXCR-4的表達(dá)。 激光后兩小時(shí)的檢測(cè)表明簡(jiǎn)短的激光影響RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)制并重編 RPE細(xì)胞以產(chǎn)生一系列能夠聚集HSC至視網(wǎng)膜的因子。激光后四小時(shí)， 可觀測(cè)到SDF-1及CXCR-4的表達(dá)提高。由于已知SDF-1及CXCR-4對(duì) 缺氧有反應(yīng)，檢測(cè)激光視網(wǎng)膜于HIF-lamRNA量的作用。在后眼杯內(nèi) HIF-1 a的mRNA量于兩小時(shí)時(shí)降低并于四小時(shí)時(shí)增加。這些研究支持由SDF-1及CXCR-4調(diào)節(jié)的RPE自分泌及旁分泌。在 不希望受到任何理論束縛的情況下，可能閾下激光促發(fā)(prime)RPE-光 受體層的細(xì)胞外環(huán)境，且創(chuàng)造用以接受聚集HSC的環(huán)境。生長(zhǎng)證據(jù)表 明細(xì)胞外hsp70是神經(jīng)保護(hù)劑。在不希望受到任何理論束縛的情況下， hsp70可能在視網(wǎng)膜內(nèi)通過促進(jìn)聚集HSC至視網(wǎng)膜而作為神經(jīng)保護(hù)因 子，以提供RPE修復(fù)。熱休克蛋白有可能作用于聚集HSC至視網(wǎng)膜。 其可通過活體內(nèi)局部產(chǎn)生化學(xué)吸引蛋白質(zhì)后的HSC的聚集而實(shí)現(xiàn)。 實(shí)施例4:初級(jí)RPE培養(yǎng)物于熱休克后Hsp70 mRNA量的增加為了確定RPE是否可作為所觀測(cè)到的活體內(nèi)細(xì)胞因子反應(yīng)的來(lái)源， 將人類初級(jí)RPE與ARPE19 (永生化RPE細(xì)胞)培養(yǎng)物熱休克。在熱休 克后二小時(shí)，可觀測(cè)到熱休克蛋白質(zhì)HIF-1 a及SDF-1與VEGF的mRNA 的抑制作用。在RPE培養(yǎng)物中，可觀測(cè)到hsp90的mRNA量顯著提高40 倍。該活體外hsp90實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其活體內(nèi)結(jié)果相似。顯著地，在初級(jí) RPE培養(yǎng)物內(nèi)可觀測(cè)到hsp70的mRNA量提高50倍，其表明固有RPE 細(xì)胞釋放這個(gè)假定的神經(jīng)保護(hù)劑?；谶@些活體內(nèi)數(shù)據(jù)，在不希望受 到任何理論束縛的情況下RPE可能為促使HSC聚集至視網(wǎng)膜的吸引因子的來(lái)源。這并不排除其它細(xì)胞類型參與聚集反應(yīng)的可能性?？傃灾@些結(jié)果首次表明可通過激光或藥學(xué)引發(fā)HSC局部聚集至視網(wǎng)膜，包含RPE層。這是由熱休克反應(yīng)的SVL引發(fā)所實(shí)現(xiàn)。激光 引發(fā)熱休克反應(yīng)是暫時(shí)與HIF-1 a釋放相關(guān)，并隨后與HSC化學(xué)吸引物 SDF-1及VEGF相關(guān)。本案結(jié)果并未產(chǎn)生臨床上可見激光灼傷或疤痕。 本方法以它沒有損傷而與其它引起可見視網(wǎng)膜損傷的激光方法相區(qū) 分。實(shí)施例5:化學(xué)引發(fā)的熱休克會(huì)聚集HSC至RPE這些觀測(cè)結(jié)果可延伸至初級(jí)人類RPE細(xì)胞內(nèi)化學(xué)引發(fā)的熱休克反 應(yīng)。暴露于激光后四小時(shí)，h印70量大幅提升，并在hsp90， h印32及 晶體蛋白的mRNA量有適當(dāng)提升。亦可觀測(cè)到SDF-1的表達(dá)。該表達(dá)的 時(shí)間過程反映了傳統(tǒng)熱休克引發(fā)的過程。此外，圖3顯示化學(xué)引發(fā)的熱休克聚集HSC至RPE。以小分子引發(fā) 物的藥學(xué)引發(fā)熱休克反應(yīng)是通過玻璃體內(nèi)格爾德霉素注射或通過分開 暴露RPE細(xì)胞以使SDF-1及VEGF同等引發(fā)。此些實(shí)驗(yàn)提供不論是通過 激光或藥學(xué)引發(fā)所引發(fā)的熱休克直接導(dǎo)致HIF-la及關(guān)鍵HSC吸引因 子SDF-1及VEGF的產(chǎn)生的決定性證據(jù)。更進(jìn)一步，其表明藥學(xué)處理有 效的聚集HSC至RPE層并分化。臨床研究表明年長(zhǎng)病人其體內(nèi)循環(huán)中的HSC量降低。這些細(xì)胞可 從骨髓中動(dòng)員并進(jìn)入體循環(huán)以聚集至視網(wǎng)膜。目前，常見干態(tài)ARMD沒 有有效治療方法。本發(fā)明提供治療ARMD的激光及藥學(xué)方法。本方法更 進(jìn)一步提供針對(duì)ARMD的造血干細(xì)胞療法。本研究表明老化修復(fù)缺陷可 能與引起發(fā)展成ARMD的有關(guān)，并更進(jìn)一步表明通過使用激光及藥學(xué)方 法的組合以提高修復(fù)功能可治療ARMD。尤其地，本發(fā)明提供多個(gè)方法， 其為通過提供動(dòng)員HSC的試劑，如GM-CSF，來(lái)促動(dòng)A脂D病人，接著通 過閾下激光或玻璃體內(nèi)注射可引發(fā)熱休克反應(yīng)的化合物而引起RPE層 的細(xì)胞修復(fù)。上述所得結(jié)果是使用以下方法及材料。 欲 敏房學(xué)做"通過周期性(如每月)ERG (用于確定光受體功能的非侵入式方法) 評(píng)測(cè)治療及未治療眼睛視網(wǎng)膜功能以確定激光或藥劑療法的效果。視網(wǎng)膜電圖學(xué)是一種非侵入式技術(shù)，其在麻醉動(dòng)物中測(cè)定對(duì)光的角膜電反應(yīng)。小鼠以80-100mg/kg可他命及5-10mg/kg甲苯噻嗪的混合物經(jīng) 腹腔注射麻醉(Phoenix Pharmaceuticals, St. Jos印h， M0)。小鼠 角膜以一滴0. 5%鹽酸丙美卡因(Akorn， Buffalo Grove， IL)麻醉， 并以一滴2.5%鹽酸去氧腎上腺素(Akorn)擴(kuò)大。末端纏有金線圈的測(cè) 量電極被放置于二角膜上，并以一滴2.5%羥丙甲纖維素(Akorn)保持 電極接觸與角膜水合。于小鼠下頭皮中心皮下放置一個(gè)參考電極，接 地電極被放置于后腿皮下。小鼠靜置于自制滑動(dòng)平臺(tái)以保持其在37。 C 恒溫下。小鼠適當(dāng)放置以使其整個(gè)頭部位于UTAS-E2000可見電診斷系 統(tǒng)(XKC Technologies, Inc. ， Gaithersburg， MD) 的Ganzfeld (全 域)照明圓頂內(nèi)。全域暗視ERG由一分鐘時(shí)間段內(nèi)強(qiáng)度為0.9及1.91og cd m-2的10微秒閃光測(cè)定。反應(yīng)是以4000的增進(jìn)擴(kuò)大，在0. 3至500 Hz間過濾，在二通道 內(nèi)以2000Hz的速率數(shù)字化。在每一強(qiáng)度將五個(gè)反應(yīng)平均。使用 UTAS-E2000軟體包(LKC Technologies, Inc.)分析波形。A-波在負(fù) 角膜向自基線至波峰測(cè)定；b-波自負(fù)角膜峰至主要正角膜峰測(cè)定。動(dòng)物在其眼中接受三次抗生素軟膏(Vetropolycin)以維持后續(xù) 步驟眼內(nèi)濕度，在這些動(dòng)物重返動(dòng)物園前，其于37° C暖盤上復(fù)蘇。 接受可他命/甲苯噻嗪麻醉的動(dòng)物亦可接受0. 01-0. 02ml/g體重的暖的 LRS SQ。 総錄澄產(chǎn)治療及未治療眼的視網(wǎng)膜檢測(cè)是通過眼底鏡檢查評(píng)測(cè)。眼底鏡檢 查是非侵入式技術(shù)，其中麻醉動(dòng)物的視網(wǎng)膜照片被拍下。小鼠被麻醉， 其眼角膜如上文ERG試驗(yàn)中描述被麻醉并擴(kuò)大。眼底照相以專門相機(jī) 及透鏡實(shí)施，以Kowa Genesis手持基底相機(jī)(Kowa Company, Ltd., Tokyo, Japan)通過Volk Super 66 Stereo Fundus Lens (Keeler， Berkshire, England)聚焦完成。通常每只眼拍攝兩張照片以確保圖 像恰當(dāng)聚焦。動(dòng)物在其眼中接受三次抗生素軟膏(Vetropolycin)以 維持后續(xù)歩驟眼內(nèi)濕度，在這些動(dòng)物重返動(dòng)物園前，其于37° C暖盤 上復(fù)蘇。接受可他命/甲苯噻嗪麻醉的動(dòng)物亦接受0. 01-0. 02ml/g體重 的暖的LRS SQ。激光治療動(dòng)物術(shù)前準(zhǔn)備包括確定牠們身體是活躍的并可接受麻醉。小鼠需 為無(wú)任何眼分泌或白內(nèi)障跡象以使它們易于觀察視網(wǎng)膜并進(jìn)行激光灼燒治療。在激光治療前，小鼠以80-100mg/kg可他命及5-10mg/kg甲 苯噻嗪混合經(jīng)腹月空注身寸麻醉(Phoenix Pharmaceuticals, St. Joseph, M0)。沒有任何的角膜水腫或白內(nèi)障的形成是與使用這些麻醉劑有關(guān)。 麻醉程度通過足墊收縮及呼吸率測(cè)定。無(wú)足墊收縮反應(yīng)表明該動(dòng)物被 恰當(dāng)?shù)芈樽?。在激光治療前或期間不使用眼睛軟膏，這是因?yàn)樗鼘⒆?止有效的激光治療。施用一些抗生素軟膏來(lái)保護(hù)未治療眼。若證實(shí)足 墊收縮后無(wú)反應(yīng)則可進(jìn)行激光治療。在激光治療所需時(shí)間內(nèi)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)表明疼痛，緊張或不適。若在 激光手術(shù)前或期間該動(dòng)物顯示增多的活動(dòng)，則需將其暴露于異氟烷下 10秒以補(bǔ)充麻醉。大約lml異氟烷吸收于放置于50ml塑料離心試管底 部的褶皺Kimwipe上，蓋上該試管。若想要的話，試管開端可于動(dòng)物 鼻部附近短暫停留。該過程進(jìn)行于通風(fēng)罩內(nèi)。此后維持測(cè)定該動(dòng)物的 呼吸率，其疼痛反應(yīng)通過足墊收縮測(cè)定。如足墊收縮后無(wú)運(yùn)動(dòng)，則可 進(jìn)行激光手術(shù)。激光治療于每只小鼠約費(fèi)時(shí)30秒。腹腔注射育亨賓 (2mg/kg體重)是用于消除可他命/甲苯噻嗪的作用。這可縮短眼睛由 于麻醉下?lián)p失的瞬目反射的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)間。術(shù)后無(wú)反常行為。激光治療后可發(fā)生疼痛，緊張或不適。文獻(xiàn)表明藉助過程最后于 角膜應(yīng)用酮洛酸使人類從激光治療恢復(fù)(Kosrirukvongs et al， Topical ketorolac trometh咖ine in the reduction of adverse effects of laser in situ keratomileusist, J". Med Assoc Thai, 2001; 84: 804-810及Price, et al， Pain reduction after laser in situ keratomileusis with ketorolac tromethamine ophthalmic solution 0.5%: a randomized, doubled-masked, placebo—controlled trail, J. Refeact Surg， 2002; 18: 140-144)。因此，在激光治療后酮洛酸 溶液(0. 5%0P)滴液被用于小鼠眼48小時(shí)，或更長(zhǎng)時(shí)間(若有需要的 話)。此溶液的商業(yè)名為Acular PF溶液。以Acular PF治療過程于小 鼠并無(wú)副作用，而通過試驗(yàn)注射賦形劑的動(dòng)物證明該過程對(duì)新生血管 化并無(wú)作用。動(dòng)物可豢養(yǎng)于籠中并維持于室溫下(18-26°C)，或37。C暖盤上，持續(xù)目測(cè)直至其顯示由麻醉中恢復(fù)的跡象。從麻醉中完全恢 復(fù)僅表現(xiàn)于該動(dòng)物完全警覺并于籠中走動(dòng)。 雌纖供體小鼠在收集骨髓前以人道方式無(wú)痛致死，此過程并非存活手術(shù)。通過注射過量克他命(甲苯噻嗪60 mg/Kg，克他命30 mg/Kg)投 用IP無(wú)痛致死動(dòng)物。在喪失深度疼痛后(以失去足尖/足墊收縮反應(yīng)確 定)，對(duì)其進(jìn)行頸部去臼以確定死亡。為了收集小鼠骨髓衍生干細(xì)胞，無(wú)菌條件下割下4至8周大表達(dá) 增強(qiáng)螢光蛋白(GFP)的基因轉(zhuǎn)殖小鼠的大腿骨并。切除大腿骨兩端， 使用2. 5ml注射器及21-量規(guī)注射針，以5ml DMEM培養(yǎng)液(匿EM; Nissui Co. ， Tokyo, Japan)擠出骨髓，該DMEM培養(yǎng)液含有10%胎牛血清，2 mM L-谷氨酸，100單元/mL青霉素G，及10%肝磷脂。進(jìn)行FACS試驗(yàn)以 確定恰當(dāng)?shù)腂MSC表現(xiàn)型。 麟離浙腹腔內(nèi)注射步驟如下盡可能靠近耳朵的后頸處將樣本拿起。以同 一只手的小指拿住小鼠尾巴。使用26量規(guī)無(wú)菌皮下注射針刺穿皮膚及 腹部肌肉并小心地將注射針內(nèi)內(nèi)含物注入腹腔內(nèi)，小心避開橫膈膜及 其它內(nèi)部器官。如上文所述麻醉小鼠。使用鹽酸丙美卡因0.5% (Alcon Laboratories, Inc. ， Fort Worth, TX)進(jìn)行額夕卜局部麻醉。注射前 將鹽酸苯腎上腺素及/或硫酸阿托品用于眼球表面以達(dá)到擴(kuò)瞳而將過 程中的傷害減至最小，注射后使用三次抗生素眼藥膏以防止感染。使 用30量規(guī)注射針在顳緣后0.5mm刺一孔，微注射針由此切口插入，大 約1.5mm深，朝向感光神經(jīng)角度至針尖于玻璃體中心可見。所有注射 藉助解剖顯微鏡而看見，該解剖顯微鏡為Nikon SM2800 (Nikon， Melville, NY)，其由光纖燈源提供照明。該光纖燈源來(lái)自Southern Micro Instruments 150瓦特光纖燈源并具有Schott Fostec光纖臂 (Southern Micron Instruments, Marietta, GA)。接著緩慢弓l入至2 微升藥物懸濁液至玻璃體，小心地取回注射針。這個(gè)過程后，小鼠可在干凈籠內(nèi)的暖盤上恢復(fù)。觀測(cè)動(dòng)物直至其完全從過程中恢復(fù)，之后將這些動(dòng)物歸回動(dòng)物園。 凝歉微對(duì)于局部投送干細(xì)胞，眼球后注射是替代后部筋脈內(nèi)注射以移植 干細(xì)胞的良好方法。如上文所述以克他命/甲苯噻嗪，或通過精密噴霧 器投用異氟烷麻醉小鼠。眼睛上方毛被溫和縮回，類似于出血過程。使用lcc注射器及27或30g注射針進(jìn)行注射，向外斜并以45°角插入眼球后部竇中心區(qū)域。小心地向前以針尖刺穿眼球后竇，確定注射針約至竇中部。緩慢注入至200ul細(xì)胞懸濁液。該細(xì)胞懸濁液在注射前過濾使其不含塊。注射后，小心移除注射針，保持斜角向外以使小鼠 眼球不被刮傷。對(duì)多重注射來(lái)說，至少注射與注射間需間隔2天。后續(xù)注射使用 交替眼球，每只小鼠每眼最多接受2次注射。于注射前一分鐘投用丙 美卡因局部麻醉。眼球后注射創(chuàng)傷顯著小于同一位置眼睛出血。術(shù)后檢查或觀測(cè)該 位置以確保眼睛無(wú)創(chuàng)傷。每一注射后，且一旦出血完全止住即將抗生 素眼藥膏均勻涂抹于眼睛以防止感染。該過程后，在隨后24-48小時(shí) 內(nèi)檢測(cè)動(dòng)物疼痛跡象(面部痙攣，斜視)并視需要給予止痛劑。于麻醉后，觀測(cè)動(dòng)物直至其有意識(shí)并可走動(dòng)，之后將這些動(dòng)物歸 回動(dòng)物園。 其它具體例由上文描述，很明顯可對(duì)如同本文所述的本發(fā)明作變化及修正以 使其合適于不同使用及狀況。這類具體例亦包含于以下權(quán)利要求的范 疇內(nèi)。以在任何定義中的變量描述的元素列表包含作為任何單一元素或 列表中元素的組合來(lái)對(duì)變量作定義。對(duì)如同本文所使用的具體例的描 述包含該具體例作為任何單一具體例或其任何其它具體例或部分的組 合。如果獨(dú)立的專利及刊物特別且單獨(dú)地被指明要并入本案參考的 話，所有本說明書提及的專利及刊物于此以相同程度并入本案參考。
權(quán)利要求
1.一種改善對(duì)象眼睛疾病的方法，其包括(a)在眼睛組織的至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)引發(fā)熱休克；及(b)聚集干細(xì)胞至該眼睛組織，由此改善該眼睛疾病。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中在該眼睛組織引發(fā)該熱休克是使用閾下激光(SVL)刺激。
3. 如權(quán)利要求l項(xiàng)所述的方法，其中引發(fā)該熱休克是使用小分子化合 物，該小分子化合物選自由格爾德霉素、雷公藤紅素、17-丙烯胺 基-17-去甲氧基格爾德霉素、EC102、根赤殼菌素、二牛龍牛兒基 丙酮(geranylgeranylacetone)、芍藥苷、PU-DZ8及H-71所組成的 群組。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中引發(fā)該熱休克是使用多肽，該多肽 選自由Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40所組成的群組。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中引發(fā)該熱休克是使用包括編碼熱休 克多肽的多核苷酸的表達(dá)載體。
6. 如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法提高熱休克蛋白 質(zhì)的表達(dá)或活性，該熱休克蛋白質(zhì)選自由Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40所組成的群組。
7. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中該熱休克多肽是Hsp70或 Hsp90。
8. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中干細(xì)胞是造血干細(xì)胞。
9. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中該方法降低至少一種眼睛疾病或失調(diào)的癥狀。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該眼睛疾病或失調(diào)選自由糖尿病視 網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管化、青光眼視網(wǎng)膜色素病變、與年齡相 關(guān)的黃斑退行性改變、青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜先天性裂(retinoschises)、其Jf特格病變(Stargardt， s Disease)、常染色 體顯形玻璃膜疣及貝斯特黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(Best， s macular dystrophy)、黃斑囊樣水腫、視網(wǎng)膜脫離、光損傷、缺血性視網(wǎng)膜 病變、炎癥引發(fā)的視網(wǎng)膜病變、X伴性青年性視網(wǎng)膜先天性裂、青 光眼、莫拉蒂致拉分提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂 巢狀視網(wǎng)膜萎縮所組成的群組。
11. —種聚集干細(xì)胞至需要的對(duì)象的眼睛組織的方法，其組成包括以閾 下激光剌激眼睛組織，其中剌激的程度是足以使至少一個(gè)干細(xì)胞聚 集至該組織。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中使用的工作期為10%或15%。
13. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中該閾下激光具有自至少約100nm 至2000nm的波長(zhǎng)。
14. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中該閾下激光能自約5mW至200mW。
15. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中該閾下激光能自約10mW至100mW。
16. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中該激光以微脈沖投用。
17. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中微脈沖的持續(xù)時(shí)間自約0.001毫 秒至1.0毫秒。
18. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中微脈沖的持續(xù)時(shí)間為0. 1毫秒。
19. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中該閾下激光能是在10mW與100mW之間且以0. 1毫秒的脈沖投用。
20. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中該刺激提高熱休克蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性，該熱休克蛋白質(zhì)選自由HsplOO、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及 Hsp40所組成的群組。
21. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中該剌激改變蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性， 該蛋白質(zhì)選自由SDF-1 、 VEGF 、 HIF-la 、晶狀球體蛋白、缺氧 誘導(dǎo)因子l-a (HIF-la)及CXCR-4組成的組。
22. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中該方法提高至少10倍的Hsp70或 Hsp90多肽的表達(dá)。
23. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中該方法提高至少40倍的Hsp70或 Hsp90多肽的表達(dá)。
24. —種聚集干細(xì)胞至需要的對(duì)象眼睛組織的方法，其包括(a) 向?qū)ο笸队米銐蛟谘劬M織內(nèi)引發(fā)熱休克的量的試劑；及(b) 聚集干細(xì)胞至該眼睛組織。
25. —種改善需要的對(duì)象眼睛疾病或失調(diào)的方法，其包括(a) 向?qū)ο笸队米銐蛟谘劬M織內(nèi)引發(fā)熱休克的量的試劑；及(b) 聚集干細(xì)胞至該眼睛組織，從而改善該眼睛疾病或失調(diào)。
26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中該眼睛疾病或失調(diào)是選自由糖尿 病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管化、青光眼視網(wǎng)膜色素病變、與年 齡相關(guān)的黃斑退行性改變、青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜先天性 裂(retinoschises)、斯特格病變(Stargardt， s Disease)、常染 色體顯形玻璃膜疣及貝斯特黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(Best， s macular dystrophy)、黃斑囊樣水腫、視網(wǎng)膜脫離、光損傷、缺血性視網(wǎng)膜 病變、炎癥引發(fā)的視網(wǎng)膜病變、X伴性青年性視網(wǎng)膜先天性裂、青光眼、莫拉蒂致拉分提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂 巢狀視網(wǎng)膜萎縮所組成的群組。
27. —種使需要的對(duì)象視網(wǎng)膜再生的方法，其包括(a) 向?qū)ο笸队米銐蛟谘劬M織內(nèi)引發(fā)熱休克的量的試劑；及(b) 聚集干細(xì)胞至該眼睛組織，從而使視網(wǎng)膜再生。
28. —種修復(fù)需要的對(duì)象的視網(wǎng)膜色素上皮損傷的方法，其包括a) 向?qū)ο笸队米銐蛟谘劬M織內(nèi)引發(fā)熱休克的量的試劑；及b) 聚集干細(xì)胞至該眼睛組織，從而修復(fù)該視網(wǎng)膜色素上皮。
29. 如權(quán)利要求22-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中引發(fā)該熱休克是使用 小分子化合物。
30. 如權(quán)利要求29的方法，其中該小分子化合物選自由格爾德霉素、 雷公藤紅素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素、EC102、根赤 殼菌素、二牛;fe牛JL基丙酉同(geranylgeranylacetone)、茍藥昔、 PU-DZ8及H-71所組成的群組。
31. 如權(quán)利要求22-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中引發(fā)該熱休克是使用 多肽。
32. 如權(quán)利要求22-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中引發(fā)該熱休克是使用 包括編碼熱休克多肽的多核苷酸的表達(dá)載體。
33. 如權(quán)利要求30或31的方法，其中該熱休克多肽選自由Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40所組成的群組。
34. 如權(quán)利要求22-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中該試劑提高熱休克蛋 白質(zhì)的表達(dá)或生物活性，該熱休克蛋白質(zhì)選自由HsplOO、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40所組成的群組。
35. 如權(quán)利要求22-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中該試劑改變蛋白質(zhì)的 表達(dá)或活性，該蛋白質(zhì)選自由SDF-1 、 VEGF 、 HIF-la 、晶狀球 體蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子卜a (HIF-la)及CXCR-4所組成的群組。
36. 如權(quán)利要求22-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法提高至少10 倍Hsp70或Hsp90多肽的表達(dá)。
37. 如權(quán)利要求22-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法提高至少40 倍Hsp70或Hsp90多肽的表達(dá)或活性。
38. 如權(quán)利要求1-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中提高造血干細(xì)胞動(dòng)員 作用的試劑是在熱休克反應(yīng)引發(fā)前投用于對(duì)象。
39. 如權(quán)利要求1-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法更進(jìn)一步包括 投用抗炎劑或抗血管生成劑。
40. 如權(quán)利要求1-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法更進(jìn)一歩包括 投用支持造血千細(xì)胞的存活、增生或轉(zhuǎn)分化的試劑。
41. 如權(quán)利要求1-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中該對(duì)象患有眼睛疾病 或失調(diào)，該眼睛疾病或失調(diào)選自由糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生 血管化、青光眼視網(wǎng)膜色素病變、與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變、 青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜先天性裂(retinoschises)、斯特 格病變(Stargardt， s Disease)、常染色體顯形玻璃膜疣及貝斯 牛寺黃珍王營(yíng)養(yǎng)不良(Best， s macular dystrophy)、黃斑囊樣水月中、 視網(wǎng)膜脫離、光損傷、缺血性視網(wǎng)膜病變、炎癥引發(fā)的視網(wǎng)膜病變、 X伴性青年性視網(wǎng)膜先天性裂、青光眼、莫拉蒂致拉分提那斯 (Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂巢狀視網(wǎng)膜萎縮所組成的群 組。
42. 如權(quán)利要求1-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法更進(jìn)一歩包括投用全反式視黃醛，以增強(qiáng)干細(xì)胞成為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分 化。
43. —種改善需要的對(duì)象眼睛疾病或失調(diào)的方法，其包括(a) 向該對(duì)象投用動(dòng)員對(duì)象的骨髓衍生干細(xì)胞的試劑；(b) 在眼睛組織內(nèi)引發(fā)熱休克；及(C)聚集該干細(xì)胞至眼睛組織，從而改善該眼睛疾病或失調(diào)。
44. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中該試劑是巨噬細(xì)胞集落刺激因子或干細(xì)胞因子。
45. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中引發(fā)該熱休克是使用閾下激光治 療。
46. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中引發(fā)該熱休克是使用為小分子化 合物、多肽或核酸分子的試劑。
47. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中該小分子化合物選自由格爾德霉 素、雷公藤紅素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素、EC102、 根赤殼菌素、二牛龍牛兒基丙酉同(geranylgeranylacetcme)、茍藥 苷、PU-DZ8及H-71所組成的群組。
48. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中該眼睛疾病或失調(diào)選自由糖尿病 視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管化、青光眼視網(wǎng)膜色素病變、與年齡 相關(guān)的黃斑退行性改變、青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜先天性裂 (retinoschises)、其Jf特格病變(Stargardt， s Disease)、常染色 體顯形玻璃膜疣及貝斯特黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(Best ， s macular dystrophy)、黃斑囊樣水腫、視網(wǎng)膜脫離、光損傷、缺血性視網(wǎng)膜 病變、炎癥引發(fā)的視網(wǎng)膜病變、X伴性青年性視網(wǎng)膜先天性裂、青 光眼、莫拉蒂致拉分提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂 巢狀視網(wǎng)膜萎縮所組成的群組。
49. 一種改善需要的對(duì)象黃斑退行性改變的方法，其包括(a) 向該對(duì)象投用GM-CSF及/或干細(xì)胞因子，其中該投用動(dòng)員該對(duì) 象的骨髓衍生干細(xì)胞。(b) 通過投用閾下激光治療或試劑在眼睛組織中弓I發(fā)熱休克；及(c) 聚集骨髓衍生干細(xì)胞至眼睛組織，從而改善該黃斑退行性改變。
50. 如權(quán)利要求49所述的方法，其中該試劑選自由格爾德霉素、雷公 藤紅素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素、EC102、根赤殼菌 素、二牛;fe牛JL基丙酉同(geranylgeranylacetone)、茍藥一昔、PU—DZ8 及H-71所組成的群組。
51. 如權(quán)利要求1-49任一項(xiàng)所述的方法，其中該試劑是通過玻璃體內(nèi) 或球后注射而投用。
52. 如權(quán)利要求49所述的方法，其中該投用引發(fā)RPE層的細(xì)胞修復(fù)。
53. 如權(quán)利要求1-49任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法更進(jìn)一步包括投 用編碼治療性多肽的載體。
54. 如權(quán)利要求1-49任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法更進(jìn)一步包括向 該對(duì)象投用實(shí)質(zhì)上純化的干細(xì)胞。
55. 如權(quán)利要求1-49任一項(xiàng)所述的方法，其中該干細(xì)胞通過玻璃體內(nèi) 或球后注射而局部投用。
56. —種聚集干細(xì)胞的藥學(xué)組合物，其包括在藥學(xué)可接受的賦形劑內(nèi)的 有效量的小分子化合物，該小分子化合物選自由格爾德霉素、雷公 藤紅素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素、EC102、根赤殼菌 素、二牛龍牛兒基丙酉同(geranylgeranylacetone)、茍藥昔、PU—DZ8 及H-71所組成的群組，該組合物為眼睛給藥而配方。
57. —種在眼睛組織聚集干細(xì)胞的藥學(xué)組合物，該組合物包括在藥學(xué)可 接受的賦形劑內(nèi)的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括編碼熱休克多肽的多 核苷酸，該組合物為眼睛給藥而配方。
58. 如權(quán)利要求54所述的藥學(xué)組合物，其中該熱休克多肽選自由 Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40所組成的群組。
59. —種在眼睛組織聚集干細(xì)胞的藥學(xué)組合物，該組合物包括在藥學(xué)可 接受的賦形劑內(nèi)的多肽，該多肽選自由Hspl00、Hsp90、Hsp70、Hsp60 及Hsp40所組成的群組。
60. —種套組，其包括在眼晴組織引發(fā)熱休克的有效量的試劑，及使用 該套組提高干細(xì)胞聚集的說明指導(dǎo)。
61. 如權(quán)利要求60所述的套組，其中該試劑是多肽、多核苷酸或小分 子化合物。
62. 如權(quán)利要求60所述的套組，其中該多肽是Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 H印60及Hsp40。
63. 如權(quán)利要求第60所述的套組，其中該多核苷酸編碼Hspl00、Hsp90、 H印70、 Hsp60及Hsp40。
64. 如權(quán)利要求60所述的套組，其中該小分子化合物選自由格爾德霉 素、雷公藤紅素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素、EC102、 根赤殼菌素、二牛龍牛兒基丙酉同(geranylgeranylacetone)、茍藥 苷、PU-DZ8及H-71所組成的群組。
65. —種識(shí)別提高眼睛組織的千細(xì)胞聚集的試劑的方法，其包括(a) 將眼睛細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；(b) 相對(duì)于未處理眼睛細(xì)胞，識(shí)別熱休克多肽的表達(dá)或活性的提高，從而識(shí)別提高干細(xì)胞聚集的化合物。
66. —種識(shí)別提高眼睛組織的干細(xì)胞聚集的試劑的方法，其包括:(a) 將眼睛細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；(b) 識(shí)別該組織內(nèi)干細(xì)胞數(shù)目的增加。
全文摘要
本發(fā)明大體來(lái)說是提供聚集(recruiting)干細(xì)胞至眼睛組織的方法，該方法包括在眼睛組織使用閾下激光及/或試劑引發(fā)熱休克。在一些具體例中，在投用動(dòng)員(mobilize)HSC的試劑后引發(fā)熱休克。
文檔編號(hào)A61F2/00GK101267779SQ200680034325
公開日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2006年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者M·G·格蘭特, S·考沙爾 申請(qǐng)人:福羅里達(dá)大學(xué)研究基金會(huì)有限公司