抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白，該重組蛋白在合成用于抵抗豬偽狂犬病毒的藥品中應(yīng)用。抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白，其氨基酸序列為由SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或者與序列SEQ?ID?No.2限定的氨基酸序列同源性在95～100%編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或；SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。本發(fā)明將重組蛋白用于抵抗豬偽狂犬病毒的藥品中，實(shí)驗(yàn)證明：具有顯著的抑制效果。
【專利說(shuō)明】抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白，該重組蛋白在合成用于抵抗豬偽狂犬病毒的藥品中應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]偽狂犬病(Pseudorabies，PR)最早在1813年美國(guó)的牛群中發(fā)現(xiàn)，病牛的臨床癥狀表現(xiàn)為極度瘙癢，所以本病也叫“瘋癢病”。1902年，匈牙利科學(xué)家Aujeszky首先分離出了該病毒，故PR又名奧耶斯基氏病(Aujeszky’s disease, AD)。1934年，Sabin和Wright經(jīng)實(shí)驗(yàn)認(rèn)證該病毒是皰疹病毒，后來(lái)命名為豬皰疹病毒(SHV-1)或偽狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)。蛋白質(zhì)測(cè)序分析表明，PRV與馬皰疫病毒(EHV-1)、牛皰疫病毒(BHV-1)、和水痘病毒(VZV)同源性很高。PRV的宿主包括除高等靈長(zhǎng)動(dòng)物和人以外的其它哺乳動(dòng)物以及脊椎動(dòng)物，豬是PRV感染后可以唯一存活的動(dòng)物，因此，豬是PRV的貯存宿主(KretzschmarC.Die Aujeszkysche Krankheit:Diagnostik, Epizootiologie undBekaempfung.Jena:Fischer, 1970)。
[0003]PRV遍布世界各國(guó)，是典型的極難防疫的自然疫源性疾病，被列為畜牧業(yè)和養(yǎng)豬業(yè)的第三大疫病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(0ΙΕ)將本病列為B類疾病，我國(guó)也將其列為二類傳染病。PRV可以感染多種動(dòng)物，以豬和牛最為嚴(yán)重。臨床癥狀的嚴(yán)重程度由感染途徑、感染病毒的毒力、豬只的年齡決定。新生仔豬感染后表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、發(fā)熱、呼吸困難等，出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的豬一般在癥狀發(fā)生后24~36h后死亡，仔豬的死亡率很高，可達(dá)100%。斷奶仔豬(3~6周齡)、幼齡斷奶豬臨床癥狀和新生仔豬相似，但是中樞神經(jīng)癥狀不經(jīng)常出現(xiàn)，死亡率一般低于50%。生長(zhǎng)豬、育肥豬感染PRV后最常見癥狀是呼吸癥狀，無(wú)繼發(fā)癥時(shí)，死亡率為1%~2%。成年母豬和公豬感染后主要是呼吸癥狀。PRV可以通過胎盤屏障，感染胎兒，導(dǎo)致死亡。成年豬感染PRV的死亡率很少超過2% (Kluge J, Beran G, Hill H andPlatt K.Pseudorabies(Aujeszky's disease).Diseases of swine, 1999,8(233-246.)。
[0004]目前該病的預(yù)防主要通過疫苗免疫，其中有效的疫苗包括弱毒疫苗和基因工程基因缺失疫苗。弱毒疫苗是野毒株在異常的條件下培養(yǎng)，通過反復(fù)傳代獲得，其基因內(nèi)部有多處點(diǎn)突變或一些基因的缺失，是一種天然的基因缺失疫苗，具有良好的免疫原性，價(jià)格也比較低廉。最常使用的弱毒疫苗是匈牙利Bartha-K61株和羅馬尼亞BUK株。對(duì)這兩株弱毒疫苗的核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，Bartha-K61株在其基因組中存在多處突變，在US區(qū)有整個(gè)gE基因和US9及部分gl和US2的缺失，在UL區(qū)gC基因、gM基因和ULZI還存在點(diǎn)突變，Bartha-K61株安全性和免疫原性良好，現(xiàn)在仍然在許多國(guó)家使用。對(duì)BUK株基因組分析表明，在US區(qū)絕大部分gE基因發(fā)生缺失。除了以上兩個(gè)弱毒株外，應(yīng)用比較廣泛的毒株還有Norden、GNKJ、MK-25、MK-35、NIA-4、Ercegovac 和 Alfort-26 株等。弱毒疫苗效果較好，但是一些實(shí)施撲滅計(jì)劃的國(guó)家已不允許使用弱毒疫苗，主要因?yàn)橐韵氯齻€(gè)原因:
[0005]①其主要毒力基因TK仍然存在，毒力有可能返強(qiáng)；
[0006]②未 經(jīng)充分致弱或過度致弱的疫苗株不僅不能獲得滿意的免疫保護(hù)反應(yīng)，反而可能引起疾病再次流行或者免疫抑制；
[0007]③弱毒疫苗仍可形成潛伏感染，并有散毒的可能，部分接種豬血清中存在中和抗體，但仍可排毒數(shù)年。
[0008]基因工程基因缺失疫苗是指利用分子生物技術(shù)對(duì)PRV的基因組進(jìn)行有目的的改造，構(gòu)建了單基因、多基因甚至多基因缺失的疫苗。最初的基因缺失疫苗是通過缺失主要毒力基因TK獲得的。TK基因缺失的疫苗與以前在有致突變劑存在下篩選得到的弱毒疫苗有個(gè)明顯的區(qū)別，它不會(huì)有毒力返強(qiáng)，所以更加安全。Kit等通過缺失BUK株TK基因中148bp的片段，構(gòu)建出缺失TK基因的PRV BUK-dl3株，該TK缺失株除了通過生物技術(shù)在TK基因處缺失外，還有來(lái)自BUK疫苗在gE基因的缺失，用不同的條件對(duì)其在細(xì)胞上培養(yǎng)，都可以達(dá)到相同的滴度(Kit S, Kit M, McConnell S and Lawhorn B.Development of active immunityin newborn pigs with colostral antibodies by vaccination with gill-deleted PRV.Acta veterinaria Hungarica, 1994, 42 (2-3): 319-330.)。利用生物學(xué)方法如 Southern 印跡雜交，空斑自顯影能把它和其它野毒株相區(qū)別。它對(duì)小鼠、兔的毒力也非常低，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明它對(duì)豬是安全的，可以產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。該疫苗有個(gè)明顯的缺點(diǎn)，它不能用血清學(xué)方法區(qū)別免疫接種豬和自然感染豬，這給檢疫工作帶來(lái)了極大的困難。之后發(fā)展起來(lái)的基因缺失疫苗是在TK缺失疫苗的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，它比TK缺失疫苗有更好的優(yōu)越性。
[0009]第二代基因缺失疫苗不但缺失TK基因，而且在編碼非必須糖蛋白的基因內(nèi)有一個(gè)新的缺失，或插入了一個(gè)報(bào)告基因，這樣得到的突變株就不能產(chǎn)生缺失基因編碼的糖蛋白，免疫動(dòng)物就不能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，因此可以通過血清學(xué)方法將免疫接種豬與自然感染野毒的豬區(qū)別開來(lái)。Moormann等用基因工程方法產(chǎn)生的‘783’株通過基因敲除的方法缺失了胸腺啥臉核普激酶(TK)的19個(gè)堿基和gl基因的2.4千個(gè)堿基而形成的雙基因缺失疫苗，其免疫原性與Bartha-61疫苗株相當(dāng)，而在小鼠上的安全性要優(yōu)于Bartha_61疫苗株，其研制過程要比 Bartha-61 疫苗株短得多(Moormann RJM, de Rover T, Briaire J, PeetersBPH, Gielkens ALJ and van Oirschot JT.1nactivation of the thymidine kinase geneof a gl deletion mutant of pseudorabies virus generates a safe but still highlyimmunogenic vaccine strain.Journal of General Virology, 1990，71 (7):1591-1595.)。這是基因缺失疫苗優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗的一個(gè)`很好例證。此類疫苗有TK-/gG-和TK-/gC-等類型，現(xiàn)在世界上應(yīng)用比較廣泛的‘783’株疫苗就是TK-/gE-型。
[0010]上述疫苗對(duì)預(yù)防該病起到了重要的作用。但是隨著偽狂犬毒株的變異等原因，現(xiàn)有的疫苗有時(shí)并不能起到完全的免疫保護(hù)作用。同時(shí)由于臨床中可能發(fā)生的免疫失敗造成部分動(dòng)物感染偽狂犬野毒，對(duì)于這部分動(dòng)物迫切需要一種針對(duì)偽狂犬病毒感染后的治療藥品和制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明目的在于提供一種抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白和編碼該蛋白的基因。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該重組蛋白在合成用于抵抗豬偽狂犬病毒的藥品中應(yīng)用。
[0013]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的具體方案如下:[0014]本發(fā)明提供的抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白，其氨基酸序列為
[0015]1)由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或者
[0016]2)與序列SEQ ID N0.2限定的氨基酸序列同源性在95~100%編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或；
[0017]3)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
[0018]編碼上述抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白的基因?qū)儆诒景l(fā)明，本發(fā)明還提供了一個(gè)編碼抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0019]由含編碼上述抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白的基因?qū)Φ闹亟M表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的范圍，該重組表達(dá)載體由含有抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白的基因原核表達(dá)載體組成。該原核載體為pET_28a表達(dá)載體。
[0020]本發(fā)明提供了一種含有上述重組表達(dá)載體的大腸桿菌BL21表達(dá)菌株。
[0021]本發(fā)明合成用于編碼抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白的基因，其全長(zhǎng)為876bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。該基因編碼的蛋白具有291個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如 SEQ ID N0.2。
[0022] 該蛋白中蛋白激酶R (protein kinase R, PKR) N端結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)dsRNA結(jié)合域；C端具有一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域。PKR蛋白結(jié)合dsRNA后，自身磷酸化后磷酸化eIF-2alpha，然后阻止病毒蛋白的翻譯。細(xì)胞凋亡蛋白激活因子(apoptotic protease activatingfactor 1，Apaf-1)能夠同時(shí)結(jié)合許多procaspases。這些procaspases通過剪切激活自身，然后酶解許多細(xì)胞蛋白，從而殺傷細(xì)胞。當(dāng)把這兩個(gè)因子的dsRNA結(jié)合域和procaspases結(jié)合域組合成一個(gè)融合蛋白，當(dāng)轉(zhuǎn)染了該蛋白的細(xì)胞遇到dsRNA后就能立即啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。故將其應(yīng)用于抵抗豬偽狂犬病毒的藥品中有很好的效果。
[0023]應(yīng)該明確的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的SEQ ID N0.2氨基酸序列，在不影響其蛋白生物活性的前提下，對(duì)于其實(shí)施取代、缺少和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)序列比對(duì)同源性在95%以上，所得到所述蛋白的突變體序列。因此本發(fā)明還包括對(duì)SEQID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺少和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到高同源性且具有生物活性和相同功能的衍生蛋白。
[0024]本發(fā)明的原理
[0025]當(dāng)細(xì)胞被病毒感染時(shí)，它會(huì)劫持這個(gè)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，復(fù)制大量的后代，再去感染其它細(xì)胞，復(fù)制過程中會(huì)產(chǎn)生雙股核糖核酸(dsRNA)，通常人的免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)抓住dsRNA，引發(fā)之后一連串反應(yīng)，終止病毒的復(fù)制。同時(shí)病毒能通過抑制細(xì)胞凋亡的途徑中的早期步驟來(lái)對(duì)抗感染。如:模擬細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2，或者抑制凋亡受體信號(hào)。還有些病毒蛋白直接抑制一個(gè)或者多個(gè)caspase，如非洲豬瘟病毒A224L (抑制caspase3)，poxvirus CrmA(抑制caspasesl, 8, andlO)。如果設(shè)i十一種能抓住dsRNA的蛋白質(zhì)，和另一種能夠引起細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)相結(jié)合，這樣當(dāng)該蛋白的一端抓住dsRNA時(shí)，另一端就會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程，從而殺死感染的細(xì)胞。
[0026]該蛋白的設(shè)計(jì)分為第一個(gè)部分涉及的是干擾素通路中的dsRNA檢測(cè)過程。大多數(shù)病毒具有雙鏈或者單鏈RNA基因組，在其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的過程中都會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)的雙鏈RNA。還有部分DNA病毒，在轉(zhuǎn)錄的過程中同樣會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)的雙鏈RNA。正常細(xì)胞不能夠產(chǎn)生長(zhǎng)的雙鏈RNA (大于21-23bp),自然的細(xì)胞防御利用這種差異產(chǎn)生自身的防衛(wèi)機(jī)制抵抗病毒的感染。例如:蛋白激酶R (PKR)在N端具有兩個(gè)dsRNA的結(jié)合域(dsRBMland2)和一個(gè)C端的激酶域。結(jié)合長(zhǎng)度至少30-50bp的雙鏈RNA后的PKR通過自身磷酸化后激活。激活的PKR然后磷酸化eIF-2 α，然后阻止病毒或者細(xì)胞蛋白的轉(zhuǎn)錄。第二個(gè)部分涉及細(xì)胞凋亡通路中的凋亡信號(hào)分子，如 apoptotic protease activating factor 1 (APAF-1)或者FLICE activateddeath domain (FADD),同時(shí)結(jié)合多種凋亡前體分子(Procaspases)。前體凋亡分子通過反式剪切激活，激活其他的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的凋亡蛋白酶，然后切割系列的細(xì)胞內(nèi)蛋白，最后殺傷細(xì)胞。
[0027]本發(fā)明的有益效果在于:
[0028]本發(fā)明將重組蛋白用于抵抗豬偽狂犬病毒的藥品中，實(shí)驗(yàn)證明:具有顯著的抑制效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為重組基因的誘導(dǎo)表達(dá)
[0030]FiglThe induction expression of recombinant gene
[0031]Line M:the protein ladder.Linel: the control,
[0032]line2:1nduction expression using IPTG.[0033]圖2重組蛋白可溶性表達(dá)的分析
[0034]Fig3_7The analysis of recombinant protein’ s solubility.[0035]Line M:the protein marker.[0036]Linel: the supernatant,
[0037]line2:the precipitation.[0038]圖33d后細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況(A，B，C是未添加重組蛋白的細(xì)胞典型圖；D，E，F(xiàn)是添加了重組蛋白的細(xì)胞典型圖)
[0039]Fig3_13The growth condition of the PK15cells3dp
[0040](Fig.A, B, C was the presentation figure of the cells not incubate withthe recombinant protein;
[0041]Fig.D，E，F(xiàn) was the presentation figure of the cells incubate with therecombinant protein)
[0042]圖4實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組病毒量的差異
[0043]Fig4The antiviral effect of recombinant protein
【具體實(shí)施方式】
[0044]為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
[0045]實(shí)施例1生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)蛋白分子及其合成的相關(guān)基因。
[0046]蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)N端結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)dsRNA結(jié)合域；C端具有一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域。PKR蛋白結(jié)合dsRNA后，自身磷酸化后磷酸化eIF-2alpha，然后阻止病毒蛋白的翻譯。細(xì)胞凋亡蛋白激活因子(apoptotic protease activating factorl, Apaf-1)能夠同時(shí)結(jié)合許多procaspases。這些procaspases通過剪切激活自身，然后酶解許多細(xì)胞蛋白，從而殺傷細(xì)胞。當(dāng)把這兩個(gè)因子的dsRNA結(jié)合域和procaspases結(jié)合域組合成一個(gè)融合蛋白，當(dāng)轉(zhuǎn)染了該蛋白的細(xì)胞遇到dsRNA后就能立即啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。
[0047]在NCBI 上檢索豬的 PKR 基因(gi | 47523704)和 Apaf-1 基因(gi | 350584646)，分析其結(jié)構(gòu)域，取PKR分子的dsRNA結(jié)合域(l_181aa)和APAF-1分子的procaspases結(jié)合域(l_97aa)。便于該設(shè)計(jì)分子穿透細(xì)胞，前面添加PTD-4肽(YARAAARQARA)標(biāo)簽。
[0048]設(shè)計(jì)的得到氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示
[0049]將該重組蛋白對(duì)應(yīng)的基因序列送往上海生工合成，該基因序列如SEQ ID N0.1所示
[0050]實(shí)施例2用原核表達(dá)載體pET_28a表達(dá)并純化該蛋白
[0051]利用以一對(duì)引物擴(kuò)增該基因，引物如下:
[0052]sDRACO-1:GACGGGCCGAAGCTTGCTATG
[0053]sDRAC0-2:GATCCGACGTCTTAGGAAGAAG
[0054]將克隆基因連接到pMD18-T載體，通過Hindlll和Xhol酶切后連接到pET_28a表達(dá)載體中。測(cè)序驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌株中。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE證實(shí)表達(dá)成功(圖1)。繼續(xù)分析重組蛋白的可溶性:重組菌株用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)超聲破碎，離心，收集上清和沉淀，分析蛋白的可溶性，SDS-PAGE結(jié)果顯示，在34.5KD處，上清和沉淀都有條帶(圖2)。培養(yǎng)重組菌株350ml，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收菌高壓破碎，離心收集上清，用HisTrapTMHP蛋白層析住進(jìn)行純化。
[0055]實(shí)施例3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)該蛋白(sDRACO)具有顯著抑制豬偽狂犬病毒增殖的能力
[0056]步驟如下:
[0057]1)把培養(yǎng)48h成良好單層的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，鋪到96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)到50~80%時(shí)進(jìn)行抗病毒實(shí)驗(yàn)；
[0058]2) PRV病毒做一系列的10倍稀釋；
[0059]3)抗病毒實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組同時(shí)加入sDRACO和PRV，對(duì)照組加入等量的PBS和PRV ；
[0060]4)觀察細(xì)胞病變的時(shí)間和孔數(shù)并記錄；
[0061]當(dāng)病毒加入劑量為10115TCID50時(shí)，部分細(xì)胞未發(fā)生病變，而相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞全部病變(圖3)。
[0062]分別收集每個(gè)孔的病毒，提取病毒DNA，利用偽狂犬病毒定量PCR引物
[0063]PRV-1:CACGGAGGACGAGCTGGGGCT
[0064]PRV-2:GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT
[0065]進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組PRV拷貝數(shù)有2-3個(gè)數(shù)量級(jí)的下降(圖4)，以上實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)該重組蛋白具有顯著的抑制豬偽狂犬病毒增殖的能力。
【權(quán)利要求】
1.一種抵抗豬偽狂犬病毒增殖的重組蛋白，其特征在于:其氨基酸序列為1)由SEQID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或者2)與序列SEQID N0.2限定的氨基酸序列同源性在95~100%編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或；3)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
2.編碼權(quán)利要求1所示蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所示基因，其核苷酸序列如SEQID N0.1。
4.一種重組表達(dá)載體，其特征在于:它含有權(quán)利要求2和3所述基因的原核表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述的原核表達(dá)載體是pET-28a表達(dá)載體。
6.含有根據(jù)權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌BL21表達(dá)菌株。
7.下述各項(xiàng)之一在合成用于抵抗豬偽狂犬病毒增殖的藥品中應(yīng)用。1)權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體，2)含有根據(jù)權(quán)利要求4或5所述重組表`達(dá)載體的大腸桿菌BL21表達(dá)菌株。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK103739697SQ201310749758
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】魏子貢, 魏榮展, 楊德明, 李文獻(xiàn) 申請(qǐng)人:魏子貢