專利名稱：：治療不正常細胞生長的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及c-Met/HGFR抑制劑用于治療哺乳動物體內不正常細胞生長的用途。更具體地說，本發(fā)明提供治療患有癌癥的哺乳動物的方法。
背景技術：
：式1代表的化合物00-3-[l-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-5-(l-哌咬-4-基-1H-吡唑-4-基)-吡啶-2-基胺為c-Met/HGFR(肝細胞生長因子受體)激酶及ALK(間變性淋巴瘤激酶)活性的有效小分子抑制劑。化合物i具有通過抑制c-Met/HGFR(參與調節(jié)多種腫瘤類型的生長及轉移進程)及ALK(與ALCL(間變性大細胞淋巴瘤)發(fā)病機理有關)來以藥理學方式介導的抗腫瘤特性。化合物i公開于國際專利申請案第PCT/IB2005/002837號及美國專利申請案第11/212，331號中，二者以引用方式全部并入本文中。此外，化合物上的外消旋物公開于國際專利申請案第PCT/IB05/002695號及美國專利申請案第11/213，039號中，二者以引用方式全部并入本文中。人類癌癥包括多種疾病，這樣的疾病共同為在全球發(fā)達國家中造成死亡的主要原因之一(AmericanCancerSociety,CancerFactsandFigures2005.Atlanta:AmericanCancerSociety;2005)。癌癥的發(fā)展由一系列復雜的多種基因及分子事件引起，這樣的事件包括基因突變、染色體異位及核型異常(HanahanD，WeinbergRA.Thehallmarksofcancer.Cell2000;100:57-70)。盡管癌癥的根本基因起因是多樣且復雜的，但已觀察到每一癌癥類型可表現(xiàn)出共同特征且需要促進其發(fā)展的能力。這種所需能力包括失調的細胞生長、持續(xù)增補血管的能力(即，血管生成)及腫瘤細胞局部擴散以及轉移至二級器官部位的能力(HanahanD，WeinbergRA.Thehallmarksofcancer.Cell2000;100:57-70)。因此，能夠鑒別l)抑制癌癥發(fā)展期間會改變的分子靶標、或2)靶向多種腫瘤中癌癥發(fā)展所共有的多個過程的新穎治療劑的能力是一種重要的未得到滿足的需求。大量文獻表明c-Met/HGFR是在各種人類癌癥中最常發(fā)生突變或以其它方式異常激活的RTK之一(ChristensenJG，BurrowsJ，SalgiaR.c一Metasatargetinhumancancerandcharacterizationofinhibitorsfortherapeuticintervention.CancerLetters2005;225:1-26)。其中報告稱通過突變或基因擴增對c-Met/HGFR進行遺傳改造的肺瘤類型包括(但不限于)具有重要的、未得到滿足的醫(yī)療需求的腫瘤學指征，例如腎癌、轉移性結腸直腸癌、神經(jīng)膠質瘤、非小細胞肺癌、胃癌及頭頸部癌癥(ChristensenJG,BurrowsJ，SalgiaR.c一Metasatargetinhumancancerandcharacterizationofinhibitorfortherapeuticintervention.CancerLetters2005;225:1-26)。已發(fā)現(xiàn)HGFR突變與腎癌有關(例如，參見L.Schmidt,K.Junker,N.Nakaigawa，T.Kinjerski，G.Weirich，M.Miller等人，NovelmutationsoftheMETproto-oncogeneinpapillaryrenalcarcinomas,Oncogene1999;18:2343—2350;L.Schmidt,F.M.Duh，F(xiàn).Chen,T.Kishida，G.Gleim，P.Choyke等人，GermlineandsomaticmutationsinthetyrosinekinasedomainoftheMETproto-oncogeneinpapi1laryrenalcarcinomas,Nat.Genet.1997;16:68-73;L.Schmidt,K.Junker,G.Weirich，G.Glenn,P.Choyke，I.Lubensky等人，TwoNorthAmericanfamilieswithhereditarypapillaryrenalcarcinomasandidenticalnovelmutationsintheMETproto-oncogene，CancerRes.1998;58:1719-1722)。HGFR突變與頭頸部癌有關(例如，參見M.F.DiRe扁，M.Olivero,T.Martone，A.Maffe，P.Maggiora，A.D.Stefani等人,SomaticmutationsoftheMEToncogeneareselectedduringmetastaticspreadofhumanHNSCcarcinomas,Oncogene2000;19:1547-1555;D.M.Aebersold,0.Landt，S.Berthou，G.Gruber，K.T.Beer,R.H.Greiner，Y.Zimmer,PrevalenceandclinicalimpactofMetY1253D-activatingpointmutationinradiotherapytreatedsquamouscellcanceroftheoropharynx,Oncogene2003;22:8519-8523)。HGFR突變亦與肺癌有關(例如,參見P.C.Ma，T.Kijima，G.Maulik，E.A.Fox,M.Sattler，J.D.Griffin等人，c-METmutationalanalysisinsmallcelllungcancer:noveljuxtamembranedomainmutationsregulatingcytoskeletalfunctions,CancerRes.2003;63:6272-6281;P.C.Ma,S.Jagdeesh，R.Jagadeeswaran，E.A.Fox,J.G.Christensen，G.Maulik等人，c-METexpression/activation,functions,andmutationsinnon-smallcelllungcancer,Proc.Am.Assoc.CancerRes.2004;63:1875)。此外，HGFR突變與其它適應癥有關，這樣的適應癥包括(但不限于)兒童肝細胞癌、人類胃癌、硬癌型胃癌、結腸直腸癌及惡性黑素瘤。(例如，參見W.S.Park,S.M.Dong,S.Y.Kim,E.Y.Na，M.S.Shin,J.H.Pi等人,SomaticmutationsinthekinasedomainoftheMet/hepatocytegrowthfactorreceptorgeneinchildhoodhepatocellularcarcinomas,CancerRes.1999;59:307—310;J.H.Lee，S.U.Han，H.Cho，B.Jennings,B.Gerrard，M.Dean等人，AnovelgermlinejuxtamembraneMetmutationinhumangastriccancer,Oncogene2000;19:4947-4953;A.Lorenzato，M.Olivero,S.Patane，E.Rosso,A.Oliaro，P.M.Comoglio，M.F.DiRenzo，NovelsomaticmutationsoftheMEToncogeneinhumancarcinomametastasesactivatingcellmotilityandinvasion,CancerRes.2002;62:7025-7030;H.Kuniyasu，W.Yasui,Y.Kitadai，H.Yokozaki，H.Ito，E.Tahara，F(xiàn)requentamplificationofthec-metgeneinscirrhoustypestomachcancer,Biochem.Biophys.Res.Commun.1992;189:227-232;M.F.DiRenzo，M.Olivero,A.Giacomini，H.Porte，E.Chastre，L.Mirossay等人，Overexpressionandamplificationofthemet/HGFreceptorgeneduringtheprogressionofcolorectalcancer,Clin.CancerRes.1995;1:147—154;T.Hara,A.0oi，M.Kobayashi，M.Mai，K.Yanagihara，I.Nakanishi，Amplificationofc-myc，K-sam，andc一metingastriccancers:detectionbyfluorescenceinsituhybridization,Lab.Invest.1998;78:1143-1153)。亦已確定HGFR突變形使功能與致癌潛力之間的關系(例如，參見，M.Jeffers，L.Schmidt,N.Nakaigawa，C.P.Webb,G.Weirich，T.Kishida等人，Activatingmutationsforthemettyrosinekinasereceptorinhumancancer,Proc.NatlAcad.Sci.USA1997;94:11445-11450;M.Jeffers，M.Fiscella，C.P.Webb，M.Anver，S.Koochekpour,G.F.VandeWoude，ThemutationallyactivatedMetreceptormediatesmotilityandmetastasis,Proc.NatlAcad.Sci.USA1998;95:14417-14422)。最后，HGFR突變與小鼠腫瘤有關且在小鼠腫瘤中加以研究(例如，參見，H.Takayama，W.J.URochelle，R.Sharp,T.Otsuka，P.Kriebel,M.Anver等人，Diversetumorigenesisassociatedwithaberrantdevelopmentinmiceoverexpressinghepatocytegrowthfactor/scatterfactor,Proc.NatlAcad.Sci.USA1997;94:701-706;T.0tsuka，H.Takayama，R.Sharp,G.Celli，W.J.LaRochelle，D.P.Bottaro等人,c-Metautocrineactivationinducesdevelopmentofmalignantmelanomaandacquisitionofthemetastaticphenotype,CancerRes.1998;58:5157-5167;M丄Gallego，B.Bierie，L.Hennighausen，TargetedexpressionofHGF/SFinmousemammaryepitheliumleadstometastaticadenosquamouscarcinomasthroughtheactivationofmultiplesignaltransductionpathways,Oncogene2003;22:8498—8508;C.R.Graveel,Y.Su，L.M.Wang,M.Fiscella，T.Lino,c.Birchmeier等人,TumorigeniceffectsofactivatingMetmutationsinaknock—inmousemodel,Proc.Am.Assoc.CancerRes.2004;44:5102)。NPM-ALK是間變性淋巴瘤激酶的致癌融合蛋白變體，該變體由染色體異位產生，與人類間變性大細胞淋巴瘤的發(fā)病機理有關(PulfordK，MorrisSW，TurturroF.Anaplasticlymphomakinaseproteinsingrowthcontrolandcancer.JCellPhysiol2004;199:330-58)。組成型活性ALK嵌合蛋白的異常表現(xiàn)在ALCL發(fā)病機理中的作用已得到很好確定(WeihuaWan等人，Anaplasticlymphomakinaseactivityisessentialfortheproliferationandsurvivalofanaplasticlargecelllymphomacells.BloodFirstEditionPaper,prepublishedonlineOctober27，2005;D0I10.1182/blood-2005-08-3254)。c-Met/HGFR(包括野生型c-Met)的不當激活亦與多種腫瘤致癌過程(例如有絲分裂、存活、血管生成、侵入性生長且尤其為轉移過程)的失調有關(Christensen等人，2005)。此外，證明c-Met及HGF(其僅有的高親和配體)的表達在多種主要人類癌癥中與不良預后或轉移性發(fā)展有關(Christensen等人，2005)。NPM-ALK與ALCL淋巴瘤細胞中細胞增殖及凋亡的失調有關(Pulford等人，2004)。
發(fā)明內容在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療需要該治療的哺乳動物體內不正常細胞生長的方法，其包括向所述哺乳動物施用治療有效量的式i的化合物或其藥學上可接受的鹽。在另一個實施方案中，所述哺乳動物為人類。在另一個實施方案中，所述哺乳動物為狗。在另一個實施方案中，所述不正常細胞生長是由至少一種遺傳改造酪氨酸激酶介導。在另一個實施方案中，所述不正常細胞生長是由肝細胞生長因子受體(c-Met/HGFR)激酶或間變性淋巴瘤激酶(ALK)介導。在另一個實施方案中，所述不正常細胞生長是由肝細胞生長因子受體(c-Met/HGFR)激酶介導。在另一個實施方案中，所述不正常細胞生長是由間變性淋巴瘤激酶(ALK)介導。在另一個實施方案中，所述不正常細胞生長為癌癥。在另一個實施方案中，所述癌癥選自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸部癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、4可杰金氏病(Hodgkin'sDisease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統(tǒng)癌、曱狀腺癌、曱狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦干膠質瘤、垂體腺瘤及其組合。在又一個實施方案中，所述癌癥選自具有下列組成的組非小細胞肺癌(NSCLC)、鱗狀細胞癌、激素難治性前列腺癌、乳頭狀腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神經(jīng)母細胞瘤、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在又一個實施方案中，該化合物或其藥學上可接受的鹽是以藥物組合物的形式施用，該組合物包含該式i的化合物及至少一種藥學上可接受的載體。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供一種通過施用式l的化合物或其藥學上可接受的鹽抑制細胞中c-Met/HGFR激酶活性的方法。在又一個實施方案中，該細胞選自具有下列組成的組A549人類肺癌、GTL-16人類胃癌、HT29人類結腸癌、Colo205人類結腸癌、A498人類腎癌、786-0人類腎癌、MBA-MD-231人類乳腺癌、Madlin-Darby犬腎(MDCK)上皮細胞、經(jīng)改造表達P-糖蛋白的MDCK細胞(MDCK-MDR1)、mlMCD3小鼠腎上皮、HUVEC(人類臍靜脈內皮細胞)、Caki-l腎癌及經(jīng)改造表達人類野生型c-Met/HGFR及包括HGFR-V1092I、HGFR-H1094R、HGFR-Y1230C及HGFR-M1250T在內的突變c-Met/HGFR的NIH-3T3細胞。圖1:化合物i對重組的人類c-Met/HGFR激酶活性的ATP-竟爭性抑制。圖2:向具有確定的GTL-16腫瘤的無胸腺小鼠以指定劑量口服施用化合物上或單獨施用賦形劑ll天。圖2A:探索GTL-16中c-Met/HGFR磷酸化作用的抑制的研究。圖2B:探索GTL-16腫瘤生長抑制的研究。圖3:向具有確定的U87MG腫瘤(150mm3)的無胸腺小鼠以指定劑量口服施用化合物i或單獨施用賦形劑9天。圖3A:探索腫瘤生長抑制的研究。圖3B:探索c-Met/HGFR磷酸化作用的抑制的研究。圖4:向具有大的確定的GTL-16腫瘤異種移植物的無胸腺小鼠每日口服施用化合物i。圖4A:大的確定的GTL-16腫瘤異種移植物在無胸腺小鼠體內的退化。圖4B:每日口服施用化合物i后的小鼠體重。圖5:向具有確定的NCI-H441或PC-3腫瘤異種移植物的無胸腺小鼠每日口服施用化合物i。圖5A:具有確定的NCI-H441的無胸腺小鼠體內的胂瘤退化。圖5B:具有確定的PC-3腫瘤異種移植物的無胸腺小鼠體內的腫瘤退化。圖6:化合物i在NPM-ALK-依賴性淋巴瘤模型(Karpas299ALCL模型)中的抗肺瘤功效。圖6A:探索腫瘤生長抑制的研究。圖6B:探索NPM-ALK磷酸化作用的抑制的研究。發(fā)明詳細描述除非另有說明，否則本文中所有對本發(fā)明的化合物的提及包括提及其鹽、溶劑化物、水合物及復合物以及其鹽的溶劑化物、水合物及復合物，包括其多晶型物、立體異構體及同位素標記的形式。定義除非另有說明，否則本文所用術語"不正常細胞生長"是指不依賴于正常調節(jié)機制的細胞生長(例如，失去接觸抑制)。除非另有說明，否則本文所用術語"治療(treating)"意指逆轉、減輕、抑制此術語所應用的疾病或病況或此種疾病或病況的一或多種癥狀的加劇，或預防此術語所應用的疾病或病況或此種疾病或病癥的一或多種癥狀。除非另有說明，否則本文所用術語"治療(treatment)"是指如上文剛剛定義的"治療(treating)"的治療活動。本文所用術語"藥學上可接受的鹽"包括酸加成鹽及堿加成鹽(包括二鹽)。適宜的酸加成鹽是由可形成無毒鹽的酸形成。實例包括乙酸鹽、天冬氨酸鹽、苯曱酸鹽、苯磺酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、硼酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、六氟磷酸鹽、羥苯酰苯酸鹽、氬氯酸鹽/氯化物、氬溴酸鹽/溴化物、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、曱基硫酸鹽、萘酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙堿酸鹽、硝酸鹽、乳清酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氬鹽、糖二酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、及三氟乙酸鹽。適宜的堿加成鹽是由可形成無毒鹽的堿形成。實例包括鋁鹽、精氨酸鹽、千星鹽(benzathine)、鈣鹽、膽堿鹽、二乙胺鹽、二醇胺鹽、甘氨酸鹽、賴氨酸鹽、鎂鹽、葡胺鹽、醇胺鹽(olamine)、鉀鹽、鈉鹽、氨基丁三醇鹽及鋅鹽。有關適宜的藥學上可接受的鹽的評述參見Stahl及Wermuth所著的"HandbookofPharmaceuticalSalts:Properties,Selection,andUse"(Wiley-VCH，Weinheim,Germany,2002),其/〉開的內容以引用方式全部并入本文中。本發(fā)明的化合物的藥學上可接受的鹽可容易地通過在適宜時將該化合物與期望的酸或堿的溶液混合在一起來制備?？蓪Ⅺ}從溶液中沉淀出并通過過濾收集或可通過蒸發(fā)溶劑回收。該鹽的電離度可在完全電離至幾乎無電離之間變化。本發(fā)明的化合物既可以非溶劑化形式存在亦可以溶劑化形式存在。本文所用術語"溶劑化物"指一包含本發(fā)明的化合物及一或多種藥學上可接受的溶劑分子(例如，乙醇)的分子復合物。當溶劑為水時，使用術語"水合物"。本發(fā)明藥學上可接受的溶劑化物包括其中結晶溶劑可經(jīng)同位素取代(例如，D20、山-丙酮、d6-DMS0)的水合物及溶劑化物。本發(fā)明亦包括經(jīng)同位素標記的化合物，除一或多個原子由一原子量或質量數(shù)不同于自然界,中常見原子量或質量數(shù)的原子代替外，這樣的化合物與化合物i相同。可加入本發(fā)明的化合物中的同位素實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟及氯的同位素，例如分別為211、3H、13C、"C、15N、180、170、"P、"P、35S、"F及"C1。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本發(fā)明的化合物及這樣的化合物的藥學上可接受的鹽涵蓋于本發(fā)明的范圍內。某些經(jīng)同位素標記的本發(fā)明化合物，例如那些加入例如3H及"C等放射性同位素的本發(fā)明化合物可用于藥物和/或底物組織分布分析。含氚即3H及碳-14即"C同位素因其易于制備及可檢測性而特別優(yōu)選。此外，用如氖即2H的較重同位素取代可因較強的代謝穩(wěn)定性提供某些治療優(yōu)點，例如增加的體內半衰期或降低的劑量需求，從而可在某些情形中優(yōu)選。本發(fā)明經(jīng)同位素標記的化合物i一般可通過實施對未經(jīng)標記的化合物所述的程序且用易于得到的經(jīng)同位素標記的試劑取代未經(jīng)同位素標記的試劑來制備。本發(fā)明范圍內亦包括復合物，諸如籠形化合物、藥物-基質包容復合物，其中與上述溶劑化物對比，藥物及基質是以化學計量或非化學計量量存在。本發(fā)明亦涵蓋含有兩種或兩種以上有機和/或無機組份的藥物的復合物，這樣的組份可呈化學計量量或非化學計量量。所獲得的復合物可離子化、部分離子化或未離子化。有關這種復合物的評述參見Haleblian的JPharmSci，，)，1269-1288(1975年8月)，其公開的內容以引用方式全部并入本文中?？谠卖奘┯帽景l(fā)明的化合物可口服施用?？诜┯每砂ㄍ萄?因此該化合物可進入胃腸道)和/或口腔或舌下施用(由此，化合物可直接自口腔進入血流)。適于口服施用的制劑包括固體制劑(例如片劑)、含有顆粒劑的膠嚢、液體、或粉劑、含錠(包括液體填充者)、咀嚼劑、多-及納米顆粒、凝膠、固體溶液、脂質體、膜劑(包括黏性黏合劑)、陰道錠、噴霧劑及液體制劑。液體制劑包括懸浮液、溶液、糖漿及酏劑。這樣的制劑可作為軟質或硬質膠嚢內的填充物使用且通常包含藥學上可接受的載體(例如，水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纖維素、或適宜油)及一或多種乳化劑和/或懸浮劑。液體制劑亦可通過裝在(例如)藥袋中的固體的重制制備。本發(fā)明的化合物亦可用于快速溶解、快速崩解劑型中，例如那些闡述于Liang及Chen所著的ExpertOpinioninTherapeuticPatents,11(6)，981-986(2001))中者，該文獻的公開內容以引用方式全部并入本文中。對于片劑劑型，根據(jù)劑量，藥物可占該劑型的1重量％至80重量％，更為通常占該劑型的5重量％至60重量％。除該藥物外，片劑中通常包含崩解劑。崩解劑的實例包括羥基乙酸淀粉鈉、羧曱基纖維素鈉、羧曱基纖維素鈣、交聯(lián)羧曱基纖維素鈉、交聚維酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、微晶纖維素、低碳烷基取代的羥丙基纖維素、淀粉、預膠化淀粉及藻酸鈉。一般而言，該崩解劑會占該劑型的1重量％至25重量％，優(yōu)選占5重量％至20重量％。勦合劑一般用來賦予片劑制劑以黏著特性。適宜黏合劑包括微晶纖維素、明膠、糖、聚乙二醇、天然及合成樹膠、聚乙烯吡咯烷酮、預膠化淀粉、羥丙基纖維素及羥丙基甲基纖維素。片劑亦可包含稀釋劑，例如乳糖(單水合物、經(jīng)噴霧干燥的單水合物、無水物及例如此類)、甘露醇、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、微晶纖維素、淀粉及二水合磷酸氫鈣。片劑亦可根據(jù)情況包含表面活性劑(例如月桂基硫酸鈉及聚山梨醇酯80)及助流劑(例如二氧化硅及滑石粉)。在含有時，表面活性劑的量通?？烧荚撈瑒┑?.2重量°/4至5重量％,助流劑可占該片劑的0.2重量%至1重量％。片劑通常亦包含潤滑劑，例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂基富馬酸鈉、及硬脂酸鎂與月桂基疏酸鈉的混合物。潤滑劑一般以占該片劑的O.25重量％至10重量％、優(yōu)選占O.5重量％至3重量％的量存在。其它慣用的成份包括抗氧化劑、著色劑、矯味劑、保存劑及遮味劑。示例性片劑包含至多約80重量％的藥物、約10重量％至約90重量％的黏合劑、約0重量％至約85重量％的稀釋劑、約2重量％至約10重量％的崩解劑、及約O.25重量％至約10重量％的潤滑劑。片劑摻合物可直接或通過輥子壓制來形成片劑。另一選擇，片劑摻合物或摻合物的各部分在壓片前可經(jīng)濕-、干-、或溶融-?；?、熔融凝結、或擠出。最終制劑可包含一或多層且可經(jīng)涂覆或未經(jīng)涂覆；或裝入膠嚢。A齊寸f'J齊寸H.Lieberman^L.Lachman6V'PharmaceuticalDosageForms:Tablets,第l巻"，MarcelDekker，N.Y.，N.Y.，1980(ISBN0-8247-6918-X)中，該文獻的公開內容以引用方式全部并入本文中?？诜┯玫墓腆w制劑可配制成能直接釋放和/或以改良方式釋放。以改良方式釋放制劑包括延時釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、受控釋放、靶向釋放及程序性釋放。適當改性的釋放制劑闡述于美國專利第6，106,864號。其它適宜釋放技術(例如高能分散液及滲透性經(jīng)涂覆顆粒)的詳細資料參見Verma等人，PharmaceuticalTechnologyOn-line,25(2)，1-14，(2001)。使用咀嚼膠達到受控釋放闡述于W000/35W8中。這些參考文獻的公開內容均以引用方式全部并入本文中。胃腸外施用本發(fā)明的化合物亦可直接施用至血流、肌肉或內部器官中。適用于胃腸外施用的方式包括靜脈內、動脈內、腹膜腔內、鞘內、心室內、尿道內、胸骨內、顱內、肌內及皮下施用。適用于胃腸外施用的裝置包括針式(包括微型針)注射器、無針式注射器及輸注技術。胃腸外制劑通常是水性溶液，其可包含賦形劑(例如鹽、碳水化合物)及緩沖劑(優(yōu)選至3至9的pH值)，但對于某些應用，可能更適合將其配制成無菌非水性溶液或配制成千燥形式以同適宜賦形劑(例如無菌、無致熱源的水)組合使用。胃腸外制劑在無菌條件下的制備(例如通過冷凍干燥法)可容易地使用本領域技術人員所熟知的標準藥學技術達到。用于制備胃腸外溶液的本發(fā)明化合物的溶解性可借助適宜制劑技術(例如加入增溶劑)來增強。胃腸外施用的制劑可經(jīng)配制而能直接釋放和/或以改良方式釋放。以改良方式釋放制劑包括延時釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、受控釋放、耙向釋放及程序性釋放。因此，可將本發(fā)明的化合物配制成固體、半固體、或搖溶液體用于以植入的儲庫形式施用來提供活性化合物的改良釋放。這些制劑的實例包括經(jīng)藥物涂布的血管支架及PGLA微球體。局部施用本發(fā)明的化合物亦可經(jīng)局部施用至皮膚或黏膜，即經(jīng)皮或穿過皮膚施用。用于此目的的典型制劑包括凝膠、水凝膠、洗劑、溶液、乳霜、軟膏、撒施粉、敷料、泡沫、膜劑、皮膚貼片、糯米紙嚢劑、植入物、海綿、纖維、繃帶及微型乳劑。亦可使用脂質體。典型載體包括醇、水、礦物油、液體凡士林、白色凡士林、甘油、聚乙二醇及丙二醇。亦可力口入增滲劑；參見(例^f口)Finnin及Morgan的JPharmSci，^1(10)，955-958(1999年10月)。其它局部施用方式包括通過電穿孔、離子電滲法、聲透法、超音促滲法及微型針或無針(例如，Powderject、810〗6"1等)注射來遞送。這些參考文獻的公開內容皆以引用方式全部并入本文中。局部施用的制劑可經(jīng)配制而能直接釋放和/或以改良方式釋放。以改良方式釋放制劑包括延時釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、受控釋放、耙向釋放及程序性釋放。吸入/鼻內施用本發(fā)明的化合物亦可經(jīng)鼻內施用或通過吸入施用，這樣的施用所用典型形式為來自干粉吸入器的干燥粉劑(或單獨地、作為混合物(例如，與乳糖的干燥摻合物)、或作為混合的組份顆粒(例如，與磷脂(如磷脂酰膽堿)混合))、作為來自加壓容器、泵、噴射器、霧化器(優(yōu)選使用電流體動力以生成細霧的霧化器)或噴霧器的氣溶膠噴霧劑(其中使用或不使用適宜推進劑，例如l，1，1，2-四氟乙烷或l，1，1，2，3，3,3-七氟丙烷)。對于鼻內使用，該粉劑可包含生物黏附劑，例如，脫乙酰殼多糖或環(huán)糊精。加壓容器、泵、噴射器、霧化器或噴霧器含有由(例如)乙醇、乙醇水溶液、或用于活性物質分散、溶解或延長釋放的適宜作用劑、呈溶劑形式的推進劑及(根據(jù)情況)表面活性劑(例如三油酸山梨醇酐酯、油酸、或寡聚乳酸)構成的本發(fā)明的化合物的溶液或懸浮液。在干燥粉劑或懸浮液制劑中使用之前，將該藥品微粉化至適宜通過吸入遞送的尺寸(通常小于5微米)。此可通過任何適宜粉末化方法(例如螺旋噴射研磨、流化床噴射研磨、超臨界流體處理)來形成納米顆粒、高壓均化、或噴霧干燥而達到。用于吸入器或吹藥器中的膠嚢(例如通過明膠或HPMC制備而成)、泡罩及藥筒可經(jīng)配制而包含本發(fā)明的化合物的粉末混合物、適宜粉末基質(例如乳糖或淀粉)及性能改良劑(例如l-亮氨酸、甘露醇、或硬脂酸鎂)。乳糖可為無水的或以單水合物的形式，優(yōu)選后者。其它適宜賦形劑包括葡聚糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖及海藻糖。適合用于使用電流體動力學以生成細霧的霧化器中的溶液制劑每次噴射可包含lUg至20mg本發(fā)明的化合物，并且該噴射體積可在lji1至100pl間變化。典型制劑包含本發(fā)明的化合物、丙二醇、無菌水、乙醇及氯化鈉?？捎糜谔娲嫉奶娲軇┌ǜ视图熬垡叶?。可將適宜矯味劑(例如薄荷醇及左薄荷醇)、或增甜劑(例如糖精或糖精鈉)添加至那些欲以吸入/鼻內方式施用的本發(fā)明制劑中。用于吸入/鼻內方式施用的制劑可用(例如)聚(DL-乳酸-共乙二醇酸)(PGLA)配制成能直接釋放和/或以改良方式釋放。以改良方式釋放制劑包括延時釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、受控釋放、靶向釋放及程序性釋放。當使用干粉吸入劑及氣溶膠時，劑量單位借助可遞送計量數(shù)量的閥來確定。通常將本發(fā)明的裝置設定至施用計量劑量或含有期望量的本發(fā)明化合物的"噴霧量"。整個日劑量可以單個劑量或更通常以分開的劑量全天施用。直腸/陰道內施用本發(fā)明的化合物可經(jīng)直腸或陰道(例如以栓劑、陰道栓、或灌腸劑的形式)施用?？煽捎褪菓T用的栓劑基質，但適當時可使用多種替代物。經(jīng)直腸或陰道施用的制劑可經(jīng)配制而能直接釋放和/或以改良方式釋放。以改良方式釋放的制劑包括延時釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、受控釋放、靶向釋放及程序性釋放。鑒部施用本發(fā)明的化合物亦可直接施用至眼或耳內，通常是以等滲且pH經(jīng)調節(jié)的無菌鹽水中的微粉化懸浮液或溶液的液滴劑形式。其它適合于經(jīng)眼或耳施用的制劑包括軟青、可生物降解的(例如可吸收凝膠海綿、膠原)及不可生物降解的(例如硅酮)植入物、糯米紙嚢劑、晶狀體及微粒或多孔系統(tǒng)(例如非離子表面活性劑嚢泡(niosome)或脂質體)?？蓪⑷缃宦?lián)聚丙烯酸、聚乙烯醇、透明質酸、纖維素聚合物(例如，羥基丙基甲基纖維素、羥基乙基纖維素或甲基纖維素)或雜多糖聚合物(例如，吉蘭膠)等聚合物與防腐劑(例如，苯扎氯銨)一起摻入。這樣的制劑亦可通過離子電滲法遞送。經(jīng)眼/耳施用的制劑可經(jīng)配制而能實時釋放和/或以修飾方式釋放。以修飾方式釋放的制劑包括延時釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、受控釋放、靼向釋放或程序性釋放。其它技術本發(fā)明的化合物可與可溶性大分子體(例如，環(huán)糊精及其適宜衍生物或包含聚乙二醇的聚合物)聯(lián)合使用，以改善其在以任一上述施用方式使用時的溶解度、溶解速率、遮味情況、生物利用度和/或穩(wěn)定性。例如，發(fā)現(xiàn)藥物-環(huán)糊精復合物一般可用于大多數(shù)劑型及施用途徑。包含復合物及非包含復合物均可使用。作為與該藥直接復合的替代形式，環(huán)糊精可用作輔助添加劑，即作為載體、稀釋劑或增溶劑。最經(jīng)常用于這樣的目的者是ot-、p-、及y-環(huán)糊精，其實例可參見PCT公開文本第W091/11172號、第W094/02518號及第WO98/55148號，這些公開文本的乂〉開內容以引用方式全部并入本文中。劑量施用的活性化合物的量將取決于被治療的受試者、病癥或病況的嚴重程度、施用速率、化合物的處置及開處方的醫(yī)師的判定。然而，有效劑量是介于約O.001mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天之間，優(yōu)選約O.01mg/kg/天至約35mg/kg/天，以單一或分次劑量給予。對于70kg的人，此劑量可折合約O.07mg/天至約7000mg/天，優(yōu)選約O.7mg/天至約2500mg/天。在一些情形中，低于上述范圍下限的劑量含量可能更為合適，而在其它情形中在不會引起任何有害副作用的情況下還可使用更大劑量，其中通常將這樣的較大劑量分成若干較小劑量來在整曰之中施用。組件式藥盒由于理想情況是施用活性化合物的組合，例如，出于治療特定疾病或病況的目的，本發(fā)明的范圍涵蓋兩種或兩種以上藥物組合物(其中至少一種包含本發(fā)明的化合物)可方便地組合成適宜同時施用這樣的組合物的藥盒形式。因此，本發(fā)明的藥盒包含兩種或兩種以上分開的藥物組合物(其中至少一種包含本發(fā)明的化合物)及用于分別保存這樣的組合物的裝置(例如容器、分開式瓶子或分開式箔片包裝)。此藥盒的實例是用于片劑、膠嚢及例如此類的封裝的常見泡軍包裝。本發(fā)明的藥盒尤其適用于施用不同劑型(例如，口服及胃腸外)、適用于以不同劑量間隔施用分開的組合物、或適用于滴定相互分開的組合物。為有助于依從性，該藥盒通常包含施用說明，且可提供輔助記憶的部件。實例體外分析材料及方法體外方法生化激酶分析法如對于c-Met/HGFR激酶的抑制的生化Ki值。將化合物及激酶分析試劑加入測試孔中并在37。C下溫育10分鐘。該分析通過加入c-Met/HGFR酶起始。酶抑制劑可降低所測量的該酶活性。在連續(xù)偶聯(lián)的分光光度測定分析中，通過經(jīng)由測量340nm處吸光度的降低進行的NADH消耗速率分析確定該激酶的ADP時間依賴性產生。在該激酶產生ADP時，可通過與磷酸烯醇丙酮酸及丙酮酸激酶反應將其重新轉化成ATP。在此反應中亦產生丙酮酸鹽。隨后通過與乳酸脫氬酶反應將丙酮酸鹽轉化成乳酸鹽，同時將NADH轉化成NAD。NADH在340nm具有可測量的吸光度而NAD沒有。因此，該分析終點是通過分光光度測定法在34Onm在指定時間點測量。細胞信號傳導的生化激酶分析法(Upstate)在加入分析物之前將激酶預先稀釋成10x工作濃度。簡言之，除組蛋白H1(10x工作儲備液，存于20mMMOPSpH7.4)、PDKtide(10x工作儲備液，存于50mMTrispH7.O)及ATF2(其通常儲存為20x工作儲備液，存于50mMTrispH7,5，150mMNaCl，0.1mMEGTA，0.03%Brij-35，50%甘油、1mM千脒、0.2mMPMSF及O.1%口-巰基乙醇)外將底物在去離子水中溶解并稀釋成工作儲備液。然后在25pl最終反應體積中對感興趣的生化酶再加以分析，該體積中含有與8mMMOPSpH7.0，0.2mMEDTA，50jiMEAIYAAPFAKKK,10mM乙酸鎂及"P-ATP(比活性約500cpm/pmo1，需要時濃縮)一起溫育的5至10mU所選酶。該反應通過加入MgATP混合物起始。在室溫溫育40分鐘后，通過加入5y1的3%磷酸溶液來終止該反應，然后將10yl該反應物點在P30filtermat上并在75mM磷酸中洗滌三次每次5分鐘且在甲醇中洗滌一次，然后千燥并實施閃爍計數(shù)。細胞系用來在體外研究中評估化合物i的細胞系如下A549人類肺癌、GTL-16人類胃癌、HT29人類結腸癌、Colo205人類結腸癌、A498人類腎癌、786-0人類腎癌、MBA-MD-231人類乳腺癌、Madlin-Darby犬腎(MDCK)上皮細胞、經(jīng)改造表達P-糖蛋白的MDCK細胞(MDCK-MDR1)、mlMCD3小鼠腎上皮、HUVEC(人類臍靜脈內皮細胞)；經(jīng)改造表達人類野生型c-Met/HGFR及包括HGFR-V1092KHGFR-H1094R、HGFR-Y1230C及HGFR-M1250T在內的突變c-Met/HGFR的NIH-3T3細胞。用來評估其它酪氨酸激酶磷酸化作用的抑制的細胞系如下KARPAS299、SU-DHL-1及Jurkat人類淋巴瘤細胞、人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、人類大血管內皮細胞(HMVEC)、經(jīng)改造表達人類VEGFR2、PDGFR0、TrkA及TrkB的豬動脈內皮(PAE)細胞；經(jīng)改造表達人類Ron、Axl、Sky及EGFR/Tie-2嵌合體的NIH-3T3細胞；經(jīng)改造表達人類IRK的HEK293細胞、經(jīng)改造表達人類Ron的中國倉鼠卵巢(CHO-B)細胞、經(jīng)改造表達人類BCR-Ab1的BaF3細胞。所有經(jīng)加工細胞系均在Pfizer形成；GTL-16胃癌細胞為來自PaoloComoglio博士的饋贈(UniversityTorinoMedicalSchool,Candiolo，Italy);HUVEC及HMVEC(人類大血管內皮細胞)購自Clonetics公司(Walkersvi1le,MD)，且其它細胞均來自ATCC(Manassas,VA)。除非另有說明，否則細胞培養(yǎng)試劑均購自LifeTechnologies公司(Gaithersburg，MD)。在37匸下將細胞保持在潮濕氣氛下，其中有5%至10%C02并使用標準細胞培養(yǎng)技術養(yǎng)護?？贵w及生長因子用來在體外ELISA及免疫印跡研究中評估化合物i的抗體如下抗-總人類c-Met/HGFR及抗-磷酸化Zap70抗體購自Zymed/Invitrogen，Carlsbad，CA;抗-總Ron、抗-總FGFRl、抗-總PDGFRp、抗-總Trk、抗-總Tie-2及抗-磷酸化酪氨酸(PY-20)抗體購自SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA;抗-總Axl及抗-總小鼠c-Met/HGFR抗體購自R&DSystems,Minneapolis,MN;抗-總IRK抗體購自BDPharmingen，SanDiego，CA;抗-VEGFR2抗體購自NovusBiologicals，Littleton,CO;抗-磷酸化-c-Met/HGFR、抗-總及-磷酸化ALK、抗-總c-ABL、抗-總及磷酸化Gabl、抗-總及磷酸化AKT、抗-總及磷酸化-MAPK44/42、抗-磷酸化Raf、Mekl/2、P90RSK及STAT5抗體購自Cel1SignalingTechnologies,Boston,MA。細胞分析中所采用的大多數(shù)生長因子均購自R&DSystems,Minneapolis,MN，只有BDGF購自GibcoBRL/Invitrogen，Carlsbad,CA，且EGF購自RocheAppliedScience,Indianapolis,IN。細胞激酶磷酸化作用分析性或組成型激酶磷酸化作用的細胞分析(即，ELISA或免疫印跡)。細胞準備將細胞接種于96孔板內生長培養(yǎng)基(補充有10%胎牛血清-FBS的培養(yǎng)基)中并在37X:下培養(yǎng)過夜以促進附著至分析板上。附著后，去除生長培養(yǎng)基并將細胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基(含有O.04%BSA)中。對化合物i實施連續(xù)稀釋，將適宜對照或指定濃度的化合物i加入各孔中，并將細胞在37。C下溫育1小時。在研究依賴于配體的RTK磷酸化作用的實驗中，將相應生長因子(例如，HGF、MSP、Gas6、EGF、NGF、BDNF、胰島素、VEGF或PDGFBB)加至細胞中保持8至20分鐘。如(Konishi，A.，Aizawa，T.Mohan,A.，Korshunov，V.A.及Berk，B.C.，HydrogenperoxideactivatestheGas6-Axlpathwayinvascularsmoothmusclecells.TheJournalofBiologicalChemistry,279:28766-28770(2004))所述使用H202來刺激HUVEC細胞中的人類Axl磷酸化作用。在未加入外源性配體的情形下對具有組成型活性激酶活性的細胞系測量組成型激酶磷酸化作用(例如，GTL-16細胞中c-Met/HGFR、Karpas299細胞中NPM-ALK、Ron-CH0-B細胞中Ron及BCR-AblBaF3細胞中BCR-Abl)。將細胞與化合物i和/或適宜配體一起溫育指定時間后，細胞用存于HBSS的1mMNa3V04洗滌一次且隨后使用溶胞緩沖液溶解(CellSignalingTechnologies,BostonMA)。ELISA分析通過三明治ELISA法利用對每一蛋白有特異性的捕獲抗體及對磷酸化酪氨酸殘基有特異性的檢測抗體評定感興趣的蛋白激酶的磷酸化作用。在每一ELISA分析中，將由用適宜RTK配體和/或化合物i處理的-c-Met/HGFR、-Ron、-Axl、-Sky、-IR、-Tie2、-KDR、-PDGFRP、-Zap70等)的96孔板中。將涂有抗體的各板在蛋白溶解產物存在下于4。C溫育過夜并用存于PBS的1。/。Tween20洗滌七次。將HRP-PY20(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-總-磷酸化酪氨酸，SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)按l:500稀釋在封阻緩沖液(Pierce,Rockford，IL)中并加入各板中保持30分鐘。然后再洗滌各板并加入TMB過氧化物酶底物(Bio-Radlaboratories,HerculesCA)以起始HRP依賴性比色反應。該反應通過加入O.09NH2S04終止。使用分光光度計在OD-450nm處測量各板。通過濃度-反應曲線擬合利用四參數(shù)分析法在基于Excel的模板中計算ICs。值。免疫印跡亦通過免疫印跡法測量化合物i抑制細胞激酶磷酸化作用的能力。如上所述用化合物i存于無血清培養(yǎng)基的稀釋液處理細胞并溶解以得到蛋白提取物。通過BSA分析(Pierce，Rockford，IL)將細胞溶解產物的蛋白濃度標準化并用特異性抗體來免疫沉淀感興趣的蛋白。通過SDS-PAGE將免疫沉淀的蛋白分開并實施用抗-磷酸化酪氨酸抗體進行的免疫印跡以確定每一藥物濃度下磷酸化蛋白的相對含量。此免疫印跡法亦用于確定感興趣分子的總蛋白含量。細胞增殖及存活分析細胞增殖分析將腫瘤細胞以低密度接種于96孔板內生長培養(yǎng)基(補充有10%胎牛血清-FBS的培養(yǎng)基)并在37C下培養(yǎng)過夜。第二天，去除生長培養(yǎng)基并將細胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基(0%FBS及0.04WBSA)中。進行化合物i的連續(xù)稀釋，將適宜對照或指定濃度的化合物i加入各孔中，并將細胞在37t:下溫育24至72小時。然后實施MTT分析(Promega，Madison，WI)以確定相對細胞數(shù)。通過濃度-反應曲線擬合利用四參數(shù)分析法計算ICs。值。凋亡/細胞存活分析將GTL-16細胞以40，Q00細胞/孔接種于96孔板中。在各孔內無血清培養(yǎng)基中加入指定濃度的PF-02341066或賦形劑。將細胞在37。C、5。/。C02下溫育48小時。使用ssDNA凋亡ELISA藥盒(ChemiconInternational)來檢測凋亡。HGF刺激的HUVEC存活分析使HUVEC細胞(第3代)在EGM2培養(yǎng)基(Walkersvi1le，MD)中生長至匯合。將細胞以高密度(20，000至30，000/孔)接種于96孔板內EGM2培養(yǎng)基中并溫育5至6小時以使細胞附著。附著后，將細胞在無血清培養(yǎng)基(CellApplications,SanDiego,CA)中于37。C、5%002下培養(yǎng)過夜。第二天，將細胞暴露于饑餓培養(yǎng)基(CellApplications,SanDiego,CA)中5小時。將化合物i在無血清培養(yǎng)基中進行連續(xù)稀釋并將適宜對照或指定濃度的化合物i加入各孔中。l小時后，將人類重組HGF(R&DSystems,Minneapolis,MN)力口入指定孑L以達到100ng/ml的終濃度。然后在48至72小時后實施MTT分析(Promega)以確定相對細胞數(shù)。通過濃度-反應曲線擬合利用四參數(shù)分析法計算ICs。值。HGF依賴性細胞遷移及侵入分析NCI-H441細胞遷移及基質膠侵入分析使用市售細胞遷移及侵入系統(tǒng)(BDBiosciences,SanJose，CA)確定化合物i對HGF刺激的NCI-H441人類非小細胞肺癌細胞遷移及基質膠侵入的影響。將對數(shù)生長期的細胞用胰蛋白酶消化并以400，OOO個細胞/ml的密度懸浮于無血清培養(yǎng)基(含有0.044BSA)中?；衔飅在無血清培養(yǎng)基中進行連續(xù)稀釋，將指定濃度化合物i加入懸浮細胞中，并將細胞在室溫溫育30分鐘。將指定對照或經(jīng)處理懸浮細胞(0.5ml)加至各遷移或侵入小室(即，板插入物)。此外，將25ng/mlHGF(0.75ml)加入每一相伴板的下層孔中作為化學吸引劑來由插入相伴板頂部的遷移或侵入小室板插入物中吸引細胞并將細胞在371C下溫育22小時。然后將侵入或遷移至板下層孔的細胞固定并在37n下對細胞核染色(l|iig/mlDAPl,存于100y。Me0H)15分鐘。隨后用TBS溶液將細胞洗滌兩次。自每孔獲取顯微鏡圖像并用Image-ProPlus軟件(MediaCybernetics,SilverSpring,MD)在每一條件下確定遷移或侵入的細胞數(shù)。通過濃度-反應曲線擬合利用四參數(shù)分析法計算IC5。值。HUVEC基質膠(matrigel)侵入分析4吏用ACEART-CES系統(tǒng)(ACEAbiologicals，SanDiego,CA)確定化合物i對體外huvec基質膠侵入的影響。用50mi的io.001%纖維連接蛋白及100ng/mlHGF(存于PBS)涂布ACEA電敏96-孔板并在37。C下溫育1小時且在4。C下溫育30分鐘。用PBS在4。C下洗滌各板后，將基質膠(BDBiosciences,SanJose，CA)按l:40稀釋于補充有HGF(100ng/ml)和/或不同濃度的化合物i的饑餓培養(yǎng)基(SM，CellApplications,SanDiego，CA)中，將其(50pl)加入指定孔，并使其在37。C下固化2小時。將,EC細胞在無血清培養(yǎng)基(CellApplications,SanDiego，CA)中培養(yǎng)5小時且隨后在SM中培養(yǎng)2小時。隨后將細胞以60，000個細胞/ml收集在SM中并用100ng/mlHGF和/或適宜化合物i在37t;下處理30分鐘。在指定條件下將HUVEC細胞懸浮液(100pl)轉移至經(jīng)涂布ACEA板指定孔中基質膠層頂部。然后在37'C、95%空氣5%C02下將ACEA板收集至ACEADeviceStation中并通過ACEASensorAnalyzer實時監(jiān)效、48小時。嵌入ACEA板底部的電子傳感器檢測到侵入穿過基質膠的HUVEC細胞。使用ACEART-CESM集合軟件確定侵入的HUVEC細胞的相對數(shù)目(細胞指數(shù))。通過濃度-反應曲線擬合利用四參數(shù)分析法計算ICs。值。MDCK細胞分散分析將MDCK細胞以低密度(25個細胞/孔)接種于96-孔板內補充有10MFBS的培養(yǎng)基中并使之生長直至出現(xiàn)10至15個細胞的小集落。然后用HGF(50ng/ml)在稀釋于生長培養(yǎng)基的各種濃度的化合物l存在下刺激細胞。過夜溫育后，將集落固定并用存于10°乂緩沖的福爾馬林中的0.2%結晶紫染色且在每一濃度下,目測評定分散。HMVEC血管芽生分析將500個HMVEC加入含有0.24。/。甲基纖維素的EGM-2培養(yǎng)基中并將其轉移至U底96-孔板中以過夜形成球狀體。收集球狀體并將其在涂布有凝血酶(2ml5，000U/ml)的48-孔板中混合入含有4。/。至8。/。FBS土化合物的2mg/ml纖維蛋白原溶液中。所得3-D纖維蛋白凝膠用含有4y。至8y。FBS的EGM-2覆蓋并在37。C、95%空氣/5°/"02下溫育。每日在倒置顯微鏡下觀察內皮管形成。在笫7天用連在該顯微鏡上的數(shù)字照相機(OlympusBX60)獲取圖像。加入若干濃度的化合物i并目測評定血管芽生。通過流式細胞術進行的細胞周期及凋亡分析通過流式細胞分析(FACSCalibur，BDBiosciences,SanJose，CA)評估化合物i對人類淋巴瘤細胞的NPM-ALK依賴性細胞周期分布及凋亡的影響。在生長培養(yǎng)基(RPMI+10。/。FBS)中用化合物i處理Karpas299及SU-DHL-1人類淋巴瘤細胞24至48小時。細胞用PBS洗滌兩次，將其固定并在4'C下用BDCytofix/Cytoperm溶液透化處理20分鐘。利用CycloTestPlusDNA試劑藥盒(BDBiosciences)評定'淋巴瘤細月包的細胞周期分布及凋亡。使用此藥盒時，細胞用lxBDPerm/Wash緩沖液洗滌兩次，加入非離子型去污劑及胰蛋白酶以分離細胞核，加入碘化丙錠以顯現(xiàn)DNA內容物，并通過流式細胞術分析細胞。用CellQuestPro評定DM內容物(確定每一細胞周期中細胞數(shù)。/。的倍性分析)并用ModFULT軟件(BDBiosciences)力口以分才斤。i口(Darzynkiewicz，Z.，Bruno，S.，Del-Bino，G.，Gorczyca，W.，Hotz，M.S.，Lassota，P.及Traganos，F(xiàn).，Cytometry13:795-808(1992))所述將凋亡峰(A》定義為以低于G。/G,峰的通道數(shù)出現(xiàn)的峰。亦通過流式細胞分析使用AnnexinV-FITC染色(BDBiosciences,SanJose，CA)確定凋亡且亦使用FACSCa1ibur加以分析。體內方法細胞系除非另有說明，否則細胞培養(yǎng)試劑均購自LifeTechnologies公司(Gaithersburg，MD)。在37X:下將細胞保持在具有5%至10%0)2的潮濕氣氛下并使用標準細胞培養(yǎng)技術傳代。U87MG(人類成膠質細胞瘤)、NCI-H441(人類非小細胞肺腺癌)、PC-3(人類前列腺腺癌)細胞自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Bethesda，MD)獲得且按其推薦培養(yǎng)。無胸腺小鼠中的皮下異種移植物模型雌性或雄性nu/nu小鼠或SCID/Beige小鼠(5-8周齡)購自Harlan(Madison,WI)或CharlesRiver(Wilmington,MA)。在潔凈室條件下將動物保持于無菌濾蓋飼養(yǎng)籠中，這樣的伺養(yǎng)籠具有裝于HEPA-過濾通風籠架上的Alpha-Dri/bed-o-cobcomb墊料。動物隨意接受無菌嚙齒動物食物及水。收集用于植入無胸腺小鼠的細胞并通過以450xg離心5至10分鐘來沉淀。將細胞沉淀洗滌一次并重新懸浮于無菌磷酸緩沖鹽溶液或無血清培養(yǎng)基中。腫瘤細胞補充有30%至50%基質膠(BDBiosciences,SanJoseCA)以促進作為異種移植物的所選腫瘤細胞的腫瘤形成及生長。將細胞(2x106至5x106，100m1)以SC方式植入小鼠后肋區(qū)并使之生長至指定大小，然后對每一實驗施用化合物。通過電子測徑器測量來確定腫瘤大小且按肺瘤長度x寬度、0.4的得數(shù)計算腫瘤體積。來自體內的靶標介導(PK/PD)研究用于體內藥代動力學研究的腫瘤及血漿處理將表達組成型磷酸化c-Met/HGFR或ALK的腫瘤細胞經(jīng)皮下植入棵小鼠體內并使其在未經(jīng)處理下生長至300至800mm3。以指定劑量含量向小鼠施用單口服劑量形式(用于急性PK/PD研究)或多口服劑量(用于穩(wěn)定狀態(tài)PK/PD研究)形式的化合物i。在施用化合物i后的指定時間，以人道方式對各小鼠實施無痛致死術，使用以硫酸肝素預處理的注射器自心臟左心室分離血液樣品。利用LCMS分析對血漿樣品中的化合物i濃度進行分析。將切除的腫瘤在干冰上快速冷凍，用經(jīng)液氮冷卻的低溫研缽及研棒將其粉碎，并在冷的1x細胞溶胞緩沖液(CellSignalingTechnologies,BostonMT)中溶解。自腫瘤溶解產物中提取蛋白并用BSA分析(Pierce,Rockford，IL)確定蛋白濃度。每一腫瘤樣品中總或/及感興趣的磷酸化蛋白的含量使用下文捕獲ELISA法確定。評定激酶靶標的藥代動力學抑制的ELISA分析在每一ELISA分析中，將自經(jīng)賦形劑或化合物i處理的腫瘤形成的蛋白溶解產物轉移至預涂有抗-c-Met/HGFR(ZymedLab/Invitrogen，Carlsbad，CA)或抗-ALK捕獲抗體(Cel1SignalingTechnologies,BostonMT)的96孔板中。在4'C下于腫瘤溶解產物存在下將涂有抗體的各板溫育過夜并用存于PBS的1。/。Tween20洗滌七次。將HRP-PY20(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-總-磷酸化酪氨酸，SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)按l:500稀釋在封阻緩沖液(Pierce,Rockford，IL)中并將其加至各板中保持30分鐘。再洗滌一次各板并加入TMB過氧4匕物酵底物(Bio—Radlaboratories,HerculesCA)以起^會HRP依賴性比色反應。通過加入O.09NH2S04來終止反應。使用分光光度計在45Onm處測量每一賦形劑或處理孔的光密度(0D)。在同一時間點根據(jù)OD讀數(shù)對自經(jīng)化合物i處理的動物切除的腫瘤中c-Met/HGFR或ALK的總磷酸化作用與自經(jīng)賦形劑處理的動物切除的腫瘤中c-Met/HGFR或ALK的總磷酸化作用加以比較。在此評估中，使用下列方程式計算腫瘤中化合物i對激酶耙標磷酸化作用的抑制％抑制=100-[(平均OD值經(jīng)處理/平均OD值未經(jīng)處理)xioo]。免疫印跡亦使用免疫印跡法來確定腫瘤樣品中感興趣的蛋白的相對激酶磷酸化作用狀態(tài)及總蛋白含量。用不同劑量的化合物i處理具有腫瘤的小鼠，如上所述制備肺瘤溶解產物及蛋白樣品。使用特異性抗體免疫沉淀感興趣的蛋白。通過SDS-PAGE及用抗-磷酸化酪氨酸或總抗體進行的免疫印跡將免疫沉淀的蛋白分開。免疫印跡研究中所使用的抗體如下購自Zymed/Invitrogen，Carlsbad,CA的抗-總人類c-Met/HGFR抗體；抗-磷酸化-c-Met/HGFR、抗-總及-磷酸化ALK、抗-總及磷酸化Gabl、抗-總及磷酸化AKT、抗-總及磷酸化-MAPK44/42、STAT5抗體，購自CellSignalingTechnologies,Boston,MA。用于體內輸注研究的微型滲透泵植入Alzet1003D及1007D微型滲透泵購自Durect7>3(Cupertino,CA)。在微型泵上加栽指定濃度的化合物i溶液，并在37X:下用無菌鹽水溶液預處理，直至其在4至5小時時達到平衡。通過外科手術按照制造商說明書將泵經(jīng)皮下植入在右側肋區(qū)具有腫瘤的小鼠的左方背側胸區(qū)。用手術夾使切口閉合，5至7天后將手術夾去除，此時皮膚切口已完全愈合。對于所需輸注時間及藥物體積超過泵容量的研究，在指定時間實施泵更換手術。腫瘤組織學及免疫組織化學(IHC)分析收集用于對免疫組織化學終點進行評估的腫瘤樣本并將其于含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑的10%經(jīng)緩沖的福爾馬林中固定24小時，然后將其轉移至70%乙醇中。隨后用石蠟包埋腫瘤樣本并切割成4微米切片且烘焙于顯微鏡載玻片上。按照制造商說明書使用市售無遮蓋室(decloakingchamber)(BiocareMedical,目錄號DC2001)進行去石蠟及抗原回收(基于EDTA)。亦收集腫瘤0CT冷凍樣品并切片用于CD-31染色。對于免疫染色，將載玻片與一級抗體一起溫育，隨后與二級抗體一起溫育，且使用比色法(DAOEnvision-HARP，DAB藥盒，DAO，Carpentaria,CA)或熒光觀J定法(Alexa488或Alexa635，MolecularProbes/Invitrogen，CarlsbadCA)顯像。使用蘇木精對所有經(jīng)免疫染色的切片進4亍復染。亦4吏用AutomatedVentanaDiscoveryXTStainingModule(VentanaMedicalSystems,Tucson,AZ)按照制造商說明書進行組織學染色。用01ympus顯微鏡對經(jīng)染色的切片進行分析并利用ACIS系統(tǒng)(AutomatedCellularImaging,Clarient，IrvineCA)實施切片染色的定量分析。亦由內部病理學家使用標準臨床方法對載玻片加以分析。免疫組織化學研究中所使用的抗體包括來自BiosourceInternationals/Invitrogen，Carlbad，CA的抗-磷酸化-c-Met/HGFR;來自SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA的抗-Ki67;來自Dacocytomation，Carpenteria，CA的抗-CD31。數(shù)據(jù)及結果化合物l針對c-Met/HGFRRTK的酶效力經(jīng)證明化合物i是重組、人類c-Met/HGFR激酶活性的有效ATP竟爭抑制劑，其中平均Ki為4nM。在生化酶分析中，化合物i抑制c-Met/HGFR的激酶活性，其中Ki為3nM。為研究相對于c-Met/HGFR的激酶選擇性，進一步在針對一組〉UO個重組激酶的生化激酶篩選分析中評估化合物i。在這些初步的生化激酶選擇性篩選中，鑒別出化合物i對其表現(xiàn)出活性的亞組激酶，從而估測對c-Met/HGFR的選擇性較c-Met/HGFR低100倍。進一步在跟蹤研酶選中物的活性加以評估(表l)。通過監(jiān)測與ATP轉換偶聯(lián)的NADH氧化確定對于c-Met/HGFR激酶的抑制的化合物i生化Ki值。將化合物及激酶分析試劑加入測試孔并在37。C下溫育10分鐘且通過加入c-Met/HGFR來起始該反應。通過分光光度測定法在340nm處于指定時間點測量NADH?；诩毎姆治鲋谢衔?的激酶選擇性在一組基于細胞的激酶活性分析中評估化合物i對所選激酶的選擇性，這樣的激酶為生化分析中的潛在選中物及其它相關RTK(例如，RON、SKY、IR)。在基于細胞的研究中，與c-Met/HGFR相比化合物上對VEGFR2及PDGFRpsplU-RTK的選擇性高IOOO倍，對IR及Lck的選擇性高200倍，且對Axl、Tie2、TrkA及TrkB的選擇性高約40至60倍(A549IC5。=8.6nM)(錯誤！參考文獻來源未找到l)。為研究50倍窗口對于體內c-Met/HGFR選擇性是否足夠，評估化合物i在棵鼠體內C6異種移植物中抑制Tie-2磷酸化作用的能力。在此研究中，在施用50mg/kg("小時內對于c-Met/HGFR抑制表示為IC99)或100mg/kg的單PO劑量后的任何時間點均未觀察到明顯的對Tie-2磷酸化作用的抑制。這表明，24小時內較c-Met/HGFR的完全抑制有關的劑量含量高多至2倍的劑量下不太可能出現(xiàn)Tie-2、Axl或TrkA及B的抑制?；衔飅對RON激酶的選擇性為20至30倍，RON激酶為潛在的有益腫瘤學靶標，這是因為其l)在所選癌癥中的過表達及突變，及2)沒有無R0N小鼠中的不良表型。與上述RTK相比，化合物i對ALKRTK(間變性淋巴瘤激酶)融合蛋白的致癌形式即NPM-ALK表現(xiàn)出近乎相等的ICs。值(24nM)，NPM-ALK是ALKRTK(間變性淋巴瘤激酶)的致癌融合蛋白變體，其是由與人類間變性大細胞淋巴瘤(ALCL，存在于人類淋巴瘤細胞系(錯誤！參考文獻來源未找到l))的發(fā)病機理有關的染色體異位所致。細胞中c-Met/HGFRRTK活性的藥代動力學抑制為確認細胞中轉變成c-Met/HGFR的抑制的有效酶活性，評估化合物i在一組腫瘤及內皮細胞系中抑制cMet/HGFR磷酸化作用的能力。在整組人類肺瘤及內皮細胞系中，化合物i抑制野生型c-Met/HGFR的HGF刺激的或組成型總酪氨酸自磷酸化作用，其中平均ICs。值為11nM(表1)?；衔飅在mlMCD3小鼠上皮細胞中表現(xiàn)出類似數(shù)值(IC5nM)(表1)。細胞中化合物l針對cMet/HGFR活性位點突變的效力c-Met/HGFR激活突變已在若干人類癌癥中得到鑒別并為證明基于其它RTK靶標的實驗證據(jù)及臨床前實驗的概念臨床研究提供強有力的基本原理。盡管未預計細胞外或近膜區(qū)結構域的c-Met/HGFR突變會影響化合物對活性位點的結合，但激酶結構域突變有可能會造成活性損失。為解決此問題，在經(jīng)化合物i處理的經(jīng)改造表達野生型c-Met/HGFR或一系列代表性c-Met/HGFR活性位點突變的NIH3T3細胞中評估RTK磷酸化作用ICs。。在這些研允中，與野生型受體(12.6nM)相比化合物i對ATP結合位點突變體(V10921，19nM及H1094R，2.2nM)或P-環(huán)突變體(M1250T，15nM)表現(xiàn)出改良的或類似活性(表l)?；衔飦A亦有效地表現(xiàn)出抑制NCI-H69(IC5。13nM)及H0P92(IC5。16nM)細胞中c-Met磷酸化作用的可比擬的效力，其中兩種細胞分別表達內源c-Met近膜區(qū)變體R988C及T1010I(表1)。與之相比，與野生型受體相比對激活環(huán)突變體(Y1230C、127nM及Y1235D，92nM)觀察到效力的明顯變化(10倍)(表l)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>_化合物l對細胞中c-Met/HGFR-或NPM-ALK依賴性致癌表型的影響表型分析已發(fā)現(xiàn)c-Met/HGFR與多種胂瘤細胞及腫瘤內皮細胞的細胞生長、遷移及侵入的失調有關，而NPM-ALK與ALCL淋巴瘤細胞中的細胞增殖及凋亡的失調有關。在一系列基于細胞的功能分析中，化合物i有效地抑制了人類GTL-16胃癌細胞生長，誘發(fā)GTL-16細胞凋亡，抑制HGF刺激的人類NCI-H441肺癌細胞遷移及侵入透過基質膠基質以及抑制HGF刺激的MDCK細胞運動性/分散。(表2)化合物l亦抑制因t2;5染色體異位而表達NPM-ALK融合蛋白的Karpas299或SU-DHL-1ALCL細胞的增殖。這些NPM-ALK陽性淋巴瘤細胞中化合物1對生長的抑制與G。/G,細胞周期停止及凋亡的誘發(fā)有關。亦為研究潛在抗血管生成活性，化合物i抑制了HGF介導的HUVEC內皮細胞存活及基質膠侵入以及纖維蛋白凝膠中的HMVEC內皮細胞管生成。這些數(shù)據(jù)證明化合物i具有抑制分別表達激活的c-Met/HGFR或NPM-ALK的細胞中c-Met/HGFR-及NPM-ALK依賴性功能二者的能力。此外，這些數(shù)據(jù)說明，化合物i的抗肝瘤功效可通過直接影響腫瘤細胞生長或存活以及抗血管生成機制來受到介導。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>體內研究數(shù)據(jù)及結果體內激酶靶標抑制及腫瘤生長抑制腫瘤模型選擇使用c-Met/HGFR依賴性腫瘤異種移植物模型來評估體內c-Met/HGFR把標抑制、肺瘤生長抑制與化合物丄的血漿暴露的關系。因缺乏由小鼠間充質細胞表達的小鼠HGF對腫瘤異種移植物表達的人類c-Met/HGFR的旁泌性激活，故使用如下表現(xiàn)出組成型c-Met/HGFR活性的人類異種移植物模型1)表達高含量組成型活性c-Met/HGFR的GTL-16人類胃癌或Caki-l腎癌模型，2)表達含有自分泌環(huán)的HGF及c-Met/HGFR二者的U87MG人類成膠質細胞瘤或PC-3人類前列腺癌模型或3)人類腫瘤細胞(例如，NCI-H441NSCLC)與人類MRC5成纖維細胞的一同植入，以提供來自腫瘤間質間隔的生物活性人類HGF來源從而恢復c-Met/HGFR的物種特異性旁分泌激活。口服施用后c-Met/HGFR抑制與抗腫瘤功效的關系GTL-16肺瘤向具有確定的GTL-16腫瘤(250腿3)的無胸腺小鼠以指定劑量口服施用化合物i或單獨施用賦形劑ll天。對于研究GTL-16中c-Met/HGFR磷酸化作用的抑制的研究(圖2A)，在該研究結束時于施用后的指定時間點以人道方式對小鼠實施無痛致死術，切除腫瘤并冷凍，且通過ELISA定量賦形劑及處理組中的磷酸化作用。腫瘤中化合物i對激酶靶標磷酸化作用的抑制如下計算％抑制=100-[(平均0D值經(jīng)處理/平均0D值未經(jīng)處理)xlOO]。在研究GTL-16腫瘤生長抑制的研究(圖M)中，通過測徑器在指定天數(shù)測量各含15只小鼠的各組的腫瘤體積，以中值腫瘤體積±SEM表示。所示百分比0O數(shù)值為在第20天對經(jīng)藥物處理的小鼠測量的腫瘤生長抑制相比于經(jīng)賦形劑處理的小鼠的腫瘤生長抑制的%且如下計算100*{1-[(經(jīng)處理第20天-經(jīng)處理第10天)/(對照第20天-對照第IO天)])。*表示，值腫瘤體積在經(jīng)處理組中明顯小于對照組(P<0.001)，如使用單因素方差分析確定(參見圖2B)。為評估對化合物i的c-Met/HGFRPD反應，在單次施用及重復施用(穩(wěn)定狀態(tài))研究中于口服施用化合物丄后的若干時間點收集GTL-16腫瘤。通過ELISA在一劑量范圍內定量腫瘤中c-Met/HGFR磷酸化作用狀態(tài)。在把注意力集中在穩(wěn)態(tài)PD研究(11天)上以繪制與腫瘤生長抑制的關系時，如圖2A及2B中所示化合物i表現(xiàn)如下特征在50mg/kg/天時在GTL-16腫瘤中，100%的腫瘤生長抑制伴隨c-Met/HGFR磷酸化作用的完全抑制持續(xù)24小時(25mg/kg—磷酸化作用及腫瘤生長二者近乎完全抑制)。在12.5mg/kg/天時l-8小時時，60%的腫瘤生長抑制伴隨80%至90%的c-Met/HGFR磷酸化作用抑制，其在16-24小時時降至50%至60%抑制。在6.25mg/kg/天時l-8小時時，非明顯的胂瘤生長抑制趨向伴隨30。/。至50。/。的c-Met/HGFR磷酸化作用抑制，且在16小時時完全恢復。U87MG腫瘤向具有確定的U87MG腫瘤(150mm3)的無胸腺小鼠以指定劑量口服施用化合物i或單獨施用賦形劑9天。對于研究腫瘤生長抑制的研究(圖3A)，通過測徑器在指定天數(shù)測量各含10-12只小鼠的各組的腫瘤體積，以中值腫瘤體積土SEM表示。所示百分比0O數(shù)值為在笫M天測量的經(jīng)藥物處理小鼠的腫瘤生長抑制相比于經(jīng)賦形劑處理的小鼠的腫瘤生長抑制的％且如下計算100*{1-[(經(jīng)處理第14天-經(jīng)處理第6天)/(對照笫14天-對照第6天)]}。*表示中值腫瘤體積在經(jīng)處理組中明顯低于對照組(P〈0.001),如使用單因素方差分析確定(參見圖3A)。對于研究c-Met/HGFR磷酸化作用的抑制的研究(圖3B)，在該研究結束時于施用化合物i后4小時以人道方式對小鼠實施無痛致死術，切除腫瘤并冷凍，且通過ELISA定量賦形劑及處理組中的磷酸化作用。腫瘤中化合物i對激酶靶標磷酸化作用的抑制是如下計算％抑制=100-[(平均OD值經(jīng)處理/平均OD值未經(jīng)處理)x100]。在U87MG異種移植物中在多至100mg/kg的劑量含量下未觀察到Tie-2磷酸化作用的藥理學相關抑制，表明化合物i在類似劑量含量下對其預期靶標具有選擇性。人類異種移植物模型中化合物1的抗腫瘤功效在多種代表癌癥適應癥的人類紳瘤異種移植物模型中評估化合物i的抗腫瘤功效，這樣的癌癥適應癥涉及c-Met/HGFR失調，包括GTL-16胃癌、U87MG成膠質細胞瘤、NCI-H441NSCLC及PC-3前列腺癌(表4)。GTL-16胃癌模型使用GTL-16胃癌模型時，化合物i表現(xiàn)出使大型確定的腫瘤(>600mm3)明顯退化的能力(圖4)。在此研究中，50mg/kg/天及75mg/kg/天的化合物i治療組在43天的施用程序表中表現(xiàn)出相等的平均腫瘤退化，此進一步證明50mg/kg/天是最大有效劑量含量。如圖4中所示，50mg/kg/天或75mg/kg/天時的平均腫瘤在施用化合物i43天后退化60%。在本研究中，在43天化合物i施用周期過程中在每一劑量含量下每一腫瘤的質量均降低，其中14只小鼠中有9只表現(xiàn)出^30%的腫瘤質量降低(部分反應)，且一只動物表現(xiàn)出完全反應，即使在停止治療IO天后仍無腫瘤跡象。每日口服施用化合物i后無胸腺小鼠中大型確定的GTL-16腫瘤異種移植物(圖4A)及小鼠體重(圖4B)的退化。向具有確定的GTL-16腫瘤(620mm3)的無胸腺小鼠以指定劑量含量口服施用化合物i或單獨施用賦形劑43天。為研究抗腫瘤功效(圖4A),通過測徑器在指定天數(shù)測量各含6至8只小鼠的各組的肺瘤體積，以中值腫瘤體積土SEM表示。(圖4B)化合物i處理及賦形劑對照組的平均小鼠體顯示于右手版面中。NCI-H441NSCLC模式/Caki-l/PC-3腫瘤異種移植物I分別向具有確定的NCI-H441(100mm3)(圖5A)、Caki-l(表3A、表3B)或PC-3胂瘤異種移植物(圖5B)的無胸腺小鼠以指定劑量口服施用化合物i或單獨施用賦形劑38、40或20天。通過測徑器在指定天數(shù)測量腫瘤體積，其中表示為中值腫瘤體積土SEM。*表示中值腫瘤體積在經(jīng)處理組中明顯低于對照組(P《0.001)，如使用單因素方差分析確定。(參見圖5)。在NCI-H441NSCLC模型中，在以SOmg/kg/天施用化合物丄38天后觀察到確定的腫瘤的43°/。平均退化(圖5)。在此研究中，在33天化合物i施用周期過程中在50mg/kg/天下每一腫瘤的質量均減低，其中l(wèi)l只小鼠中有3只表現(xiàn)出^30。/。的腫瘤質量降低(部分反應)，且3只動物表現(xiàn)出完全反應，沒有腫瘤跡象(圖5)?；衔飅的抗胂瘤功效具有劑量依賴性，其中在50mg/kg/天下觀察到確定的NCI-H441肺瘤的退化且在15mg/kg/天下觀察到腫瘤生長(57y。腫瘤生長抑制)的部分抑制(圖5)。相比于賦形劑處理的對照，化合物處理組中在NCI-H441模型中觀察到的化合物i的抗腫瘤功效與腫瘤中c-Met/HGFR磷酸化作用的抑制一致。在Caki-l腎癌模型中，在33天化合物i施用周期過程中在50mg/kg/天下觀察到平均腫瘤體積降低53。/。(圖5B)。在Caki-l研究中，每一腫瘤的體積在33天化合物i施用周期過程中至少降低30。/。(表3B，表4)。亦在PC-3前列腺癌異種移植物模型中研究化合物i的抗腫瘤功效且在此模型中觀察到腫瘤生長的近乎完全抑制(84%生長抑制)。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表3B<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>抗腫瘤功效與c-Met/HGFR的抑制的關系進行一系列劑量-反應抗腫瘤功效及藥代動力學研究以闡明c-Met/HGFR耙標抑制與抗腫瘤功效之間的關系。為評估化合物丄對c-Met/HGFR的藥代動力學抑制，在口服施用化合物l后的若干時間點收集GTL-16胃癌肺瘤。通過ELISA在一定劑量范圍內定量腫瘤中c-Met/HGFR磷酸化作用狀態(tài)。在這些研究中，化合物i表現(xiàn)出c-Met/HGFR的劑量-及時間依賴性抑制與腫瘤生長抑制間的緊密關系。在GTL-16模型中定義乾標PD與功效間的關系時，下列結論顯而易見1)24小時內c-Met/HGFR活性的完全抑制與肺瘤生長的完全抑制一致(50mg/kg，畫TGI)，2)僅一部分程序表內的c-Met/HGFR活性的有效抑制與次最佳功效一致(12.5mg/kg，60%TGI)，3)無能力達到>50%的c-Met/HGFR活性抑制(3.125，6.25mg/kg)與缺乏明顯腫瘤生長抑制(TGI)—致(圖2A及2B)。另外的GTL-16研究顯示，50mg/kg/天及75mg/kg/天化合物i對照組表現(xiàn)出相等的平均肺瘤退化，此進一步證明S0rag/kg/天是最大有效劑量含量(圖4及表4)。這些研究結果表明c-Met/HGFR抑制的持續(xù)時間與化合物i的抗腫瘤功效直接相關。此外，利用所有腫瘤模型(GTL-16、U87MG及NCI-H441)及施用程序表均觀察到類似的化合物i對腫瘤生長及c-Met/HGFR磷酸化作用的劑量-劑量依賴性影響，這些進一步支持觀察結果(表4)。在每一這些研究中，5Omg/kg/天劑量含量引起了完全腫瘤生長抑制或腫瘤退化(表4)。此外，在每一才莫型中于c-Met/HGFR磷酸化作用的抑制與抗腫瘤功效之間均觀察到劑量依賴性關系，進一步支持最大化c-Met/HGFR抑制的程度及持續(xù)時間可達到完全功效的概念?？偠灾@些研究表明，對于最大化治療益處施用程序表的持續(xù)時間內c-Met/HGFR磷酸化作用的近乎完全的抑制是必要的且抑制c-Met/HGFR活性的程度及持續(xù)時間與抗腫瘤功效含量直接相關。此數(shù)據(jù)支持化合物i的預期藥理學靶標即c-Met/HGFR的抑制與抗肺瘤功效程度之間的關聯(lián)。NPM-ALK-依賴性淋巴瘤模型中化合物1的抗胂瘤功效Karpas299ALCL模型向具有確定的Karpas299腫瘤(220mm3)的SCID-beige小鼠以指定劑量口服施用化合物i或單獨施用賦形劑，持續(xù)指定時間。對于研究腫瘤生長抑制的研究(圖6A),通過測徑器在指定天數(shù)測量各含8至12只小鼠的各組的胂瘤體積，以中值腫瘤體積土SEM表示。所示百分比(%)數(shù)值為在第23天測量的經(jīng)藥物處理的小鼠的腫瘤生長抑制相比于經(jīng)賦形劑處理的小鼠的腫瘤生長抑制的。/。且如下計算100*{1-[(經(jīng)處理第23天-經(jīng)處理第12天)/(對照第23天-對照第12天)]}。*表示中值腫瘤體積在經(jīng)處理組中明顯低于對照組(P〈0.001)，如使用單因素方差分析確定。對于研究NPM-ALK磷酸化作用的抑制的研究(圖6B)，在該研究結束時于施用化合物1后4小時以人道方式對小鼠實施無痛致死術，切除腫瘤并冷凍，且通過ELISA定量賦形劑及經(jīng)處理腫瘤中ALK磷酸化作用。肺瘤中化合物i對激酶靶標磷酸化作用的抑制是如下計算％抑制-10G-[(平均OD值經(jīng)處理/平均OD值未經(jīng)處理)x100]。使用Karpas299ALCL模型時，化合物i表現(xiàn)出可引起確定的胂瘤(〉200mm"明顯退化的能力(圖6A)。在此研究中，以100mg/kg/天施用化合物i在開始化合物施用后的15天內引起此施用組中所有小鼠的腫瘤的完全退化(圖6A)。17天后，停止化合物i處理，導致腫瘤重新生長。在腫瘤生長至較大尺寸(〉600mm"時，重新開始化合物i處理，持續(xù)13天且再一次表現(xiàn)出腫瘤的完全退化(圖6A，表4)?；衔飅的細胞減少性作用與其在體外對ALCL細胞的抗增殖及凋亡作用的觀察結果相一致。亦在多個劑量含量及時間點確定腫瘤NPM-ALK磷酸化作用的抑制與抗腫瘤功效之間的關系。類似于在c-Met/HGFR依賴性腫瘤模型中觀察到的結果，完全施用間隔(24小時)內NPM-ALK活性的近乎完全抑制(>90°/。抑制)與100mg/kg下最大抗腫瘤功效(完全退化)相一致(圖6A及6B)。NPM-ALK磷酸化作用的不完全抑制(在25mg/kg或S0mg/kg下〈90。/。抑制)與次最大抗腫瘤功效相一致(圖6A及6B)。類似于c-Met/HGFR依賴性腫瘤模型中的研究，此數(shù)據(jù)支持NPM-ALK依賴性腫瘤模型中化合物i的其它預期藥理學靶標即NPM-ALK的抑制與抗腫瘤功效的程度之間的關聯(lián)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>化合物l的合成PLE是一種由Roche生產且由Biocatalytics公司以來自豬肝的粗制酯酶制劑形式出售的酶，常稱作PLE-AS(作為ICR-123購自Biocatalytics,以硫酸銨懸浮液形式出售)。該酶在CAS注冊號中分類為"羧酸酯水解酶，CAS第9016-18-6號"。相應的酶分類號為EC3.1.1.1。已知該酶對多種酯的水解具有廣泛底物特異性。利用基于水解丁酸乙酯的方法在pH滴定器中測定脂酶活性。1LU(脂酶單位)為在22'C、pH8.2下釋放1pmol可滴定的丁酸的酶的量。本文所報告的制劑(PLE-AS,呈懸浮液形式)通常作為不透明的褐色-綠色液體運輸，填報活性為>45LU/mg(蛋白含量約40mg/ml)。(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇根據(jù)反應圖B通過外消旋乙酸l-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酯的酶水解、酯化作用及伴隨轉位的化學水解的組合制備(lS)-l-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇(在下方反應圖中顯示為化合物(S-l))。根據(jù)反應圖A制備外消旋l-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酸乙酯(化合物A2)。反應圖A<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>l-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇(A1):將硼氫化鈉(90mg，2.4mmo1)加入2'，6'-二氯-3'-氟-乙酰苯(Aldrich，目錄號52,294-5)(207mg，lmmol)溶于2ml無水CH30H的溶液中。將該混合物在室溫攪拌l小時然后蒸發(fā)，得到無色油狀剩余物。該剩余物通過快速層析法純化(用0—10%存于己烷中的EtOAc洗脫)，得到無色油狀的化合物A1(180mg;0.88mmol;產率86.5W;MS(APCI)(M-H)-208;1HNMR(400MHz，氯仿-D)5ppm1.64(d，J-6.82Hz，3H)3.02(d,J-9.85Hz，1H)6.97-7.07(m，1H)7.19—7,33(m，1H)。l-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酸乙酯(A2):將乙酸酐(1.42ml，15mmol)及吡咬(1.7ml，21mmo1)依序加入化合物A1(2.2克,10.5mmo1)溶于20mlCH2Cl2的溶液中。將該混合物在室溫攪拌12小時且隨后蒸發(fā)，得到淺黃色油狀剩余物。該剩余物通過快速層析法純化(用7—9%存于己烷中的EtOAc洗脫)，得到化合物無色油狀的A2(2.26g;9.Ommol;產率85.6%);1H薩(400MHz，氯仿-D)Sppm1.88(d，J=6.82Hz，3H)2.31(s，3H)6.62'(q，J=6.82Hz，1H)7.25(t，J=8.46Hz,1H)7.49(dd，J=8.84，5.05Hz，1H)。反應圖B在一個配有pH電極、頂置攪拌器及堿添加線(lMNaOH)的50ml夾套式燒瓶中加入l.2ml的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.O)及O.13ml的PLEAS懸浮液。然后，逐滴加入化合物A2(0.13克，0.5mmo1，l.OO當量)且將所得混合物在室溫攪拌20小時，用lMNaOH將反應的pH恒定在7.0。由RP-HPLC監(jiān)測反應物的轉化和對映異構體過量值(ee)，并在消耗50%起始材料后終止(在這些條件下為約17小時)。然后用10ml乙酸乙酯將該混合物萃取三次以回收為R-l與S-2的混合物的酯和醇二者。在氮氣氣氛下，將曱磺酰氯(O.06ml,0.6mmol)加入R-l與S-2的混合物(0.48mmol)溶于4ml吡咬的溶液中。將該混合物在室溫攪拌3小時然后蒸發(fā)以得到油。將水(20ml)加入該混合物中且隨后加入EtOAc(20mlx2)以萃取該水溶液。將有機層合并、干燥、過濾并蒸發(fā)，得到R-3與S-2的混合物。該混合物無需進一步純化即可用于下一步反應。力NMR(400MHz，氯仿一D)5ppm1.66(d，J=7.1Hz，3H)1.84(d，J-7.1Hz，3H)2.09(s，3H)2.92(s，3H)6.39(q,J=7,0Hz，1H)6.46(q，J=6.8Hz,1H)6.98-7.07(ra,1H)7.07-7.17(m，1H)7.23-7.30(m，1H)7.34(dd，J=8.8，4.80Hz，1H)。在氮氣氣氛下，將乙酸鉀(O.027克，G.Mmmol)加入R-S與S-2(0.48mmol)于4mlDMF的混合物中。該反應混合物在100。C加熱U小時。將水(20ml)加入該反應混合物中并加入EtOAcQ0mlx"萃取該水溶液。將合并的有機層干燥、過濾并蒸發(fā)，得到S-2的油(72mg，兩步產率61%)。手性ee:97.6%。力醒(400MHz，氯仿-D)5ppm1.66(d，J=7.1Hz，3H)2.09(s,〗H)6.39(q，J-6.8Hz，1H)7.02(t，J=8.5Hz，1H)7.22-7.30(m，1H)。在氮氣氣氛下，將曱醇鈉(19mmol;0.5M,于甲醇中)于O'C緩慢加至化合物S-2(4.64克，18.8mmol)中。將所得混合物在室溫攪拌4小時。蒸發(fā)溶劑并加入H力(100ml)。冷卻的反應混合物用乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中和至pH7。加入乙酸乙酯(100mlx"萃取該水溶液。將合并的有機層經(jīng)由Na2S04干燥，過濾并蒸發(fā)，得到白色固體狀的S-1(4.36克，產率94.9W;SFC-MS:97%ee。力NMR(400MHz，氯仿-D)5ppml.65(d，J-6.8Hz，3H)5.58(q，J=6.9Hz，1H)6.96-7.10(m，1H)7.22-7.36(m，1H)。5-溴-3-[1-(2，6-二氯-3-氟-苯基)—乙氧基]-吡啶-2-基胺(外消旋物)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>1.在(TC下，將2，6-二氯-3-氟乙酰苯(15克，0.Q72mo1)于THF(150ml，0.5M)中借助冰浴攪拌10分鐘。緩慢加入氬化鋁鋰(2.75克，0.072mol)。將該反應物在環(huán)境溫度下攪拌3小時。將該反應物在冰浴中冷卻，并逐滴加入水(3ml)，隨后緩慢加入15%NaOH(3ml)。將該混合物在環(huán)境溫度下攪拌30分鐘。加入15%NaOH(9ml)、MgS04并將該混合物過濾以去除固體。這樣的固體用THF(50ml)洗滌且將濾液濃縮，得到黃色油狀1-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙醇(14.8克，產率95W。^NMR(400MHz，DMS0-d》51.45(d，3H)，5.42(m，2H)，7.32(m，1H)，7.42(m，1H)。2.在0。C下向三苯基膦(8.2克，0.03mol)及DEAD(13.65ml,40%溶于甲苯的溶液)溶于THF(200ml)的經(jīng)攪拌的溶液中加入1-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙醇(4.55克，0.021mol)及3-羥基-硝基吡啶(3.35克，0.023mol)溶于THF(200ml)的溶液。在氮氣氣氛下，將所得鮮橙色溶液在環(huán)境溫度下攪拌4小時，此時所有起始材料已被消耗。去除溶劑，且將干燥粗制材料上樣至硅膠上，且用乙酸乙酯-己烷(20:80)洗脫，得到粉紅色固體狀3-(2，6-二氯-3-氟-芐氧基)-2-辨基-吡啶(6.21克，0.021mol，98%)。力腿,13，300MHz)51.8-1.85(d，3H)，6.0—6.15(q，1H)，7.0-7.1(t，1H)，7.2-7.21(d，1H)，7.25-7.5(m，2H)，8.0-8.05(d，1H)。3.將3-(2，6-二氯-3-氟-爺氧基)-2-硝基-吡啶(9.43克，0.028mol)及鐵屑(15.7克，0.28mol)懸浮于AcOH(650ml)與EtOH(500ml)的經(jīng)攪拌混合物中。將該反應物緩慢加熱至回流且將其攪拌l小時。將該反應物冷卻至i:溫，然后加入二乙醚(500ml)和水(500ml)。通過加入碳酸鈉來小心地中和溶液。合并的有機萃取物用飽和NaHC03(2xl00ml)、H20(2x100ml)及鹽水(1x100ml)洗滌，然后干燥(Na2S04)，過濾并在真空中濃縮至干燥狀態(tài)，得到淺粉色固體狀3-(2，6-二氯-3-氟-芐氧基)-吡啶-2-基胺(9.04克，0.027mol，99%)。^NMR(CDCh，300MHz)51.8-1.85(d，3H)，4.9-5.2(brs，2H),6.7-6.84(q，1H)，7.0-7.1(m，1H)，7.2-7.3(m，1H)，7.6—7.7(m，1H)。4.借助冰浴將3-(2，6-二氯-3-氟-千氧基)-吡啶-2-基胺(9.07克，0.03mol)溶于乙腈的經(jīng)攪拌溶液冷卻至0t:。在此溶液中逐份加入N-溴琥珀酰亞胺(NBS)(5.33克，0.03mol)。將該反應物在(TC下攪拌15分鐘。將該反應物在真空中濃縮至干燥狀態(tài)。將所得黑色油溶于EtOAc(500ml),并經(jīng)由硅膠層析法純化。然后在真空中去除溶劑，得到白色結晶固體狀5-溴-3-(2，6-二氯-3-氟-節(jié)氧基)-吡啶-2-基胺(5.8克，0.015mol，51%)。^NMR(CDC13，300MHz)51.85—1.95(d，3H)，4.7-5.0(brs,2H)，5.9-6.01(q，1H)，6.8-6.95(d，1H),7.01—7.2(t，1H)，7.4-7.45(m，1H)，7.8-7.85(d，1H)。5-溴-3-[1(R)-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-吡啶-2-基胺<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>如上所述制備該外消旋物的對映異構體純R異構體，但使用上述對映異構體純起始材料。力NMR(400MHz，DMSO-d6)51.74(d，3H)，6.40(m，1H)，6.52(brs，2H)，7.30(m，1H)，7.48(m,1H)，7.56(s，1H);MSm/z382(M+l)。4-甲磺?；趸?哌啶-l-羧酸叔丁酯(2)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>在冷卻至0'C的4-羥基-哌啶-l-羧酸叔丁酯(7.94克，39.45mmol)溶于CH2Ch(100ml)的經(jīng)攪拌溶液中緩慢加入NEt3(5.54ml，39.45mmol)，隨后加入甲磺酰氯(3.06ml，39.45mmol)及DMAP(48mg，0.39mmol)。將該混合物在室溫下攪拌過夜。向該混合物中加入水(30ml)。用CH2Ch(3x30ml)萃取，隨后干燥(Na2S04)并在真空中去除溶劑，得到白色固體狀的4-甲磺?；趸?哌啶-1-羧酸叔丁酯(11.00克，產率>99%)。!HNMR(CDC13，400MHz)S4.89(m,IH)，3.69(m，2H)，3.31(m，2H)，3.04(s，3H)，1.95(m，2H)，1.83(m，2H)，1.46(s，9H)。4-[4-(4，4,5,5-四甲基-l，3，2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-l-基]哌啶-1-羧酸叔丁酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>4-(4-丐}哚-1H-吡唑-l-基)哌啶-l-羧酸叔丁酯("在4X:下，將NaH(1.2當量，0.68mmol)逐份加入4-吲咮吡唑(0.57mmol)溶于DMF(2公升)的經(jīng)攪拌溶液中。將所得混合物在4匸下攪拌l小時且隨后加入4-甲磺?；趸?哌啶-l-羧酸叔丁酯，即化合物2U.l當量，0.63mmo1)。將所得混合物在100t:加熱12小時。用H20淬滅該反應物并用EtOAc萃取若干次。將合并的有機層干燥、過濾并濃縮，得到橙色油。該剩余物通過硅膠層析法(用5。/。存于戊烷中的EtOAc洗脫)純化，得到白色固體狀的化合物2(140克，66%)。4_[4-(4，4，5，5-四甲基-l，3，2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-lH-吡唑-l-基]哌啶-1-羧酸叔丁酯④將雙(戊酰)二硼(bis(pinacolato)diboron)(1.4當量，134克，0.52mol)及乙酸鉀(4當量，145克，1.48mol)依序加至化合物(140克，0.37mol)溶于l.5公升DMS0的溶液中。該混合物用氮氣凈化若干次且隨后加入二氯雙(三苯基膦)鈀(II)(0.05當量，12.9克，0.018mol)。將所得混合物在80。C下加熱2小時。將該反應混合物冷卻至室溫并過濾過硅藻土床且用EtOAc洗滌。濾液用飽和NaCl(500mlx2)洗滌，經(jīng)由Na2S04干燥，過濾并濃縮。該剩余物通過硅膠層析法(用5%存于己烷中的EtOAc洗脫)純化，得到白色固體狀的化合物4(55克，40%)。3-[(R)-l-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-5-(l-哌啶-4-基-lH-吡唑-4-基)-吡咬-2-基胺(i)在3-[(R)-1-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-5-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-吡啶-2-基胺(15.22克，35.64mmol)及4-(4-溴-吡唑-1-基)-哌啶-l-羧酸叔丁酯(14.12克，42.77mmol)溶于DME(143ml)的經(jīng)攪拌溶液中加入^20)3(H.33克，10692mmol)溶于水(36ml)的溶液。給該溶液脫氣并沖入氮氣三次。在該溶液中加入Pd(PPh3)2Ch(1.25mg，1.782mmo1)。給該反應溶液脫氣并再沖入氮氣三次。將該反應溶液在87t:油浴中攪拌約16小時(或直至硼烷頻哪醇酯耗盡為止)，冷卻至環(huán)境溫度并用EtOAc(600ml)稀釋。經(jīng)由硅藻土墊過濾該反應混合物并用EtOAc洗滌。該EtOAc溶液用鹽水洗滌，經(jīng)Na2S04干燥并濃縮。該粗制產物在用EtOAc/己烷系統(tǒng)洗脫的硅膠管柱上純化(Biotage90+管柱用600mll00%己烷平衡，區(qū)段l:2250ml50%EtOAc/己烷，線性；區(qū)段2:4500ml75%EtOAc/己烷線性；區(qū)段3:4500ml畫EtOAc),得到4-(4-{6-氨基-5-[(R)-1-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-吡啶-3-基}-吡唑-l-基)-哌啶-l-羧酸叔丁酯(11.8克，產率60%，純度約95%),其中Rf為0.15(50%EtOAc/己烷)。MSm/e550(M+l)+。在4-(4-{6-氨基-5-[(R)-l-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-吡啶-3-基}-吡唑-1-基)-哌啶-l-羧酸叔丁酯(ll.8克，21.45mmol)溶于CH2C12(59ml，0.2M)的溶液中加入4NHCl/二-惡烷(21ml)。將該溶液攪拌過夜，形成一固體。用玻璃棒將該固體徹底碾碎并超聲處理以釋放該固體中截留的起始材料。加入另外的4NHCl/二喁烷(21ral)并在室溫下再攪拌2小時，其中LCMS顯示不存在起始材料。將該懸浮液在襯有濾紙的布氏漏斗中加以過濾。保存母液，乃因其含有<5%的產物。將該固體轉移至50Oml燒杯中并加入HPLC水直至固體完全溶解。借助添加固體Na2C03將pH調節(jié)至10。該水溶液用CH2Cl2(5x200ml)萃取或直至LCMS顯示水性層中不存在產物為止。CH2Cl2溶液經(jīng)由Na2S04干燥并濃縮。重新溶于CH2Cl2(10ml)及MeOH(lml)中的粗制產物在用CH2Cl2/MeoH/NEt3系統(tǒng)洗脫的硅膠管柱上純化(Biotage40+管柱用600mlCH2Cl2100%平衡，得到副產物，區(qū)段l:1200mll0%MeOH/CH2Cl2線性；區(qū)段2:2400mll(^MeOH/CH2Cl2步驟；區(qū)段3:2400ml9%MeOH/1%NEt3/CH2Cl2)。收集所需部分，得到3-[(R)-l-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-lH-吡唑-4-基)-吡啶-2-基胺(7.19克，組合產率75%，白色固體)。MSm/e450(M+l)+。力醒R(DMS0-d6，400MHz)S7.92(s，1H)，7.76(s，1H)，7.58(m，1H)，7.53(s，1H)，7.45(m，1H)，6.90(s，1H),6.10(m，1H)，5.55(bs，2H)，4.14(m，1H)，3.05(m，2H)，2.58(m，2H)，1,94(m，2H)，1.80(d，3H)，1.76(m，2H)。將固體產物3-[(R)-1-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-5-(l-哌啶-4-基-lH-吡唑-4-基)-吡啶-2-基胺溶于二氯甲烷，并緩慢蒸發(fā)溶劑，生成微細結晶固體。高真空下千燥后，該樣品經(jīng)確認為單一多晶型物晶型A，其熔點為194'C。權利要求1.一種治療需要該治療的哺乳動物體內不正常細胞生長的方法，其包括向所述哺乳動物施用治療有效量的(R)-3-[1-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)-吡啶-2-基胺或其藥學上可接受的鹽。2.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中所述哺乳動物為人類。3.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中所述哺乳動物為狗。4.根據(jù)權利要求1至3中任一項的方法，其中所述不正常細胞生長是由至少一種遺傳改造酪氨酸激酶介導的。5.根據(jù)權利要求1至3中任一項的方法，其中所述不正常細胞生長是由肝細胞生長因子受體(c-Met/HGFR)激酶或間變性淋巴瘤激酶(ALK)介導的。6.根據(jù)權利要求5的方法，其中所述不正常細胞生長是由肝細胞生長因子受體(c-Met/HGFR)激酶介導的。7.根據(jù)權利要求5的方法，其中所述不正常細胞生長是由間變性淋巴瘤激酶(ALK)介導的。8.根據(jù)權利要求1至3中任一項的方法，其中所述不正常細胞生長為癌癥。9.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述癌癥選自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸部癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏病、食道癌、小腸癌、內分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、曱狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦干膠質瘤、垂體腺瘤及其組合。10.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述癌癥選自具有下列組成的組非小細胞肺癌(NSCLC)、鱗狀細胞癌、激素難治性前列腺癌、乳頭狀腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神經(jīng)母細胞瘤、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。11.根據(jù)前述權利要求中任一項的方法，其中所述化合物或其藥學上可接受的鹽作為藥物組合物施用，該藥物組合物包含(R)-3-[1-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-5-(l-哌啶-4-基-lH-吡唑-4-基)-吡啶-2-基胺及至少一種藥學上可接受的載體。12.—種通過施用(R)-3-[l-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-lH-吡唑-4-基)-吡啶-2-基胺來抑制細胞中c-Met/HGFR激酶活性的方法。13.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述細胞選自具有下列組成的組A549人類肺癌、GTL-16人類胃癌、HT29人類結腸癌、Colo205人類結腸癌、A498人類腎癌、786-0人類腎癌、MBA-MD-231人類乳腺癌、Madlin-Darby犬腎(MDCK)上皮細胞、經(jīng)改造表達P-糖蛋白的MDCK細胞(MDCK-MDR1)、mlMCD3小鼠腎上皮、HUVEC(人類臍靜脈內皮細胞)、Caki-l腎癌和經(jīng)改造表達人類野生型c-Met/HGFR及包括HGFR-V10921、HGFR-H1Q94R、HGFR-Y1230C和HGFR-M1250T在內的突變c-Met/HGFR的NIH-3T3細胞。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的c-Met/HGFR抑制劑即(R)-3-[1-(2，6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)-吡啶-2-基胺用于治療哺乳動物體內不正常細胞生長的用途。更具體地說，本發(fā)明提供治療患有癌癥的哺乳動物的方法。文檔編號A61P35/00GK101321527SQ200680045478公開日2008年12月10日申請日期2006年11月23日優(yōu)先權日2005年12月5日發(fā)明者J·G·克里斯坦森,鄒亞紅申請人:輝瑞產品公司