本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組人熱休克蛋白及其編碼基因，本發(fā)明還涉及所述重組人熱休克蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是在從細菌到哺乳動物中廣泛存在的一類熱應激蛋白質(zhì)，當有機體暴露于高溫時就會由熱激發(fā)合成此類蛋白質(zhì)，來保護有機體自身。熱休克蛋白10(HSP10)是熱休克蛋白家族中的一員，又稱為CPN10、GROES或HSPE1，其廣泛存在于人、動物、微生物和植物細胞中，是一類在遺傳上高度保守的蛋白質(zhì)。人熱休克蛋白10基因位于2號染色體q33.1位點，該基因長度是306bp，編碼產(chǎn)物人熱休克蛋白10由102個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為10KD。

人熱休克蛋白10廣泛存在于人體的各類組織中，研究表明，HSP10在多種應激條件下，比如，高溫、紫外線、藥物、重金屬、缺氧等的刺激下大量表達，作為分子伴侶保護細胞功能，抑制細胞凋亡的發(fā)生；能夠通過翻譯后修飾擴大胰島素樣生長因子1受體通路，保護心肌細胞免受缺血性損傷；能夠減輕同種移植的免疫排斥反應；同時，也有研究提示，HSP10與生殖不孕不育有關(guān)。大量的研究表明，HSP10具有不可限量的市場價值，不僅可以用于藥物開發(fā)，還可以作為生物美容的新成員，應用于美容化妝品行業(yè)中。

雖然人熱休克蛋白10具有廣闊的應用領(lǐng)域，但是當前還缺少高效表達人熱休克蛋白10的方法，并且，當人熱休克蛋白10應用于化妝品中時，存在皮膚穿透能力較差的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種重組人熱休克蛋白、其編碼基因以及制備方法。

一方面，本發(fā)明提供了一種重組人熱休克蛋白10，包括：

(1)人熱休克蛋白10的氨基酸序列；

(2)細胞穿膜肽的氨基酸序列；和

(3)柔性連接肽的氨基酸序列，用于連接所述人熱休克蛋白10的氨基酸序列和所述細胞穿膜肽的氨基酸序列。

前述的重組人熱休克蛋白10，所述細胞穿膜肽的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:4的序列，或者，與序列表中SEQ ID No:4的序列的同源性在90％以上(優(yōu)選95％，更優(yōu)選98％)且具有相同活性的氨基酸序列。

前述的重組人熱休克蛋白10，所述柔性連接肽的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:6的序列。

前述的重組人熱休克蛋白10，所述重組人熱休克蛋白10的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:1的氨基酸序列。

另一方面，本發(fā)明提供了重組人熱休克蛋白10的制備方法，包括：

(1)獲得基因：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:2的序列，對pPIC9K載體及人工全基因合成的SEQ ID No:2的序列進行XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒；

(2)轉(zhuǎn)化：將步驟(1)制備的質(zhì)粒與感受態(tài)畢赤酵母混合進行轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化后菌落；

(3)篩選多拷貝重組子：將步驟(2)轉(zhuǎn)化后的菌落進行進一步培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子，獲得重組人熱休克蛋白10工程菌；

(4)發(fā)酵培養(yǎng)誘導表達：對步驟(3)獲得的重組人熱休克蛋白10工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)獲得重組人熱休克蛋白10發(fā)酵液；

(5)純化：對步驟(4)獲得的重組人熱休克蛋白10發(fā)酵液依次進行固液分離、過濾、濃縮和離子交換層析得到產(chǎn)品。

前述的制備方法，所述步驟(5)的純化的具體步驟為：將步驟(4)得到的發(fā)酵液經(jīng)離心進行固液分離，取上清液，對發(fā)酵上清液進行微濾，收集濾液，再進行超濾脫鹽濃縮，收集濃縮液，然后進行離子交換層析，即可得到產(chǎn)品。

前述的制備方法，包括：

(1)制備質(zhì)粒

人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:2的序列，然后對pPIC9K載體及人工全基因合成的SEQ ID No:4的序列進行XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為pPIC9K-YARA-HSP10；

(2)畢赤酵母電轉(zhuǎn)化

將經(jīng)SalⅠ內(nèi)切酶線性化的pPIC9K-YARA-HSP10質(zhì)粒，與畢赤酵母感受態(tài)細胞混勻，轉(zhuǎn)至冰預冷的電轉(zhuǎn)化杯中，電擊，加入冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，涂布MD培養(yǎng)基平板，倒置培養(yǎng)，在MD培養(yǎng)基平板上長出菌落；

(3)多拷貝插入重組子的篩選

將MD培養(yǎng)基平板上長出的菌落對應接種到G418濃度分別為0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，培養(yǎng)，篩選獲得轉(zhuǎn)化子；

(4)發(fā)酵

將篩選到的工程菌接種于BMGY培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，作為一級種子轉(zhuǎn)接于裝有FBS培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，pH值在5.5左右，作為二級種子轉(zhuǎn)接入裝有FBS培養(yǎng)基的大罐發(fā)酵；

(5)純化

將步驟(4)得到的發(fā)酵液經(jīng)離心進行固液分離，取上清液，用分子截留量為80000D的中空纖維超濾系統(tǒng)進行超濾，收集濾液，用分子量為1000D的卷式超濾膜超濾，收集濃縮液，隨后進行離子交換層析，即可得到產(chǎn)品。

另一方面，本發(fā)明提供了重組人熱休克蛋白10的編碼基因。

前述的編碼基因，所述編碼基因是序列表中SEQ ID No:2的核苷酸序列，或者，與SEQ ID No:2具有至少90％(優(yōu)選95％，更優(yōu)選98％)同源性且編碼相同功能蛋白的核苷酸序列。

另一方面，本發(fā)明提供了含有前述編碼基因的表達載體。

另一方面，本發(fā)明提供了含有前述編碼基因的細胞系。

本發(fā)明的重組人熱休克蛋白10在不影響活性的前提下極大的提高了人熱休克蛋白10的皮膚穿透能力。

附圖說明

圖1是實施例中重組表達載體pPIC9K-YARA-HSP10的質(zhì)粒圖譜。

圖2是實施例中YARA-HSP10的PCR產(chǎn)物圖。

圖3是實施例中SDS-PAGE電泳圖。

圖4是實施例中Western-blot結(jié)果。

圖5是實施例中重組人熱休克蛋白10免疫熒光檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

為了充分說明本發(fā)明解決技術(shù)問題所實施使用的技術(shù)方案。下面結(jié)合實施例和附圖對發(fā)明做詳細說明,但本發(fā)明的技術(shù)方案、技術(shù)方案的實施方式以及保護范圍并不僅僅限于此。除非另有說明，否則下文中出現(xiàn)的科技和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是在從細菌到哺乳動物中廣泛存在的一類熱應激蛋白質(zhì)，當有機體暴露于高溫時就會由熱激發(fā)合成此類蛋白質(zhì)，來保護有機體自身。熱休克蛋白10(HSP10)是熱休克蛋白家族中的一員，又稱為CPN10、GROES或HSPE1，其廣泛存在于人、動物、微生物和植物細胞中，是一類在遺傳上高度保守的蛋白質(zhì)。人熱休克蛋白10基因位于2號染色體q33.1位點，該基因長度是306bp，編碼產(chǎn)物人熱休克蛋白10由102個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為10KD，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:3的序列。

細胞穿膜肽是一類能攜帶大分子物質(zhì)進入細胞的短肽，其穿膜能力不依賴經(jīng)典的胞吞作用。這類物質(zhì)均為帶有正電荷的長短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，二級結(jié)構(gòu)皆具有α-螺旋的空間構(gòu)象。

針對當前無法高效表達人熱休克蛋白10且其用于化妝品時皮膚穿透能力較差的問題，本發(fā)明人設(shè)計了一段柔性連接肽，將細胞穿膜肽連接人熱休克蛋白10(人HSP10)的氮端，在不影響活性的前提下，達到提高人熱休克蛋白10的皮膚穿透能力的目的。

根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供了一種重組人熱休克蛋白10，其包括(1)人熱休克蛋白10的氨基酸序列；(2)細胞穿膜肽的氨基酸序列；和(3)柔性連接肽的氨基酸序列。其中，柔性連接肽用于連接所述人熱休克蛋白10的氨基酸序列和所述細胞穿膜肽的氨基酸序列。

在一種具體實施方式中，所述細胞穿膜肽的氨基酸序列是YARAAARQARA(即序列表中SEQ ID No:4的序列，簡稱穿膜肽YARA)，或者，與SEQ ID No:4的同源性在90％以上(優(yōu)選95％以上，更優(yōu)選98％以上)且具有相同活性的氨基酸序列；所述柔性連接肽的氨基酸序列是GGGS。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，穿膜肽YARA可攜帶肽類物質(zhì)進入皮膚的表面和真皮，并且其轉(zhuǎn)導能力是穿膜肽TAT的33倍。利用柔性連接肽將穿膜肽YARA連接到人熱休克蛋白10，獲得重組人熱休克蛋白10，以未連接穿膜肽的人熱休克蛋白10為對照，利用免疫熒光技術(shù)對重組人熱休克蛋白10進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)在不影響活性的前提下，重組人熱休克蛋白10的細胞膜穿透能力相比于對照得到了極大的提升。

在一種優(yōu)選的具體實施方式中，本發(fā)明的重組人熱休克蛋白10的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:1的氨基酸序列。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了上述重組人熱休克蛋白10的制備方法，包括：

(1)獲得基因：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:2的序列，對pPIC9K載體及人工全基因合成的SEQ ID No:2的序列進行XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒；

(2)轉(zhuǎn)化：將步驟(1)制備的質(zhì)粒與感受態(tài)畢赤酵母混合進行轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化后菌落；

(3)篩選多拷貝重組子：將步驟(2)轉(zhuǎn)化后的菌落進行進一步培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子，獲得重組人熱休克蛋白10工程菌；

(4)發(fā)酵培養(yǎng)誘導表達：對步驟(3)獲得的重組人熱休克蛋白10工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)獲得重組人熱休克蛋白10發(fā)酵液；

(5)純化：對步驟(4)獲得的重組人熱休克蛋白10發(fā)酵液依次進行固液分離、過濾、濃縮和離子交換層析得到產(chǎn)品。

在一種優(yōu)選的具體實施方式中，所述方法包括如下步驟：

(1)基因的獲得

設(shè)計一段柔性連接肽，核苷酸序列為GGTGGTGGTAGT(即序列表中SEQ ID No:5的序列)，在人熱休克蛋白10基因序列的N端，通過柔性連接肽連接穿膜肽YARA；采用全基因合成方法合成細胞穿膜肽YARA-柔性連接肽-人熱休克蛋白10基因(簡稱YARA-HSP10)。該穿膜肽YARA-HSP10基因的核苷酸序列為是序列表中SEQ ID No:2的核苷酸序列，具體如下：

上游和下游分別引入了Xho I和Not I的限制性酶切位點，Xho I的限制性酶切位點是CTCGAG，Not I的限制性酶切位點是GCGGCCGC。。

(2)pPIC9K載體與重組人熱休克蛋白10基因的連接

對pPIC9K、YARA-HSP10進行Xho I和Not I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，提取質(zhì)粒命名為pPIC9K-YARA-HSP10，測序鑒定，測序結(jié)果顯示，YARA-HSP10已正確連接至pPIC9K，說明pPIC9K-YARA-HSP10表達載體構(gòu)建成功。

(3)畢赤酵母感受態(tài)制備

挑取畢赤酵母單菌落，接種至含有YPD培養(yǎng)基試管中，培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至含有新鮮YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)過夜，至OD600值達到1.2～2.0。將細胞培養(yǎng)物離心，棄上清，用冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸，離心，按照相同方法用冰預冷的D-山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，離心棄上清。重復兩次。用冰預冷的D-山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，置于冰水混合物中待用。

(4)畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)化

將經(jīng)Sal I內(nèi)切酶線性化的pPIC9K-YARA-HSP10質(zhì)粒，與畢赤酵母感受態(tài)細胞混勻，轉(zhuǎn)至冰預冷的電擊杯中，電擊4～10毫秒，加入冰預冷的D-山梨醇水溶液將菌體混勻，涂布MD培養(yǎng)基平板，倒置培養(yǎng)直至MD培養(yǎng)基平板上長出菌落。

(5)多拷貝重組子的篩選

將MD培養(yǎng)基平板上長出的菌落用無菌牙簽對應接種到G418濃度分別為0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培養(yǎng)，篩選獲得轉(zhuǎn)化子。

(6)重組人熱休克蛋白10工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)誘導表達

將篩選得到的工程菌接種于BMGY培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24小時，作為一級種子轉(zhuǎn)接于裝有FBS培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，維持pH值在5.5左右(pH值5-6)培養(yǎng)16～20小時，小罐培養(yǎng)，作為二級種子轉(zhuǎn)接入大罐，進行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液通過離心進行固液分離，保留上清液，目的蛋白即存在于上清液中。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了編碼上述重組人熱休克蛋白10的編碼基因。優(yōu)選地，所述編碼基因是序列表中SEQ ID No:2的核苷酸序列，或者，與SEQ ID No:2具有至少90％同源性，優(yōu)選至少93％、95％、97％、98％或99％同源性且編碼相同功能蛋白的核苷酸序列。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明還提供了含有所述基因的表達載體，和含有基因的細胞系。

在一種特別優(yōu)選的具體實施方式中，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明人設(shè)計了一段柔性連接肽，氨基酸序列是GGGS(即序列表中SEQ ID No:6的序列)，通過柔性連接肽GGGS將穿膜肽YARA與人熱休克蛋白10連接，得到重組人熱休克蛋白10，氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:1的序列。

編碼上述重組人熱休克蛋白10的基因的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No:2的序列。

上述重組人熱休克蛋白10的制備方法包括下述步驟：

(1)基因的獲得

設(shè)計一段柔性連接肽，序列為GGTGGTGGTAGT(即序列表中SEQ ID No:5的序列)，在人熱休克蛋白10基因序列的N端，通過柔性連接肽連接穿膜肽YARA；采用全基因合成方法合成細胞穿膜肽YARA-柔性連接肽-人熱休克蛋白10基因(簡稱YARA-HSP10)，即序列表中SEQ ID No:2的核苷酸序列。上游和下游分別引入了Xho I和Not I的限制性酶切位點。

(2)pPIC9K載體與重組人熱休克蛋白10基因的連接

對pPIC9K、YARA-HSP10進行Xho I和Not I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，提取質(zhì)粒命名為pPIC9K-YARA-HSP10，測序鑒定，測序結(jié)果顯示，YARA-HSP10已正確連接至pPIC9K，說明pPIC9K-YARA-HSP10表達載體構(gòu)建成功。

(3)畢赤酵母GS115感受態(tài)制備

挑取畢赤酵母單菌落，接種至含有5mL YPD培養(yǎng)基試管中，30℃，225rpm培養(yǎng)過夜。取100μL的培養(yǎng)物接種至含有50mL新鮮YPD培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃，225rpm培養(yǎng)過夜，至OD600值達到1.2～2.0。將細胞培養(yǎng)物于4℃，1500g離心5min，棄上清，用50mL的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸。離心，按照相同方法用20mL的冰預冷的1mol/L的D-山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，離心棄上清。重復兩次。用0.5mL的冰預冷的1mol/L的D-山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為0.7mL。置于冰水混合物中待用。

(4)畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)化

將10uL經(jīng)Sal I內(nèi)切酶線性化的pPIC9K-YARA-HSP10質(zhì)粒，與100uL畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞混勻，轉(zhuǎn)至2mm冰預冷的電擊杯中，電擊5ms，加入1mL冰預冷的1mol/L的D-山梨醇水溶液將菌體混勻，涂布MD培養(yǎng)基平板，29℃倒置3-4天，待MD培養(yǎng)基平板上長出菌落。

(5)多拷貝重組子的篩選

將MD培養(yǎng)基平板上長出的菌落用無菌牙簽對應接種到G418濃度分別為0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，29℃培養(yǎng)，篩選獲得轉(zhuǎn)化子。

(6)重組人熱休克蛋白10工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)誘導表達

將篩選得到的工程菌接種于400mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)24小時，作為一級種子轉(zhuǎn)接于裝有4L FBS培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，溫度恒定為30℃，用氨水調(diào)pH值，維持pH值在5.5左右，小罐培養(yǎng)16-20h，作為二級種子轉(zhuǎn)接入150L大罐。誘導溫度為29℃，溶氧控制在20％～30％，當溶氧(Dissolved oxygen，DO)陡然上升時(預示基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的甘油已耗盡，此階段耗時約20h)，開始流加補料生長培養(yǎng)基(含12mL/L PTM1的50％甘油，維持DO 30％左右)發(fā)酵。發(fā)酵液的濕重達到300g/L時，停止補料，饑餓1h，甘油耗盡后流加發(fā)酵誘導培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度為75％的含12mL/L PTM1的甲醇水溶液)，以低的速率流加甲醇維持2～3h的過渡階段，過渡階段結(jié)束后，提高甲醇流加速率并維持補料速度在10.9mL/L/h左右進行發(fā)酵。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓和通氣量使溶氧大于20％，誘導發(fā)酵42h左右。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液通過離心進行固液分離，保留上清液，目的蛋白即存在于上清液中。經(jīng)測定，重組人熱休克蛋白10的產(chǎn)量可達450mg/L。

(7)重組人熱休克蛋白10的純化

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心分離，取上清液80L，用分子截留量為80000D的中空纖維超濾系統(tǒng)進行超濾，收集濾過液，用分子量為1000D的卷式超濾膜超濾，收集濃縮液，通過上述兩步超濾法即可去除畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)生的色素及一些雜蛋白，獲得重組人熱休克蛋白10粗蛋白濃縮液。將重組人熱休克蛋白10粗蛋白液進行陽離子交換層析，填料選用CM Sepharose FF，購于美國GE公司，用3倍柱體積的pH為7.5的20mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡，上樣，用10倍柱體積的含1.0mol/L NaCl的pH值為7.5的20mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，收集重組人熱休克蛋白10蛋白液，用分子量為1000D的卷式超濾膜超濾，脫鹽，收集濃縮液，用冷凍干燥機凍干，獲得重組人熱休克蛋白10，發(fā)酵上清液表達量達450mg/L。

實施例

下面對本發(fā)明實施例中的測定方法以及材料來源進行說明。

pPIC9K購于Invitrogen公司

Xho I和Not I購于Thermo Fisher公司

本實施例的重組人熱休克蛋白10全長117個氨基酸，該蛋白質(zhì)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:1的序列，具體如下：

上述的基因重組人熱休克蛋白10制備方法如下：

(1)基因的獲得

設(shè)計一段柔性連接肽，序列為GGTGGTGGTAGT(即序列表中SEQ ID No:5的序列)，在人熱休克蛋白10基因序列的N端，通過柔性連接肽連接穿膜肽YARA；采用全基因合成方法合成YARA穿膜肽-柔性連接肽-人熱休克蛋白10基因(簡稱YARA-HSP10)。該穿膜肽YARA-HSP10基因的核苷酸序列為是序列表中SEQ ID No:2的核苷酸序列，具體如下：

在上下游引入限制性酶切位點Xho I和Not I。重組人熱休克蛋白10基因的電泳結(jié)果見圖1。

(2)pPIC9K載體與重組人熱休克蛋白10基因的雙酶切

對PPIC9K、YARA-HSP10進行Xho I和Not I雙酶切，酶切體系如下：

上述試劑加好后，37℃，PCR儀控溫酶切1小時，用DNA純化試劑盒，按照說明書，從1.2％的瓊脂糖凝膠上回收特異性條帶。

(3)pPIC9K載體與重組人熱休克蛋白10基因(即YARA-HSP10)的連接

利用T4DNA連接酶對pPIC9K和YARA-HSP10片段進行連接，反應體系如下：

上述體系混勻后，于22℃，連接4小時，命名為pPIC9K-YARA-HSP10。

(4)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

取冷凍的DH5a感受態(tài)細胞1管40uL，置于冰上解凍，加入上述連接產(chǎn)物pPIC9K-YARA-HSP10，混勻，置冰上30min，42℃水浴熱激90s，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻2-3min，加入300uL滅菌的LB液體培養(yǎng)基，混勻，37℃溫育1小時，吸取200uL菌液，涂于含有氨芐青霉素(50ug/mL)的固體LB平板上，37℃，倒置培養(yǎng)12-18小時，挑去單菌落接種于含有氨芐青霉素(50ug/mL)的5mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃，225rpm，搖床培養(yǎng)14小時，對菌液進行PCR鑒定(圖2)，鑒定陽性的菌液外送測序，測序結(jié)果顯示，穿膜肽YARA-HSP10已正確連接至pPIC9K，說明pPIC9K-YARA-HSP10表達載體構(gòu)建成功。

(5)畢赤酵母GS115感受態(tài)制備

挑取畢赤酵母單菌落，接種至含有5mL YPD培養(yǎng)基試管中，30℃，225rpm培養(yǎng)過夜。取100μL的培養(yǎng)物接種至含有50mL新鮮YPD培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃，225rpm培養(yǎng)過夜，至OD600值達到1.2～2.0。將細胞培養(yǎng)物于4℃，1500g離心5min，棄上清，用50mL的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸。離心，按照相同方法用20mL的冰預冷的1mol/L的D-山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，離心棄上清。重復兩次。用0.5mL的冰預冷的1mol/L的D-山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為0.7mL。置于冰水混合物中待用。

(6)畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)化

將10uL經(jīng)Sal I內(nèi)切酶線性化的pPIC9K-YARA-HSP10質(zhì)粒，與100uL畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞混勻，轉(zhuǎn)至2mm冰預冷的電擊杯中，電擊5ms，加入1mL冰預冷的1mol/L的D-山梨醇水溶液將菌體混勻，涂布MD培養(yǎng)基平板，29℃倒置3-4天，待MD培養(yǎng)基平板上長出菌落。

(7)多拷貝重組子的篩選

將MD培養(yǎng)基平板上長出的菌落用無菌牙簽對應接種到G418濃度分別為0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，29℃培養(yǎng)，篩選獲得轉(zhuǎn)化子。

(8)重組人熱休克蛋白10工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)誘導表達

將篩選到的工程菌接種于400mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600達10左右，轉(zhuǎn)接于裝有4L FBS(1L中含甘油40g、K₂SO₄ 18.2g、H₃PO₄26.7mL、CaSO₄.2H₂O 0.93g、MgSO₄14.9g、KOH 4.13g混合制成)培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，溫度恒定為30℃，用氨水調(diào)pH值，維持pH值在5.5左右，溶氧控制在20％～30％，小罐培養(yǎng)16-20h，轉(zhuǎn)接入150L大罐。發(fā)酵過程中，當溶氧(Dissolved oxygen，DO)陡然上升時(預示基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的甘油已耗盡，此階段耗時20h)，開始流加18.15mL/h/L質(zhì)量百分濃度為50％的甘油，在質(zhì)量百分濃度為50％的甘油中含有12mL/L微量元素PTM1(1L中含有CuSO₄.5H₂O 6g、NaI 0.08g、MnSO₄.H₂O 3g、Na₂MoO₄.H₂O 0.2g、H₃BO₃ 0.02g、H₂SO₄ 5mL、CoCl₂.6H2O 0.5g、ZnCl₂ 20g、FeSO₄.7H₂O 75g、生物素0.2g，混合制成)。發(fā)酵液的濕重達到300mg時，停止補料，饑餓1h，甘油耗盡后流加發(fā)酵誘導培養(yǎng)基(含12mL/L PTM1的甲醇)，以低的速率流加甲醇維持2～3h的過渡階段，溫度設(shè)置為28℃。過渡階段結(jié)束后，提高甲醇流加速率并維持補料速度在10.9mL/L/h左右進行發(fā)酵。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓和通氣量使溶氧大于20％，誘導發(fā)酵42h左右。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液通過離心進行固液分離，保留上清液，目的蛋白即存在于上清液中。HSP10產(chǎn)量可達450mg/L。

(9)重組人熱休克蛋白10蛋白的純化

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心分離，取上清液80L，用分子截留量為80000D的中空纖維超濾系統(tǒng)進行超濾，收集濾過液，用分子量為1000D的卷式超濾膜超濾，收集濃縮液，通過上述兩步超濾法即可去除畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)生的色素及一些雜蛋白，獲得重組人熱休克蛋白10粗蛋白濃縮液。將重組人熱休克蛋白10粗蛋白液進行陽離子交換層析，填料選用CM Sepharose FF，購于美國GE公司，用3倍柱體積的pH為7.5的20mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡，上樣，用10倍柱體積的含1.0mol/L NaCl的pH值為7.5的20mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，收集重組人熱休克蛋白10蛋白液，用分子量為1000D的卷式超濾膜超濾，脫鹽，收集濃縮液，用冷凍干燥機凍干，獲得重組人熱休克蛋白10，發(fā)酵上清液表達量達450mg/L。

(10)基因重組人熱休克蛋白10的檢測

(10.1)配制試劑

低雙丙烯酰胺母液：9.6g丙烯酰胺，0.3g甲叉雙丙烯酰胺，溶于20mL水；

高雙丙烯酰胺母液：9.3g丙烯酰胺，0.6g甲叉雙丙烯酰胺，溶于20mL水；

凝膠緩沖液：2.422g三羥甲基氨基甲烷，0.02g十二烷基硫酸鈉(SDS)，溶于20mL水，HCl調(diào)節(jié)pH至8.45；

陽極緩沖液：12.11g三羥甲基氨基甲烷加水溶解，定容至500mL，用HCl調(diào)pH至8.9；

陰極緩沖液：6.06g三羥甲基氨基甲烷，8.89g三甲基甘氨酸(Tricine)，0.5g十二烷基硫酸鈉(SDS)，加水至500mL；

固定液：30mL乙醇，0.5mL戊二醛，加水定容至100mL；

染色液：0.125g考馬斯亮藍R250，10mL冰醋酸，45mL甲醇，加水至100mL；

脫色液：10mL冰醋酸，45mL甲醇，加水至100mL；

(10.2)膠的配制

按如下體積配制質(zhì)量百分濃度為16％的分離膠：

向玻璃板間灌注6mL的分離膠，立即覆一層二次蒸餾水，聚合30min。

如下體積配制質(zhì)量百分濃度為10％的間隔膠：

將分離膠上層二次蒸餾水倒去，濾紙吸干，灌注1mL間隔膠，加水水封，聚合30min。

再按如下體積配制質(zhì)量百分濃度為4％的濃縮膠：

間隔膠聚合以后，灌注2mL的濃縮膠，插上樣品梳，聚合30min。

(10.3)電泳

將40uL蛋白樣品與10uL上樣緩沖液混合，放入水浴鍋100℃加熱5min，在電泳槽底部加入陽極緩沖液，將制好的膠連同其裝置放入電泳槽，在兩塊膠之間注入陰極緩沖液，30V電泳預電泳10min，然后上樣。當染料從間隔膠進入分離膠時，加大電壓至90V，繼續(xù)電泳直至結(jié)束。電泳結(jié)果如圖3。

(11)重組人熱休克蛋白10的Western-blot蛋白免疫印跡鑒定

對純化后的重組人熱休克蛋白10進行Tricine-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，放入電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20min，同時浸泡6張濾紙，1張聚偏氟乙烯膜。從負極到正極順序為：三層濾紙—凝膠—聚偏氟乙烯膜—三層濾紙，恒流300mA，電轉(zhuǎn)移1小時。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將聚偏氟乙烯膜用去離子水漂洗干凈將聚偏氟乙烯膜浸泡于含質(zhì)量百分濃度為5％的牛血清白蛋白的TBS(1.21g三羥甲基氨基甲烷，8.8g氯化鈉，加水800mL溶解后用鹽酸調(diào)pH至7.5，再加水定容至1L)緩沖液中，室溫封閉1小時，加入來源于兔的多克隆抗體(一抗，1：500),4℃過夜，以TBST(1L TBS中加入0.5mL吐溫20)洗膜4次(10min/次)，加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(二抗，1:1000)，37℃孵育1小時，以TBST洗膜4次，底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。Western-blot鑒定結(jié)果如圖4。在12KD處有顯色反應，出現(xiàn)特異性條帶，說明獲得了正確的重組人熱休克蛋白10。

(12)免疫熒光技術(shù)檢測重組人熱休克蛋白10的細胞膜穿透能力

(12.1)細胞培養(yǎng)

將新鮮F12完全培養(yǎng)液(購自國藥集團，含10％的胎牛血清，含100ug/ml氨芐青霉素)從4℃冰箱中取出，室溫放置1小時，并與離心管、培養(yǎng)皿等實驗用具一起放置超凈臺內(nèi)，紫外滅菌30min，快速從液氮罐中取出凍存的小鼠成纖維細胞(l929)，立刻放入37℃水浴中，快速解凍；融化后，將其吸入10ml離心管中，加入2ml新鮮的完全培養(yǎng)液，以減少DMSO對細胞的傷害，之后在低速離心機中以1000rpm離心5min；吸去上清，再向離心管中加入4ml新鮮培養(yǎng)液，將細胞吹懸后吸入培養(yǎng)皿中，補充培養(yǎng)基至8ml，放入CO₂(CO₂濃度5％，O₂濃度15.5％)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(12.2)免疫熒光檢測

培養(yǎng)至一定密度的小鼠成纖維細胞用3ml 0.25％的胰酶消化，消化后的細胞分別用含有未連接穿膜肽的人熱休克蛋白10(1mg/ml)和重組人熱休克蛋白10(1mg/ml)的細胞培養(yǎng)液吹懸后接種于24孔板中，培養(yǎng)48h，棄去細胞培養(yǎng)液，用細胞用PBS清洗3次(5min/次)，用4％的甲醇對細胞進行固定，室溫固定30min，再用PBS清洗3次(5min/次)，用1％的Triton透膜劑對細胞進行透膜處理30min，再用PBS清洗3次(5min/次)，山羊血清封閉液封閉45min，PBS清洗3次(5min/次)，加入來源于兔的熱休克蛋白10的多克隆抗體(一抗，1：500)，4℃過夜孵育，次日于室溫下放置30min，再用PBS清洗3次(5min/次)，用帶有FITC(異硫氰酸熒光素)熒光標記的二抗避光孵育45min(二抗，1:1000)，再用PBS清洗3次(5min/次)，用共聚焦顯微鏡照相，觀察蛋白在細胞內(nèi)的分布情況。免疫熒光檢測結(jié)果如圖5，重組人熱休克蛋白10(Y-HSP10)較未連接穿膜肽的熱休克蛋白10(HSP10)，細胞穿膜能力得到了極大的提高。

序列表

<110> 陜西慧康生物科技有限責任公司

<120> 一種重組人熱休克蛋白10及其編碼基因與制備方法

<160> 6

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 重組人熱休克蛋白10

<400> 1

YARAAARQAR AGGGSMAGQA FRKFLPLFDR VLVERSAAET VTKGGIMLPE KSQGKVLQAT 60

VVAVGSGSKG KGGEIQPVSV KVGDKVLLPE YGGTKVVLDD KDYFLFRDGD ILGKYVD 117

<210> 2

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacgctagag ctgctgctag acaagctaga gctggtggtg gtagtatggc aggacaagcg 60

tttagaaagt ttcttccact ctttgaccga gtattggttg aaaggagtgc tgctgaaact 120

gtaaccaaag gaggcattat gcttccagaa aaatctcaag gaaaagtatt gcaagcaaca 180

gtagtcgctg ttggatcggg ttctaaagga aagggtggag agattcaacc agttagcgtg 240

aaagttggag ataaagttct tctcccagaa tatggaggca ccaaagtagt tctagatgac 300

aaggattatt tcctatttag agatggtgac attcttggaa agtacgtaga ctga 354

<210> 3

<211> 102

<212> PRT

<213> 人熱休克蛋白10

<400> 3

MAGQAFRKFL PLFDRVLVER SAAETVTKGG IMLPEKSQGK VLQATVVAVG SGSKGKGGEI 60

QPVSVKVGDK VLLPEYGGTK VVLDDKDYFL FRDGDILGKY VD 117

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 穿膜肽YARA

<400> 4

YARAAARQAR A 60

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

GGTGGTGGTA GT 60

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 連接肽

<400> 6

GGGS 60