專利名稱：ErbB受體激動(dòng)劑在制備治療癲癇病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ErbB受體激動(dòng)劑在制備治療癲癇病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癲癇(印il印sy)是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病。癲癇患病率很高，中國(guó)約有一千萬(wàn)患者，影響總?cè)丝诘拇蠹s1 %，癲癇死亡率約為20%。給家庭、社會(huì)造成很大的負(fù)擔(dān)。目前，經(jīng)過(guò)現(xiàn)有的抗癲癇藥物治療，仍有大約30% 的患者不能控制。藥物不能控制的癲癇即難治性癲癇的死亡率更高，可達(dá)50%，盡管對(duì)于藥物不能控制的癲癇目前多采取手術(shù)治療，但適合手術(shù)的患者只占一小部分。因此，尋找有效和安全的治療藥物是生物醫(yī)學(xué)重要的目標(biāo)之一。在大腦中，約有10 20%的神經(jīng)元是GABA能中間神經(jīng)元，盡管數(shù)量不多，但是 GABA能中間神經(jīng)元在感覺(jué)信息的處理、神經(jīng)環(huán)路的同步化、腦電節(jié)律、抑制癲癇活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用。特別是一種表達(dá)鈣結(jié)合蛋白ParvaIbumin(PV)的細(xì)胞占抑制性中間神經(jīng)元的50%之多，由于其高頻的發(fā)放特點(diǎn)，又被稱作快發(fā)放中間神經(jīng)元。來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室David Lau, Ikuo Ogiwara等人用在體腦電記錄的方式顯示PV中間神經(jīng)元的低功能可以導(dǎo)致癲癇發(fā)生。在解剖學(xué)上，PV中間神經(jīng)元與周圍神經(jīng)元主要有兩類連接方式，(1)通過(guò)投射到椎體神經(jīng)元的胞體以及軸突起始端來(lái)調(diào)節(jié)椎體神經(jīng)元發(fā)放；( 通過(guò)縫隙連接與周圍的PV神經(jīng)元廣泛連接，進(jìn)而影響抑制性網(wǎng)絡(luò)的同步化活動(dòng)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(Neuregulin，NRG)是生長(zhǎng)因子家族的一員，主要由(NRG1 4)所編碼，NRGl是被詮釋較多的一種。由于不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和選擇性剪切，NRGl可以產(chǎn)生 6種蛋白(I-VI)和至少31種亞型。NRGl的受體ErbB根據(jù)亞型分為ErbBl ErbB4四個(gè)受體。其中ErbBl和ErbB2沒(méi)有配體結(jié)合區(qū)，但是胞內(nèi)段具備水解和激酶活性；而ErbB3可以結(jié)合NRGl但是不具備激酶活性。ErbB4是唯一一個(gè)可以特異性結(jié)合NRGl并且具有激酶活性的受體。ErbB受體之間可以形成同二聚體或異二聚體。NRGl通過(guò)激動(dòng)ErbB酪氨酸激酶受體，繼而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，產(chǎn)生一系列細(xì)胞反應(yīng)，包括增生、凋亡、遷移、分化和黏附的活躍或抑制。2010年，！^zzari等人發(fā)現(xiàn)ErbB4集中在中間神經(jīng)元上表達(dá)，特別是在PV神經(jīng)元上。這一結(jié)果提示，PV中間神經(jīng)元很可能是NRGl-ErbB4信號(hào)的主要細(xì)胞靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明研究了 ErbB4激動(dòng)劑NRGl對(duì)癲癇的抑制作用，為探索癲癇抑制藥物的新型有效“靶標(biāo)”和分子提供研究方向，為治療以神經(jīng)元興奮性改變?yōu)榛A(chǔ)的腦系疾病提供候選治療藥物。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是ErbB受體激動(dòng)劑在制備治療癲癇病的藥物中的應(yīng)用。所謂ErbB4受體激動(dòng)劑，是指神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-I (Neuregulin-I)。所述Neuregulin-I分為內(nèi)源性和外源性激動(dòng)劑兩種。
3外源性Neuregulin-I為人重組蛋白Neuregulin-lbeta 2 (NRGl)，它是由61個(gè)氨基酸組成的多肽鏈。內(nèi)源性Neuregulin-Ι是由神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞產(chǎn)生，這里所用ErbB4胞外段 (aal-659, ecto_ErbB4)中和掉的部分。優(yōu)選的，所述ErbB受體激動(dòng)劑為ErbB4受體激動(dòng)劑。具體的，所述ErbB受體激動(dòng)劑可用于制備增強(qiáng)皮層和海馬區(qū)域PV中間神經(jīng)元的興奮性的藥物。優(yōu)選的，所述ErbB受體激動(dòng)劑為NRGl (人重組Neuregulin-I beta2)，由61 amino acids組成，序列為shlvkcaekektfcvnggecfmvkdlsnpsrylckcpne ftgd rcqnyvmasfykaeelyq ；分子量為7055道爾頓。ErbB4—旦與NRGl結(jié)合，ErbB4即被激活，其羧基末端的絡(luò)氨酸殘基發(fā)生磷酸化并聚集連接蛋白如Shc和GA2等，進(jìn)而激活Ras-Raf-Erk信號(hào)通路。本申請(qǐng)發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，ErbB4受體可能是抗癲癇藥物的潛在靶點(diǎn)，ErbB4激動(dòng)劑NRGl對(duì)癲癇有一定的抑制作用，其機(jī)制是中間神經(jīng)元上的Kvl. 1鉀通道。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明揭示了 ErbB4激動(dòng)劑NRGl對(duì)癲癇的抑制作用并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了深入研究，為探索癲癇抑制藥物的新型有效“靶標(biāo)”和分子提供研究方向，為治療以神經(jīng)元興奮性改變?yōu)榛A(chǔ)的腦系疾病的新藥篩選提供了基礎(chǔ)。


圖1為ErbB4受體敲除老鼠與正常老鼠對(duì)致癇藥戊四唑以及匹魯卡品的易感性； 結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。圖2為預(yù)先腦室內(nèi)注射人重組Neuregulin-I組與腦室只注射等量人工腦脊液組對(duì)致癇藥戊四唑以及匹魯卡品的易感性；結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。圖3為癲癇患者以及正常對(duì)照組大腦皮層ErbB4和ErbB2表達(dá)量；結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。圖4為外源性或內(nèi)源性Neuregulin-I對(duì)大腦皮層或海馬PV中間神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用；結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。圖5為藥理學(xué)阻斷ErbB4受體或基因特異性敲除ErbB4受體后，Neuregulin_l的作用消失了 ；結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。圖6為Neuregulin-I對(duì)PV中間神經(jīng)元上Kvl. 1型鉀電流的調(diào)節(jié)；結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。圖7為細(xì)胞膜上Kvl. 1酪氨酸磷酸化水平會(huì)受到NRGl_ErBB4信號(hào)的調(diào)節(jié)；結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 :PV中間神經(jīng)元上特異性敲除ErbB4受體的老鼠更易發(fā)癲癇(1)實(shí)驗(yàn)材料
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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性PV-Cre-ErbB4—ρ小鼠(基因敲除ErbB4受體的小鼠)及同窩的對(duì)照ErbB4LoxP/LoxP小鼠(含有ErbB4受體的正常小鼠)，各18只，八周齡，體重24士2克， 飼養(yǎng)于相同的環(huán)境，食物和水自由攝取海天給12h的光照。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在12:00 14:00 之間進(jìn)行?；蚯贸鼸rbB4受體的小鼠采用國(guó)際上廣泛應(yīng)用的Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)獲得。該系統(tǒng)含有兩種成分①一段長(zhǎng)Mbp的DNA序列，含有兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp 的核心序列，其序列如下5' -ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3'。這段 34bp 序列是重組酶識(shí)別的位點(diǎn)，被稱為IoxP位點(diǎn)；②Cre重組酶(cyclizationrecombination)， 它是一種由343個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，可以引發(fā)IoxP位點(diǎn)的DNA重組，Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)l(^9bp (EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X03453)。任何序列的DNA，當(dāng)其位于兩個(gè)IoxP 位點(diǎn)之間的時(shí)候，在Cre重組酶的作用下要么被缺失(兩個(gè)IoxP位點(diǎn)的方向相同)，要么方向發(fā)生倒轉(zhuǎn)(兩IoxP位點(diǎn)的方向相反)。其中PV-Cre老鼠受贈(zèng)于美國(guó)冷泉港Dr.ZJ Huang 實(shí)驗(yàn)室，即在parvalbumin基因的第五號(hào)外顯子3' UTR端插入Cre重組酶基因，其在美國(guó) Jacksonlab公司的商品號(hào)為008069。ErbB4L°xlVL°xP老鼠受贈(zèng)于美國(guó)佐治亞大學(xué)Dr. LMei實(shí)驗(yàn)室，即一段Ioxp序列置于erbb4上游，另一段置于erbb4下游。上訴兩種老鼠雜交，產(chǎn)生的子代老鼠中，經(jīng)基因鑒定篩選出帶有PV-Cre-ErbBfrap^xp基因型的老鼠。試劑PTZ (戊四唑)，pilocarpine (匹魯卡品)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。儀器透明玻璃籠子(2)實(shí)驗(yàn)方法I、根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用PTZ濃度為40mg/kg，pilocarpine200mg/kg,溶解于PBS，并與腹腔內(nèi)注射。注射PTZ以后，小鼠單獨(dú)放予透明玻璃籠子內(nèi)，觀察行為變化 30min。癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度根據(jù)文獻(xiàn)分級(jí)0級(jí)無(wú)反應(yīng)；1級(jí)耳朵和面部抽動(dòng)，包括眨眼、 動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼；2級(jí)肌陣攣，但無(wú)直立；3級(jí)肌陣攣，雙側(cè)前肢抬起；4級(jí)側(cè)身倒地；5 級(jí)背部倒地，全身強(qiáng)直.陣攣發(fā)作6級(jí)死亡.II、評(píng)估了兩種老鼠在由PTZ誘發(fā)全身發(fā)作的發(fā)生率。III、還評(píng)估了兩種老鼠在由匹魯卡品引起癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生率。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果I、圖la、b所示為PV-Cre-ErbBfxtvtap小鼠對(duì)戊四唑誘發(fā)的癲癇表現(xiàn)更高的發(fā)作級(jí)別，以及更多的發(fā)作百分比。II、圖Ic所示為PV-Cre-ErbB4—M、鼠對(duì)匹魯卡品誘發(fā)癲癇表現(xiàn)更高的發(fā)生率。(4)結(jié)論P(yáng)V中間神經(jīng)元上特異性敲除ErbB4受體的老鼠更易發(fā)癲癇。實(shí)施例2 外源性腦室內(nèi)注入NRGl可以抑制癲癇的發(fā)作(1)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性ErbB4L°xlVL°xP小鼠，共20只，八周齡，體重M+2克，飼養(yǎng)于相同的環(huán)境，食物和水自由攝??；每天給12h的光照。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在12:00 14:00之間進(jìn)行。試劑PTZ，pilocarpine購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Isoflurane (異氟烷)購(gòu)自河北九派制藥公司；儀器；立體定位儀，型號(hào)512600，產(chǎn)于美國(guó)Moelting公司；麻醉機(jī)。
(2)實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)前面得出的結(jié)果可以做出這樣的假設(shè)藥物刺激NRGl_ErbB4軸可能會(huì)有抗癲癇的作用。持續(xù)異氟烷吸入麻醉，小鼠被固定在立體定位儀下，待麻醉平穩(wěn)后， 右腦室(AP -O. 5mm, L -lmm, V :-2. 2mm)內(nèi)注入人重組蛋白 Neuregulin-lbeta 2(6mmol in 3 μ 1)。在十五分鐘的恢復(fù)后，在進(jìn)行腹腔內(nèi)注射PTZ濃度為60mg/kg或，pilocarpine 250mg/kg。相應(yīng)的，對(duì)照組采取注入右腦室相應(yīng)體積腦脊液，15分鐘后，腹腔內(nèi)注入PTZ濃度為60mg/kg或，pilocarpine250mg/kg。癲癇發(fā)作評(píng)級(jí)同上。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果I、所有的老鼠在腹腔注射60mg/kg PTZ后，都會(huì)表現(xiàn)出癲癇癥狀，然而，注射過(guò) NRGl的老鼠發(fā)作的級(jí)別和發(fā)作次數(shù)明顯低于對(duì)照組。II、老鼠在腹腔注射250mg/kg pilocarpine后，預(yù)先給NRGl的老鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)生率更低并且發(fā)作潛時(shí)更長(zhǎng)。(4)結(jié)論外源性腦室內(nèi)注入NRGl可以抑制癲癇的發(fā)作。實(shí)施例3 :ErbB4受體在人的癲癇患者腦中表達(dá)量下降(1)實(shí)驗(yàn)材料人腦組織5例難治性癲癇患者術(shù)后腦組織，符合以下標(biāo)準(zhǔn)1特征性腦電圖、藥物治療兩年以上仍有癲癇發(fā)作、應(yīng)用2 3種一線抗癲癇藥物并已達(dá)到血藥濃度。II癲癇癥狀符合1981年國(guó)際抗癲癇組織分類標(biāo)準(zhǔn)。IIICT或MRI指引下沒(méi)有進(jìn)行性灶點(diǎn)。IV除癲癇外，沒(méi)有其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病V術(shù)前評(píng)估屬于位置相關(guān)的癲癇樣放電。對(duì)照組腦組織符合以下標(biāo)準(zhǔn)1沒(méi)有神經(jīng)系統(tǒng)的疾病史。II除外傷外，沒(méi)有其他可以引起癲癇的腦結(jié)構(gòu)或功能改變的損傷。這兩組之間年齡沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。試劑:anti-ErbB4(ErbB4 抗體)和 anti-ErbB2 (ErbB2 抗體)購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz Biotechnology 公司，anti-caveolin-Ι (小凹蛋白 1 抗體)購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology 公司。儀器Western Blotting所需的基本分子實(shí)驗(yàn)設(shè)備。(2)實(shí)驗(yàn)方法蛋白定量裂解細(xì)胞，提取蛋白裂解液，用于Wfestern Blotting。Western Blotting — 抗?jié)舛葹閍nti-ErbB4(l 1000)，anti_ErbB2(1 1000)和 anti-caveolin-1(1 ； 1000)。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3所示癲癇患者大腦皮層地ErbB4表達(dá)量只有正常對(duì)照組的 60%，然而，ErbB2的表達(dá)量卻沒(méi)有發(fā)生改變。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖北。(4)結(jié)論ErbB4受體在人的癲癇患者腦中表達(dá)量下降。實(shí)施例4 =NRGl增強(qiáng)皮層和海馬區(qū)域PV中間神經(jīng)元的興奮性(1)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物B13和G42小鼠受贈(zèng)于美國(guó)冷泉港Dr. ZJ Huang實(shí)驗(yàn)室。G42，即一段 GAD67-GFP BAC重組體被插入到GAD67gene的第一段外顯子內(nèi)，其在美國(guó)Jacksonlab公司的商品號(hào)為007677。B13，即一段Pv-GFPBAC重組體被插入于PV gene內(nèi)。這兩種老鼠的 PV中間神經(jīng)元上被特異性的標(biāo)有綠色熒光。試劑NRG1購(gòu)自美國(guó) Prospec 公司，ecto-ErbB4 轉(zhuǎn)染 ecto_ErbB4 (含有 ErbB4 胞外段aa 1-659的pErbB4ex/Fc與昍以93，經(jīng)培養(yǎng)、純化提取ecto_ErbB4。MEM培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。儀器細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)箱。切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)Leica公司。紅外干涉顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。電生理記錄系統(tǒng)MultiClamp 700B放大器，Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器以及pClamp 10. 2記錄軟件購(gòu)自美國(guó)Axon Instruments/Molecular Devices公司。(2)實(shí)驗(yàn)方法人工腦脊液配制125mMNaCl, 3mM KCl, 1. 25mM NaH2PO4, 2mMMgS04, 2mM CaCl2, 25mM NaHCO3, and IOmM glucose，溶劑為去離子水；電極內(nèi)液配制130mM K-gluconate, 20mM KCl，IOmM Hepes, 4mMMg2ATP, 0. 3mM NaGTP, IOmM disodium phosphocreatine and 0. 2mMEGTA(pH 7. 2with Κ0Η, 288m0sm), MM 為去離子水；腦片準(zhǔn)備動(dòng)物麻醉后，取腦盡量快速，并保持低溫。然后冠狀切300微米，在33°C 人工腦脊液孵育60分鐘后，轉(zhuǎn)移到22°C室溫下，電生理記錄全程32°C 33°C。首先在用綠色熒光標(biāo)記的中間神經(jīng)元上做了全細(xì)胞記錄。所用液體全程充氣95% 02/5% C02。電生理記錄在腦片2或3層，經(jīng)四十倍水鏡，熒光激發(fā)指引下找到帶有綠色熒光的神經(jīng)元，做全細(xì)胞記錄，電流鉗模式下注入500毫秒電流。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果I、圖如所示外源性灌流10納摩爾的NRGl加快了皮層PV中間神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻率。同時(shí)熱失活NRGl后再灌流，對(duì)頻率沒(méi)有影響。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖如。 II、圖4b所示，用ecto_ErbB4拮抗內(nèi)源性的NRGl，皮層PV中間神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏念l率明顯下降。同時(shí)熱失活ect0-ErbB4后再灌流，對(duì)頻率沒(méi)有影響。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖如。III圖4d所示，在海馬區(qū)域重復(fù)如上實(shí)驗(yàn)，得到類似的效果。(4)結(jié)論NRG1增強(qiáng)皮層和海馬區(qū)域PV中間神經(jīng)元的興奮性實(shí)施例5 :ErbB4受體對(duì)于NRGl調(diào)節(jié)中間神經(jīng)元的興奮性是必要的(1)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物G42-ErbB4L。xlVL。xP小鼠，由 G42 與 ErbB4L。xlVL。xP 雜交獲得； G42-PV-Cre-ErbB4LoxP/LoxP 小鼠，由 G42_ErbB4L。xlVL。xP 與 PV-Cre_ErbB4L。xlVL。xP 雜交獲得。試劑NRG1購(gòu)自美國(guó) Prospec 公司，ecto_ErbB4 轉(zhuǎn)染含有 ecto_ErbB4 的 pErbB4ex/Fc與HEK293，經(jīng)培養(yǎng)、純化提取ecro_ErbB4。MEM培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco公司。AG1478購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。儀器細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)箱。切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)Leica公司。紅外干涉顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。電生理記錄系統(tǒng)MultiClamp 700B放大器，Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器以及pClamp 10. 2記錄軟件購(gòu)自美國(guó)Axon Instruments/Molecular Devices公司。(2)實(shí)驗(yàn)方法人工腦脊液配制125mMNaCl, 3mM KCl, 1. 25mM NaH2P04, 2mMMgS04, 2mM CaCl2, 25mM NaHCO3, and IOmM glucose，溶劑為去離子水；電極內(nèi)液配制130mM K-gluconate, 20mM KCl, IOmM Hepes, 4mMMg2ATP, 0. 3mM
7NaGTP, IOmM disodium phosphocreatine and 0. 2mMEGTA(pH 7. 2with KOH, 288m0sm), MM 為去離子水；腦片準(zhǔn)備動(dòng)物麻醉后，取腦盡量快速，并保持低溫。然后冠狀切300微米，在33°C 人工腦脊液孵育60分鐘后，轉(zhuǎn)移到22°C室溫下，電生理記錄全程32°C 33°C。首先在用綠色熒光標(biāo)記的中間神經(jīng)元上做了全細(xì)胞記錄。所用液體全程充氣95% 02/5% C02。電生理記錄在腦片2或3層，經(jīng)四十倍水鏡，熒光激發(fā)指引下找到帶有綠色熒光的神經(jīng)元，做全細(xì)胞記錄，電流鉗模式下注入500毫秒電流。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、圖如所示，先用了藥理學(xué)的方法，ErbB4的特異性阻斷劑-AG1478，可以阻礙 NRGl對(duì)中間神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)。而且AG1478本身就可以明顯的減慢PV中間神經(jīng)元的發(fā)放頻率(圖)，這又進(jìn)一步為內(nèi)源性NRGl的作用提供了證據(jù)。II，圖恥所示，用Cre-LoxP的轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法特異性敲除PV中間神經(jīng)元上的 ErbB4受體。發(fā)現(xiàn)NRGl不再能加快PV中間神經(jīng)元的興奮性。這與藥理學(xué)的結(jié)果相一致，進(jìn)一步為ErbB4的必要性提供證據(jù)。(4)結(jié)論ErbB4受體對(duì)于NRGl調(diào)節(jié)中間神經(jīng)元的興奮性是必要的。實(shí)施例6 (1)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物B13和G42小鼠受贈(zèng)于美國(guó)冷泉港Dr. ZJ Huang實(shí)驗(yàn)室。G42，即一段 GAD67-GFP BAC重組體被插入到GAD67gene的第一段外顯子內(nèi)，其在美國(guó)Jacksonlab公司的商品號(hào)為007677。B13，即一段Pv-GFPBAC重組體被插入于PV gene內(nèi)。這兩種老鼠的 PV中間神經(jīng)元上被特異性的標(biāo)有綠色熒光；試劑NRG1購(gòu)自美國(guó) Prospec 公司，ecto_ErbB4 轉(zhuǎn)染含有 ecto_ErbB4 的 pErbB4ex/Fc與HEK293，經(jīng)培養(yǎng)、純化提取ecro_ErbB4。MEM培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司。DiTx-K 購(gòu)自美國(guó) Alomone Labs.公司。儀器細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)箱。切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)Leica公司。紅外干涉顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。電生理記錄系統(tǒng)MultiClamp 700B放大器，Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器以及pClamp 10. 2記錄軟件購(gòu)自美國(guó)Axon Instruments/Molecular Devices公司。(2)實(shí)驗(yàn)方法人工腦脊液配制125mMNaCl, 3mM KCl, 1. 25mM NaH2PO4, 2mMMgS04, 2mM CaCl2, 25mM NaHCO3, and IOmM glucose，溶劑為去離子水；電極內(nèi)液配制130mM K-gluconate, 20mM KCl，IOmM Hepes, 4mMMg2ATP, 0. 3mM NaGTP, IOmM disodium phosphocreatine and 0. 2mMEGTA(pH 7. 2with KOH, 288m0sm), MM 為去離子水；腦片準(zhǔn)備動(dòng)物麻醉后，取腦盡量快速，并保持低溫。然后冠狀切300微米，在33°C 人工腦脊液孵育60分鐘后，轉(zhuǎn)移到22°C室溫下，電生理記錄全程32°C 33°C。首先在用綠色熒光標(biāo)記的中間神經(jīng)元上做了全細(xì)胞記錄。所用液體全程充氣95% 02/5% C02。電生理記錄在腦片2或3層，經(jīng)四十倍水鏡，熒光激發(fā)指引下找到帶有綠色熒光的神經(jīng)元，做全細(xì)胞記錄，電壓鉗模式。用了電流相減的分析方法分離出DTx-K敏感的鉀電流Kvl. 1以及受到ecto-ErbB4調(diào)節(jié)的電流。把灌流ecto-ErbB4前后的電流相減得到受到 ecto-ErbB4調(diào)節(jié)的外向電流?；蚴前压嗔鱀Tx-K前后電流相減得到DTX_k敏感的鉀電流 Kvl. 1。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6所示，ecto-ErbB4可以增加整體的外向鉀電流。這一增加的部分被后來(lái)的 DTx-K完全的抑制掉(圖)。當(dāng)提前用DTx-k孵育腦片的情況下，ecto-ErbB4不再能增加鉀電流(圖)。(4)結(jié)論這一結(jié)果顯示，ecto-ErbB4調(diào)節(jié)的部分電流是DTx-K敏感的鉀電流，即 Kvl. 1電流。實(shí)施例7 細(xì)胞膜上Kvl. 1酪氨酸磷酸化水平會(huì)受到NRGl-ErBB4信號(hào)的調(diào)節(jié)。(1)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PV-Cre-ErbB4—ρ小鼠及同窩的對(duì)照小鼠ErbB4L°xPA°xP試劑:anti-Kvl.1 (Kvl. 1 抗體)購(gòu)自美國(guó) NeuroMab 公司，anti-caveolin-l (小凹蛋白-1抗體)和anti-phosphotyrosine (酪氨酸磷酸化抗體)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司。儀器(2)實(shí)驗(yàn)方法免疫沉淀裂解組織，提取膜蛋白裂解液，富集膜上的Kvl. 1蛋白，用于Western Blotting。蛋白定量蛋白定量裂解組織，提取蛋白裂解液，用于Western Blotting。 Western Blotting 一抗?jié)舛葹閍nti_Kvl· 1 (1 1000), anti-phospho-tyrosine 禾口 anti-caveolin-l (1 ； 1000)(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果I、圖7a所示，Kvl. 1總蛋白在NRGl處理后20分鐘內(nèi)都沒(méi)有明顯改變，然而細(xì)胞膜上的Kvl. 1通道酪氨酸水平在20分鐘內(nèi)逐漸升高。II、圖 7b 所示，PV-Cre-ErbB4L°xlVL°XIVjHllKVl. 1 磷酸化水平低于 ErbB4L°xlVL°xP 小鼠 Kvl. 1水平。(4)結(jié)論細(xì)胞膜上Kvl. 1酪氨酸磷酸化水平會(huì)受到NRGl-ErBB4信號(hào)的調(diào)節(jié)。
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權(quán)利要求
1.ErbB受體激動(dòng)劑在制備治療癲癇病的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述ErbB受體激動(dòng)劑為ErbB4受體激動(dòng)劑。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述ErbB受體激動(dòng)劑用于制備增強(qiáng)皮層和海馬區(qū)域PV中間神經(jīng)元的興奮性的藥物。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述ErbB受體激動(dòng)劑為人重組蛋白 Neuregulin-1 beta 2，其氨基酸序列如下:shlvkcaekektfcvnggecfmvkdlsnpsryIckcpnef tgdrcqnyvmasfykaeelyq0
全文摘要
本發(fā)明提供了ErbB受體激動(dòng)劑在制備治療癲癇病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明揭示了ErbB4激動(dòng)劑NRG1對(duì)癲癇的抑制作用并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了深入研究，為探索癲癇抑制藥物的新型有效“靶標(biāo)”和分子提供研究方向，為治療以神經(jīng)元興奮性改變?yōu)榛A(chǔ)的腦系疾病的新藥篩選提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K45/00GK102327613SQ20111025806
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者盧應(yīng)梅, 李可心, 李曉明 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)