專利名稱：：用于治療變態(tài)反應(yīng)的合成IgE膜錨肽免疫原的制作方法發(fā)明所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種合成肽免疫原組合物的用途，該免疫原包含以線性串聯(lián)形式共價連接的靶抗原位點和輔助T細(xì)胞表位。更具體地說，本發(fā)明涉及在包括人類的健康哺乳動物中引發(fā)產(chǎn)生高滴度抗體的組合物的用途，該抗體對B細(xì)胞表達(dá)的膜結(jié)合的人IgE的ε重鏈上之位點，即膜結(jié)合的人ε-鏈的錨結(jié)構(gòu)域的胞外片段上之位點是特異性的，本發(fā)明也涉及該組合物作為疫苗以提供治療變態(tài)反應(yīng)的免疫療法的用途。
背景技術(shù)：
：用于預(yù)防IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)(如氣喘和枯草熱)的免疫療法從本世紀(jì)早期就已經(jīng)知道并進行實踐，這種方法牽涉到通過對患者施用逐漸增加量的變應(yīng)原以降低隨后接觸那種變應(yīng)原(1)的作用的脫敏作用和減敏作用。這種基于免疫原的免疫療法的限制包括鑒別涉及的變應(yīng)原的困難和由于使用鑒別的變應(yīng)原(1)經(jīng)常產(chǎn)生的副反應(yīng)。其它減輕變態(tài)反應(yīng)的處理方法使用治療化合物以阻斷在變態(tài)反應(yīng)中起作用的細(xì)胞事件的級聯(lián)。這些化合物包括抗組胺、減充血劑、β2興奮劑和皮質(zhì)類固醇?？菇M胺、減充血劑、和β2興奮劑在變應(yīng)性級聯(lián)反應(yīng)中作用于IgE下游事件上，進行姑息治療，這種治療指出變應(yīng)性癥狀而非必須作用于較接近IgE介導(dǎo)的變應(yīng)性的起始反應(yīng)的事件的預(yù)防性處理。這些姑息治療提供短期的和部分的減輕，但經(jīng)常伴隨著不利的副作用。例如，抗組胺可以導(dǎo)致不安或不鎮(zhèn)靜，β2興奮劑有時和氣喘病患者發(fā)病的增加有關(guān)。與抗組胺相比，減充血劑、β2興奮劑和皮質(zhì)類固醇是強的免疫抑制劑，對變應(yīng)性癥狀的處理是非常有效的。然而，它們產(chǎn)生不利的激素活性并可導(dǎo)致不需要的廣范圍免疫抑制。為避免這些治療化合物的缺點，希望通過選擇性地對準(zhǔn)IgE的抑制在IgE水平上預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。這可以通過直接或間接地抑制IgE的合成完成。間接抑制能通過脫敏或抑制IL-4和其它T細(xì)胞產(chǎn)生的IgE合成(3)的介體完成。如由Chang等(4)表明的，直接抑制可通過用選擇性抗體特異性地對準(zhǔn)IgE產(chǎn)生的B細(xì)胞來完成。Chang等(4-8)和其它人(9)曾研究人類ε-鏈和對應(yīng)的抗體以及編碼ε-鏈的基因和mRNAs。他們已經(jīng)闡明了兩類IgE表達(dá)的分子基礎(chǔ)通過結(jié)合到進行IgE合成的B細(xì)胞分泌形式和膜結(jié)合形式。IgE(mIgE)的膜結(jié)合形式可以通過附加的膜錨結(jié)構(gòu)域和分泌形式區(qū)別，此結(jié)構(gòu)域從重鏈的C端伸展并與IgE的CH4穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域相鄰。膜結(jié)合形式與結(jié)合到進行IgE合成的B細(xì)胞表面明顯不同。通過用接觸的那種錨結(jié)構(gòu)域的胞外片段的特異性抗體定位這類細(xì)胞，這類細(xì)胞可被除去或滅活。通過這類抗體除去IgE分泌細(xì)胞的機制可通過抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)和補體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解(6，7)。通過抗IgE抗體減少循環(huán)IgE和IgE表達(dá)細(xì)胞在小鼠體內(nèi)已經(jīng)證明，大鼠模型中是通過活體內(nèi)被動的皮膚過敏反應(yīng)的抑制證明的。這點在人IgE分泌細(xì)胞系中也得到了證明，在此細(xì)胞系中抗IgE顯示導(dǎo)致細(xì)胞生長的減少、降低IgE的積累和在補體介導(dǎo)的和ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞溶解測定(1)中的細(xì)胞溶解。通過測定人類基因組DNA和人mIgE表達(dá)B細(xì)胞的mRNA的適當(dāng)片段的核苷酸序列來預(yù)測錨結(jié)構(gòu)域胞外部分的氨基酸序列。這些位點的存在和特異性以及它們對抗體的可接近性用特異性抗體(4，8)確證。這些多克隆和單克隆抗體是衍生自用ε鏈相關(guān)的“肽載體蛋白質(zhì)綴合物”(4，8)免疫的抗體。載體蛋白質(zhì)是匙孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)，已知它有能力刺激對靶肽的抗體反應(yīng)，因而是有用的。這種方法可用于證明mIgE特異性肽免疫原用于變應(yīng)性疾病的免疫療法的可用性，此免疫療法通過用單克隆抗體被動免疫或通過自動免疫(6，7)進行。使用這類肽KLH疫苗給有IgE介導(dǎo)的敏感性的患者提供免疫治療的可行性已經(jīng)由Stanworth等使用不同的ε鏈肽報導(dǎo)(12，13)。選自從多次免疫(可產(chǎn)生高于平均抗肽滴度)獲得的血液中的兔抗肽血清減少了誘導(dǎo)的組胺以滴度依賴性方式從大鼠腹膜肥大細(xì)胞中釋放。這種抑制活性通過在大鼠被動皮膚過敏反應(yīng)(PCA)模型中進行活體試驗進一步確證。這種針對過敏反應(yīng)的兔抗肽血清的作用通過染藍(lán)區(qū)域的測量評價。當(dāng)假定大鼠用變應(yīng)原引起過敏反應(yīng)前先通過多種變應(yīng)原施用致敏時可以通過估計顏色強度評價。這些結(jié)果初步表明使用基于肽的疫苗治療變態(tài)反應(yīng)的可行性。然而，這種肽綴合策略遇到了許多困難。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)形成的克隆和用這類綴合物產(chǎn)生的抗血清包含直接抗蛋白質(zhì)載體KLH上的而不是靶肽(14)上的表位的抗體。蛋白質(zhì)載體綴合物疫苗的另一個主要缺點包括小于最優(yōu)的免疫刺激能力，由于載體蛋白質(zhì)的十分有限的組合物的制作困難和綴合反應(yīng)的不均一性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常使用合成的肽免疫原的綴合蛋白質(zhì)載體，因為小肽是不好的免疫原。為了使這些肽成為免疫原，通常將它們化學(xué)地或通過基因融和綴合到大的載體蛋白質(zhì)上。然而，這些過程可引起肽的不可預(yù)測的構(gòu)象改變。而且，免疫反應(yīng)經(jīng)常被誤導(dǎo)進行優(yōu)勢免疫載體反應(yīng)。因而，提供長期持續(xù)的預(yù)防變態(tài)反應(yīng)的高效疫苗的開發(fā)需要進一步的免疫原設(shè)計。悉心探察“最優(yōu)免疫原”設(shè)計(包括用全面試驗嘗試充分證實)仍有待完成。參考文獻1.Noon，“抗枯草熱預(yù)防接種”Lancet.i1572-1573(1991).2.世界健康組織和免疫學(xué)協(xié)會國際聯(lián)合會工作組報告變應(yīng)原免疫療法的當(dāng)前狀態(tài)，Lancet，i259-261(1989).3.Pene等，美國科學(xué)院學(xué)報，856880-6884(1988).4.Dayis，Gosset和Chang，生物技術(shù)，953-56(1991).5.Sun，Lieu，Sun，Gosset等，免疫學(xué)雜志，146199-205(1991).6.Chang.存在于B細(xì)胞而非嗜堿細(xì)胞表面的IgE的抗原表位，美國專利號5,091,313(1992).7.Chang.最近鑒別的人類ε免疫球蛋白肽和有關(guān)的產(chǎn)物，美國專利5,274,075(1993).8.Peng，Dayis，Sun等，免疫學(xué)雜志，148129-136(1992).9.Saxon，Kurbe-Leamer等，免疫學(xué)雜志，1474000-4006(1991).10.Haba和Nisonoff，美國科學(xué)院學(xué)報，873363-3367(1990).11.Davis，Gosset，Pinkston，Lieu等，SprinserSemin.Immunopath，1551-73(1993).12.Stanworth，Jones，Lewin和Nayyar，Lancet，3361279-1281(1990).13.Stanwortb，Lewin，Nayyax和Jones，免疫反應(yīng)肽和抗體以及它們在抗變態(tài)反應(yīng)治療中的用途.EPO403312Al(1990).14.Stanworth和Burt，分子免疫學(xué)，231231-1235(1986).15.Brett等，歐洲免疫學(xué)雜志，231608-1614(1993).16.Weismuller等，國際肽研究雜志，40255-260(1992).17.Celis等，免疫學(xué)雜志，1401608-1815(1988).18.Demotz等，免疫學(xué)雜志，142394-402(1989).19.Chong等，感染免疫學(xué)，604640-4647(1992).20.Grant，ed.合成肽使用指導(dǎo)，W.H.Freeman&amp;Co.，紐約，NY，(1992)，382頁.21.O’Hagan等，疫苗，9768-771(1991).22.Eldridge等，分子免疫學(xué)，28287-294(1991).發(fā)明目的本發(fā)明的目標(biāo)是使用一組化學(xué)合成的與T輔助表位肽線性串聯(lián)的膜結(jié)合IgE(mIgE)ε鏈肽免疫原，其中，當(dāng)T輔助表位肽被導(dǎo)入包括人類的哺乳動物時能引發(fā)針對人mIgE膜錨結(jié)構(gòu)域的露置肽位點的高滴度抗體。另一個目標(biāo)是設(shè)計優(yōu)化的肽免疫原，這種肽免疫原具有取自人類mIgE重鏈膜錨結(jié)構(gòu)域(SEQIDNOS1，2)并以特定的方向連接到包含混雜的人輔助T細(xì)胞表位的肽上的特異性氨基酸序列，當(dāng)此氨基酸序列導(dǎo)入哺乳動物(包括人類)中時，將刺激對人mIgE錨結(jié)構(gòu)域位點有效的抗體的產(chǎn)生。這些抗體可以導(dǎo)致IgE產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞的減少，因而可以減弱變應(yīng)原誘導(dǎo)的IgE的產(chǎn)生，通過IgE變應(yīng)原復(fù)合物限制肥大細(xì)胞的活性，降低產(chǎn)生變應(yīng)性癥狀的化學(xué)介質(zhì)(如組胺)的隨后釋放，抑制IgE介導(dǎo)的被動皮膚過敏性反應(yīng)(PCA)。預(yù)期最后結(jié)果是降低變態(tài)反應(yīng)的癥狀。另一個目標(biāo)是開發(fā)有效的基于mIgEε鏈的疫苗，使用包含這類線性肽免疫原的組合物以便為變態(tài)反應(yīng)的治療提供免疫療法。發(fā)明概述按照本發(fā)明，一系列線性排列的合成肽(這種合成肽包含相應(yīng)于人mIgE膜錨結(jié)構(gòu)域露置部分位點(SEQIDNO1，2)的兩種肽序列之一或它們的免疫原性類似物與輔助T細(xì)胞表位(Th表位)的一部分)通過固相合成制備。本發(fā)明的組合物用于免疫健康哺乳動物，例如產(chǎn)生對mIgE錨膜位點(SEQIDNO1，2)特異性的而不含無關(guān)抗體的高滴度抗血清的大鼠和人類。按照本發(fā)明的包含合成肽組合物作為其關(guān)鍵免疫原的疫苗也可以在適當(dāng)?shù)淖魟┖?或施用載體存在時用免疫學(xué)有效量的線性合成肽制備?？梢灶A(yù)期這樣的疫苗組合物比當(dāng)前由Chang等(4，6-8)使用的肽載體蛋白質(zhì)綴合物引發(fā)更集中的抗IgE肽反應(yīng)，這樣提供了治療變態(tài)反應(yīng)的更好的免疫療法。發(fā)明詳述本發(fā)明包括一組新的基于肽的免疫原的用途，這種免疫原用于在哺乳動物(包括人類)中產(chǎn)生人IgEε重鏈的mIgE錨膜位點(SEQIDNO1，2)的高滴度抗體，此免疫原最終用于治療IgE介導(dǎo)的變應(yīng)性疾病。表I顯示了人膜結(jié)合IgE(mIgE)的ε重鏈的膜錨結(jié)構(gòu)域的排列和氨基酸序列，該序列是從編碼膜結(jié)合的ε鏈(7，8)的mRNA的優(yōu)勢種類的核苷酸序列推導(dǎo)得來的。作為本發(fā)明靶免疫原使用的肽的ε鏈序列上的區(qū)域劃有下劃線SEQIDNO1的劃單線，SEQIDNO2的劃雙線。表ICH4結(jié)構(gòu)域|膜錨結(jié)構(gòu)域/胞外片斷0...ValAsnPro|GlyLeuAlaGlyGlySerAlaGlnSerGlnArgAlaProAspArgValLeuCysHisSerGlyGlnGlnGlnGlyLeuProArgAlaAlaGlyGlySerValProHisPro/胞外ArgCysHisCysGlyAlaGlyArgAlaAspTrpProGlyProProGluLeuAspValCysVal片斷1/跨膜錨片斷GluGluAlaGluGlyGluAlaProTrpThrTrpThrGlyLeuCysIlePheAlaAlaLeuPhe/胞質(zhì)錨片段LeuLeuSerValSerTyrSerAlaAlaLeuThrLeuLeuMetValGlnArgPheLeuSerAlaThrArgGlnGlyArgProGlnThrSerLeuAspTyrThrAsnValLeuGlnProHisAla通常本領(lǐng)域技術(shù)人員承認(rèn)變應(yīng)性癥狀(IgE依賴的過敏性的直接結(jié)果)是由肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞釋放的化學(xué)介質(zhì)引起的。當(dāng)連接到肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞的受體上的分泌性IgE通過對受體結(jié)合的IgE特異性的變應(yīng)原結(jié)合時，觸發(fā)這種釋放。在抗原抗體類型相互作用中，在變應(yīng)原結(jié)合到表面結(jié)合的IgE的Fab片段部分后，啟動觸發(fā)反應(yīng)。變應(yīng)原/抗體結(jié)合交聯(lián)二價表面結(jié)合的IgE，同時誘導(dǎo)IgE的遠(yuǎn)側(cè)FC區(qū)的構(gòu)象變化，IgE此區(qū)域與在肥大細(xì)胞/嗜堿細(xì)胞細(xì)胞表面的高親和性Fc受體以及細(xì)胞表面的受體位點直接相連。由于至今對機制仍不是準(zhǔn)確了解，構(gòu)象變化活化細(xì)胞-IgE-變應(yīng)原復(fù)合物，同時從細(xì)胞釋放包括組胺的化學(xué)介質(zhì)，引起變應(yīng)性癥狀和IgE的進一步分泌。介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的分泌IgE在變應(yīng)原反應(yīng)中通過末期分化的B細(xì)胞產(chǎn)生。除分泌結(jié)合到肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的循環(huán)IgE之外，進行IgE合成的B細(xì)胞也在它們表面顯示出膜結(jié)合的IgE(mIgE)。mIgE分子是變應(yīng)原受體，被認(rèn)為在B細(xì)胞的成熟和B細(xì)胞被變應(yīng)原特異性T細(xì)胞的活化中起調(diào)節(jié)作用。mIgE可通過膜錨片段和分泌IgE區(qū)別，這種膜錨片段從用來把mIgE連接到細(xì)胞膜的重鏈的C端延伸。通過測定人類基因組DNA和人表達(dá)mIgE的B細(xì)胞的mRNA的適當(dāng)片段的核苷酸序列，可推斷錨結(jié)構(gòu)域胞外部分的兩個免疫原位點的氨基酸序列(SEQIDNO1，2)。這些位點以源于不同mRNA接合反應(yīng)的mIgE的替代形式存在。兩種位點以表I顯示的方向在膜結(jié)合的ε鏈的優(yōu)勢種類中存在。這些位點的存在和特異性以及它們對抗體的接近性用特異性抗體(4，8)確證。直接抗這類特異性mIgE位點的抗IgE抗體的存在，通過主動或被動免疫可導(dǎo)致產(chǎn)生IgE的B細(xì)胞數(shù)目減少和循環(huán)IgE的伴隨減少，這可能是通過表達(dá)IgE的細(xì)胞(10，11)的溶胞除去達(dá)到的。而且，對膜錨結(jié)構(gòu)域的抗IgE抗體是合乎需要的，因為結(jié)構(gòu)域是對表達(dá)IgE的細(xì)胞特異性的表面標(biāo)記物。在分泌性IgE上沒有這種靶位點。這樣，這類抗mIgE不能結(jié)合和交聯(lián)結(jié)合到肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞受體上的IgE，而且不能自身引起組胺釋放。把遭受變態(tài)反應(yīng)的宿主的表達(dá)IgE的細(xì)胞除去可以導(dǎo)致IgE產(chǎn)生的負(fù)調(diào)節(jié)，并具有治療的結(jié)果。通過特異性抗IgE抗體的使用，在治療變態(tài)反應(yīng)中使用的這類干預(yù)，即一種免疫療法，可以被動地通過用IgE的特異性的“直接抗位點的”抗體預(yù)防處理或更優(yōu)選地通過主動地給宿主提供由直接抗位點的肽免疫原組成的疫苗以引起宿主自身產(chǎn)生直接抗位點的抗IgE抗體來達(dá)到。人們相信自動免疫將提供更有效和更長期持久形式的保護。如表I顯示的膜結(jié)合的IgE上排列的膜錨結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO1，2)的胞外片段上的位點已經(jīng)確證為免疫原位點，此免疫原位點可通過抗體的IgE分泌細(xì)胞表面的和抗體交叉反應(yīng)接近，其中的抗體通過用偶聯(lián)到載體蛋白質(zhì)匙孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)(4，8)的mIgE錨膜肽免疫動物產(chǎn)生。這些原型“mIgE肽”疫苗的主要缺陷是它們的弱免疫原性以及與幾乎所有的自身抗原相關(guān)的固有問題。在本發(fā)明中，提供了特定實施例合成的免疫刺激單元以特定的方向連接到mIgE肽(SEQIDNOS1，2)，以便直接抗mIgE上這些位點的高效抗體能夠在遺傳多樣性的宿主個體中產(chǎn)生。反之，這些抗體可能導(dǎo)致表達(dá)IgE的細(xì)胞減少、降低循環(huán)IgE的水平以及降低的IgE介導(dǎo)的反應(yīng)，這樣就產(chǎn)生了一種預(yù)防IgE介導(dǎo)的變應(yīng)性疾病的有效治療。本發(fā)明的肽免疫原在實質(zhì)上不能介導(dǎo)非細(xì)胞溶解的組胺釋放的同時，卻能夠用血清學(xué)上與人mIgE膜錨結(jié)構(gòu)域(SEQIDNOS1，2)的胞外區(qū)域的靶氨基酸序列進行交叉反應(yīng)引發(fā)抗體。初始劑量(例如為0.2-2.5mg；優(yōu)選的為lmg)的免疫原通過注射(優(yōu)選地通過肌內(nèi)注射)施用，然后重復(fù)用藥(加強免疫)。如在疫苗和治療領(lǐng)域所熟悉的，劑量依賴于患者的年齡、體重和一般的健康狀況。本發(fā)明對提供抗體制劑的哺乳動物沒有特定的限制，通常優(yōu)選的是使用小鼠、兔、豚鼠、豬、山羊、大鼠或羊等作為宿主。對于自動免疫接種，本文所指的術(shù)語“免疫原”涉及能夠誘導(dǎo)抗mIgE膜錨結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO1，2)的抗體并導(dǎo)致抑制IgE介導(dǎo)的嗜堿細(xì)胞和肥大細(xì)胞的降解顆粒的合成肽。本發(fā)明的免疫原包括線性的合成肽，此肽包含混雜的輔助T細(xì)胞表位(Th表位)。為引起高效的抗體反應(yīng)，Th肽通過間隔共價連接到mIgE膜錨結(jié)構(gòu)域肽(SEQIDNO1，2)以便和膜錨肽的N端或C端鄰近。免疫原也可以包含對應(yīng)于細(xì)菌耶爾森氏菌屬的幾個種(15)的侵染素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的免疫刺激物氨基酸序列。侵染素結(jié)構(gòu)域通過間隔連接到Th肽上。本發(fā)明的免疫原減少了不相關(guān)抗體的產(chǎn)生以引發(fā)對“靶序列”的更集中的免疫反應(yīng)，即所需的對mIgE膜錨位點(SEQIDNOS1，2)的反應(yīng)，而不產(chǎn)生不需要的可以使治療變態(tài)反應(yīng)的免疫治療過程復(fù)雜化的副作用。然而，當(dāng)所需要的靶序列很短時(如本發(fā)明的26和17個氨基酸的mIgE肽(SEQIDNO1，2))，由于這類短肽抗原通常是T細(xì)胞依賴的抗原(即，使這些抗原成為免疫原性的需要T輔助表位的存在)，一種可抹蓋另一種對抗體的誘導(dǎo)。為提供功能的T細(xì)胞表位，必須努力設(shè)計包含短mIgE錨膜肽(SEQIDNOSl，2)的線性合成免疫原。本發(fā)明的肽由式(A)n-(Th)m-(B)o-(mIgE肽)代表，其中A是氨基酸、α-NH2、脂肪酸或它們的衍生物，或侵染素結(jié)構(gòu)域；B是氨基酸；Th是輔助T細(xì)胞表位或其免疫增強類似物或它們的片斷；mIgE肽是Gly-Leu-Ala-Gly-Gly-Ser-Ala-Gln-Ser-Gln-Arg-Ala-Pro-Asp-Arg-Val-Leu-Cys-His-Ser-Gly-Gln-Gln-Gln-Gly-Leu(SEQIDNO1)；或者Pro-Glu-Leu-Asp-Val-Cys-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Gly-Glu-Ala-Pro-Trp-Thr(SEQIDNO2)；或它們的免疫原性類似物；n從1到約10；m從1到約4；o從0到約10。本發(fā)明的肽免疫原包括約20到約100個氨基酸殘基，優(yōu)選的是從約20到約50個氨基酸殘基，更優(yōu)選的是從約20到約35個氨基酸殘基。當(dāng)A是氨基酸時，其可以是任何非天然存在的或任何天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸包括(但不限于)β-丙氨酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，甲狀腺素，γ-氨基丁酸，高絲氨酸，瓜氨酸和類似物。天然存在的氨基酸包括丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，酪氨酸和纈氨酸。此外，當(dāng)m大于1，而且A組的兩個或兩個以上是氨基酸時，各氨基酸可以獨立地相同或不同。當(dāng)A是脂肪酸(如硬脂酸、棕櫚酸)或脂肪酸衍生物[如S-N-棕櫚酰-(R)-半胱氨酸](Pam3Cys)時，它通過提高Th表位(16)的免疫刺激性質(zhì)而可用作佐劑。脂肪酸部分或其衍生物優(yōu)選地定位在mIgE肽的氨基末端。當(dāng)A是脂肪酸或其衍生物時，肽免疫原包含另外的2或3種是氨基酸的A部分。本文所用的脂肪酸選自具有8-24個碳原子的烴鏈組。烴鏈可以是飽和的或不飽和的。當(dāng)A是侵染素結(jié)構(gòu)域時，它是耶爾森氏菌屬物種的侵染素蛋白質(zhì)的免疫刺激表位。這種免疫刺激性質(zhì)由于這種侵染素具有與存在于T細(xì)胞(尤其是活化免疫的T細(xì)胞或記憶T細(xì)胞)上的β1整聯(lián)蛋白分子相互作用的能力而產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)的與β1整聯(lián)蛋白相互作用的侵染素結(jié)構(gòu)域的特異性序列已由Brett等(15)描述，本文一并參考。在一個優(yōu)選的實施方案中，連接到混雜Th表位的侵染素結(jié)構(gòu)域(Inv)的序列是Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gln-Phe(SEQIDNO3)或其得自另一耶爾森氏菌屬物種侵染素蛋白質(zhì)的對應(yīng)區(qū)域的免疫刺激類似物。因而，如果這種類似物保留免疫刺激性質(zhì)，它就可以包含取代、缺失或插入氨基酸殘基以容納菌株之間的變異。在一個實施方案中，n是1，A是α-NH2。在另一個實施方案中，n是4，A是α-NH2，其侵染素結(jié)構(gòu)域(Inv)的順序是甘氨酸-甘氨酸。B是間隔，并且是如上所述的天然存在的或非天然存在的氨基酸。每種B獨立地相同或不同。另外，B的氨基酸能形成柔性鉸鏈或間隔以提高對Th表位和mIgE肽及其免疫原性類似物的免疫反應(yīng)。編碼柔性鉸鏈的序列的例子在免疫球蛋白重鏈鉸鏈區(qū)域發(fā)現(xiàn)。柔性鉸鏈序列經(jīng)常富含脯氨酸。一種尤其有用的柔性鉸鏈由序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQIDNO4)給出，其中Xaa是任意氨基酸，優(yōu)選的是天冬氨酸。免疫原性也能通過在混雜的Th表位和mIgE膜錨肽(SEQIDNOS1，2)及它們的免疫原性類似物之間的間隔殘基(例如Gly-Gly)的附加增強。除了從B細(xì)胞表位物理地分離Th表位(即mIgE膜錨肽(SEQIDNO1，2)和它們的免疫學(xué)類似物)之外，間隔甘氨酸殘基可破壞任何通過把mIgE膜錨肽(SEQIDNO1，2)和其免疫原性類似物與Th表位連接構(gòu)造的人造二級結(jié)構(gòu)，因而可除去T和/或B細(xì)胞反應(yīng)之間的干擾。這樣，輔助細(xì)胞和引發(fā)結(jié)構(gòu)域的抗體之間構(gòu)象的分離使得闡述的免疫原和適合的Th和B細(xì)胞之間更有效的相互作用。Th是包含Th表位的氨基酸(天然或非天然的氨基酸)序列。Th表位可由連續(xù)的或不連續(xù)的表位組成。因此不是Th的所有氨基酸都是表位的必需部分。因而，Th表位(包括Th表位的類似物和片段)能提高或刺激對mIgE膜錨肽(SEQIDNO1，2)及其免疫原性類似物的免疫反應(yīng)。優(yōu)勢免疫和混雜的Th表位在具有廣泛趨異MHC類型(17-19)的動物和人類中是高度而廣泛反應(yīng)的。本發(fā)明肽的Th結(jié)構(gòu)域具有約10到約50個氨基酸，優(yōu)選地具有約10到30個氨基酸。當(dāng)多個Th表位存在(即m≥2)時，每一個Th表位獨立地相同或不同。Th表位類似物包括Th表位中取代、附加、缺失及插入1到約10個氨基酸殘基。Th片段是Th表位的鄰接部分，此Th表位足以提高或刺激對mIgE膜錨肽(SEQIDNO1，2)和其免疫原性類似物的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的Th表位包括肝炎B表面和核心抗原輔助T細(xì)胞表位(HBsTh和HBcTh)、百日咳毒素輔助T細(xì)胞表位(PTTh)、破傷風(fēng)毒素輔助T細(xì)胞表位(TTTh)、麻疹病毒F蛋白質(zhì)輔助T細(xì)胞表位(MVFTh)、沙眼衣原體主要外膜蛋白質(zhì)輔助T細(xì)胞表位(CTTh)、白喉毒素輔助T細(xì)胞表位(DTTh)、匙孔嘁血藍(lán)蛋白、惡性瘧原蟲環(huán)鐮刀狀體(circumsporozoite)輔助T細(xì)胞表位(PFTh)、曼氏裂體吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶輔助T細(xì)胞表位(SMTh)、大腸桿菌TraT輔助T細(xì)胞表位(TraTTh)和免疫增強類似物及這些Th表位的任意片斷。如下表II給出了Th表位序列的例子表IIHBsThPhe-Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-Asp(SEQIDNO5)PT1ThLys-Lys-Leu-Arg-Arg-Leu-Leu-Tyr-Met-Ile-Tyr-Met-Ser-Gly-Leu-Ala-Val-Arg-Val-His-Val-Ser-Lys-Glu-Glu-Gln-Tyr-Tyr-Asp-Tyr(SEQIDNO6)TT1ThLys-Lys-Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Leu(SEQIDNO7)TT2ThLys-Lys-Phe-Asn-Asn-phe-Thr-Val-Ser-Phe-Trp-Leu-Arg-Val-Pro-Lys-Val-Ser-Ala-Ser-His-Leu(SEQIDNO8)PT1AThTyr-Met-Ser-Gly-Leu-Ala-Val-Arg-Val-His-Val-Ser-Lys-Glu-Glu(SEQIDNO9)TT3ThTyr-Asp-Pro-Asn-Tyr-Leu-Arg-Thr-Asp-Ser-Asp-Lys-Asp-Arg-Phe-Leu-Gln-Thr-Met-Val-Lys-Leu-Phe-Asn-Arg-Ile-Lys(SEQIDNo10)PT2ThGly-Ala-Try-Ala-Arg-Cys-Pro-Asn-Gly-Thr-Arg-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Glu-Leu-Arg-Gly-Asn-Ala-Glu-Leu(SEQIDN011)MVF1ThLeu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val(SEOIDNO12)HBcThVal-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr-Pro-Pro-Ala-Tyr-Arg-Pro-Pro-Asn-Ala-Pro-Ile-Leu(SEQIDN013)MVF2ThGly-Ile-Leu-Glu-Ser-Arg-Gly-Ile-Lys-Ala-Arg-Ile-Thr-His-Val-Asp-Thr-Glu-Ser-Tyr(SEQIDN014)TT4ThTrp-Val-Arg-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp-Phe-Thr-Asn-Glu-Ser-Ser-Gln-Lys-Thr(SEQIDN015)TT5ThAsp-Val-Ser-Thr-Ile-Val-Pro-Tyr-Ile-Gly-Pro-Ala-Leu-Asn-Ile-Val(SEQIDNO16)CTThAla-Leu-Asn-Ile-Trp-Asp-Arg-Phe-Asp-Val-Phe-Cys-Thr-Leu-Gly-Ala-Thr-Thr-Gly-Tyr-Leu-Lys-Gly-Asn-Ser(SEQIDNO17)DT1ThAsp-Ser-Glu-Thr-Ala-Asp-Asn-Leu-Glu-Lys-Thr-Val-Ala-Ala-Leu-Ser-Ile-Leu-Pro-Gly-Ile-Gly-Cys(SEQIDNO18)DT2ThGlu-Glu-Ile-Val-Ala-Gln-Ser-Ile-Ala-Leu-Ser-Ser-Leu-Met-Val-Ala-Gin-Ala-Ile-Pro-Leu-Val-Gly-Glu-Leu-Val-Asp-1Ile-Gly-Phe-Ala-Ala-Thr-Asn-Phe-Val-Glu-Ser-Cys(SEQIDNO19)PFThAsp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Val-Val-Asn-Ser(SEQIDNO20)SMThLys-Trp-Phe-Lys-Thr-Asn-Ala-Pro-Asn-Gly-Val-Asp-Glu-Lys-Ile-Arg-Ile(SEQIDNO21)TraT1ThGly-Leu-Gln-Gly-Lys-His-Ala-Asp-Ala-Val-Lys-Ala-Lys-Gly(SEQfDNO22)TraT2ThGly-Leu-Ala-Ala-Gly-Leu-Val-Gly-Met-Ala-Ala-Asp-Ala-Met-Val-Glu-Asp-Val-Asn(SEQIDNO23)TraT3ThSer-Thr-Glu-Thr-Gly-Asn-Gln-His-His-Tyr-Gln-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Asn-Ala-Asn-Lys(SEQIDNO24)如式(A)n-(Th)-(B)o-(mIgE肽)或(mIgE肽)-(B)o-(Th)m-(A)n所描述的本發(fā)明的線性合成肽具有通過間隔B共價連接到mIgE膜錨肽(SEQIDNOS1，2)和它們的免疫原性類似物任一N端上的Th表位。在一個優(yōu)選的實施方案中，Th表位是HB5、Th、pT1Th、PT2Th、TT1Th、TT3Th或MVF1Th。mIgE膜錨肽的序列包括Gly-Leu-Ala-Gly-Gly-Ser-Ala-Gln-Ser-Gln-Arg-Ala-Pro-Asp-Arg-Val-Leu-Cys-His-Ser-Gly-Gln-Gln-Gln-Gly-Leu(SEQIDNO1)；或Pro-Glu-Leu-Asp-Val-Cys-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Gly-Glu-Ala-Pro-Trp-Thr(SEQIDNO2).按照本發(fā)明mIgE錨肽(SEQIDNO1，2)的免疫原性肽類似物可以進一步包括取代、添加、缺失、插入從1到約4個氨基酸殘基(如果肽類似物能夠引發(fā)與mIgE膜錨肽(SEQIDNOS1，2)的交叉免疫反應(yīng)的話)。取代、添加和插入可以用如本文限定的天然的或非天然的氨基酸完成。因此，本發(fā)明優(yōu)選的肽免疫原是包含mIgE膜錨肽(SEQIDNOS1，2)或其免疫原性類似物和Th的線性合成肽。更優(yōu)選的肽免疫原是線性構(gòu)建體，這些構(gòu)建體包含mIgE膜錨肽(SEQIDNOS1，2)或其免疫原性類似物；間隔(例如Gly-Gly)；選自HB5、Th、PT1、Th、PT2、Th、TT1、Th、TT3、Th和MVF1Th(分別為SEQIDNOS5，6，11，7，10，12)的Th表位和可有可無的Inv結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO3)或其類似物。本發(fā)明的肽免疫原可以通過為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的化學(xué)合成法制備。參見，例如，Granted.的合成肽(20)。因此，肽可以使用固相合成的自動Merrifield技術(shù)合成，這種合成使用側(cè)鏈保護的氨基酸通過T-Boc或F-moc化學(xué)保護的α-NH2進行(如應(yīng)用生物系統(tǒng)肽合成儀430A或431模型)。當(dāng)A是脂肪酸時，可用熟知的二環(huán)己基碳二亞胺偶聯(lián)方法容易地加到合成肽的N端氨基基團上。Pam3Cys，脂氨基酸S-[2，3-雙(棕櫚酰氧)-(2R)-丙基-N-棕櫚酰-(R)-半胱氨酸也可以用化學(xué)方法合成。例如Pam3Cys可通過固相合成偶聯(lián)到mIgE肽的N端，在最后偶聯(lián)步驟使用了把脂氨基酸連接到結(jié)合樹脂的mIgE肽鏈的Pam3Cys-OH。為提高最后偶聯(lián)的脂肽產(chǎn)物的溶解性，固相肽可有另外的絲氨酸和賴氨酸殘基在N端延伸。所需免疫原完全裝配后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法處理樹脂以從樹脂上裂解肽并使氨基酸側(cè)鏈上的功能基去封閉。游離肽通過HPLC純化，并通過生物化學(xué)方法確定其特征，例如，可通過氨基酸分析或測序進行。肽的純化和定性方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。產(chǎn)生本發(fā)明的包含mIgE和Th位點的線性肽構(gòu)建體的其它化學(xué)方法包括鹵素乙?；暮蚦ysteinylated的肽通過“硫醚”鍵形成的連接。例如，半胱氨酸可附加到包含Th的肽的C端，半胱氨酸的巰基可用于和親電子基團(如Nα氯乙酰基修飾的或順丁烯二酰亞胺衍生的連接到mIgE膜錨肽(SEQIDNOS1或2)或其免疫原性類似物的N端的賴氨酸殘基的α-或ε-NH2基)形成共價鍵。用這種方式，具有Th-(mIgE肽)的構(gòu)建體或它的逆序列(mIgE肽)-Th都可以獲得。本發(fā)明的免疫原也可以聚合形成。例如聚合反應(yīng)可使用常用的方法通過戊二醛和賴氨酸殘基的-NH2基之間的反應(yīng)完成。通過另一種方法，線性“A-Th-間隔-(mIgE肽)”或“(mIgE肽)-間隔-(Th)”免疫原可通過聚合或共聚合形成(利用另外的半胱氨酸附加到線性“A-Th-間隔-(mIgE肽)”或“(mIgE肽)-間隔-(Th)m-(A)n”免疫原N端)。N端半胱氨酸的巰基用于與鹵素乙酰修飾的氨基酸或順丁烯二酰亞胺衍生的賴氨酸殘基的α-或ε-NH2基形成“硫醚”鍵，其中賴氨酸殘基連接到分支的聚賴氨酰核心分子的N端(例如，K2K，K4K2K或K8K4K2K)。另外，較長的線性肽免疫原能夠使用已知的重組DNA技術(shù)合成。任何DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)手冊都提供產(chǎn)生本發(fā)明的肽的詳盡方案。為構(gòu)建編碼本發(fā)明的肽的基因，氨基酸序列優(yōu)選地使用基因所表達(dá)的有機體中的最優(yōu)密碼子逆翻譯為核酸序列。接著，典型地通過合成重疊寡核苷酸構(gòu)造合成基因，使用的寡核苷酸必要時可編碼肽和任何調(diào)節(jié)單元。合成基因可插入到適合的克隆載體中，獲得重組體并確定其特征。然后，肽在適合于選擇的表達(dá)系統(tǒng)和宿主的條件下表達(dá)。肽用標(biāo)準(zhǔn)的方法純化并確定其特征。本發(fā)明的免疫原的效能可通過給動物(例如，大鼠)注射，然后如實施例詳述的監(jiān)測對mIgE膜錨肽(SEQIDNO1，2)及其免疫原性類似物的體液免疫反應(yīng)確定。本發(fā)明的另一方面提供一種疫苗組合物，這種疫苗組合物包含本發(fā)明的免疫學(xué)有效量的一種或多種免疫原，該免疫原在藥學(xué)上可接受的運送系統(tǒng)中。這類疫苗組合物用于包括變應(yīng)性鼻炎、食物變應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、氣喘、過敏反應(yīng)和其它的IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)(如病毒誘導(dǎo)的氣喘)的特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)的預(yù)防。因此，本發(fā)明的主題肽可以使用佐劑、藥學(xué)上可接受的載體或疫苗組合物中使用的其它常規(guī)組分配制成疫苗組合物。這類制劑易于由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定，并包括即刻釋放和/或持續(xù)釋放和誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫和/或誘導(dǎo)局部粘膜免疫的制劑，例如，這可通過微粒包載免疫原完成。此疫苗可通過任何方便的路線(包括皮下、口服、肌內(nèi)或其它腸胃外或腸通道)施用。類似地，疫苗能夠作為單劑或多劑施用。免疫程序表易于由普通技術(shù)人員確定?？捎糜诒景l(fā)明的佐劑或乳化劑包括明礬、不完全弗氏佐劑、liposyn、皂苷、L121、emulsigen和ISA720以及其它有效的佐劑和乳化劑。本發(fā)明的疫苗組合物包含本發(fā)明的有效量的一種或多種免疫原和藥學(xué)上可接受的載體。合適劑量單位形式的這類組合物一般包含約0.5μg到約1mg免疫原/千克體重。當(dāng)以混合藥劑施用時，它以可以以每劑量單位方便地劃分為適當(dāng)?shù)牧俊０哂袃蓚€或更多Th表位的此免疫原混合物的疫苗可以在更廣泛的群體中提高免疫效能，這樣就提供了對mIgE膜錨肽(SEQIDNO1，2)的增強的免疫反應(yīng)。例如，實施例1的1-4號和實施例4的7-10號肽的混合物是有用的?；谄渌拿庖叽碳の锖铣呻牡膍IgE錨肽免疫原經(jīng)修飾成為脂肽(如Pam3Cys)，以給高效疫苗提供一種嵌入的佐劑。對包含免疫原的合成mIgE錨肽的免疫反應(yīng)可通過由O’Hagan等描述的生物降解的微粒中或其上的截留施用來提高。這種免疫原可以用或不用佐劑膠囊化，且包含共價連接的Pam3Cys，這類微粒能夠攜帶免疫刺激佐劑(如弗氏不完全佐劑或明礬)。微粒的功能是加強免疫原的免疫反應(yīng)，包括尤其適用于粘膜局部變態(tài)反應(yīng)的局部粘膜免疫性，并為持久的或周期性的反應(yīng)提供定時釋放，并可用于口服施用和局部施用(21，22)。特異性肽免疫原和組合物在下列實施例中提供以說明本發(fā)明。本發(fā)明的肽免疫原對改善IgE介導(dǎo)的變應(yīng)性紊亂是有用的。實施例11-4號肽免疫原“Th-間隔-(mIgE肽)”和“(mIgE肽)-間隔-Th”的合成免疫原1-4(表III)使用F-moc化學(xué)法在應(yīng)用生物系統(tǒng)肽合成儀430A或431模型按照制造廠商的指導(dǎo)通過固相合成。肽完全裝配后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法處理樹脂以從樹脂上裂解肽并脫保護氨基酸側(cè)鏈上的功能團。然后游離肽通過HPLC純化，并以生物化學(xué)方法確定氨基酸含量和序列的特征。1-4號肽免疫原(從氨基端到羧基端)的結(jié)構(gòu)特征為A-Th-B-(mIgE肽)或(mIgE肽)-B-Th-A，其中，“A”是Nh2-，“B”是Gly-Gly間隔，“Th”是麻疹病毒F1輔助T細(xì)胞表位MVF1Th(SEQIDNO12)，“(mIgE肽)”是SEQIDNO1或SEQIDNO2的mIgE肽。這樣，例如，1號肽可作為“MVF1Th-GG-(mIgE1)”明確地闡述，2號肽可作為“(mIgE2)-GG-MVF1Th”闡述。肽1-4(SEQIDNO25-28)的真實序列在表2中顯示。表21-4號肽的氨基酸序列</tables></tables>實施例2用“Th-間隔-(mlgE肽)”和“(mIgE肽)-間隔-Th”線性構(gòu)建體及1-4號肽免疫大鼠并通過ELISA評價其免疫原性1-4號肽免疫原的效能在5只大鼠的組中通過以下概述的實驗免疫方案和測定免疫原性的血清學(xué)分析評價。實驗設(shè)計免疫原1-4號肽(每組1個)劑量每次免疫用100μg路線肌內(nèi)佐劑弗氏完全/不完全佐劑劑量時間表第0周(FCA)，3周和6周(IFA)采血時間表第0，3，6，8，10周物種Sprague-Dawley大鼠組的大小5只測定抗肽活性的ELISAs測定。在通過用靶肽(SEQIDNO1，2)經(jīng)ELISA滴定前，收集血液，加工成血清并保存?？闺目贵w活性使用96孔平底微滴定板通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)測定，微滴定板用作為免疫吸附劑的相應(yīng)靶mIgE肽表位(SEQIDNO1描述的mIgE錨位點的No.5肽或SEQIDNO2描述的6號肽)涂覆。5μg/ml濃度的肽免疫原溶液的等分試樣(100μL)在37℃溫育1小時。平板通過與3％明膠/PBS溶液在37℃再溫育1小時封閉。然后封閉的平板干燥并用于測定。試驗的大鼠血清的等分試樣(100μL)開始在樣品稀釋緩沖液中以1∶10稀釋，接著以10倍系列稀釋，然后加入肽涂覆的平板上。平板在37℃下溫育1小時。平板用0.05％PBS/Tween緩沖液洗滌六次。100μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠抗體以1∶1,000的稀釋液加入綴合物稀釋緩沖液(包含0.5MNaCl的磷酸緩沖液和正常的山羊血清)中。平板如上洗滌之前在37℃下溫育1小時。然后加入氧鄰苯二胺底物溶液的等分試樣(100μL)。顯色5-15分鐘，然后通過加入50μL2NH2SO4使酶促顯色反應(yīng)停止。各孔內(nèi)含物的A492nm值在平板讀數(shù)儀讀出。所有的血清通過抗肽ELISA測定，那些1∶100稀釋液的A492nm值≥0.2的樣品作為血清陽性對照記錄。正常的大鼠血清用作陰性對照。結(jié)果也與用以上所述的No.5或6肽的KLH綴合物免疫的大鼠的陽性對照血清比較，以證明本發(fā)明的肽的增強的免疫原性。實施例31-4號肽的大鼠抗血清在人分泌IgE的細(xì)胞系上的功能性效能的評價本發(fā)明的肽免疫原組合物產(chǎn)生針對分泌IgE的人B細(xì)胞的抗體，并抑制IgE的產(chǎn)生。不象抗IgE的大多數(shù)抗體，mIgE肽產(chǎn)生的抗體不能結(jié)合到只產(chǎn)生結(jié)合到受體的分泌形式的IgE的細(xì)胞，因而，不能自身觸發(fā)IgE致敏的肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的變態(tài)反應(yīng)中化學(xué)介質(zhì)的釋放。這些生物活性與變態(tài)反應(yīng)的免疫療法有關(guān)，可在1-4號肽免疫原的大鼠抗血清中通過測定下列功能觀察到1.結(jié)合IgE分泌的B細(xì)胞而不結(jié)合IgE致敏的嗜堿細(xì)胞的抗體。人IgE產(chǎn)生的B細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系SKO-007(ATCC，RockyilleMD)或EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系8866)與大鼠抗mIgE的系列稀釋液溫育，抗體的結(jié)合使用FITC標(biāo)記的抗大鼠IgG以及通過熒光流細(xì)胞計量法定量測定檢測。大鼠抗mIgE抗體和正常人嗜堿細(xì)胞的結(jié)合程度以相似的方式評價(5)，該嗜堿細(xì)胞從外周血液制備并用分泌IgE裝載或致敏制備。2.減少分泌IgE的細(xì)胞中IgE的積累。IgE在骨髓瘤細(xì)胞系SKO-007和類似的IgE分泌細(xì)胞系的培養(yǎng)基上積累。為確定用由1-4號肽免疫原產(chǎn)生的大鼠抗mIgE血清處理IgE分泌細(xì)胞能否導(dǎo)致IgE分泌進培養(yǎng)基的減少，細(xì)胞用一系列抗體濃度處理，培養(yǎng)基中隨時間的IgE水平通過IgE特異性的ELISA監(jiān)測(11)。有效的抗體引起累積IgE的藥劑相關(guān)的減少。3.通過依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抗體(ADCC)裂解分泌IgE的細(xì)胞。大鼠抗mIgE血清的各種濃度誘導(dǎo)SKO-007細(xì)胞(或類似細(xì)胞)的細(xì)胞裂解的能力通過ADCC活性評價其裂解百分率，評價通過使用幾種供體效應(yīng)細(xì)胞的測定進行(11)。4.不能誘導(dǎo)組胺從嗜堿細(xì)胞釋放。大鼠抗mIgE血清以幾種濃度用來顯示與劑量有關(guān)的誘導(dǎo)組胺從IgE致敏的分離的外周血液的嗜堿細(xì)胞中釋放的能力。組胺釋放通過熒光測定法定量測定(5)。不能誘導(dǎo)組胺釋放是本發(fā)明的肽免疫原的效能和安全的證據(jù)。實施例4進一步拓寬反應(yīng)群體的肽免疫原混合物免疫原性的Th-間隔-(mIgE肽)和(mIgE肽)-間隔-Th肽的混合物可用來拓寬遺傳多樣性的人群體中的免疫反應(yīng)，其中有一個以上Th表位被不同的MHC類型識別。從表II選擇對拓寬群體免疫反應(yīng)有用的混雜Th表位。表II中對這些肽混合物有用的Th表位包括(但不限于)在1-4號肽(SEQIDNOS25-28)和HBsTh肽(SEQIDNO5)中使用的MVF1Th肽(SEOIDNO12)。包含兩種錨膜mIgE肽序列(SEQIDNOS1或2)和HBsTh肽之一的肽在表1V中作為7-10號肽免疫原(SEQIDNOS29-32)描述。如實施例1中所述合成7-10號肽免疫原，并且相互及與1-4號肽免疫原以相同的摩爾比混合以制備肽混合物。作為混合物制備的本發(fā)明的組合物的免疫效能在大鼠中通過以下描述的方案評價。實驗設(shè)計免疫原(1)混合物1-4號和7-10號肽(2)陽性對照5和6號肽單個與KLH以1∶1結(jié)合的綴合物(每組大鼠一種免疫原)劑量每種合成肽免疫原的摩爾當(dāng)量或mIgE肽當(dāng)量等于每次免疫100μg總的或12.5μg的每種肽。路線肌內(nèi)(注射)佐劑(1)弗氏完全/不完全佐劑(2)0.4％的明礬(氫氧化鋁)(每組每種免疫原用任一佐劑)劑量時間表0，2和4周CFA/IFA組在第0周接收CFA，第2和4周接受IFA。明礬組接受所有3種劑量的明礬制劑。采血時間表0，3，6和8周物種Sprague-Dawley大鼠組的大小5，4組測定兩次測定抗肽活性的ELISA，固相底物，5和6號肽(SEQIDNOS1，2)。收集血液，在通過如實施例2所述的兩種抗肽ELISAs進行血清轉(zhuǎn)變測定前加工成血清并保存。設(shè)計此實驗是為了證明本發(fā)明肽的施用提高的免疫原性，并說明本發(fā)明的與藥學(xué)上可接受的佐劑(明礬)制備的組合物的效能。表IV7-10號肽的氨基酸序列</tables>實施例5證明混合物的治療功效的臨床試驗攜帶麻疹病毒F和肝炎B表面抗原的Th表位序列的單個構(gòu)建體是混雜的用于人體的多效的HLADR抗原，以在遺傳多樣性的人群體中提供最大免疫原性。而且，因為這些Th表位源于兒童疫苗，兒童期免疫是免疫人群的Th記憶分子的潛在來源。因此，兒童疫苗具有提供增強的由這類Th肽混合物組成的抗變態(tài)反應(yīng)疫苗的免疫效能。設(shè)計以下的臨床方案以證明本發(fā)明的組合物的功效，該組合物作為這類線性的“Th-間隔-(mIgE肽)”和“(mIgE肽)-間隔-Th”肽構(gòu)建體和廣泛接受的佐劑(明礬)混合物配制。試驗設(shè)計受治療者枯草熱患者季節(jié)和延續(xù)時間枯草熱季節(jié)，8周組4組，1組/免疫原/劑量，每組N＝15，其中12個接收免疫原，3個接收無效對照劑免疫原混合物1；1-4，7-10號肽佐劑0.2％明礬劑量每種合成肽的摩爾當(dāng)量等于500μg總的或每劑量62.5μg的每種肽路線肌內(nèi)劑量時間表第0周和第4周評價時間表第0，4和6周收集血液，如實施例2所述經(jīng)ELISA滴定前加工成血清并保存。臨床組合物的效能和安全性通過血清學(xué)試驗、皮膚試驗反應(yīng)的比較評價，比較通過記錄患者的枯草熱藥療法、變應(yīng)性癥狀和副反應(yīng)的身體檢查及訪問受治療的患者對所用藥的評價進行。血清學(xué)評價包括上述的抗肽滴度的ELISAs和測定組胺水平(13)降低和確定產(chǎn)物不觸發(fā)組胺釋放的標(biāo)準(zhǔn)自動分光熒光計測定。皮膚試驗是皮內(nèi)試驗，其中把變應(yīng)原的標(biāo)準(zhǔn)化溶液注入皮膚的較上層。對變應(yīng)原的反應(yīng)通過皮膚試驗中測定在變應(yīng)原反應(yīng)中產(chǎn)生的典型“風(fēng)塊和潮紅”區(qū)定量測定。預(yù)期的結(jié)果包括研究結(jié)束時變應(yīng)性癥狀的明顯好轉(zhuǎn)，且無組胺釋放的跡象。這個實驗證明了本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的組合物的臨床功效和安全性。序列表(1)一般信息(i)申請人UnitedBiomedical公司；Walfield，AlanM.；Wang，ChangYi(ii)發(fā)明名稱用于治療變態(tài)反應(yīng)的合成IgE膜錨肽免疫原(iiii)序列數(shù)32(iV)通訊地址(A)收信人MariaC.HLin(B)街道345公園路(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家美國(F)郵區(qū)代碼10154(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WordPerfect5.1(Vi)在先申請的數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/328，519(B)申請日期1994年10月25日(C)分類號(vii)當(dāng)前申請的數(shù)據(jù)(A)申請數(shù)量待指定(B)申請日1995年10月25日(C)分類號(viii)律師/代理人信息(A)姓名Lin，MariaC.H.(B)登記號29，323(C)證書號1151-4117(ix)電信信息(A)電話212-758-4800(B)傳真212-751-8849(C)電傳421792(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度26個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDN01GlyLeuAlaGlyGlySerAleGlnSerGlnArgAlaPro1510AspArgValLeuCysHisSerGlyGlnGlnGlnGlyLeu152025(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長度17個氨基酸(E)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO2ProGluLeuAspValCysValGluGluAlaGluGlyGlu1510AlaProTrpThr15(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO3ThrAlaLysSerLysLysPheProSerTyrThrAlaThr1510TyrGlnPhe15(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO4ProProXaaProXaaPro15(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO5PhePheLeuLeuThrArgIleLeuThrIleProGin1510SerLeuAsp15(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長度30個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO6LysLysLeuArgArgLeuLeuTyrMetIleTyrMetSer1510GlyLeuAlaValArgValHisValSerLyeGluGluGin152025TyrTyrAspTyr30(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO7LysLysGinTyrIleLyeAleAsnSerLysPheIleGly1510IleThrGluLeu15(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長度22個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO8LysLysPheAsnAsnPheThrValSerPheTrpLeuArg1510ValProLysValSerAleSerHisLeu1520(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO9TyrMetSerGlYLeuAlaValArgValHisValSerLys1510GluGlu15(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長度27個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO10TyrAspProAsnTyrLeuArgThrAspSerAspLysAsp1510ArgPheLeuGinThrMetValLyeLeuPheAsnArgIle152025Lys(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型肽(xi)序列描述SEQIDNO11GlyAlaTyrAlaArgCysProAsnGlyThrArgAlaLeu1510ThrValAlaGluLeuArgGlyAsnAlaGluLeu1520(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO12LeuSerGluIleLysGlyValIleValHisArgLeuGlu1510GlyVal15(2)SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO13ValSerPheGlyValTrpIleArgThrProProAlaTyr1510ArgProProAsnAlaProIleLeu1520(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO14GlyIleLeuGluSerArgGlyIleLysAlaArgIleThr1510HisValAspThrGluSerTyr1520(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO15TrpValArgAspIleIleAspAspPheThrAsnGluSer1510SerGlnLysThr15(2)SEQIDN016的信息(i)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDN015AspValSerThrIleValProTyrIleGlyProAlaLeu1510AsnIleVal15(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)長度25個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)類型肽(xi)序列描述SEQIDNO17AlaLeuAsnIleTrpAspArgPheAspValPheCysThr1510LeuGlyAlaThrThrGlyTyrLeuLysGlyAsnSer152025(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO18AspSerGluThrAlaAspAsnLeuGluLysThrValAla1510AlaLeuSerIleLeuProGlyIleGlyCys1520(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特征(A)長度39個氨基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO19GluGluIleValAlaGlnSerIleAlaLeuSerSerLeu1510MetValAlaGlnAlaIleProLeuValGlyGluLeuVal152025AspIleGlyPheAlaAlaThrAsnPheValGluSerCys3035(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)類型肽(xi)序列描述SEQIDNO20AspIleGluLysLysIleAlaLysMetGluLysAleSer1510SerValPheAsnValValAsnSer1520(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)類型肽(xi)序列描述SEQIDNO21LysTrpPheLysThrAsnAlaProAsnGlyValAspGlu1510(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO22GlyLeuGlnGlyLysHisAlaAspAlaValLysAlaLys1510Gly(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO23GlyLeuAlaAlaGlyLeuValGlyMetAlaAlaAspAla1510MetValGluAspValAsn15(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO24SerThrGluThrGlyAsnGlnHisHisTyrGlnThrArg1510ValValSerAsnAlaAsnLys1520(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特征(A)長度42個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO25LeuSerGluIleLysGlyValIleValHisArgLeuGlu1510GlyValGlyGlyLeuAlaGlyGlySerAlaGlnSerGln152025ArgAlaProAspArgValLeuCysHisSerGlyGlnGln3035GlnGlyLeu40(2)SEQIDNO26的信息(i)序列特征(A)長度43個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO26GlyLeuAlaGlyGlySerAlaGlnSerGlnArgAlaPro1510AspArgValLeuCysHisSerGlyGlnGlnGlnGlyLeu152025GlyGlyLeuSerGluIleLysGlyValIleValHisArg3035LeuGluGlyVal40(2)SEQIDNO27的信息(i)序列特征(A)長度34個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO27LeuSerGluIleLysGlyValIleValHisArgLeuGlu1510GlyValGlyGlyProGluLeuAspValCysValGluGlu152025AlaGluGlyGluAlaProTrpThr30(2)SEQIDNO28的信息(i)序列特征(A)長度34個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO28ProGlyLeuAspValCysValGluGluAlaGluGlyGlu1510AlaProTrpThrGlyGlyLeuSerGluIleLysGlyVal152025IleValHisArgLeuGluGlyVal30(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特征(A)長度42個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO29PhePheLeuLeuThrArgIleLeuThrIleProGlnSer1510LeuAspGlyGlyLeuAlaGlyGlySerAlaGlnSerGln152025ArgAlaProAspArgValLeuCysHisSerGlyGlnGln3035GlnGlyLeu40(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特征(A)長度43個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO30GlyLeuAlaGlyGlySerAlaGlnSerGlnArgAlaPro1510AspArgValLeuCysHisSerGlyGlnGlnGlnGlyLeu152025GlyGlyPhePheLeuLeuThrArgIleLeuThrIlePro3035GlnSerLeuAsp40(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特征(A)長度34個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO31PhePheLeuLeuThrArgIleLeuThrIleProGlnSer1510LeuAspGlyGlyProGluLeuAspValCysValGluGlu152025AlaGluGlyGluAlaProTrpThr30(2)SEQIDNO32的信息(i)序列特征(A)長度34個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO32ProGluLeuAspValCysValGluGluAlaGluGlyGlu15l0AlaProTrpThrGlyGlyPhePheLeuLeuThrArgIle152025LeuThrIleProGlnSerLeuAsp30權(quán)利要求1.一種選自下組的肽免疫原(A)n-(Th)m-(B)o-(mIgE肽)或(mIgE肽)-(B)o-(Th)m-(A)n，其中A是氨基酸、α-NH2、脂肪酸或它們的衍生物，或具有免疫刺激性質(zhì)的侵染素結(jié)構(gòu)域；B是氨基酸；Th是輔助T細(xì)胞表位或其免疫增強類似物或片斷；mIgE肽是SEQIDNO1，SEQIDNO2，或它們的免疫原性類似物；n從1到約10；m從1到約4；o從0到約10。2.權(quán)利要求1的肽免疫原，其中所說的Th具有選自SEQIDNOS5-24或它們的免疫原性類似物或片段的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1的肽免疫原，其具有選自SEQIDNO25，SEQIDNO26，SEQIDNO27，SEQIDNO27，SEQIDNO28，SEQIDNO29，SEQIDNO30，SEQIDNO31和SEQIDNO32的氨基酸序列。4.權(quán)利要求2的肽免疫原，其還包含脂肪酸。5.權(quán)利要求2的肽免疫原，其還包含脂肪酸衍生物。6.權(quán)利要求5的肽免疫原，其中所說的脂肪酸衍生物是Pam3Cys。7.權(quán)利要求3的肽免疫原，其還包含脂肪酸。8.權(quán)利要求3的肽免疫原，其還包含脂肪酸衍生物。9.權(quán)利要求8的肽免疫原，其中所說的脂肪酸的衍生物是Pam3Cys。10.一種疫苗組合物，該組合物包含有效量的權(quán)利要求1中的肽免疫原和藥學(xué)上可接受的傳送系統(tǒng)。11.一種疫苗組合物，該組合物包含有效量的權(quán)利要求2的肽免疫原和藥學(xué)上可接受的傳送系統(tǒng)。12.一種疫苗組合物，該組合物包含有效量的權(quán)利要求3的肽免疫原和藥學(xué)上可接受的傳送系統(tǒng)。13.一種疫苗組合物，該組合物包含有效量的權(quán)利要求4的肽免疫原和藥學(xué)上可接受的傳送系統(tǒng)。14.一種疫苗組合物，該組合物包含有效量的權(quán)利要求5的肽免疫原和藥學(xué)上可接受的傳送系統(tǒng)。15.一種疫苗組合物，該組合物包含有效量的權(quán)利要求6的肽免疫原和藥學(xué)上可接受的傳送系統(tǒng)。16.一種疫苗組合物，該組合物包含有效量的權(quán)利要求7的肽免疫原和藥學(xué)上可接受的傳送系統(tǒng)。17.一種疫苗組合物，該組合物包含有效量的權(quán)利要求8的肽免疫原和藥學(xué)上可接受的傳送系統(tǒng)。18.一種疫苗組合物，該組合物包含有效量的權(quán)利要求9的肽免疫原和藥學(xué)上可接受的傳送系統(tǒng)。19.一種通過給患者施用有效量的按照權(quán)利要求1的組合物治療變態(tài)反應(yīng)的方法。20.一種通過給患者施用有效量的按照權(quán)利要求2的組合物治療變態(tài)反應(yīng)的方法。21.一種通過給患者施用有效量的按照權(quán)利要求3的組合物治療變態(tài)反應(yīng)的方法。22.一種通過給患者施用有效量的按照權(quán)利要求4的組合物治療變態(tài)反應(yīng)的方法。23.一種通過給患者施用有效量的按照權(quán)利要求5的組合物治療變態(tài)反應(yīng)的方法。24.一種通過給患者施用有效量的按照權(quán)利要求6的組合物治療變態(tài)反應(yīng)的方法。25.一種通過給患者施用有效量的按照權(quán)利要求7的組合物治療變態(tài)反應(yīng)的方法。26.一種通過給患者施用有效量的按照權(quán)利要求8的組合物治療變態(tài)反應(yīng)的方法。27.一種通過給患者施用有效量的按照權(quán)利要求9的組合物治療變態(tài)反應(yīng)的方法。全文摘要本發(fā)明涉及在包括人類的健康哺乳動物中，經(jīng)使用包含合成肽免疫原(含有胞外膜錨位點)之組合物引發(fā)產(chǎn)生高滴度的對B細(xì)胞表達(dá)的人IgE的膜結(jié)合ε重鏈的錨結(jié)構(gòu)域胞外片段上之位點特異性的抗體，以減少IgE分泌B白細(xì)胞和變應(yīng)原誘導(dǎo)的IgE產(chǎn)生的方法。本發(fā)明也涉及優(yōu)化設(shè)計的無載體蛋白質(zhì)的IgEε鏈相關(guān)的免疫原的用途，該免疫原在合成疫苗中作為關(guān)鍵組分，以提供治療變態(tài)反應(yīng)的免疫療法。主題肽包含免疫刺激質(zhì)序列(含有串聯(lián)的輔助T細(xì)胞表位)，有助于刺激針對mIgE膜錨結(jié)構(gòu)域的免疫反應(yīng)。文檔編號C07K16/00GK1167491SQ95196496公開日1997年12月10日申請日期1995年10月25日優(yōu)先權(quán)日1994年10月25日發(fā)明者王長怡,A·M·瓦費爾德申請人:美國聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司