專利名稱：：通過給藥非復制型載體化疫苗而進行的對禽類的免疫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明通常涉及免疫學和疫苗技術(shù)的領(lǐng)域。更具體的是，本發(fā)明涉及重組的非復制性載體，例如用于向禽類遞送例如禽流感病毒抗原等禽類免疫原和抗原的El-缺陷性人腺病毒載體。本發(fā)明還提供了在包括禽類胚胎在內(nèi)的禽類個體中導入并表達禽類免疫原的方法，以及在禽類個體中引發(fā)對免疫原的免疫反應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
：禽流感(AI)是一種感染禽類、其它動物和人類的嚴重的病原體。自1997以來，已經(jīng)發(fā)生了多次AI病毒向人類遞送的事件(Subbarao.等人，1998;Ungchusak等人.，2005)。也有證據(jù)表明禽流感病毒與人流感病毒之間的基因重組在病史中已經(jīng)出現(xiàn)多次(Kawaoka等人，1989)。由于禽類與人類親密接觸，因此人們相信能夠跨越種間屏障進入人類種群的新AI病毒菌抹的產(chǎn)生會繼續(xù)成為公共衛(wèi)生的關(guān)注的問題。禽類的大量接種疫苗看來是最有希望預(yù)防AI病毒傳播并且減少人類傳染病風險的方法。在過去的幾年里，在一些國家已經(jīng)進行了用滅活的完整病毒疫苗對禽類的接種。這些AI疫苗是由從被感染的卵中獲得的amnio-鳥嚢液制得的，然后通過福爾馬林或|3-丙內(nèi)酯來滅活(TollisandDiTrani,2002)。然而，新AI病毒菌林的無法預(yù)測的出現(xiàn)，病毒向一種對雞胚高度致命的形式的進化(Wood等人，2002),以及致命AI菌林通過生物恐怖分子的可能傳播使得快速發(fā)展以及即使供應(yīng)安全有效的AI疫苗成為一項至關(guān)緊要且仍然十分困難的任務(wù)。此外，不可能將區(qū)域被感染的小雞與那些之前經(jīng)相同菌林的滅活的AI病毒免疫的小雞區(qū)分開(Normile,2004)。一種編碼AI病毒的血凝素(HA)的實3全性重組雞痘病毒在翅-蹼(wing-web)穿刺后已經(jīng)保護了小雞以抵抗H5N2AI病毒的感染，盡管血凝抑制(HI)血清學反應(yīng)可忽略(Beard等人，1992)。通過翅蹼接種了活的表達HA的重組牛痘病毒的小雞也形成了對致命性AI病毒具有抗性的保護性免疫，檢測到了低水平的血清HI抗體(Chambers等人，1988)。盡管具有向消化道的趨向性的水禽來源的AI分離物已經(jīng)作為經(jīng)口腔的AI疫苗接種到小雞中(Crawford等人，1998),但由于這種病毒類型固有的動態(tài)進化，估計這些分離物并不能廣泛有效地抵抗新的AI病毒菌才朱。禽類已經(jīng)通過皮下注射由桿狀病毒載體表達的HA蛋白質(zhì)(Crawford等人，1999)以及用基因槍將表達HA的表達質(zhì)粒接種到皮膚中(Fynan等人.，1993)而獲得免疫。這些AI疫苗能夠保護禽類不呈現(xiàn)出臨床表征和死亡，并且能夠減少含有同源性HA的活化(challenge)病毒的呼吸道和腸道的復制。也有證據(jù)表明來自于表達HA的含有非病原性流感病毒主鏈的新城疫病毒載體或重組流感病毒的低成本氣溶膠AI疫苗(Swayne,2003)可能有效(Lee等人，2004;Webby等人，2004)。上述AI疫苗中的大多數(shù)倚賴于勞動密集型的腸道外的遞送。經(jīng)口的和氣溶膠AI疫苗在大量接種中對家禽類個體遞送同一劑量時出現(xiàn)了不相容性。一些疫苗中使用的復制載體由于帶來非自然的微生物形式而給環(huán)境造成了生物危害。重組流感病毒疫苗通過同時在環(huán)境中循環(huán)的重酉己(reassortant)流感病毒與野生型AI病毒之間的重組甚至會產(chǎn)生有害的重配(reassortments)(Hilleman,2002)。目前有幾種值得注意的以往使用重組腺病毒("Ad")載體作為疫苗的理由。Ad載體能夠在原地轉(zhuǎn)換有絲分裂的細胞和有絲分裂期后的細胞。此外，含有高滴度病毒的Ad原種(stocks)(即，高于10!2pfu[噬斑形成單位]/ml)的制備易于產(chǎn)生，這使得在原位以高感染復數(shù)(MOI)轉(zhuǎn)導細胞成為可能。Ad載體也已經(jīng)有^皮證明的安全記錄，該記錄基于它們作為疫苗的長期使用而獲得。而且，Ad病毒能夠引起基因的高水平表達(至少作為原始的暴發(fā)(initialburst)),并且復制缺陷性Ad載體能夠使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)容易地被進行生物工程化，被制造以及儲存。由于Ad載體對特異性受體的高親合性以及它避開紅細胞漿質(zhì)途徑的能力，基于Ad的疫苗要比DNA疫苗更有效(Curiel，1994)。Ad載體通過將其的纖維與被發(fā)現(xiàn)位于雞細胞的表面上的柯薩奇病毒以及腺病毒受體(CAR)結(jié)合可以轉(zhuǎn)導部分雞胚(Tan等人，2001)。此外，至少一種Ad的成分，異己酮，免疫原性高，并且能夠給予外源抗原輔助活性(Molinier-Frenkel等人，2002)。基于Ad的疫苗模擬其能力中的自然感染來誘導主要組織相容性復合體(MHC)I類限制性T-細胞反應(yīng)，而由于該載體只表達了病原體基因的亞片段，因此減弱了逆轉(zhuǎn)成毒性的可能性。這種"選擇性表達，，可以問題，這是因為不能使用不是由該載體編碼的病原體的特異性標記物來區(qū)分這兩種情況。值得注意的是，由于相關(guān)抗原基因可以直接從野生樣品中擴增和克隆，因此載體化的疫苗的產(chǎn)生不需要病原體的繁殖(Rajakumar等人，1990)。這對生產(chǎn)例如H5N1等高毒性的AI菌株尤為重要，這是因為這種菌林太危險，難以繁殖(Wood等人，2002)。除了上述標準外，商業(yè)關(guān)注因素主要集中在家禽業(yè)。目前的AI疫苗單獨花費約每只家禽7分，這還不算注射飛禽的勞動(Normile,2004)。不能復制的E1/E3-缺陷型人Ad血清型5(Ad5)-衍生的載體已經(jīng)在哺乳動物中獲得了廣泛的研究(GrahamandPrevec，199"。盡管雞已經(jīng)通過皮下或皮內(nèi)注射編碼抗原的禽類Ad雞胚胎致死性孤兒(CELO)病毒載體獲得免疫(Francois等人，2004),然而CELO載體具有低堅持服藥率(compliancerate),并且由于其能夠在雞細胞中復制，因此可能有害。由于CELO沒有可確認的El,E3和E4區(qū)域(Chiocca等人，1996),無法復制的CELO載體在當時并不作為用于免疫的載體而存在。本發(fā)明通過提供一種安全且有效的用于基因遞送的方法來保護禽類不受眾多疾病的困擾，從而防止禽類病原體向人類傳播，借此提出了這種需要。發(fā)明簡述目前已經(jīng)令人驚訝地表明人腺病毒-載體化的疫苗的肌肉以及卵內(nèi)的遞送能夠快速，安全以及有效地免疫禽類。針對幾種禽類病原體對禽類進行的大規(guī)模免疫對于預(yù)防巨大經(jīng)濟損失以及阻止例如禽流感病毒等禽類病原體向人群傳播至關(guān)重要。用機械化注射器進行的疫苗或免疫原性組合物的卵內(nèi)遞送，是一種以即時的方式對禽類進行大規(guī)模免疫的非勞動密集型方法。與其它卵內(nèi)禽類疫苗不同，人腺病毒-載體化疫苗或免疫原性組合物的生產(chǎn)不需要致命性病原體的繁殖，不包括能夠在禽類中復制的免疫原或載體的傳播。而且，用這種疫苗或免疫原性組合物進行的免疫使得經(jīng)免疫的與自然感染的動物區(qū)分開來。一方面，本發(fā)明提供了重組人腺病毒表達載體，該載體包括并表達腺病毒DNA序列，和與編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列可操縱地連接的啟動子序列。優(yōu)選的是，所屬人腺病毒序列來自于人腺病毒血清型5。該人腺病毒序列可來源于復制缺陷型腺病毒、非復制型腺病毒、可復制型腺病毒或野生型腺病毒。所述啟動子序列可選自下組病毒啟動子禽類啟動子，CMV啟動子，SV40啟動子，P-肌動蛋白啟動子，白蛋白啟動子，EFl-a啟動子，PyK啟動子，MFG啟動子，和勞斯肉瘤病毒啟動子。一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原可以來源于，例如禽流感病毒，傳染性嚢病病毒，馬雷克病病毒，傳染性喉氣管炎病毒等皰滲病毒，禽類傳染性支氣管炎病毒，禽呼腸孤病毒，包括禽痘，鳥痘，金絲雀痘，鴒痘，鵪l烏痘和dovepox的痘病毒，禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻氣管炎病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒，禽逆轉(zhuǎn)錄病毒，禽內(nèi)源性病毒，禽成紅血細胞增多癥病毒，禽肝炎病毒，禽貧血癥病毒，禽腸炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽細小病毒，禽輪狀病毒，禽造血細胞組織增生病毒，禽肌腱膜纖維肉瘤病毒，禽成髓細胞過多癥病毒，禽成髓細胞過多癥相關(guān)病毒，禽髓細胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾壞死病毒。優(yōu)選的是，所述一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于禽類流感，也就是血凝素，核蛋白質(zhì)，基質(zhì)和神經(jīng)氨酸酶。更優(yōu)選的是，所述一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于血湊是素亞型3、5、7或9。本發(fā)明的另一方面提供了一種用于體內(nèi)遞送到禽類個體的免疫原性組合物或疫苗，其包括一種獸醫(yī)學上可接受的載體或賦形劑和一種包括并表達DNA序列，與一個與編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或^達載體。；、。。、'、、口-、'''、優(yōu)選的是，腺病毒DNA序列來源于腺病毒血清型5(Ad5)。優(yōu)選的是，所述人腺病毒序列來源于腺病毒血清型5。人腺病毒序列可來源于復制缺陷型腺病毒。—啟動子序列可選自禽類啟動子，CMV啟動子，SV40啟動子，卩-肌動蛋白啟動子，白蛋白啟動子，EFl-a啟動子，PyK啟動子，MFG啟動子，和勞斯肉瘤病毒啟動子。一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原可以來源于，例如禽流感病毒，傳染性嚢病病毒，馬雷克病病毒，傳染性喉氣管炎病毒等皰滲病毒，禽類傳染性支氣管炎病毒，禽呼腸孤病毒，包括禽痘，鳥痘，金絲雀痘，鴒痘，鵪鵓痘和dovepox的痘病毒，禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻氣管炎病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒，禽逆轉(zhuǎn)錄病毒，禽內(nèi)源性病毒，禽成紅血細胞增多癥病毒，禽肝炎病毒，禽貧血癥病毒，禽腸炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽細小病毒，禽輪狀病毒，禽造血細胞組織增生病毒，禽肌腱膜纖維肉瘤病毒，禽成髓細胞過多癥病毒，禽成髓細胞過多癥相關(guān)病毒，禽髓細胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾壞死病毒。優(yōu)選的是，所述一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于禽類流感，也就是血凝素，核蛋白質(zhì)，基質(zhì)和神經(jīng)氨酸酶。更優(yōu)選的是，所述一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于血凝素亞型3、5、7或9。所述免疫原性組合物或疫苗可再包括佐劑。所述免疫原性組合物或疫苗可再包括另外的疫苗。本發(fā)明的另一個方面提供了一種在細胞中導入和表達一個或多個禽類抗原或免疫原的方法，所述方法包括用重組人腺病毒表達載體接觸所述細胞，并在足以在細胞中表達一種或多種禽抗原或免疫原的條件下培養(yǎng)細胞，所述載體包括并表達腺病毒DNA序列，和與編碼一種序列。優(yōu)選的是，所述細胞是293細胞或PER.C6細胞。優(yōu)選的是，一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于禽流感病毒，傳染性嚢病病毒，馬雷克病病毒，禽皰滲病毒，傳染性喉氣管炎病毒，禽傳染性支氣管炎病毒，禽呼腸孤病毒，禽痘，鳥痘，金絲雀痘，鵒痘，鵪l烏痘，和dovepox，禽多瘤病毒，新城病病毒，禽月申病毒，禽鼻氣管炎病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒，禽逆轉(zhuǎn)錄病毒，禽內(nèi)源性病毒，禽成紅血細胞增多癥病毒，禽肝炎病毒，禽貧血癥病毒，禽腸炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽細小病毒，禽輪狀病毒，禽造血細胞組織增生病毒，禽肌腱膜纖維肉瘤病毒，禽成髓細胞過多癥病毒，禽成髓細胞過多癥相關(guān)病毒，禽髓細胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾壞死病毒。優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列來源于一種或多種禽病毒。優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列來源于禽流感。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列選自血凝素，核蛋白質(zhì)，基質(zhì)或神經(jīng)氨酸酶。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列選自血凝素亞型3、5、7或9。本發(fā)明的另一個方面提供了一種在禽胚胎中導入和表達一種或多種禽流感抗原或免疫原的方法，包括用重組人腺病毒表達載體接觸所述禽胚胎，從而獲得一種或多種禽流感抗原或免疫原在禽胚胎中的表達，所述載體包括并表達腺病毒DNA序列，和與編碼一種或多種所關(guān)、優(yōu)選的是:';述編碼一'種或多;所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列來源于一種或多種禽病毒。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列來源于禽流感。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列選自血凝素，核蛋白質(zhì)，基質(zhì)或神經(jīng)氨酸酶。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列選自血凝素亞型3、5、7或9。在禽胚胎中導入和表達一種或多種禽流感抗原或免疫原的方法優(yōu)選可通過卵內(nèi)遞送發(fā)生。本發(fā)明的另一方面提供了一種在禽類個體中引起免疫原性反應(yīng)的方法，其包括對禽類個體施加一種免疫有效量的本發(fā)明的組合物。然而，本發(fā)明的另一方面提供了一種在禽類個體中引起免疫原性反應(yīng)的方法，所述方法包括用一種免疫有效量的免疫原性組合物感染禽類個體，所述組合物包括含有并表達腺病毒DNA序列，和與編碼一子;列的重組人腺病毒表達^::'其中一^或多;所關(guān)注的禽類抗原或免疫原以足以在禽類個體中引起針對一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的免疫原性反應(yīng)的水平被表達。優(yōu)選的是，一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于禽流感病毒，傳染性嚢病病毒，馬雷克病病毒，禽皰滲病毒，傳染性喉氣管炎病毒，禽傳染性支氣管炎病毒，禽呼腸孤病毒，禽痘，鳥痘，金絲雀痘，鵒痘，鵪鵓痘，和dovepox,禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻氣管炎病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒，禽逆轉(zhuǎn)錄病毒，禽內(nèi)源性病毒，禽成紅血細胞增多癥病毒，禽肝炎病毒，禽貧血癥病毒，禽腸炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽細小病毒，禽輪狀病毒，禽造血細胞組織增生病毒，禽肌腱膜纖維肉瘤病毒，禽成髓細胞過多癥病毒，禽成髓細胞過多癥相關(guān)病毒，禽髓細胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾壞死病毒。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列來源于禽流感。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列選自血凝素，核蛋白質(zhì)，基質(zhì)或神經(jīng)氨酸酶。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列選自血凝素亞型3、5、7或9。該方法還包括施加另外的疫苗。優(yōu)選的是，感染的方法通過卵內(nèi)遞送發(fā)生。本發(fā)明的另一個方面提供了一種在禽類個體中引起免疫原性反應(yīng)的方法，其包括用一種免疫有效量的免疫原性組合物感染禽類個體，所述組合物包括含有并表達腺病毒DNA序列，和與編碼一種或多種所組人腺病毒表達載體，其中一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原以足以在禽類個體中引起針對一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的免疫原性反應(yīng)的水平被表達。優(yōu)選的是，一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于禽流感病毒，傳染性嚢病病毒，馬雷克病病毒，禽皰滲病毒，傳染性喉氣管炎病毒，禽傳染性支氣管炎病毒，禽呼腸孤病毒，禽痘，鳥痘，金絲雀痘，鴒痘，鵪鵓痘，和dovepox,禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻氣管炎病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒，禽逆轉(zhuǎn)錄病毒，禽內(nèi)源性病毒，禽成紅血細胞增多癥病毒，禽肝炎病毒，禽貧血癥病毒，禽腸炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽細小病毒，禽輪狀病毒，禽造血細胞組織增生病毒，禽肌腱膜纖維肉瘤病毒，禽成髓細胞過多癥病毒，禽成髓細胞過多癥相關(guān)病毒，禽髓細胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾壞死病毒。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列來源于禽流感。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列選自血凝素，核蛋白質(zhì)，基質(zhì)或神經(jīng)氨酸酶。更優(yōu)選的是，所述編碼一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的外源序列選自血凝素亞型3、5、7或9。該方法還包括施加另外的疫苗。優(yōu)選的是，所述禽類個體通過翅-蹼，翅尖，胸肌，或大腿肌肉組織的皮下注射被感染。所述禽類個體也可以在卵內(nèi)^:感染。本發(fā)明的另一個方面提供一種對禽類個體接種的方法，包括在卵內(nèi)施加重組人腺病毒，其含有并表達編碼禽類個體的病原體的抗原的異源核酸分子。優(yōu)選的是，該人腺病毒包括源于腺病毒血清型5的序列。優(yōu)選的是，所述人腺病毒包括源于復制缺陷型腺病毒的序列，非復制型腺病毒，可復制型腺病毒，或野生型腺病毒。優(yōu)選的是，所述禽類病原體的抗原來源于禽流感病毒，傳染性嚢病病毒，馬雷克病病毒，禽皰滲病毒，傳染性喉氣管炎病毒，禽傳染性支氣管炎病毒，禽呼腸孤病毒，禽痘，鳥痘，金絲雀痘，鴒痘，鵪鵓痘，和dovepox,禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻氣管炎病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒，禽逆轉(zhuǎn)錄病毒，禽內(nèi)源性病毒，禽成紅血細胞增多癥病毒，禽肝炎病毒，禽貧血癥病毒，禽腸炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽細小病毒，禽輪狀病毒，禽造血細胞組織增生病毒，禽肌腱膜纖維肉瘤病毒，禽成髓細胞過多癥病毒，禽成髓細胞過多癥相關(guān)病毒，禽髓細胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾壞死病毒。更優(yōu)選的是，所述禽類病原體的抗原來源于禽流感。更優(yōu)選的是，所述禽流感抗原或免疫原選自血凝素，核蛋白質(zhì)，基質(zhì)，或神經(jīng)氨酸酶，更優(yōu)選的是，所述禽流感抗原或免疫原選自血凝素亞型3、5、7或9。所述方法還包括施加另外的疫苗。本發(fā)明的另一個實施方式提供了一種用于將免疫原性組合物遞送到禽類胚胎的卵內(nèi)的給藥裝置，其中該裝置含有一種表達一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的重組人腺病毒表達載體，其中該裝置將重組人腺病毒遞送到禽。優(yōu)選的是，該人腺病毒表達載體包括衍生自腺病毒血清型5的序列。優(yōu)選的是，該人腺病毒表達載體包括衍生自復制缺陷型腺病毒，非復制型人腺病毒，可復制型腺病毒，或野生型腺病毒的序列。優(yōu)選的是，所述一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于禽流感病毒，傳染性嚢病病毒，馬雷克病病毒，禽皰滲病毒，傳染性喉氣管炎病毒，禽傳染性支氣管炎病毒，禽呼腸孤病毒，禽痘，鳥痘，金絲雀痘，鴒痘，鵪鵓痘，和dovepox,禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻氣管炎病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒，禽逆轉(zhuǎn)錄病毒，禽內(nèi)源性病毒，禽成紅血細胞增多癥病毒，禽肝炎病毒，禽貧血癥病毒，禽腸炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽細小病毒，禽4侖狀病毒，禽造血細胞組織增生病毒，禽肌腱膜纖維肉瘤病毒，禽成髓細胞過多癥病毒，禽成髓細胞過多癥相關(guān)病毒，禽髓細胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾壞死病毒。更優(yōu)選的是，所述一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于禽流感。更優(yōu)選的是，所述禽流感抗原或免疫原選自血凝素，核蛋白質(zhì)，基質(zhì)或神經(jīng)氨酸酶。更優(yōu)選的是，所關(guān)注的禽流感抗原或免疫原選自血凝素亞型3、5、7或9。所述方法還可包括施用另外的疫苗。這些以及其它實施方式被公開或者包括于以下詳細說明中，或由其顯而易見得到。附圖的簡要說明通過實施例給出了以下詳細說明，但不會將本發(fā)明限制于某個具體實施方式，可以結(jié)合附圖來理解所述詳細說明，它們均并入本文作為參考，其中圖1描述了通過卵內(nèi)免疫小雞以及肌肉內(nèi)注射表達禽流感HA的重組腺病毒載體。組1代表9天大的含胚雞蛋，組2代表18天大的含胚雞蛋，體積為200)li1,劑量為5xl01Qpfu/蛋。在組3,將100(il所述表達禽流感HA的病毒載體肌肉內(nèi)注射到4周大的小雞中，劑量為2.5xl0"pfu/動物。圖2描述了在培養(yǎng)的10或18天在卵內(nèi)接種了AdTW68.H5的28天大的SPF小雞中檢測到的血細胞凝集抑制抗體效價(點)，以及在培養(yǎng)的10或18天在卵內(nèi)進行了疫苗接種并且孵化后15天通過鼻途徑:故加強免疫(boost)的小雞中檢測到的血細胞凝集抑制抗體效價(點)。條，幾何平均log2[HI效價]。在未實驗的對照組小雞中沒有檢測到HI效價(數(shù)據(jù)未示出)。圖3分別表示在孵化后23天和29天的SPF小雞中的血細胞凝集抑制抗體，這些小雞或是胚胎形成18天只在卵內(nèi)接種AdTW68.H5.D23和D29(7只雞)，或是在卵內(nèi)接種AdTW68.H5.D23和D29并在孵化后15天鼻內(nèi)加強免疫(boost)(12只雞)，孵化后23天和29天HI效價；點，各個鳥中的log2[HI效價];條，幾何平均log2[HI效價][HI效價]。在孵化后23天和29天，未實驗的11組對照組小雞中沒有檢測到HI效價(數(shù)據(jù)未示出)。圖4表示在卵內(nèi)對第18天的白色來亨雞胚胎的疫苗接種。用10"vp的AdTW68.H5進行卯內(nèi)接種疫苗(在卵內(nèi))。在單獨的組中，在孵化后15天通過在鼻內(nèi)以同樣劑量滴灌AdTW68.H5對在卯內(nèi)接種了疫苗的家禽加強免疫(boost)(在卵內(nèi)+鼻內(nèi)加強免疫)。以沒有經(jīng)過免疫的未實驗的胚胎作為陰性對照(對照)。以致命劑量的高病原性A/Ck/Queretaro/14588-19/95(H5N2)Al病毒菌抹通過鼻后孔縫隙在鼻內(nèi)攻擊34天大的小雞。使用Logrank檢驗(Prism4.03,GraphPadSoftware)測定了生存中統(tǒng)計學上重要的變化。與未接種疫苗的對照相比(P〈0.001)，使用或沒有使用鼻內(nèi)加強免疫在卵內(nèi)接種AdTW68.H5都顯著地保護了小雞(100%)以避免致命的AI病毒帶來的危險。圖5描述了通過定量的實時RT-PCR(16)測定用這種高病原性AI病毒鼻內(nèi)攻擊后，被接種免疫的雞和對照雞中的口咽樣本中的A/Ck/Queretaro/14588-19/95病毒RNA。如圖3中描述的那樣對小雞進行疫苗接種。在感染后2，4和7天收集試樣。在接種了疫苗的小雞和未接種疫苗的對照組中，疫苗負載在第7天達到顯著差異(P0.05)。圖6是一幅描述第18天在卯內(nèi)通過以3xl08ifu的劑量接種AdTW68.H5載體進行接種疫苗的圖。通過SartobindQ5膜(SartoriusNorthAmerica,Inc.，Edgewood,NY)純化Ad5載體，并重懸于Al95緩沖液(Evans,2004)。第25天分析預(yù)攻擊血清HI抗體。減號(-)表示死于攻擊的禽類；加號(+)表示在攻擊后生存的禽類。與死亡者相比，幸存者顯著地提高了預(yù)攻擊血清HI活性(P<0.001)(不成對t-檢驗；Prism4.03)。所有純對照禽類以及經(jīng)對照載體AdCMV-tetC免疫的烏類沒有生產(chǎn)可檢測到的HI抗體效價。圖7是一幅描述第18天在卵內(nèi)通過以3xl08ifu的劑量接種AdTW68.H5載體進行接種疫苗的圖。通過SartobindQ5膜(SartoriusNorthAmerica,Inc.,Edgewood,NY)純化Ad5載體，并重懸于A195緩沖液(Evans，2004)。通過第31天在鼻內(nèi)施加105EID50的H5N1AI病毒A/Swan/Mongolia〃244L/2005對對照和被免疫的禽類進行攻擊。發(fā)明的詳細內(nèi)容本發(fā)明的公開內(nèi)容中，"包括"，"包含""含有""具有"等等可具有歸于美國專利法中的含義，并且可以指包括等等；"基本由......組成含有"同樣具有歸于美國專利法中的含義，并且該術(shù)語是無限制的，允許存在所描述之外的含義，只要所描述的基礎(chǔ)的或新的性質(zhì)沒有被所描述之外的含義的存在而改變，但是不包括現(xiàn)有技術(shù)的實施方式。術(shù)語"核酸"或"核酸序列"是指單鏈形式或雙鏈形式的脫氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。該術(shù)語包括核酸，即寡核普酸，包括天然核苷酸的已知的類似物。該術(shù)語也包括具有合成的主鏈的核酸類似的結(jié)構(gòu)，參見，例如，Eckstein,1991;Baserga等人，1992;Milligan,1993;WO97/03211;WO96/39154;Mata,1997;Strauss-Soukup，1997;和Samstag，1996。這里所使用的"重組體"是指合成的多核苷酸或者另外在體外操作的多核苷酸(例如，"重組多核苷酸")，指使用重組多核苷酸在細胞或其它生物系統(tǒng)中生產(chǎn)基因產(chǎn)品的方法，或指由重組多核普酸編碼的多肽("重組蛋白質(zhì)")。"重組方式，，也包括將具有來自不同來源的編碼區(qū)域或域或啟動子序列的核酸連結(jié)到表達盒或載體以表達例如本發(fā)明的載體中的多肽編碼序列的可誘導的或組成型的表達。當提到核酸時使用的術(shù)語"異源的，，是指在自然界中不常發(fā)現(xiàn)的細胞或病毒中的核酸；或者，包括通常在自然界中所發(fā)現(xiàn)的彼此之間的同源關(guān)系中并沒有被發(fā)現(xiàn)的兩條或更多亞序列，或者經(jīng)重組設(shè)計以至其表達水平，或與細胞其它核酸或其它分子的物理關(guān)系，或結(jié)構(gòu)在自然界中不常見。本文中所使用的一個相似的術(shù)語是"外源的"。例如，異源核酸通常由重組生產(chǎn)，其具有來自于以自然界中無法發(fā)現(xiàn)的方式排列的不相關(guān)的基因的兩種或多種序列；例如，插入于本發(fā)明的基于腺病毒的載體的與啟動子序列可操縱地連接的人類基因。作為一個例子，所關(guān)注的異源核酸能夠編碼一種免疫原性基因產(chǎn)品，其中該腺病毒以疫苗或疫苗組合物形式治療性地或預(yù)防性地被施予。異源序列可以包括各種啟動子和序列的各種組合，這些啟動子和序列的例子描述于本文的詳述中。"抗原"是由免疫系統(tǒng)識別并引起免疫反應(yīng)的物質(zhì)。本文中使用的一個類似術(shù)語是"免疫原"。本發(fā)明的上下文中的"禽類個體"指的是鳥綱中的任意和所有家養(yǎng)和野生成員，其包括，但不限于新頜總目(Neognathae)和古頜總目(Palaeognathae)。新頜總目(Neognathae)包括，其中，雁形目(Anseriformes),雨燕目(Apodiformes)，Buceroformes,夜鷹目(Caprimulgiformes),鵒形目(Charadriiformes),鸛開j目(Ciconiiformes),鼠鳥目(Coliiformes),鴒形目(Columbiformes),Coraciifomies,鵑開j目(C畫lifo畫s),隼形目(Falco函薩s),鵒鴛目(Galbuliformes)，雞形，目(Galliformes)，潛鳥目(Gaviiformes),鶴形目(Gruiformes)，蕉鵑目(Musophagiformes),Opisthocomiformes，Passeriforaies，弟鳥形目(Pelecaniformes),紅鸛目(Phoenicopteriformes)，詠木鳥目(Piciformes),鷓鷉目(Podicipedifo認s),信天翁目(Procellariiformes)，鸚形目(Psittaciformes),企我烏目(Sphenisciformes)，號鳥形目(Strigiformes)，Trochiliforaies,Trogoniformes,咬鵑目(Tumiciformes),和戴勝目(Upupiformes)。古頜總目包括無翼鳥目(Apterygiformes)，鶴鴕目(Casuariiformes)，恐鳥目(Dinornithiformes),美洲烏它目(Rheiformes),駝形目(Struthioniformes),和Tiniamifo騰s。禽類個體可包括成年禽類，雛和禽類胚胎/蛋?；蚧蚝怂岬?表達，，不止包括細胞基因表達，還包括在克隆系統(tǒng)中或在其它環(huán)境中的核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯。如這里所使用的，"載體"是一種允許或助于一種實體從一種環(huán)境轉(zhuǎn)移到另一種環(huán)境中的工具。通過實施例，重組DNA技術(shù)中使用的某些載體允許實體，例如DNA的一個片段(例如異源的DNA片段，例如異源的cDNA片段)，轉(zhuǎn)移到耙細胞中。本發(fā)明包括重組載體，所述重組載體可包括病毒載體，細菌載體，原生動物載體，DNA載體，或重組體。至于用于在載體中表達的外源DNA(例如，編碼所關(guān)注的表位和/或抗原和/或治療性)以及提供這種外源DNA的文獻，用于提高核酸分子表達的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯因子，以及例如"所關(guān)注的表位"，"治療性"，"免疫反應(yīng)"，"免疫應(yīng)答"，"保護性免疫反應(yīng)"，"免疫組合物"，"免疫原性組合物，，，和"疫苗組合物"，及其它，參考公開于1999-11-23的U.S.專利No.5,990,091，和WO98/00166和WO99/60164，以及它們所引用的文獻和該美國專利和上述PCT申請的進行(prosecution)過程中記錄的文獻；所有這些文獻都并入本文作為參考。因此，在本發(fā)明實施中可以查閱并入本文作為參考的U.S.專利No.5,990,091,和WO98/00166和WO99/60164以及其所引用的文獻以及該美國專利和上述PCT申請的進行(prosecution)過程中記錄的文獻，以及這里或其它地方引用的其它文獻；在其中所引用的所有外源核酸分子，啟動子和載體可用于本發(fā)明的實施中，出于這種考慮，也同時提及U.S.專利Nos.6,706,693;6,716,823;6,348,450;U.S.專利申請系列號10/424,409;10/052,323;10/116,963;10/346,021;和PCT/US98/16739中的于1999-2-25公開的WO99/08713。如這里所使用的，術(shù)語"免疫原性組合物"和"免疫組合物"和"免疫原性或免疫學組合物"包括任何引起針對由本發(fā)明的腺病毒載體和病毒表達的所關(guān)注的抗原或免疫原的免疫反應(yīng)的組合物；例如，在施加給個體后，引起針對所關(guān)注的耙免疫原或抗原的免疫反應(yīng)。術(shù)語"疫苗的組合物"和"疫苗"和"疫苗組合物"包括任意誘發(fā)針對在施加或注射到個體中后，引發(fā)針對耙抗原或免疫原的保護性的免疫反應(yīng)，或提供有效保護以對抗由本發(fā)明的腺病毒表達的抗原或免疫原。術(shù)語"獸醫(yī)組合物"是指包括用于獸醫(yī)用途的表達治療性蛋白質(zhì)的載體的任意組合物，例如紅細胞生成素(EPO)或免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，例如，干擾素(IFN)。與之相似，術(shù)語"藥物組合物"是指含有用于表達治療性蛋白質(zhì)的載體的任意組合物。"免疫有效量"是指當施予某個體時，產(chǎn)生針對所關(guān)注的基因的免疫反應(yīng)的編碼所關(guān)注的基因的重組載體的量或濃度。"循環(huán)重組形式"指的是在兩個或更多個亞型或菌抹中已經(jīng)歷了基因重組合的重組病毒。本發(fā)明的正文中所使用的其它術(shù)語為"雜交形式"，"重組形式"和"重配形式"。"臨床分離物"指的是，例如，通常使用的分離自被感染的個體的病毒的實驗室菌林，并且要強調(diào)的是它們與高生長供體病毒的適應(yīng)實驗室的主要菌抹同時存在于實驗室細胞或個體。"曠野分離物"是指從環(huán)境中或從被感染的個體中分離的病毒。供以治療性接種方式減輕疾病的癥狀。本發(fā)明的重組載體可以單獨或作為免疫學或免疫原性組合物的一部分施加給個體。本發(fā)明的重組載體可以通過體內(nèi)表達蛋白質(zhì)被用于向目的個體遞送或施加一種或多種蛋白質(zhì)。有人指出本發(fā)明中的免疫學產(chǎn)品和/或抗體和/或表達產(chǎn)物可以在體外表達并以免疫學產(chǎn)品和/或表達產(chǎn)物和/或抗體可被常規(guī)使用的方式被使用，而且那些表達免疫學產(chǎn)品和/或表達產(chǎn)物和/或抗體的細胞能夠在體外神皮使用，例如，這些用途和應(yīng)用可包括診斷學，檢測，體外診斷(例如，其中，表達所述基因產(chǎn)品和/或免疫反應(yīng)的細胞在體外被擴展并—皮重新導入到宿主或動物)等，參見U.S.專利No.5,990,091,WO99/60164和WO98/00166其所引用的文獻。而且，由其中的方法分離的表達的抗體或基因產(chǎn)品，或者按照其中給藥方法在體外擴展的細胞中分離的表達的抗體或基因產(chǎn)品可以以組合物形式被給藥，與給藥亞基表位或抗原或療法或抗體以誘導免疫，刺激治療反應(yīng)和/或刺激-故動免疫相類似。此處使用的術(shù)語"人腺病毒，，，是指包括所有腺病毒科(Adenoviridae)家族的人腺病毒，該家族包括Mastadeno病毒屬的成員。迄今為止，超過五十腺病毒的人血清型已經(jīng)獲得了鑒定(參見，例如，F(xiàn)ields等人，Virology2,Ch.67(3ded,Lippincott國RavenPublishers))。A泉病毒可以有血清群A,B，C,D，E，或F。人腺病毒可以是血清型1(Adl),血清型2(Ad2)，血清型3(Ad3),血清型4(Ad4),血清型6(Ad6)，血清型7(Ad7),血清型8(Ad8),血清型9(Ad9),血清型10(AdIO),血清型11(Adll),血清型12(Adl2),血清型13(Adl3)，血清型14(AdH),血清型15(Adl5),血清型16(Adl6),血清型17(Adl7)，血清型18(Adl8),血清型19(Adl9),血清型19a(Adl9a)，血清型19p(Adl9p),血清型20(Ad20),血清型21(Ad21),血清型22(Ad22),血清型23(Ad23)，血清型24(Ad24),血清型25(Ad25),血清型26(Ad26),血清型27(Ad27),血清型28(Ad28),血清型29(Ad29),血清型30(Ad30)，血清型31(Ad31),血清型32(Ad32)，血清型33(Ad33),血清型34(Ad34),血清型35(Ad35),血清型36(Ad36),血清型37(Ad37)，血清型38(Ad38),血清型39(Ad39),血清型40(Ad40),血清型41(Ad41),血清型42(Ad42)，血清型43(Ad4'3)，血清型44(Ad44),血清型45(Ad45),血清型46(Ad46),血清型47(Ad47),血清型48(Ad48)，血清型49(Ad49),血清型50(Ad50),血清型51(Ad51),或優(yōu)選的是，血清型5(Ad5)，但不限于這些例子。也被本發(fā)明所考慮的還有可包括來自于一種以上的腺病毒血清型的亞病毒顆粒的重組載體，免疫原性組合物和重組腺病毒。例如，眾所周知的是腺病毒載體能夠呈現(xiàn)被改變的對特異性組織或細胞類型的趨向性(Havenga，MJ.E.等人，2002)，因此，混合并匹配不同的腺病毒衣殼，即，來源于各種腺病毒血清型的纖維或penton蛋白質(zhì)可能是危險的。含有纖維和penton的腺病毒衣殼的修飾可能產(chǎn)生具有與未修飾的腺病毒不同趨向的腺病毒載體。感染細胞的能力被修飾并被最佳化的腺病毒載體可使得治療或預(yù)防劑量顯著減少，導致局部和浸染毒性減少。腺病毒是一種非包膜的DNA病毒。源自腺病毒的載體有許多使它們特別有利于基因轉(zhuǎn)移的特征。如這里所使用的，"重組腺病毒載體"是一種攜帶一種或多種異源的核苷酸序列(例如，兩個，三個，四個，五個或更多異源的核苷酸序列)的腺病毒載體。例如，腺病毒的生物學的特征具體在于腺病毒與嚴重的人類病理無關(guān)，這種病毒對于將基因轉(zhuǎn)導到宿主細胞中極為有效，該病毒可感染大量細胞，其宿主范圍很廣，這種病毒可較為容易地被大量生產(chǎn)，而且通過在病毒基因組中的早期區(qū)域l("El")的缺失可以使這種病毒成為復制缺陷性和/或非復制型。腺病毒的基因組是一種大約有36,000個堿基對("bp")的線性雙鏈DNA分子，其中每一條鏈的5，-末端共價連接了一種55-kDa末端蛋白質(zhì)。AdDNA含有相同的大約為100bp的反向末端序列("ITRs"),其具體的長度取決于血清型。病毒的復制起點位于正好在基因在末端的ITRs內(nèi)。DNA合成出現(xiàn)在兩個階l殳。首先，復制通過鏈取代并產(chǎn)生一個子代雙分子和一個父代被取代的鏈而進行。被取代的鏈是單鏈，可形成一種"鍋柄"中間體，這使得復制起始并產(chǎn)生一條子代雙分子。作為選擇，復制可以從基因組的兩端同時進行，避免需要形成鍋柄結(jié)構(gòu)。在生產(chǎn)性感染周期中，病毒基因在兩個階段被表達早期階段和晚期階段，早期階段為直到病毒DNA復制的階段，晚期階段為病毒DNA復制的起始相一致的階段。在早期階段，由區(qū)域El,E2,E3和E4編碼的基因產(chǎn)品被表達，所述基因產(chǎn)品執(zhí)行許多制備用于合成病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的細胞(Berk，AJ.,1986)的功能。在晚期，除早期基因產(chǎn)品之外，晚期病毒基因也被表達，宿主細胞DNA和蛋白質(zhì)合成被關(guān)閉。因此，這種細胞就成為用于生產(chǎn)病毒DNA和病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的細胞(Tooze,J.,1981)。腺病毒的E1區(qū)是在感染靶細胞后表達的腺病毒的第一個區(qū)域。該區(qū)域由兩個轉(zhuǎn)錄單元組成，E1A和E1B基因，二者均為原生(胚胎的)嚙齒類培養(yǎng)物的致癌轉(zhuǎn)化所需要。E1A基因產(chǎn)物的主要功能是誘導休眠細胞進入細胞周期并重新開始細胞的DNA合成，并轉(zhuǎn)錄性激活E1B基因和該病毒基因組的其它早期區(qū)域(E2，E3和E4)。單獨以E1A基因轉(zhuǎn)染初生細胞可以誘導無限繁殖(永生)，但不能產(chǎn)生完整的轉(zhuǎn)化。然而，E1A的表達，在大多數(shù)情況下，導致細胞程序化死亡(細胞凋亡)的誘導，只是偶爾獲得永生(Jochemsen等人，1987)。細胞凋亡的誘導的防止以及完整的形態(tài)學轉(zhuǎn)化的發(fā)生需要E舊基因的共表達。在已經(jīng)建立的永生的細胞系中，E1A的高水平表達在缺少E1B下可引起完整的轉(zhuǎn)化(Roberts,B.E.等人,1985)。E1B編碼的蛋白質(zhì)輔助E1A重新定向細胞的功能使得病毒可進行復制。E1B55kD和E433kD蛋白質(zhì)形成基本位于細胞核的復合物，它們起到抑制宿主蛋白質(zhì)中的合成并且利于病毒基因表達的作用。它們的主要影響是建立病毒mRNAs由細胞核到細胞質(zhì)的選擇性轉(zhuǎn)移，所述轉(zhuǎn)移伴隨著感染的晚期階段的開始。E1B21kD蛋白質(zhì)對于生產(chǎn)性感染周期的正確的瞬間控制十分重要，因而防止宿主細胞在病毒生活周期完成之前提前死亡。不能夠表達E1B21kD基因產(chǎn)品的突變的病毒顯示出縮短的感染周期，所述周期伴隨著宿主細胞的染色體DNA過度降解(deg-表型)并呈現(xiàn)增強的細胞病理效應(yīng)(cyt-表型；Telling等人，1994)。當E1A基因也被突變時，deg和cyt表型受到抑制，這表明這些表型是E1A的功能(White,E.等人，1988)。而且，E1B21kDa蛋白質(zhì)減慢了E1A接通其它病毒基因的速率。E1B21kD抑制這些倚賴于E1A的功能的機制還不不了解。與之相反，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒不整合到宿主的基因組中，能夠感染非分裂細胞，并能夠在體內(nèi)有效轉(zhuǎn)移重組基因(Brody等人，1994)。這些特征使得腺病毒成為將耙抗原或免疫原在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移到細胞，組織或需要的個體中的有吸引力的候選者。優(yōu)選含有多個缺失的腺病毒載體來提高載體的攜帶能力并減少重組生成能夠復制的腺病毒(RCA)的可能性。當腺病毒含有多個缺失時，并不需要每種缺失，如果單獨存在，會產(chǎn)生復制缺陷性和/或非復制型腺病毒。只要其中的一種缺失使腺病毒成為復制缺陷或非復制，為了其它目的還可以包括其它額外的缺失，例如，提高腺病毒基因組對異源的核苷酸序列的攜帶能力，優(yōu)選的是，多于一種的缺失預(yù)防功能蛋白質(zhì)的表達并使得腺病毒成為復制缺陷或非復制。更優(yōu)選的是，所有這些缺失都是使得腺病毒成為復制缺陷型和/或非復制型和/或減毒的缺失。然而，本發(fā)明還包括能夠復制和/或野生型腺病毒和腺病毒載體，即包括所有對在一個個體中感染和復制所必需的腺病毒基因。使用腺病毒重組體的本發(fā)明的實施方式可包括El-缺陷型或缺失型，或E3-缺陷型或缺失型，或E4-缺陷型或缺失型或含有El和E3,或El和E4,或E3和E4的缺失的腺病毒載體，或El,E3和E4被缺失，或所有病毒基因均被缺失的"gutless"腺病毒載體。該腺病毒載體可含有在El,E3,或E4基因中的突變，或含有在這些或所有腺病毒基因中的缺失。El突變增加了載體的安全限度，因為El-缺陷性腺病毒突變體據(jù)說在有抵抗性的細胞中為復制缺陷型和/或非復制型，而且最低限度地被高度減毒了。E3突變通過破壞腺病毒向下調(diào)節(jié)MHCI類分子的機制提高了抗原的免疫原性。E4突變通過抑制晚期基因表達減少腺病毒載體的免疫原性，因此可使得使用相同載體的重復的再次接種疫苗成為可能。本發(fā)明包括El,或E3，或E4，或E1和E3，或El和E4被缺失或發(fā)生突變的任意血清型或血清群的腺病毒載體。這些腺病毒基因的缺失或突變導致這些蛋白質(zhì)的活性受損或基本完全喪失。這種"gutless"腺病毒載體是腺病毒載體家族中的另一種類型的載體。其復制需要輔助病毒和表達Eia和Cre的特殊的人293細胞系，并且需要并不存在于自然環(huán)境中的條件；該載體喪失了所有的病毒基因，因此該載體作為疫苗載體是非-免疫原性，并且可以被接種多次以行再次免疫。這種"gutless"腺病毒載體也含有用于容納目的抗原或免疫原的36kb空間，從而可以將大量抗原或免疫原共轉(zhuǎn)移到細胞中。本領(lǐng)域中其它已知的其它毒載體系統(tǒng)包括AdEasy系統(tǒng)(He等人，1998)，以及其后的經(jīng)修飾的AdEasier系統(tǒng)(Zeng等人，2001)，它們被例如BJ5183這樣的大腸桿菌細胞中發(fā)生并過夜快速產(chǎn)生重組Ad載體。PAdEasy包括腺病毒結(jié)構(gòu)序列，所述序列當以反式與例如表達目的抗原或免疫原的pShuttle-CMV供體載體提供時，導致抗原或免疫原(例如，免疫原和/或抗原)包裹在腺病毒衣殼內(nèi)。pAdEasy的序列在本領(lǐng)域中是公知的且公眾可獲得的，且通過Stmtagene可商業(yè)獲得。本發(fā)明可采用AdHigh系統(tǒng)而獲得(美國專利臨時申請系列號60/683,638)。AdHigh是一種安全，快速且有效地生產(chǎn)高效價的重組腺病毒的方法，該方法沒有產(chǎn)生可對禽類個體有害或致命的RCA的風險。而且，RCA可對人具有免疫性，并且在食物鏈中也不希望有它存在。在大腸桿菌細胞中用腺病毒主鏈質(zhì)粒生產(chǎn)重組體后，AdHigh系統(tǒng)采用例如pAdHigh這樣的改良的穿梭質(zhì)粒來提高無RCA腺病毒在例如PER.C6細胞這樣的感受細胞中的生產(chǎn)。這些穿梭質(zhì)粒含有用以便于插入例如禽流感免疫原或抗原的等禽免疫原或抗原多連接子或多克隆位點。可以容易地實施腺病毒穿梭質(zhì)粒與例如pAdEasy等腺病毒輔助質(zhì)粒在細菌細胞中的重組(也就是，BJ5183)來生產(chǎn)表達本發(fā)明的禽抗原或免疫原的重組人腺病毒。通過克隆和限制性分析生產(chǎn)重組載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如RGD基序這樣的特定的序列基序可插入于腺病毒載體中的H-I環(huán)中以提高其感染力。該序列已經(jīng)顯示出對于某種細胞外基質(zhì)和附著蛋白與稱為整聯(lián)蛋白的細胞表面受體的超家族的相互作用必不可少。RGD基序的插入在免疫缺失的個體中可能是方便有利的。通過將特異性抗原或免疫原或其片斷插入于例如上述這樣的腺病毒載體構(gòu)建腺病毒重組體。所述腺病毒重組體被用作免疫劑以轉(zhuǎn)換脊推動物的細胞。(參見，例如U.S.專利申請系列號No.10/424,409,并入本文作為參考)。本發(fā)明的腺病毒載體有利于在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)移表達禽抗原或免疫原的核酸。尤其是，這種有創(chuàng)造力的載體可被方便地用于將核酸轉(zhuǎn)移到動物中，更優(yōu)選禽和哺乳動物細胞。目的核酸包括編碼肽和蛋白質(zhì)的核酸，優(yōu)選治療性(例如用于醫(yī)療或獸醫(yī)用途)或免疫原性(例如用于疫苗)肽或蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是，編碼目的抗原或免疫原的密碼子為"最佳的"密碼子，即密碼子為那些常常出現(xiàn)，也就是高度表達的禽基因，而不是那些常常被被例如流感使用的密碼子。這些密碼子的選擇提供了所述抗原或免疫原在人或禽細胞中有效的表達。在其它的實施方式中，例如，當目的抗原或免疫原在細菌，酵母或其它表達系統(tǒng)中表達時，密碼子選基因-斤偏好的密碼子:許多物^t(的高度表達的基因的密碼子選擇模式在文獻中是已知的(例如Nakamum等人，1996;Wang等人，1998;McEwan等人1998)。作為另一種選擇，該腺病毒載體可被用于感染培養(yǎng)中的細胞以表達所希望的基因產(chǎn)品，例如生產(chǎn)一種目的蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選的是，所述蛋白質(zhì)或肽被分泌到培養(yǎng)基中，并使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)以及本申請所提供的技術(shù)從中被純化。導向蛋白質(zhì)的胞外分泌的信號肽序列在本領(lǐng)域中已知，并且編碼所述信號肽的核苷酸序列可通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)被可操縱地連接到編碼目的肽或蛋白質(zhì)的核苷酸序列上。作為選擇，這些細胞可被溶解，所表達的重組蛋白質(zhì)可以從細胞溶解物中被純化。優(yōu)選的是，所述細胞為動物細胞，更優(yōu)選為禽或哺乳動物細胞。同樣優(yōu)選的有，能夠通過腺病毒進行轉(zhuǎn)導的細胞。這些細胞包括PER.C6細胞，911細胞和HEK293細胞。本發(fā)明還包括禽細胞的用途，這些細胞例如，但不限于禽胚胎成纖維細胞，例如DF-I細胞，例如并入本文作為參考的U.S.專利Nos.6,872,561;6,642,042;6,280,970和6,255,108中描述的禽干細胞，禽淋巴母細胞，禽上皮細胞，其中，例如來源于雞胚的細胞抹CHCC-OU2(Ogura,H.等人，1987;日本專利公開9-173059),源于鵪鵓的細胞林QT-35(曰本專利公開9-98778)。任何能夠用于感染，轉(zhuǎn)染或其它基因轉(zhuǎn)移類型的禽細胞都能夠用于實施本發(fā)明。用于培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基包括通常用于組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中，例如M199曙earlebase,EagleMEM(E國MEM),DulbeccoMEM(DMEM),SC-UCM102,UP-SFM(GIBCOBRL)，EX-CELL302(Nichirei),EX-CELL293-S(Nichirei),TFBM-01(Nichirei)，ASF104。適于特定的細胞類型的培養(yǎng)基可以在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)或歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)找到。培養(yǎng)基可以補充例如L-谷氨酰胺等氨基酸，鹽，例如兩性霉素B(Fungizone⑧)，青霉素-鏈霉素等抗真菌或抗細菌劑，動物血清等等。細胞培養(yǎng)基可任選為無血清。本發(fā)明還提供了作為疫苗有用的載體。所述免疫原或抗原可存在于腺病毒衣殼中，作為選擇，所述抗原可以由導入于重組腺病毒基因組并由所述有創(chuàng)造力的腺病毒攜帶的抗原或免疫原所表達。該腺病毒載體可以提供任何目的抗原或免疫原。本文也對免疫原的例子給出了詳述。載體包括表達控制序列，例如復制起點(可以為細菌起點，例如來源于細菌栽體，如pBR322,或真核起點，例如自主復制序列(ARS)),啟動子，增強子和必要的信息加工位點，例如核糖體結(jié)合位點，RNA剪接位點，聚腺苦?；稽c，包裝信號和轉(zhuǎn)錄中止序列。例如，本發(fā)明的重組腺病毒載體可含有適當?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯控制信號和聚腺苷?；盘?例如，來源于牛生長激素的聚腺苷酰化信號，SV40聚腺苷?；盘?，它們與要導入到靶細胞中的抗原或免疫原序列可操縱地連接。大量啟動子/增強子元件可被使用，這取決于所需的水平和組織特異性表達。所述啟動子可以是組成型的或可誘導型的(例如，金屬硫蛋白啟動子)，這取決于所需要的表達的模式。所述啟動子可以是自身的或異源的，可以是天然的或是合成的序列。異源是指在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域所導入到的野生型宿主中沒有發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。挑選出能夠在靶細胞或目的組織中發(fā)揮作用的啟動子。腦特異性，肝特異性和肌肉特異性(包括骨骼肌，心肌，平滑肌和/或橫膈膜特異性)啟動子也包含于本發(fā)明中。哺乳動物和禽啟動子也是優(yōu)選的。所述啟動子優(yōu)選可為"早期"啟動子。"早期"啟動子在本領(lǐng)域中已知，并且被定義為驅(qū)使基因在缺少蛋白質(zhì)重新合成下快速且瞬間表達的啟動子。該啟動子也可以是"強"或"弱"啟動子。術(shù)語"強啟動子"和"弱啟動子"在本領(lǐng)域中已知，而且由啟動子處的轉(zhuǎn)錄起始(每分鐘的次數(shù))的相對頻率所定義。"強"或"弱"啟動子可以由它對RNA聚合酶的親和性來定義。更優(yōu)選的是，所述抗原或免疫原與例如，人細胞巨化病毒(CMV)主要即時早期啟動子，猿病毒40(SV40)啟動子，P-肌動蛋白啟動子，白蛋白啟動子，延伸因子l-a(EFl-a)啟動子，PyK啟動子，MFG啟動子或勞斯肉瘤病毒啟動子操作性相聯(lián)系。其它表達控制序列包括源于免疫球蛋白基因，腺病毒，牛乳頭狀瘤病毒，皰瘆病毒等等的啟動子。除了任意禽病毒啟動子之外，任意哺乳動物病毒啟動子也可用于實施本發(fā)明。在病毒來源的禽啟動子中，傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的即時早期(即，ICP4,ICP27)基因的啟動子，馬雷克病病毒，(即，gB,gC,pp38,ppl4,ICP4,Meq)或火雞的皰滲病毒的(即，gB,gC,ICP4)的早期(即，胸普激酶，DNA解旋酶，核糖核苷酸還原酶)或晚期(即，gB,gD,gC，gK)基因的啟動子可以在本發(fā)明和載體中使用。而且，選擇一種以足夠高的水平表達目的抗原或免疫原以誘導或引起對該抗原或在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)，不需要過度的試驗。已經(jīng)考慮到的是，用CMV啟動子驅(qū)動異源的核苷酸轉(zhuǎn)錄可在免疫活性的動物中導致表達的下調(diào)(參見，例如Guo等人，1996)。因此，將抗原或免疫原序列與例如不會產(chǎn)生抗原或免疫原表達的下調(diào)的改良的CMV啟動子可4喿縱地連接也是優(yōu)選的。本發(fā)明的載體還可以包括多連接子或多克隆位點("MCS"),它們可有利地位于啟動子的下游。所述多連接子提供了一個與啟動子序列一起位于"框內(nèi)"的用于插入抗原或免疫原分子的位點，使得將啟動子序列"可操縱地連接"到目的抗原或免疫原上。多克隆位點和多連接子對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。這里所使用的術(shù)語"可操縱地連接"是指所描述的元件處于允許它們以它們預(yù)期的方式行使功能的關(guān)系中。取決于載體，當用于在體外擴增和純化重組載體時，編碼抗生素抗性的選擇性標記可出現(xiàn)，并位于在商業(yè)上可獲得的AdEasy，AdEasier和AdHigh腺病毒系統(tǒng)中，以監(jiān)控供體載體和腺病毒輔助載體之間的同源重組。這種AdEasy,AdEasier和AdHigh系統(tǒng)有助于供體載體和腺病毒輔助載體之間位于ITR序列的同源重組。每個載體都含有一種不同的抗生素抗性基因，而且通過雙重選擇可選擇表達重新組合的載體的重組體。能夠整合到本發(fā)明的載體中的這些抗生素抗性基因的例子，其中包括，但不限于氨千青霉素，四環(huán)素，新霉素，zeocin，卡那霉素，博來霉素，潮霉素，氯霉素。在有多于一個抗原或免疫原的實施方式中，所述抗原或免疫原序列可與單個上游啟動子和一個或多個下游內(nèi)部核糖體進入部位(IRES)序列可操縱地連接(例如，小核糖核酸病毒EMCIRES序列)。在抗原或免疫原序列要在耙細胞中被轉(zhuǎn)錄然后翻譯的本發(fā)明的實施方式中，特定的起始信號是插入的蛋白質(zhì)編碼序列的有效翻譯通常所需要的。這些異源翻譯控制序列，可以是各種來源的，可以是天然的和合成的，其包括ATG起始密碼子和鄰近序列。任意來源于禽病原體的禽抗原或免疫原可被用于本發(fā)明的方法和重組載體中。優(yōu)選的抗原或免疫原，其中包括，但不限于源于禽流感病毒的抗原或免疫原，例如血凝素，神經(jīng)氨酸酶，基質(zhì)和核蛋白質(zhì)抗原或免疫原，傳染性嚢病病毒抗原，例如VP1,VPlsl,VPls2,VP2(Heine,H.G.等人,1991;Dormitorio，T.V等人，1997;和Cao，Y.C.等人，1998),VP2S,VP3,VP4，VP4S和VP5,如胸苷激酶，gA,gB,gC,gD,gE,gH，gl和gL等馬雷克病病毒抗原(Coussens等人1988);Ross等人1989);Ross等人1991);國際公開號WO90/02803(1990);Brunovskis和Velicer,1995);和Yoshida等人1994),包括gA,gB,gD,gE,gl和gG在內(nèi)的皰滲病毒例如傳染性喉氣管炎病毒抗原(Veits,J.等人2003),刺突糖蛋白，完整的膜蛋白質(zhì)M,小膜蛋白質(zhì)E和聚蛋白質(zhì)(Casais,R.等人2003)等禽傳染性支氣管炎病毒抗原，衣殼，sigmaNS，sigmaA,sigmaB和sigmaC蛋白質(zhì)等禽呼腸孤病毒抗原(Spandidos,D.A.等人，1976)，例如胸苷激酶等包括禽痘，鳥痘，金絲雀痘，鴒痘，鵪鶉痘在內(nèi)的痘病毒和dovepox抗原，VP1,VP2,VP3和VP4等禽多瘤病毒抗原(Rott，O.等人1988)，例如HN,P,NP,M,F和L蛋白質(zhì)等新城疫病毒抗原(Alexander,DJ.中綜述，1990),禽肺病毒抗原SH,F,G和N(Seal,B.S.，2000),例如糖蛋白，基質(zhì)，融合和核衣殼等禽鼻氣管炎病毒抗原(Cook,J.K.,1990)，例如p29,被膜，gag,蛋白酶，和聚合酶等禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒抗原(Dornburg,R.1995),包括禽癌病毒在內(nèi)的禽逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原gag,pol,和env,禽內(nèi)源病毒gag,pol,env,衣殼和蛋白酶(Rovigatti,U.G.等人，1983)，禽成紅血細胞增多癥病毒gag,erbA,erbB(Graf，T.等人，1983),禽肝炎病毒核心蛋白質(zhì)pol和表面蛋白質(zhì)(Cova,L.等人，1993),禽貧血癥病毒VP1,VP2,VP3(Rosenberger,J.K.等人，1998),禽腸炎病毒抗原-聚合酶，52K蛋白質(zhì)，penton,IIIa和核心蛋白質(zhì)(Pitcovski,J.等人，1988),帕切科病病毒IE蛋白質(zhì)，糖蛋白K,解旋酶，糖蛋白N,VP11-12,糖蛋白H，胸苷激酶，糖蛋白B和核磷蛋白(KaletaE.F.,1990),禽白血病病毒抗原-;^皮膜，gag和聚合酶(Graf，T.等人，l978),禽細小病毒，如NSPl,NSP2，NSP3，NSP4,VP1,VP2，VP3,VP4,VP5,VP6和VP7等禽輪狀病毒抗原(Mori,Y.等人，2003;Borgan,M.A.等人，2003)，例如被膜，gag和聚合酶等禽造血細胞組織增生病毒抗原(Bieth,E.等人，1992);禽肌腱膜纖維肉瘤病毒(Kawai,S.等人,1992),禽成髓細胞瘤病毒抗原p15，p27,被膜，gag和聚合酶，核衣殼和gs-b(Joliot,V.等人,1993),禽成髓細胞瘤相關(guān)病毒(Perbal,B.,1995),禽髓細胞瘤病病毒(Petropoulos，C丄，1997)，例如p19和被膜等禽肉瘤病毒抗原(Neckameyer,W.S.等人，1985),和禽脾壞死病毒gag,被膜和聚合酶(Purchase,H.G.等人，1975)。斯德菌(Pasteurellamultodda)菌林的細菌抗原，例如39kDa嚢狀蛋白質(zhì)(AIi,H.A.等人，2004;Rimler，R.B.2001),16-kDa外膜蛋白質(zhì)(Kasten，R.W.，等人，1995),脂多糖(Baert,K.等人,2005),大腸桿菌，例如l型菌毛，P菌毛和curli(Roland,K.等人，2004);Fl菌毛粘附素，P菌毛粘附素，氣桿菌素(aerobactin)受體蛋白質(zhì)和脂多糖(Kariyawasam，S.等人，2002),雞敗血枝原體(Mycoplasmagallisepticum),例如主要膜抗原pMGA(已知為P67;Jan,G.等人，2001;Noormohammadi,A.H.等人，2002a),TM-I(Saito,S.等人，1993)，粘附素(Barbour,E.K.等人,1989),P52(Jan,G.等人，2001)血清平板凝集(SPA)抗原(Ahmad,I.等人，1988),雉枝原體(Mycoplasmagallinaceum)，雞枝原體(Mycoplasmagallinarum)，火雞枝原體(Mycoplasmagallopavonis),關(guān)節(jié)液枝原體(Mycoplasmasynoviae),包括例如主要膜抗原等抗原MSPB(Noormohammadi,A.H.等人，2002b)和165-kDa蛋白質(zhì)(BenAbdelmoumen,B.等人，1999)，吐綬雞枝原體(Mycoplasmameleagridis),衣阿華枝原體(Mycoplasmaiowae),小雞枝原體(Mycoplasmapullorum),摹仿枝原體(Mycoplasmaimitans),腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)例如鞭毛蛋白，(膜)孔蛋白(porins),OmpA,SEF21和SEF14菌毛(Ochoa-Reparaz,J.等人，2004)，例如表達SEF14和SEF21等的侵害性沙門氏菌(Gallinarum)和鼠傷害沙門氏菌(Typhimurium)等腸沙門氏菌(Salmonellaenterica)血清變型(Li，W.等人，2004)，空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni),例如鞭毛蛋白，67國kDa抗原，CjaA,CjaC,和CjaD蛋白質(zhì)(Widders,P.R.等人，1998;Wyszynska，A.等人，2004),富l)雞嗟血菌(Haemophilusparagallinarum)例如血清群A,B和C抗原如血凝素(Yamaguchi,T.等人，1988)，鴨痘立默氏菌(Riemerellaanatipestifer),例如疫苗抗原(Higgins,D.A.等人，2000),鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci)菌抹例如血清變型A和6B并表達例如主要外膜蛋白質(zhì)(MOMP)(Vanrompay,D.等人，1999),包括66-64kDa蛋白質(zhì)抗原的朱紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)(Timoney,J.F.等人，1993),紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixinsidiosa)例如菌苗(Bigland，CH.andMatsumoto，JJ.,1975),流產(chǎn)布魯氏菌(Brucellaabortus),例如抗原P39和細菌鐵蛋白(bacterioferrin)(Al德riri，A.等人，2001),鵝疏螺旋體(Borreliaanserina)例如22-kDa主要外表面蛋白質(zhì)(Sambri,V.等人，1999),外膜蛋白質(zhì)P66(Bunikis,J.等人，1998)和OspC(Marconi，R.T.等人,1993)，糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis),糞便鏈球菌(Streptococcusfaecalis),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。本發(fā)明還包括源自禽原生動物抗原的免疫原/抗原，其中，例如，但不限于堆形艾美耳球蟲(Eimeriaacewulina)如3-IE抗原(Lillehoj,H.S.等人，2005;Ding,X.等人，2004),頂復體抗原(Constantinoiu,CC.等人，2004)和乳酸脫氫酶(Schaap,D.等人，2004),巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)例如gam56和gam82(Belli,S丄等人，2004),56和82kDa抗原蛋白質(zhì)(Belli,S丄等人,2002)和EmTFP250(Witcombe,D.M.等人,2004),毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)例如35-kD蛋白質(zhì)(Tajima,O.等人，2003)，柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)例如TA4和S07基因產(chǎn)品(Wu，S.Q.等人，2004;Pogonka，T.等人，2003)和12-kDa亂嚢壁蛋白質(zhì)(Karim,MJ.等人，1996),Eimeriavermiformis,腺型艾美耳J求蟲(Eimeriaadenoeides),卡氏《主白細月包蟲(Leucocytozooncaulleryi)例如R7外膜抗原(Ito,A.，等人，2005),鳥癡疾(Plasmodiumrelictum),雞癡原蟲(Plasmodiumgallinaceum)例如CSP蛋白質(zhì)(Grim,K.C.等人，2004)和17-和32-kDa蛋白質(zhì)抗原(Langer，R.C.等人，2002),和長癡原蟲(Plasmodiumelongatum)。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式使用禽流感病毒抗原或免疫原。本發(fā)明還提供了一種表達各種禽抗原或免疫原的重組載體，例如，以單次注入可保護禽類抵抗多種禽疾病的多價疫苗或免疫原性組合物。禽流感病毒被傳播到人，豬，馬，甚至海洋哺乳動物，其成為對于人流感大流行的出現(xiàn)的關(guān)鍵因素。流感病毒屬于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，基于它們的核蛋白質(zhì)(NP)和基質(zhì)(M1)蛋白質(zhì)中的抗原性區(qū)別被分類為A,B和C。AU禽流感病毒^皮分類為A。而且，亞型是基于兩種表面糖蛋白，血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性。目前，15HA和9NA亞型在流感A病毒中被鑒定(Murphy,B.R.等人，1996;Rohm,C.等人，1996b)。Hal區(qū)域的氨基酸序列，其負責HA抗原性，其在亞型與亞型的差異有30%或更多(Rohm，C.等人，1996b)。結(jié)果所有HA和NA亞型的病毒在禽類中被發(fā)現(xiàn)，哺乳動物流感病毒的病毒亞型是有限的。禽流感A病毒是通過它們的毒性被定義的能引起禽疫的高毒性型和通常只引起輕度疾病或無癥狀感染的無毒性型。在極少情況下，然而，在實驗室有低病原性的病毒在野生引起嚴重疾病的暴發(fā)。盡管如此，與這些病毒相關(guān)的患病率和死亡率往往比由致命病毒引起的患病率和死亡率更4氐。高毒性禽流感病毒已經(jīng)在如下國家的家禽中引起暴發(fā)澳大利亞(1976[H7](Bashiruddin,J.B.等人，1992);1985[H7](Cross,G.M.,1987;Nesto歸icz,A.等人,1987),1992[H7](Perdue,MX.等人,1997)，1995[H7],and1997[H7]),英國(1979[H7](Wood,G,W.,等人，1993)和1991[H5](Alexander,DJ.等人,1993),美國(1983to1984[H5](Eckroade,RJ.等人，1987)，Ireland(1983to1984[H5])(Kawaoka,Y.等人，1987),德國(1979[H7](Rohm,C.等人，1996a),Mexico(1994to1995岡(Garcia,M.等人，1996;Horimoto，T.等人，1995)，巴基斯坦(1995[H7](Perdue,MX.等人，1997),意大利(1997[H5])和香港(1997[H5](Claas,EJ.等人，1988)。并不希望^f皮任何理論限制，據(jù)信所有的病原性禽流感A病毒為H5或H7亞型，盡管該亞型特異性的理由仍然不為人知。NA亞型與毒性病毒似乎沒有聯(lián)系。另外兩種亞型，H4[A/Chicken/Alabama〃395/75(H4N8)](Johnson,D.C.等人，1976)和H10[A/Chicken/Germany/N/49(H10N7)],已經(jīng)從處于嚴重的類禽疫暴發(fā)中的雞中^皮分離出來。流感A病毒十分相似(Lamb,R.A.等人，1996)。通過電子顯微鏡，該病毒為多晶，包括一般為球形(直徑大約為120nm)和絲狀的病毒粒子。刺突的兩種完全不同的類型(長度大約為16nm),相應(yīng)于HA和NA分子，存在于病毒粒子的表面。這兩種糖蛋白通過疏水性氨基酸的短序列(跨膜區(qū)域)錨定在源于宿主細胞的原生質(zhì)膜的脂類被膜上。HA是I類糖蛋白，含有一個N-末端胞外(結(jié)構(gòu))域(ectodomain)和一個C-末端錨，而NA是II類糖蛋白，其含有一種N-近端的錨和一個C-末端的胞夕卜(結(jié)構(gòu))域(ectodomain)。HA使得病毒粒子依附到細胞表面唾液酸4氐聚糖(sialyloligosaccharides)(Paulson,J.C.,1985),并且負載其紅血球凝聚活性(Hirst,G.K.,1941)。HA引出在抗感染的保護中十分重要的病毒-中和抗體。NA是一種唾液酸酶(Gottschalk,A.,1957),其通過清除細胞和病毒粒子表面唾液酸(sialyloligosaccharides中由HA識別的初級基序)來防止病毒粒子聚集(Paulson,J.C,1985)。NA的抗體在保護宿主方面也十分重要(Webster,R.G.，等人，l988)。除了HA和NA之外，有限數(shù)量的Ml蛋白質(zhì)被整合到病毒粒子中(Zebedee,S.L.等人，1988)。它們形成四聚物，具有HI離子通道活性，并且，當在內(nèi)涵體中^:低pH激活時，使病毒粒子的內(nèi)部酸化，有助于其脫殼(Pinto,L.H.等人，1992)。位于被膜內(nèi)的Ml蛋白質(zhì)被認為在裝配和出芽中起作用。單鏈RNA分子的八個片段(反義或互補于mRNA)包含于病毒的被膜中，與NP和病毒聚合酶的三個亞基相聯(lián)系(PB1,PB2和PA)，一起形成一種參與RNA復制和轉(zhuǎn)錄的核糖核蛋白(RNP)復合體。NS2蛋白質(zhì)，現(xiàn)已知存在于病毒粒子中(Richardson,J.C.等人，1991;Yasuda,J.等人，1993),被認為通過與Ml蛋白質(zhì)(Ward，A.C.等人，1995)的相互作用在RNP從細胞核向外輸出中起作用(O'Neill,R.E.等人，1998)。NS1蛋白質(zhì)，流感A病毒唯一的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)有許多功能，包括剪接的調(diào)節(jié)，細胞mRNA的細胞核輸出和翻譯的刺激(Lamb,R.A.等人，1996)。據(jù)信其主要的功能為抵抗宿主的干擾素活性，由于敲除了NSl的病毒盡管在非干擾素缺陷細胞中沒有母代病毒生長有效，但仍可存活(Garcia-Sastre,A.等人，1988)。本發(fā)明中有用的禽流感免疫原或抗原包括但不限于HA,NA和Ml,NS2,和NS1。特別優(yōu)選的禽流感免疫原或抗原為HA和NA。所述禽流感免疫原或抗原可源自AI的任意已知菌抹，包括所有的禽流感A菌抹，臨床分離物，野生分離物和其重配(reassortments)。這些菌抹和亞型的例子包括但不限于H10N4,H10N5,H10N7，H10N8,H10N9,H11N1,H11N13,H11N2,H11N4，H11N6,H11N8,H11N9,H12N1,H12N4，H12N5,H12肌H13N2,H13N3,H13N6,H13N7，H14N5，H14N6,H15N8,H15N9,H16N3,H1N1,H1N2,H1N3，H1N6，H2N1,H2N2，H2N3,H2N5,H2N7,H2N8,H2N9，H3N1，H3N2,H3N3,H3N4,H3N5,H3N6,H3N8,H4N1,H4N2，H4N3,H4N4,H4N5,H4N6，H4N8,H4N9，H5N1,H5N2,H5N3，H5N7,H5N8,H5N9,H6N1，H6N2,H6N4,H6N5,H6N6,H6N7,H6N8,H6N9，H7N1,H7N2,H7N3,H7N5,H7N7，H7N8，H8N4,H8N5,H9N1,H9N2,H9N3，H9N5,H9N6,H9N7,H9N8和H9N9。本發(fā)明還涉及被突變的或改變的禽流感免疫原或抗原，其中，所述禽流感免疫原或抗原反映抗原性漂移和抗原性轉(zhuǎn)變。流感病毒的抗原性通過點突變(抗原性漂移)逐步改變或者通過基因重配(reassortment)(抗原性轉(zhuǎn)變)徹底改變(Murphy,B.R.等人，1996)。對HA和NA的免疫壓力被認為驅(qū)動抗原性漂移。非人流感病毒對人的直接傳播或感染同一細胞的兩種不同的流感病毒的基因的重配(reassortment)均可引起抗原性轉(zhuǎn)變(Webster，R.G等人，1982)。理論上，所述病毒的8種不同的基因片段的移動(shuffling)可產(chǎn)生256種不同的RNA組合。在實驗室條件下在體外和在體內(nèi)，基因重配(reassortment)(Webster，R.G.等人，l975)都有案可查。更重要的是，相對而言，混合感染常常出現(xiàn)在自然界中，并且會引起基因重配(reassortment)，產(chǎn)生新的野生(fields)分離物，雜合形式或重S己(reassortant)形式(Bean，WJ.等人，1980;Hinshaw,VS.等人，1980;Young,J.F.，等人，1979)。之前流行的病毒的再次出現(xiàn)是另一種機制，通過該機制抗原性轉(zhuǎn)變可能出現(xiàn)。因此，本發(fā)明也關(guān)注于經(jīng)歷了抗原性漂移或抗原性轉(zhuǎn)變的禽流感免疫原或抗原的用途，包括禽流感的臨床分離物，禽流感的野生或環(huán)境分離物，禽流感的雜合形式和重配(reassortant)形式。而且，本發(fā)明包括本發(fā)明所公開的載體和方法中的多于一種的禽流感免疫原或抗原的用途，所述免疫原或抗原以獨立的重組載體或在同一重組載體中進行遞送以便提供一種刺激或調(diào)節(jié)針對一種或多種禽流感菌林和/或雜種(hybrids)的免疫反應(yīng)的多價禽流感疫苗或免疫原性組合物。許多馴養(yǎng)的和野生的禽類受到流感病毒感染。它們包括雞，火雞，鴨，珍珠雞，家鵝，鵪鵓，野雞，山鵓，八哥，雀形目鳥，鸚鵡，相思鸚鵡，鷗，shorebirds,海鳥和鴯鹋(Easterday,B.C.等人，1997;Webster，R.G.等人，1988)。一些被感染的鳥類出現(xiàn)流感的癥狀，而其它的卻沒有。在馴養(yǎng)的禽類中，火雞最常涉及于流感暴發(fā)中；雞也涉及其中，但頻率卻低些。禽流感A病毒在鳥類中產(chǎn)生一系列癥狀，由無癥狀到輕微的上呼吸道感染到蛋產(chǎn)量的損失，再到快速致死的系統(tǒng)性疾病(Eckroade,RJ.等人，1987)。疾病的嚴重性取決于多種因素，包括病毒的毒性，免疫狀況和伴隨著細菌感染和施加于宿主的壓力宿主的飲食。取決于在雞和火雞中的它們的病原性，禽流感A病毒被分類為劇毒(能夠引起禽疫)或無毒(引起輕度或無癥狀的疾病)。甚至當對一種禽類具有高病原體性時，流感A病毒不可能對另的禽類具有病原性(Alexander,DJ.等人，1986)。例如，鴨子通常對在雞中致命的病毒具有抗性。作為另一個例子，很容易殺死雞和火雞的A/火雞/愛爾蘭/1378/85(H5N8)在鴨子中卻不會引起疾病癥狀，盡管如此，它還是會在被感染的鳥類的許多內(nèi)部器官和血中被檢測到(Kawaoka,Y.等人，1987)。流感病毒由腸道被分泌到被感染的鳥類的糞便中(Kida,H.,等人，1980;Webster,R.G.等人，1978)。其傳播方式可以是直接的或間接的；它們包括與氣溶膠和其它病毒污染物質(zhì)接觸。由于被感染的烏類在它們的糞便中分泌大量病毒，許多不同的物質(zhì)都會被污染(例如，食物，水，裝置和籠子)并有助于病毒的傳播。水源傳播可提供一種使禽流感病毒在天然的水禽棲息地一年一年地永存下去的機制。由商售的禽類所證明的典型的體征和癥狀，例如受高病原性的禽流感病毒感染的家禽的體征和癥狀包括蛋量減產(chǎn)，呼吸病征，水泡音，過度流淚，竇炎，無毛皮膚的青紫(尤其是肉冠和垂肉)，頭和臉的水腫，褶的羽毛，腹瀉，和神經(jīng)系統(tǒng)混亂。出現(xiàn)的特征的數(shù)量取決于鳥類的種類和年齡，病毒的毒林和伴隨的細菌感染(Easterday,B.C.等人，1997;Webster,R.G,等人，1988)。偶爾，烏也會不出現(xiàn)任何疾病病征地死亡(Alexander,DJ.等人，1993;Wood,G.W.,等人，1994)。被注射了高病原性病毒的雞的肉眼損傷和組織學損傷十分相似，但并沒有顯示出某種菌抹變異(Alexander,DJ.等人，1986;Mo,LP.等人，1997;Swayne,D.E.等人，1997)。所報道的案例間的一些差異可反映實驗條件中的差異，包括接種路線，雞的品種和年齡以及病毒的劑量。微脈管內(nèi)皮的膨脹，系統(tǒng)性充血，多灶性出血，血管周圍的單核細胞滲透和血栓形成通常在被高毒性病毒感染的雞中^f皮觀察到。這些病毒在脈管內(nèi)皮和血管周圍薄壁組織細胞中有效復制，這是一種可能對病毒傳播和系統(tǒng)性感染十分重要的性質(zhì)(Kobayashi,Y.等人,1996;Suarez,D丄.等人，1998)。除了其它器官中的有壞死變化和炎性變化的細胞之外，病毒抗原也可以在壞死的心肌細胞中被發(fā)現(xiàn)(Kobayashi,Y.等人，1996)。本發(fā)明還涉及在細胞中表達一種或多種抗原或免疫原的方法。作為實驗室設(shè)置的初步步驟，抗原或免疫原可以由編碼蛋白質(zhì)和肽的異源的核苷酸序列所替代，所述核普酸序列包括編碼報告蛋白質(zhì)(例如，酶)的核苷酸序列。報告蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域中已知，其包括但不限于綠色熒光蛋白質(zhì)，P-半乳糖苦酶，|3-葡糖普酸酶，焚光酶，堿性磷酸酶和氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因。許多這種報告蛋白質(zhì)以及它們檢測的方法都作為許多商售的診斷試劑盒的一部分包括于其中。目的抗原或免疫原可編碼一種反義核酸，小干護LRNAs(siRNAs),核酶或其它非翻i奪RNAs,例如"向?qū)В?，RNAs(Gorman等人，1998)等等。本發(fā)明的重組載體和方法還包括可倚賴于重組載體或免疫原性組合物的遞送調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)或佐劑分子的用途。這些治療性蛋白質(zhì)或佐劑分子可包括但不限于免疫調(diào)節(jié)子，例如白細胞介素，干擾素和共刺激分子。本領(lǐng)域已知的在禽類個體中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的禽細胞因子為雞干擾素-a(IFNa)(Kamca，K.等人，1998;Schijns，V.E.等人，2000),雞干擾素-Y(IFNY)，雞白細胞介素-l卩(CWL-l卩)(Kamca,K.等人，1998),雞白細胞介素-2(ChlL畫2)(Hilton,L.S.等人，2002),和雞骨髓-單核細胞生長因子(cMGFlYork,JJ.等人，1996;Djeraba，A.等人，2002)。免疫調(diào)節(jié)分子可以與有創(chuàng)造力的免疫原性組合物一同給藥，或者作為選擇，免疫調(diào)節(jié)分子的核酸可以在本發(fā)明的重組載體中與禽免疫原或抗原一起共表達。所述異源序列的受試個體中的表達，即禽流感免疫原，可在個體的本發(fā)明的重組載體可以在免疫組合物或疫苗中被使用從而提供一種引起免疫反應(yīng)的方式，該免疫反應(yīng)可以是保護性免疫但并不必須是保護性免疫。本發(fā)明上下文中所使用分子生物學技術(shù)已由Sambrook等人(2001)描述。作為另一種選擇，或是額外的，本發(fā)明所包含的免疫原性或免疫組合物中，編碼抗原或免疫原的核苦酸序列可以在編碼跨膜區(qū)域的部分中有所刪除。然而，作為另一種選擇，或是額外的，所述載體或免疫原性組合物可再含有一種編碼例如人或禽tPA這樣的異源tPA信號序列的核苷酸序列和/或一種穩(wěn)定化的例如兔P-珠蛋白基因的內(nèi)含子II這樣的內(nèi)含子，并在宿主細胞中進行表達。本發(fā)明還提供了一種在體外或在體內(nèi)將異源核苷酸序列傳輸和/或施加到細胞內(nèi)的方法。根據(jù)該方法，細胞^皮本發(fā)明的重組人腺病毒載體所感染(如本文詳細描述的)。該細胞可以通過病毒轉(zhuǎn)導的自然過程被所述腺病毒載體感染。作為選擇，所述載體可通過本領(lǐng)域中其它已知的方法纟皮導入到細胞中。例如，該細胞可以與目的腺病毒載體(如下文所述)接觸，并被另一種交替的機制所吸收，例如，由受體介導的內(nèi)吞作用。作為另一種實施例，采用一種抗體或其它結(jié)合蛋白質(zhì)，該載體可^L耙向于一種內(nèi)在化的細胞表面蛋白質(zhì)上。載體可以以能夠?qū)崿F(xiàn)基因產(chǎn)品(例如，表位，抗原，治療劑和/或抗體)組合物所指的量施加到禽類個體中。當然，本發(fā)明面對上下文中所舉例的劑量，對于任何要施加給禽個體的組合物，包括其成分，對于任何特殊的施加方法，優(yōu)選測定毒性，例如通過測定合適的禽模型中的致命劑量(LD)和LD50;并且，確定引起適當?shù)姆磻?yīng)的組合物的劑量，其中成分的濃度和施加組合物的時機的選擇，例如通過血清滴定法及其分析，例如通過ELISA和/或血清中和(seroneutralization)分析。這些測定不需要超出本領(lǐng)域技術(shù)人員的實驗，這種公開的內(nèi)容和文件都引入本文。本發(fā)明的組合物的例子包括用于孔(口)或粘膜的，例如口腔，鼻，肛門，陰道的，經(jīng)口的，胃內(nèi)給藥的等液體制劑，例如懸浮液，溶液，噴霧劑，糖漿劑或酏劑；和用于腸胃外，皮膚外(epicutaneous),皮下(即，通過下頸)，皮內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)(即，通過翅-蹼，翅尖，胸和大腿肌肉組織穿刺)，鼻內(nèi)或靜脈給藥(例如，可注射的給藥)的制劑，例如無菌懸浮液或乳劑。本申請涉及于2004年4月6日出版的美國專利第6,716，823號；于2004年3月16日出版的美國專利第6,706,693號；2002年2月19日出版的美國專利第6,348,450號；美國申請系列號10/052,323和10,116,963;和10/346,021,這些內(nèi)容都并入本文作為參考，這些文獻公開了通過遞送的非侵害性方式進行的免疫原性或疫苗組合物的免疫和遞送，也就是皮膚外和鼻內(nèi)給藥。對禽類的給藥和遞送的其它方法包括在飲用水或水中投放重組載體或免疫原性組合物，其中疫苗的劑量可選自1(^至ioV動物之間。對于肌肉內(nèi)注射，給藥可發(fā)生在胸部(pectoral),腿(大腿上部/橫側(cè)腹肌肉組織)，翅-蹼(翼膜)，翅下(腋窩)和翅尖。所使用的針的長度和直徑(標準尺)應(yīng)該是能夠使得疫苗遞送導所選擇的肌肉的中心的長度和直徑。給藥的一種特別有效的方法為卵內(nèi)遞送(Gildersleeve,R.P.,1993a;Gildersleeve，R.P.等人，1993b;Sharma，J.M.,1985;Sharma,J.M.等人，1984)。卵內(nèi)遞送作為一種用于禽類的大量免疫的有前景的方法，正在興起。這是因為以均一劑量的疫苗通過機器注射器進行給藥既省勞動力又省時間(Johnstonetal，1997;Oshopetal,2002)。迄今為止，超過80%的美國大批生產(chǎn)的肉用仔雞在卯內(nèi)經(jīng)機械注射器處理以對抗馬雷克病(Wakenell等人，2002)。該方法也^皮越來越多地采用來給藥傳染性囊病(IBD)和新城疫(ND)疫苗。在雞中DNA疫苗的卵內(nèi)遞送也引起免疫反應(yīng)(Kapczynski等人，2003;Oshop等人，2003)和一種復制性的a病毒-載體化的疫苗(Schultz-Cherry等人，2000)。與它們的復制對應(yīng)物相比，DNA和病毒載體化的卵內(nèi)疫苗和免疫原性組合物不太可能殺死或傷害胚胎，特別是，Ad載體由于它們不能在卵內(nèi)復制因此具有更高的堅持服藥率。機械化的系統(tǒng)，裝置和設(shè)備，例如像INOVOJECT⑧這樣的商業(yè)上可獲得的機械化的系統(tǒng)，裝置和設(shè)備，緩緩地以精確測定的量注射化合物，疫苗和免疫原性組合物而不對發(fā)育的胚胎引起創(chuàng)傷，從而通過自動化和減少活禽生產(chǎn)成本，減少雞的管理，提高孵卵所的易管理性。INOVOJECT⑧和其它機械化的系統(tǒng)，裝置或設(shè)備，通過以下方式進行運作將注射頭緩緩降低到蛋的頂部，一個小直徑的空心沖頭在蛋殼上鉆開一個小孔。針通過管下降到被控制的深度(通常2.54cm),將預(yù)先確定體積的少量疫苗，免疫原性組合物或化合物遞送到胚胎中，然后針被抽出，并在滅菌洗滌劑中進行清洗。在卵內(nèi)遞送疫苗和基因的方法可以在下列文獻中找到美國專利第4,458,630號；RE35973;6,668,753;6,601,534;6,506,385;6,395,961;6,286,455;6,244,214;6,240,877;6,032,612;5,784,992;5,699,751;5,438,954;5,339,766;5,176，101;5,136,979;5,056,464;4,903,635;4,681,063;于2003年10月16日提交的美國申請系列號10/686,762;于2002年8月9日提交的10/216,427;于2002年2月13日提交的10/074/714;和于2002年1月9日提交的10/043,025,這些內(nèi)容都明確地并入本文作為參考。因此，本發(fā)明包括一種用于對本文所描述的重組載體疫苗或免疫原性組合物進行卵內(nèi)遞送或給藥的設(shè)備或裝置。該裝置或設(shè)備任選可包括本發(fā)明的重組人腺病毒載體或免疫原性組合物，即可以預(yù)先載有用于對禽類進行卵內(nèi)給藥的載體或免疫原性組合物。本發(fā)明還包括有創(chuàng)造力的組合物的連續(xù)給藥或所述方法的連續(xù)施行，例如有創(chuàng)造力的組合物的定期給藥，例如對某種狀況進行治療或處理期間和/或增大劑量給藥免疫組合物期間和/或最初的增強給藥法(prime-boostregimens)期間；且連續(xù)給藥的時間和方式不用過度試-驗就可確定。而且，本發(fā)明包括組合物以及制備和使用載體的方法，包括在體內(nèi)和/或體外生產(chǎn)基因產(chǎn)品和/或免疫制品和/或抗體的方法(例如，后兩者，舉例來說，在從經(jīng)按照本發(fā)明的給藥的宿主的細胞中分離出來后，例如在該細胞的隨意膨脹后)，以及這些基因和/或免疫制品和/或抗體的用途，包括在診斷，化^r,治療，處理等中的用途。通過將載體和一種合適的載體或稀釋劑混合配制載體組合物；同樣通過混合基因和/或免疫制品和/或抗體和一種合適的載體或稀釋劑配制基因產(chǎn)品和/或免疫制品和/或抗體組合物；參見例如美國專利第5,990,091號，WO99/60164,WO98/00166,它們所引用的文獻以及本文引用的其它文獻，以及本文的其它教導(例如，涉及載體，稀釋劑等等)。在這些組合物中，所述重組載體可以與一種合適的獸醫(yī)學或藥學上可接受的載體，稀釋劑或例如無菌水，生理鹽水，葡萄糖等等賦形劑混合。所述組合物也可以是被凍干的。根據(jù)所希望的給藥途徑和制備，所述組合物可含有輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑，pH緩沖劑，佐劑，膠化或粘度提高添加劑，防腐劑，增味劑，著色劑等等。已知DMSO提高疫苗和免疫原性組合物的效能，尤其是涉及載體或含有載體的免疫原性組合物的卵內(nèi)遞送。DMSO被認為增加細胞膜的滲透性提高來提高疫苗的效能(Osh叩等人，2003)。其它能夠滲透細胞的試劑或添加劑，減少羊水的粘性，并呈現(xiàn)比可用于疫苗或免疫原性組合物的配制的DMSO更高的堅持服藥率，尤其是通過卯內(nèi)遞送給藥時。已經(jīng)顯示出，許多蛋白質(zhì)的吸收，例如胰島素，leptin和生長激素，在鼻內(nèi)給藥后由于十四烷基麥芽糖苷(TDM)等表面活性劑而增加，且沒有明顯的副作用(Arnold,等人，2004)。本發(fā)明因而包括TDM在所述方法中使用以及這里所描述的組合物。含有0.125%TDM的配方能緩和細胞形態(tài)中的變化，而更高濃度的TDM(即0.5%)能夠瞬間引起更廣泛的變化。人們認為由于哺乳動物中的粘滯的鼻弟和含胚的禽蛋的羊水，TDM提高載體在卵內(nèi)的遞送。Arnold,等人(2004)所描述的TDM的安全分布(safetyprofile)對于提高被免疫禽類的健康和對進入食物鏈的適應(yīng)性特別有利。要給藥的載體的數(shù)量隨給藥個體和處理的條件而各不相同，就體重來說，每天可由一個或幾個微克變化至幾百個或幾千個微克，且疫苗或免疫原性組合物的劑量優(yōu)選在10M06噬斑形成單位(PFU)/鳥之間，優(yōu)選10、1()SpFU/鳥之間。對于注射，當在翅蹼給藥時，含有上述效價的疫苗，當用獸醫(yī)學上可接受的液體例如生理鹽水稀釋至終體積約為0.1ml或0.01ml。本發(fā)明的載體和方法使得卵內(nèi)接種和對1天大的小雞的接種以及更大的雞和成年雞的接種成為可能。載體可沒有侵害性地以能夠?qū)崿F(xiàn)基因產(chǎn)物(例如，表位，抗原，治療劑和/或抗體)組合物所需(statedfor)的量被給藥到禽類個體。當然，本發(fā)明關(guān)注于上文和下文這些列舉的劑量，對于任何要施加到禽類個體的包括其成分在內(nèi)的組合物而言，對于任何具體的給藥方法，優(yōu)選測定毒性，例如通過測定適當?shù)那蓊惸Ｐ椭械闹滤绖┝?LD)和LD50;和引起適當反應(yīng)的組合物的劑量，其成分的濃度以及施加組合物的時機，例如通過血清滴定法及其分析，例如通過ELISA和/或血清中和(seroneutralization)分析。這些測定不需要超出本領(lǐng)域技術(shù)人員的實驗，這種公開的內(nèi)容和文件都引入本文。重組載體可以以足以獲得相應(yīng)于本文描述的和或本文所引用的文獻中描述的劑量的體內(nèi)表達的合適量被給藥。例如，病毒懸浮液的適當范圍可以根據(jù)經(jīng)驗來確定。如果多于一種基因產(chǎn)物通過多于一種的重組體被表達，每種重組體可以以在這些量的范圍中被給藥；或者，每種重組體可以以組合的方式給藥，重組體的總量包括這些量。在本發(fā)明所使用的載體或質(zhì)粒組合物中，劑量可以是如本文引用的文獻中或本文所描述的或者本文所參考或引用的文獻的中所引用的文獻所描述的劑量。優(yōu)選的是，所述劑量應(yīng)當是足以引起與所述抗原直接存在的組合物相似的反應(yīng)的質(zhì)粒的量；或是具有與這些組合物中的劑量類似的表達的量；或具有與在體內(nèi)通過重組組合物獲得的表達類似的表達的量。然而，引起適當?shù)拿庖叻磻?yīng)的組合物的劑量，其成分的濃度和組合物的給藥時才幾，可以通過例如血清的抗體滴定法這樣的方法測定，例如通過ELISA和/或血清中和(seroneutralization)化驗分析。這些測定不需要超出本領(lǐng)域技術(shù)人員的實驗，這種公開的內(nèi)容和文件都引入本文。而且，連續(xù)給藥的時機也同樣用所述公開和現(xiàn)有技術(shù)中可確定的方法確定，不需要過度的實驗。本發(fā)明所關(guān)注的免疫原性或免疫組合物也可以含有佐劑。合適的佐劑包括fMLP(N-甲酰基-蛋氨?；?亮氨酰基-笨丙氨酸；美國專利第6,017,537)和/或丙烯酸或曱基丙烯酸聚合物和/或一種馬來酐和烯基衍生物的共聚物。丙烯酸或曱基丙烯酸聚合物可以是交聯(lián)的，例如與糖或多元醇的聚鏈烯基醚交聯(lián)。這些化合物以術(shù)語"卡波姆(carbomer)"的名義是已知的(Pharmeuropa,Vol.8,No.2,June1996)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以參考美國專利第2,909,462號(并入本文作為參考)，其討論了這種與含有至少3個羥基的多羥基化化合物交聯(lián)的丙烯酸聚合物在一種實施方式中，多羥基化化合物含有不超過8個羥基；在另一個實施方式中，至少三個羥基的氫原子被含有至少兩個碳原子的不飽和脂肪基替代；在另一個實施方式中，被含有約2-約4個碳原子的基團，例如乙烯基，烯丙基和其它烯鍵式不飽和基團替代。所述不飽和基團自身可含有其它取代基，例如曱基。這些產(chǎn)品的商品名為Carbopol(NoveonInc.,Ohio,USA),特別適于做為佐劑來使用。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇交聯(lián)，提到了產(chǎn)物Carbopol974P,934P和971P。至于馬來酐和烯基衍生物的共聚物，提到了EMA制品(Monsanto),其為馬來酐和乙烯的共聚物，可以是線性或交聯(lián)，例如與二乙烯基醚交聯(lián)。此外，還參考美國專利第6,713,068號和Regelson,W.等人，1960;并入本文作為參考)。美國專利第6,713,068描述了含有季銨鹽的陽離子脂類，該專利的內(nèi)容并入本文作為參考，這種含有季銨鹽的陽離子脂類也可以在本發(fā)明的方法和組合物中使用。在這些陽離子脂類中，優(yōu)選DMRIE(N-(2-羥基乙基)-N,N-二甲基-2,3-二(十四烷基氧基)-l-丙烷銨；WO96/34109),優(yōu)選的是，與一種中性脂類相聯(lián)系，優(yōu)選的是DOPE(二油酰基-磷脂酰-乙醇胺；BehrJ.P.,1994)以形成DMRIE-DOPE。重組疫苗或免疫原性或免疫組合物可以配制成水包油乳劑的形式。這種水包油乳劑可以基于例如輕液狀石蠟油(歐洲Pharmacopea型)；類異戊二烯油例如角鯊烷，角鯊烯，EICOSANETM或四十四烷；烯烴的低聚產(chǎn)生的油，例如異丁烯或癸烯；含有線性烷基的酸或醇的酯，例如植物油，油酸乙酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，丙三醇三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇的酯類，例如異硬脂酸酯。所述油優(yōu)選與乳化劑結(jié)合使用以形成乳劑。所述乳化劑可以是非離子型表面活性劑，例如山梨聚糖，二縮甘露醇(例如脫水甘露醇油酸酯)，甘油，聚甘油，丙二醇和油酸，異硬脂酸，荒麻油酸或羥基硬脂酸的酯，它們可任選地被乙氧基化，所述乳化劑可以是聚氧化丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，例如Pluronic⑧產(chǎn)品，例如L121。所述佐劑可以為乳化劑，微團形成劑和油的混合物，這種混合物可以以名為Provax(IDECPharmaceuticals,SanDiego,CA)獲得。表達一種或多種目的抗原或免疫原的重組腺病毒或重組腺病毒載體，例如根據(jù)本發(fā)明的栽體，可以以液體形式于5口，或者以冷凍干燥或凍千形式，在穩(wěn)定的存在下被保存和/或保藏和儲存。冷凍千燥可以按照已知的標準冷凍干燥程序進行。藥學上可接受的穩(wěn)定劑可以是SPGA(磷酸蔗糖谷氨酸白蛋白；Bovarnick，等人，1950),碳水化合物(例如，山梨醇，甘露醇，乳糖，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖，誨藻糖)，谷氨酸鈉(Tsvetkov,T.等人,1983;Israeli,E.等人,1993)，蛋白胨等蛋白質(zhì)，白蛋白或酪蛋白，含有脫脂奶等試劑的蛋白質(zhì)(Mills,CK.等人，1988;Wolff，E.等人，1990),和緩沖液(例如磷酸緩沖液，堿金屬磷酸緩沖液)?？墒褂米魟┖?或載體或賦形劑來使得凍干制品可溶。本發(fā)明可通過下述非限制性的實施例被進一步描述，這些實施例以說明本發(fā)明的各個實施方式的方式給出，并不意味以任何方式限制本發(fā)明。實施例實施例1:編碼A/Panama/2007/99HA的Ad載體的構(gòu)建流感病毒菌株，A/Panama/2007/99(H3N2)(SEQIDNOs:1,2)，是在2003-2004年間篩選出來用于疫苗生產(chǎn)的，由疾病控制中心(CentersforDiseaseControl)提供(CDC)。血凝素(HA)基因通過以下方式克隆逆轉(zhuǎn)錄流感RNA,然后用采用表1中的下述引物以聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增HA基因。表l:Ad載體構(gòu)建中使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>這些引物含有退火到A/Panama/2007/99HA基因的5'和3，端的序列，和對應(yīng)于緊挨著HA起始ATG密碼子的上游的真核核糖體結(jié)合位點的序列(Kozak,1986),和用于隨后的克隆的AT/wl位點。含有完整的HA基因的^/"1片段以正確的方向被插入到pShuttle-CMV的f/wl位點中(He等人，1998)(T.He提供)，處于人細胞巨化病毒(CMV)早期啟動子轉(zhuǎn)錄控制下。^使用一種如前人(Zeng等人，2001)所述的簡化的重組系統(tǒng)，在人293細胞中生產(chǎn)了編碼A/Panama/2007/99HA(AdPNM2007/99.H3)的E1/E3-缺陷型Ad5載體。通過對HA插入體和載體之間的5，和3'端連接進行測序，驗證AdPNM2007/99.H3載體的有效性。在鼻內(nèi)給藥AdPNM2007/99.H3后，抗A/Panama/2007/99的HI抗體在小鼠體內(nèi)引發(fā)。實施例2.通過在卵內(nèi)和肌肉內(nèi)注射重組Ad載體對雞進行免疫通過免疫接種人Ad-載體化的疫苗對雞進行的免疫迄今為止還沒有報道過。由于Ad5不能在鳥中自然發(fā)現(xiàn)，這種載體被認為無法感染雞細胞和/或在雞細胞中有效復制。令人驚訝的是，肌肉注射AdPNM2007/99.H3兩周后，在所有3只雞中均獲得了512的血清HI效價(圖1)。當將AdPNM2007/99.H3載體注射到9天大和18天大的含胚雞蛋時，前者的血清HI效價達到8和16,孵化后兩星期的后者中HI效價達到<4,4和8。該結(jié)果提示E1/E3-缺陷型人Ad5載體由于其轉(zhuǎn)染禽細胞的能力以及無法在禽細胞中復制，因此可用作禽類的疫苗載體。通過卵內(nèi)接種引發(fā)的相對低的HI效價可歸因于，其中，劑量和胚胎的階段。Ad5載體通過將其纖維結(jié)合到在雞細胞表面發(fā)現(xiàn)的柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR)可具有雞胚的轉(zhuǎn)化部分(Tan等人，2001)。因為Ad是一種能夠通過在內(nèi)化后破壞核內(nèi)體保護載體DNA的有效載體，因此在只轉(zhuǎn)導一部分細胞后，可引起免疫反應(yīng)(Curiel,1994)。此外，至少一種Ad組分，異己酮，具有高免疫原性，并給外源抗原提供佐劑活性(Molinier-Frenkel等人，2002)。將AdPNM2007/99.H3載體以200[mu]l的體積，5xlO"pfu/蛋的劑量分別注射到9天大(組l)和18天大(組2)含胚雞蛋的羊膜中。每組6個蛋；然而，組1中只孵化出兩只禽，組2只孵出3只禽。孵化后兩周以前人描述方式測定了血清HI效價(VanKampen等人，2005)。組3中，將AdPNM2007/99.H3載體肌肉內(nèi)以100|ul的體積，2.5><1010pfu/動物的劑量注射到3只4周大的雞中。免疫后兩周測定HI效價。組1(卵內(nèi)免疫9天大的胚胎)中，HI效^f介達到8和16;組2中(卯內(nèi)免疫18天大的胚胎)，HI效價達到<4(任意指定效價為2),4和8;組3(肌肉內(nèi)免疫4周大的雞)中，在三只雞中HI效價均達到512。圖1以1og2標度表示HI效價。正方形對應(yīng)組1中各個雞的HI效價；而三角形對應(yīng)于組2中各個雞中的HI效價。圓圈對應(yīng)于組3中各個雞的HI效價。實施例3.編碼A/Turkev/Wisconsin/68H基因TAdTW68.H5)的Ad載體的構(gòu)建編碼AI病毒菌株的H的A/Turkey/WI/68H(SEQIDNOs:3,4)的DNA沖莫沖反，由USDASoutheastPoultryResearchLaboratory,AthensGA提供，使用下表2中的引物進行PCR。表2:構(gòu)建Ad載體時使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>這些引物含有退火到A/Turkey/Wisconsin/68H基因的5，和3'端的序列，緊挨著H起始ATG密碼子的上游的真核核糖體結(jié)合位點(Kozak,1986),和唯一的用于隨后的克隆的限制性位點。含有完整的H基因的片段以正確的方向被插入到穿梭質(zhì)粒pAdApt(由Crucell,Leiden,TheNetherlands提供)的Hindlll-BamHI位點，處于人細胞巨化病毒(CMV)早期啟動子轉(zhuǎn)錄控制下。通過按前人所述方式(Shi等人，2001)將pAdApt-TW68.H5與Ad5主鏈質(zhì)粒pAdEasyl(He等人，1998)共轉(zhuǎn)染，在人PER.C6細胞(由Crucell提供)中產(chǎn)生了一種編碼A/Turkey/Wisconsin/68H基因(AdTW68.H5)的無RCA的E1/E3—缺陷型Ad載體。通過對H插入體和載體之間的5，和3'端連接進行測序，驗證AdTW68.H5載體的有效性。Ad-載體化卵內(nèi)AI疫苗可被快速生產(chǎn)，并在極好的安全分布內(nèi)大量地給藥到雞群中，應(yīng)興起的AI傳染病的要求。在連同層析介導的純化(Konz，2005)和不需要冷凍機長期保存的緩沖液(Evans，2004)的無血清懸浮生物反應(yīng)器(Lewis,2006)中，無RCA的Ad5載體在已明確表征的PER.C6細胞系中的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)當大幅極少Ad5載體的生產(chǎn)成本。使用培養(yǎng)細胞代替含胚蛋作為用于疫苗生產(chǎn)的基質(zhì)十分重要，尤其是在AI暴發(fā)時當受精卯短缺時。該Ad5-載體化AI疫苗之所以按照DIVA策略，是因為該載體只編碼病毒HA。因此，通過酶聯(lián)免疫吸附測定進行的血清HI抗體的分析和抗-AI核蛋白質(zhì)的測量使得AI疫苗或病毒的暴露的測定快速進行。盡管可以通過由含有非病原體性流感病毒主鏈的新城疫病毒載體(Swayne,2003)或重配(reassortant)流感病毒(Lee，2004)表達HA來制備氣溶膠AI疫苗，無RCA的Ad5-載體化卵內(nèi)AI疫苗提供了一種能夠通過均一劑量的非復制型AI疫苗的自動化給藥抑制被免疫的禽類的HPAI病毒感染的獨特平臺，與DIVA策略相一致。與產(chǎn)生回復體的風險相關(guān)的且允許遺傳修飾的生物在環(huán)境中的目標物種和非目標物種中傳播的復制中的重組載體不同，無RCA的Ad5載體不會在野外傳播。與可產(chǎn)生不想要的與另一種同時流行的野生流感病毒(Hilleman,2002)的重配(reassortment)的AI病毒疫苗不同，Ad5的DNA基因組不可能經(jīng)歷與流感病毒的分^:的RNA基因組的重酉己(reassortment)。實施例4.在卵內(nèi)接種AdTW68.H5在卯內(nèi)接種按前人所述方式進行(Senne,1998;Sharma等人，1982)。在接種前，對光檢查所有胚胎的生存能力，標記接種位點，并用含有3.5%碘的70%的乙醇溶液清除。用裝有尖頭電極的旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭在殼上打孔。用lml注射器按照羊膜-尿嚢路線進行接種。接種后，用熔化的石蠟封口。實施例5.AdTW68.H5的血清學二次接種在SPF含胚雞蛋中二次傳代AI菌林A/Turkey/WI/68使效價達到10,胚胎感染劑量為50%/ml。檢測氨尿嚢液(Amnioallantoicfluids)的紅血球凝集活性。按前人描述方法使用AI病毒的4個血細胞凝集單位的血細胞凝集抑制測定各體血清樣本中的抗體效價(Swayne等人，1998,Thayer等人，1998)。實施例6.AI基因組的取樣和定量來自于各個禽類的口咽樣本懸浮于1.0ml的腦心浸液培養(yǎng)基中(Difco,Detroit,Mich.),并保藏于-70。C。用RNeasymini試劑盒(Qiagen)提取RNA(Qiagen)。用特異于A型流感病毒基質(zhì)RNA的引物進行定量的實時RT-PCR,按前人所述方式(Spackman,2002)。使用由已知量的對照的A/Ck/Queretaro/14588-19/95RNA(101Q-106。EIDs。/mL)產(chǎn)生的標準曲線，從周期閾值中以內(nèi)插法計算病毒RNA。實施例7.通過卵內(nèi)接種AdTW68.H5對雞進行免疫，然后進行孵化后加強免疫在胚胎的第10或18天通過將含有10"病毒顆粒/ml(vp/ml)的300W的AdTW68.H5給藥到SPF含胚蛋中進行對雞的通過接種的免疫。每組孵化的雞被平均分為兩組在孵化后15天一半雞經(jīng)鼻途經(jīng)再次接種相同劑量的AdTW68.H5，剩下的雞沒有受到孵化后加強免疫的處理(boosterapplication)。孵化后28天這些雞組中獲得的血清中4全測到的HI抗體效價示于圖2。胚胎的第10天卵內(nèi)進行了接種的雞的HI效價在21og2至71og2(平均值為4.2)之間變化；經(jīng)孵化后加強免疫處理的在胚胎第10天進行了接種的雞的效價在21og2至91og2(平均值為5.5)之間變化；在胚胎第18天進行了接種的雞的效價在21og2至91og2(平均值為5.5)之間變化；在胚胎第18天進行了接種并在孵化后15天后加強免疫(boosted)的雞的HI值在21og2和81og2(平均值為5.7)之間?？傮w來說，在卵內(nèi)給藥人Ad-載體化AI疫苗在雞內(nèi)引起了針對AI的強免疫反應(yīng)，而將這種載體化疫苗鼻內(nèi)滴注到雞中，如最近所證明的(Gao,2006),并沒有效果。實施例8.在卵內(nèi)接種AdTW68.H5使之免于遭受高病原性禽流感菌抹HPAIA/Ck/Oueretaro/19/95(H5N2)的致命攻擊在接種第18天以與實施例7中描述的AdTW68.H5的相同劑量，通過卵內(nèi)途徑免疫19個SPF雞胚胎。孵化的雞通過翅標纟皮逐個鑒定。一組12只雞通過鼻途徑在孵化后15天纟皮加強免疫(boosted)，剩下的7只雞沒有被加強免疫。在23天和29天大時從每只經(jīng)翅標的雞中獲得血樣，并通過針對禽流感菌林A/Turkey/Wisconsin/6的抗體的HI進行檢測。總的來說，在這些雞中檢測到的HI抗體效價(圖3)與之前試驗中獲得的值相似(圖2)。大多數(shù)雞的效價達到了^51og2。只在卯內(nèi)接種的雞的效價在孵化后23天達到51og2至91og2之間(圖3)。孵化后29天，這些雞的抗體效價獲得了維持或獲得提高。與鼻內(nèi)加強免疫同時在卵內(nèi)接種顯示出抗體效價在孵化后23天在31og2至91og2之間變化(圖3)。與前組相似，大多數(shù)雞在孵化后29天，效價提高了11og2或21og2階段。通過口咽接種以105胚胎感染劑量(EID50)的HPAIA/Ck/Queretaro/19/95(H5N2)(Horimoto,1995，Garcia,1998)以生物安全等級3+facilities進行攻擊(challenge)。該攻擊菌林的H基因與Ad-載體化疫苗中使用的AI菌抹A/Tk/WI/68的H(GenBank登錄號U79448&U79456)(SEQIDNOs:5,6，7,8)具有90.1%核苷酸同一性，有94.4%推測的氨基酸相似性。總共30只雞在孵化34后天被攻擊，這其中包括7只經(jīng)卵內(nèi)接種的雞和12只卵內(nèi)接種然后又在孵化15天后鼻內(nèi)加強免疫(boosted)的雞，和11只未經(jīng)接種免疫的對照。在14天的試-瞼時間里從始至終每天觀察^皮攻擊的雞的患病率和死亡率。攻擊后兩天在11只對照雞中的10只中觀察到了AI的臨床表征，包括雞冠和垂肉的腫脹，結(jié)膜炎，厭食和體溫過低。兩天后，對照組中的大多數(shù)幸存者出現(xiàn)雞冠壞死，垂肉腫脹，腹瀉，脫水，嗜水，小腿皮下出血。經(jīng)接種疫苗的雞中沒有顯示出疾病的病征。所有經(jīng)AdTW6S.H5(l9/19)接種的(只在卵內(nèi)和在卵內(nèi)+鼻內(nèi)加強免疫)雞都幸免于攻擊(圖4)。通過實時逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)定量測定攻擊后2,4和7天收集的咽拭子(oropharyngealswabs)中的#皮攻擊的雞的A/Chicken/Queretaro/19/95的病毒基因組。在攻擊后第7天，經(jīng)接種和未經(jīng)接種的雞之間的AI病毒基因組的濃度有顯著差異(pO.05)(圖5)。經(jīng)免疫的雞中缺少可檢測到的病毒RNA提供了卯內(nèi)接種引起了能夠控制AI病毒在一周之內(nèi)離體的免疫反應(yīng)的證據(jù)。這些結(jié)果總的來說，表明在卵內(nèi)經(jīng)編碼來源于不同流感病毒(人和禽來源)的H基因的無RCA人Ad載體免疫的雞出現(xiàn)抗同源AI病毒的效價，這些雞受到保護以對抗相同H型的高病原性AI病毒菌抹的致命性攻擊。實施例9.卵內(nèi)接種AdTW68.H5使之免于受到高病原性禽流感菌為了測定AdTW68.H5-載體化AI疫苗能夠提供保護以對抗最近的H5N1HPAI病毒菌抹，31只雞在卵內(nèi)以2x108ifu的劑量在卵內(nèi)接種了AdTW68.H5載體。對照組包括10只接種了編碼不相關(guān)的抗原(破傷風毒素C-片段)的Ad5載體(AdCMV-tetC)(Shi等人，2001)的雞和10只暴露于Ad5載體的雞。在第31天，用H5N1AI病毒A/Swan/Mongolia/244L/2005攻擊對照和經(jīng)免疫的雞(攻擊菌林的HA與A/Turkey/Wisconsin/68菌林的HA的89%推測的HA氨基酸序列具有相似性)。如圖6所示，卵內(nèi)免疫在第25天引發(fā)抗體，范圍在llog2至61og2之間。未接種(10/10)和經(jīng)AdCMV-tetC-免疫的(10/10)雞沒有產(chǎn)生出可檢測得到的HI抗體，所有都在攻擊后9天內(nèi)死于AI,而68%(21/31)的經(jīng)AdTW68.H5-免疫的雞在攻擊后10天幸存下來而沒有出現(xiàn)臨床病征(圖7)。值得注意的是，HI效價為>3log2(圖6)免疫組中的7只雞還是被高致命性的H5N1AI病毒殺死。這可能是針對H5N1AI病毒的存活率可以通過卵內(nèi)接種編碼具有更接近的抗原性的HA的Ad5載體而提高。這些結(jié)果證明卵內(nèi)接種了編碼禽H5HA的無RCA的人Ad5載體可引發(fā)抗HPAI病毒的保護性免疫。本發(fā)明優(yōu)選的實施方式已經(jīng)進行了詳細的描述，應(yīng)當理解的是，由所附加的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明并不受上述陳述的具體細節(jié)限制，因為這些內(nèi)容的許多明顯的改變可不遠離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍。參考文獻1.Ahmad,I,,KJeven,S，H.，Avakian，AJ.,andGlisson,J.R,(1988)SensitivityandspecificityofMycoplasmagallis印ticuoiagglutinationantigenspreparedfrommedium^ithartificialliposomessubstitutingforserum.AvianDis.32,519-26,2.Al-Mariri,A.,Tibor,A,,Mertens,P.，DeBol〗e,X"Michel,P.，Gode&oid,J.，Walravens，K,，加dLetesson,J丄(2001)ProtectionofBA￡/B/omJeeagainstBrucellaabortus54^1challengebyvaccinationwithbaoterioferritfaorP39recombinantproteinswithCpGoligodeoxynucleotidesasadjuvant.InfectJtanum,tfP,48〗6-22，3.Alexander,D丄，Lister,S.A"Johnson'M丄，Randall,CJ',andThomas,P丄(1993),AnoutbreakofhighlypathogenicavianinfluenzainturkeysinGreatBritainin19呑1.Vet,Rec,535-536.4.AlexanderD,J,(1990)AvianPar咖yxoviridae—recentdevelopments.VetMicrobiol,"，103-14.5.Alexander'D丄,Parsons,G.,andM肌vdl，R丄(1986)ExperimentalassessmentofthepathogenicityofeightavianinfluenzaAviruseso^H5subtypeforchickens,turkeys,ducksandquail，AvianPathol.",647-662，6.Ali》H.A,,Sawada，T,'andNodaK,(2004)Protectivityof加imnumoaffinity-pwified39kDacapsularproteinofavianPasteurel〗amutocidainmiceJ.Vet.Med.Soi.65,7.Arnold,J丄，Ahs肌,F.,Meez叫E.,andPillion,D丄(2004)Correlationoftetradecymaltosideinducedincreasesinnasalpeptidedrugdeliverywithmorphologicalchangesinnasalepithelialcells,J,Ph咖，Sci.P3，2205-13.8.Baert，K,,Duchateau，L.,DeBoever,S.,Cheriet,M.,andDeBacker,P.(2005)AntipyreticeffectoforalsodiumsalicylateafteranintravenousE.coliLPSinjectionhibroilerchickens,BrPoultSci,仏137-43.9.Bartour,E,K,,Newxn肌，J.A,，S貼ipreeyaj叫J,,C叩uUi,A,C'，andMimeer，M.A.(1989〉IdentificationoftheantigeniccomponentsthevirukatMycoplasmagallisepticum(R)inchickens:theirroeindifferentiationfromthevaccinestrain(F),VetInimmo!ImmunopathoL27，197-206,10.Baserga^R,,andDenhardt，D.T,(eds.)(1992),AntisenseStrategies,AnnalsoftheNewYork入caderayofSciences,Vol,600，NewYorkAead咖yofSde叫es)NewYork,NY*，Bashiruddin,J,B.'Gould,A，R,，andWestbury，H,A.(〗992)MolecularpathotypingoftwoavianinfluenzavirusesisolatedduringtlieVictoria1976outbreak.Aust,Vet.J.140-〗42.12.Bean,W丄,Cox,N丄,andKendal,A,P.(1980)RecombinationofhumaninfluenzaAvirusesinnature.Nature2W，638-640,13,Beard,C,W,，Schnitzbiti，W,M"andTripathy,D、N,(1,Effectofrouteofadministr汰ticmontheefficacyofarecombinantfowlpoxvirusagainstH5N2avianinfluenza,人vi肌Dis1052-1055,14.Behr,J.P.(1994)Genetransferwithsyntheticeationic咖phiphiles:prospectsforgenetherapy.BioconjugChem.5,382-9.15'Belli'S丄，Ue，M.,Thebo，P,,Wallaoh，M.G.,Schwartsburd,B,,andSmith,N*C,(2002)Biochemicalcharacterisationofthe56and82kDainmuwiodominantgaroetocyteantigensfromEimeriamaxima.IntJParasit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)權(quán)利要求46的方法，其中所述人腺病毒含有源于腺病毒血清型5的序列。48.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述人腺病毒含有源于復制缺陷型腺病毒、非復制型腺病毒、可復制型腺病毒或野生型腺病毒的序列。49.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述禽類病原體的抗原來源于禽流感病毒、傳染性嚢病病毒、馬雷克病病毒、禽皰滲病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、禽呼腸孤病毒、禽痘、鳥痘、金絲雀痘、鴒痘、鵪鵓痘和dovepox、禽多瘤病毒、新城病病毒、禽肺病毒、禽鼻氣管炎病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒、禽逆轉(zhuǎn)錄病毒、禽內(nèi)源性病毒、禽成紅血細胞增多癥病毒、禽肝炎病毒、禽貧血癥病毒、禽腸炎病毒、帕切科病病毒、禽白血病病毒、禽細小病毒、禽輪狀病毒、禽造血細胞組織增生病毒、禽肌腱膜纖維肉瘤病毒、禽成髓細胞過多癥病毒、禽成髓細胞過多癥相關(guān)病毒、禽髓細胞瘤病病毒、禽肉瘤病毒或禽脾壞死病毒。50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述禽類病原體的抗原來源于禽流感。51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述禽流感抗原或免疫原選自血凝素、核蛋白質(zhì)、基質(zhì)或神經(jīng)氨酸酶。52.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述禽流感抗原或免疫原選自血凝素亞型3、5、7或9。53.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其還包括給予另外的疫苗。54.—種用于將免疫原性組合物遞送到禽類胚胎的卵內(nèi)給藥的裝置，其中所述裝置含有表達一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原的重組人腺病毒表達載體，該裝置將這種重組人腺病毒遞送到禽胚胎。55.根據(jù)權(quán)利要求54的裝置，其中所述人腺病毒表達載體含有源于腺病毒血清型5的序列。56.根據(jù)權(quán)利要求54的裝置，其中所述人腺病毒表達載體含有源于復制缺陷型腺病毒、非復制型人腺病毒、可復制型腺病毒或野生型腺病毒的序列。57.根據(jù)權(quán)利要求54的裝置，其中所述一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于禽流感病毒、傳染性嚢病病毒、馬雷克病病毒、禽皰滲病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、禽呼腸孤病毒、禽痘、鳥痘、金絲雀痘、鴿痘、鵪鶉痘和dovepox、禽多瘤病毒、新城病病毒、禽肺病毒、禽鼻氣管炎病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒、禽逆轉(zhuǎn)錄病毒、禽內(nèi)源性病毒、禽成紅血細胞增多癥病毒、禽肝炎病毒、禽貧血癥病毒、禽腸炎病毒、帕切科病病毒、禽白血病病毒、禽細小病毒、禽輪狀病毒、禽造血細胞組織增生病毒、禽肌腱膜纖維肉瘤病毒、禽成髓細胞過多癥病毒、禽成髓細胞過多癥相關(guān)病毒、禽髓細胞瘤病病毒、禽肉瘤病毒或禽脾壞死病毒。58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中所述一種或多種所關(guān)注的禽類抗原或免疫原來源于禽流感。59.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中所述禽流感抗原或免疫原選自血凝素、核蛋白質(zhì)、基質(zhì)或神經(jīng)氨酸酶。60.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中所述關(guān)注的禽流感抗原或免疫原選自血凝素亞型3、5、7或9。61.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其還包括施加另外的疫苗。62.—種免疫禽宿主的方法，所述方法包括接種編碼一種或多種病原體來源的抗原的非復制型表達載體。全文摘要本發(fā)明通常涉及免疫學領(lǐng)域和疫苗
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體的是，本發(fā)明涉及用于將禽類免疫原和抗原例如禽流感遞送到禽類內(nèi)的重組人腺病毒載體。本發(fā)明還提供了在包括禽胚胎在內(nèi)的禽類個體中導入并表達禽類免疫原的方法，以及在禽類個體中引起針對禽類免疫原的免疫原性反應(yīng)的方法。文檔編號A61K39/235GK101365484SQ200680038344公開日2009年2月11日申請日期2006年8月15日優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日發(fā)明者D·C·唐,H·托羅,K·R·范坎彭申請人:瓦克辛公司;奧本大學