專利名稱：：包括ppar激動劑的藥物的制作方法
技術領域：
：0001本發(fā)明涉及促進瞼板腺上皮細胞或角膜上皮細胞增殖的試劑，包括PPAR(過氧化物酶體增殖物激活受體)a或S作為活性成分。
背景技術：
：0002瞼板腺為包括在上和下眼瞼內的產(chǎn)生脂質的腺體，通過位于眼瞼睫毛的結膜側的開口分泌脂質。構成淚液的脂質層含有瞼板腺提供的液體作為組分，防止淚液從眼表面蒸發(fā)。已知，在瞼板腺功能異?；虿€板炎患者中，瞼板腺的功能惡化，并且脂質分泌量減少，引起蒸發(fā)過強型干眼、角膜結膜上皮病癥、角膜上皮糜爛和角膜潰瘍(它們與干眼有關)，等等。此外，角膜由外胚層上皮和中胚層前界層(Bowman膜)/基質/后界層(Descemet膜)/內皮構成。由于角膜是眼球的最前部，其容易受到外界環(huán)境的影響，結果出現(xiàn)多種病癥。與角膜上皮細胞的損傷或缺陷有關的疾病的實例包括干眼綜合征、角膜潰瘍、淺層點狀角膜炎、角膜上皮糜爛、與角膜損害有關的眼變應性疾病如春季結膜炎和特應性角膜結膜炎，等等。0003另一方面，PPAR為核內受體之一，其在幾乎所有的脊推動物中表達，據(jù)稱是與細胞內糖-脂代謝和細胞分化緊密相關的轉錄因子族。作為亞型，a、5和y是已知的。一些情況下PPAR5被稱為PPARP(非專利文獻1)。作為PPAR在眼組織中的分布，已知PPARa和(3在兔的角膜上皮細胞中表達(非專利文獻2)以前，有報道稱具有PPAR激活作用的5-[4-(6-曱氧基-l-甲基-lH-苯并咪唑-2-基甲氧基)苯曱基]噻唑烷-2，4-二酮可被用作治療角膜結膜病癥的試劑(專利文獻1和2),以及在治療眼病(結膜炎、干眼綜合征、角膜炎等)中給予PPARot、S或Y激動劑(專利文獻3)。此外，已知PPARoc在肝、腎等中有分布，并且影響脂代謝/運輸，進一步地，有報告稱其激動劑可被用作治療角膜疾病的試劑(專利文獻4)。關于PPAR5激動劑，之前已有報告稱該激動劑促進大鼠皮脂腺上皮細胞的增殖和分化(非專利文獻3)，并促進皮膚損傷的愈合(非專利文獻4)。另外，已知通過給予非蓬唑烷二酮PPAR配體和GLP-1衍生物刺激P-細胞增殖(專利文獻5)和通過PPARY激動劑匹格列酮抑制白血病細胞和前列腺癌細胞的增殖(專利文獻6)的方法。0004但是，PPARa、5和y在每種動物種類和每種組織或細胞中的表達和功能包括4艮多待回答的問題，并且哪種PPAR激動劑可用于人眼疾病是未知的。[專利文獻1]WO2005/039574[專利文獻2]日本專利申請公開(JP-A)號2001-39976[專利文獻3]WO2002/076177[專利文獻4]JP-ANo.2005-008570[專利文獻5]WO2002/69994[專利文獻6]WO1998/25598[非專利文獻1]JMedChem2000,43:527-550[非專利文獻2]JBiolChem2000,275:2837[非專利文獻3]MolecularGeneticandMetabolism2001，74:362-369[非專利文獻4]AmJClinDermatol2003，4(8):523-530
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的問題0005本發(fā)明的目的是提供能夠促進瞼板腺上皮細胞和角膜上皮細胞增殖的試劑，其可為對諸如干眼等的眼病的基礎治療，以及用于諸如瞼板腺功能異常、蒸發(fā)過強型干眼等的眼病的治療劑，其含有所述的促進劑。實現(xiàn)目的的手段0006鑒于上述問題，本發(fā)明人進行了各種研究，結果發(fā)現(xiàn)PPARa或S激動劑具有促進瞼板腺上皮細胞和角膜上皮細胞增殖的活性，最終完成本發(fā)明。相應地，本發(fā)明包括至少以下內容(1)促進瞼板腺上皮細胞增殖的試劑，包括PPARa或S激動劑作為活性成分。(2)促進角膜上皮細胞增殖的試劑，包括PPARa或S激動劑作為活性成分。(3)治療瞼板腺功能異常(meibomianglanddysfunction)的試劑，包括PPARoc或S激動劑作為活性成分。(4)治療角膜上皮病癥的試劑(anagentfortreatingacornealepithelialdisorder),包括PPARa或5激動劑作為活性成分。(5)治療蒸發(fā)過強型干眼(hyperevaporativedryeye)的試劑，包4舌PPARa或5激動劑作為活性成分。(6)促進瞼板腺上皮細胞增殖的試劑，包括PPARS激動劑作為活性成分。(7)促進角膜上皮細胞增殖的試劑，包括PPAR5激動劑作為活性成分。(8)治療瞼板腺功能異常的試劑，包括PPARS激動劑作為活性成分。(9)治療角膜上皮病癥的試劑，包括PPAR5激動劑作為活性成分。(10)治療蒸發(fā)過強型干眼的試劑，包括PPARS激動劑作為活性成分。(11)根據(jù)(1)至(5)任一項的試劑，其中PPARa或5激動劑為式(I)表示的化合物或其藥理學可接受的鹽10007[化學式1]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>0008其中A為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團，B為選自畫CO-、-NH-、-(CH2)n-S-、醒(CH2)n-0-和-0-(CH2)n-0-的連接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-，Ar!為5至6元芳環(huán)基團，任選地具有1至3個取代基，Rj和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團，以及R3為氬、鹵素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團。(l2)根據(jù)(6)至(10)任一項的試劑，其中PPARS激動劑為式(II)表示的化合物或其藥理學可接受的鹽[化學式2]0010<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中A為氬原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團，B為選自-(CH2)n-S-和-0-(CH2)n-0-的連接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-，An為5至6元芳環(huán)基團，任選地具有1至3個取代基，和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團，以及R3為氫、卣素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團。(13)根據(jù)(11)或(12)的試劑，其中PPARS激動劑為(4-(3-(4-乙酰基-3-羥基-2-丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基)乙酸、(2-曱基-4-(((4-甲基-2-(4-(三氟曱基)苯基)-5_噻唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸或(4-(((2-(3-氟-(4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)甲基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸，或其藥理學上可接受的鹽。(14)根據(jù)(ll)的試劑，其中PPARa激動劑為2-(4-(4-氯苯曱?；?苯氧基)-2-曱基丙酸l-甲基乙脂或((4-氯-6-((2,3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸，或其藥理學上可接受的鹽。的用途。5一&、工(16)PPARa或5激動劑在生產(chǎn)促進角膜上皮細胞增殖的試劑中的用途。(17)PPARa或S激動劑在生產(chǎn)治療瞼板腺功能異常的試劑中的用途。(18)PPARa或5激動劑在生產(chǎn)治療角膜上皮病癥的試劑中的用途。(19)PPARa或S激動劑在生產(chǎn)治療蒸發(fā)過強型干眼的試劑中的用途。(20)PPARS激動劑在生產(chǎn)促進瞼板腺上皮細胞增殖的試劑中的用途。(21)PPAR5激動劑在生產(chǎn)促進角膜上皮細胞增殖的試劑中的用途。(22)PPARS激動劑在生產(chǎn)治療瞼板腺功能異常的試劑中的用途。(23)PPAR5激動劑在生產(chǎn)治療角膜上皮病癥的試劑中的用途。(24)PPARS激動劑在生產(chǎn)治療蒸發(fā)過強型干眼的試劑中的用途。(25)促進瞼板腺上皮細胞增殖的方法，包括向需要促進瞼板腺上皮細胞增殖的個體給予有效量的PPARa或S激動劑。(26)促進角膜上皮細胞增殖的方法，包括向需要促進角膜上皮細胞增殖的個體給予有效量的PPARa或S激動劑。(27)根據(jù)(25)的方法，其被執(zhí)行以治療瞼板腺功能異常。(28)根據(jù)(26)的方法，其被執(zhí)行以治療角膜上皮病癥。(29)治療蒸發(fā)過強型干眼的方法，包括向患有蒸發(fā)過強型干眼的患者給予有效量的PPARa或S激動劑。(30)促進瞼板腺上皮細胞增殖的方法，包括向需要促進瞼板腺上皮細胞增殖的個體給予有效量的PPAR5激動劑。(31)促進角膜上皮細胞增殖的方法，包括向需要促進角膜上皮細胞增殖的個體給予有效量的PPARS激動劑。(32)根據(jù)(30)的方法，其被執(zhí)行以治療瞼板腺功能異常。(33)根據(jù)(31)的方法，其被執(zhí)行以治療角膜上皮病癥。(34)治療蒸發(fā)過強型千眼的方法，包括向患有蒸發(fā)過強型干眼的患者給予有效量的PPARS激動劑。發(fā)明效果0011根據(jù)本發(fā)明，提供了促進瞼板腺上皮細胞增殖的新試劑或促進角膜上皮細胞增殖的新試劑，并且該促進劑促進了瞼板腺上皮細胞和角膜上皮細胞的增殖。此外，本發(fā)明的治療可有效地用于治療或改善疾病，如瞼板腺功能異常、角膜上皮病癥和蒸發(fā)過強型干眼。附圖簡要說明0012圖1顯示了培養(yǎng)的人角膜上皮細胞(上列)、培養(yǎng)的兔角膜上皮細胞(中列)、以及培養(yǎng)的猴瞼板腺上皮細胞(下歹'j)中PPARa、S或ymRNA的表達。實施本發(fā)明的最佳方式0013本發(fā)明提供了促進瞼板腺上皮細胞增殖的試劑，包括PPARot或5激動劑作為活性成分。該促進劑促進瞼板腺上皮細胞的增殖。本發(fā)明還提供了促進角膜上皮細胞增殖的試劑，包括PPARa或S激動劑作為活性成分。該促進劑促進了角膜上皮細胞的增殖。本發(fā)明中，促進細胞增殖的試劑意味著具有促進細胞分裂以增加細胞數(shù)量作用的試劑和具有抑制細胞死亡以增加細胞數(shù)量作用的試劑。0014本發(fā)明的促進劑包括PPARa或5激動劑作為活性成分。PPARa激動劑指具有結合并激活PPARa的作用的物質。另外，PPARS激動劑指具有結合并激活PPAR5的作用的物質。0015作為PPARa或S激動劑，可纟是及各種已知的PPARa或S激動劑。PPARa或S激動劑的特定實例包括例如WO2001/00603、W099/62872、WO2002/100813、W097/28149、WO2004/022551、WO2001/79197、WO2003/099793、W02005/105736、WO2005/105726、WO2005/085235、WO2005/113600、W02005/105754、WO2005/049606、WO2004/111020、WO2006/055187、WO2006/084176、WO2005/060958、WO2005/097786、W02004/092117、WO2005/037763、WO2005/030694、WO2005/016335、WO2003/074495、WO2004/058174、JP2003-171275A、JP2005-179281A、WO2006/031969、WO2005/097763、WO2004/063165、WO2002/050048、WO2005/090966、WO2003/099793、WO2002/076959、WO2002/053547、WO2001/00603、W097/28149、WO2004/063184、WO2006/090920、WO2006/059744、WO2006/041197、WO2003/033493、WO2003/016291、WO2002/076957、WO2002/046176、WO2002/046154、WO2002/014291、WO2001/079197等等中描述的物質。0016PPARa或S激動劑化合物的特定實例包括2-(4-(4-氯苯甲?；?苯氧基)-2-甲基丙酸l畫曱基乙酉旨(非諾貝特;CAS登記號49562-28-9)、((4國氯-6-((2，3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸(WY-14643;CAS登記號50892-23-4)、(4-(3-(4-乙?；?3-羥基-2-丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基)乙酸(L畫165041;CAS登記號79558-09-1)、(2-曱基-4-(((4-甲基-2-(4-(三氟甲基)苯基)-5-(噻唑基)甲基)硫基)苯氧基)乙酸(0\￥-501516;CAS登記號317318-70-0)、(4-(((2-(3-氟-4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)曱基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸(GW-0742;CAS登記號317318-84-6)、2-曱基-4-((2R)-2-(3-曱基-5-(4-(三氟曱基)苯基)-2-噻吩基)丙氧基)-苯丙酸(CAS登記號728038-95-7)、2-乙基-2-(4-(4-(4-(4-曱氧基苯基)-哌。秦-1-基)-2-(4-三氟曱基-苯基)-噻唑-5-基曱基磺?；?-苯氧基)丁酸(GSK-677954;CAS登記號884324-15-6)、(4-(3-(3-苯基-7-丙基-苯并呋喃-6-基氧基)-丙基磺?；?-苯基)乙酸(L-796449;CAS登記號194608-80-5)、以及2-(4-(3-(1-(2-(2-氯-6-氟-苯基)-乙基)-3-(2,3-二氯-苯基)-脲基)-丙基)-苯氧基)-2-曱基丙酸(GW-2433;CAS登記號227941-61-9)。0017知是否是PPARoc或S激動劑的物質組^中篩選得、到，并且J種物質(化合物.)可以被用作本發(fā)明的活性成分。已知PPARa或S激動劑分別結合PPARot或5的配體結合結構域(LBD)，以活化該受體，并調節(jié)PPAR靶基因的轉錄。為了利用這種性能并同時不影響存在于哺乳動物細胞中的其它核受體，可通過釆用LBD和酵母GAL4嵌合受體以及報告基因的篩選方法選擇新的PPARoc或5激動劑。0018作為篩選方法，以PPAR-GAL4測定舉例說明(參考文獻，T.M.Willsonetal.,JournalofMedicinalChemistry，2000，vol.43，No.4,p.528-550和J.M.Lehmannetal.，TheJournalofBiologicalChemistry,1995，vol.270，No.22,p.12953-12956)。具體地，實例包括的方法包括(a)向細胞引入載體和報告質粒的步驟，該載體用于表達酵母轉錄因子GAL4的DNA結合結構域(DBD)和PPARoc或5的LBD的融合蛋白，該質粒含有GAL4的DNA結合元件和報告基因，(b)讓細胞與測試物接觸、測量細胞中報告基因的表達量并將該表達量與未與測試物接觸的對照細胞中的表達量進行比較的步驟，以及0019土5,'、、'/在上述方法的步驟(a)中，所使用的細胞為不內源表達GAL4的細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞。報告基因可以為編碼可檢測的蛋白或酶的基因，其實例包括LUC(熒光素酶)基因、SPAP(分泌的胎盤堿性磷酸酶)基因、CAT(氯霉素乙酰轉移酶)基因等。'制備融合蛋白表達載體和報告質粒以及將該載體和質粒引入細胞可通過上述參考文獻或本身已知的方法進行。0020J在上述方法的步驟(b)中，測試物可以為任何已知的化合物或新化合物，其實例包括核酸、糖、脂、蛋白、肽、有機低分子量化合物、采用組合化學技術制備的化合物庫、通過固相合成方法或噬菌體展示技術制備的隨機肽庫、以及源于微生物、動物和植物、海洋生物等的天然組分。此外，在步驟(b)中，由于測試物存在或不存在導致的PPARot或5轉錄活性通過所謂的報告物測定進行研究。取決于所使用的報告基因，凈艮告物測定可通過本身已知的方法進行。在上述方法的步驟(c)中，當存在測試物時的報告物活性顯著高于其不存在時的報告物活性時，則測試物可一皮確定為具有PPARoc或S激動劑活性的化合物。當通過ECso值表示時，用在本發(fā)明中的PPARa激動劑對人PPARa的活性不超過50pM、優(yōu)選不超過10iaM、進一步優(yōu)選不超過5fiM。當通過ECso值表示時，用在本發(fā)明中的PPARS激動劑對人PPARS的活性不超過10(iM、優(yōu)選不超過1jiM、進一步優(yōu)選不超過0.1fiM。EC50值為采用人PPARa或5通過PPAR-GAL4測定測量的值(參見T.M.Willsonetal.，JournalofMedicinalChemistry,2000,vol.43,No.4,p.527-550)。PPARot或S激動劑的優(yōu)選實例包括具有以下式(I)表示的結構的化合物或其藥理學上可接受的鹽0021002200230024[化學式3]0025其中A為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團，B為選自畫CO-、-NH-、-(CH2)n-S-、隱(CH2)n-0畫和-0-(CH2)n-0-的連接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-,An為5或6元芳環(huán)基團，任選地具有1至3個取代基，Ri和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團，以及R3為氫、鹵素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團。0026對于上式(I)中的A,"碳原子數(shù)1至6的烷基基團"的實例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-甲基戊基、2-甲基戊基、3-曱基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1，3-二曱基丁基、2,2-二曱基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-曱基丙基、1，1，2-三甲基丙基等。碳原子數(shù)1至6的烷基基團優(yōu)選異丙基。0027對于上述式(I)中的B,連接物優(yōu)選-CO-、-NH-、《H2-S-或-0-(CH2)3-0-,更優(yōu)選-CHrS-或-0-(CH2)3-0-。0028對于上述式(I)中的Ar,，5或6元芳環(huán)基團的實例包括苯基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、嗯唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-嗯二唑基、1,2,4-P惡二唑基、1,3,4-嚼二唑基、呋咱基、1,2，3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1,2，3-三唑基、1，2,4-三哇基、四唑基、p比咬基、噠。秦基、嘧啶基、p比。秦基、三漆基等。該芳族環(huán)基團優(yōu)選苯基或噻唑基。0029上述式(I)中可以具有的取代基的實例包括卣素原子、羥基基團、碳原子數(shù)1至6的烷基基團、碳原子數(shù)1至6的卣代烷基基團、碳原子數(shù)2至7的?；腿芜x具有碳原子數(shù)1至6的烷基基團或碳原子數(shù)1至6的卣代烷基基團的苯基基團。優(yōu)選的取代基為氯原子、羥基基團、甲基基團、乙酰基基團、4-三氟曱基苯基基團和3-氟-4-曱基苯基基團。0030對于上述式(I)中R,或R2，"碳原子數(shù)1至6的烷基基團"的實例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-甲基丁基、2-曱基丁基、1，2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-曱基戊基、3-甲基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1，3-二曱基丁基、2，2-二曱基丁基、2，3-二曱基丁基、3,3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1,2-三曱基丙基等。該碳原子數(shù)1至6的烷基基團優(yōu)選曱基。0031對于上述式(I)中R3，"鹵素原子"的實例包括氟原子、氯原子、溴原子等。該卣素原子優(yōu)選為氯原子。0032對于上述式(I)中R3，"碳原子數(shù)1至6的烷基基團"的實例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-甲基戊基、3-曱基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2,3-二曱基丁基、3,3-二曱基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-曱基丙基、1,1,2-三甲基丙基等。該碳原子數(shù)1至6的烷基基團優(yōu)選曱基。0033式(I)表示的化合物藥理學上可接受的鹽的實例包括無機酸、有機酸和酸性氨基酸等的酸加合鹽，其中無機酸例如為鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等；有機酸例如為曱酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、馬來酸、蘋果酸、酒石酸、甲石黃酸、乙磺酸等；酸性氨基酸例如為天冬氨酸、谷氨酸等。這些鹽還包括其溶物可以含;光學異構體或幾;異i勾體。、這類異構體^包括在本發(fā)明的范圍內，并可根據(jù)本身已知的方法分離和純化。其任何混合物和分離形式都可用在本發(fā)明中。0034本發(fā)明中，式(I)表示的化合物中優(yōu)選的PPARa激動劑包括2-(4-(4-氯苯曱?；?苯氧基)-2-甲基丙酸l-甲基乙酯(非諾貝特；CAS登記號49562-28-9)、((4-氯-6-((2,3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸(WY-14643;CAS登記號50892-23-4)等。優(yōu)選的PPAR5激動劑包括4-(3-(4-乙?；?3-羥基-2_丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基乙酸(L-165041;CAS登記號79558-09-1)、(2-甲基-4-(((4-曱基-2-(4-(三氟曱基)苯基)-5-瘞唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸(GW-501516、CAS登記號317318-70-0)、(4-(((2-(3-氟-4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)甲基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸(GW-0742;CAS登記號317318-84-6)等。0035優(yōu)選的PPARS激動劑包括下式(II)表示的化合物和其藥理學上可接受的鹽0036[化學式4]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中A為氫原子或碳原子數(shù)l至6的烷基基團，B為選自-(CH2)n-S-和-0-(CH2)n-0-的連接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-,Ar!為5或6元芳環(huán)基團，任選地具有1至3個取代基，R,和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團，以及R3為氫、卣素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團。0037對于上述式(II)中的A，"碳原子數(shù)1至6的烷基基團"的實例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1，2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-曱基戊基、3-曱基戊基、4-曱基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二曱基丁基、1,3-二曱基丁基、2，2-二曱基丁基、2,3-二甲基丁基、3，3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基等。0038對于上述式(II)中的B，連接物優(yōu)選-CH2-S-或-0-(CH2)3-0-。0039對于上述式(II)中的Ar,,5或6元芳環(huán)基團包括苯基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、P惡唑基、異P惡唑基、噻唑基、異噻唑基、咪唑基、吡唑基、1，2,34惡二唑基、1,2,4-嗯二唑基、1,3,4-P惡二唑基、呋咱基、1,2，3畫蓬二唑基、1,2,4-漆二唑基、1，3,4-噻二唑基、1，2,3-三唑基、1,2,4-三哇基、四唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡。秦基、三嗪基等。該芳族環(huán)基團優(yōu)選苯基或p塞唑基。0040上述式(n)中Ar!可以具有的取代基的實例包括鹵素原子、羥基基團、碳原子數(shù)1至6的烷基基團、碳原子數(shù)1至6的卣代烷基基團、碳原子數(shù)2至7的?；鶊F和任選具有碳原子數(shù)1至6的烷基基團或碳原子數(shù)1至6的卣代烷基基團的苯基基團。優(yōu)選的取代基為氯原子、羥基基團、曱基基團、乙?；鶊F、4-三氟曱基苯基基團和3-氟-4-曱基苯基基團。0041對于上述式(II)中R,或R2,"碳原子數(shù)1至6的烷基基團"的實例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-曱基戊基、3-甲基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1,3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2,3-二曱基丁基、3，3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-曱基丙基、1,1，2-三曱基丙基等。該碳原子數(shù)1至6的烷基基團優(yōu)選曱基。10042對于上述式(II)中R3，"卣素原子"的實例包括氟原子、氯原子、溴原子等。該囟素原子優(yōu)選為氯原子。0043對于上述式(II)中R3，"碳原子數(shù)1至6的烷基基團"的實例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-甲基丁基、2-甲基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-曱基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二曱基丁基、1，3-二甲基丁基、2,2-二曱基丁基、2，3-二曱基丁基、3,3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-曱基丙基、1,1,2-三甲基丙基等。該碳原子數(shù)l至6的烷基基團優(yōu)選曱基。00441式(II)表示的化合物藥理學上可接受的鹽的實例包括無機酸、有機酸和酸性氨基酸等的酸加合鹽，其中無機酸例如為鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等；有機酸例如為曱酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、馬來酸、蘋果酸、酒石酸、甲磺酸、乙磺酸等；酸性氨基酸例如為天冬氨酸、谷氨酸等。這些鹽還包括其溶劑化物。式(II)表示的化合物可以具有不對稱碳原子或雙鍵，這種化合物可以含有光學異構體或幾何異構體。這類異構體也包括在本發(fā)明的范圍內，并可根據(jù)本身已知的方法分離和純化。其任何混合物和分離形式都可用在本發(fā)明中。0045本發(fā)明中，式(II)表示的化合物中，優(yōu)選的PPARa激動劑包括4-(3-(2-丙基-3-羥基-4-乙?；?苯氧基)丙基氧基苯氧基乙酸(L-16S(Ml;CAS登記號79558-09-1)、(2-甲基-4-(((4-曱基-2-(4-(三氟曱基)苯基)曙5-噻唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸(GW-501516;CAS登記號317318-70-0)、(4-(((2-(3-氟-4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)曱基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸(GW-0742;CAS登記號317318-84-6)等。0046在本發(fā)明的促進劑中，PPARa或S激動劑的含量通常為0.000001-1wt%，優(yōu)選0.00001-1wt%,最優(yōu)選0.0001-0.1wt%。0047除了上述活性成分，本發(fā)明的促進劑還可含有任何載體。載體的實例包括溶劑(例如水、醇等)、緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、谷氨酸、s氨基己酸等)、防腐劑(例如，苯扎氯胺、芐索氯銨(benzethoniumchloride)、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、苯曱醇、脫氫乙酸鈉、對羥基苯曱酸鹽、依地酸鈉、硼酸等)、等滲劑(例如，氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、葡萄糖、丙二醇等)等。10048本發(fā)明的促進劑可在體外或體內用作藥物或測試試劑。當本發(fā)明的促進劑被用作測試試劑時，其可在生理學和生物化學領域在多個方面用作測試試劑。10049當用作藥物時，由于本發(fā)明的促進劑促進瞼板腺上皮細胞的增殖，其可用做治療與瞼板腺上皮細胞的損傷或萎縮有關的疾病以及由于瞼板腺上皮細胞功能惡化產(chǎn)生的疾病。這種疾病的實例包括瞼板腺功能異常。此外，由于瞼板腺上皮細胞在淚液中分泌脂質組分，并且這種脂質防止了淚液蒸發(fā)并穩(wěn)定淚液層，所以本發(fā)明的治療劑可用于伴有淚液中脂質異常(分泌量減少、組分變化)的疾病。這種疾病的實例包括蒸發(fā)過強型干眼。此外，本發(fā)明的促進劑還可用于治療干眼、角膜潰瘍、淺層點狀角膜炎、角膜上皮糜爛等。00501此外，由于本發(fā)明的促進劑促進角膜上皮細胞的增殖，所以其可用作治療與角膜上皮細胞損傷(即，創(chuàng)傷或缺陷)有關的疾病。本發(fā)明的促進劑可用作治療角膜上皮病癥的試劑，具體地，與內源疾病有關的角膜上皮病癥如Sjogren綜合征、Stevens-Johnsons綜合征或干性角膜結膜炎(干眼)；手術后、藥物使用、創(chuàng)傷或使用隱形眼鏡情況下伴隨外源疾病的角膜上皮病癥；或伴隨角膜潰瘍或與角膜損害有關的眼變應性疾病的角膜上皮病癥、春季結膜炎(springcatarrh)或特應性角膜結膜炎(atopickeratoconjunctivitis)。本發(fā)明的促進劑也可用于治療淺層點狀角膜炎(superficialpunctatekeratitis)和角膜上皮潰瘍。此外，本發(fā)明的促進劑還可用作促進角膜傷口愈合的試劑。0051此外，由于本發(fā)明的促進劑具有角膜上皮細胞增殖促進活性和瞼板腺上皮細胞增殖活性，所以其顯示了直接作用于角膜組織的效果和通過作用于瞼板腺細胞而改善淚液功能的效果。結果，該試劑尤其可用作蒸發(fā)過強型干眼的治療劑。0052本發(fā)明的治療劑中，PPARa或5激動劑的含量通常為0.000001至1%重量比，優(yōu)選0.00001至1%重量比，最優(yōu)選0.0001至0.1%重量比。0053以本發(fā)明的促進劑或治療劑向其給藥的個體的實例包括哺乳動物(例如，人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、綿羊、猴等)。0054本發(fā)明的治療劑可以諸如滴眼劑、粘性皮膚貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、口服制劑等的劑型使用，并且除了上述活性成分外還可含有任意載體，例如藥物上可接受的載體。0055在本發(fā)明的治療劑中，其給藥途徑?jīng)]有特別限制，只要發(fā)揮了上述治療效果，但是該治療劑優(yōu)選局部給藥至眼。用于眼局部給藥的劑型的實例包括滴眼劑和眼軟膏。例如，當本發(fā)明的治療劑被用作滴眼劑或眼軟膏時，穩(wěn)定劑(例如，亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、依地酸鈉、檸檬酸鈉、抗壞血酸、二丁基羥基甲苯等)、增溶劑(例如，丙三醇、丙二醇、聚乙二醇(macrogol)、聚環(huán)氧乙烷硬化的蓖麻油等)、助懸劑(例如聚乙烯吡咯烷酮、羥基丙基曱基纖維素、羥曱基纖維素、羧甲基纖維素鈉等)、乳化劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、聚環(huán)氧乙烷硬化的蓖麻油、聚山梨醇酯80等)、緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、谷氨酸、s-氨基己酸等)、增稠劑(例如，水溶性纖維素衍生物如曱基纖維素、羥乙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素或羧曱基纖維素，硫酸軟骨素鈉，透明質酸鈉，羧基乙烯聚合物，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇等)、防腐劑(例如，苯扎氯胺、芐索氯銨、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、苯甲醇、脫氫乙酸鈉、對羥基苯曱酸酯、依地酸鈉、硼酸等)、等滲劑(例如，氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、葡萄糖、丙二醇等)、pH調節(jié)劑(例如，鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸等)、清新劑(例如l-薄荷醇、d-樟腦、d-龍腦、薄荷油等)、軟膏基質(白凡士林、純化的羊毛脂、液體石蠟、植物油(橄欖油、山茶油、花生油等)等)可作為添加劑被加入。盡管這些添加劑的量隨所添加的添加劑的種類、用途等而變化，但是添加劑可以以足以實現(xiàn)其目的的濃度加入。當本發(fā)明的治療劑被配制為滴眼劑或眼軟膏時，它們可以根據(jù)藥學領域常用的方法產(chǎn)生，并且例如可基于JapanesePharmacopoeia14thedition,GeneralRulesforPreparation,itemofeyedropsanditemofocularointments(日本藥典第14版，一般配制規(guī)則，滴眼劑項和眼軟膏項)生產(chǎn)。0056本發(fā)明提供了促進瞼板腺上皮細胞增殖的方法，包括向需要促進瞼板腺上皮細胞增殖的個體給予有效量的PPARa或S激動劑。進行該方法來治療瞼板腺功能異常是所期望的。0057本發(fā)明還提供了促進角膜上皮細胞增殖的方法，包括向需要促進角膜上皮細胞增殖的個體給予有效量的PPARa或S激動劑。進行該方法來治療角膜上皮病癥是所期望的。0058本發(fā)明還提供了治療蒸發(fā)過強型干眼的方法，包括向患有蒸發(fā)過強型干眼的患者給予有效量的PPARa或5激動劑。0059PPARa或5激動劑的有效量不能無條件地定義，其隨化合物的種類，給藥個體的年齡、體重和狀況，治療目的等而變化。當本發(fā)明的促進劑或治療劑向人給藥時，例如含有通常0.000001至1%重量比、優(yōu)選0.00001至1%重量比、最優(yōu)選0.0001至0.1%重量比濃度的PPARa或S激動劑的溶液每次給藥向每只眼給藥1或2滴，即每次給藥約50至200|LiL，每天1至8次。具有以上范圍內濃度和體積的溶液中含有的PPARa或S激動劑的量可作為有效量的實例被給出。實施例0060下文中，參照以下測試實施例描述本發(fā)明，但是本發(fā)明絕不一皮它們所限制。0061(測試實施例1)PPAR激動劑對細胞數(shù)量增加的作用，采用角膜上皮細胞1.使用的動物使用雄性兔(日本白兔，KITAYAMALABESCo.，Ltd.)。根據(jù)InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals(關于使用動物進行生物醫(yī)學研究的國際指導準則)使用實驗動物。2.制備角膜上皮細胞從兔眼球制備角膜上皮細胞。從分離的眼球切下角膜，保存在Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS;Invitrogen)中，并將其轉移至超凈工作臺。以下的細胞制備操作都是無菌進行的。將分離的角膜片段用向其中加入了1%青霉素-鏈霉素(Invitrogen)的D-PBS洗滌三次，并將其轉移至最低基礎培養(yǎng)基(MEM;Invitrogen)。用眼手術刀(Alcon)將浸泡在MEM中的角膜片段的角膜內皮細胞和Descemet膜剝離，并將剝離后的角膜片段(角膜基質和角膜上皮)轉移至加有2.4U/mL分散酶II(RocheDiagnostics)的MEM中。將其在37。C孵育1小時，之后，將該分散酶II處理的角膜片段轉移至MEM。采用眼手術刀將浸泡在MEM中的角膜片段的角膜上皮分離，并從MEM中去除角膜片段殘余(角膜基質)。將剝離的角膜上皮細胞和含有它們的MEM收集在50mL離心管中，在室溫下以1，500rpm離心5分鐘。棄去上清以得到角膜上皮細胞層。向該角膜上皮細胞層加入1mL胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen),充分混合后，讓細胞在37。C下孵育5分鐘以解開細胞間的粘合。向其中加入含有100/()胎牛血清(FBS;Invitrogen)的9mLMEM以終止酶反應，再次在室溫下以1,500rpm離心5分鐘以獲得角膜上皮細胞層。向得到的角膜上皮細胞層加入1mM的無血清液體培養(yǎng)基，用于正常兔角膜上皮細胞的增殖(RCGM^KuraboIndustriesLTD.)以懸浮細胞，將其接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿(IWAKI)以培養(yǎng)細胞，該培養(yǎng)皿中已加有9mL的RCGM2。接種的細胞培養(yǎng)在設置為37°C、5%C02、95%空氣、和100。/。濕度的培養(yǎng)箱(SANYO)中。培養(yǎng)基每48小時用新鮮培養(yǎng)基替換，直至測試曰。00623.測試物和制備方法以下的化合物一皮用作測試物。PPARa激動劑WY-14643(Calbiochem)和非諾貝特(fenofibrate)(Sigma畫Aldrich)PPAR5激動劑L-165041(Sigma國Aldrich)將每種測試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，濃度為培養(yǎng)基中終濃度的200倍，并保存在-80。C，直至使用前不久。為了研究每種測試物促進細胞增殖的作用，將從RCGM2中除去了附加至RCGM2的小鼠衍生表皮生長因子(mEGF)的培養(yǎng)基用作基礎培養(yǎng)基，而作為證實促進細胞增殖作用的陽性對照，根據(jù)RCGM2制備方案的指導使用向其中添加了mEGF的培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基+10ng/mLmEGF)。00634.測:汰方法1)培養(yǎng)皿的膠原處理作為測試促進細胞增殖的培養(yǎng)亞，使用了96孔組織培養(yǎng)培養(yǎng)皿(Corning)。測試前一天，向培養(yǎng)皿的每孔加入50|iL的0.01%I型膠原(NittaGelatinInc.),在4。C進行包一皮直至測試前不久。在測試當天，在除去I型膠原溶液后，用D-PBS洗滌培養(yǎng)亞的底部3次，將此作為月交原處理的培養(yǎng)皿用在測試中。2)細胞培養(yǎng)和添加測試物測試中，使用在直徑10cm的培養(yǎng)亞中已經(jīng)培養(yǎng)至亞匯合(subconfluent)的兔角膜上皮細胞。在除去培養(yǎng)基后，采用D-PBS將培養(yǎng)皿底部洗滌兩次，向其中加入1mL的胰蛋白酶-EDTA,并在37。C下孵育5分鐘，由此讓細胞從培養(yǎng)皿底部剝離。孵育后，將含有10%FBS的9mLMEM添加至培養(yǎng)皿以終止酶反應，并將其在室溫下以1，500rpm離心5分鐘，以獲得角膜上皮細胞層。向得到的細胞加入適量的RCGM2,達到2xio5細胞/mL的細胞濃度以懸浮細胞。向每孔加入64faL的這種細胞懸浮液，使經(jīng)膠原處理的用于組織培養(yǎng)的96孔培養(yǎng)皿單位底面積(0.32cm"的細胞數(shù)量為4x104細胞/112。結束細胞接種后，將培養(yǎng)皿轉移至設定為37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時。細胞接種24小時后，棄去培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿的每孔新加入100fiL的以下培養(yǎng)基。[l]僅基礎培養(yǎng)基(無添加物組)[2]基礎培養(yǎng)基+mEGF(終濃度10ng/mL;陽性對照組)[3]基礎培養(yǎng)基+WY-14643(終濃度0.1pM和1pM)[4]基礎培養(yǎng)基+非諾貝特(終濃度l!iM和10iLiM)[5]基礎培養(yǎng)基+L-165041(終濃度0.1pM和1pM)為了讓所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%,分別向培養(yǎng)基[l]和[2]加入5|uL/lmL的乙醇。3)細胞數(shù)量的測量從培養(yǎng)基替換起48小時后，除去每孔的培養(yǎng)上清，接著向每孔加入100加有10%細胞計數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的基礎培養(yǎng)基。加入后，將培養(yǎng)皿轉移至設定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育2小時。孵育2小時后，采用微孔板閱讀儀(Daini卯onPharmaceuticalCo.,Ltd.)測量450nm處的吸收值，并將此用作細胞數(shù)量增加的指標。00645.統(tǒng)計分析假定無添加物組的吸收值均值為100%，計算無添加物組、每種測試物添加組和陽性對照組每組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗法(雙尾)比較無添加物組與每種測試物添加組和陽性對照組。作為測試結果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。00656.測試結果增加每組的細胞數(shù)量的作用顯示在表1中。-假定無添加物組的細胞增殖為100%,所有測試物添加組中的細胞增殖和陽性對照組中的細胞增殖顯著高于無添加物組(p<0.01),并且其顯示細胞增殖被增強。從該測試結果顯然可知，PPARa激動劑和PPARS激動劑增加了角膜上皮細胞的數(shù)量。0066[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>0067PPARa激動劑或PPAR5激動劑或mEGF(陽性對照)被添加到培養(yǎng)的兔角膜上皮細胞中時的細胞數(shù)量變化被顯示為無添加物組均值為100%時的值(均值±標準偏差，N=5)。表中的**表示與無添加物組比較有顯著差異(p〈0.01)。0068(測試實施例2)PPARS激動劑對細胞數(shù)量增加的作用，采用角膜上皮細胞1.使用的動物使用雄性兔(日本白，重量約1.5kg,KITAYAMALABESCo.,Ltd.)。才艮才居InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals使用實驗動物。2.制備角膜上皮細胞采用與(測試實施例1)中相同的方法制備兔角膜上皮細胞。00693.測試物和制備方法以下的化合物^皮用作測試化合物。PPAR5激動劑L-165041(Sigma-Aldrich)和GW-501516(Alexis)將每種測試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，濃度達到培養(yǎng)基中終濃度的200倍，將它們保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測試物促進細胞增殖的作用，將從RCGM2中除去了附加至RCGM2的小鼠衍生表皮生長因子(mEGF)的培養(yǎng)基用作基礎培養(yǎng)基，而作為證實促進細胞增殖作用的陽性對照，根據(jù)RCGM2制備方案的指導使用向其中添加了mEGF的培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基+10ng/mLmEGF)。00704.測-試方法1)培養(yǎng)皿的膠原處理采用與(測試實施例1)中相同的方法進行培養(yǎng)皿的膠原處理。2)細力包培養(yǎng)和測試物的添加測試中，使用在直徑10cm的培養(yǎng)皿中已經(jīng)培養(yǎng)至亞匯合的兔角膜上皮細胞。在除去培養(yǎng)基后，采用D-PBS將培養(yǎng)皿底部洗滌兩次，向其中加入lmL的胰蛋白酶-EDTA,并在37°C下孵育5分鐘，由此讓細胞從培養(yǎng)皿底部剝離。孵育后，將含有10%FBS的9mLMEM添加至培養(yǎng)皿以終止酶反應，并將其在室溫下以1，500rpm離心5分鐘，以獲得角膜上皮細胞層。向得到的細胞加入適量的RCGM2，達到1x105細胞/mL的細胞濃度以懸浮細胞。向每孔加入64pL的這種細胞懸浮液，使經(jīng)膠原處理的用于組織培養(yǎng)的96孔培養(yǎng)皿單位底面積(0.32cn^)的細胞數(shù)量為2x10S田胞/cm2。結束細胞接種后，將培養(yǎng)皿轉移至設定為37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時。細胞接種24小時后，棄去培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿的每孔新加入100|LiL的以下培養(yǎng)基。[1]僅基礎培養(yǎng)基(無添加物組)[2]基礎培養(yǎng)基+mEGF(終濃度10ng/mL;陽性對照組)[3]基礎培養(yǎng)基+L-165041(終濃度0.1和1pM)[4]基礎培養(yǎng)基+GW-501516(終濃度0.01|aM和0.1pM)為了讓所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%，分別向培養(yǎng)基[l]和[2]加入5|aL/lmL的乙醇。3)細胞數(shù)量的測量從替換含有測試物的培養(yǎng)基起，每48小時除去每孔的培養(yǎng)上清，并且向每孔加入100pL新配制的培養(yǎng)基。從最初替換為含有測試物的培養(yǎng)基起120小時后，除去每孔的培養(yǎng)上清，接著向每孔加入IOO加有10%細胞計數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的基礎培養(yǎng)基。加入后，將培養(yǎng)皿轉移至設定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育2小時。孵育2小時后，采用微孔板閱讀儀(DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)測量450nm處的吸收值，并將此用作纟田月包凄史量增加的指標。00715.統(tǒng)計分析假定無添加物組的吸收值均值為100%，計算無添加物組、每種測試物添加組和陽性對照組每組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗法(雙尾)比較無添加物組與每種測試物添加組和陽性對照組。作為測試結果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。00726.測試結果每組細胞數(shù)量增加的影響顯示在表2中。假定無添加物組的細胞增殖為100%，所有測試物添加組中和陽性對照組中的細胞增殖顯著高于無添加物組(p<0.01),并且其顯示細胞增殖被增強。從該測試結果顯然可知，具有PPAR5激動劑活性的化合物增加了角膜上皮細胞的數(shù)量。0073[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>0074PPAR5激動劑或mEGF(陽性對照)^皮添加到培養(yǎng)的兔角膜上皮細胞中時的細胞數(shù)量變化纟皮顯示為相對于無添加物組均值為100%時的值(均值±標準偏差，N=5)。表中的**表示與無添加物組比較有顯著差異(p〈0.01)。0075(測試實施例3)PPAR激動劑對增加細胞數(shù)量的作用，采用瞼板腺上皮細胞1.使用的動物使用雄性食蟹猴(cynomolgusmonkey)(EnvironmentalBiologicalLifeScienceResearchCenter)。才艮據(jù)InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals使用實驗動物。2.制備瞼板腺上皮細胞從猴眼瞼制備瞼板腺上皮細胞。分離眼瞼，并保存在Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS;Invitrogen)中，將其轉移至超凈工作臺。以下的細胞制備操作都無菌進行。在分離的眼瞼被浸泡在80%乙醇中30秒后，將該眼瞼用向其中加有P/。青霉素-鏈霉素(Invitrogen)的D-PBS洗滌三次，并將其轉移至最^f氐基石出培養(yǎng)基(minimumessentialmedium)(MEM;Invitrogen)。在立體顯微鏡下除去圍繞瞼板腺組織的脂肪組織和肌肉組織，并將其轉移至含有0.475U/mL膠原酶A(RocheDiagnostics)和2.4U/mL分散酶II(RocheDiagnostics)的MEM中，在37°C孵育過夜。孵育結束后，將經(jīng)酶處理的組織再次置于立體顯^f鼓鏡下，除去睫毛和眼瞼結締組織，并分離出瞼板腺組織。向分離的腺體組織加入1mL胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)，在37。C下孵育5分鐘。孵育后，添加9mL含有10%FBS的MEM以終止酶反應，接著采用10mL移液管重復抽排五次，并進一步采用配備有21G注射針頭的注射器抽排五次，以分散構成組織的細胞。將細胞分散體經(jīng)100|^im、然后40jim尼龍濾器(CellStrainer;Falcon),以除去包含在分散體中的未經(jīng)酶處理的細胞團。在50mL離心管中回收已濾過濾器的細胞分散體，并在室溫下以1,500rpm離心5分鐘。向含有通過離心獲得的目的細胞的細胞層添加80fiL含有0.5%牛血清白蛋白(BSA;Sigma-Aldrich)的D-PBS，以充分懸浮細胞，向其中添加20的抗成纖維細胞微珠(MilitenyiBiotec),讓其在室溫下靜置30分鐘。完成與抗體的反應后，向其中加入2mL含有0.5%BSA的D-PBS,并再次在室溫下以1，500rpm離心5分鐘。向含有通過離心獲得的目的細胞的細胞層添加1mL含有0.5%BSA的D-PBS以充分懸浮細胞，將其滴加至預先采用柱洗液(含有2mMEDTA(DojindoLaboratories)和0.5%BSA的D-PBS)平tf的LD牙主(MilitenyiBiotec)。然后，向LD柱滴加2mL的柱洗液。從滴加細胞懸液后開始到完成滴加柱洗液，在50mL離心管中回收未被吸附至柱上的未被抗體標記的目的細胞(非成纖維細胞)。使回收在離心管中的細胞再次在室溫下以1,500rpm離心5分鐘，以除去上清液。向沉淀加入1mL的成分明確的角質細胞無血清培養(yǎng)基(DK-SFM;Invitrogen)以懸浮細胞，由此制備了瞼板腺上皮細胞懸液。將制備的細胞接種在直徑3.5cm的用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)皿(IWAKI)中，該培養(yǎng)i預先經(jīng)I型膠原溶液(NittaGelatinInc.)包被，并加入了3mL的DK-SFM。接種的細胞在設定37。C、5%C02、95%空氣、和100。/。濕度的培養(yǎng)箱(SANYO)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每48小時以新鮮培養(yǎng)基替換，直至測試日。00763.測試物和制備方法以下化合物用作測試物PPARa激動劑非諾貝特(Sigma-Aldrich)PPAR5激動劑L-165041(Sigma-Aldrich)PPARy激動劑曲格列酮(Calbiochem)將每種測試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，濃度達到培養(yǎng)基中終濃度的200倍，將它們保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測試物的促進細胞增殖效果，根據(jù)DK-SFM制備方案的說明，將從DK-SFM去除附加至DK-SFM的補充物而得到的培養(yǎng)基用作基礎培養(yǎng)基，而作為用于證實促進細胞增殖效果的陽性對照，使用向其中加入了補充物的培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基+補充物)。00774.測試方法1)培養(yǎng)皿的膠原處理將用于組織培養(yǎng)的96孔培養(yǎng)皿(Corning)用作細胞增殖促進測試的培養(yǎng)皿。在測試前一天，向培養(yǎng)皿的每孔加入50IliL的0.01%I型膠原(NittaGelatinInc.),在4°C進行包被直至測試前。在測試當天，在除去I型膠原溶液后，用D-PBS洗滌培養(yǎng)皿的底部3次，將此作為膠原處理的培養(yǎng)皿用在測試中。2)細力包培養(yǎng)和加入測試物在測試中，使用猴瞼板腺上皮細胞，其已經(jīng)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至亞匯合，直徑3.5cm,并且在液氮中冷藏保存。將已懸浮在細胞banker(NipponZenyakuKogyoCo.,Ltd.)并已;令藏寸呆存的纟田月包融解，專爭移至50mL離心管，加入10-倍量的DK-SFM。此后在室溫下以1,500rpm離心5分鐘以回收細l包層，加入合適量的DK-SFM以懸浮細胞，使得到的細胞濃度為3x106細胞/mL。向每孔加入64的這種細胞懸浮液，使得用于組織培養(yǎng)的經(jīng)膠原處理的96-孔培養(yǎng)皿單位底部面積(0.32cm,的細胞數(shù)量為6x10S田胞/cm2。細胞接種結束后，將培養(yǎng)皿轉移至設定了37。C、5%C02、95%空氣和100%濕度的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時。自細胞接種起24小時后，棄去培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿的每孔新加入100pL的以下培養(yǎng)基。[1]僅基礎培養(yǎng)基(無添加物組)[2]基礎培養(yǎng)基+補加物(陽性對照組)[3]基礎培養(yǎng)基+非諾貝特(終濃度1iaM和10|uM)[4]基礎培養(yǎng)基+L-165041(終濃度0.1(aM和1pM)[5]基礎培養(yǎng)基+曲格列酮(終濃度0.1fiM和1|iM)為了使所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%,向培養(yǎng)基[1]和[2]力口入5|uL/lmL的乙醇。3)細胞數(shù)的測量從開始培養(yǎng)基轉換起48小時后，用上述[1]至[4]的每種新制備的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。此外，自此48小時后，除去每孔的培養(yǎng)上清，接著向每孔加入100pL含有10%細胞計數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的DK-SFM。加入后，將培養(yǎng)皿轉移至設定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育兩小時。孵育兩小時后，采用微量板閱讀4義(DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)測量450nm處的吸收，將此用作細胞數(shù)量增加的指標。00785.統(tǒng)計分析，支定無添加物組的吸收值均值為100%,計算無添加物組、每種測試物添加組和陽性對照組每組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗法(雙尾)比4交無添加物組與每種測試物添加組和陽性對照組。作為測試結果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。00796.測試結果每組細胞數(shù)量增加的影響顯示在表3中。假定無添加物組的細胞增殖為100。/。，PPARot激動劑非諾貝特添加組和PPAR5激動劑L-165041添加組，以及陽性對照組中的細胞增殖顯著高于無添加物組(p〈0.01),并且其顯示細胞增殖被增強。另一方面，PPARY激動劑曲格列酮未顯示出細胞增殖促進活性。乂人該測試結果顯然可知，PPARot激動劑和PPAR5激動劑增加了瞼板腺上皮細胞的數(shù)量。0080[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>0081PPARot激動劑、PPAR5激動劑或PPARy激動劑或補加物(陽性對照)被添加到培養(yǎng)的猴瞼板腺上皮細胞中時的細胞數(shù)量變化被顯示為當無添加物組均值為100%時的值(均值±標準偏差，N=5)。表中的**表示與無添加物組比較有顯著差異(p<0.01)。0082(測試實施例4)PPAR在角膜上皮細胞和瞼板腺上皮細胞中的表達1.-使用的細胞將通過與(測試實施例l)相同方法制備并培養(yǎng)的細胞用作兔角膜上皮細胞。將通過與(測試實施例3)相同方法制備并培養(yǎng)的細胞用作猴瞼板腺上皮細胞。將在設定37°C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中采用用于正常人角膜上皮細胞增殖的無血清基礎培養(yǎng)基(EpiLife;KuraboIndustriesLTD.)培養(yǎng)的細胞用作人角膜上皮細胞(humancornealepithelialcell)。00832.測-汰方法1)A人細胞纟是取總RNA根據(jù)TRizol試劑(Invitrogen)常規(guī)方法從每種細胞提取總RNA2)從提取的RNA制備cDNA根據(jù)DNA-free(Ambion)常規(guī)方法在37°C進行總提取RNA的DNA酶處理30分鐘，以除去基因組DNA。根據(jù)SuperscriptII逆轉錄酶(Invitrogen)常規(guī)方法從提取的RNA制備cDNA。即，釆用隨機引物(Invitrogen)從1jag的經(jīng)DNA酶處理的總RNA制備與其互補的cDNA。3)擴增PPAR基因(聚合酶鏈式反應；PCR)根據(jù)PlatinumPCRSuperMix(Invitrogen)常規(guī)方法進行PPAR基因的PCR。參考人、猩猩、食蟹猴、牛和小鼠的已知序列，PPAR引物被設計為使得PCR產(chǎn)物為約200bps。PPARoc:GTAGAATCTGCGGGGACAAG(有義)(SEQIDNo.:1):GTTGTGTGACATCCCGACAG(反義)(SEQIDNo.:2)PPARS:TTCCTTCCAGCAGCTACACA(有義)(SEQIDNo.:3):GATCGTACGACGGAAGAAGC(反義)(SEQIDNo.:4)PPARy:CTCCGTGGATCTCTCCGTAA(有義)(SEQIDNo.:5):GATGCAGGCTCCACTTTGAT(反義)(SEQIDNo.:6)通過在94°C反應2分15秒后，重復94°C30秒、55°C30秒和72°C30分鐘的三階段反應35次，完成該PCR反應。使PCR反應后的樣品經(jīng)采用2%瓊脂糖的電泳，然后采用SYBRGold(MolecularProbes)對在膠中分離的DNA染色。讓染色的DNA在UV透射儀上發(fā)光，圖像被存儲為數(shù)字數(shù)據(jù)。00843.測試結果電泳后染色的DNA帶顯示在圖1中。作為該測試的結果，其證實所有PPARa、PPAR5和PPARy都在人角膜上皮細胞和猴瞼板腺上皮細胞中表達。此外，在兔角膜上皮細胞中，僅證實有PPARS的表達。Bonazzi等人報道，PPAR中PPARa和PPARP(=S)在兔角膜上皮細胞中表達(BonazziA.etal.，J.Biol.Chem.(2000);275(4):2837-2844)，在他們的報告中，他們使用了檢測PPARoc的特殊方法。如測試實施例1中所顯示的，顯然PPARa激動劑促進了兔角膜上皮細胞的增殖，既然Bonazzi等人的報告中采用特殊的檢測方法檢測到了PPARot，就提示PPARa在兔角膜上皮細胞中的表達量很小。0085(測試實施例5)PPAR5激動劑對細胞數(shù)量增加的作用，采用人角膜上皮細胞1.-使用的細月包使用了正常人角膜上皮細胞(KURABO)。2.測試物和制備方法將以下的化合物用作測試物。PPAR5激動劑L-165041(Sigma畫Aldrich),GW-501516(Alexis)將每種測試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，終濃度為培養(yǎng)基中終濃度的200倍，保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測試物促進細胞增殖的作用，將這樣的培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基)用作細胞培養(yǎng)基向EpiLife(KURABO)中添加了包含在HCGS增殖添加劑組合(KURABO)中的胰島素、氫化可的松、和轉鐵蛋白。此外，作為證實細胞增殖促進作用的陽性對照，使用了向基礎培養(yǎng)基中添加了包含在HCGS增殖添加劑組合(KURABO)中的小鼠衍生上皮生長因子(mEGF)的培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基+lng/mLmEGF)。00863.測:汰方法1)細力包i告養(yǎng)和測試物的添加融解在液氮中冷藏保存的正常人角膜上皮細胞、對細胞計數(shù)，并且將其總量轉移至向其中添加了所有HCGS增殖添加劑組合(胰島素、小鼠衍生上皮生長因子、氫化可的松、轉鐵蛋白、牛垂體腺提取物)的4mLEpiLife(完全培養(yǎng)基)中，以將它們充分懸浮。將該細胞懸浮液接種在纖維蛋白包被的多孔板(24孑L,BECTONDICKINSON)上，使得細胞數(shù)為2x].O4細胞/500^L/孔(由于底面積為2cm2,數(shù)量為1x104細胞/cm2)。在完成細胞接種后，在設定37°C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，接著培養(yǎng)基每個以400nL的基礎培養(yǎng)基替換。另外，此后24小時，培養(yǎng)基被各400nL的以下培養(yǎng)基替換。[1]僅基礎培養(yǎng)基(無添加物組)[2]基礎培養(yǎng)基+mEGF(終濃度1ng/mL;陽性對照組)[3]基礎培養(yǎng)基+L-165041(終濃度0.01|aM和0.1,[4]基礎培養(yǎng)基+GW-501516(終濃度0.001|uM和0.01pM)為了使所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%,向培養(yǎng)基[1]和[2]分別加入5jaL/1mL的乙醇。2)細胞數(shù)量的測量在開始用測試物刺激起24小時后，除去每孔的培養(yǎng)上清，將其中加有10。/。細胞計數(shù)試劑盒-8(a10%CellCountingKit-8)(DOJINDO)的200iaL基礎培養(yǎng)基加入至每孔。加入后，將培養(yǎng)皿轉移至設定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育2小時，在完成該反應后，從上清液各取出100|iL至用于組織培養(yǎng)的培養(yǎng)皿(Corning)。已轉移至96孔培養(yǎng)皿的反應溶液在450nm處的吸收值通過微量板閱讀4義(DainipponSumitomoPharmaceuticalCo.,Ltd.)觀'J量,并將此用作細胞數(shù)量增加的指標。00874.統(tǒng)計分析假定無添加物組的吸收值的均值為100%,計算無添加物組、每種測試物添加組和陽性對照組每組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗法(單尾)比4交無添加物組與每種測試物添加組和陽性對照組。作為測試結果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。5.測試結果每組細胞數(shù)量增加的影響顯示在表4中。假定無添加物組的細月包增殖為100%,測試物添加組(<0.01)，以及陽性對照組(p〈0.05)中的細胞增殖顯著高于無添加物組，并且其顯示細胞增殖被增強。從該測試結果顯然可知，PPARS激動劑增加了正常人角膜上皮細胞的數(shù)量。00891[<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>PPARS激動劑或mEGF(陽性對照)被添加到培養(yǎng)的正常人角膜上皮細胞中時的細胞數(shù)量變化被顯示為相對于無添加物組均值為100%時的值(均值±標準偏差，N二3至4)。表中的*表示與無添加物組比4交有顯著差異(p<0.05)，表中的"表示與無添加物組比較有顯著差異(p<0.01)。0091(測試實施例6)PPARS激動劑對細胞數(shù)量增加的作用，采用正常人角膜上皮細胞1.4吏用的細月包使用正常人角膜上皮細胞(KURABO)。2.測試物和制備方法將以下化合物用作測試物。PPAR5激動劑GW-501516(Alexis),GW-0742(Sigma畫Aldrich)將每種測試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，終濃度為培養(yǎng)基中終濃度的200倍，保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測試物對促進細胞增殖的影響，將這樣的培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基)用作細胞培養(yǎng)基向EpiLife(KURABO)中添加了包含在HCGS增殖添加劑組合(KURABO)中的胰島素、氫化可的松、和轉鐵蛋白。00923.測i式方法1)纟田胞培養(yǎng)和測試物的添力口融解在液氮中冷藏保存的正常人角膜上皮細胞，對細胞計數(shù)，并且將其總量轉移至向其中添加了所有HCGS增殖添加劑組合(胰島素、小鼠衍生上皮生長因子、氫化可的松、轉鐵蛋白、牛垂體腺提取物)的4mLEpiLife(完全培養(yǎng)基)中，以將它們充分懸浮。將該細胞懸浮液接種在用于組織培養(yǎng)的96孔培養(yǎng)皿(Corning)上，使得細胞數(shù)為1.28x104細胞/100nL/孔(由于底面積為0.32cm2,數(shù)量為4x1()4細胞/cm2)。在完成細胞接種后，在設定37°C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，接著培養(yǎng)基以100pL的基礎培養(yǎng)基(EpiLife,向其中加入了HCGS增殖添加劑的胰島素、氫化可的松和轉鐵蛋白)替換。另外，此后24小時，培養(yǎng)基被各100的以下培養(yǎng)基替換。[1]基礎培養(yǎng)基(無添加物組)[2]基礎培養(yǎng)基+GW-501516(終濃度0.01|iM)[3]基礎培養(yǎng)基+GW-0742(終濃度0.01^M)為了使所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%，向培養(yǎng)基[l]加入5|iL/lmL的乙醇。2)細胞數(shù)量的測量在開始用測試物刺激起48小時后，除去每孔的培養(yǎng)上清，將其中加有10%細胞計數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的100[iL基礎培養(yǎng)基加入至每孔。加入后，將培養(yǎng)皿轉移至設定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育2小時。每孔在450nm處的吸收值通過微量板閱讀4義(DainipponSumitomoPharmaceuticalCo.,Ltd.)測量，并^l奪jt匕用作細胞數(shù)量增加的指標。00934.統(tǒng)計分析假定無添加物組的吸收值的均值為100%,計算無添加物組和每種測試物添加組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗法(單尾)比較無添加物組與每種測試物添加組和陽性對照組。作為測試結果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。00945.測試結果每組細胞數(shù)量增加的影響顯示在表5中。假定無添加物組的細胞增殖為100%，兩測試物添加組中的細胞增殖顯著高于無添加物組，并且其顯示細;9包增殖^:增強(p<0.01)。^v該測試結果顯然可知，PPARS激動劑增加了正常人角膜上皮細胞的數(shù)量。0095[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>0096PPARS激動劑被添加到培養(yǎng)的正常人角膜上皮細胞中時的細胞數(shù)量變化被顯示為相對于無添加物組均值為100%時的值(均值±標準偏差，N=4至5)。表中的"表示與無添加物組比較有顯著差異(p〈0.01)。0097(測試實施例7)PPARy激動劑對細胞數(shù)量增加的影響，采用正常人角膜上皮細胞1.使用的細胞使用正常人角膜上皮細胞(KURABO)。2.測試物和制備方法采用以下化合物作為測試化合物。PPARy激動劑曲格列酮(Calbiochem)將測試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，終濃度為培養(yǎng)基中終濃度的200倍，保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測試物對正常人角膜上皮細胞的影響，將這樣的培養(yǎng)基(EpiLife基礎培養(yǎng)基)用作細胞培養(yǎng)基向EpiLife(KURABO)中添加了包含在HCGS增殖添加劑組合(KURABO)的添加劑中的胰島素、氬化可的松、和轉鐵蛋白，除了小鼠衍生上皮生長因子(mEGF)。00983.測i式方法1)細胞培養(yǎng)和添加測試物正常人角膜上皮細胞融解在液氮中冷藏保存的正常人角膜上皮細刀包，對細胞計數(shù)，并且將其總量轉移至向其中添加了所有HCGS增殖添加劑組合(含有mEGF)的EpiLife(完全培養(yǎng)基)中，以將它們充分懸浮。將該細胞懸浮液接種在如測試實施例1中所述被膠原包被的多孔板(96孑L,Costar)中，使得細胞數(shù)為1.28x104細胞/64(aL/孔(由于底面積為0.32cm2,數(shù)量為4x1()4細胞/cm2)。在完成細胞接種后，在設定37°C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，接著培養(yǎng)基以100(iL的含有以下測^式物的培養(yǎng)基替換，并繼續(xù)培養(yǎng)。[1]僅EpiLife基礎培養(yǎng)基(無添加物組)[2]EpiLife基礎培養(yǎng)基+曲格列酮(終濃度0.1fiM)為了使所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%,向培養(yǎng)基[l]加入5pL/1mL的乙醇。在測試物添加起始日和細胞數(shù)量測量日之間，每兩天將培養(yǎng)基以含有前述測試物的培養(yǎng)基替換。2)細胞數(shù)量的測量在開始用測試物刺激起6天后，除去每孔的培養(yǎng)上清，將其中加有10%細胞計數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的100pLEpiLife基礎培養(yǎng)基加入至每孔。加入后，將培養(yǎng)皿轉移至設定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育2小時，完成反應后該培養(yǎng)i每孔在450nm處的吸^lj直通過樣i:量氺反閱"i賣^義(DainipponSumitomoPharmaceuticalCo.,Ltd.)測量，并將此用作細胞數(shù)量增加的指標。00994.統(tǒng)計分析假定無添加物組的吸收值的均值為100%,計算無添加物組和每種測試物添加組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗法(單尾)比較無添加物組與每種測試物添加組。作為測試結果，小于5%的顯著性水平纟皮確定為顯著的。01005.測試結果PPARy激動劑對正常人角膜上皮細胞的影響顯示在表6中。從該測試結果可知，沒有看出PPARy激動劑增加角膜上皮細胞數(shù)量的作用。0101[表6]<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>0102PPARr激動劑被添加到培養(yǎng)的正常人角膜上皮細胞中時的細胞數(shù)量變化被顯示為相對于無添加物組均值為100%時的^直(均值±標準偏>差，N=3或4)。表中的**表示與無添加物組比較有顯著差異(p<0.01)。0103(測試實施例8)PPAR5激動劑對瞼板腺上皮細胞數(shù)量增加的作用1.制備猴瞼板腺上皮細胞從猴眼瞼制備瞼板腺上皮細胞按測試實施例3進行。采用成分明確的角質細胞無血清培養(yǎng)基(DK-SFM;Invitrogen,根據(jù)制備方案添加了附加的補加物)在設定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，并且培養(yǎng)基每48小時用新鮮培養(yǎng)基替換，直至達到亞匯合。01042.測試物和制備方法將以下化合物用作測試化合物。PPAR5激動劑L-165041(Sigma-Aldrich)和GW-501516(Alexis)將每種測試物溶解在乙醇(NacalaiTesque，Inc.)中，濃度達到培養(yǎng)基中終濃度的200倍，將它們保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測試物的促進細胞增殖效果，根據(jù)DK-SFM制備方案的說明，將從DK-SFM去除附加至DK-SFM的補充物而得到的培養(yǎng)基用作基礎培養(yǎng)基，而作為用于證實促進細胞增殖效果的陽性對照，使用向其中加入了補充物的培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基+補充物)。01053.測試方法1)培養(yǎng)jm的膠原處理采用I型膠原(NittaGelatinInc.)包被用于細胞增殖促進測試的培養(yǎng)皿，如測試實施例3中所述。2)細胞培養(yǎng)和測試物的添加在測試中，使用猴瞼板腺上皮細胞，其已經(jīng)被培養(yǎng)至亞匯合，懸浮在細胞banker(NipponZenyakuKogyoCo.，Ltd.)中并冷藏保存在液氮中。將冷藏保存的細胞融解，轉移至50mL離心管，并加入10-倍量的DK-SFM。此后在室溫下以1,500rpm離心5分鐘以回收細胞層，力口入合適量的DK-SFM以懸浮細胞，使得到的細胞濃度為2x106細胞/mL。向每孔加入64|aL的這種細胞懸浮液，使得用于組織培養(yǎng)的經(jīng)月交原處理的96-孔培養(yǎng)皿單位底部面積(0.32cm"的細胞數(shù)量為4x104細胞/cm2。細胞接種結束后，將培養(yǎng)皿轉移至設定37。C、5%C02、95%空氣和100%濕度的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時。自細胞接種起24小時后，棄去培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿的每孔新加入100(iL的以下培養(yǎng)基。[1]僅基礎培養(yǎng)基(無添加物組)[2]基礎培養(yǎng)基+補加物(陽性對照組)[3]基礎培養(yǎng)基+L-165041(終濃度0.1(iM和1pM)[4]基礎培養(yǎng)基+GW-501516(終濃度0.01和0.1一)為了使所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%,分別向培養(yǎng)基[l]和2]加入5fiL/1mL的乙醇。3)細胞數(shù)量的測量從最初培養(yǎng)基替換起48小時后，培養(yǎng)基以新制備的培養(yǎng)基[1]至[4]之一替換。此外，自此48小時后，培養(yǎng)基再次用新制備的培養(yǎng)基[l〗至[4]之一替換。此外，自此48小時后，除去每孔的培養(yǎng)上清，接著向每孔加入100|aL加有10%細胞計數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的基礎培養(yǎng)基。加入后，將培養(yǎng)皿轉移至設定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，并孵育2小時。孵育2小時后，采用微量板閱讀儀(DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)測量450nm處的吸收值，并3尋jt匕用作細胞數(shù)量增加的指標。4.統(tǒng)計分析假定無添加物組的吸收值的均值為100%，計算無添加物組、每種測試物添加組和陽性對照組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗法(單尾)比較無添加物組與每種測試物添加組和陽性對照組。作為測試結果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。01075.測試結果每組的促進細胞增殖作用顯示在表7中。假定無添加物組的細月包增殖為100%,PPARS激動劑L-165041(l(T6M)添加組和PPAR5激動劑GW-501516(l(T7M)添加組，以及陽性對照組中的細胞增殖顯著高于無添加物組，并且其顯示細胞增殖被增強。從該測試結果顯然可知，PPARS激動劑增加了瞼板腺上皮細胞的數(shù)量。0108[表7]<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>0109PPAR5/p激動劑或補充物(supplement)!陽性對照.)被添加到培養(yǎng)的猴瞼板腺上皮細胞中時的細胞數(shù)量變化被顯示為相對于無添加物^L均值為100%時的值(均值±標準偏差，N=5)。表中的*表示與無添力口物組比較有顯著差異(p<0.05),表中的**表示與無添加物組比較有顯著差異(p〈0.01)。0110(測試實施例9)研究PPARS激動劑對角膜上皮損傷的愈合促進活性1.使用的動物使用雄性兔(日本白兔，KITAYAMALABESCo.,Ltd.)。根據(jù)InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals使用實驗動物。2.測試物和制備滴眼劑溶液的方法將PPARS激動劑GW-501516(AlexisBiochemicals)用作測試物。其中GW-501516以0.05%懸浮在以下載體中的溶液3皮用作滴眼劑溶液。無水磷酸二氫鈉0.05g氯化鈉0.45g超純水q.s.聚山梨醇酯80(Polysorbate80)0.05mLNaOH__總量50mL(pH7.0)作為測試物給藥組的對照，設置了不含藥物的上述載體給藥組。01113.實,險方法1)角膜上皮細胞刮除在通過肌肉注射(0.9mL/kg)selactar(2%曱苯蓬口秦Bayer):ketalar(5%氯胺酮Sankyo)=0.5:1混合溶液使動物全身麻醉后，給予鹽酸丁氧普魯卡因滴眼劑溶液(Benoxil滴眼劑溶液0.4%;SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.),^吏眼球暴露。采用直徑6mm的環(huán)鉆在角月莫中心部分的角膜上皮上鉆出直徑6mm的痕跡，并在立體顯微鏡下將鉆出圓周內的整個角膜上皮層刮除。刮除后，采用生理鹽水(OtsukaPharmaceuticalFactoryInc.)洗滌角膜表面，讓眼球返回到眼眶以完成角膜上皮刮除處理。2)給藥采用微量移液管向處理眼給予測試物滴眼劑溶液或滴眼劑溶液載體，每次50iuL,在角膜上皮刮除當天給藥兩次，第二天和之后，每天四次，直至完成測試。3)評估將完成所有個體雙眼角膜上皮刮除的時間點定義為測試起始時間(0小時)，通過在其后24、38和48小時定量角膜上皮缺損面積，評估角膜上皮的恢復。即，在每個時間點，向經(jīng)處理眼給予10fiL的0.1%焚光素鈉(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)溶液，采用配備了鈷濾光片的裂隙燈立即對動物眼前端照相，由此記錄經(jīng)染色的角膜上皮缺損面積。將顯影的照片作為數(shù)字圖像存儲在計算機中，采用圖像分析軟件(Image-ProPlus)測量經(jīng)染色的角膜上皮缺損部分的面積。01124.統(tǒng)計分析關于在每個時間點測量的角膜上皮缺損面積，計算每個個體的值，假定其起始值為100%,將此采納為剩余角膜上皮缺損的比例。關于每個時間點剩余角膜上皮缺損的比例，通過t檢驗進行載體給藥組和測試物給藥組的比較，少于5%的顯著性水平被確定為顯著的。01135.測試結果載體給藥組和0.05%GW-501516給藥組在每個測量時間點時剩余角膜上皮缺損的比例顯示在表8中。其顯示0.05%GW-501516給藥組在角膜上皮刮除后24小時和38小時時角膜上皮缺損比例顯著降低。48小時后，所有個體中角膜上皮缺損消失。由此檢驗結果顯然可知，通過向眼給予PPARS激動劑促進了缺損的角膜上皮的恢復。0114[表8]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>0115對于每個個體，假定起始值為100%,顯示了通過計算在兔眼的角膜上皮刮除處理后剩余的角膜上皮缺損比例(％)而獲得的值(均值±標準偏差，N二4)。表中的f表示與載體給藥組相比有顯著差異(p<0.05),**表示與載體給藥組相比有顯著差異(p<0.01)。工業(yè)實用性0116根據(jù)本發(fā)明，提供了促進瞼板腺上皮細胞增殖的新試劑或促進角膜上皮細胞增殖的新試劑，該促進劑促進了瞼板腺上皮細胞和角膜上皮細胞的增殖。此外，本發(fā)明的治療劑可有效用于治療/改善諸如瞼板腺功能異常、角膜上皮病癥或蒸發(fā)過強型干眼的疾病。0117本發(fā)明基于2005年11月28日提交的日本專利申請2005-342025，在此通過參考將其內容整體并入本文。權利要求1.一種促進瞼板腺上皮細胞增殖的試劑，包括作為活性成分的PPARα或δ激動劑。2.—種促進角膜上皮細胞增殖的試劑，包括作為活性成分的PPARot或5激動劑。3.—種治療瞼板腺功能異常的試劑，包括作為活性成分的PPARoc或S激動劑。4.一種治療角膜上皮病癥的試劑，包括作為活性成分的PPARa或5激動劑。5.—種治療蒸發(fā)過強型干眼的試劑，包括作為活性成分的PPARa或5激動劑。6.—種促進瞼板腺上皮細胞增殖的試劑，包括作為活性成分的PPARS激動劑。7.—種促進角膜上皮細胞增殖的試劑，包括作為活性成分的PPA&S激動劑。8.—種治療瞼板腺功能異常的試劑，包括作為活性成分的PPARS激動劑。9.一種治療角膜上皮病癥的試劑，包括作為活性成分的PPAR5激動劑。10.—種治療蒸發(fā)過強型干眼的試劑，包括作為活性成分的PPARS激動劑。11.如權利要求1至5中任一項所述的試劑，其中所述PPARot或5激動劑為式(I)表示的化合物或其藥理學上可接受的鹽其中A為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團，B為選自-CO-、-NH-、-(CH2)n-S-、-(CH2)n-C-0-(CH2)i^接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-,Ar,為5至6元芳環(huán)基團，任選地具有1至3個取代基，R,和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團，以及R3為氫、卣素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團。12.如權利要求6至10中任一項所述的試劑，其中所述PPARS激動劑為式(II)表示的化合物或其藥理學上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中A為氫原子或碳原子數(shù)l至6的烷基基團，B為選自-(CH2)n-S-和-0-(CH2)n-0-的連接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-，Ar，為5至6元芳環(huán)基團，任選地具有1至3個取代基，R,和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團，以及R3為氫、卣素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團。13.如權利要求11或12所述的試劑，其中所述PPAR5激動劑為(4-(3-(4-乙?；?3-羥基-2-丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基)乙酸、(2-甲基一4-(((4-曱基-2-(4-(三氟曱基)苯基)-5-噻唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸或(4-(((2-(3-氟-(4-(三氟曱基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸，或它們藥理學上可接受的鹽。14.如權利要求11所述的試劑，其中所述PPARoc激動劑為2-(4-(4-氯苯曱酰基)苯氧基)-2-曱基丙酸1-甲基乙酯或((4-氯-6-((2，3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸，或它們藥理學上可接受的鹽。15.PPARoc或S激動劑在生產(chǎn)促進瞼板腺上皮細胞增殖的試劑中的用途。16.PPARot或S激動劑在生產(chǎn)促進角膜上皮細胞增殖的試劑中的用途。17.PPARa或S激動劑在生產(chǎn)治療瞼板腺功能異常的試劑中的用途。18.PPARoc或5激動劑在生產(chǎn)治療角膜上皮病癥的試劑中的用途。19.PPARot或S激動劑在生產(chǎn)治療蒸發(fā)過強型干眼的試劑中的用途。20.PPAR5激動劑在生產(chǎn)促進瞼板腺上皮細胞增殖的試劑中的用途。21.PPARS激動劑在生產(chǎn)促進角膜上皮細胞增殖的試劑中的用途。22.PPARS激動劑在生產(chǎn)治療瞼板腺功能異常的試劑中的用途。23.PPARS激動劑在生產(chǎn)治療角膜上皮病癥的試劑中的用途。24.PPAR5激動劑在生產(chǎn)治療蒸發(fā)過強型干眼的試劑中的用途。25.—種促進瞼板腺上皮細胞增殖的方法，包括向需要促進瞼板腺上皮細胞增殖的個體給予有效量的PPARot或5激動劑。26.—種促進角膜上皮細胞增殖的方法，包括向需要促進角膜上皮細胞增殖的個體給予有效量的PPARa或S激動劑。27.如權利要求25所述的方法，其被執(zhí)行以治療瞼板腺功能異常。28.如權利要求26所述的方法，其被執(zhí)行以治療角膜上皮病癥。29.—種治療蒸發(fā)過強型干眼的方法，包括向患有蒸發(fā)過強型干眼的患者給予有效量的PPARa或5激動劑。30.—種促進瞼板腺上皮細胞增殖的方法，包括向需要促進瞼板腺上皮細胞增殖的個體給予有效量的PPARS激動劑。31.—種促進角膜上皮細胞增殖的方法，包括向需要促進角膜上皮細胞增殖的個體給予有效量的PPAR5激動劑。32.如權利要求30所述的方法，其被執(zhí)行以治療瞼板腺功能異常。33.如權利要求31所述的方法，其被執(zhí)行以治療角膜上皮病癥。34.—種治療蒸發(fā)過強型干眼的方法，包括向患有蒸發(fā)過強型干眼的患者給予有效量的PPARS激動劑。全文摘要本發(fā)明的目的是提供促進瞼板腺上皮細胞和角膜上皮細胞增殖的試劑，以及提供治療諸如瞼板腺功能異常或蒸發(fā)過強型干眼的眼病的治療劑。本發(fā)明提供了促進瞼板腺上皮細胞或角膜上皮細胞增殖的試劑，其含有PPARα或δ激動劑作為活性成分，以及用于治療諸如瞼板腺功能異?；蛘舭l(fā)過強型干眼的眼病的試劑，其含有PPARα或δ激動劑作為活性成分。文檔編號A61K31/216GK101336113SQ200680051899公開日2008年12月31日申請日期2006年11月27日優(yōu)先權日2005年11月28日發(fā)明者中村義邦,井上淳,花野郁子申請人:千壽制藥株式會社