專(zhuān)利名稱(chēng)：：雙功能錨定蛋白的制作方法雙功能錨定蛋白本發(fā)明涉及免疫學(xué)和疫苗遞送領(lǐng)域。更具體而言，涉及具有內(nèi)在免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的細(xì)菌疫苗遞送技術(shù)，其可以使任何目標(biāo)抗原不經(jīng)過(guò)預(yù)先的抗原修飾而固定。目前正在開(kāi)發(fā)通過(guò)表達(dá)抗多種疾病的不同抗原決定簇的減毒細(xì)菌載體株的疫苗遞送或免疫。使用這種載體的粘膜(鼻或口)免疫已引起廣泛關(guān)注。例如，在口腔建群有在其表面表達(dá)所述抗原決定簇的基因工程人口腔共生格氏鏈球菌(&r印tococcwgw^"http://)的小鼠中檢測(cè)到抗大黃蜂毒液的抗原決定簇的系統(tǒng)和粘膜抗體應(yīng)答(Medaglini等人，PNAS1995，2;6868-6872)。而且，通過(guò)口服遞送其中破傷風(fēng)毒素C片段在乳酸乳球菌(Za"ocoww/acto)組成型表達(dá)的重組細(xì)菌疫苗可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答(Robinson等人,NatureBiotechnology1997,15;653-657)。特別地，粘膜免疫，作為誘導(dǎo)針對(duì)粘膜表面的特異性病原體的IgG和分泌性IgA的一種方法，被認(rèn)為是接種疫苗的有效途徑。由細(xì)菌載體表達(dá)的免疫原以顆粒形式呈遞到免疫系統(tǒng)的抗原呈遞細(xì)胞(例如M細(xì)胞)，因此其引起耐受性的可能性比可溶性抗原低。另外，共同粘膜免疫系統(tǒng)的存在允許在一特定粘膜表面免疫，從而誘導(dǎo)抗原特異性IgA的分泌，并在遠(yuǎn)端粘膜位點(diǎn)誘導(dǎo)其它特異性免疫應(yīng)答。這種方法的缺點(diǎn)在于菌株本身有可能引起炎癥和疾病，可能引起發(fā)燒和菌血癥。另一種方法通過(guò)選擇如乳桿菌(丄actoZwc/〃w^p)和乳球菌(i^"0COCCWSMP)的重組共生菌作為疫苗載體，避免了使用其本身會(huì)變?yōu)橹虏【臏p毒菌株。然而，使用這種重組生物的缺點(diǎn)在于它們可建群于粘膜表面，從而導(dǎo)致長(zhǎng)期暴露于這些重組微生物表達(dá)和釋放的目標(biāo)抗原。這種長(zhǎng)期的暴露可以引起免疫耐受性。此外，單單這種生物體體被遺傳修飾并含有重組核酸這樣的事實(shí)，在整體上正面臨公眾(非專(zhuān)家的公眾)的極大反對(duì)，這是由于對(duì)含有重組DNA或RNA的產(chǎn)品的普遍接受性水平低。同樣存在對(duì)使用致病性菌株(即使是減毒的)的反對(duì)，或者反對(duì)使用來(lái)自致病菌株的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分。如上所述，常規(guī)使用的蛋白異源表面展示技術(shù)通常需要使用錨定或靶向蛋白，所述蛋白對(duì)有限的一系列一般為重組或致病性的微生物具有特異性和選擇性，因此極大限制了其潛在應(yīng)用。我們先前在專(zhuān)利申請(qǐng)WO99/25836和WO02/101026中已經(jīng)提出了該問(wèn)題，所述專(zhuān)利描述了使用含有與抗原融合的AcmA(-樣)結(jié)合域的嵌合融合蛋白，將抗原連接于來(lái)自非重組革蘭氏陽(yáng)性菌的無(wú)活力球狀肽聚糖顆粒。在與抗原結(jié)合前，革蘭氏陽(yáng)性菌接受非酶預(yù)處理(參見(jiàn)WO02/101026)。以前被稱(chēng)之為"外殼"的肽聚糖顆粒仍然包含具有免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的細(xì)菌成分，如肽聚糖。因此，這些顆粒現(xiàn)在被稱(chēng)為革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)("GEM")或"GEM顆粒"。因此，WO99/25836和WO02/101026中公開(kāi)的方法避免了使用那些通常為重組的或具有致病性的活細(xì)菌和/或微生物。然而，以前公開(kāi)的方法限于可以作為嵌合蛋白產(chǎn)物制備(重組)的蛋白抗原的附著。對(duì)于一些蛋白抗原這不是可行的方法。例如，制備所述抗原有特殊要求，抗原中存在AcmA(-樣)結(jié)合域的存在可起到干擾作用。另外，對(duì)于非蛋白抗原，當(dāng)然不能進(jìn)行基因融合。而且，該方法不允許顆?？乖母街？梢栽O(shè)想通過(guò)化學(xué)方法將目標(biāo)抗原共價(jià)偶聯(lián)到肽聚糖顆粒上，例如使用與抗原和細(xì)菌顆粒均能反應(yīng)的化學(xué)交聯(lián)劑。乳酸菌細(xì)胞壁的肽聚糖層被多種物質(zhì)，例如(脂)胞壁酸、中性和酸性多糖和(表面)蛋白覆蓋。因?yàn)榛瘜W(xué)修飾可以干擾抗原誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)效力，所以這種化學(xué)方法不會(huì)適合于每種類(lèi)型的抗原。此外，多數(shù)化學(xué)交聯(lián)劑需要特定的反應(yīng)基(例如，SH)以調(diào)節(jié)共價(jià)相互作用，所述反應(yīng)基可能不總是存在，或者在交聯(lián)分子中位于不合適的(例如，抗原結(jié)合)位點(diǎn)。本發(fā)明的目的是克服這些限制。為此目的，開(kāi)發(fā)了雙功能多肽，其既含有結(jié)合(非共價(jià)地)目標(biāo)抗原的功能性，又含有結(jié)合(非共價(jià)地)免疫原性載體(如GEM顆粒)的功能性。該系統(tǒng)可以使任何目標(biāo)抗原不經(jīng)過(guò)預(yù)先的修飾而固定在GEM顆粒的表面。所述抗原可以是(多)肽、糖類(lèi)、脂類(lèi)、DNA、RNA或任何其它生物有機(jī)化合物，甚至本身可以具有顆粒性質(zhì)，例如病毒顆粒。因此，本發(fā)明涉及負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物，其包含至少一種附著到免疫原性載體上的多肽，所述多肽包含融合于抗原結(jié)合域(ABD)的肽聚糖結(jié)合域(PBD)，所述多肽通過(guò)該肽聚糖結(jié)合域附著于所述載體，所述抗原結(jié)合域能夠結(jié)合目標(biāo)抗原。在本發(fā)明的負(fù)載抗原的復(fù)合物中，至少一種目標(biāo)抗原結(jié)合于(非共價(jià)地)ABD。所述PBD包含能夠結(jié)合于肽聚糖的氨基酸序列，該序列選自由如下(i)、(ii)和(iii)組成的組(i)LysM域，(ii)以乳酸乳球菌細(xì)胞壁水解酶AcmAC末端中三個(gè)LysM域(重復(fù)區(qū)域)(所述域在此也稱(chēng)為AcmALysM域)其中之一在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索所檢索到的氨基酸序列，以及(iii)與所述三個(gè)AcmALysM域其中任何一個(gè)具有至少70%的相同性的序列。所述PBD能夠附著于革蘭氏陽(yáng)性微生物的細(xì)胞壁。術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合"意指結(jié)合目標(biāo)抗原的能力。所述能力由至少一種雙功能多肽賦予。術(shù)語(yǔ)"雙功能"表示所述多肽具有至少兩種不同的功能性肽聚糖結(jié)合功能性和抗原結(jié)合功能性。所述功能性可以是多價(jià)的，例如雙功能多肽可以包含多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)"免疫原性載體"是指在施用到對(duì)象時(shí)具有提高或修飾附著到其上的抗原的免疫刺激性的能力的部分。因此免疫原性載體具有佐劑性質(zhì)。此外，其包含肽聚糖，使得通過(guò)其肽聚糖結(jié)合域(PBD)附著一種或多種雙功能接頭多肽。由于上述原因，優(yōu)選非重組免疫原性載體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述免疫原性載體復(fù)合物為由革蘭氏陽(yáng)性菌制得的無(wú)活力球狀肽聚糖顆粒(GEM顆粒，或者"外殼")。制備GEM顆粒的方法以前已經(jīng)描述，例如在專(zhuān)利申請(qǐng)WO02/101026和WO2004/102199中。所述方法保留了所述細(xì)菌的天然球狀結(jié)構(gòu)的大部分。簡(jiǎn)而言之，所述方法包括用能夠從細(xì)胞壁物質(zhì)除去細(xì)胞壁成分(如蛋白質(zhì)、脂胞壁酸或糖類(lèi))的溶液處理革蘭氏陽(yáng)性菌。隨后可以?xún)?chǔ)存制得的GEM顆粒，直到其與所需雙功能多肽接觸。GEM顆粒比未處理的革蘭氏陽(yáng)性菌結(jié)合高得多的量的PBD融合物。因此，在GEM顆粒上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原的高負(fù)載能力(WO02/101026)。GEM顆粒比機(jī)械破碎的細(xì)胞壁物質(zhì)更好地能夠結(jié)合到特定細(xì)胞或組織和/或更容易被特定細(xì)胞或組織占有。GEM顆粒靶向巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞的能力提高了它們的功效。因此本發(fā)明的非重組、無(wú)活性免疫原性載體復(fù)合物適用作疫苗遞送載體。同樣參見(jiàn)WO02/101026和WO2004/102199。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了一種疫苗遞送技術(shù)，其基于GEM顆粒，所述GEM顆粒具有一種或多種通過(guò)使用雙功能多肽附著到所述顆粒上的抗原，其中GEM顆粒起到表面附著致病源化合物的免疫原性骨架的作用，從而模仿病原顆粒(圖1)。該遞送技術(shù)通過(guò)向免疫反應(yīng)性位點(diǎn)遞送作為顆粒的亞單位疫苗而可以模仿病原體。原則上GEM顆?？梢杂扇魏胃锾m氏陽(yáng)性菌制備。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁包括肽聚糖層、蛋白質(zhì)、脂胞壁酸和其它修飾的糖類(lèi)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁物質(zhì)的化學(xué)處理可用于除去如蛋白質(zhì)和脂胞壁酸的細(xì)胞壁成分，以制得具有改進(jìn)的結(jié)合性質(zhì)的GEM顆粒。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物包括使用酸溶液制得的GEM顆粒(參見(jiàn)WO02/101026)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述免疫原性載體復(fù)合物由非致病菌、優(yōu)選食品級(jí)細(xì)菌或者G.R.A.S.(通常認(rèn)為是安全的)級(jí)的細(xì)菌制備。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞壁物質(zhì)來(lái)自乳球菌、乳桿菌、芽孢桿菌或者分支桿菌。使用如乳酸乳球菌的革蘭氏食品級(jí)細(xì)菌作為疫苗遞送載體比使用如沙門(mén)氏菌屬或分支桿菌屬的其它細(xì)菌具有顯著的優(yōu)勢(shì)。乳酸乳球菌不在人組織中復(fù)制或者侵入人組織，據(jù)報(bào)道其具有低內(nèi)源性免疫性(Norton等人，1994)。已經(jīng)表明即使在施用前殺滅載體細(xì)菌，表達(dá)破傷風(fēng)毒素片段C的乳酸乳球菌在粘膜遞送后仍誘導(dǎo)抗體，所述抗體保護(hù)小鼠抵御破傷風(fēng)毒素的致死性攻擊。與本文公開(kāi)的免疫原性載體復(fù)合物中的非重組GEM顆粒相比，這些細(xì)菌仍然含有會(huì)擴(kuò)散到環(huán)境中的重組DNA，尤其是在大規(guī)?？诜庖唔?xiàng)目中使用時(shí)。這種重組DNA不可控制的擴(kuò)散到環(huán)境中會(huì)存在基因被其它細(xì)菌或其它(微)生物攝入的危險(xiǎn)。本發(fā)明的多肽包含肽聚糖結(jié)合域(PBD)，其可以使任何目標(biāo)抗原附著到如GEM的免疫原性載體上。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述PBD包含能夠結(jié)合于肽聚糖的氨基酸序列，該序列為L(zhǎng)ysM域。所述多肽優(yōu)選包含至少兩個(gè)、更優(yōu)選至少三個(gè)LysM域。LysM(細(xì)胞溶素基序)域?yàn)榧s45個(gè)殘基長(zhǎng)。其在參與細(xì)菌細(xì)胞壁降解的多種酶中被發(fā)現(xiàn)(Joris等人，F(xiàn)EMSMicrobiolLett1992;70:257-264)。認(rèn)為L(zhǎng)ysM域具有普通的肽聚糖結(jié)合功能。該域的結(jié)構(gòu)已知("ThestructureofaLysMdomainfromco//membrane-boundlyticmureintransglycosylaseD(MItD)".BatemanA，BycroftM;JMolBiol2000;299:1113-11192)。LysM域的存在不限于細(xì)菌蛋白。它們還可以存在于多種真核蛋白中，而它們?cè)诠偶?xì)菌蛋白中缺乏。已經(jīng)假說(shuō)，很多含有LysM域的蛋白質(zhì)具有細(xì)胞壁結(jié)合功能。部分純化的希氏腸球菌(￡"to'OCOCCMWrae)的胞壁質(zhì)酶-2(與AcmA相似并包含六個(gè)LysM域的蛋白質(zhì))結(jié)合同一菌株的肽聚糖片段。單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌(L^er/a歸mc;^gwey)的p60蛋白包含兩個(gè)LysM域并顯示出與細(xì)胞表面結(jié)合?？莶菅挎邨U菌(Sac/〃船wto似)的Y-D-谷氨酸-內(nèi)消旋二氨基庚二酸胞壁肽酶LytE和LytF分別在它們的N末端具有三個(gè)和五個(gè)重復(fù)，且它們均是結(jié)合細(xì)胞壁的。通過(guò)使用本領(lǐng)域己知的方法在公共的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基于同源性的檢索，技術(shù)人員能夠鑒定LysM域氨基酸序列。多種已知算法己經(jīng)公開(kāi)，并且可以使用多種公開(kāi)并且市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)的軟件。例子包括但不限于MacPattern(EMBL)、BLASTP(NCBI)、BLASTX(NCBI)禾卩FASTA(弗吉尼亞大學(xué))。在一個(gè)實(shí)施方式中，LysM域的PFAM登錄號(hào)PF01476(參見(jiàn)http:Vwww.sanger.ac.uk/cgi-bin/Pfam/getaccPF01476)用于檢索符合LysM域標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸序列。PFAM網(wǎng)站提供兩個(gè)隱馬爾可夫模型(profileHMM)，其可以用于使用序列家族共有序列的統(tǒng)計(jì)描述進(jìn)行敏感數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。HMMER是用于蛋白質(zhì)序列分析的profileHMM軟件的可免費(fèi)傳播的執(zhí)行工具。乳酸乳球菌主要的自溶素AcmA的C末端區(qū)域包含三個(gè)同源LysM域，其被非同源序列隔開(kāi)。對(duì)于三個(gè)AcmALysM域的氨基酸序列，例如可以參見(jiàn)W099/25836的圖10，其中三個(gè)LysM域由Rl、R2和R3表示。表明AcmA的C末端區(qū)域調(diào)節(jié)自溶素的肽聚糖結(jié)合(Buist等人.[1995]J.Bacteriol.177:1554-1563)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物包含雙功能多肽，雙功能多肽通過(guò)其PBD結(jié)合于優(yōu)選為GEM顆粒的免疫原性載體表面的肽聚糖，其中所述PBD包含至少一個(gè)如AcmA中存在的LysM域。如果保持肽聚糖結(jié)合功能性，那么還包含AcmALysM域確切的氨基酸序列中的變化。因此，在不失去肽聚糖結(jié)合能力的情況下，可以進(jìn)行氨基酸的替換、缺失和/或插入。AcmALysM域的一些部分較少適于改變，例如全部三個(gè)域中發(fā)現(xiàn)的保守GDTL和GQ基序。然而可以改變其它部分而不影響PBD結(jié)合免疫原性載體的功效。例如，可以修飾AcmA三個(gè)LysM域中在具有非常不同性質(zhì)(極性、非極性、親水性、疏水性)的位置的氨基酸殘基。優(yōu)選地，所述PBD包含與乳酸乳球菌AcmA三個(gè)LysM域其中之一具有至少70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90°/。，如92%、95%、97%或99。/。相同性的序列。用于本發(fā)明的多肽的PBD可以包含一個(gè)或多個(gè)這種(同源的)AcmALysM域，其可以是不同的或相同的。一般地，LysM域彼此相鄰，其可以被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基隔開(kāi)。LysM域可以被短距離(如分開(kāi)115氨基酸)、中等距離(15100個(gè)氨基酸)、或長(zhǎng)距離(如分開(kāi)150或甚至200個(gè)氨基酸)分開(kāi)。在某方面，本發(fā)明涉及PBD，其包含與AcmALysM域具有至少約80%的氨基酸序列相同性、或至少約81%的氨基酸序列相同性、或至少約82%的氨基酸序列相同性、或至少約83%的氨基酸序列相同性、或至少約84%的氨基酸序列相同性、或至少約85%的氨基酸序列相同性、或至少約86%的氨基酸序列相同性、或至少約87%的氨基酸序列相同性、或至少約88%的氨基酸序列相同性、或至少約89%的氨基酸序列相同性、或至少約90%的氨基酸序列相同性、或至少約91%的氨基酸序列相同性、或至少約92%的氨基酸序列相同性、或至少約93%的氨基酸序列相同性、或至少約94%的氨基酸序列相同性、或至少約95%的氨基酸序列相同性、或至少約96%的氨基酸序列相同性、或至少約97%的氨基酸序列相同性、或至少約98%的氨基酸序列相同性、以及或至少約99%的氨基酸序列相同性的氨基酸序列。多肽的"氨基酸序列相同性百分比"，如70%、80%、90%、95%、98%、99%或者100%的序列相同性，可以通過(guò)在比較窗口中比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列來(lái)確定，其中為了兩個(gè)氨基酸序列的最佳比對(duì)，與參考序列相比(其不包含添加或缺失)比對(duì)窗口中的多肽序列部分可以包含添加或缺失(即，缺口)。百分比如下計(jì)算:(a)確定兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同氨基酸的位置的數(shù)目以得到配對(duì)位置的數(shù)目；(b訴配對(duì)位置的數(shù)目除以比對(duì)窗口中的位置總數(shù)；以及(c)結(jié)果乘以100以得到序列相同性百分比?？梢酝ㄟ^(guò)計(jì)算機(jī)應(yīng)用已知算法或者通過(guò)檢查來(lái)進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)。易于獲得的序列比較和多序列比對(duì)算法分別為基本的局部比對(duì)搜索工具(BLAST)(Altschul,S.F.等人.1990.J.Mol.Biol.215:403;Altschul,S.F.等人.1997.NucleicAcidRes.25:3389-3402)和ClustalW程序，其均可在因特網(wǎng)上得到。在另一實(shí)施方式中，PBD包含LysM域，該LysM域存在于自氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)AcmALysM域進(jìn)行同源性檢索而檢索到的氨基酸序列，其中LysM域能夠使物質(zhì)附著到革蘭氏陽(yáng)性微生物的細(xì)胞壁上。檢索到的氨基酸序列優(yōu)選為來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的氨基酸序列。例如其為細(xì)菌細(xì)胞壁水解酶的氨基酸序列。優(yōu)選地，檢索到的氨基酸序列與AcmALysM域呈現(xiàn)至少70%、更優(yōu)選80%、最優(yōu)選至少90%的序列相同性?？梢詸z索到的序列的例子可以見(jiàn)專(zhuān)利申請(qǐng)W099/25836的圖11。從上清楚可見(jiàn)，可以多種方式在結(jié)構(gòu)上對(duì)PBD進(jìn)行定義。然而，在所有情況下可以將PBD定義為用于結(jié)合于微生物細(xì)胞壁的工具，其中所述用于結(jié)合的工具具有肽的性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，PBD能夠結(jié)合到革蘭氏細(xì)菌或來(lái)自其的細(xì)胞壁物質(zhì)(例如GEM顆粒)上。PBD的結(jié)合能力可以在結(jié)合試驗(yàn)中容易地確定，該試驗(yàn)包括如下步驟用報(bào)告分子標(biāo)記PBD，使標(biāo)記的PBD與革蘭氏陽(yáng)性微生物接觸以使所述工具結(jié)合到所述微生物上；以及通過(guò)檢測(cè)微生物結(jié)合的報(bào)告分子的存在與否來(lái)確定所述PBD的結(jié)合能力。用于結(jié)合試驗(yàn)的報(bào)告分子(還稱(chēng)為可檢測(cè)分子)可以具有多種性質(zhì)。在本領(lǐng)域己知多種類(lèi)型的報(bào)告分子。例如其為熒光分子(例如FITC)、抗原、親和性標(biāo)簽(例如生物素)、抗體或酶。報(bào)告分子可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法偶聯(lián)于PBD上。在報(bào)告分子具有肽的性質(zhì)情況下，用報(bào)告分子標(biāo)記PBD的步驟優(yōu)選包括PBD與報(bào)告分子之間產(chǎn)生基因融合。這種融合已在本領(lǐng)域中描述。例如，W099/25836描述了包含零、一、二或三個(gè)AcmALysM域的多肽與報(bào)告酶(在這種情況下可以是a-淀粉酶或P-內(nèi)酰胺酶)之間產(chǎn)生融合構(gòu)建體。為確定給定多肽是否為本發(fā)明的PBD，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，以提供與隨后可以檢測(cè)細(xì)胞結(jié)合活性的報(bào)告多肽(酶、抗原等)的融合物。優(yōu)選的酶報(bào)告分子為那些可比色或熒光檢測(cè)它們的活性的報(bào)告分子。本領(lǐng)域中描述了多種使用比色或熒光底物的報(bào)告酶體系，如辣根過(guò)氧化酶(HRP)/2,2，-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)(ABTS);堿性磷酸酶/4-硝基苯基磷酸酯或卩-半乳糖苷酶/2-硝基苯基-(3-D-吡喃半乳糖苷(2-NPG)。在PBD用抗原標(biāo)記的情況下，通過(guò)檢測(cè)與微生物結(jié)合的報(bào)告分子的存在與否來(lái)確定所述PBD的結(jié)合能力一般包括使用與所述抗原特異性反應(yīng)的抗體(例如單克隆鼠抗體)?？梢允褂脭y帶所謂的三明治形式的可檢測(cè)標(biāo)記的二抗(例如，兔抗鼠IgG抗體)來(lái)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物。例如為二抗提供其活性可以使用上述比色物質(zhì)測(cè)量的報(bào)告酶。還可以用作為報(bào)告分子的一抗標(biāo)記PBD，并且使用攜帶可檢測(cè)標(biāo)記(酶、熒光染料)的二抗檢測(cè)與微生物結(jié)合的報(bào)告分子的存在與否。用于結(jié)合試驗(yàn)的革蘭氏陽(yáng)性微生物可以是有活力或無(wú)活力的。包括如芽孢桿菌、鏈球菌、分支桿菌、李斯特氏菌或梭菌的革蘭氏陽(yáng)性菌。使標(biāo)記的PBD與革蘭氏陽(yáng)性微生物接觸以使所述工具結(jié)合到所述微生物上的步驟可以包括在包含標(biāo)記的PBD的溶液或者含有標(biāo)記的PBD的粗細(xì)胞提取物中重懸浮指數(shù)生長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性菌(如乳酸乳球菌)的沉淀的培養(yǎng)物。所述溶液還可以是表達(dá)和分泌標(biāo)記的PBD的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液。溫育一段時(shí)間后，例如440。C、1~120分鐘，如1040。C、1~30分鐘，沉淀并洗滌革蘭氏陽(yáng)性菌，以除去任何非特異性結(jié)合的報(bào)告分子。此后，確定與沉淀的細(xì)菌結(jié)合的報(bào)告分子的量。在特定實(shí)施方式中，細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)包括使用與PBD融合的來(lái)自地衣芽孢桿菌(Sacz7/w〃c/2em/onm;s)的a-淀粉酶或￡.co//TEMp-內(nèi)酰胺酶作為報(bào)告分子。融合蛋白在將融合蛋白分泌到培養(yǎng)物上清液中的細(xì)菌宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生。在結(jié)合試驗(yàn)中，GEM顆粒用作革蘭氏陽(yáng)性微生物。它們可以如WO02/101026中和本申請(qǐng)下面所述進(jìn)行制備。將載有兩種融合蛋白的GEM顆粒旋沉并用PBS洗滌兩次。結(jié)合的a-淀粉酶PBD融合物和卩-內(nèi)酰胺酶PBD融合物的酶活性進(jìn)行比色測(cè)定。通過(guò)在37。C和200rpm將負(fù)載的GEM顆粒在lml直鏈淀粉天青(Sigma)底物溶液(20mMK2HP04/KH2P04緩沖液中0.6mg/ml直鏈淀粉天青，50mMNaCl，pH7.5)，測(cè)定a-淀粉酶活性。60分鐘后，將GEM顆粒和不溶的直鏈淀粉天青旋沉，在595nm測(cè)定吸光度。通過(guò)向終體積為lml的PBS中的負(fù)載有p-內(nèi)酰胺酶PBD融合蛋白的GEM顆粒加入40^1頭孢硝噻(Ca舊iochem)來(lái)測(cè)量P-內(nèi)酰胺酶活性。包含PBD和ABD、在WO99/25836和WO02/101026中還稱(chēng)為cA或錨定蛋白的多肽(其中PBD包含乳酸乳球菌細(xì)胞壁水解酶AcmA的三個(gè)LysM域)，在本申請(qǐng)中稱(chēng)為"Protan接頭"。技術(shù)人員應(yīng)該理解，在保持肽聚糖結(jié)合功能的情況下，Protan接頭與天然存在的AcmALysM序列相比可以包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。所述多肽中ABD和PBD的相對(duì)位置可以改變。然而，應(yīng)該理解，一方面通過(guò)PBD使多肽附著到免疫原性載體上，另一方面通過(guò)ABD結(jié)合抗原，這在所述域之間需要一定程度的間隔，以避免或使互擾最小化。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽包含通過(guò)接頭或間隔區(qū)序列融合到ABD上的PBD。所述接頭或間隔區(qū)可以是如1200個(gè)氨基酸的相對(duì)短鏈的接頭、如200600個(gè)氨基酸的中等大小的接頭、或超過(guò)600個(gè)殘基的較大的接頭。例如，在一實(shí)施方式中，所述多肽的N末端部分包含通過(guò)接頭融合到位于C末端部分的ABD上的PBD。在另一實(shí)施方式中，PBD構(gòu)成多肽的C末端部分，而ABD構(gòu)成N末端部分。ABD和/或PBD不是必須位于多肽的最兩端;在多肽任一端可以存在一個(gè)或多個(gè)既不是ABD的部分也不是PBD的部分的氨基酸殘基。本發(fā)明的多肽包含一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合域(ABD)。單個(gè)多肽中的多個(gè)ABD使抗原以高密度存在于免疫原性載體復(fù)合物上。在一實(shí)施方式中，多肽包含兩個(gè)能夠結(jié)合相同或不同目標(biāo)抗原的ABD。如果存在多個(gè)ABD，將它們彼此相鄰排列會(huì)是有利的，例如在其之間具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸，以使多個(gè)抗原最優(yōu)化地結(jié)合到多肽上。存在于本發(fā)明的多肽中的ABD是能夠結(jié)合到目標(biāo)抗原上的蛋白質(zhì)部分。如果存在合適的ABD可用，那么任何類(lèi)型的抗原可以結(jié)合于本發(fā)明的抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物。目標(biāo)抗原可以選自多肽、糖類(lèi)、脂類(lèi)、多核苷酸和致病抗原(包括滅活病毒顆粒和純化的抗原決定簇)。在一實(shí)施方式中，目標(biāo)抗原為不能以與PBD的融合物制備的抗原，如包含至少一個(gè)非蛋白部分的抗原。在一實(shí)施方式中，目標(biāo)抗原為多核苷酸。用多核苷酸的免疫是疫苗開(kāi)發(fā)中的最近的進(jìn)展。該技術(shù)被稱(chēng)為基因免疫或DNA免疫。該免疫方法的基礎(chǔ)在于細(xì)胞可以攝取質(zhì)粒DNA并在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)該基因。因此，接種疫苗的動(dòng)物本身起到制備疫苗的生物反應(yīng)器的作用。這使得疫苗制備相對(duì)便宜。多核苷酸免疫的一些優(yōu)點(diǎn)在于極其安全、誘導(dǎo)寬范圍的免疫應(yīng)答(細(xì)胞和體液應(yīng)答)、長(zhǎng)期免疫性，且最重要的是可以在存在母體抗體的情況下誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。雖然這在疫苗技術(shù)中是最吸引人的開(kāi)發(fā)技術(shù)之一，但依然大大需要開(kāi)發(fā)更好的遞送系統(tǒng)以提高體內(nèi)轉(zhuǎn)染率。在本發(fā)明的一特定方面，本發(fā)明的免疫原性載體復(fù)合物用于遞送雙鏈RNA，例如基于RNA干擾(RNAi)的治療。這種治療尤其適合于對(duì)抗病毒感染。應(yīng)該理解，ABD的結(jié)構(gòu)特征將主要取決于目標(biāo)抗原。目標(biāo)抗原的己知結(jié)合伴侶或這種己知結(jié)合伴侶的部分可以用作ABD。例如，可以通過(guò)使用病原體正常的宿主受體使多肽具有結(jié)合如病毒或細(xì)菌的病原體的能力。病原體宿主受體在本領(lǐng)域己知，且它們的序列已經(jīng)確定并保存于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中。例如ICAM-1為人鼻病毒(HRV)的宿主受體，而CD4為HIV的宿主受體。在另一方面，ABD包含具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體或其功能片段(如Fab片段)，或其它結(jié)合目標(biāo)抗原的多肽。本領(lǐng)域已知的許多特異性抗體(片段)可以用于本發(fā)明。例如，結(jié)合到病毒表面的保守決定簇的抗體(片段)，如脊髓灰質(zhì)炎病毒上的VP4、或HIV上的gp120、或流感病毒上的HA。工業(yè)上的分子親和體(iMab⑧)同樣適用作根據(jù)本發(fā)明的ABD(參見(jiàn)，例如來(lái)自荷蘭CatchMabsBV的WO2004108749)。同樣可以使用由比利時(shí)Ablynx,Gent開(kāi)發(fā)的NanobodiesTM。WO02/101026以申請(qǐng)人的名義公開(kāi)了使用GEM顆粒作為AcmA型錨定蛋白與如蛋白質(zhì)、肽和抗體的反應(yīng)基之間的多肽融合的遞送載體。在此，抗體不用作抗原的載體，而它們本身為治療性物質(zhì)，即通過(guò)與內(nèi)源性抗原的特異性相互作用。當(dāng)然，為此目的，抗體必須不是"預(yù)負(fù)載"有抗原，如本申請(qǐng)中的情況。因此WO02/101026沒(méi)有公開(kāi)或暗示附著到GEM顆粒上的抗體負(fù)載有目標(biāo)抗原。對(duì)基本上任何抗原(其可以是肽、糖、脂、核酸或整個(gè)生物體等)具有特異性的抗體片段和肽可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法選擇。市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)到肽文庫(kù)，包含大量隨機(jī)合成的肽，所述肽可用于選擇目標(biāo)抗原合適的結(jié)合伴侶。例如，NewEnglandBiokbs提供預(yù)制隨機(jī)肽文庫(kù)以及用于構(gòu)建常規(guī)文庫(kù)的克隆載體M13KE。所述預(yù)制文庫(kù)由直鏈七肽和十二肽文庫(kù)以及含二硫化物的七肽文庫(kù)組成。含二硫化物的七肽的隨機(jī)化片段兩側(cè)連接有一對(duì)半胱氨酸殘基，其在噬菌體組裝過(guò)程中氧化成二硫鍵，從而導(dǎo)致所展示的肽以環(huán)呈遞于耙點(diǎn)。所有文庫(kù)具有超過(guò)20億個(gè)獨(dú)立克隆的復(fù)雜度。在全部三個(gè)文庫(kù)中的隨機(jī)化肽序列在次要衣殼蛋白pm的n末端表達(dá)，從而導(dǎo)致每個(gè)病毒體5拷貝展示蛋白的效價(jià)。全部文庫(kù)在展示的肽與pIII之間包含短的接頭序列(Gly-Gly-Gly-Ser)。最令人感興趣的是使用噬菌體展示技術(shù)。多篇噬菌體展示技術(shù)的綜述可用，例如參見(jiàn)Smith和Petrenko[1997]Chem.Rev.97:391-410。簡(jiǎn)而言之，表面展示技術(shù)為選擇技術(shù)，其中多種肽的文庫(kù)或人單鏈Fv抗體在噬菌體病毒體的外部表達(dá)，而編碼各變體的遺傳物質(zhì)位于內(nèi)部。這在各變體蛋白序列和編碼它的DNA之間形成物理連接，其可以通過(guò)稱(chēng)為淘選的體外選擇方法進(jìn)行基于與給定目標(biāo)分子(抗體、酶、細(xì)胞表面受體等)的結(jié)合親和力的快速分選。以其最簡(jiǎn)單的形式，淘選通過(guò)如下步驟進(jìn)行用覆有目標(biāo)(即目標(biāo)抗原)的平板(或珠)溫育噬菌體展示肽文庫(kù)，洗去未結(jié)合的噬菌體，以及洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。然后將洗脫的噬菌體擴(kuò)增并通過(guò)另外的結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán)以豐富所需結(jié)合序列庫(kù)。34個(gè)循環(huán)后，一般通過(guò)DNA測(cè)序和ELISA表征單個(gè)克隆。包含在所需噬菌體中編碼特殊肽序列的DNA然后可以用作在編碼本發(fā)明的多肽的核酸構(gòu)建體中編碼ABD的核酸。本領(lǐng)域中存在一些成功應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)以鑒定與微生物選擇性結(jié)合的肽的例子。這些技術(shù)可以用于鑒定可以用作根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合域的肽。例如，Knurr等人(Appl.EnvironMicrobiol.2003Nov;69(ll):6841)描述了在噬菌體展示肽文庫(kù)中篩選與枯草芽孢桿菌及近緣種的孢子緊密結(jié)合的7肽和12肽。Lindquist等人(Microbiology.2002Feb;148(Pt2):443-51)使用噬菌體呈遞人單鏈Fv抗體文庫(kù)以選擇對(duì)結(jié)合在沙眼衣原體(Oz/aw;^/arac/zoma^)原體(EB)表面的成分具有特異性的結(jié)合伴侶。而噬菌體展示在本領(lǐng)域中主要用以選擇純化成分的特異性抗體，這些數(shù)據(jù)顯示該技術(shù)適于由復(fù)合抗原(如微生物病原體表面)選擇特異性探針。作為另一個(gè)有用的例子，JP2002284798公開(kāi)了由噬菌體展示技術(shù)獲得的與流感病毒/血球凝集素(HA)特異性結(jié)合的肽。而本發(fā)明尤其感興趣的是Kim等人(J.BiochemBiophysResCommun.2005Apr1;329(1):312)的最新研究，其描述了使用環(huán)氧珠由噬菌體展示文庫(kù)篩選LPS特異性肽。LPS(脂多糖；內(nèi)毒素)是革蘭氏陰性菌外膜主要的表面暴露結(jié)構(gòu)成分。其結(jié)構(gòu)可以分為三個(gè)區(qū)域(l)負(fù)責(zé)其主要生物活性的磷脂(脂質(zhì)A)、(2)核心寡糖、以及(3)0-特異性鏈，其為由高度可變的重復(fù)寡糖亞單位鏈構(gòu)成的抗原性多糖。Kim等人在偶聯(lián)LPS的環(huán)氧珠上使用生物淘選重復(fù)富集了編碼AWLPWAK禾nNLQEFLF的克隆。發(fā)現(xiàn)這些肽與在革蘭氏陰性菌種中高度可變的LPS的多糖部分相互作用。另外，發(fā)現(xiàn)編碼這些肽的噬菌體優(yōu)選結(jié)合到沙門(mén)氏菌屬的LPS。偶聯(lián)AWLPWAK的珠可以用于從溶液中吸附腸炎沙門(mén)氏菌(6b/zwo"e〃"ew/en'/Wj)。雖然本發(fā)明可以使未修飾的抗原固定到免疫原性載體上，但是其不限于未修飾的抗原。在本發(fā)明一實(shí)施方式中，ABD能夠通過(guò)(化學(xué))修飾的或標(biāo)記的目標(biāo)抗原結(jié)合到目標(biāo)抗原上。例如，可以向抗原提供親和性標(biāo)簽，該標(biāo)簽可以結(jié)合到ABD上。本申請(qǐng)下面的實(shí)施例2中展示了生物素標(biāo)記的酶通過(guò)使用雙功能鏈霉抗生物素蛋白-Protan雙功能接頭結(jié)合到GEM顆粒上。本申請(qǐng)還提供一種制備本發(fā)明的抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物的方法。如下文所述，該方法包括如下步驟提供免疫原性載體，提供包含融合于抗原結(jié)合域(ABD)的肽聚糖結(jié)合域(PBD)的多肽，以及允許所述多肽附著于所述免疫原性載體以產(chǎn)生抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物。如上所述，噬菌體展示技術(shù)的使用對(duì)于獲得特殊目標(biāo)抗原的ABD尤其有用?？梢允褂蒙虡I(yè)肽或抗體片段文庫(kù)。通過(guò)構(gòu)建通常被接頭序列隔開(kāi)的各個(gè)域的融合基因，以及使用本領(lǐng)域公知的方法在合適(細(xì)菌)宿主細(xì)胞中表達(dá)所述基因，可以容易地制備包含ABD和PBD的雙功能多肽。如下面實(shí)施例中所示例，可以簡(jiǎn)單地將重組制得的多肽與免疫原性載體接觸，以允許雙功能多肽結(jié)合于顆粒表面的肽聚糖，從而制得本發(fā)明的抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物。在一特定技術(shù)方案中，制備免疫原性載體的步驟包括由革蘭氏陽(yáng)性菌制備無(wú)活力球狀肽聚糖顆粒(GEM顆粒)。制得的載體復(fù)合物與一種或多種目標(biāo)(修飾)抗原接觸，以制備其中至少一種目標(biāo)抗原結(jié)合到ABD上的本發(fā)明的負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物。然而，還可以顛倒結(jié)合的順序，即在將負(fù)載抗原的多肽通過(guò)PBD附著到免疫原性載體之前，將目標(biāo)抗原通過(guò)ABD結(jié)合到多肽上。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物。例如，提供包含負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物的免疫原性組合物。所述免疫原性組合物能夠誘導(dǎo)生物體中的免疫應(yīng)答。在一實(shí)施方式中，所述免疫原性組合物為能夠誘導(dǎo)動(dòng)物中的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗組合物。由于粘膜表面疫苗施用更簡(jiǎn)易、更安全，所以免疫原性組合物(如疫苗)可以被遞送到粘膜表面而不是被注射。乳酸乳球菌來(lái)源的免疫原性載體復(fù)合物可以用于粘膜接種疫苗，由于該菌是腸源性的，且通常預(yù)計(jì)乳酸乳球菌沒(méi)有免疫副反應(yīng)。還提供了本發(fā)明的抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物用于將(保護(hù)性)目標(biāo)抗原遞送至對(duì)象的免疫系統(tǒng)的用途。所述抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物包含至少一種附著到免疫原性載體上的雙功能多肽，所述多肽包含融合于抗原結(jié)合域(ABD)的肽聚糖結(jié)合域(PBD)，所述多肽通過(guò)PBD附著于所述載體，所述抗原結(jié)合域(ABD)能夠結(jié)合所述目標(biāo)抗原，其中所述PBD包含選自由如下(i)、(ii)和(iii)組成的組的氨基酸序列(i)LysM域，(ii)以AcmALysM域C末端的LysM域在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索所檢索到的氨基酸序列，以及(iii)與AcmALysM域顯示至少70%的序列相同性的序列，條件是該P(yáng)BD能夠?qū)⑽镔|(zhì)附著于革蘭氏陽(yáng)性微生物的細(xì)胞壁。還提供了所述負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物用于向?qū)ο?、?yōu)選人類(lèi)對(duì)象的免疫系統(tǒng)遞送(保護(hù)性)目標(biāo)抗原的用途。向免疫系統(tǒng)的遞送優(yōu)選包括向粘膜位點(diǎn)的抗原遞送，如鼻內(nèi)遞送，例如通過(guò)噴霧或口服、陰道或直腸遞送。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供基于在此公開(kāi)的免疫原性載體復(fù)合物的亞單位疫苗。亞單位疫苗是開(kāi)發(fā)的針對(duì)單個(gè)病毒或細(xì)菌成分的疫苗，其還稱(chēng)為在誘導(dǎo)保護(hù)性免疫中起到關(guān)鍵作用的"免疫決定簇"。為了開(kāi)發(fā)亞單位疫苗，重要的是確定對(duì)誘導(dǎo)保護(hù)重要的病原體的那些成分(通常(糖)蛋白)，并去除其它成分。一些蛋白質(zhì)如果包含在疫苗中會(huì)是免疫抑制性的，而在其它情況下，對(duì)一些蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答實(shí)際上會(huì)加重疾病。結(jié)合基因組學(xué)與我們對(duì)病理學(xué)的理解，可以確定在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中關(guān)鍵的多數(shù)病原體的特定蛋白(參見(jiàn)WO2004A02199)。除了使用全蛋白作為疫苗，可以在這些保護(hù)性蛋白中確定單個(gè)表位并開(kāi)發(fā)肽疫苗。使用亞單位作為疫苗的潛在優(yōu)點(diǎn)在于提高的安全性以及由于只有少數(shù)成分包含在疫苗中而具有較少的抗原競(jìng)爭(zhēng)，將疫苗靶向需要免疫的位點(diǎn)的能力，以及從感染的動(dòng)物中區(qū)分接種疫苗的動(dòng)物的能力(標(biāo)記疫苗)。本領(lǐng)域中已知的亞單位疫苗的缺點(diǎn)之一在于它們通常需要強(qiáng)的佐劑，而這些佐劑經(jīng)常會(huì)引起組織反應(yīng)。在此公開(kāi)的免疫原性載體復(fù)合物具有內(nèi)在的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，并能有效地向免疫反應(yīng)位點(diǎn)遞送作為顆粒的抗原決定簇。特別是GEM顆粒將被特異性細(xì)胞或組織結(jié)合和域攝取。GEM顆粒靶向巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞的能力提高了它們的功效。事實(shí)上，根據(jù)其抗原成分，現(xiàn)在可以模擬病原體，而避免其它成分不需要的影響，同時(shí)保持佐劑性質(zhì)。當(dāng)然，可以向免疫原性載體提供多種多肽。這些多肽中一些為雜合抗原-Protan融合物(例如WO99/25836和WO02/101026中所述)，而一些為在此公開(kāi)的雙功能Protan融合物，其各自包含至少一個(gè)ABD(參見(jiàn)圖1)。使用包含不同ABD的多肽可允許不同的目標(biāo)抗原結(jié)合到單個(gè)免疫原性載體上。使用為單個(gè)多肽部分或不同多肽部分的多個(gè)ABD可以制備多表位疫苗。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種診斷方法，該方法包括使用本發(fā)明的免疫原性載體復(fù)合物。還提供了一種診斷試劑盒，該試劑盒包括使用本發(fā)明的免疫原性載體復(fù)合物。ABD可以用于捕獲樣品(如生物樣品)中的目標(biāo)抗原并固定于載體復(fù)合物上。這種'負(fù)載'的載體復(fù)合物適用于從剩余的樣品中分離目標(biāo)抗原，例如通過(guò)離心。隨后，可以檢測(cè)并定量結(jié)合目標(biāo)抗原的載體的量。因此，所述免疫原性載體復(fù)合物(例如GEM顆粒)可以用作'生物親和珠'以分離目標(biāo)抗原，任選地隨后分析目標(biāo)抗原。通過(guò)下面的實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。圖l.本發(fā)明的疫苗遞送技術(shù)的示意圖。右側(cè)顯示的為負(fù)載有幾種不同抗原的免疫原性GEM顆粒，所述抗原通過(guò)使用抗原-Protan融合蛋白和/或包含抗原結(jié)合域(ABD)和肽聚糖結(jié)合域(PBD)的雙功能多肽而結(jié)合到所述顆粒上，在這種情況下為Protan。圖2.ProtA-Protan雙功能多肽的GEM結(jié)合分析。M-全藍(lán)色預(yù)染精確分子量標(biāo)記(BioRad)BG=結(jié)合到GEM顆粒上之前ProtA-Protan制備培養(yǎng)基的TCA沉淀(200}il上清液)AG^吉合到GEM顆粒上并除去GEM顆粒后制備培養(yǎng)基的TCA沉淀(200|_il上清液)G二負(fù)載有ProtA-Protan的GEM顆粒(800(11上清液0.4單位GEM)箭頭表示ProtA-Protan融合蛋白預(yù)期的遷移位置(50.7千道爾頓[kDa])圖3.小鼠IgG與附著有ProtA-Protan的GEM顆粒的結(jié)合。上面部分根據(jù)堿性磷酸酶(AP)活性獲得的比色值。AP偶聯(lián)于識(shí)別小鼠IgG的二抗。因此，如果結(jié)合鼠IgG，可以檢測(cè)AP活性。下面部分上面部分中相應(yīng)的樣品的樣品成分的描述。圖4.鏈霉抗生物素蛋白-Protan的GEM結(jié)合分析。M-全藍(lán)色預(yù)染精確分子量標(biāo)記(BioRad)BG=結(jié)合到GEM顆粒上之前含鏈霉抗生物素蛋白-Protan的培養(yǎng)基的TCA沉淀(200pl上清液)AG^吉合到GEM顆粒上并除去GEM顆粒后培養(yǎng)基的TCA沉淀(200pl上清液)G-負(fù)載有鏈霉抗生物素蛋白-Protan的GEM顆粒(800pl上清液0.4單位GEM)箭頭表示鏈霉抗生物素蛋白-Protan融合蛋白預(yù)期的遷移位置(35.8kDa)圖5.生物素-HRP與附著有鏈霉抗生物素蛋白-Protan的GEM顆粒的結(jié)合上面部分該圖顯示根據(jù)辣根過(guò)氧化物斷HRP)活性獲得的比色值。生物素結(jié)合到HRP上。因此，如果結(jié)合生物素，可以測(cè)量HRP活性。下面部分描述本圖上面部分中相應(yīng)樣品的樣品成分。如果沒(méi)有鏈霉抗生物素蛋白-Protan融合物存在(樣品1和3)，只有Protan存在于GEM顆粒上(樣品3)，沒(méi)有生物素-HRP(樣品2)或GEM顆粒(樣品5)加入正如所預(yù)期的，測(cè)不到活性。僅在樣品4中測(cè)到活性，這說(shuō)明GEM顆粒上的鏈霉抗生物素蛋白-Protan結(jié)合生物素-HRP偶聯(lián)物。結(jié)論是，鏈霉抗生物素蛋白-Protan雙功能接頭可以附著到GEM顆粒上，且這種復(fù)合物可以結(jié)合生物素化的化合物。試驗(yàn)部分實(shí)施例l:在GEM顆粒上負(fù)載抗體本實(shí)施例描述了抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物的制備，使用GEM顆粒作為免疫原性載體以及蛋白A作為抗原結(jié)合域，將作為目標(biāo)抗原的抗體附著于載體復(fù)合物。金黃色葡萄球菌(6^p/^/ococcwawrew)的蛋白A(ProtA)為結(jié)合到IgG抗體的Fc區(qū)的42kDa蛋白。其可以用于從溶液中捕獲抗體并將它們固定于表面。在此制備ProtA與包含三個(gè)AcmALysM域的乳酸乳球菌細(xì)胞壁水解酶AcmA的肽聚糖結(jié)合域(cA)的融合基因，在此還稱(chēng)為錨定蛋白或者'Protan接頭'。由重組乳酸乳球菌表達(dá)和分泌制得的ProtA-Protan雙功能接頭。除去重組的制備細(xì)胞后，通過(guò)雜合接頭中的Protan部分將雙功能接頭附著到乳酸乳球菌的GEM顆粒上。相同的雜合接頭中的ProtA部分仍然能夠結(jié)合IgG抗體，從而將這些固定在GEM顆粒上。菌株和生長(zhǎng)條件本研究中使用的菌株列于表l中。乳酸乳球菌于3(TC在作為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的M17肉湯(DIFCO)中或含有1.5%瓊脂的M17平板上進(jìn)行培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基添加0.5。/。葡萄糖(w/v)(GM17)，且如果需要，添加5fig/ml氯霉素(SIGMA)用于質(zhì)粒篩選。用如前所述產(chǎn)生乳酸鏈球菌肽的乳酸乳球菌株NZ9700的培養(yǎng)物上清液誘導(dǎo)PnisA驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)(Kuipers等人[1997]TrendsBiotechnol.15:135-140)。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>普通分子生物學(xué)酶和緩沖液購(gòu)自NewEnglandBiolabs或Fermentas。乳酸乳球菌的電轉(zhuǎn)化使用Bio-RadGenePulser(Bio-Rad)如前所述(HoIo和Nes[1995]MethodsMol.Biol.47:195-199)進(jìn)行。通過(guò)BaseClear(Leiden,荷蘭)進(jìn)行核苷酸序列分析。含有ProtA-Protan的融合構(gòu)建體的制備夾自?xún)L昔色葡萄球菌的ProtA(NCBI登錄號(hào)BAB93949.1:US5,151,350;Uhlen等人[1984]J.Biol.Chem.259:1695-1702)含有五個(gè)各自由大約58個(gè)氨基酸組成的同源IgG-Fc結(jié)合區(qū)。對(duì)于ProtA與Protan的融合，只通過(guò)使用引物SpA.fw和SpA.rev(見(jiàn)表2)的PCR擴(kuò)增Fc結(jié)合域。表2:本研究中使用的引物_名稱(chēng)序列(5'—3')_限制,切位點(diǎn)_SpA.fwCCGTCTCCCATGGTTGCTGATGCGCAACAAAATAACEsp31(以下劃線標(biāo)示，產(chǎn)生Ncol粘性末端)SpA.revCCGTCTCGAATTCGTTTTGG丁GCTTGAGCATCGEsp31_(以下劃線標(biāo)示，產(chǎn)生EggEL粘性末端)由金黃色葡萄球菌基因組擴(kuò)增Fc結(jié)合部分后，從凝膠中分離710bpPCR片段并用&p3I消化，產(chǎn)生7VcoI和五coRI粘性末端。消化產(chǎn)物連接到用&oRI和iVcoI消化的pPA3上。通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)移到乳酸乳球菌PA1001中，并產(chǎn)生pPA217質(zhì)粒。菌株乳酸乳球菌(pPA217)產(chǎn)生分泌的ProtA-Protan多肽。產(chǎn)生的融合蛋白的TCA沉淀為了檢測(cè)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生的多肽的量，進(jìn)行TCA沉淀。TCA沉淀通過(guò)向1ml含有Prolan融合蛋白的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入200pl50%三氯乙酸(TCA)進(jìn)行。渦旋后將混合物冰上放置1小時(shí)。將沉淀的蛋白質(zhì)在離心機(jī)中以14,000rpm(4。C)旋沉20分鐘，丙酮洗滌，真空容器(exicator)中干燥并在SDS樣品緩沖液中重懸浮。GEM制備和結(jié)合條件用于制備GEM的乳酸乳球菌NZ9000通常用氯化氫(HCl,pHl.O)按照如下步驟進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理通過(guò)離心收集穩(wěn)定期培養(yǎng)物細(xì)胞，并用0.5體積的磷酸緩沖鹽溶液(PBS:58mMNa2HP04,17mMNa2H2P04，68mMNaCl,pH7.2)洗滌一次。在1/5體積的HC1，pH1.0溶液中重懸細(xì)胞并煮沸30分鐘。然后，用PBS洗滌依此方式形成的GEM顆粒三次，在PBS中重懸，直到用Burker-Turk血球計(jì)測(cè)定為平均2.5xlO"GEM顆粒/ml。GEM顆?？闪⒓从糜诮Y(jié)合實(shí)驗(yàn)，或者以1.0ml等分試樣在-8(TC保存直至使用。在典型的結(jié)合試驗(yàn)中，2.5xl09GEM顆粒(l單位)用2ml含有雙功能多肽(Protan融合蛋白)的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基在軸向旋轉(zhuǎn)器(over-endrotator)中于室溫溫育30分鐘。結(jié)合后，通過(guò)離心收集GEM顆粒，用PBS洗滌兩次，并通過(guò)SDS-PAGE或者酶活性分析。AP酶分析比色測(cè)定結(jié)合的兔抗鼠IgG堿性磷酸酶(AP)(Sigma)的酶活性。將0.5單位負(fù)載有ProtA-Protan融合蛋白、小鼠IgGl(K輕鏈)(Sigma)(lml,PBS中1:100稀釋)和兔抗鼠IgGAP(Sigma)(lmlPBS中1:10,000稀釋)的GEM顆粒旋沉并用PBS洗滌兩次。通過(guò)將負(fù)載的GEM顆粒在1ml4-硝基苯基磷酸酯(Sigma)(50mM碳酸鈉緩沖液，pH9.6,1mMMgCl2中1mg/ml)中于室溫溫育來(lái)測(cè)定堿性磷酸酶活性。5分鐘后，通過(guò)加入0.5ml2MNaOH終止反應(yīng)。旋沉GEM顆粒，通過(guò)分光光度計(jì)(BioRadSmartspec300)測(cè)定所述上清液在405nm的吸光度。ProtA-Protan多肽附著于GEM顆粒如上所述誘導(dǎo)多肽的制備。誘導(dǎo)過(guò)夜后，通過(guò)向0.5U的GEM中加入1ml制備株的上清液進(jìn)行GEM結(jié)合試驗(yàn)，以此來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)。結(jié)果示于圖2中。可清楚看到，多數(shù)制備的ProtA-Protan融合肽(泳道BG)被特異性地從制備培養(yǎng)基(泳道AG)中除去，并有效地結(jié)合到GEM顆粒上(泳道G)。泳道G中成片條帶是由GEM顆粒中存在的降解的乳酸乳球菌蛋白引起。小鼠IgG結(jié)合于ProtA-Protan-GEM顆粒如上所述使用報(bào)告酶堿性磷酸酶(AP)測(cè)定附著于GEM顆粒的ProtA-Protan多肽的抗體結(jié)合活性。如圖3所示，對(duì)于該試驗(yàn)，考慮不同的對(duì)照組。結(jié)果清楚地證實(shí)小鼠IgG結(jié)合于用附著的ProtA-Protan融合蛋白活化的GEM顆粒(樣品1)。正如所預(yù)期的，在沒(méi)有ProtA-Protan加到GEM顆粒(樣品2)時(shí)，或沒(méi)有偶聯(lián)AP的二抗加入(樣品5)時(shí)，檢測(cè)不到活性。含有偶聯(lián)的AP的抗小鼠二抗同樣為IgG抗體，即使在不存在小鼠IgG(樣品4)的'瞎況下，仍結(jié)合ProtA-Protan-GEM復(fù)合物。在不存在GEM顆粒的情況下，檢測(cè)到一些活性(樣品3)，很可能是由于在制備過(guò)程中旋沉的ProtA-Protan融合蛋白的一些團(tuán)聚或由于一些蛋白質(zhì)與塑料反應(yīng)管的特異性結(jié)合?？傊?，ProtA-Protan雙功能接頭可以附著到GEM顆粒上，且該復(fù)合物可以結(jié)合IgG抗體。總之，ProtA-Protan雙功能多肽可以附著到GEM顆粒上以產(chǎn)生免疫原性載體復(fù)合物，且該復(fù)合物可以負(fù)載有IgG抗體。實(shí)施例2:在GEM顆粒上固定生物素化的化合物阿維丁鏈霉菌(&z^^om;;c"aw'力'm7)的鏈霉抗生物素蛋白為一種15kDa蛋白質(zhì)，作為四聚體起作用，并結(jié)合生物素。鏈霉抗生物素蛋白可以用作抗原結(jié)合域(ABD)，以從溶液中捕獲生物素化的物質(zhì)并在表面固定它們。如實(shí)施例1中所述，我們制成鏈霉抗生物素蛋白與Protan接頭的融合基因。制得的鏈霉抗生物素蛋白-Protan雙功能多肽由重組的乳酸乳球菌表達(dá)和分泌。除去重組的制備細(xì)胞后，將雙功能接頭通過(guò)多肽的Protan部分的肽聚糖結(jié)合域(PBD)附著到乳酸乳球菌的GEM顆粒上。相同的多肽中ABD仍然起作用，并用于結(jié)合作為目標(biāo)抗原的生物素化的辣根過(guò)氧化物酶到并將其固定于GEM顆粒上。菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)過(guò)程的條件、普通分子生物技術(shù)、GEM制備以及結(jié)合條件和制備的融合蛋白的TCA沉淀與實(shí)施例1中的相同。HRP酶檢測(cè)比色測(cè)定結(jié)合的生物素-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)(分子探針)的酶活性。將0.5U負(fù)載有鏈霉抗生物素蛋白-Protan融合蛋白和生物素-HRP融合蛋白(lml，PBS中1:2000生物素-HRP(lmg/ml)的GEM顆粒旋沉，并用PBS洗滌兩次。通過(guò)將負(fù)載的GEM顆粒在1mlABTS(Fluka)(10mg，在100ml0.05M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中，pH5.0)和1(ilH202(100%)中于室溫溫育來(lái)測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶活性。5分鐘后，通過(guò)加入100pl10%SDS終止反應(yīng)。旋沉GEM顆粒，通過(guò)分光光度計(jì)(BioRadSmartspec300)測(cè)定上清液在405nm的吸光度。含有鏈霉抗生物素蛋白-Protan的融合構(gòu)建體的制備只有鏈霉抗生物素蛋白的核心用作制備雙功能多肽(鏈霉抗生物素蛋白-Protan)的ABD。該核心為鏈霉抗生物素蛋白的生物素結(jié)合單元(NCBI登錄號(hào)CAA00084)，其包含A37-S163的氨基酸(Argarafia等人[19S6]NucleicAcidResearch14:1871-1882，P能ler等人[1987]J.Biol.Chem.262:13933-13937)。為了鏈霉抗生物素蛋白核心與包含PBD的Protan部分的融合，設(shè)計(jì)了8個(gè)引物。在兩個(gè)不同的PCR反應(yīng)中，這些引物，首先StrepLfw至Strep4.rev以及Strep5.fw至Strep8.rev可以相互進(jìn)行擴(kuò)增。兩種PCR產(chǎn)物混合并用兩個(gè)外端引物Str印l.fw和Str印8.rev擴(kuò)增，其中產(chǎn)生397bp的鏈霉抗生物素蛋白核心基因片段，其使用乳酸乳球菌密碼子最優(yōu)化。用于制備這種基因片段的引物在表3中描述。為能夠篩選包含正確DNA序列的PCR片段，使用ZeroBluntTOPO克隆試劑盒(Irwitrogen)。用EcoM和JVcoI消化包含正確的鏈霉抗生物素蛋白核心基因片段的ZeroBlm^TOPC^質(zhì)粒。該消化產(chǎn)物連接到同樣用和TVcoI消化的pPA3上。通過(guò)電穿孔將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到乳酸乳球菌PAIOOI，從而產(chǎn)生pPA218質(zhì)粒。在培養(yǎng)基中，乳酸乳球菌(pPA218)產(chǎn)生并分泌鏈霉抗生物素蛋白-Protan多肽。多肽附著于免疫原性載體如上所述誘導(dǎo)融合蛋白的產(chǎn)生。誘導(dǎo)過(guò)夜后，通過(guò)向0.5單位的GEM顆粒中加入lm制備株的上清液進(jìn)行GEM結(jié)合試驗(yàn)，以此來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)(圖4)?？汕宄吹?，多數(shù)制備的鏈霉抗生物素蛋白-Protan融合蛋白(泳道BG)特異性地從制備培養(yǎng)基(泳道AG)中除去，并有效地結(jié)合于GEM顆粒(泳道G)。泳道G中成片條帶是由GEM顆粒中存在的降解的乳酸乳球菌蛋白引起。表3.用于制備鏈霉抗生物素蛋白核心基因的引物。斜體、下劃線、雙下劃線、小寫(xiě)字母、斜體并下劃線、小寫(xiě)字母并下劃線、或者小寫(xiě)字母并斜體且下劃線的核苷酸序列可以相互退火。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>生物素-HRP結(jié)合于鏈霉抗生物素蛋白-Protan-GEM顆粒在此如下所述使用HRP作為報(bào)告酶測(cè)定結(jié)合于GEM的融合蛋白的生物素結(jié)合活性。如圖5所示，對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，考慮不同的對(duì)照組。如果不存在鏈霉抗生物素蛋白-Protan融合蛋白(樣品1和3)，只有Protan存在于GEM顆粒上(樣品3)，不加入生物素-HRP(樣品2)或GEM顆粒(樣品5)，正如所預(yù)期的，測(cè)定不到活性。只有在樣品4中檢測(cè)到活性，表明GEM顆粒上的鏈霉抗生物素蛋白-Protan結(jié)合生物素-HRP偶聯(lián)物?？傊溍箍股锼氐鞍?Protan雙功能多肽可以附著到免疫原性GEM顆粒上，且該復(fù)合物可以結(jié)合生物素修飾的目標(biāo)抗原。實(shí)施例3:使用雙功能Protan接頭在GEM顆粒上固定滅活的全脊髓灰質(zhì)炎病毒噬菌體展示(Smith和Petrenko[1997]Chem.Rev.97:391-410)已經(jīng)成為選擇特異性結(jié)合肽的強(qiáng)大技術(shù)(Sidhu等人[2000]Meth.Enzymol.328:333-344;Cwirla等人[1990]Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87:6378-6382)。編碼所述肽的DNA序列翻譯性地融合到編碼基因3次要衣殼蛋白的DNA上，從而在噬菌體表面展示所述肽。依此方式，在展示的肽和編碼該肽的DNA之間建立物理性連接。通過(guò)在特定目標(biāo)上篩選，噬菌體肽文庫(kù)可以用于有效地從多種變體中搜索出特異性連接物(binder)。然后，可以在大腸桿菌中擴(kuò)增選擇的噬菌體并進(jìn)行另外的淘選循環(huán)，以富集特異性結(jié)合于目標(biāo)的肽。隨機(jī)肽文庫(kù)己用于多種應(yīng)用，例如，結(jié)合于蛋白質(zhì)(Sidhu等人[2000]Meth.enzymol.328:333-344)、結(jié)合于多糖Kim等人[2005]Biochem.Biophys.Res.Commun.329:312-317)、結(jié)合于細(xì)菌芽孢Knurr等人[2003]Appl.Environ.Microbiol.69:6841-6847)、結(jié)合于全細(xì)胞(Brown[2000]Cuit.Opinion.Chem.Biol.4:16-21)以及結(jié)合于無(wú)機(jī)物質(zhì)(Whaley等人[2000]Nature405:665-668)。在目前應(yīng)用中，噬菌體展示可以用于篩選隨后用于構(gòu)建雙功能Protan接頭的特異性結(jié)合肽。如Protan接頭的雙功能多肽的應(yīng)用可以允許目標(biāo)化合物(如蛋白質(zhì)、多糖、細(xì)菌、病毒或真菌)附著于GEM顆粒。肽比結(jié)合蛋白優(yōu)越的地方在于它們免疫原性較低且易于制備。在該實(shí)施例中描述基于噬菌粒的肽文庫(kù)的構(gòu)建，其用于篩選目標(biāo)為滅活的全脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性結(jié)合肽。篩選的特異性結(jié)合于全脊髓灰質(zhì)炎病毒的肽遺傳融合于Protan，且該雙功能Protan接頭附著到乳酸乳球菌GEM顆粒上。其可以非共價(jià)偶聯(lián)滅活的全脊髓灰質(zhì)炎病毒。制得的GEM顆粒與滅活的全脊髓灰質(zhì)炎病毒的負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物可以直接用于疫苗中。肽噬菌體展示載體的構(gòu)建由pCANTAB5EST(AmershamPharmacia)構(gòu)建噬菌粒pPEP，用于展示短肽序列。肽的展示需要肽與噬菌體M13的次要衣殼蛋白3(g3p)的框內(nèi)融合。因此，去掉pCANTAB5EST中/7/wniI和j5a"2ffl識(shí)別序列之間的多余核苷酸序列，并由只編碼相關(guān)序列元件的PCR擴(kuò)增片段替換。另外，插入^/7l和識(shí)別序列，以在基因3的5'端克隆肽序列。此外，為了改進(jìn)展示的肽的靶向性，在克隆的肽和次要衣殼蛋白之間包含三個(gè)甘氨酸殘基的小間隔序列。肽噬菌體展示載體的構(gòu)建需要多種聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)步驟。首先，通過(guò)兩個(gè)連續(xù)的重疊PCR合成由W/"dIII識(shí)別序列到基因3的起始的DNA片段。由寡核苷酸Cb1F2.fw,5'-ggagccttttttttggagattttcaacgtgaaaaaattattattcgcaattcctttagtggta;Cb1F.3.fw，5'-gcaattcctttagtggtacctttctatgcggcccagccggccatggcccagggcgctgggaga;以及CblF4.rev,5'-ttcaacagtaccgccaccccgtcttctcccagcgccctgggc制備暫時(shí)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。純化暫時(shí)的擴(kuò)增子，并與外側(cè)引物CblFl,fw，5'-atgattacgccaagcttt-ggagccttttttttggag禾口CblF5.rev5'-aggttttgctaaacaactttcaacagtaccgccacc—起在第二重疊PCR中用作模板，從而產(chǎn)生最終擴(kuò)增的PCR片段。使用寡核苷酸Cb2.fw，5'-actgttgaaagttgtttagcaaaacct和Cb2.rev5'-agacgattggccttgatattcacaaac通過(guò)PCR制備包含基因3的第一617個(gè)核苷酸的第二DNA片段。在最終重疊PCR中，后面的擴(kuò)增子與第一擴(kuò)增PCR產(chǎn)物以及外側(cè)引物CblFl.fw和Cb2.rev結(jié)合，產(chǎn)生711bpPCR片段。用歷"cHn和5麵HI消化該擴(kuò)增產(chǎn)物并連接到pCANTAB5EST的相同位點(diǎn)中，從而產(chǎn)生噬菌粒pPEP。隨機(jī)肽文庫(kù)的構(gòu)建噬菌粒pPEP在基因3的5'端包含A^"I和識(shí)別位點(diǎn)，以作為N端g3p融合物展示隨機(jī)肽。由于pPEP為噬菌粒，所以以單價(jià)形式展示肽，即每個(gè)噬菌體顆粒的表面只有1或2拷貝g3p將會(huì)融合于克隆的肽。根據(jù)Noren和Noren[2001](Methods23:169-178)構(gòu)建編碼12個(gè)氨基酸直鏈隨機(jī)肽的寡核苷酸文庫(kù)。簡(jiǎn)而言之，用序列5'-accgaagaccccacc(BNN)i2ctgggccatggccggctgggccgcatagaaaggtacccggg(B=C或G或T)設(shè)計(jì)92核苷酸文庫(kù)寡核苷酸，PEP12Lib.rev。在Klenow反應(yīng)中退火并延伸通用延伸引物PEPext.fw5'-catgcccgggtacctttctatgcgg。純化得到的雙鏈文庫(kù)寡核苷酸，用和￡^'1消化，并連接到已經(jīng)用相同的酶消化的pPEP中，產(chǎn)生pPEP12。通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)染進(jìn)五.co//XLl-blue或TG1細(xì)胞中(Stratagene)，直至獲得-109個(gè)獨(dú)立的克隆。用30倍的過(guò)量M13K07輔助噬菌體轉(zhuǎn)染包含pPEP12的￡.co//TG1或XLl-blue細(xì)胞，以制備噬菌粒顆粒。通過(guò)PEG沉淀，從轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物純化噬菌粒顆粒。生物淘選使用滅活的全脊髓灰質(zhì)炎病毒用于親和篩選特異性結(jié)合蛋白。脊髓灰質(zhì)炎病毒被涂敷有兔抗脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG(0.5-llag/ml)的ELISA板捕獲?；蛘撸顾杌屹|(zhì)炎病毒在負(fù)載有結(jié)合于ProtA-Protan融合蛋白的抗脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG的GEM顆粒上展示。使來(lái)自十二肽文庫(kù)的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)+O.P/。Tween20(PBS-T)中大約1011個(gè)噬菌粒顆粒在孔中反應(yīng)，或者與攜帶滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒的-l(^個(gè)GEM顆粒在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。用PBS-T洗滌GEM或孔十次，用0.2M甘氨酸/HCl(pH2.2)稀釋結(jié)合的噬菌體。用2MTris堿中和稀釋的噬菌體懸浮液。稀釋的噬菌體用于轉(zhuǎn)染￡.co//TG1或XLl-blue細(xì)胞?？偣策M(jìn)行6個(gè)循環(huán)的篩選，此后分離單個(gè)的噬菌體克隆用于進(jìn)一步分析。結(jié)合分析為評(píng)價(jià)肽與脊髓灰質(zhì)炎病毒的結(jié)合，用抗脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG(0.5-1嗎/ml)涂敷多孔板。用PBS-T洗滌后，在室溫用PBS-T中的1。/。BSA封閉孔1小時(shí)。將滅活的全脊髓灰質(zhì)炎病毒加入PBS-T+1%BSA中，并在室溫溫育1小時(shí)。將PBS-T中選擇的肽-噬菌體(10"cfU/ml)加入孔中。室溫1小時(shí)后，用PBS-T洗滌板三次。使用ABTS[2,2'-連氮基雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]作為底物用偶聯(lián)HRP的抗M13抗體(Pharmacia)檢測(cè)結(jié)合于脊髓灰質(zhì)炎病毒的肽-噬菌體。合適的時(shí)間后，測(cè)量410nm處的吸光度。篩選兩種對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒呈現(xiàn)最佳結(jié)合的肽-噬菌體，用以通過(guò)序列分析進(jìn)一步鑒定。這兩種噬菌粒稱(chēng)為pPEP-PVl和pPEP-PV2。PEP-Protan融合蛋白的構(gòu)建基于pPEP-PVl和pPEP-PV2中結(jié)合肽的核苷酸序列，用^al和^/I懸垂5，端設(shè)計(jì)并制備對(duì)應(yīng)于結(jié)合肽PV1和PV2的兩種互補(bǔ)寡核苷酸。在總體積為100^的10mMTris-HCl(pH8.0)中將等摩爾濃度的兩種寡核苷酸退火。在熱循環(huán)儀中將混合物加熱至94t:并緩慢冷卻至室溫。退火的寡核苷酸連接到用^al和5pz'I消化的pPA224中。質(zhì)粒pPA224為pPA3的衍生質(zhì)粒(Steen等人[2003]J.Biol.Chem.278:23874-23881)，其缺少c-,，c序列并在信號(hào)序列和Protan序列之間具有修飾的多克隆位點(diǎn)。連接后將混合物通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)移至乳酸乳球菌PAIOOI。得到質(zhì)粒pPA224-PVl和pPA224-PV2，其中PV1和PV2分別轉(zhuǎn)錄性融合于Protan序列的5'端。乳酸乳球菌PA1001(pPA224-PVl)和乳酸乳球菌PA1001(pPA224-PV2)分別向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分泌PVl-Protan和PV2-Pi'otan雙功能接頭。通過(guò)微過(guò)濾和/或離心將制備細(xì)胞從制備培養(yǎng)基中去除。滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒與抗原結(jié)合性GEM顆粒的結(jié)合雙功能多肽PV1-Protan和PV2-Protan各自單獨(dú)地或者通過(guò)結(jié)合的方式有效地附著到乳酸乳球菌GEM顆粒上。由此得到的抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物PVl-Protan-GEM、PV2-Protan-GEM禾卩PVl+PV2-Protan-GEM與含有滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒顆粒的懸浮液混合。在所有情況中，脊髓灰質(zhì)炎病毒顆粒有效地結(jié)合于GEM-雙功能Protan復(fù)合物。該實(shí)施例說(shuō)明使用噬菌體展示可以選擇特異性抗原結(jié)合域，甚至對(duì)于整個(gè)病毒顆粒，并說(shuō)明該結(jié)合域可以用于雙功能多肽以將整個(gè)病毒固定在免疫原性載體上。此外，實(shí)施例說(shuō)明無(wú)論已知的抗原結(jié)合域還是由隨機(jī)肽文庫(kù)新篩選的結(jié)合域都可以用于Protan融合物中而作為雙功能Protan接頭，以將目標(biāo)化合物(例如抗原)固定在GEM顆粒上，而無(wú)需在結(jié)合到免疫原性載體之前修飾目標(biāo)化合物。權(quán)利要求1.一種負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物，其包含至少一種附著于免疫原性載體的雙功能多肽，所述多肽包含融合于抗原結(jié)合域(ABD)的肽聚糖結(jié)合域(PBD)，所述多肽通過(guò)該肽聚糖結(jié)合域附著于所述載體，所述抗原結(jié)合域能夠結(jié)合目標(biāo)抗原，其中所述PBD包含選自由如下(i)、(ii)和(iii)組成的組的氨基酸序列(i)LysM域，(ii)以乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)細(xì)胞壁水解酶AcmAC末端中的LysM域(所述域在此還稱(chēng)為AcmALysM域)在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索所檢索到的氨基酸序列，以及(iii)與AcmALysM域顯示至少70％的序列相同性的序列，條件是所述PBD能夠附著于革蘭氏陽(yáng)性微生物的細(xì)胞壁，以及，其中至少一種目標(biāo)抗原結(jié)合于所述ABD。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其中至少兩種雙功能多肽附著于所述載體，各雙功能多肽具有不同的ABD和不同的目標(biāo)抗原。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合物，其中所述免疫原性載體包含自革蘭氏陽(yáng)性菌獲得的無(wú)活力球狀肽聚糖顆粒(GEM顆粒)。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中所述細(xì)菌為非致病菌，優(yōu)選為食品級(jí)細(xì)菌。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中所述細(xì)菌選自乳球菌、乳桿菌、芽孢桿菌和分支桿菌。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中所述肽聚糖結(jié)合域(PBD)包含乳酸乳球菌細(xì)胞壁水解酶AcmAC末端的肽聚糖結(jié)合域。7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中所述ABD能夠結(jié)合選自多肽、糖類(lèi)、脂類(lèi)、多核苷酸和包括滅活的病毒顆粒和純化的抗原決定簇的致病抗原的抗原。8.—種提供根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物的方法，該方法包括如下步驟-提供免疫原性載體；-提供雙功能多肽，所述雙功能多肽包含融合于抗原結(jié)合域(ABD)的肽聚糖結(jié)合域(PBD)，以允許所述多肽附著于所述免疫原性載體；以及-使所述免疫原性載體與所述多肽接觸；-使所述多肽與目標(biāo)抗原接觸。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述提供免疫原性載體包括自革蘭氏陽(yáng)性菌制備無(wú)活力的球狀肽聚糖顆粒。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中，提供所述雙功能多肽包括自隨機(jī)肽或抗體文庫(kù)篩選抗原結(jié)合域，其優(yōu)選使用噬菌體展示技術(shù)。11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的方法，其包括通過(guò)重組表達(dá)編碼所述多肽的核酸構(gòu)建體而在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生所述雙功能多肽。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中分泌所述多肽。13.—種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物。14.一種免疫原性組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物。15.抗原結(jié)合性免疫原性載體復(fù)合物用于將目標(biāo)抗原遞送至對(duì)象的免疫系統(tǒng)的用途，所述復(fù)合物包含至少一種附著于免疫原性載體的雙功能多肽，所述多肽包含肽聚糖結(jié)合域(PBD)，所述多肽通過(guò)該肽聚糖結(jié)合域附著于所述載體，該肽聚糖結(jié)合域(PBD)融合于能夠結(jié)合所述目標(biāo)抗原的抗原結(jié)合域(ABD)，其中所述PBD包含選自由如下(i)、(ii)和(iii)組成的組的氨基酸序列(i)LysM域，(ii)以乳酸乳球菌細(xì)胞壁水解酶AcmAC末端中的LysM域(所述域在此還稱(chēng)為AcmALysM域)在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索所檢索到的氨基酸序列，以及(iii)與AcmALysM域顯示至少70°/。的序列相同性的序列，條件是所述PBD能夠?qū)⑽镔|(zhì)附著于革蘭氏陽(yáng)性微生物的細(xì)胞壁。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其中所述向免疫系統(tǒng)的遞送包括向粘膜位點(diǎn)的遞送，例如鼻內(nèi)或口、陰道或直腸遞送。17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的用途，其中所述復(fù)合物負(fù)載有所述目標(biāo)抗原。全文摘要本發(fā)明涉及免疫學(xué)和疫苗遞送領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及具有內(nèi)在免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的細(xì)菌疫苗遞送技術(shù)，其可以使任何目標(biāo)抗原不經(jīng)過(guò)預(yù)先的抗原修飾而固定。本發(fā)明提供一種負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物，其包含至少一種附著于免疫原性載體的雙功能多肽，所述雙功能多肽包含融合于抗原結(jié)合域(ABD)的肽聚糖結(jié)合域(PBD)，所述多肽通過(guò)該肽聚糖結(jié)合域附著于所述載體，所述抗原結(jié)合域結(jié)合至少一種目標(biāo)抗原。本發(fā)明還提供一種包含本發(fā)明的負(fù)載抗原的免疫原性載體復(fù)合物的藥物組合物(例如疫苗)。文檔編號(hào)A61P35/00GK101268095SQ200680034459公開(kāi)日2008年9月17日申請(qǐng)日期2006年7月20日優(yōu)先權(quán)日2005年7月20日發(fā)明者C·J·利恩霍茨,M·L·范羅斯馬倫,T·伯斯馬申請(qǐng)人:應(yīng)用超微系統(tǒng)股份有限公司