專利名稱：：針對(duì)nogo的免疫球蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫球蛋白，特別是結(jié)合NOGO并中和其活性的抗體，編碼這種抗體的多核普酸，含有所述抗體的藥物制劑，并且涉及這些抗體在治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病方面的用途。根據(jù)以下的詳細(xì)i兌明，本發(fā)明的其他方面、目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。
背景技術(shù)：
：中風(fēng)是西方世界中死亡和失能(disability)的主要原因。除了組織血纖蛋白溶解酶原(t-PA)之外對(duì)于中風(fēng)的處理沒有批準(zhǔn)的治療，組織血纖蛋白溶解酶原在計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(CT)掃描以排除出血之后在發(fā)作的3小時(shí)之內(nèi)施用。迄今為止，直接針對(duì)急性中風(fēng)的治療(即，神經(jīng)保護(hù))的大多數(shù)治療試劑主要涉及靶向谷氨酸受體和已知涉及急性細(xì)胞死亡的它們的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signalling)途徑。然而迄今為止這些策略在臨床試驗(yàn)中被證明是不成功的，通常與劑量限制性副作用相關(guān)(Hill&Hachinski,TheLancet,352:(supplIII)10-14(1998))。因而，針對(duì)在血流停止之后改善細(xì)胞死亡，需要新的方法。神經(jīng)保護(hù)是一種防止或直才妻地耙向神經(jīng)元、或間接地通過防止神經(jīng)膠質(zhì)(包4舌少突月交質(zhì)細(xì)l包)細(xì)胞損失來實(shí)現(xiàn)。在中風(fēng)發(fā)作之后，在許多患者中觀察到了一定程度的自發(fā)的功能恢復(fù)，表明大腦具有在損傷之后修復(fù)和/或重塑的能力(雖然是有限的)。具有增強(qiáng)這種恢復(fù)的潛力的試劑因而可以容許在腦缺血發(fā)作之后晚得多之時(shí)進(jìn)行介入(可能數(shù)天)。能夠提供急性神經(jīng)保護(hù)并增強(qiáng)功能恢復(fù)的試劑可以提供優(yōu)于當(dāng)前的潛在的神經(jīng)保護(hù)策略的顯著的優(yōu)點(diǎn)。阿爾茨海默氏病(AD)特征在于兩種病理診斷特征的存在。它們分別是由聚集的P-淀粉樣蛋白肽(AP40和Ap42)和超磷酸化的tau組成的淀粉樣蛋白斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Dawbarn&Allen2001NeurobiologyofAlzheimer'sDiseaseOUP)。綜合分析顯示了在患者中P-淀粉樣蛋白積聚和認(rèn)知下降之間的強(qiáng)的聯(lián)系(Naslundetal,JAMA,March22/29,2000,Vol.283,No;12,page1571-1577)。這與遺傳學(xué)和流行病學(xué)研究一致，其表明了在APP和早老素(presenilin)基因中的某些突變可以傾向于早期發(fā)作AD,這些突變還提高了AP40和AP42肽的水平，包括其比率。I型跨膜淀粉樣蛋白前體蛋白質(zhì)(APP)被稱為P-和Y-分泌酶的兩種不同蛋白酶的裂解是P-淀粉樣蛋白肽的形成所必需的。已經(jīng)確認(rèn)了P-分泌酶作為天冬氨酸(aspartyl)蛋白酶Asp2/BACE1的分子身份(HussainetalMol.Cell.NeuroSci.16,609-619(2000);Vassaretal,Science(1999),Oct.22;286(5440):735-741)。y-分泌酶的性質(zhì)仍然是某些爭論的來源，可能由至少包括以下蛋白質(zhì)的高分子量復(fù)合物組成早老素、Aphl、Pen2和nicastrin(綜述見Medina&DottiCellSignalling200315(9):829-41)。APP在CNS中的加工可能在許多細(xì)l包類型內(nèi)發(fā)生，包4舌神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。而在這些細(xì)胞中APP加工的總體速率將受到APP、BACE1/Asp2、早老素-1和-2、Aphl、Pen2和nicastrin的表達(dá)的相對(duì)水平的影響。此外，調(diào)節(jié)APP的亞細(xì)胞位置的其他因素也可以影響它的加工，如以下的發(fā)現(xiàn)所顯示，阻斷其內(nèi)吞作用的APP細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中YENP基序的突變降低了P-淀粉樣蛋白產(chǎn)生(Perezetal1999JBiolChem274(27)18851-6)。通過添加KKQN滯留基序，APP-卩-CTF在ER中的滯留足以降低轉(zhuǎn)染的細(xì)月包中的淀粉樣蛋白產(chǎn)量(Malteseetal2001JBiolChem276(23)20267-20279)。反之，通過Rab5的過量表達(dá)，內(nèi)吞作用的升高足以提高來自轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的淀粉樣蛋白分泌(Grbovicetal2003JBiolChem278(33)31261-31268)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，進(jìn)一步的研究顯示了細(xì)胞膽固醇水平(公知的AD風(fēng)險(xiǎn)因素)的降低降低了P-淀粉樣蛋白形成。這種變化取決于通過使用顯性陰性dynamm突變體(K44A)以及Rab5GTPase活化蛋白R(shí)N-Tre的過量表達(dá)展現(xiàn)的改變的內(nèi)吞作用(Ehehaltetal2003JCellBiol160(1)113-123)。富膽固醇微結(jié)構(gòu)域或我(rafts)也是P-淀粉樣蛋白產(chǎn)生的重要細(xì)胞位點(diǎn)，APP、BACE1和y-分泌酶復(fù)合物的成分都顯示了短暫地存在于筏內(nèi)。針對(duì)富膽固醇筏的APP和BACE1的抗體交聯(lián)能夠提高P-淀粉樣蛋白產(chǎn)生(Ehehaltetal2003JCellBiol160(1)113-123)。專門地革巴向脂質(zhì)筏的、GPI錨定的BACE1的表達(dá)，類似地能夠提高APP裂解和P-淀粉樣蛋白產(chǎn)生(Cordyetal2003PNAS100(20)11735-11740)。在中風(fēng)或其他神經(jīng)損傷事件或疾病之后功能恢復(fù)的機(jī)制當(dāng)前是未知的。損傷的或未損傷的軸突的出芽(sprouting)被認(rèn)為是一種可能的機(jī)制。然而，雖然體內(nèi)研究顯示了用神經(jīng)營養(yǎng)因子治療脊髓損傷或中風(fēng)引起了增強(qiáng)的功能恢復(fù)和一定程度的軸突出芽，這些沒有證明軸突出芽的程度和功能恢復(fù)的程度之間的直接聯(lián)系(Jakeman,etal.1998,Exp.Neurol.154:170-184,Kawamataetal.1997,ProcNatlAcad.Sci.USA.,94:8179-8184,Ribotta,etal.2000,JNeurosci.20:5144-5152)。此外，軸突出芽需要活的神經(jīng)元。在疾病例如與廣泛的細(xì)l包死亡相關(guān)的中風(fēng)中，給定的試劑在中風(fēng)后提供的功能恢復(fù)的增強(qiáng)因而可能通過軸突出芽以外的機(jī)制，例如內(nèi)源千細(xì)胞的分化、冗余途徑的活化、受體分布的改變、或神經(jīng)元或神經(jīng)月交質(zhì)的可激發(fā)性(Fawcett&Asher,1999，BrainRes.Bulletin,49:377-391,Horner&Gage,2000,Nature407963-970)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)在損傷之后修復(fù)的有限能力被認(rèn)為部分是由于CNS環(huán)境內(nèi)的分子，所述分子對(duì)于軸突出芽(軸索長出)具有抑制效果。CNS髓鞘質(zhì)^皮認(rèn)為含有抑制性分子(SchwabMEandCaroniP(1988)J.Neurosci.8,2381-2193)。兩種髓鞘質(zhì)蛋白，髓鞘質(zhì)相關(guān)斗唐蛋白(MAG)和NOGO已經(jīng)^L克隆并鑒定為軸索長出的推定的抑制物(SatoS.etal(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163,1473-1480;McKerracherLetal(1994)Neuron13，805-811;MukhopadhyayGetal(1994)Neuron13,757-767;TorigoeKandLundborgG(1997)Exp.Neurology150,254-262;Schaferetal(1996)Neuron16,1107-1113;W09522344;WO9701352;PrinjhaRetal(2000)Nature403,383-384;ChenMSetal(2000)Nature403,434-439;GrandPreTetal(2000)Nature403,439-444;US005250414A;WO200005364A1;WO0031235)。已經(jīng)鑒定了三種形式的人類NOGO:NOGO-A具有1192個(gè)氨基酸殘基(GenBankaccessionno.AJ251383);NOGO-B,缺少推定的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中殘基186-1004的剪接變體(GenBankaccessionno.AJ251384)，以及更短的剪4妻變體NOGO-C,其也缺乏殘基186到1004,并且具有更小的、可選擇的氨基末端結(jié)構(gòu)域(GenBankaccessionno.AJ251385)(Prinjhaetal(2000)上文)。CNS抑制性蛋白質(zhì)例如NOGO的抑制可以提供治療手段來改善神經(jīng)元損壞并促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和生長，從而潛在地幫助從神經(jīng)元損傷例如中風(fēng)中遭受的損傷的恢復(fù)。這種NOGO抑制物的實(shí)例可以包括小分子、肽和抗體。報(bào)道了鼠單克隆抗體IN-l促進(jìn)軸突再生，其針對(duì)髓鞘質(zhì)蛋白NI-220/250產(chǎn)生，NI-220/250是軸索生長的強(qiáng)力抑制物(后來顯示了是NOGO-A的片l殳)(Caroni,PandSchwab,ME(1988)Neuron185-96;Schnell，LandSchwab,ME(1990)Nature343269-272;Bregman,BSetal(1995)Nature378498-501andThallmair,Metal(1998)NatureNeuroscience1124-131)。還報(bào)道的是NOGO-A是IN-l的抗原(Chenetal(2000)Nature403434-439)。IN-lFab片段或人源化的IN-l對(duì)經(jīng)歷了脊髓橫切的大鼠的施用增強(qiáng)了恢復(fù)(Fiedler,Metal(2002)ProteinEng15931-941;Brosamle,Cetal(2000)J.Neuroscience208061-8068)。在WO04/052932和WO2005028508中描述了結(jié)合NOGO的單克隆抗體。WO04/052932公開了鼠抗體11C7,其以高親和性結(jié)合某些形式的人類NOGO。專利申請WO05/061544還公開了高親和性單克隆抗體，包括鼠單克隆抗體2A10，并一般地-公開了其人源化的變體，例如H1L11(HI和Lll的序列分別在SEQIDNO:33和34中提供(僅VH或VL序列))。公開的抗體以高親和性與人類NOGO-A結(jié)合。鼠2A10抗體(和其CDR移植(grafted)的人源化變體)特征在于它們的輕鏈和重鏈可變區(qū)內(nèi)的以下互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列(如4吏用Kabat方法測定的(Kabatetal.(1991)"Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest";FifthEdition;USDepartmentofHealthandHumanServices;NIHpublicationNo91-3242)):表1:抗體2A10輕鏈CDR<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2:抗體2A10重鏈CDR<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>WO05/061544進(jìn)一步公開了所述抗體的"類似物"，其包含以上表1和2的CDR,這種"類似物"具有與衍生它們的供體抗體相同的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。盡管本領(lǐng)域提供了高親和性抗NOGO抗體，分離并開發(fā)結(jié)合并抑制人類NOGO的活性的可選擇的、或改進(jìn)的、治療有用的單克隆抗體仍然是高度期望的目標(biāo)。神經(jīng)變性(neurodegeneration)的過程是許多神經(jīng)疾病/失調(diào)的基礎(chǔ)，包括但不限于，急性疾病例如中風(fēng)(缺血性的或溢血性的)、外傷性腦損傷和脊髓損傷，以及慢性疾病，包括阿爾茨海默氏病、額顳葉癡呆(tau蛋白病變(tauopathies))、周圍神經(jīng)病、帕金森氏病、Creutzfeldt畫Jakob病(CJD)、精神分裂癥、月幾萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬4b、Huntington's病、多發(fā)性硬化和包含體肌炎。因而，本發(fā)明的抗NOGO單克隆抗體等等，在這些疾病/失調(diào)的治療中是有用的。用于上述疾病/失調(diào)的治療的抗體由本發(fā)明提供，并在下文中詳細(xì)描述。發(fā)明概述本發(fā)明提供了特異性重鏈可變區(qū)，以及包含所述特異性重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體或其片段，所述輕鏈可變區(qū)容許當(dāng)與所述重鏈可變區(qū)配對(duì)時(shí)，F(xiàn)v二聚體以高親和性結(jié)合人類NOGO-A,從而中和人類NOGO-A的活性。本發(fā)明的重鏈可變區(qū)可以是格式化的(formatted),與輕鏈可變區(qū)一起以允許結(jié)合人類NOGO-A,以常規(guī)的免疫球蛋白方式(例如，人類IgG、IgA、IgM等等)，或以結(jié)合人類NOGO-A的其任何其他片段或"抗體樣"形式(例如，單鏈Fv、雙抗體(diabodies)、TandabsTM等等(可選擇的"抗體"形式的概述參見HolligerandHudson,NatureBiotechnology,2005,Vol23,No.9,1126-1136))。重鏈可變區(qū)包含基本上由氨基酸殘基GQGY組成的第三個(gè)CDR,其中所述CDR含有GQGY核心序列內(nèi)的至少一個(gè)替4灸，所述替換選自以下替換其中第一位置的G一皮R、I、W或M取代；第二位置的Q^皮D、I、A、L、V或S取代；第三位置的G被W、N、Y、S、L或F取代；第四位置的Y被W取代。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第三個(gè)重鏈CDR(CDRH3)僅含有一個(gè)替換，產(chǎn)生以下CDRH3:RQGY(SEQIDNO:75)、IQGY(SEQIDNO:76)、MQGY(SEQIDNO:45)、GDGY(SEQIDNO:77)、GIGY(SEQIDNO:78)、GSGY(SEQIDNO:79)、GQNY(SEQIDNO:80)、GQYY(SEQIDNO:81)、GQSY(SEQIDNO:62)、GQLY(SEQIDNO:82)、GQFY(SEQIDNO:83)、GQGW(SEQIDNO:84)、WQGY(SEQIDNO:86)、GAGY(SEQIDNO:87)、GLGY(SEQIDNO:88)、GVGY(SEQIDNO:89)、GQWY(SEQIDNO:90)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，上述重鏈可變區(qū)進(jìn)一步含有表2所列的其他CDR,即，CDRHI(SEQIDNO:1)禾口CDRH2(SEQIDNO:2)。本發(fā)明的抗體或其片段保持了包含CDRH3:GQGY的抗體的人類NOGO結(jié)合活性，對(duì)如ELISA和Biacore實(shí)驗(yàn)中測量的它們的活性而言，在某些情況下，在這些實(shí)驗(yàn)中活性被提高。舍lG95MW乂類一戎乂源必Wf鏈^Tf^匸夢炎遞i^^^W^炎J。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的重鏈可變區(qū)包含表3中定義的CDR(如Kabat所定義的)表3:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含表3所列每一個(gè)CDR的人類或人源化重鏈可變區(qū)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了處在人類重鏈可變區(qū)的更大序列內(nèi)的包含表3中所列CDR的人源化的重鏈可變區(qū)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，人源化的重鏈可變區(qū)包含處在接受體4元體框架內(nèi)的表3所列的CDR，所述接受體抗體框架在框架區(qū)域中具有與鼠2A10供體抗體重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:7)的大于40%的同一性、或大于50%、或大于60%、或大于65%的同一性。當(dāng)表3的CDR被全部使用時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方式中，重鏈可變區(qū)序列是作為SEQIDNO:66提供的序列H98(H98VH是HIVH(SEQIDNO:33)的等價(jià)物，不同僅在于在H98中CDRH3是MQGY，而不是HI中發(fā)現(xiàn)的GQGY)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，抗體包含具有SEQIDNO:66的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(H98可變區(qū))，進(jìn)一步包含在位置38、40、48、67、68、70、72、74和79的一個(gè)或多個(gè)處的一定數(shù)量的替^:;其中每個(gè)替^:的氨基酸殘基被SEQIDNO:7(供體抗體2A10的重鏈可變區(qū))中等價(jià)位置處的氨基酸殘基取代，替換的數(shù)目在1到9之間。在其他實(shí)施方式中，替換的數(shù)目是l、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8或9。在上下文中，所描述的替換在概念上等價(jià)于"回復(fù)突變"，其中在H98序列內(nèi)特定位置中人類框架氨基酸殘基被回復(fù)突變?yōu)?A10供體抗體序列內(nèi)的等價(jià)位置中的氨基酸殘基。除非另外特別地聲明與此處的相反，當(dāng)在本文件中提及特定序列中存在的氨基酸殘基的數(shù)字性位置時(shí)，例如"位置12",意圖指熟練的讀者為序列中的第一個(gè)氨基酸分配位置"1"并從位置一開始計(jì)數(shù)，并識(shí)別處在期望的位置中的氨基酸，在這個(gè)實(shí)例中是序列中的第十二個(gè)氨基酸殘基。熟練的讀者將注意到，這種編號(hào)系統(tǒng)不符合Kabat編號(hào)系統(tǒng)，Kabat編號(hào)系統(tǒng)常常被用于定義抗體序列內(nèi)的氨基酸位置。對(duì)于最佳的結(jié)合親和性，對(duì)于小鼠抗體2A10(它的VH是SEQIDNO:7)的人源化發(fā)現(xiàn)的是，在位置48和68處的氨基酸殘基對(duì)，應(yīng)當(dāng)分別是I和A(如同它們存在于2A10中)或分別是M和V(如同它們存在于H98中)。預(yù)期的是，上述發(fā)現(xiàn)還與2A10的G95M變體的人源化相關(guān)。以下表才各包括三種不同的重《連可變(VH)區(qū)域的細(xì)節(jié)，它們可以形成本發(fā)明的抗體的部分。每一種公開的VH是基于H98VH(SEQIDNO:66)的，進(jìn)一步包含在表格(表4)中提及的替換，其中在相關(guān)位置的H98的殘基被該位置的2A10的殘基替換(在表中，"-"是指在該位置沒有替換，從而殘基保持與H98的序列中一樣)表4,新的VH(SEQIDNO,X)叛字性殘基i8i',flVW>|,jw,i曙醇,鼓紀(jì)4":嗎-':,'68'翻W一—緣■i，銀166靡,"國咖纖一'，，，#，:w!'憶:似纖禁:霄"'H26(47)--1-A---AH27(48)KR1KA匕VKAH28(49)--1KA--A因而，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的重鏈可變區(qū)(VH)是H26VH(SEQIDNO:47)、H27VH(SEQIDNO:48)和H28VH(SEQIDNO:49)。SEQID47:VH人源化的構(gòu)建體H26QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIG幽PSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSSEQID48:VH人源化的構(gòu)建體H27QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSSEQID49:VH人源化的構(gòu)建體H28QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTS曹MHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS逸括G/o/s乂類成乂源必:T遂^"賞^r遞i^X^^在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，提供了包含表5中定義的CDR的人類或人源化重鏈可變區(qū)表5:CDR才艮據(jù)KabatHISYWMH(SEQIDNO:l)H2NINPSNGGTNYNEKFKS(SEQIDNO:2)H3GQSY(SEQIDNO:62)在一個(gè)實(shí)施方式中，表5的CDR包括在人類重鏈可變區(qū)序列中。在又一個(gè)實(shí)施方式中，人源化的重鏈可變區(qū)包含處在接受體抗體框架內(nèi)的表5所列的CDR,所述接受體抗體框架在框架區(qū)域中具有與鼠2A10供體抗體重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:7)的大于40%的同一性、或大于50%、或大于60%、或大于65%的同一性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，表5的CDR被插入人類重鏈可變區(qū)來得到以下的序列(H99):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS(SEQID61:2A10VH人源化的構(gòu)建體H99).在其他實(shí)施方式中，進(jìn)一步的回復(fù)突變被添加到H99VH序列的^f立置38、40、48、67、68、70、72、74或79(通過凄t字性殘基位置表示)的任一個(gè)中；其中每個(gè)替換的氨基酸殘基被SEQIDNO:7(供體抗體2A10的重鏈可變區(qū))中等價(jià)位置的氨基酸殘基取代，替換的數(shù)目在1到9之間。在其他實(shí)施方式中，替換的數(shù)目是l、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8或9個(gè)。H99VH是H1VH(SEQIDNO:33)的等價(jià)物，不同僅在于CDRH3在H99中是GQSY，而不是H1中發(fā)現(xiàn)的GQGY。對(duì)于最佳的結(jié)合親和性，對(duì)于小鼠抗體2A10(它的VH是SEQIDNO:7)的人源化發(fā)現(xiàn)的是，在位置48和68處的氨基酸殘基對(duì)，應(yīng)當(dāng)分別是I和A(如同它們存在于2A10中)或分別是M和V(如同它們存在于H98中)。預(yù)期的是，上述發(fā)現(xiàn)還與2A10的G95M變體的人源化相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中，回復(fù)突變位于以下表6中表明的位置，其中在相關(guān)位置的H99的殘基被該位置的2A10的殘基替換(在表中，"-"意思是在該位置沒有替換，從而殘基保持與Hl的序列中的一樣)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>逸^vL類成人源化f且;^輕鏈^T寬^的在謬4;^嚴(yán)本發(fā)明的VH構(gòu)建體可以與輕鏈配對(duì)來形成任何形式的人類NOGO-A結(jié)合單位(Fv),包括常規(guī)的具有全長(FL)可變區(qū)和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域重鏈序列的IgG抗體形式。包含本發(fā)明的VH構(gòu)建體和在位置235和237處的失活突變(EUIndex編號(hào))使得抗體為非溶胞性的全長(FL)IgGl重鏈序列的實(shí)例是SEQIDNO:53、54和55。SEQID53:重鏈人源化的構(gòu)建體H26MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS隨VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS隨GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.SEQID54:重鏈人源化的構(gòu)建體H27MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKF隨YVDGVEVH隨TKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQID55:重鏈人源化的構(gòu)建體H28MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCE國GYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD隨EPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK與本發(fā)明的重鏈可變區(qū)序列形成Fv的輕鏈可變區(qū)序列可以是容i午Fv結(jié)合人類NOGO-A的任何序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述輕鏈可變區(qū)是2A10輕鏈(參見WO05/061544)，其輕鏈可變區(qū)在此提供為SEQIDNO:8或其人源化^變體。2A10輕鏈的人源化變體優(yōu)選地含有嫁接到人類輕鏈可變區(qū)接受體框架上的表l中描述的所有輕鏈可變區(qū)CDR。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源化的輕鏈可變區(qū)是Lll(SEQIDNO:34)、L13(SEQIDNO:13)或L16(SEQIDNO:14)。在表7中提供了包含kabat位置37和/或45中的特定替換、基于L13和L16的可選擇的輕鏈可變區(qū)。表7,<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在另一個(gè)實(shí)施方式中，全長(FL)輕鏈序列是L11FL(SEQIDNO:36)、L13FL(SEQIDNO:17)或L16FL(SEQIDNO:18)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體、其片段或功能等價(jià)物包括選自H26、H27、H28、H100、H101和H102的VH序列；與以下的VL序列Lll、L13、L16、L100、L101、L102、L103、L104和L105的任一個(gè)組合。預(yù)期的是，特別地公開了列出的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的所有可能的組合(例如，H28L104等)。在特定的實(shí)施方式中，抗體、其片段或功能等價(jià)物包含以下的可變區(qū)酉己只十H27L16(SEQIDNO:48+SEQIDNO:14)H28L13(SEQIDNO:49+SEQIDNO:13)H28L16(SEQIDNO:49+SEQIDNO:14)在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包含以下的全長序列H27FLL16FL(SEQIDNO:54+SEQIDNO:18)H28FLL13FL(SEQIDNO:55+SEQIDNO:17)H28FLL16FL(SEQIDNO:55+SEQIDNO:18)在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包含H27L16(SEQIDNO:48+SEQIDNO:14)、或是全長抗體H28FLL16FL(SEQIDNO:55+SEQIDNO:18)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體或其片段結(jié)合到與H28L16的相同的人類NOGO表位，或者與H28L16竟?fàn)幗Y(jié)合人類NOGO,在這兩種情況下特征在于所述竟?fàn)幙贵w或其片段不是鼠抗體2A10或其人類或人源化變體，所述鼠抗體2A10或其人類或人源化變體包含具有序列GQGY的CDRH3(SEQIDNO:3)或含有CDRH3中的一個(gè)氨基酸取代的序列。在特定的實(shí)施方式中，抗體、其片段或功能等價(jià)物包含以下的可變區(qū)配對(duì)H100L16(SEQIDNO:63+SEQIDNO:14)H101L13(SEQIDNO:64+SEQIDNO:13)H102L16(SEQIDNO:65+SEQIDNO:14)4在#^和錄合;賴^《在的遽一#的我沐在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了抗體或其片段，其能夠在ELISA分析中結(jié)合人類NOGO蛋白或其片段，例如GST-NOGO-A56蛋白質(zhì)(SEQIDNO:32),其中在ELISA分析中所述抗體或其片段與人類NOGO蛋白或其片段的結(jié)合在存在具有以下序列VLPDIVMEAPLN(SEQIDNO:60)的肽的情況下被降低，并且在存在不相關(guān)的肽，例如來自人類NOGO不與SEQIDNO:60重疊的肽(例如SEQIDNO:85,YESIKHEPENPPPYEE)的情況下不一皮降低，特征在于所述抗體或其片段不是包含具有由氨基酸殘基GQGY組成的CDRH3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體或在CDRH3中具有一個(gè)氨基酸替換的其類似物。做為選擇，竟?fàn)幮噪氖荰PSPVLPDIVMEAPLN(SEQIDNO:73)或VLPDIVMEAPLNSAVP(SEQIDNO:74)。此外，結(jié)合與所述抗體或其片段相同的表位的抗體可以是不包含表1和2中所列全部CDR的抗體，或者是包含與組合的表1和2中、或單獨(dú)的表1或2中所列CDR具有80%或更大同源性的一組CDR的任何抗體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了抗體或其片段，其能夠在ELISA分析中結(jié)合由多肽序列VLPDIVMEAPLN(SEQIDNO:60)組成的人類NOGO蛋白質(zhì)的區(qū)域，特征在于所述抗體或其片段不是包含具有由氨基酸殘基GQGY組成的CDRH3的可變重鏈結(jié)構(gòu)域的抗體或在CDRH3中具有一個(gè)氨基酸替換的其類似物。做為選擇，所述抗體或其片段能夠結(jié)合TPSPVLPDIVMEAPLN(SEQIDNO:73)或VLPDIVMEAPLNSAVP(SEQIDNO:74)。此外，結(jié)合與所述抗體或其片段相同的表位的抗體可以是不包含表1和2中所列全部CDR的抗體，或者是包含與組合的表1和2中、或單獨(dú)的表1或2中所列CDR具有80%或更大同源性的一組CDR的任何抗體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了獲得抗體或其結(jié)合片段的方法，所述抗體或其結(jié)合片段結(jié)合人類NOGO表位VLPDIVMEAPLN(SEQIDNO:60),包括用所述肽免疫哺乳動(dòng)物并分離能夠產(chǎn)生結(jié)合所述肽的抗體的細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了獲得分離的抗體或其結(jié)合片段的方法，所述抗體或其結(jié)合片段結(jié)合人類NOGO表位VLPDIVMEAPLN(SEQIDNO:60),包括通過抗體或其結(jié)合片l殳與NOGO表位VLPDIVMEAPLN(SEQIDNO:60)的結(jié)合來篩選含有多種抗體或其結(jié)合片段的庫，每一種抗體或其結(jié)合片段與編碼所述抗體或其結(jié)合片段的核苷酸序列一起是可從所述庫中分離的。秀參逸合參本發(fā)明的進(jìn)一步的方面提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗NOGO抗體或其功能片段或等價(jià)物，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了在人類中治療或預(yù)防中風(fēng)(特別是缺血性的中風(fēng))和其他神經(jīng)疾病，特別是阿爾茨海默氏病，以及治療患有對(duì)CNS的機(jī)械性損傷(例如脊索損傷)的方法，其包括向有需要的所述人類施用本發(fā)明的有效量的抗NOGO抗體或其功能片段。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗NOGO抗體或其功能片段在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防中風(fēng)(特別是缺血性中風(fēng))和其他神經(jīng)疾病，特別是阿爾茨海默氏病和患有對(duì)CNS的機(jī)械性創(chuàng)傷(例如脊索損傷)的患者的治療。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了在患有或存在風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生中風(fēng)(特別是缺血性中風(fēng))或其他神經(jīng)疾病，特別是阿爾茨海默氏病的人類患者中，和在患有對(duì)CNS的機(jī)械性損傷(例如脊索損傷)的患者的治療中抑制神經(jīng)變性和/或促進(jìn)功能恢復(fù)的方法，其包括向所述有需要的人類施用有效量的本發(fā)明的抗NOGO抗體或其功能片段。在又進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗NOGO抗體或其功能片段在制備藥物中的用途，所述藥物用于在患有或存在風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生中風(fēng)和其他神經(jīng)疾病、特別是阿爾茨海默氏病的人類患者中以及患有對(duì)CNS的機(jī)械性損傷(例如脊索損傷)的患者的治療中抑制神經(jīng)變性和/或促進(jìn)功能恢復(fù)。本發(fā)明的其他方面和益處在詳細(xì)的說明中和其優(yōu)選的實(shí)施方式中進(jìn)一步描述。發(fā)明的詳細(xì)i兌明本發(fā)明的重鏈可變區(qū)可以形成天然抗體或其功能片段或等價(jià)物的結(jié)構(gòu)。因而抗體可以包含當(dāng)與合適的輕鏈配對(duì)時(shí)形成全長抗體、(Fab，)2片段、Fab片段或其等價(jià)物(例如，scFv、二、三或四體、Tandabs,等等)的本發(fā)明的VH區(qū)域。所述抗體可以是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4;或IgM;IgA，IgE或IgD,或其^務(wù)飾的變體。可以相應(yīng)地選才奪抗體重鏈的恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)可以是kappa或lambda恒定區(qū)。此外，抗體可以包含所有種類的修飾，例如，IgG二聚體、不再結(jié)合Fc受體或介導(dǎo)Clq結(jié)合的Fc突變體?？贵w還可以是在WO86/01533中描述的類型的嵌合抗體，其包含抗原結(jié)合區(qū)和非免疫球蛋白區(qū)域。根據(jù)需要的功能選擇恒定區(qū)。通常，IgGl將通過結(jié)合補(bǔ)體展現(xiàn)溶胞能力，和/或?qū)⒔閷?dǎo)ADCC(抗體依賴性的細(xì)胞的細(xì)胞毒性)。如果需要非細(xì)胞毒性封閉抗體，IgG4將是優(yōu)選的。然而，IgG4抗體可能展現(xiàn)產(chǎn)品中的不穩(wěn)定性，因而更優(yōu)選的是修飾一般更為穩(wěn)定的IgGl。在EP0307434中描述了建議的修飾，優(yōu)選的^f飾包括在位置235和237。因而，本發(fā)明提供了溶胞性或非溶胞形式的根據(jù)本發(fā)明的抗體。因而在優(yōu)選的形式中，本發(fā)明的抗體是具有在此描述的重鏈可變區(qū)的全長(即，H2L2四聚體)的非溶胞性IgGl抗體。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了編碼在此描述的重鏈可變區(qū)的多核苷酸。"NOGO"是指任何NOGO多肽，包括變體形式。這包括但不限于，具有1192個(gè)氨基酸殘基的NOGO-A(GenBankaccessionno.AJ251383);NOGO-B,—種缺少推定的細(xì)胞外結(jié)構(gòu);或中的殘基186-1004的剪接變體(GenBankaccessionno.AJ251384)和更短的剪接變體NOGO-C,其也缺少殘基186-1004，并且還具有更小的、可選擇的氨基末端結(jié)構(gòu)域(GenBankaccessionno.AJ251385)(Prinjhaetal(2000)上文)。在此所有對(duì)"NOGO"的引用被理解為包括NOGO的任何和所有的變體形式，例如NOGO-A和所描述的剪接變體，除非指明了特定的形式。"中和"和其語法上的變體是指全部或部分地抑制NOGO功能，包括它與神經(jīng)元的結(jié)合，以及對(duì)軸突生長的抑制作用。術(shù)語Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2按照它們標(biāo)準(zhǔn)的意義使用(參見,例如Harlowetal.,AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,(1988))。"嵌合抗體，，是指一種工程化的抗體，其含有來自供體抗體的天然存在的可變區(qū)(輕鏈和重鏈)，與來自接受體抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)連接。"人源化的抗體"是指一種工程化的抗體，具有來自非人類供體免疫球蛋白的CDR,分子的其余的免疫球蛋白衍生部分來源于一種(或多種)人免疫球蛋白。此外，框架支持殘基可以被改變以保持結(jié)合親和性(參見，例如，Queenetal.,Proc.NatlAcadSciUSA，86:10029-10032(1989),Hodgsonetal.,Bio/Technology,9:421(1991))。適合的人類接受體抗體可以是選自常規(guī)數(shù)據(jù)庫的一種，例如，KABAT⑧數(shù)據(jù)庫、LosAlamos數(shù)據(jù)庫和Swiss蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，通過與供體抗體(在這種情況下，為鼠供體抗體2A10)的核苷酸和氨基酸序列的同源性。特征在于與供體抗體的框架區(qū)域的同源性的人類抗體(在氨基酸的基礎(chǔ)上)可以適合于提供重鏈恒定區(qū)和/或重鏈可變框架區(qū)用于插入供體CDR(對(duì)于插入接受體框架的2A10CDR，參見表l)。能夠供給輕鏈恒定或可變框架區(qū)域的適合的接受體抗體可以按類似方式選擇。要注意的是，接受體抗體重鏈和輕鏈不需要來源于相同的接受體抗體。先有技術(shù)描述了幾種產(chǎn)生這樣的人源化抗體的方法，參見，例如，EP-A-0239400和EP-A-054951。術(shù)語"供體抗體"是指非人類抗體，其向人源化抗體貢獻(xiàn)它的可變區(qū)、CDR或其他功能片段或類似物的氨基酸序列，從而為人源化抗體提供供體抗體的抗原特異性和中和活性特征。術(shù)語"接受體抗體，，是指異源于供體抗體的抗體，其向人源化抗體提供了它的重鏈和/或輕鏈框架區(qū)和/或它的重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。接受體抗體可以來自任何哺乳動(dòng)物，只要它在人類中是非免疫原性的。優(yōu)選的，接受體抗體是人類抗體。做為選擇，人源化可以通過"飾面(veneering)，，的過程來實(shí)現(xiàn)。獨(dú)特的人類和鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的統(tǒng)計(jì)分析揭示了暴露的殘基的確切模式在人類和鼠抗體中是不同的，最獨(dú)特(individual)的表面位置具有對(duì)少數(shù)不同殘基的強(qiáng)的偏愛性(參見PadlanE.A."a/;(1991)Mol.Immunol.28,489-498和PedersenJ.T."(1994)J.Mol.Biol.235;959-973)。因而，有可能通過替換其框架區(qū)域中與在人類抗體中通常發(fā)現(xiàn)的不同的暴露殘基來降低非人類Fv的免疫原性。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)抗原性可能與表面可接近性相關(guān)，表面殘基的替換可能足以使小鼠可變區(qū)對(duì)于人類免疫系統(tǒng)來說成為"看不見的，，(還參見MarkG.E."a/(1994)in//aw<i/)oo^o/五:t/e"'me^a/尸/zarmaco/ogyvo/.773.'T7ze//w簡aco/ogyo/歸woc/owa/j加力odies,Springer-Verlag,ppl05-134)。這種人源化的過程被稱為"飾面"，因?yàn)閮H改變了抗體的表面，支持殘基保持原狀的。進(jìn)一步可選擇的方法在WO04/006955中列出。"CDR"被定義為抗體的互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列，其是免疫球蛋白重《連和輕《連的高變區(qū)。參見,例如Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,4thEd"U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NationalInstitutesofHealth(1987)。在免疫球蛋白的可變部分存在三個(gè)重鏈和三個(gè)輕鏈CDR(或CDR區(qū))。因而，在此使用的"CDR"是指所有；個(gè)重鏈CDR,或所有三個(gè)輕鏈CDR(或者如果合適，指全部重鏈和全部輕鏈CDR)?？贵w的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)折疊可能意味著其他殘基被認(rèn)為是抗原結(jié)合區(qū)域的部分，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解為是這樣。參見例如Chothiaetal.,(1989)Conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions;Nature342,p877-883。雙特異性抗體是具有對(duì)至少兩個(gè)不同表位的結(jié)合特異性的抗體。產(chǎn)生這種抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。慣例地，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)是基于兩條免疫球蛋白H鏈-L鏈配對(duì)的共表達(dá)，其中兩條H鏈具有不同的結(jié)合特異性，參見Millstein""/,Nature305537-539(1983),WO93/08829和Traunecker"a/EMBO,10,1991,3655-3659。由于H和L鏈的隨機(jī)分配，產(chǎn)生了十種不同抗體結(jié)構(gòu)的潛在混合物，其中僅有一種具有期望的結(jié)合特異性。可選擇的方法包括將具有期望的結(jié)合特異性的可變區(qū)融合到至少包含絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域的部分的重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選的是含有輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的CHI區(qū)域存在于至少一個(gè)所述融合物中。編碼這些融合物和如果希望，編碼L鏈的DNA被插入到獨(dú)立的表達(dá)載體中，然后共轉(zhuǎn)染到適合的宿主有機(jī)體中。然而可能的是將兩條或全部三條鏈的編碼序列插入到一個(gè)表達(dá)載體中。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，雙特異性抗體由在一條臂上具有第一結(jié)合特異性的H鏈和在另一臂上提供第二結(jié)合特異性的H-L鏈配對(duì)組成，參見WO94/04690。還參見Suresh"a/MethodsinEnzymology121,210，1986。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了雙特異性治療性抗體，其中所述抗體的至少一個(gè)結(jié)合特異性在SEQIDNO:60中描述的表位處結(jié)合人類NOGO。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體包含重鏈可變區(qū)CDRH3序列MQGY(SEQIDNO:45)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體包含以下的重4連和輕4連可變區(qū)對(duì)H27L16(SEQIDNO:48+SEQIDNO:14),H28L13(SEQIDNO:49+SEQIDNO:13)或H28L16(SEQIDNO:49+SEQIDNO:14)。本發(fā)明的抗體可以通過用包含本發(fā)明的抗體的編碼序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞來產(chǎn)生。通過將抗體的這些編碼序列與常規(guī)的調(diào)節(jié)控制序列可操作性相連地放置，產(chǎn)生表達(dá)載體或重組質(zhì)粒，所述調(diào)節(jié)控制序列能夠控制在宿主細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)和/或從宿主細(xì)胞的分泌。調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列，例如CMV啟動(dòng)子，和信號(hào)序列，其可以來源于其他已知的抗體。類似地，可以產(chǎn)生具有DNA序列的第二表達(dá)載體，所述DNA序列編碼互補(bǔ)的抗^^輕《連或重《連。優(yōu)選的，除了所涉及的編碼序列和可選才奪標(biāo)記之外，這種第二表達(dá)載體與第一表達(dá)載體相同，以確保盡可能地功能上表達(dá)每條多肽鏈。做為選擇，改變的抗體的重鏈和輕鏈編碼序列可以存在于單個(gè)載體上。選定的宿主細(xì)胞通過常規(guī)技術(shù)用第一和第二載體共轉(zhuǎn)染(或僅用單個(gè)載體轉(zhuǎn)染)，來創(chuàng)建包含重組或合成的輕鏈和重鏈的本發(fā)明的轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。然后通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來產(chǎn)生本發(fā)明的工程化的抗體。通過合適的分析，例如ELISA或RIA,來從培養(yǎng)物篩選包括了重組重鏈和/或輕鏈的締合的抗體?？梢圆捎孟嗨频某Ｒ?guī)技術(shù)來構(gòu)建其他改變的抗體和分子。一種有用的表達(dá)系統(tǒng)是谷氨酸合成酶系統(tǒng)(例如，LonzaBiologies所出售的)，特別是其中宿主細(xì)胞是CHO或NS0時(shí)(見下文)。使用常規(guī)過程(例如，寡核苷酸探針)容易地分離和測序編碼抗體的多核苷酸?？梢允褂玫妮d體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、微染色體(minichromsomes)，其中質(zhì)粒是典型的實(shí)施方式。一般地，這些載體進(jìn)一步包括與輕鏈和/或重鏈多核苷酸可操作連接的信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列以便于表達(dá)。編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸可以插入獨(dú)立的載體中，并導(dǎo)入(例如，通過電穿孔)相同的宿主細(xì)il包，或者，如果希望，重鏈和輕鏈可以被插入相同的載體用于轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。因而根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供了構(gòu)建編碼本發(fā)明的治療性抗體的輕鏈和/或重鏈或其抗原結(jié)合片段的載體的過程，所述方法包括向所述載體中插入編碼本發(fā)明的治療性抗體的輕鏈和/或重鏈的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了編碼具有SEQIDNO:47、48或49所列序列的人源化重鏈可變區(qū)的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了編碼具有SEQIDNO:53、54或55所列序列的人源化重鏈的多核苷酸。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員直接顯而易見的是，由于遺傳密碼的冗余，對(duì)于在此公開的那些的可選擇的多核苷酸也是可獲得的，其將編碼本發(fā)明的多肽。對(duì)于在本發(fā)明的方法和組合物構(gòu)建中采用的克隆和亞克隆步驟的合適的載體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，可以使用常規(guī)的pUC克隆載體系列。一種載體pUC19是可從供應(yīng)點(diǎn)例如Amersham(Buckinghamshire,UnitedKingdom)或Pharmacia(Uppsala,Sweden)商業(yè)獲得的。另外，能夠容易地復(fù)制的、具有豐富的克隆位點(diǎn)和可選擇基因(例如，抗生素抗性)并且易于操作的任何載體可以用于克隆。因而，克隆載體的選擇不是本發(fā)明的限制因素。其他優(yōu)選的載體序列包括多聚腺苷酸(polyA)信號(hào)序列，例如來自牛生長激素(BGH)的，以及P珠蛋白(betaglobin)啟動(dòng)子序列(betaglopro)。在此有用的表達(dá)載體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)來合成。典型的選擇基因編碼了蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)(a)賦予對(duì)抗生素或其他毒素例如氨節(jié)青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素的抗性，或(b)補(bǔ)足營養(yǎng)缺陷或補(bǔ)充復(fù)合培養(yǎng)基中不可獲得的營養(yǎng)物。選擇方案可以涉及延滯宿主細(xì)胞的生長。記物所賦予的藥物抗性而存活。另一個(gè)實(shí)例是所謂的DHFR選擇標(biāo)記，其中轉(zhuǎn)化體在存在氨甲蝶呤的情況下培養(yǎng)。CHO細(xì)胞是DHFR選擇的特別有用的細(xì)胞系。選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞拷貝數(shù)的方法包括使用DHFR系統(tǒng)，參見KaufmanR.J.etalJ.Mol.Biol.(1982)159,601-621,綜述參見WernerRG,NoeW,KoppK,SchluterM，"Appropriatemammalianexpressionsystemsforbiopharmaceuticals",Arzneimittel-Forschung.48(8):870-80,1998Aug。進(jìn)一步的實(shí)例是谷氨酸合成酶表達(dá)系統(tǒng)(LonzaBiologies)。用于酵母中的適合的選擇基因是trpl基因；參見Stinchcomb"Nature282,38,1979。這些載體的組件，例如復(fù)制子、選擇基因、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、信號(hào)序列等等，可以從商業(yè)上的或天然的來源獲得，或通過已知的過程合成，用于指導(dǎo)重組DNA的產(chǎn)物在選定的宿主中的表達(dá)和/或分泌。用于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、昆蟲、酵母和真菌表達(dá)的本領(lǐng)域已知的許多類型的其他合適的表達(dá)載體也可以為了這個(gè)目的而^皮選擇。粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。對(duì)于這些克隆載體的克隆和其他操作有用的宿主細(xì)胞也是常規(guī)的。然而，最理想地，來自E.coli的各種菌抹的細(xì)胞被用于克隆載體的復(fù)制和本發(fā)明的改變的抗體的構(gòu)建中的其他步驟。用于表達(dá)本發(fā)明的抗體的適合的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物細(xì)月包，例如NS0、Sp2/0、CHO(例如DG44)、COS、成纖維細(xì)月包(例如，3T3)和骨髓瘤細(xì)胞，更優(yōu)選的是CHO或骨髓瘤細(xì)胞。可以使用人類細(xì)胞，因而允許分子用人類糖基化模式來修飾。做為選擇，可以采用其他真核細(xì)胞系。適合的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的選擇以及用于轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選和產(chǎn)物產(chǎn)生和純化的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如以上引述的Sambrooketal.。細(xì)菌細(xì)胞作為適合于表達(dá)本發(fā)明的抗體或其片段(例如重組Fab或ScFv)的宿主細(xì)胞可以證明是有用的(參見，例如Pliickthim,A.,Immunol.Rev.,130:151-188(1992))。然而，由于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)處于未折疊或不正確折疊形式或處于非糖基化形式的傾向，在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的任何重組片段應(yīng)當(dāng)篩選抗原結(jié)合能力的保留。如果細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的分子以適當(dāng)?shù)卣郫B的形式產(chǎn)生，該細(xì)菌細(xì)胞將是期望的宿主。例如，用于表達(dá)的E.coli的各種菌抹在生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中作為宿主細(xì)胞是公知的。B.subtilis、Streptomyces、其他牙胞桿菌屬(bacilli)等等的各種菌才朱也可以用于這個(gè)方法中。當(dāng)希望時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酵母細(xì)胞的菌抹作為宿主細(xì)胞也是可獲得的，以及昆蟲細(xì)月包，例如果蠅和鱗翅目昆蟲和病毒表達(dá)系統(tǒng)。參見，例如，Milleretal.,GeneticEngineering,8:277-298,PlenumPress(1986)和其中引用的參考文獻(xiàn)?？梢詷?gòu)建載體的一般方法、產(chǎn)生本發(fā)明的宿主細(xì)胞需要的轉(zhuǎn)染方法、從這些宿主細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明的抗體所必需的培養(yǎng)方法都是常規(guī)技術(shù)。一般地，本發(fā)明的培養(yǎng)方法是無血清培養(yǎng)方法，通常通過在懸浮液中無血清培養(yǎng)細(xì)胞。同樣地，一旦產(chǎn)生了，本發(fā)明的抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)容物中純化，包括石克酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳等等。這些技術(shù)處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，并且不限制本發(fā)明。例如，在WO99/58679和WO96/16990中描述了抗體的制備。抗體表達(dá)的又一個(gè)方法可以利用在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)，例如在美國專利No.4,873,316中描述的。這涉及利用動(dòng)物的酪蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)其被轉(zhuǎn)基因摻入哺乳動(dòng)物中時(shí)允許雌性在它的奶中產(chǎn)生期望的重組蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)用編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈和/或重鏈的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞并回收由此產(chǎn)生的抗體的步驟。用于克隆或表達(dá)編碼本發(fā)明的抗體的載體的適合的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞、酵母或更高等的真核細(xì)胞。適合的原核細(xì)胞包括真細(xì)菌，例如腸4干菌牙+(enterobacteriaceae),^口i^'c/2en'c/2za伊J^口￡.Co/z(侈寸^口ATCC31,446;31,537;27,325),￡>^oZ)<2"er，￡>wz>n'a，A7eZw'e〃a尸ro&斷5W/wo加〃a例如5"a/附o"e〃a妙/zz.mwrz'謂,沙雷氏菌屬,例如,Se/ra^fwarcesc"w禾口57n'ge〃a以及牙月包斥干菌屬，<列^口禾口5.//c/zem/onH^(參見DD266710),假單胞菌屬，例如和5^e/tom_yc^。#宿主纟田月包中，Sacc/zaro7W少c65ce廠^vz、/ae、sc/n.zo^acc/za^o^wj/ces/ww&、Kluyveromyces(例如ATCC16,045;12，424;24178;56,500)、yar卿ia(EP402,226)、尸/c/n力尸朋旨^(EP183,070，還參見Peng"a/J.Biotechnol.108(2004)185-192)、Q2"t/^3、7Wc/zocfenT^reewarEP244,234,>尸em'"'〃z'w、Tb/j^oc/at/z'wm一口^4s/erg7'〃z^宿主例^t口Am'tiw/am1牙口也是期《寺的。雖然原核和酵母宿主細(xì)胞是本發(fā)明特別期待的，然而一般地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是脊推動(dòng)物細(xì)胞。適合的脊推動(dòng)物宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如COS陽l(ATCCNo.CRL1650)、COS-7(ATCCCRL1651)、人類胚腎系293、嬰兒倉鼠腎臟細(xì)胞(BHK)(ATCCCRL.1632)、BHK570(ATCCNO:CRL10314)、293(ATCCNO.CRL1573)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO(例如CHO-Kl、ATCCNO:CCL61，DHFR-CHO細(xì)胞系例如DG44(參見Urlaub"a/,(1986)SomaticCellMol.Genet.12,555-556)),特別是適合于懸浮培養(yǎng)的那些CHO細(xì)胞系、小鼠滋養(yǎng)細(xì)胞、猴腎臟細(xì)胞、非洲綠猴腎臟細(xì)胞(ATCCCRL-1587)、HELA細(xì)胞、犬腎臟細(xì)胞(ATCCCCL34)、人類肺細(xì)J包(ATCCCCL75)、HepG2和骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞，例如NS0(參見US5,807,715)、Sp2/0、Y0。因而在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含載體的穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述載體編碼在此描述的治療性抗體的重《連和/或輕鏈或其抗原結(jié)合片段。一般地，這種宿主細(xì)胞包含編碼輕鏈的第一載體和編碼所述重鏈的第二載體。用編碼本發(fā)明的治療抗體或其抗原結(jié)合片段的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來培養(yǎng)。宿主細(xì)胞可以在旋轉(zhuǎn)燒瓶、滾瓶或空心絲系統(tǒng)中培養(yǎng)，但對(duì)于大規(guī);溪生產(chǎn)優(yōu)選的是，對(duì)懸浮培養(yǎng)物特別地使用攪拌罐反應(yīng)器。一般地，攪拌罐適合于利用例如起泡器(sparger)、擋板或低剪切轉(zhuǎn)子的曝氣(aeration)。對(duì)于泡柱和氣升反應(yīng)器，可以使用空氣或氧氣泡的直接曝氣。當(dāng)宿主細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選的是培養(yǎng)基補(bǔ)充有細(xì)胞保護(hù)試劑，例如pluromcF-68以幫助防止作為曝氣過程的結(jié)果的細(xì)胞損傷。取決于宿主細(xì)胞特征，樣吏載體可以用作貼壁(anchorage)依賴性細(xì)胞系的生長底物，或者細(xì)胞可以適合于懸浮培養(yǎng)(這是典型的)。宿主細(xì)胞特別是脊推動(dòng)物宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可以利用多種操作方式，例如進(jìn)料-分批、重復(fù)的分批處理(參見Drapeau"a/(1994)cytotechnology15:103-109)、擴(kuò)展的分配處理或灌注培養(yǎng)。雖然重組轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可以在含有血清的培養(yǎng)基(這樣的培養(yǎng)基包含胎牛血清(FCS))中培養(yǎng)，優(yōu)選的是這種宿主細(xì)胞在如KeenW(1995)Cytotechnology17:153-163中所公開的合成的無血清培養(yǎng)基中或商業(yè)上可獲得的培養(yǎng)基如ProCHO-CDM或UltraCHO(CambrexNJ,USA)中培養(yǎng)，必要時(shí)補(bǔ)充能量來源例如葡萄糖和合成的生長因子例如重組胰島素。宿主細(xì)胞的無血清培養(yǎng)可能需要那些細(xì)胞適合于在無血清條件中生長。一種適應(yīng)的方法是在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這種宿主細(xì)胞，并重復(fù)地將80%的培養(yǎng)基交換為無血清培養(yǎng)基，從而宿主細(xì)胞學(xué)習(xí)在無血清條件中的適應(yīng)(參見例如，Scharfenbergf"0995)in爿m'附a/Ce〃fec/wo/ogy:Z)eve/op膨她to而油/7zece幽r少(^BeuveryE.C."eds),pp619-623,KluwerAcademicpublishers)。分泌到培養(yǎng)基中的本發(fā)明的抗體可以使用各種技術(shù)來從培養(yǎng)基中回收和純化，以提供適合于預(yù)定用途的純化的程度。例如，與包含治療性抗體的培養(yǎng)基相比，用于治療人類患者的本發(fā)明的治療抗體的應(yīng)用一般需要至少95%的純度，更一般地98%或99%純度。在笫一種情況下，來自培養(yǎng)基的細(xì)胞碎片一般使用離心、隨后通過利用例如微量過濾、超濾和/或深度過濾的上清液澄清步驟來除去。各種其他技術(shù)例如透析和凝膠電泳和層析技術(shù)例如羥磷灰石(HA)、親和層析(任選的涉及例如聚組氨酸的親和標(biāo)簽系統(tǒng))和/或疏水性相互作用層析(HIC,參見US5,429，746)是可利用的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體在一些澄清步驟之后使用蛋白A或G親和層析來捕獲，隨后是進(jìn)一步的層析步驟，例如離子交換和/或HA層析、陰離子或陽離子交換、尺寸(size)排阻層析和硫酸銨沉淀。一般地，還采用了各種病毒去除步驟(例如，使用例如DV-20過濾器的納濾)。在這幾個(gè)步驟之后，提供了包含至少75mg/ml或更高例如100mg/ml或更多本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的純化的(通常為單克隆的)制品，因而形成本發(fā)明的實(shí)施方式。適當(dāng)?shù)?，這種制品基本上沒有聚集形式的本發(fā)明的抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗NOGO抗體的方法，所述抗體特異性地結(jié)合并中和人類NOGO-A的活性，所述方法包括步驟(a)提供編碼抗體的重鏈的第一載體；(b)提供編碼抗體的輕鏈的第二載體；(c)用所述第一和第二載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(例如，CHO);(d)在有助于所述抗體從所述宿主細(xì)胞分泌到所述培養(yǎng)基中的條件下培養(yǎng)步驟(c)的宿主細(xì)胞；(e)回收步驟(d)的分泌的抗體。一旦通過期望的方法表達(dá)，通過使用合適的分析檢查抗體的體外活性。采用當(dāng)前常規(guī)的ELISA分析形式來評(píng)估抗體與NOGO的定性和定量的結(jié)合。另外，在隨后進(jìn)行的人類臨床研究來評(píng)估不考慮一般的清除才幾制在體內(nèi)的抗體留存之前，其他體外分析也可以用于證實(shí)中和效力。對(duì)本發(fā)明的抗體的其他修飾包括本發(fā)明的抗體的糖基化變體。在抗體的恒定區(qū)中保守位置處抗體的糖基化已知對(duì)于抗體功能具有深刻的影響，特別是效應(yīng)物功能，例如如上描述的那些，參見，例如Boyd"a/(1996),Mol.Immunol.32,1311-1318。其中添加、替換、刪除或修飾了一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分的本發(fā)明的治療性抗體或其抗原結(jié)合片段的糖基化變體是期待的。導(dǎo)入天冬酰胺-X-絲氨酸或天冬酰胺-X-蘇氨酸基序創(chuàng)建了碳水化合物部分的酶學(xué)附著的潛在位點(diǎn)，因而可以用于操作抗體的糖基化。在Rajuefa/(2001)Biochemistry40,8868-8876中，TNFR-IgG免疫粘附素(immunoadhesin)的末端唾液酸化(smlyation)通過利用P-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和/或a,2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶的重新半乳糖基化(regalactosylation)和/或重新唾液酸化的過程來提高。提高末端唾液酸化被認(rèn)為提高免疫球蛋白的半衰期。與大多數(shù)糖蛋白一樣，在自然中抗體一般作為糖形式(glycoform)的混合物來產(chǎn)生。當(dāng)抗體在真核的特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)，這種混合物是特別明顯的。已經(jīng)開發(fā)了多種方法來制造限定的糖形式，參見Zhang"a/Science(2004)，303，371,Sears"a/,Science,(2001)291,2344,Wacker"a/(2002)Science,2981790,Davisw(2002)Chem.Rev.102，579,HangW(2001)Acc.Chem.Res34,727。因而，本發(fā)明涉及在此描述的多種治療性(一船二單克隆的)抗體(其可以是IgG同種型，例如IgGl),其包含所述抗體或其抗原結(jié)合片段的預(yù)定數(shù)量(例如7個(gè)或更少，例如5個(gè)或更少，例如兩個(gè)或一個(gè))糖形式。本發(fā)明的治療試劑可以預(yù)防性的、或在中風(fēng)事件之后/在臨床癥狀發(fā)作時(shí)、或根據(jù)另外的需要來施用。治療的劑量和持續(xù)時(shí)間涉及本發(fā)明的分子在人類循環(huán)中的相對(duì)持續(xù)時(shí)間，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員取決于要治療的狀況和患者的一般健康狀態(tài)來調(diào)整。設(shè)想的是，可能需要在延長的時(shí)間段(例如，四到六個(gè)月)上的重復(fù)劑量給藥(例如，每周一次或每兩周一次)來實(shí)現(xiàn)最大的治療效力。本發(fā)明的治療試劑的施用方式可以是向宿主遞送試劑的4壬何適合的途徑?？贵w和本發(fā)明的藥物組合物對(duì)于腸胃外施用，即皮下地(s.c.)、鞘內(nèi)地(intrathecally)、腹膜內(nèi)地(i.p.)、肌肉內(nèi)地(i.m.)、靜脈內(nèi)地(i.v.)或鼻內(nèi)地(i.n.)是特別有用的。本發(fā)明的治療試劑可以作為藥物組合物來制備，所述組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中有效量的本發(fā)明的抗體作為活性成分。在本發(fā)明的預(yù)防性試劑中，優(yōu)選的正在生理學(xué)的pH值下緩沖的、處于待注射形式的含有工程化的抗體的水懸浮液或溶液是優(yōu)選的。用于腸胃外施用的組合物通常將包含溶于藥學(xué)上可接受的載體、優(yōu)選的水性載體中的本發(fā)明的抗體或其混合物(cocktail)的溶液。可以使用各種水性載體，例如0.9%鹽水、0.3%甘氨酸，等等。這些溶液是無菌的，一般沒有顆粒物質(zhì)。這些溶液可以通過常規(guī)的、公知的滅菌技術(shù)(例如，過濾)來滅菌。組合物可以含有達(dá)到近似生理?xiàng)l件所需的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑，等等。在這種藥物制劑中本發(fā)聽的抗體的濃度可以廣泛地變化，即，按重量從低于約0.5%,通常在或至少約1%到多達(dá)15或20%,將主要根據(jù)液體體積、粘度等等、根據(jù)選定的特定施用方式來選擇。因而，用于肌內(nèi)注射的本發(fā)明的藥物組合物可以被制備以含有1mL的無菌緩沖水，和約lng到約100mg、例如約50ng到約30mg或更多、優(yōu)選的約5mg到約25mg之間的本發(fā)明的抗體。類似地，用于l爭脈內(nèi)輸注的本發(fā)明的藥物組合物可以被制備以含有約250ml無菌Rmger's溶液，和每mlRmger，s溶液約1到約30、優(yōu)選的5mg到約25mg的本發(fā)明的工程化的抗體。制備胃腸外可施用的組合物的實(shí)際方法是公知的，或者對(duì)于本領(lǐng)域-技術(shù)人員是顯而易見的，在例如Remington'sPharmaceuticalScience,15thed.,MackPublishingCompany,Easton,Pennsylvania中更詳細(xì)地描述。對(duì)于本發(fā)明的靜脈內(nèi)可施用抗體制劑的制備,參見LasmarUandParkinsD"TheformulationofBiopharmaceuticalproducts",Pharma.Sci,Tech.today,page129-137,Vol.3(3rdApril2000),Wang,W"Instability,stabilisationandformulationofliquidproteinpharmaceuticals",Int.J.Pharm185(1999)129-188,StabilityofProteinPharmaceuticalsPartAandBedAhemT.J.,ManningMC.,NewYork,NY:PlenumPress(1992),Akers,M.J."Excipient-DruginteractionsinParenteralFormulations",J.PharmSci91(2002)2283-2300,Imamura,Ketal"EffectsoftypesofsugaronstabilizationofProteininthedriedstate",JPharmSci92(2003)266-274,Izutsu,Kkojima,S."Excipientcrystalinityanditsprotein-stmcture-stabilizingeffectduringfreeze-drying，，，JPharm.Pharmacol,54(2002)1033-1039,Johnson,R,"Manmtol-sucrosemixtures-versatileformulationsforproteinlyophilization",J.Pharm.Sci,91(2002)914-922。Ha,EWangW,WangY.j."Peroxideformationinpolysorbate80andproteinstability",J.PharmSci，91,2252-2264,(2002)它的完整內(nèi)容通過引用合并在此，讀者可以特別地參考它。優(yōu)選的是，本發(fā)明的治療試劑當(dāng)在藥物制品中時(shí)，以單位劑量形式存在。合適的治療有效劑量將由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。為了在人類中有效地治療中風(fēng)和其他神經(jīng)疾病，設(shè)想胃腸外地、優(yōu)選的S.C.、l.V.或i.m.(月幾內(nèi)地)施用每70kg體重700到3500mg范圍內(nèi)的本發(fā)明抗體的一個(gè)劑量。如果必要，這種劑量可以在由醫(yī)師酌情選擇的合適時(shí)間間隔上重復(fù)。在此描述的抗體可以被凍千用于保存和在使用前在適合的載體中重構(gòu)。這種技術(shù)已經(jīng)顯示了對(duì)于常規(guī)的免疫球蛋白是有效的，可以采用本領(lǐng)i或已知的凍干和重構(gòu)4支術(shù)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗NOGO抗體或其功能片段以及藥學(xué)上可接受的載體，用于中風(fēng)和其他神經(jīng)疾病的治療或預(yù)防。在又進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗NOGO抗體或其功能片段以及藥學(xué)上可接受的載體，用于在患有、或存在風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生中風(fēng)或其他神經(jīng)疾病的人類患者中抑制神經(jīng)變性和/或促進(jìn)功能恢復(fù)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在人類中治療或預(yù)防中風(fēng)(特別是缺血性中風(fēng))和其他神經(jīng)疾病/失調(diào)、特別是阿爾茨海默氏病的方法，其包括向所述有需要的人類施用有效量的本發(fā)明的抗NOGO抗體或其功能片段。除了在人類患者中治療確定的疾病之外(或作為選擇)，本發(fā)明的抗體可以用于治療方法中來減緩或停止阿爾茨海默氏病的發(fā)展和/或發(fā)作。進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗NOGO抗體或其功能片段在制備用于治療或預(yù)防中風(fēng)和其他神經(jīng)疾病/失調(diào)、特別是阿爾茨海默氏病的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了在患有或存在風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生中風(fēng)或其他神經(jīng)疾病/失調(diào)、特別是阿爾茨海默氏病的人類患者中抑制神經(jīng)變性和/或促進(jìn)功能恢復(fù)的方法，其包括向所述有需要的人類施用有效量的本發(fā)明的抗NOGO抗體或其功能片段。此外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗NOGO抗體或其功能片段在制備用于在患有或存在風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生中風(fēng)和其他神經(jīng)疾病/失調(diào)、特別是阿爾茨海默氏病的人類患者中抑制神經(jīng)變性和/或促進(jìn)功能恢復(fù)的藥物中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在人類中治療或預(yù)防中風(fēng)或其他神經(jīng)疾病/失調(diào)、特別是阿爾茨海默氏病的方法，包括腸胃外施用治療有效量的本發(fā)明的抗NOGO抗體的步驟。優(yōu)選的，所述抗NOGO抗體是靜脈內(nèi)施用的。上文中使用的神經(jīng)疾病或失調(diào)包括但不限于外傷性腦損傷、脊髓損傷、額顳葉性癡呆(tau蛋白病變)、周圍神經(jīng)病、帕金森氏病、Huntington，s病，特別是阿爾茨海默氏病、多發(fā)性硬化或肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。本發(fā)明還提供了促進(jìn)軸突出芽的方法，包括用本發(fā)明的抗NOGO抗體接觸人類軸突的步驟。這種方法可以體外或體內(nèi)地進(jìn)行，優(yōu)選的所述方法體內(nèi)i也進(jìn)4亍。因而在進(jìn)一步的方面，提供了在人類患者中治療中風(fēng)(特別是缺血性中風(fēng))、腦損傷、脊髓損傷、額顳葉癡呆(tau蛋白病變)、周圍神經(jīng)病、帕金森氏病、Huntmgton，s病、多發(fā)性硬化，以及特別是阿爾茨海默氏病的方法，所述方法包括靜脈內(nèi)施用治療有效量的本發(fā)明的抗NOGO抗體。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了促進(jìn)人類受試者(例如患者)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的軸突出芽的方法，所述方法包括施用(例如，靜脈內(nèi)施用)治療有效量的本發(fā)明的抗NOGO抗體。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了本發(fā)明的抗NOGO抗體(例如，包含在此所列CDR的抗NOGO抗體)在制造用于在人類患者中治療中風(fēng)(特別是缺血性中風(fēng))、腦損傷、脊髓損傷、額顳葉癡呆(tau蛋白病變)、周圍神經(jīng)病、帕金森氏病、Huntington's病、特別是阿爾茨海默氏病、多發(fā)性硬化或肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)的靜脈內(nèi)可施用藥物中的用途。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了在患有(或易感于)中風(fēng)(特別是缺血性中風(fēng))、腦損傷、脊髓損傷、額顳葉癡呆(tau蛋白病變)、周圍神經(jīng)病、帕金森氏病、Huntington's病、多發(fā)性硬—化和特別是阿爾茨海默氏病的人類患者中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中再生軸突過程的方法，所述方法包括施用(例如，靜脈內(nèi)地)治療有效量的本發(fā)明的抗NOGO抗體的步驟。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了本發(fā)明的抗NOGO抗體在制造用于在患有(或易感于)中風(fēng)(特別是缺血性中風(fēng))、腦損傷、脊髓損傷、額顳葉癡呆(tau蛋白病變)、周圍3申經(jīng)病、帕金^兔氏病、Huntington's病、多發(fā)性硬化和特別是阿爾茨海默氏病的人類患者中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中再生軸突過程的靜脈內(nèi)可施用藥物組合物中的用途。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了調(diào)節(jié)淀粉樣蛋白產(chǎn)生肽(amyloidogenicpeptide)的產(chǎn)生的方法，包括用本發(fā)明的抗NOGO抗體接觸表達(dá)前體和NOGO多肽(例如，人類NOGO-A)的細(xì)胞的步驟，所述淀粉樣變性肽衍生自所述前體。在典型的實(shí)施方式中，所述前體是APP。在進(jìn)一步典型的實(shí)施方式中，所述淀粉樣變性肽是AP，最優(yōu)選的是AP40、AP42或兩者的組合。如在此使用的，術(shù)語"功能恢復(fù)，，是指在例如缺血性事件或損傷之后或臨床癥狀發(fā)作后在受試者中運(yùn)動(dòng)和/或感覺和/或行為的改善。人類中的功能恢復(fù)可以通過工具來評(píng)估，所述工具被設(shè)計(jì)以測量基本神經(jīng)功能例如運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、感覺和協(xié)調(diào)、認(rèn)知功能例如記憶、語言和跟隨指導(dǎo)的能力、功能能力例如每天的生活或器械活動(dòng)的基本活動(dòng)力?；旧窠?jīng)功能的恢復(fù)可以使用工具例如NIHStrokeScale(NIHSS)來測量，認(rèn)知功能的恢復(fù)可以利用神經(jīng)心理學(xué)測試?yán)鏐ostonNamingTest、Trail-makingTests和CaliforniaVerbalLearningTest來領(lǐng)'J量，每天生活的活動(dòng)力可以用4義器例如ADCS/ADL(Alzheimer'sDiseaseClinicalStudies/ActivitiesofDailyLiving)scale或BristolActivitiesofDailyLivingScale來測量，所有的測試和度量都是本領(lǐng)域已知的。以下實(shí)施例說明但不限制本發(fā)明。實(shí)施例1,乂漆必jfeA^G(9戎謬^y夕^^^表id:通過構(gòu)建包括限制性位點(diǎn)的重疊寡核苷酸用于克隆到Rid和Rln哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(或用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的任何其他適合的表達(dá)載體)中以及人類信號(hào)序列，從頭開始制備人源化Vh和Vl枸建體。HindIII和SpeI限制性位點(diǎn)一皮導(dǎo)入以構(gòu)成(frame)含有CAMPATH-1H信號(hào)序列的vh結(jié)構(gòu)域用于克隆到含有人類Y1突變的恒定區(qū)的Rid中，以防止ADCC和CDC活性(L235A和G237A-EUIndex編號(hào)系統(tǒng))。將HmdIII和BsiWI限制性位點(diǎn)導(dǎo)入以構(gòu)成含有CAMPATH-1H信號(hào)序列的VL結(jié)構(gòu)域用于克隆到含有人類kappa恒定區(qū)的Rln中。CAMPATH-1H信號(hào)序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ.ID.NO:31)產(chǎn)生編碼人類IgG重鏈氨基酸序列的質(zhì)粒，其中CDR是表2中描述的那些。通過使用Quickchange試劑盒(Stratagene)導(dǎo)入單個(gè)點(diǎn)突變基酸序列的質(zhì)粒，其中CDR是如表3中描述的那些。及哪些序列是配對(duì)的，配對(duì)的全長(FL)重鏈序列的氨基酸序列中僅有的差異是在可變區(qū)的CDRH3內(nèi)G95M(kabat編號(hào))處的替換<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>編碼重鏈的質(zhì)粒然后與以下全長輕鏈序列之一共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中(細(xì)節(jié)參見實(shí)施例2):LllFL(SEQIDNO:36),L13FL(SEQIDNO:17)或L16FL(SEQIDNO:18)。并行地，產(chǎn)生稱為HcLc的嵌合體(其是2A10的嵌合體(SEQIDNO:9和10——包含2A10鼠VH(SEQIDNO:7)和VL(SEQIDNO:8)以及人類IgG恒定區(qū)的的全長鏈)。實(shí)施例2,C/Z(9細(xì)應(yīng)哞的在謬表這分別編碼重鏈和輕鏈的Rid和Rln質(zhì)粒(或適用于哺乳動(dòng)物細(xì)月包中的其他載體)瞬時(shí)地共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，并以小規(guī)?；虼笠?guī)模表達(dá)來產(chǎn)生抗體。做為選擇，通過電穿孔將相同的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到DHFR-CHO細(xì)胞中，使用無核苷培養(yǎng)基選擇表達(dá)合適的抗體的穩(wěn)定的多克隆細(xì)胞群體(Rid含有DHFR基因，Rln含有新霉素選擇標(biāo)記物)。在某些分析中，直接地從組織培養(yǎng)上清液評(píng)估抗體。在其他分析中，通過親和層新-在蛋白A瓊脂糖上回收和純化重組抗體。實(shí)施例3,乂源化^我M9G(9戎謬/,合M9GO在PBS中0.05-1ng/ml的GST-人類NOGO-A56(參見實(shí)施例5)包被在NuncImmunosorp平板上(100ju1每孔)在4。C過夜。用TBS+0.05%Tween(TBST)清洗反應(yīng)孔(well)—次，隨后與TBST中的2%BSA在室溫下孵育1小時(shí)來阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)?？贵w在TBST+2%BSA中稀釋到10Mg/ml,從中制備l/2稀釋物?？贵w一式兩份添加到反應(yīng)孔，在室溫下孵育1小時(shí)。用TBST洗滌反應(yīng)孔三次，與抗人類kappa過氧化物酶共扼物(1:2000)孵育1小時(shí)。反應(yīng)孔用TBST洗滌三次，然后與每個(gè)反應(yīng)孔100m1OPD過氧化物酶底物(Sigma)孵育10分鐘。顯色反應(yīng)通過添加25JU1濃縮的H2S04來停止。使用平板讀數(shù)器測量490nm處的光密度。減去從沒有抗體的反應(yīng)孔讀取的背景值。其是2A10的嵌合體(包含2A10鼠VH(SEQIDNO:7)和VL(SEQIDNO:8)和人類IgG恒定區(qū))相比對(duì)GST-人類NOGO-A56(細(xì)節(jié)參見實(shí)施例5)的劑量依賴性結(jié)合。Y軸顯示了在490nm測量的光密度(OD),在反應(yīng)孔中捕獲的抗體的定量測量。X軸顯示了在每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)每個(gè)反應(yīng)孔使用的抗體濃度(mcg/ml)。附圖1-4中使用的抗體材料是通過多克隆表達(dá)系統(tǒng)或大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的純化的抗體。在這些情況下，IgG水平通過ELISA和光密度來定量。附圖1-4中顯示的實(shí)馬全的結(jié)果顯示，G95M突變的包括改善了抗體的性能。唯一例外是附圖3和4中顯示的H27L16,其非常不良地進(jìn)4亍。我們相信，這個(gè)數(shù)據(jù)由H27L16分析的未筌別的技術(shù)問題引起，因?yàn)樵谄渌治鲋蠬27L16另外具有一致地良好表現(xiàn)(在附圖1和2顯示的ELISA中，以及在BIAcore分析中(表9和10))。H27L16在后來的實(shí)驗(yàn)中也顯示了工作得非常好(參見附圖11和12)。實(shí)施例4,NuncImmunosorp平板用碳酸氫鹽緩沖液(Sigma#C3041)中2jug/ml的山羊抗人IgG鏈捕獲抗體(Sigma#13382)包被，在4。C孵育過夜。平板用含有0.05%Tween20的TBS(TBST)洗滌兩次，用含有2%(或1-3%)BSA的200julTBST(封閉緩沖劑)在室溫下封閉1小時(shí)。平斗反用TBST洗滌兩次。含有抗體的組織培養(yǎng)上清液^爭越平板在2倍稀釋步驟中滴定到封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。平板用TBST洗滌三次。HRP軛合的抗體H23(山羊抗人kappa鏈，Sigma#A7164)在TBST中1:2000稀釋，每個(gè)反應(yīng)孔添加100|ul。平板在室溫下孵育1小時(shí)。平板用TBST洗滌三次，用100piFast-OPD底物(Sigma弁P9187)顯色。容許顏色顯現(xiàn)5-10分鐘，之后用25)al3MH2S04停止ELISA。在490nM處讀取平板的吸光度，通過參考標(biāo)準(zhǔn)曲線測定抗體濃度。實(shí)施例5,MXCM,發(fā)^,ir#6>G6M5(5，&g(9/DAA<9.'WJ編碼包含人類NOGO-A的氨基酸586-785和GST標(biāo)簽(SEQIDNO:32)的多肽的cDNA序列通過將編碼人類NOGO-A的氨基酸586-785的cDNA克隆到pGEX-6Pl的BamHI-XhoI位點(diǎn)中來產(chǎn)生稱為GST-人類-NOGO-A56的GST標(biāo)簽的融合蛋白來創(chuàng)建。質(zhì)粒在具有100jug/ml氨芐青霉素的2XTY培養(yǎng)基中在BL21細(xì)胞中表達(dá)，隨后用0.5mM的IPTG在37。C誘導(dǎo)3小時(shí)。通過超聲處理裂解細(xì)胞團(tuán)，根據(jù)廠家說明書使用Glutathione-瓊脂糖(AmershamPharmacia)純化融合蛋白。純化的蛋白質(zhì)使用還原的谷胱甘肽洗脫，相對(duì)于PBS廣泛地透析，-使用BSA標(biāo)準(zhǔn)物和基于BioRadcoomassie的蛋白質(zhì)分析來定量，然后以等分量儲(chǔ)存在-80°C。實(shí)施例6,乂源必^戎M9GO卓^謦我謬^6w0^e為V^f抗NOGO單克隆抗體(mAb)與重組表達(dá)的GST-人類NOGO-A的結(jié)合動(dòng)力學(xué)使用Biacore3000生物傳感器或BIAcoreT100來分析。hNOGO-A芯片如下制備方法GST-人類NOGO-A56使用為目標(biāo)固定水平i殳計(jì)的BiacoreWizard程序通過伯胺聯(lián)結(jié)固定在CM5芯片上。通過流通50mMN-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)和200mMN-乙基-N，-二曱基氨基丙基碳化物(EDC)的溶液來活化CM5傳感器表面。然后使醋酸鈉緩沖劑中的GST-人類NOGO-A56,pH5.0或pH4.5,通過芯片上并固定。在固定完成之后，通過注射1M鹽酸乙醇胺、pH8.5來封閉任何仍然活化的酯?？筃OGOmAb在HBS陽EP(10mMHEPES,pH7.4,150mMNaCl，3mMEDTA,和0.005%P-20表面活性劑)中稀釋用于BIAcore3000,或在T100的情況下在HBS-EP+(lOmMHEPES,pH7.4,150mMNaCl，3mMEDTA和0.05。/。P-20表面活性劑)中稀釋，在限定的抗體濃度范圍內(nèi)進(jìn)行結(jié)合研究。所有的運(yùn)行都參考空白的傳感器表面(如早先描述的活化和封閉但沒有添加配體的表面)。結(jié)合分析對(duì)于BIAcore3000使用BIAevaluation動(dòng)力學(xué)分析軟件版本4.1,以及T100動(dòng)力學(xué)分析軟件版本1.0來進(jìn)行。本發(fā)明的其他抗體的Biacore分析基本上遵照與在此描述相同的方案。除非另有說明，BIAcore實(shí)驗(yàn)在25。C進(jìn)行。在以下的結(jié)果小節(jié)中，每個(gè)數(shù)據(jù)表格代表從單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果。結(jié)果-表9<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實(shí)施例7:《/^#處遽舉("o/T-mfe,~#/{/的乂漆化我7^90(9卓^發(fā)戎謬^腦C力Vf如同為了動(dòng)力學(xué)分^f的制備GST-人類NOGO-A56芯片。細(xì)胞上清液直接取自CH0-K1細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。這些直接通過傳感器表面，測量相互作用。模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液被用于雙重參考以除去由于組織培養(yǎng)基的任何偽差。所有的運(yùn)行都參考空白的感受器表面(如早先描述的活化和封閉但沒有添加配體的表面)。使用BIAevaluation動(dòng)力學(xué)分析軟件版本4.1進(jìn)行結(jié)合分析?！禴艇,衡獲得跨越GST-人類NOGO-A56結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:32)的NOGO-A56部分的47個(gè)重疊肽(從Mimotope)。除了在C-末端具有GSG-生物胞素標(biāo)簽的第一個(gè)肽之外，肽長度是16個(gè)氨基酸，十二個(gè)氨基酸與鄰近的肽重疊(每個(gè)肽進(jìn)一步在n-末端包含生物素-sgsg序列)。肽被用于表位作圖2A10和H28L16的結(jié)合位點(diǎn)。^在斧^W才法.'無菌水中5jug/ml的鏈霉抗生物素蛋白包被在Nuncimmunosorp平板(100jul每孔)上37。C過夜。平板用含有0.05%Tween的PBS(pbst)清洗3次，然后用pbst中的3。/。bsa在4。C封閉過夜。平板用TBST洗滌3次。然后以大約IOjug/ml(在PBST中的3。/。BSA中稀釋)的濃度將肽添加到反應(yīng)孔，在室溫下孵育l小時(shí)。平板用PBST洗滌3次，然后與在pbst中的3%bsa中稀釋到5mg/ml的抗nogo抗體孵育1小時(shí)。平板用PBST洗滌3次，隨后與抗人或抗小鼠kappa過氧化物酶共軛物(1:1000,在pbst中的3%bsa中稀釋)孵育1小時(shí)。平板用PBST洗滌3次，然后與每反應(yīng)孔100julOPD過氧化物酶底物(Sigma)孵育IO分鐘。通過添加50yl3摩爾H2S04來停止顯色反應(yīng)。使用平板讀數(shù)器測量490nm處的吸光度。結(jié)果在附圖5(使用H28L16的表位作圖)、附圖6(使用2A10的表位作圖)中顯示。附圖5和6分別顯示了2A10和H28L16的表位作圖的結(jié)果。顯示的數(shù)據(jù)表明，2A10和H28L16結(jié)合于肽6和7,其NOGO特異性部分分別在SEQIDNO:73和SEQIDNO:74中給出，兩者都含有序列VLPDIVMEAPLN。這些結(jié)果表明，VLPDIVMEAPLN(SEQIDNO:60)含有2A10和H28L16的結(jié)合表位。Hclx的修飾的變體通過^f吏用Quikchange試劑盒(Stratagene)導(dǎo)入單個(gè)點(diǎn)突變G95M(Kabat編號(hào))從現(xiàn)有的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建?？勺冎劓溄Y(jié)構(gòu)域Hc(G95M)蛋白質(zhì)的蛋白序列在SEQID59中給出。Hc(G95M)Lc如早先描述的在CHO鈿I包中表達(dá)?？贵w如實(shí)施例4中描述的定量。附圖7和8顯示了Hc(G95M)Lc與HcLc的結(jié)合活性的比較，如使用人類NOGO-A結(jié)合ELISA所測定的，此時(shí)NOGO以0.05(附圖7)和1jug/ml(附圖8)包被在Nuncimmunosorp平板上。以下的表格顯示了He(G95M)Lc和HcLc的結(jié)合親和性的比較。表12,基于一個(gè)實(shí)驗(yàn)通過Biacore排列測量的解離速率<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>數(shù)據(jù)展現(xiàn)了，CDRH3內(nèi)的G95M替換不僅提高了人源化抗體(H6L13)的結(jié)合活性，還提高鼠供體抗體2A10(HcLc)的結(jié)合活性。,滋辨/0:舍,CZ^/ZJ尹^參炎^MX(9《謬^#^^弄^試通過在CDRH3中含有的殘基、或前述亮氨酸中的單個(gè)點(diǎn)突變創(chuàng)建了90個(gè)重鏈可變區(qū)的面板。特別地，制造編碼重鏈的載體(根據(jù)H6FL,SEQIDNO:15),其編碼重鏈可變區(qū)，其中CDRH3中的每個(gè)氨基酸殘基和前述亮氨酸使用除半胱氨酸外的所有其他天然存在的氨基酸替換(使用Quikchange試劑盒(Stratagene)),與輕鏈(L13FL,SEQIDNO:17)—同表達(dá)來得到90種不同的抗體。在ELISA和Biacore實(shí)-險(xiǎn)中分析這些抗體對(duì)NOGO的結(jié)合。附圖9和IO顯示了與H6FLL13FL相比H6FL的變體的結(jié)合活性的比較。表14和15顯示了通過Biacore測量的解離速率動(dòng)力學(xué)的比較，僅顯示了在Biacore分析中具有可測量的解離速率并在ELISA中具有與H6L13可比較的結(jié)合活性的那些抗體的結(jié)果。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>結(jié)論結(jié)果表明，保持了鼠2A10以及含GQGY的抗體H6L13的結(jié)合性質(zhì)的抗體是含有以下CDRH3的那些RQGY、IQGY、MQGY、GDGY、GIGY、GSGY、GQNY、GQYY、GQSY、GQLY、GQFY、GQGW、WQGY、GAGY、GLGY、GVGY、GQWY。實(shí)施例11,^"lG2G7^w^廣/Z2(9ZJ(5，力G95A/f弄//息/3弄/7息/W#,城如上所述制造表15中所列的抗體?！?-乂漆必Z4/0在A^go-^我#/殺^名多戎#^歐復(fù)^^:#^/爻(^:,fc::::::::;:::::::、::每個(gè)完整抗體/四聚體的回復(fù)突變的總數(shù)H20L1622H28L1622H28L1316H27L1632為了排列抗體，在包括ELISA、反向形式ELISA、竟?fàn)幮訣LISA、Biacore和通過流式細(xì)胞計(jì)的一系列分析中研究了它們的結(jié)合性質(zhì)。//./^五ZJ&4f力,邀乂類MX7(9^4^潛合通過各種相關(guān)的ELISA分析研究了抗體結(jié)合重組人類Nogo-A(GST-人類Nogo-A56)的能力(在與實(shí)施例3中描述的相關(guān)但稍微不同的方案中進(jìn)行)。在第一分析中，重組Nogo-A以各種不同的抗原濃度直接包被在平板上?？乖詌mcg/ml或0.05mcg/ml加載時(shí)直接結(jié)合ELISA的結(jié)果分別在附圖IIA和附圖IIB中顯示。數(shù)據(jù)證實(shí)了，當(dāng)與嵌合形式的親本抗體(HcLc)比較時(shí)，所有的抗體顯示了對(duì)重組人類Nogo-A的可比4交的結(jié)合活性。在更高的抗原包一皮濃度下，所有抗體產(chǎn)生了相似的EC50值。相比之下，在較低的抗原包被濃度下，分析能夠辯別這些抗體。雖然沒有獲得飽和曲線，系列的(onthelines)趨勢分析揭示了以下排列順序H27L16〉H28L16、H28L13、H20L16。在平行實(shí)驗(yàn)中，分析的形式是反向的。在這種形式中，抗體被捕獲到平板上，使用GST標(biāo)簽檢測重組人類Nogo-A(GST-人類Nogo-A-56)的結(jié)合。反向形式ELISA的結(jié)果在附圖12中顯示。數(shù)據(jù)證實(shí)了，當(dāng)與嵌合形式的親本抗體(HcLc)比較時(shí)，所有的抗體顯示了對(duì)重組人類Nogo-A的可比較的結(jié)合活性。這種形式的結(jié)合ELISA不能區(qū)分這些抗體。77.2f爭五ZJ&4使用竟?fàn)嶦LISA評(píng)估了抗體與親本抗體直接竟?fàn)幦祟怤ogo-A上的相同表位的能力。重組人類Nogo-A(GST-人類Nogo-A56)包一皮在平板上。親本抗體2A10和人源化抗體在添加到平^反之前預(yù)先混合。2A10的結(jié)合使用抗小鼠IgG-HRP共軛物(Dakocytomation,#P0260)來定量。附圖13中顯示的結(jié)果證實(shí)了，所有四種抗體可以與2A10竟?fàn)?。這表明，人源化抗體和親本抗體識(shí)別人類Nogo-A上的重疊表位。此外，人源化抗體的活性與嵌合體HcLc是可比較的或更好的。結(jié)果表明，H27L16、H28L16和H28L13比H20L16更有效力。/入3倫cBiacore一皮用于^f吏用兩種不同的方法來測定親和性和排列抗體。在第一種方法中，重組Nogo-A與芯片的表面聯(lián)結(jié)，抗Nogo-A抗體通過這個(gè)表面。在第二種方法中，蛋白A被用于將抗體捕獲在芯片的表面上，重組GST-人類Nogo-A56通過該表面。表16中顯示的結(jié)果通過將抗原聯(lián)結(jié)到表面來獲得，證實(shí)了所有四種抗體顯示了與親本抗體(HcLc)可比較的或更好的親和性。根據(jù)六個(gè)獨(dú)立運(yùn)行的平均值，就總體親和性而言按以下順序排列抗體H27L16>H28L16〉H28L13〉H20L16,與直接結(jié)合ELISA的排列順序一致(附圖11B)。對(duì)于H27L16和H28L16來說，人源化抗體展現(xiàn)了親本抗體(HcLc)的2-3倍的親和性。《76-如炎^5wcore7706*源定W戎A^go-J乂漆必^謬力f逸乂類iVogo-J("GST-人類iVogo^456y的潛合動(dòng)力^。戎i遞《必展聯(lián)潛潛合游份迷/f^六f教ji運(yùn)/力W"f衫值;^赤,森J4^岸"f坊值和標(biāo),偏j之,農(nóng)ji^為Vf每個(gè)^:多^炎孩i^。//，ZJ6農(nóng)為Vf7//邀凝游，一逸不^被》浙。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>按照與ELISA類似的方式，還以反向形式評(píng)估了抗體結(jié)合重組人類Nogo-A(GST-人類Nogo-A56)的動(dòng)力學(xué)(參見實(shí)施例11.1)。在這個(gè)分析中，人源化抗體通過蛋白A捕獲在CM5芯片上。六個(gè)獨(dú)立運(yùn)行的平均結(jié)果在表17中顯示。與反向形式的ELISA—致，在反向形式Bmcore中，所有人源化Nogo-A抗體顯示了與嵌合體(HcLc)相似的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。4/7—如炎y^A"com7700^/定^戎M)go-J乂,必我謬^f逾乂類rOSr-乂類iVogo-J5+6J^^反^7多4'潛合參》夢。蛋冷爿遞3必應(yīng)^定到義^WW^仏^于Ut2W-3^^f/^#^戎#。A^go"以各#諒遞W.725-S"tW^。炎值^^7—4游份迷/力W三個(gè)逸ji運(yùn)/戶^"f坊資斧浙,森^。^^卑"f衫值弄赤雀偏j之單授ji^》V,殺個(gè)炎游逾。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>潛合無然'乂類MX(9為了展現(xiàn)人源化抗體以與親本抗體可比較的分布型(profile)結(jié)合天然人類Nogo-A,開發(fā)了兩種基于流式細(xì)胞計(jì)的分析。在第一種分析中，產(chǎn)生在細(xì)胞表面表達(dá)人類Nogo-A細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的基于CHO-K1的細(xì)胞系。人源化抗Nogo-A抗體的結(jié)合通過流式細(xì)胞計(jì)使用PE標(biāo)記的抗人類IgG(Sigma,#P8047)來評(píng)估。以下的附圖14顯示了抗Nogo-A抗體在CHO-Nogo-A細(xì)胞系上的典型分布。雖然該分析不是足夠每丈感以區(qū)分這些抗體，結(jié)果證實(shí)了所有四種抗體可以以與嵌合體可比4交的水平識(shí)別細(xì)胞表面表達(dá)的人類Nogo-A。沒有抗體識(shí)別親本細(xì)胞系(CHO-Kl—數(shù)據(jù)未顯示)。在第二種分析中，使用人類成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR32評(píng)估人源化抗體結(jié)合天然Nogo-A的能力。這種細(xì)胞系特征在于Nogo-A蛋白質(zhì)的高細(xì)胞內(nèi)/低細(xì)胞表面水平。為了提高結(jié)合信號(hào)，建立分析來檢測細(xì)胞內(nèi)Nogo-A(ER-駐留的)。在用抗Nogo-A人源化抗體染色之前，IMR32細(xì)胞進(jìn)行滲透化和固定。使用PE標(biāo)記的二級(jí)抗人類IgG(Sigma,#P8047)來檢測抗體與Nogo-A的結(jié)合。以下的附圖15中顯示的結(jié)果證實(shí)了，所有的抗體以與親本抗體HcLc可比4交的或更高的水平結(jié)合細(xì)月包內(nèi)Nogo-A。與來自CHO-Nogo-A細(xì)胞系的結(jié)果一起，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了人源化抗體可以以與嵌合體HcLc相比可比4支的或更好的水平識(shí)別更為天然形式的Nogo-A蛋白質(zhì)。這些分析不是足夠敏感的以排列抗體面板。在早先描述的基于定量NO的分析中，測試人源化抗Nogo-A抗體中和Nogo-A的軸突長出(NO)抑制活性的能力。在該分析中測試的抗體在它們對(duì)Nogo-A的結(jié)合動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)上來選擇。對(duì)高親和性人源化抗體即H28L16、H27L16、H20L16以及供參考的它們的親本抗體2A10(小鼠單克隆的)和HcLc(人類小鼠嵌合體)檢測了Nogo-A中和。為了比較，還在分析中測試了抗體11C7(參見實(shí)施例13)。為了測試選定的人源化抗體的中和活性，在添加小腦粒狀神經(jīng)元(CGN)之前，反應(yīng)孔用人類重組GST-人類Nogo-A56包被并在37°C用各種濃度的抗體處理1小時(shí)。對(duì)照孔用HBSS處理。對(duì)每個(gè)孔測量每個(gè)軸突的平均軸突長度。附圖16顯示了在該分析中測試的人源化抗體的結(jié)果。對(duì)照抗體的面板(對(duì)照IgG,純化的小鼠IgG;Campath和另一個(gè)不相關(guān)的人源化抗體)用于確認(rèn)活性的特異性。作為進(jìn)一步的對(duì)照，相同的人源化抗體在GST包被的平板上滴定。結(jié)果證實(shí)了，H28L16、H27L16和H20L16逆轉(zhuǎn)了Nogo-A介導(dǎo)的軸突長出抑制作用，達(dá)到對(duì)親本抗體(2A10和HcLc)所觀察的相似的程度。效果似乎是牢固(robust)和穩(wěn)定的，在十一個(gè)獨(dú)立的軸突長出實(shí)-瞼中的八個(gè)中用H28L16見到。相比之下，人源化抗體不提高GST包被的平板上的軸突長出，對(duì)照抗體的面板不顯示任何劑量依賴性的抑制作用逆轉(zhuǎn)，證實(shí)了人源化抗體的效果特異于Nogo-A介導(dǎo)的抑制作用。為軸突長出呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)選自多個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。雖然沒有顯示的許多重復(fù)看起來在性質(zhì)上是可變的，相信的是，效果方面的真實(shí)活性。實(shí)施例12,//2&L/6^遽一#^#"在/2/乂,全7^,逸A^go-JW潛合通過直接結(jié)合ELISA分析研究了抗體結(jié)合全長細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域重組人類Nogo-A(GST-人類Nogo-A-ECD)的能力。在這種情況下，ECD是落入人類NOGOA的大約位置186-1004的區(qū)域(開始于DETFAL(SEQIDNO:95)、以ELSKTS(SEQIDNO:96)結(jié)束的部分)的剪接變體。重組GST-人類Nogo-A-ECD直接以ljug/ml包被在平板上。附圖17中的數(shù)據(jù)證實(shí)了，與親本(HcLc)或H20L16相比，H28L16可以以可比較的或更好的水平識(shí)別GST-人類Nogo-A-ECD。為了改善候選物的安全分布型，重鏈恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)殘基L235和G237(EUIndex系統(tǒng))一皮突變成丙氨酸殘基，/人而降4氐觸發(fā)抗體介導(dǎo)的免疫學(xué)效應(yīng)物功能的可能性。降低的人類Clq結(jié)合被用作Fc功能抑制的替代。以下的附圖18顯示了與Campath-IgGl(野生型)相比，H28L16具有顯著降低的Clq結(jié)合活性，與帶有相同突變(Fc突變的抗體(Fc-))的CampathIgGl構(gòu)建體和CampathIgG4是可比較的。這些數(shù)據(jù)表明，H28L16中存在的CH2結(jié)構(gòu)域突變將顯著地降4氐觸發(fā)Fc介導(dǎo)的效應(yīng)物功能的可能性。/23i,秀^漆參TwY/zo/ogwe,潛合為了證實(shí)H28L16顯示了與親本抗體(HcLc)可比4支的對(duì)Nogo-A的各種直系同源物的結(jié)合活性，進(jìn)行了一系列的結(jié)合分析。以下的附圖19A-D顯示了對(duì)分別來自大鼠(SEQIDNO:94)、獼猴(SEQIDNO:92)、狨猴(SEQIDNO:93)和松鼠猴(SEQIDNO:91)的重組NOGO(GST-人類Nogo-A56)的直接結(jié)合ELISA的結(jié)果。在所有情況中，H28L16顯示了與嵌合抗體(HcLc)相比可比較的或更好的活性。計(jì)算的EC50值非常類似于對(duì)結(jié)合人類重組Nogo-A計(jì)算的那些。使用Biacore測定了與HcLc和11C7相比較的H28L16對(duì)各種Nogo-A直系同源物的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。以下的表18和表19顯示了在兩種不同形式的分析中的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。當(dāng)重組Nogo-A直接聯(lián)結(jié)到CM5芯片時(shí)(表18),大鼠、獼猴、松鼠猴和狨猴的結(jié)合動(dòng)力學(xué)非常類似于人類的(范圍^0.33-0.67nM)。當(dāng)分析的形式一皮逆轉(zhuǎn)、抗體利用蛋白A捕獲在芯片上時(shí)(表19),H28L16對(duì)大鼠Nogo-A的結(jié)合親和性為對(duì)人類Nogo-A的約四分之一。對(duì)于獼猴Nogo-A(為人類的8.5分之一的親和性)和另一種靈長類直系同源物(為人類的12-17分之一的親和性)觀察到類似的趨勢。在兩種方向的分析中，嵌合抗體HcLc顯示了結(jié)合Nogo-A的直系同源物的相似分布型。由于不清楚哪種分一斤形式最好地代表了體內(nèi)狀況，可以從這項(xiàng)研究得出的初步結(jié)論是1)H28L16保持了與嵌合抗體HcLc相關(guān)的直系同源物交叉反應(yīng)性分布型，2)HcLc對(duì)大鼠和獼猴Nogo-A的親和性處在對(duì)人Nogo-A的親和性的4倍到8.5倍之間，在一定條件下可能是非常相似的?！?S-炎,歷flcoM7700*定^//2S丄M、//C7,i/c丄cMgo畫^^重逸i系^漆參^潛合^力夢。義為/W-7柳A"W冬神Mgo-」i,秀^7源參遞《必應(yīng)爽潛"#,4CM5^方J:。在沐"##^,^遞m725-S"M入凝潛^^7—^竭^、遽/,^/-2個(gè)/々ji適/;f^-f增值f口標(biāo),偏^^^岸^坊值和標(biāo),偏i之;^農(nóng)ji她為Vf每個(gè)炎拔逸。〃C7由于不T岸,的必4',去茅一逸必4'。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*^Swcwe77(90J:《/定^//2SZJ6、"C7f口//c丄cX,乂類^f^i,秀^7源參i^^/^多0,合動(dòng)力夢。f冷J"乂^^^^RV^;C^衷面J:，戎A^goJ戎羋以義為3^-W0尺f/被^^t。承/關(guān)于摩迷溝建沐，f邀資^者("OSr-A。G(9-^456J"吝神》產(chǎn)(^."5-6*My>^動(dòng)遞d。摩l^運(yùn)/力一4;^份^遽/戶。炎值^云7/-3個(gè)農(nóng)ji運(yùn)/f^"f游值^#^森^廣括#哞,，每f運(yùn)/f一4;湯,^遽/力4^^"f衫虔弄裔雀偏j之^授ji^^^f每個(gè)炎蕃遂。H28L1611C7HcLc直系同源物KaKD(nM〉KaKD,KaKD闊獼猴(3個(gè)運(yùn)行)3.26E5(4.06E3)1.11E-3(2.23E-5)3.41(0.05)4.02E5(6.85E4)2.97E"4(1.11E-5)0.76(0.12)3.03E5(4.58E3)1,41E-3(2.84E-5)大鼠(3個(gè)運(yùn)行)3.80E5(5.68E3)(1.24E-5)1.76(0.03)2.83E5(4.66E4)1.77E"4(1.34E-5)0.64(0.09》5.47E5(1.20E4〉1.10E-3(2.86E-5)2.01(0,07)映猴(l個(gè)運(yùn)行)2.22E5(3.61E3)1.09E-3(7.35E-5)4.89(0.25)1.91E5(2.90E3)2.54E-4(3,46E"6)1.33(0.00)3.02E5(9.90E2)1.36E-3(7.92E-5)4.51(0.28J凇鼠猴(l個(gè)運(yùn)行)1.57E5(2.69E3)1.08E-3(5.02E-5)6.86(0.20)1.03E5(2.12E3)2.78E4(3.61E"6〉2.69(0.02)1.74E5(2.19E3)1.29E-3(7.64E-5)7,45(0.34)人類(l個(gè)運(yùn)行)1.20E6(8.49E4)k.75E-4(9.97E"6)0.40(0.02)2.64E5(3.32E3)1.49E-4(1.61E-5)0.57(0.07)1.32E6(2.71E5)7.00E-4(3.18E-5)0,54(0.09)通過SEC-HPLC和SDS-PAGE評(píng)估了H28L16和H20L16的物理化學(xué)性質(zhì)。SEC-HPLC使用100mM磷酸鈉、400mM氯化鈉pH6.8和TSKG3000SWxl30cmx7.8mm不銹鋼柱以l.Oml/分鐘進(jìn)行，在214nm和280nm處檢測。在加載10pg產(chǎn)物并用SyproRuby染色的4-20%NovexTris-HCL凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。使用pH3.5-10兩性電解質(zhì)(ampholmes)在BeckmanMDQ上進(jìn)行C-IEF。獲得以下結(jié)果.-420—^iVogo-J在沐的X寸摔逸^^fJ//尸LC為Vxf。j^的炎值^€#鴕到#不^7#類^每一#^^在傳W^為V么。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>4"-戎iVogo-^在^^5"DS-尸^4GE為V,。^^的炎值i主要襲夢^存^W在謬W^"為V么。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>SEC-HPLC數(shù)據(jù)表明,與H28L16(H28L16)相比，H20L16對(duì)聚集更為敏感。如果在此報(bào)告的數(shù)據(jù)在大的規(guī)模上重復(fù)，這可能影響生產(chǎn)過程產(chǎn)生臨床使用可接受質(zhì)量(〉95%單體)的材料的能力。SDS-PAGE數(shù)據(jù)顯示了，兩種候選物都是可接受的，兩者都顯示了典型的分布。實(shí)施例13,//2&L/<5力//C7^/么凝稱為11C7的鼠抗Nogo-A抗體在WO2004052932中描述，其是針對(duì)肽表位產(chǎn)生的。嵌合的11C7根據(jù)WO2004052932中提供的序列信息來制造。為了比較2A10和11C7的結(jié)合表位，建立竟?fàn)幮訣LISA來研究11C7和2A10是否識(shí)別Nogo-A上的重疊表位。如以下附圖20中顯示的，HcLc(2A10的嵌合形式)能夠與2A10竟?fàn)幗Y(jié)合人類重組Nogo-A，而11C7顯示與2A10沒有竟?fàn)?，甚至是在高達(dá)100mcg/ml的濃度下。實(shí)施例14:f爭嫂￡X/&4^j應(yīng),與乂類WOQ9-5+6i^f爭錄合MX^9/Z息M^處力競爭性ELISA的方法使用竟?fàn)幮訣LISA來評(píng)估肽與NOGO-A(GST-人類Nogo-A56)直接竟?fàn)幗Y(jié)合NOGOH28L16的能力。在碳酸氫鹽緩沖劑中5g/ml的兔抗人類IgG(Sigma，#1-9764)包被在Nuncimmunosorp平板(100jal每孑L)上在4'C過夜。平板用含有0.05%Tween的TBS(TBST)清洗3次，然后用TBST中的1。/。BSA在室溫下封閉1小時(shí)。H28L16然后在室溫下捕獲在平板上1小時(shí)(1^g/ml,在TBST中的1%BSA中稀釋，50每孔)。平板用TBST洗滌3次。肽(0到100g/ml)和1昭/ml濃度(在TBST中的1%BSA中稀釋)的GST-人類NOGO-A56在添加到反應(yīng)孔之前預(yù)先混合，在室溫下孵育1小時(shí)。平^1用TBST洗滌3次，然后與兔抗GST過氧化物酶共軛物(Sigma,#A7340,1:2000,在TBST中的1%BSA中稀釋)孵育1小時(shí)。平板用TBST洗滌3次，然后與每孔501OPD過氧化物酶底物(Sigma)孵育10分鐘。通過添加251濃縮的112304來停止顯色反應(yīng)。使用平板讀數(shù)器測量490nm處的吸光度。附圖21中顯示的結(jié)果證實(shí)了在表位作圖ELISA(實(shí)施例8)中是陽性的肽6和7可以與GST-人類NOGO-A56竟?fàn)幗Y(jié)合H28L16。這表明在表位作圖研究中是陽性的肽含有H28L16結(jié)合的表位。不含有建議的表位的肽16和17(其含有NOGO肽，但不與肽6或7重疊)不與NOGO-5+6竟?fàn)帯Ｓ雁錨五ZJ&4#浙H6的重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:11)的修飾的變體G101S(也稱為H100(SEQIDNO'.63))通過將單個(gè)替換G101S(Kabat編號(hào))導(dǎo)入如上所述的CDRH3中來產(chǎn)生。類似地，L13的輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:13)的修飾的變體Q37R通過將單個(gè)替換(Kabat編號(hào)Q37R)導(dǎo)入框架區(qū)域來產(chǎn)生(以形成L100)?？勺冚p鏈結(jié)構(gòu)域Q37R的蛋白質(zhì)序列在SEQIDNO:67中給出。編碼含有G101S/Q37R替換的重鏈和輕鏈的全長版本的基因如早先描述的在CHO細(xì)胞中表達(dá)，并如早先描述的在直接結(jié)合ELISA中分析。當(dāng)抗原以0.05|ug/ml加載時(shí)直接結(jié)合ELISA的結(jié)果在附圖22中顯示。數(shù)據(jù)證實(shí)了，當(dāng)與H27L16比較時(shí)，抗體H100L100顯示了對(duì)重組GST-人類NOGO-A56的可比4支的結(jié)合活性，當(dāng)與H6L13相比時(shí)H100L100具有改進(jìn)的結(jié)合分布型。相應(yīng)的EC50值在以下的表才各中顯示表22:力//(5丄/3和/Z27/J6^^么趁^G/WS/(937尺^T謬^五C50》,f值<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>實(shí)施例16:孩拔CDA//3f#G/0/S^乂源必戎A「(9G(9卓^發(fā)在謬^■5/"corg#浙H6的重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:11)的修飾的變體H100通過將單個(gè)替換G101S(Kabat編號(hào))導(dǎo)入CDRH3中來產(chǎn)生?？勺冎劓溄Y(jié)構(gòu)域H100蛋白的蛋白質(zhì)序列在SEQIDNO:63中給出。類似地，L13的輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:13)的修飾的變體L100和L101通過將單個(gè)替換(分別是Kabat編號(hào)Q37R和Q45R)導(dǎo)入框架區(qū)域來產(chǎn)生?？勺冚p鏈結(jié)構(gòu)域L100和L101蛋白的蛋白質(zhì)序列分別在SEQIDNCh67和SEQIDNO:68中給出。H100L100和H100L101的全長版本如早先描述的在CHO細(xì)胞中表達(dá)。表23顯示了H6L13與H100L100和H100L101的結(jié)合親和性的比專支，表明了當(dāng)與H6L13相比4交時(shí)H100L100和H100L101具有改進(jìn)的結(jié)合親和性。在這個(gè)實(shí)施例中，該方法基本上如實(shí)施例6中描述的進(jìn)行，其中CM5芯片通過以5|a1/ml在芯片上通過NHS和EDC溶液7分鐘來活化，在通過芯片之前，NOGO懸浮在10nM醋酸鈉緩沖劑(pH4.5)中。表23-與H6L13相比4支，H6可變重鏈的G101S變體與L13可變輕鏈的變體組合的Biacore測量值<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>sec工DNO,sywmh2A10CDR-H1SEGIDNO.2:2A10CDR-H2NINPSMGGTNYNEKFKSSEQ工DNO.GQGY2A10CDR-H3segidno.4:2a10cdr-l1rssksij:lykdgktyijNSE<3IDNO.5:2A10LMSTRASCDR-L2SE<3工DNO，S:2A10SEQIDNO.7:2A10,VH(鼠)MSSSTAYMQIiSSIiTSEDSAVYYCELjGQGYWGQGTTIiTVSSSEQ工DNO-8:2A10,VL(鼠)GTDFTLEISRVKAKDVGVYYCOGLVEYPLTFGAGTKLELKSEQIDNO-9:嵌合的重鏈HcQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO.10:嵌合的輕鏈LcYACEVTH柳SSPVTKSFNRGECSEQID11:2A10VH人源化的構(gòu)建體H6DTSTSTAYMEIjSSIjRSEDTAVYYCELGQGywgogtlvtvssSEQIDNO.122A10VH人源fl:的構(gòu)建體H16DKSTSTAYMEIiSSIjRSEDTAVYYCEIjGQGyWGOGTIjVTVSSSEQIDNO.13:2A10VL人源化的構(gòu)建體L13GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPIjTFGQGTKLE工KSEO工DNO.14:2A10人源化的構(gòu)建體L16GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCCffiljVEYPIjTFGQGTKLEIKSEQIDNO.15:2A10重鏈人源^f匕的構(gòu)建體H6QOGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSIjSIjSPGKSEQIDNO.16:2A10重鏈人源化的構(gòu)建體H16PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAIjHNHYTQKSLSIjSPGKSEQIDNO.17:2A10輕鏈人源J匕的構(gòu)建體Ll3ACEVTHQGIiSSPVTKSFNRGECSEQIDWO.18:2A10輕鏈人源化的構(gòu)建體L16ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQIDNO.13:編；馬2A10,VH(鼠)SEQID:7的PNGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCASEQIDNO.20:編；馬2A10,VL(鼠)SEQID:8的PNGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAASEQIDNO.21:編石馬嵌合重鏈HcSEQID:9的PNTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO,22:編碼嵌合輕鏈LcSEQID:IO的PNSEQIDNO.23:編碼2A10VH人源化的構(gòu)建體H6SEQID:ll的PNGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCASEQIDNO.24:編碼2A10VH人源化的構(gòu)建體H16SEQID:12的PNGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCASEQIDMO.25:編碼2A10VL人源化的構(gòu)建體L13SEQID:13的PNGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGQACCAAGCTGGAGATCAAASEQIDNO.26:編石馬2A10VL人源化的構(gòu)建體L16SEQID:14的PNGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAASEQ工DNO.27:編;馬2A10重鏈人源化的構(gòu)建體H6SEQID:15的PNGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCATCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.2B:編碼2A1O重鏈人源化的構(gòu)建體Hl6SEQID:16的PNTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDMO.29:編碼2AlO輕鏈人源化的構(gòu)建體Ll3SEQID:17的PN57GcAGcGAcGTTAGGcTca:CJcSEQIDNO.30:編碼2A10輕鏈人源化的構(gòu)建體L16SEQID:18的PNSEQIDNO.31:Ca即ath前導(dǎo)序列MGWSCIILFIiVATATGVHSSEQIDNO.32:與GST融合的人類NOGOA(NOGO-A56)的氨基酸586—785LERPHRDSEQIDNO.33:2A10VH人源化的構(gòu)建體HlDTSTSTVYMEIjSSLRSEDTAVYYCEIjGQGYWGQGTIjVTVSSSEQIDNO.34:2A10VL人源4fc的構(gòu)建體Ll1GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKSEQIDNO.36:2Al0輕鏈人源化的構(gòu)建體L11ACEVTHQGIjSSPVTKSFNRGECSEQIDNO.35:2A10重鏈人源化的構(gòu)建體H1QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKVDGGRLwATVSEQIDNO.37:編碼2A10VH人源化的構(gòu)建體HlSEQID:33的PNGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCASEQIDNO.38:編碼2A10VL人源化的構(gòu)建體LllSEQID:34的PNGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAASEQIDNO.39:編石馬2A1O人源化的重鏈HlSEQID:35的PNCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDITO.40:編碼2A1O人源化的輕鏈構(gòu)建體LllSEQID:36的PNSEQIDNO.41.'2A10VH人源化的構(gòu)建體H20DTSTSTAYMEIjSSIjRSEDTAVYYCELGiaGYWGQGTLVTVSSSEQIDNO.42:2A10重鏈人源化的構(gòu)建體H20PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL0SSGLYSLSSWTVPSSSLGTOTYIC1TQOGNVFSCSVMHEAIjHNHYTQKSIiSIiSPGKSEQIDNO.43:編碼2A10VH人源化的構(gòu)建體H20SEQID:41的PNGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCASEQIDNO.44:編碼2A10重鏈人源-化的構(gòu)建體H20SEQID:42的PNGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.45:2A10CDR-H3(G95M)MQGYSEQIDNO.46:狨猴NOGO-A片段的氨基酸序列DHSEIjVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKETXTETSFESMIEHENKSEQIDNO.47:VH人源化的構(gòu)建體H26DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSSEQIDNO.48:VH人源4t的構(gòu)建體H27DKSTSTAYME1jSSLRSEDTAVYYCEIiMQGYWGQGTLVTVSSSEQIDNO.49:VH人源化的構(gòu)建體H28DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCEIjMQGYWGQGTLVTVSSSEQIDNO.50:編碼VH人源化的構(gòu)建體H26SEQID:47的PNGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCASEQIDNO.51:編碼VH人源化的構(gòu)建體H27SEQID:48的PNGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTA。TCACAGTCTCCTCASEQIDNO.52:編碼VH人源化的構(gòu)建體H28SEQID:49的PNGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCASEQIDNO.53:重鏈人源4fc的構(gòu)建體H26QQGNVFSCSVMHEAIiHKHYTQKSLSLSPGK-SEQIDNO.54:重鏈人源化的構(gòu)建體H27QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSIiSPGKSEQIDNO.55:重鏈A源化的構(gòu)建體H28GQGNVFSCSVMHEALH服YTQKSLjSLSPGKSEQIDNO.56:編碼重鏈人源化的構(gòu)建體H26SEQID:53的PNTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.57:編碼重鏈人源化的構(gòu)建體H27SEQID:54的PNTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.58:編碼重鏈人源化的構(gòu)建體H28SEQID:55的PNTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.59:重鏈He(G95M)QQGNVFSCSVMHEALiHNHYTQKSLSLSPGKSEQID60:表位VLPDIVMEAPLNSEQID61:2A10VH人源化的構(gòu)建體H99DTSTSTVYMELjSSLRSEDTAVYYCELiGQSYWGQGTLVTVSSSEQIDNO.62:CDRH3GQSYSEQIDNO.63:VH人源化的構(gòu)建體HIOODTSTSTAYMEIjSSIjRSEDTAVYYCEIiGQSYWGQGTIiVTVSSSEQIDNO.64:VH人源化的構(gòu)建體HIOIDKSTSTAYMEIjSSliRSEDTAVYYCEIiGQSYWGQGTIjVTVSSSEQIDNO,65:VH人源4t的構(gòu)建體H102DTSTSTAYMEIiSSIiRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSSSEQIDNO,662A10VH人源孑匕的構(gòu)建體H98DTSTSTVYMEIiSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSSEQIDNO.67OTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQIjVEYPLTFGQGTKLEIKSEQIDNO.68GTDFTIjKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPIjTFGQGTKIiEIKSEQIDNO.69GTDFTIiKISRVEAEDVGVYYCGGLVEYPIiTFGQGTKLEIKSEQIDNO.70GTOFTIjK工SRVEAEDVGVYYCQQIjVEYPLTFGQGTKLE工KSEQIDNO.71GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQGLVEYPLTFGQGTKLEIKSEQIDNO.72GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKSEQ工DNO.73TPSPVLPDIVMEAPLNSEQIDNO.74PDIVMEAPLAVPSEQ工DNO.75RQGYSEQIDNO.76IQGYSEO10NO.77SEQIDNO.78GIGYSEQIDNO.79GSGYSEQIDNO.80SHK3工DNO,81GQYYSEQIDNO.82SEQ工DNO.83GQFYSEQ工DNO,84GQGWSEQ工DNO.85YESIKHEPENPPPYEESEQ工DNO.86WQGYSEQ工DNO.87SEQ工DNO、88SEQ工DNO.89GVGYSEQIDWO.90GQWYSEQIDNO.91ERPHRDSEQIDMO.92ESMIEHEMKEKLSALPPEGGSSGRIVTDSEGIDNO.93ERPHRDSEQIDNO.94FSNYSEIAKFEKSVPEHAELVEDSSPESEPVDLFSDDSIPEVPQTQEEAVMLMKESLTEVSETVAGHKEERLSEQIDNO.95DETFALSEQIDNO.96ELiSKTS權(quán)利要求1.一種重鏈可變區(qū)，包含基本上由氨基酸殘基GQGY組成的第三個(gè)CDR，其中所述CDR含有GQGY核心序列內(nèi)的至少一個(gè)替換，所述替換選自以下替換:其中第一位置的G被R、I、W或M取代；第二位置的Q被D、I、A、L、V或S取代；第三位置的G被W、N、Y、S、L或F取代；第四位置的Y被W取代。2.權(quán)利要求1中所要求的重鏈可變區(qū)，其中存在對(duì)所述GQGY序列的單個(gè)替換，產(chǎn)生以下CDRH3之一RQGY(SEQIDNO:75)、IQGY(SEQIDNO:76)、MQGY(SEQIDNO:45)、GDGY(SEQIDNO:77)、GIGY(SEQIDNO:78)、GSGY(SEQIDNO:79)、GQNY(SEQIDNO:80)、GQYY(SEQIDNO:81)、GQSY(SEQIDNO:62)、GQLY(SEQIDNO:82)、GQFY(SEQIDNO:83)、GQGW(SEQIDNO:84)、WQGY(SEQIDNO:86)、GAGY(SEQIDNO:87)、GLGY(SEQIDNO:88)、GVGY(SEQIDNO:89)、GQWY(SEQIDNO:90)。3.權(quán)利要求2所要求的重鏈可變區(qū)，其中所述CDRH3是MQGY或GQSY。4.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所要求的重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含序列SYWMH作為CDRHI(SEQIDNO:1)和NINPSNGGTNYNEKFKS作為CDRH2(SEQIDNO:2)。5.權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所要求的重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)是人源化的序列。6.權(quán)利要求5所要求的重鏈可變區(qū)，其中所述接受體重鏈可變區(qū)序列在框架區(qū)中具有與SEQIDNO:7中給出的2A10供體抗體重鏈可變區(qū)序列的至少40%的同一性。7.權(quán)利要求6所要求的重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:66(H98可變區(qū))或SEQIDNO:61(H99可變區(qū))的氨基酸序列，進(jìn)一步包含在數(shù)字性位置38、40、67、68、70、72、74和79的一個(gè)或多個(gè)處的多個(gè)替換；其中每個(gè)替換的氨基酸殘基用SEQIDNO:7中等價(jià)位置處的氨基酸殘基取代。8.權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所要求的重鏈可變區(qū)，具有SEQIDNO:47(H26)、SEQIDNO:48(H27)、SEQIDNO:49(H28)、SEQIDNO:63(HlOO)、SEQIDNO:54(H101)、SEQIDNO:65(H102)中給出的氨基酸序列。9.一種能夠結(jié)合人類NOGO-A的分離的抗體或其片段，包含權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所要求的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。10.權(quán)利要求7所要求的分離的抗體或其片段，包含以下重鏈和輕鏈可變區(qū)配對(duì)H27L16(SEQIDNO:48+SEQIDNO:14)、H28L13(SEQIDNO:49+SEQIDNO:13)、H28L16(SEQIDNO:49+SEQIDNO:14)。11.一種分離的抗體，包含以下重鏈和輕鏈序列H27FLL16FL(SEQIDNO:54+SEQIDNO:18)、H28FLL13FL(SEQIDNO:55+SEQIDNO:17)、H28FLL16FL(SEQIDNO:55+SEQIDNO:18)。12.—種藥物組合物，其包含包含權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所要求的重鏈可變區(qū)的抗NOGO抗體或其片段或者權(quán)利要求9到11中所要求的抗體或其片段，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。13.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所要求的抗NOGO抗體或其片段或者權(quán)利要求9到11中要求的抗體或其片段用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防中風(fēng)和其他神經(jīng)疾病/失調(diào)，或用于治療患有對(duì)中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)械性損傷的患者。14.一種在人類中用于治療或預(yù)防中風(fēng)或其他神經(jīng)疾病/失調(diào)、或用于治療患有對(duì)中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)械性損傷的患者的方法，包括腸胃外施用治療有效量的權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所要求的抗NOGO抗體或其片段或者權(quán)利要求9到11中所要求的抗體或其片段的步驟。15.—種抗體或其片段，其能夠結(jié)合由多肽序列VLPDIVMEAPLN(SEQIDNO:60)組成的人類NOGO蛋白質(zhì)的區(qū)域，特征在于所述抗體或其片段不是包含具有由氨基酸殘基GQGY組成的CDRH3的可變重鏈結(jié)構(gòu)域的抗體或其中具有一個(gè)氨基酸替換的其類似物。16.—種多核香酸，其編碼具有SEQIDNO:47、48、49、53、54或55中所列序列的多肽。17.—種抗體或其片段，其能夠在ELISA分析中結(jié)合人類NOGO蛋白質(zhì)，其中所述抗體或其片段與人類NOGO蛋白質(zhì)的結(jié)合在存在具有以下序列VLPDIVMEAPLN(SEQIDNO:60)的肽的情況下^皮降低，并且在存在不相關(guān)的肽的情況下不被降低，特征在于所述抗體或其片段不是包含具有由氨基酸殘基GQGY組成的CDRH3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體或其中具有一個(gè)氨基酸替換的其類似物。全文摘要本發(fā)明涉及針對(duì)NOGO的抗體、含有它們的藥物制劑，并涉及這些抗體在神經(jīng)疾病/失調(diào)的治療和/或預(yù)防中的用途。文檔編號(hào)A61P25/00GK101374863SQ200680052952公開日2009年2月25日申請日期2006年12月14日優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日發(fā)明者G·科普西達(dá)斯,J·H·艾利斯,P·A·漢布林,R·K·普林哈,R·麥克亞當(dāng),S·J·克勒格,V·格爾馬謝夫斯基申請人:葛蘭素集團(tuán)有限公司