專利名稱：：殼聚糖和肝素納米微粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的目的在于用于肝素控釋的納米微粒體系。本發(fā)明的目的尤其在于包含殼聚糖、肝素以及任選的聚氧乙烯化衍生物并且離子交聯(lián)的納米微粒體系以及獲得這樣的納米微粒體系的方法。
背景技術(shù)：
：用于釋放生物活性藥劑的體系形成了持續(xù)發(fā)展的研究領(lǐng)域。已知將活性成分通過(guò)不同的給藥途徑向人和動(dòng)物體給藥具有缺點(diǎn)。某些藥物，包括肽、蛋白和多糖，由于其在人和動(dòng)物體內(nèi)對(duì)上皮屏障的滲透性有限而不能通過(guò)粘膜表面有效吸收。跨粘膜屏障能力很差的這些藥物的一實(shí)例是肝素，其給藥目前是通過(guò)腸胃外或皮下途徑，因此使得若要發(fā)現(xiàn)那些目前存在的途徑的可選擇途徑，則有必要開(kāi)發(fā)允許該活性分子通過(guò)粘膜更好吸收的給藥體系。還尤其期望它們可通過(guò)口服給藥。有文獻(xiàn)描述了生物相容的和生物可降解的聚合物，例如與肝素組合的殼聚糖，以及其制藥用途。因此，文獻(xiàn)EP0771206描述了殼聚糖基質(zhì)以及通過(guò)沉淀或通過(guò)共價(jià)鍵固定于其上的肝素在制備能夠使諸如骨組織的硬組織再生的藥物中的用途。所述組合可以是粉末、溶液、薄膜或凝膠的形式。專利EP0930885也涉及肝素與殼聚糖聯(lián)合在獲得預(yù)防由皰滲病毒引起的感染的藥物中的用途。它可以是任何物理形式，如混懸液、溶液或凝月交。專利EP0772446和EP0759760描述了殼聚糖和多糖的用途，所述多糖如通過(guò)離子鍵或共價(jià)鍵或者通過(guò)機(jī)械包埋等方式固定于其上，以在受創(chuàng)傷的情況下使組織再生的肝素。所述組合物可以是薄膜、膜、管、溶液、粉末或凝膠的形式。這些文獻(xiàn)均沒(méi)有提及納米微粒形式的體系或其透過(guò)粘膜受控給藥的用途。另一方面，專利申請(qǐng)WO03/090763的目的在于包含殼聚糖配合物與肝素聯(lián)合的水性組合物通過(guò)將溶液局部給藥而對(duì)炎性疾病進(jìn)行直腸治療中的用途。專利申請(qǐng)WO96/20730涉及包含具有特定乙?；潭炔⒕哂芯酆衔锓肿恿康臍ぞ厶堑乃幬镏苿湓试S增加親水性藥物的上皮滲透性。在其它活性藥劑中提及低分子量肝素作為可能的治療劑。在最近提出的克服藥物所面臨的生物屏障的可能性中強(qiáng)調(diào)了將活性成分并入小微粒中。在這種意識(shí)下，專利申請(qǐng)WO98/04244、WO2004/009060和WO2004/112758描述了含有殼聚糖，用于活性成分給藥的納米微粒體系。專利申請(qǐng)WO96/05810描述了用于粘膜給藥的殼聚糖微粒，明確說(shuō)明向已形成的粒徑為IO微米至50微米的殼聚糖微球中加入低分子量肝素溶液，形成混懸液，將其冷凍并凍千進(jìn)行給藥。Andersson,M.和Lofroth，JE在/"f/尸/watw.2003，257(1-2)305-309中描述了用微乳液形成的納米大小的肝素/殼聚糖配合物微粒。盡管有大量出版物目的在于開(kāi)發(fā)肝素釋放體系，仍需要提供一類小尺寸微粒體系，其容易生產(chǎn)、收率高、具有很強(qiáng)的與肝素締合的能力并允許其以可控速率透過(guò)粘膜釋放。發(fā)明的簡(jiǎn)要描述在本發(fā)明中，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在聚氧乙烯化衍生物存在或不存在下，由包含殼聚糖和肝素的納米微粒組成的體系，并且所述體系是在導(dǎo)致殼聚糖交聯(lián)的藥劑存在下通過(guò)離子膠凝法獲得的，其允許有效的肝素分子締合及其隨后在適當(dāng)?shù)纳锃h(huán)境中的釋放。令人驚訝的是，這些納米微粒在胃腸液中穩(wěn)定并具有優(yōu)異的效能和生物利用度，如由體內(nèi)獲得的數(shù)據(jù)所示。釋放是以可控的和緩慢的方式發(fā)生的。因此這些體系足以用于口服給藥。事實(shí)上，通過(guò)這些納米微粒的口服給藥獲高達(dá)10倍。此外，本發(fā)明提出的用于肝素締合與控釋的納米微粒體系具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，例如(l)肝素并入過(guò)程很簡(jiǎn)單并且不需要使用對(duì)生物體有毒的成分；(2)其物理化學(xué)性質(zhì)，尤其是其粒度和表面電荷，能夠根據(jù)制劑中組分的比率及其分子量而進(jìn)行調(diào)節(jié)；(3)它們具有優(yōu)異的肝素締合能力；以及(4)它們以可控的速率釋放所述活性分子。因此，本發(fā)明的目的在于包含粒度小于1微米(micron)的納米微粒、用于肝素控釋的藥物組合物，其中所述納米微粒包含至少殼聚糖或其衍生物，以及至少一種肝素或其衍生物，并且其中所述納米微粒通過(guò)交聯(lián)劑交聯(lián)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑是多磷酸鹽，優(yōu)選為三聚磷酸鈉。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述納米微粒包含a)50%至90%重量比的殼聚糖或其衍生物，以及b)10%至50%重量比的肝素或其衍生物。在另一實(shí)施方案中，殼聚糖-肝素納米微粒還包含聚氧乙烯化的化合物，優(yōu)選為聚氧乙烯或環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述納米微粒的表面電荷或Z電位為0mV至+50mV,所述電荷優(yōu)選為+1mV至+40mV。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物用于通過(guò)粘膜給藥。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物用于口服給藥。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述納米微粒是凍干形式。本發(fā)明的另一目的在于制備上文所定義的用于肝素控釋的藥物組合物的方法，所述方法包括a)制備包含殼聚糖或其衍生物的水溶液；b)制備包含肝素或其衍生物以及交聯(lián)劑的水溶液；以及c)在攪拌下混合步驟a)和b)的所述溶液，使得通過(guò)離子膠凝而獲得所述殼聚糖-肝素納米微粒。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述方法在步驟c)后還包括額外的步驟，其中將所述納米微粒凍干。附圖的詳細(xì)描述圖l顯示在大鼠中，在將低分子量肝素(LMWH)以溶液形式口服給藥后以及將該LMWH與高分子量殼聚糖(HMWCS)締合的納米孩吏粒的口服給藥后，表示為抗Xa活性(IU/ml)的LMWH血漿水平(n-5)。圖2顯示在大鼠中，在將低分子量肝素(LMWH)以溶液形式口服給藥后以及將該LMWH與低分子量殼聚糖(LMWCS)締合的納米微粒的口服給藥后，表示為抗Xa活性(IU/ml)的LMWH血漿水平(n-5)。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的體系包含納米微粒，其結(jié)構(gòu)為網(wǎng)狀的殼聚糖和肝素。所作用結(jié)合在一起，而不是通過(guò)它們之間實(shí)質(zhì)上的任何共價(jià)結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"納米微粒"被理解為通過(guò)殼聚糖和肝素之間的靜電相互作用并通過(guò)加入陰離子成網(wǎng)劑(reticulatingagent)由所述共軛物的離子移變膠凝而形成的結(jié)構(gòu)。發(fā)生在納米微粒的兩種組分之間的靜電相互作用以及隨后的成網(wǎng)產(chǎn)生特定的物理實(shí)體，其是獨(dú)立的并且可觀察的，其平均粒徑小于1nm，即平均粒徑為1nm至999nm。術(shù)語(yǔ)"平均粒徑"被理解為包含聚合的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、在水性介質(zhì)中共同移動(dòng)的納米微粒總體的平均直徑。這些體系的平均粒徑能夠使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)定，這些程序在例如下文的實(shí)驗(yàn)部分中進(jìn)行描述。本發(fā)明的體系的納米微粒的平均粒徑小于1即其平均粒徑為1nm至999nm，優(yōu)選為50nm至800nm，更優(yōu)選為50nm至500nm，甚至更優(yōu)選為50nm至200nm。所述平均粒徑主要受下列因素影響殼聚糖的分子量、殼聚糖的脫乙?；潭?、殼聚糖相對(duì)于聚氧乙烯化衍生物(若存在)的比例以及微粒形成條件(殼聚糖濃度、交聯(lián)劑濃度及二者之間的比率)。通常，聚氧乙烯化衍生物的存在導(dǎo)致相對(duì)于由殼聚糖在不存在所述衍生物時(shí)形成的體系，其平均粒徑增加。的表面電荷(通過(guò)z電位測(cè)定)。對(duì)正電荷的貢獻(xiàn)歸因于殼聚糖的胺基團(tuán)，而對(duì)負(fù)電荷的貢獻(xiàn)歸因于肝素的羧基和硫酸鹽基團(tuán)。取決于殼聚電荷大小可以是0mV至+50mV，優(yōu)選+1mV至+40mV。通常關(guān)注的是表面電荷為正電荷以改善納米微粒與帶負(fù)電荷的生物表面，尤其是粘膜表面之間的相互作用。這樣，生物活性分子順利地對(duì)把組織起作用。然而，在某些情況下，為了確保納米微粒在腸胃外給藥之后的穩(wěn)定性，中性電荷可能更合適。殼聚糖是具有氨基多糖結(jié)構(gòu)和陽(yáng)離子特性的天然聚合物。其包含式(I)的單體單元的重復(fù)其中n是整數(shù)并表示聚合度，即殼聚糖鏈中單體單元的數(shù)目。除了這些單體單元，殼聚糖通常含有一部分氨基基團(tuán)被乙?；膯误w單元。事實(shí)上，殼聚糖是通過(guò)曱殼質(zhì)的脫乙?；@得的(100%乙?；?。所述脫乙?；潭韧ǔＴ?0%至95%的范圍內(nèi)，優(yōu)選在55%至90%的范圍內(nèi)，這表明10%至45%的氨基基團(tuán)被乙?；?。用于獲得本發(fā)明的納米微粒的殼聚糖的分子量為2kDa至2000kDa，優(yōu)選為2kDa至500kDa,更優(yōu)選為5kDa至150kDa。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，使用所謂的低分子量殼聚糖(LMWCS)，其中所述分子量低于10kDa。在另一不同方案中，使用所謂的高分子量殼聚糖(HMWCS),其中其分子量為100kDa至150kDa。作為對(duì)殼聚糖的可選方案，還能夠使用其衍生物，可理解為這樣的殼聚糖，其中一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)和/或一個(gè)或多個(gè)胺基團(tuán)被修飾以增加殼聚糖的溶解性或增加其粘著性。這些衍生物包括但不限于乙?；⑼榛蚧撬峄臍ぞ厶?、硫醇化衍生物，如Roberts,C/nWwCAem&^y,Macmillan,1992,166中所述。優(yōu)選地，當(dāng)使用書f生物時(shí)，其選自O(shè)-烷基醚、O-?；?、三曱基殼聚糖、聚乙二醇修飾的殼聚糖等等。其它可能的衍生物為鹽，如檸檬酸鹽、硝酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽等等。在任何情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何確定在不影響最終制劑的穩(wěn)定性和商業(yè)可行性的前提下能夠?qū)ぞ厶沁M(jìn)行的修飾。肝素是血液中的天然物質(zhì)，是凝血過(guò)程中涉及的多糖。其化學(xué)結(jié)構(gòu)包含式(II)的單體單元的重復(fù)其中n是整數(shù)并代表聚合度，即肝素鏈中單體單元的數(shù)目。傳統(tǒng)的或未分餾的肝素(UFH)與分餾的或低分子量的肝素(LMWH)不同。前者是天然物質(zhì)，存在于所有脊推動(dòng)物中。其是由不同分子量的多個(gè)鏈形成的，這賦予其很大的不均勻性，然而，所有的鏈通過(guò)兩個(gè)糖的組合而結(jié)合糖醛酸和glucosaline。鏈長(zhǎng)會(huì)變化，盡管可確定其每個(gè)鏈具有平均50個(gè)糖，平均分子量為15kDa。可如此使用或優(yōu)選地以鹽的形式使用，例如以其鈉或4丐鹽的形式使用。分餾的或低分子量的肝素是通過(guò)常規(guī)肝素的化學(xué)解聚或酶解聚而產(chǎn)生的。這類肝素的實(shí)例為依諾肝素(enoxaparin)、帕肝素(parnaparin)、達(dá)肝素(dalteparin)和那屈肝素(nadroparin)及其鹽，例如其鈉鹽和鉤鹽。通常大部分獲得具有18個(gè)糖或5.4kDa的鏈。在該長(zhǎng)度下，從酶的角肝素度肝素作用發(fā)生變化，其藥物動(dòng)力學(xué)也發(fā)生變化，.日/量的肝素。這些衍生物是已知的并源自分子中存在的不同官能團(tuán)的反應(yīng)性，如式II所示。因此已知N-脫硫酸化肝素、N-乙?；嗡?、0-脫羧基化肝素、氧化或還原的肝素等等。肝素及其衍生物的已知用途包括預(yù)防和治療深度靜脈血栓形成，肺、動(dòng)脈或腦血栓栓塞；防止進(jìn)行手術(shù)、透析或輸血的患者由于其抗凝血活性而發(fā)生的血凝塊。包含用于肝素或其衍生物給藥的納米微粒的本發(fā)明組合物優(yōu)選具有的殼聚糖或殼聚糖衍生物含量為50%至99%重量比，優(yōu)選為50%至90%重量比。另一方面，體系中的肝素含量?jī)?yōu)選為10%至50%重量比，優(yōu)選為25%至40%重量比。本發(fā)明的殼聚糖-肝素納米微粒體系的特征在于其是通過(guò)殼聚糖和肝素以聚合納米簇形式的共沉淀過(guò)程而形成的，所述共沉淀過(guò)程是通過(guò)加入交聯(lián)劑引起的。不需要使用有機(jī)溶劑或極端的pH條件或有毒的輔助物質(zhì)。按照離子相互作用機(jī)理發(fā)生肝素與納米微粒的締合。肝素的結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)負(fù)電基團(tuán)，疏酸鹽和羧酸鹽基團(tuán)，這證明了其對(duì)殼聚糖的正電氨基基團(tuán)的高離子親合力，有利于保持納米微粒的外觀。交聯(lián)劑的存在允許殼聚糖-肝素體系的交聯(lián)，以形成肝素插入其間的網(wǎng)格，所述肝素可隨后被釋放。此外，交聯(lián)劑為納米微粒提供了其尺寸、電位和結(jié)構(gòu)特征，這使得該納米顆粒適于作為所述活性分子的給藥體系。交聯(lián)刑優(yōu)選為陰離子鹽，其允許通過(guò)離子膠凝而形成網(wǎng)狀殼聚糖-肝素體系，致使自發(fā)形成納米微粒。優(yōu)選使用多磷酸鹽，尤其優(yōu)選三聚磷酸鈉(TPP)。在本發(fā)明的體系的具體實(shí)施方案中，所述納米微?？砂ň垩跻蚁┗幕衔?。聚氧乙烯化的化合物被理解為結(jié)構(gòu)中具有環(huán)氧乙烷單元的非離子性質(zhì)的合成親水聚合物，優(yōu)選使用聚氧乙烯或通常稱為泊洛沙姆(poloxamer)的環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷(PEO-PPO)共聚物。市售的這些聚合物具有不同的分子量，然而，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用分子量為2000至10000的聚氧乙烯化衍生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述聚氧乙烯化衍生物是三嵌段共聚物(PEO-PPO-PEO)，例如商業(yè)上稱為泊洛沙姆188的共聚物。殼聚糖相對(duì)于并入微粒形成介質(zhì)中的聚氧乙烯化的化合物的比例可有^f艮大變化，其范圍為50:0至1:100，優(yōu)選為50:0至1:20。聚氧乙烯化的化合物的存在可具有略微增加納米微粒粒徑的效果并且其有助于穩(wěn)定膠體體系。若將該聚氧乙烯化的化合物在納米微粒形成后加入，則其形成包衣，這顯著增加了納米微粒的粒徑。盡管聚氧乙烯化衍生物的存在對(duì)于獲得納米微粒不是必需的，其允許修飾所述納米微粒的物理化學(xué)特性(粒徑和Z電位)，并且最重要地，在胃腸液中穩(wěn)定所述體系。在WO98/04244中描述了在聚氧乙烯化的化合物的存在或不存在下，通過(guò)交聯(lián)劑制備和形成殼聚糖納米微粒和活性成分，其在此被認(rèn)為是被整體并入作為參考的。本發(fā)明的藥物組合物可以液體(納米^f效?；鞈乙?或固體形式存在。在這種情況下，納米微?？梢詢龈苫驀婌F形式形成粉末，所述粉末可用于制備顆粒劑、片劑、膠嚢或吸入制劑。盡管所述組合物主要用于透過(guò)粘膜給藥，本發(fā)明的藥物組合物還可通過(guò)口服、口腔或舌下、透皮、眼、鼻、陰道或腸胃外途徑給藥。在非腸胃外途徑的情況下，能夠通過(guò)為微粒提供重要的正電荷而改善納米微粒與皮膚或粘膜的接觸，這有利于其與所述帶負(fù)電荷的表面的相互作用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述制劑通過(guò)粘膜途徑給藥。殼聚糖的正電荷通過(guò)其與帶負(fù)電荷的粘膜和上皮細(xì)胞表面的相互作用而提供肝素在粘膜表面的更好的吸收。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述制劑通過(guò)口服途徑給藥。在這種情況下，所述納米微粒具有額外的優(yōu)點(diǎn)-它們?cè)谖改c液中是穩(wěn)定的，因在本發(fā)明的藥物組合物的用途中，該組合物尤其適于預(yù)防進(jìn)行整栓形成，所述非手術(shù)患者的狀態(tài)可被定義為中度或高度危險(xiǎn)的狀態(tài)。該組合物還顯示為預(yù)防血液透析的體外循環(huán)回路中的凝血，治療確定的深度靜脈血栓形成(具有或不具有肺栓塞)，并且可與其它抗凝血?jiǎng)┞?lián)合給藥治療不穩(wěn)定心絞痛和心肌梗塞。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及制備如前文所定義的殼聚糖-肝素納米孩i粒的方法，所述方法包括a)制備殼聚糖或其衍生物的水溶液；b)制備肝素和交聯(lián)劑的水溶液；以及c)攪拌下混合步驟a)和b)的溶液，使得通過(guò)離子膠凝和隨后的沉淀自發(fā)獲得殼聚糖-肝素納米微粒。在前述方法的具體實(shí)施方案中，得到的交聯(lián)劑/殼聚糖的比率為0.01/1至0.50/1，優(yōu)選的比率為0.05/1至0.40/1，這為制劑提供相對(duì)寸氐的多分散性。然而，也可能使用更大或更小的交聯(lián)劑/殼聚糖的比率。在所述方法的另一實(shí)施方案中，其還包括將聚氧乙烯化的化合物并入前述的殼聚糖水溶液中。在用于獲得本發(fā)明所述納米微粒的方法的另一實(shí)施方案中，可使用無(wú)機(jī)鹽，例如氯化鈉，其使納米微粒產(chǎn)品的收率增加。可將所述無(wú)機(jī)鹽加入到殼聚糖或殼聚糖衍生物的溶液中。然而，觀察到加入所述鹽會(huì)改變殼聚糖和肝素的相互作用，致使與納米微粒體系締合的肝素的量略微下降，以及中和納米微粒電荷，這是由于介質(zhì)的負(fù)離子被吸附到殼聚糖的正電表面上?？紤]到這一點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根椐期望的最終特性在低收率的情況下使用所述鹽，并且所述鹽的量導(dǎo)致適當(dāng)?shù)氖章实谄谕喓铣潭然螂姾勺銐蚋咭愿纳婆c粘膜的相互作用時(shí)不對(duì)締合程度或電荷造成負(fù)面影響。在所述方法的另一實(shí)施方案中，若期望殼聚糖-肝素納米微粒被聚氧乙烯化的化合物包被時(shí)，則在納米微粒形成后并入該聚氧乙烯化的化合物。制備本發(fā)明的納米微粒的這些方法允許肝素與納米微粒的締合超過(guò)90%。取決于殼聚糖的分子量、其脫乙?；潭纫约熬垩跻蚁┗苌锘驘o(wú)機(jī)鹽的存在，能夠觀察到所述締合的略微變化。納米微粒一旦形成，可通過(guò)在甘油或葡萄糖床中或在海藻糖溶液中離心將其分離，棄去上清液，以分離未與納米微粒締合的肝素分子。隨后能夠?qū)⒓{米微粒再次懸浮在水或緩沖液中用于以混懸液使用。制備殼聚糖-肝素納米微粒的方法還能夠包括額外的步驟，其中將所述納米微粒凍干或霧化。從制藥的角度，能夠得到凍干形式的納米微粒是很重要的，這是由于這樣改善了其儲(chǔ)存穩(wěn)定性。可在5%濃度的諸如葡萄糖、蔗糖或海藻糖的防凍劑的存在下對(duì)殼聚糖-肝素納米微粒(其中殼聚糖可與聚氧乙烯化衍生物物理混合)進(jìn)行凍干。事實(shí)上，本發(fā)明的納米微粒具有額外的優(yōu)點(diǎn)凍干之前和之后的粒徑?jīng)]有顯著變化。即，能夠?qū)⒓{米微粒凍干并再次懸浮而不改變其特征。類似地，還可使用甘露醇或乳糖作為佐劑使所述納米微粒霧化。下文描述了一些示例性的實(shí)施例，其顯示本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)；所述實(shí)施例不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明目的的限制。實(shí)施例作為下述所有實(shí)施例的通用方法，從尺寸、Z電位(或表面電荷)、締合效率(與納米微粒締合的肝素的百分比)以及產(chǎn)品收率(形成納米微粒的材料的百分比)的角度對(duì)納米微粒進(jìn)行表征。通過(guò)光子相關(guān)光i普法(PCS;ZetaSizer，Nanoseries,Nano-ZS,MalvernInstruments,UK)進(jìn)行在產(chǎn)為、^"測(cè)定，給出平均粒徑和納米微?？傮w分散(多分散指數(shù))值。通過(guò)激光多普勒風(fēng)速測(cè)量法(LDA;ZetaSizer，Nanoseries,Nano-ZS，MalvernInstruments,UK)測(cè)量Z冶位。將才羊品稀釋于超純水中以測(cè)定電泳遷移率。通過(guò)對(duì)未締合的肝素進(jìn)行定量而間接確定量^的舉合##量，并且通過(guò)使用Stachrom⑧肝素試劑盒(DiagnosticaStago,Roche)確定抗Xa活性的量來(lái)測(cè)定未締合的肝素量。為了進(jìn)行該定量，通過(guò)離心分離所述納米孩i:粒并將得到的上清液通過(guò)PVDF0.22過(guò)濾。通過(guò)將納米微粒在16000xg離心40分鐘，隨后除去上清液(其中保持在溶液中的成分會(huì)被去除)并最終稱量干殘余物而確定Z品炎舉的量。實(shí)施例中所用的殼聚糖(ProtasanUPCl113)來(lái)自NovaMatrix-FMCBiopolymer，寸氐分子量肝素來(lái)自Aventis(Enoxaparin)，泊洛沙姆188來(lái)自BASFCorporation,以及所用的其余產(chǎn)品來(lái)自SigmaAldrich，例如未分餾的肝素、三聚磷酸鈉、氯化鈉、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和用于制備不含酶的模擬胃腸液的鹽。實(shí)施例1具有不同分子量的肝素的殼聚糖納米微粒(殼聚糖溶液中存在或不存在泊洛沙姆188)的制備和表征制備含有和不含有泊洛沙姆188(4mg/ml和10mg/ml)的殼聚糖(CS)的水溶液(lmg/ml)。將這些溶液進(jìn)行磁力攪拌，同時(shí)加入不同分子量的肝素水溶液(UFH和LMWH;相對(duì)于殼聚糖，25%重量比的理論加入量)和三聚磷酸鈉水溶液(TPP，CS/TPP比率1/0.1至1/0.4)。兩種水相的體積比保持恒定，為1ml的殼聚糖水溶液對(duì)0.2ml的肝素和交聯(lián)劑溶液。在殼聚糖水相中并入泊洛沙姆能夠?qū)е挛⒘Ｖ睆铰晕⒃黾右约芭c納米微粒體系締合的肝素百分比略微下降，這與肝素類型(UFH或LMWH)無(wú)關(guān)，如表I所示。在某些制劑中(尤其是那些與UFH締合的制劑中)，泊洛沙姆的存在還會(huì)導(dǎo)致表面電荷(或Z電位)略微下降，盡管該影響通?？珊雎?。當(dāng)在殼聚糖水相中加入泊洛沙姆時(shí)觀察到的這些變化(物理化學(xué)特性)能夠歸因于在體系形成時(shí)，其鏈在殼聚糖和肝素基質(zhì)中保持被截留。多分散指數(shù)為0.20至0.30的數(shù)據(jù)表明，無(wú)論泊洛沙姆是否存在，該參數(shù)保持不變，從而泊洛沙姆不增加納米微粒粒度分布。在產(chǎn)品收率計(jì)算中未考慮泊洛沙姆的重量，這是由于泊洛沙姆是過(guò)量的并在離心過(guò)程后隨著上清液被除去。理論上，泊洛沙姆存在于溶液中能夠有利于體系的穩(wěn)定性(其是膠體體系中常用的穩(wěn)定表面活性劑)?；诘玫降漠a(chǎn)品收率，能夠說(shuō)泊洛沙姆鏈有效地存在于納米微?；|(zhì)網(wǎng)絡(luò)中。表I:具有肝素納米微粒(相對(duì)于殼聚糖，25%的理論加入量)的殼聚糖在不同比例的泊洛沙姆188存在下的粒徑和電位(n23;平均值士SD)。肝素類型泊洛沙，粒徑姆比例,,(nm)(相對(duì)于CS)多分散山，，,,Z電位指數(shù)(mV)(P丄)肝素締合(相對(duì)于初始力口入量的百分比％)產(chǎn)品收率(%)0225±170.27+31.0±2.39945.5±3.3LMWH4338±700.33+32.6±1.4n.d.n.d.10311±240.20+31.5±0.89854.6±2.8*0264±330.22+41.4±1.49747.6±5.4UFH4322±210.25+36細(xì).5n.d.n.d.10292±280.24+34.6±1.49558.3±4.1*n.d.:未測(cè)定；LMWH:4氐分子量肝素；UFH:未分餾肝素*:未考慮泊洛沙姆重量實(shí)施例2具有不同分子量肝素并使用泊洛沙姆188包被的殼聚糖納米微粒的制備和表征用兩種類型的肝素(UFH和LMWH)4安照實(shí)施例1所述的方法制備了殼聚糖(CS)納米微粒(lmg/ml)，然后加入泊洛沙姆188(10mg/1mgCS)。出于對(duì)得到的泊洛沙姆包衣的影響進(jìn)行觀察的目的，對(duì)于LMWH，測(cè)試了相對(duì)于殼聚糖25%和40%的理論加入量；以及對(duì)于UFH，測(cè)試了25%的理論加入量。納米微粒的物理化學(xué)特性如表II所示。與在殼聚糖溶液中加入泊洛沙姆(實(shí)施例1，表I)相比，當(dāng)將泊洛沙姆在納米微粒形成過(guò)程之后加入時(shí)，尤其是當(dāng)肝素的理論加入量從25%增加至40%(相對(duì)于殼聚糖)時(shí)，粒徑增加更為顯著。此外，當(dāng)納米微粒被包被時(shí)，尤其是^f吏用UFH肝素時(shí)，其Z電位略微下降。這些數(shù)據(jù)顯示泊洛沙姆確實(shí)包被了納米微粒。表II:加入泊洛沙姆188之前和之后，具有肝素納米微粒的(相對(duì)于殼聚糖，25%和/或40。/。的理論加入量)殼聚糖的粒徑和電位(n23;平均值土SD)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例3具有不同分子量肝素的殼聚糖納米微粒(殼聚糖溶液中存在或不存在氯化鈉)的制備和表征制備了殼聚糖(CS)水溶液(2mg/ml),其中加入0mL至1.5mL體積的氯化鈉(0.9%)。對(duì)這些溶液進(jìn)行/磁力攪拌，同時(shí)向其中加入肝素(UFH或LMWH)(相對(duì)于殼聚糖，25%的理論加入量)和交聯(lián)劑三聚磷酸鈉的水溶液(TPP，CS/TPP比率1/0.3至1/0.4)。如表III所示，若在制備納米微粒前向殼聚糖水相中加入氯化鈉，則納米微粒的物理化學(xué)特性無(wú)顯著變化。然而，觀察到產(chǎn)品收率顯著增加以及與納米微粒體系締合的肝素的量略微下降。這顯示在制備納米微粒前，初始溶液中離子的存在略微改變殼聚糖-肝素的相互作用。帶有氯化鈉的納米微粒的Z電位給出中性值(約OmV)，這是由于介質(zhì)的陰離子保持吸附在殼聚糖納米微粒的表面上中和其電荷。表m:向殼聚糖溶液中加入氯化鈉后的殼聚糖-肝素納米微粒的表征(n23;平均值土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>CS:殼聚糖；LMWH:低分子量肝素；UFH:未分餾肝素;*:納米微粒的Z電位被介質(zhì)的離子屏蔽實(shí)施例4具有不同分子量肝素(含有泊洛沙姆188和氯化鈉)的殼聚糖納米微粒的制備和表征考慮到上述實(shí)施例，其中可以看到親水性聚合物(例如泊洛沙姆)的加入或鹽(例如氯化鈉)的加入如何改變納米微粒的特性，本實(shí)驗(yàn)的目的在于研究在納米微粒的制備中加入兩種物質(zhì)后得到的納米微粒的特性。如下表所示，若將泊洛沙姆和氯化鈉加入到殼聚糖溶液中，則得到的納米微粒體系具有更大的粒徑(基本上是由于泊洛沙姆的存在)以及略微降低的締合效率(由于兩種組分的存在)。表IV:用未分餾肝素(UFH)和低分子量肝素(LMWH)以25%的加入量制備殼聚糖納米樣i粒時(shí)加入泊洛沙姆188(10mg)和/或氯化鈉(0.9。/。，1.5mL)的影響(n^3;平均值士SD)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>CS:殼聚糖；LMWH:低分子量肝素；UFH:未分餾肝素實(shí)施例5具有低分子量肝素的殼聚糖納米微粒(不同分子量)的制備和表征該研究的目的在于使用不同分子量的殼聚糖制備與肝素締合的納米微粒。制備了不同分子量(高分子量殼聚糖HMWCS:100kDa至150kDa以及低分子量殼聚糖LMWCS:<10kDa)的殼聚糖(CS)(1mg/ml)水溶液。高分子量殼聚糖碎裂后獲得低分子量殼聚糖。為了進(jìn)行碎裂過(guò)程，通過(guò)磁力攪拌(2至4小時(shí))使CS溶解(20mg/ml)于超純水中，然后在攪拌下向殼聚糖溶液中滴加0.1ml的NaN02(0.1M)。殼聚糖溶液在磁力攪拌下維持過(guò)夜。按照實(shí)施例l所述的制備方法，用高分子量殼聚糖和碎裂的(低分子量)殼聚糖制備納米微粒(殼聚糖納米微粒和肝素，在水性外相中存在或不存在泊洛沙姆作為添加劑)。得到的結(jié)果如表V所示。低分子量殼聚糖納米微粒的粒徑、多分散指數(shù)、Z電位和締合百分?jǐn)?shù)均小于由用高分子量殼聚糖所制備的納米微粒獲得的數(shù)據(jù)。當(dāng)殼聚糖是低分子量時(shí)，制備納米微粒時(shí)泊洛沙姆的存在不導(dǎo)致得到的納米微粒體系的平均粒徑的增加(實(shí)施例1;表1)。表V:在與LMWH(相對(duì)于殼聚糖，25%理論加入量)形成納米微粒中，殼聚糖的分子量以及泊洛沙姆188的存在的影響(nS;平均值土SD)添力口劑"丄絲cs類型(在cs水相中)多分散指數(shù)(P丄)Z電位(mV)締合效率產(chǎn)品收率(%)(%)HMWCS—畫225±170.27+31.0±2.39945.5±3.3(100kDa至AA.，，泊洛沙姆282土18150kDa)0.32+31.5±0.898n.d.LMWCS…163±30.10+25.9±1.89348.1±1.0(<10kDa)泊洛沙姆164±30.13+26.6±0.892n.d.CS:殼聚糖；LMWCS:低分子量殼聚糖；HMWCS:高分子量殼聚糖;n.d.:未測(cè)定實(shí)施例6具有低分子量肝素的殼聚糖納米微粒(具有不同乙酰化程度)的制備和表征制備了LMWH-殼聚糖納米微粒，所述殼聚糖具有兩個(gè)不同的乙?；潭?10%至15%和35%至45%),但具有相同的分子量(PIVKIOkDa)。殼聚糖的乙?；^(guò)程包括向殼聚糖溶液(2mg/ml;25ml)中加入乙酸酐(2.5ml)并使其在磁力攪拌下維持過(guò)夜。然后將殼聚糖透析24小時(shí)以除去未反應(yīng)的乙酸酐并最終凍干。如實(shí)施例5所述進(jìn)行低分子量殼聚糖的獲得。必須指明，有必要略微改變乙?；臍ぞ厶侨芤旱膒H，這是由于將其溶于水后，得到的pH為5.8-6.0，必須將其降低至pH5.0以復(fù)制去乙酰化殼聚糖的條件。通過(guò)在磁力攪拌下將殼聚糖溶液(具有相應(yīng)的乙?；潭?和泊洛沙姆與成網(wǎng)劑和LMWH溶液(25%的理論加入量)混合而制備納米微:粒。這些納米微粒的特性如表VI所示。兩種納米微粒體系的粒徑和分布是類似的，而不論殼聚糖的乙?；潭?。然而，對(duì)于用乙?；瘹ぞ厶侵苽涞募{米微粒，Z電位正電性更弱，這是由于部分氨基基團(tuán)被乙?；?。殼聚糖的該化學(xué)修飾還導(dǎo)致產(chǎn)品收率以及與膠體體系締合的肝素的百分?jǐn)?shù)顯著增加。表VI:殼聚糖(LMWCS;<10kDa)的乙酰化程度以及泊洛沙姆188的存在對(duì)與LMWH(相對(duì)于殼聚糖，25%的理論加入量)形成納米#:粒的影響(r^3;平均值土SD)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>實(shí)施例7具有肝素的納米微粒殼聚糖體系在模擬的胃腸液中的穩(wěn)定性出于對(duì)具有LMWH的殼聚糖納米^f敖?？诜o藥的目的，從粒徑和LMWH釋放的角度起始研究了該納米微粒體系的穩(wěn)定性。制備了不同的納米樣t粒，在納米孩t粒形成中使用乙?；暮臀匆阴；腖MWCS，含有或不含有泊洛沙姆188，其在納米微粒制備過(guò)程中被加入或在獲得納米微粒之后立即被加入。在所有情況下，殼聚糖相對(duì)于所加入的泊洛沙姆的比例為約10:1。制備所述納米微粒后，將其稀釋(體系液體比率l:3)并在37。C下孵育15分鐘和30分鐘。在孵育之前和之后測(cè)量納米樣M立的粒徑。表VII顯示Df/Di(孵育后的直徑/孵育前的直徑)粒徑的比率。在所述表中可以看到，具有肝素的(未乙酰化的)殼聚糖納米微粒在胃液中保持其初始粒徑，并在腸液中當(dāng)其并入泊洛沙姆(制備納米微粒之前或之后)時(shí)，該納米微粒的粒度值增加至800nm至1000nm(Df/Di=4-5)。然而，當(dāng)其不在介質(zhì)中并入泊洛沙姆時(shí)，這些納米微粒的粒徑值達(dá)到3nm的值(DfyDi-14-15)并因此失去其特征性的納米尺寸。該研究證實(shí)了泊洛沙姆在納米微粒混懸液中的存在對(duì)體系具有穩(wěn)定作用，防止其聚集。乙?；臍ぞ厶羌{米微粒在腸液中孵育后其粒徑顯著增加，超過(guò)儀器(ZetaSizer,Nanoseries,Nano-ZS,MalvernInstruments,UK)允許的最大粒徑(>3pm)。在不含有酶(USPXXVII)的模擬的胃液和腸液中孵育后，通過(guò)確定上清液(對(duì)樣品進(jìn)行離心和過(guò)濾后獲得的)中的抗Xa活性的量而測(cè)定LMWH從殼聚糖納米微粒體系的釋放。所述釋放無(wú)法檢測(cè)或小于1%的締合量。抗Xa活性是肝素通過(guò)血漿抗凝血酶III對(duì)性因子X(jué)(因子X(jué)a)活性凝結(jié)酶的抑制或中和能力的量度標(biāo)準(zhǔn)。表VII:介質(zhì)中含有和不含有泊洛沙姆188時(shí)LMWCS-LMWH納米微粒在胃液和腸液中的穩(wěn)定性(nS;平均值土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>Df:在介質(zhì)中孵育后的納米微粒直徑；Di:初始納米微粒直徑；LMWCS:低分子量殼聚糖；LMWH:低分子量肝素實(shí)施例8殼聚糖-肝素(均具有低分子量)納米微粒凍干研究出于方便保存納米微粒體系和防止可能的降解的目的，對(duì)在制備中并入泊洛沙姆的HMWCS-LMWH體系進(jìn)行凍干研究，其中測(cè)試了不同的防凍劑，例如蔗糖、葡萄糖和海藻糖。防凍劑的存在是不可缺少的，這是由于在沒(méi)有這些保護(hù)劑的存在下凍干制劑(不稀釋)并將其用水重組后，會(huì)出現(xiàn)聚合的聚集體而失去其物理化學(xué)特性。在制備具有LMWH的殼聚糖納米微粒后，加入一定量所選防凍劑以達(dá)到1%或5%(w/v)的濃度。將制劑定量加入管形瓶中，冷凍(-20。C)并凍干(冷凍干燥系統(tǒng)-12L,Labconco),其中在-35。C進(jìn)^f亍第一干燥40小時(shí)，并通過(guò)將溫度升高(rc/min)至0。C(1小時(shí))，然后升高至14°C(1小時(shí))并最終升高至25°C而進(jìn)行第二干燥。將凍干的產(chǎn)物再次懸浮在水中并在凍干過(guò)程之前和之后測(cè)量粒徑。表VIII顯示Df/Di(最終直徑-凍干的和再次懸浮的體系/凍干前初始直徑)的粒徑比率，這樣接近于1的值表明在凍干和再次懸浮過(guò)程后納米微粒體系保持初始的納米尺寸。如下表所示，當(dāng)加入5%的被研究防凍劑時(shí)，凍干體系的再次懸浮是適當(dāng)?shù)?。?:使用不同防凍劑進(jìn)行的LMWCS-LMWH-泊洛沙姆納米微粒凍干研究(10/1;Polox/CS)(n^2;平均值土SD)防凍劑量(w/v)Df/Di蔗糖11.16±0.0451.06±0.07海藻糖11.26±0.06200680038221.1說(shuō)明書第20/21頁(yè)1.02±0.03*11.77±0.23葡萄糖50.99±0.04Df:凍干后納米微粒的直徑；Di:凍干前納米微粒的直徑實(shí)施例9大鼠中溶液形式的以及與殼聚糖納米微粒(具有高分子量)締合形式的低分子量肝素的口服給藥-生物利用度測(cè)定按照實(shí)施例1所述的方法制備HMWCS-LMWH納米樹(shù):粒后，將這些納米微粒在蔗糖(5%)的存在下凍干并在適當(dāng)體積的水中重組，使得以200IU/ml/大鼠給藥。必須指出，肝素是以國(guó)際單位定量加入，參照標(biāo)準(zhǔn)，將毫克的量改變?yōu)槠渌哂械膯挝粩?shù)。一國(guó)際單位被定義為等于一抗凝血酶單位和一抗Xa單位。沒(méi)有為除去溶液中的肝素的目的而分離納米微粒，這是由于與膠體體系締合的肝素的量超過(guò)95%，因此未締合的肝素的量被忽略以及在調(diào)節(jié)給藥體積(根據(jù)劑量)時(shí)考慮分子總量。制備了LMWH制劑，也將其凍干(以相同的濃度并在相同的條件下)并以與納米微粒相同的體積再次懸浮，使得制劑具有等量的蔗糖。在給藥之前將動(dòng)物(每組11=5)保持在饑餓狀態(tài)12小時(shí)并在下列時(shí)刻取血漿樣本O(給藥前)、l小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)和10小時(shí)。通過(guò)4吏用比色i式劑盒(StachromHeparin,DiagnosticaStago，Roche)確定血漿樣品中的抗Xa活性(IU/ml)的量，用溶液中的HPBM做標(biāo)準(zhǔn)線。獲得的"^:^"結(jié)果如圖l所示，其中能夠看到，給藥后6小時(shí)，HMWCS-LMWH納米^t粒產(chǎn)生的血漿水平顯著高于(尤其是高10倍)當(dāng)肝素以溶液形式給藥時(shí)所產(chǎn)生的血漿水平。出于對(duì)口服給藥的LMWH制劑(溶液中以及與納米微粒締合)相對(duì)于溶解于鹽水(0.9%)的LMWH的皮下給藥的相對(duì)生物利用度進(jìn)行定量的目的，使用相同的劑量和相同的條件將LMWH通過(guò)這兩種途徑給藥。對(duì)于LMWH溶液，取樣時(shí)刻(0-10小時(shí))的口服生物利用度是5%,而對(duì)于與HMWCS納米微粒締合的LMWH，取樣時(shí)刻(0-10小時(shí))的口服生物利用度是8%。口服給藥血漿水平曲線下方的面積x靜脈注射劑量生物利用度(％)=..................................................................靜脈注射給藥血漿水平曲線下方的面積x口服劑量實(shí)施例10大鼠中溶液形式的以及與殼聚糖納米微粒(具有低分子量)締合形式的低分子量肝素的口服給藥-生物利用度測(cè)定兩種制劑的制備和給藥過(guò)程與前一實(shí)施例中所述完全相同，除了在本實(shí)施例中所用的殼聚糖是低分子量殼聚糖(實(shí)施例5)并且其中血漿取樣間隔延長(zhǎng)至4小時(shí)(每2小時(shí))?？筙a活性(IU/ml)血漿水平顯示，與LMWCS納米微粒締合的LMWH的腸內(nèi)吸收產(chǎn)生時(shí)間更長(zhǎng)的治療響應(yīng)，在給藥后6小時(shí)至12小時(shí)給出顯著更高的值。為了對(duì)口服給藥后兩種制劑的生物利用度進(jìn)行定量，考慮了稀釋于鹽水(0.9%)中的LMWH對(duì)一組大鼠的皮下給藥(相同的劑量和條件)。對(duì)于LMWH溶液，取樣時(shí)刻(0至12小時(shí))的生物利用度是6%，而對(duì)于與HMWCS納米孩i粒締合的LMWH,取才羊時(shí)刻(O至12小時(shí))的生物利用度是11%。權(quán)利要求1.用于釋放肝素的包含粒徑小于1微米的納米微粒的藥物組合物，其中所述納米微粒包含至少殼聚糖或其衍生物，以及至少一種肝素或其衍生物，并且其中所述納米微粒通過(guò)交聯(lián)劑交聯(lián)。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述交聯(lián)劑為多磷酸鹽，優(yōu)選為三聚磷酸鈉。3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述納米微粒包含a)50%至90%重量比的殼聚糖或其衍生物，以及b)10%至50%重量比的肝素或其^1汙生物。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述納米微粒還包含聚氧乙烯化的化合物。5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述聚氧乙烯化的化合物是聚氧乙烯或環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物。6.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述殼聚糖或其衍生物相對(duì)于所述聚氧乙烯化的化合物的起始量的比例為50:1至l:50重量比，優(yōu)選為50:1至1:20。7.如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述殼聚糖或其衍生物的分子量為2kDa至2000kDa,優(yōu)選為2kDa至500kDa，更優(yōu)選為5kDa至150kDa。8.如權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述殼聚糖或其^f汙生物的脫乙?；潭葹?0%至95%，優(yōu)選為55%至90%。9.如權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述交聯(lián)劑和殼聚糖的比率為0.01:1至0.50:1，優(yōu)選為0.05:1至0.40:1。10.如權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述納米微粒的電荷(Z電位)為0mV至+50mV,優(yōu)選為+1mV至+40mV。11.用于透過(guò)粘膜給藥的權(quán)利要求1至10中任一權(quán)利要求所述的組合物。12.用于口服給藥的權(quán)利要求1至10中任一權(quán)利要求所述的組合物。13.如權(quán)利要求1至12中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述納米微粒是凍干的形式。14.制備權(quán)利要求1至12中任一權(quán)利要求所述的用于肝素給藥的藥物組合物的方法，所述方法包括a)制備包含殼聚糖或其衍生物的水溶液；b)制備包含肝素或其衍生物及交聯(lián)劑的水溶液；以及c)在攪拌下將步驟a)和b)的所述溶液混合，使得通過(guò)離子膠凝自發(fā)獲得殼聚糖-肝素納米微粒。15.如4又利要求14所述的方法，其中步驟a)的所述水溶液還包含聚氧乙烯化的化合物。16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中步驟a)的所述水溶液還包含無(wú)機(jī)鹽，優(yōu)選為氯化鈉。17.如權(quán)利要求14至16中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述交聯(lián)劑是多磷酸鹽，優(yōu)選為三聚磷酸鈉。18.如權(quán)利要求14至17中任一權(quán)利要求所述的方法，還包括步驟c)后的額外步驟，其中將所述納米微粒凍干。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中在選自蔗糖、葡萄糖或海藻糖的防凍劑存在下凍干所述納米微粒。全文摘要本發(fā)明的目的在于用于肝素控釋的納米微粒體系。本發(fā)明的目的尤其在于包含殼聚糖、肝素以及任選的聚氧乙烯化衍生物并且離子交聯(lián)的納米微粒體系以及獲得這樣的納米微粒體系的方法。文檔編號(hào)A61K33/42GK101374530SQ200680038221公開(kāi)日2009年2月25日申請(qǐng)日期2006年10月13日優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日發(fā)明者安娜·伊莎貝爾·維爾佩尼亞,瑪·何賽·阿隆索費(fèi)爾南德斯,西爾維亞·斯瓦里滋盧克申請(qǐng)人:先進(jìn)離體細(xì)胞技術(shù)有限公司