專利名稱：含有肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的疫苗的制作方法
專利說明含有肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的疫苗 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及改進(jìn)的肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)疫苗。

背景技術(shù)：
不到2歲的兒童對大多數(shù)多糖疫苗不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，所以一直以來必須通過與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)綴合使多糖成為免疫原性的。將為非T細(xì)胞依賴性抗原的多糖與為T細(xì)胞依賴性抗原的蛋白偶聯(lián)賦予多糖T細(xì)胞依賴性特性，包括同種型轉(zhuǎn)換、親和力成熟和記憶誘導(dǎo)。
然而，重復(fù)給予多糖-蛋白綴合物或?qū)⒍嗵?蛋白綴合物聯(lián)合成多價疫苗可能有問題.例如，已有報道指出在一定劑量范圍內(nèi)測試了使用破傷風(fēng)類毒素(TT)作為蛋白載體的乙型流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)多糖(PRP)疫苗，該疫苗與(游離的)TT和肺炎鏈球菌多糖-TT綴合疫苗按照標(biāo)準(zhǔn)嬰兒免疫程序同時免疫。當(dāng)肺炎鏈球菌疫苗的劑量增加時，對Hib綴合疫苗的PRP多糖部分的免疫應(yīng)答降低，這表明很可能是通過使用相同載體蛋白引起的多糖免疫干擾(Dagan等，Infect Immun.(1998)；662093-2098)。
已證實載體-蛋白劑量對針對蛋白自身的體液免疫應(yīng)答的影響是多方面的。據(jù)報道在人類嬰兒中增加四價破傷風(fēng)類毒素綴合物的劑量導(dǎo)致對破傷風(fēng)載體的應(yīng)答下降(Dagan等，出處同上)。對于聯(lián)合疫苗的這些效應(yīng)的經(jīng)典分析一直被描述為載體誘導(dǎo)的表位抑制，這一點還沒有完全弄清楚，但一般認(rèn)為是由過量的載體蛋白引起的(Fattom，vaccine 17126(1999))。這似乎導(dǎo)致針對載體蛋白的B細(xì)胞和針對多糖的B細(xì)胞競爭Th細(xì)胞。如果針對載體蛋白的B細(xì)胞占優(yōu)勢，則沒有足夠的Th細(xì)胞可用于為多糖特異性B細(xì)胞提供必需的輔助。然而，觀察到的免疫效果一直不一致，載體蛋白的總量在某些情況下增加免疫應(yīng)答，而在另一些情況下降低免疫應(yīng)答。
因此，將多種多糖綴合物組合成單一的、有效的疫苗制劑仍有技術(shù)難度。
肺炎鏈球菌為革蘭氏陽性細(xì)菌，可導(dǎo)致相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率(尤其是對年紀(jì)小的人和上年紀(jì)的人)，引起諸如肺炎、菌血癥和腦膜炎等侵襲性疾病以及與定植相關(guān)的疾病，如急性中耳炎。在美國，60歲以上的人患有肺炎鏈球菌性肺炎的比例估計為十萬分之3-8。其中20％的病例中會引發(fā)菌血癥，其它則表現(xiàn)為例如腦膜炎，即便采用抗生素治療死亡率也接近30％。
肺炎鏈球菌被賦予血清型特異性的化學(xué)連接的多糖包裹。有90種公知的肺炎鏈球菌血清型，莢膜是肺炎鏈球菌毒力的主要決定因素，因為莢膜不但保護(hù)細(xì)菌內(nèi)表面不受補(bǔ)體影響，而且其本身是弱免疫原性的。多糖是非T細(xì)胞依賴性抗原，不能被加工或呈遞到MHC分子上，從而不能與T細(xì)胞相互作用。但它們能通過一種涉及B細(xì)胞表面受體交聯(lián)的替代機(jī)制來刺激免疫系統(tǒng)。
一些實驗表明，對侵襲性肺炎鏈球菌疾病的防護(hù)作用與莢膜特異性抗體最為相關(guān)，且該防護(hù)作用具有血清型特異性。
肺炎鏈球菌是嬰兒和兒童侵襲性細(xì)菌疾病和中耳炎的最常見致病因素。同樣，老年人對肺炎鏈球菌疫苗的應(yīng)答較弱[Roghmann等，(1987)，J.Gerontol.42265-270]，因此，在該人群中細(xì)菌性肺炎的發(fā)病率升高[Verghese和Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62271-285]。
因此，本發(fā)明的目的是開發(fā)一種改進(jìn)的多種血清型肺炎鏈球菌多糖綴合疫苗的制劑。
附圖簡述

圖1 顯示老年獼猴(Rhesus monkeys)中的11價綴合物免疫原性的條形圖。淺色條代表用在磷酸鋁佐劑中的11價綴合物2次接種后的GMC。深色條代表用在佐劑C中的11價綴合物2次接種后的GMC。
圖2 顯示用在佐劑C或磷酸鋁佐劑中的11價綴合物接種后針對PS3的記憶B細(xì)胞的條形圖。
圖3 顯示Balb/C小鼠中4價普通多糖和4價dPly綴合物的抗多糖19F免疫原性的條形圖。
圖4 顯示Balb/C小鼠中4價普通多糖和4價PhtD綴合物的抗多糖22F免疫原性的條形圖。
圖5 顯示Balb/C小鼠中的抗22F IgG應(yīng)答的條形圖。
圖6 顯示Balb/C小鼠中的抗22F調(diào)理吞噬效價的條形圖。
圖7 比較在C57B1幼齡小鼠中用以不同佐劑配制的13價綴合疫苗免疫后誘導(dǎo)的IgG應(yīng)答的條形圖。
圖8 顯示不同疫苗組合在猴肺炎模型中的保護(hù)效力的條形圖。
圖9 顯示Balb/c小鼠中用22F-PhtD或22F-AH-PhtD綴合物免疫后的抗PhtD IgG應(yīng)答的條形圖。
圖10 在小鼠中用22F-PhtD或22F-AH-PhtD免疫后的抗4型肺炎鏈球菌挑戰(zhàn)的保護(hù)作用。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供含有血清型19A和19F肺炎鏈球菌(Streptococcus.pneumoniae)莢膜糖綴合物的免疫原性組合物，其中19A與為第一種細(xì)菌類毒素的載體蛋白綴合，19F與為第二種細(xì)菌類毒素的載體蛋白綴合。
術(shù)語莢膜糖包括莢膜多糖和可來源于莢膜多糖的寡糖。寡糖包含至少4個糖殘基。術(shù)語綴合物和綴合的涉及與載體蛋白共價鍵合的莢膜糖。
就本發(fā)明而言，“免疫人類宿主以抵御COPD惡化”或“治療或預(yù)防COPD惡化”或“減輕COPD惡化嚴(yán)重性”是指COPD惡化的發(fā)生率或速率下降(例如速率下降0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、20％或以上)，例如在用本發(fā)明的組合物或疫苗免疫的患者組中。
術(shù)語細(xì)菌類毒素包括通過遺傳突變、化學(xué)處理或綴合失活的細(xì)菌毒素。適宜的細(xì)菌類毒素包括破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素、細(xì)菌溶細(xì)胞素或肺炎鏈球菌溶血素。業(yè)已描述了降低肺炎鏈球菌溶血素毒性的肺炎鏈球菌溶血素(Ply)突變(WO 90/06951、WO99/03884)。同樣，知曉降低其毒性的白喉毒素遺傳突變(參見下文)。白喉毒素的遺傳學(xué)上的解毒類似物包括CRM197和其它突變體，參見US 4,709，017、US 5,843,711、US 5,601,827和US 5,917,017。CRM197是無毒形式的白喉毒素，但在免疫學(xué)上與白喉毒素沒有區(qū)別。CRM197由不產(chǎn)毒噬菌體β197tox感染的白喉棒桿菌(C.diphtheriae)產(chǎn)生，而β197tox是通過對產(chǎn)毒棒狀噬菌體b進(jìn)行亞硝基胍誘變產(chǎn)生的(Uchida等，Nature New Biology(1971)233；8-11)。CRM197蛋白與白喉毒素具有相同分子量，但由于1個堿基變化而在結(jié)構(gòu)基因方面不同。這導(dǎo)致52位的氨基酸從甘氨酸變?yōu)楣劝滨０?，使A片段不能結(jié)合NAD，因此無毒(Pappenheimer 1977，Ann Rev，Biochem.46；69-94，RappuoliApplied and Environmental Microbiology，1983年9月，560-564頁)。
第一種和第二種細(xì)菌類毒素可相同或不同。當(dāng)?shù)谝环N和第二種細(xì)菌類毒素不同時，意味著它們具有不同的氨基酸序列。
例如，19A和19F可分別與破傷風(fēng)類毒素和破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素和白喉類毒素、Crm197和CRM197、肺炎鏈球菌溶血素和肺炎鏈球菌溶血素、破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素和CRM197、破傷風(fēng)類毒素和肺炎鏈球菌溶血素、白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素和CRM197、白喉類毒素和肺炎鏈球菌溶血素、CRM197和破傷風(fēng)類毒素、CRM197和白喉類毒素、CRM197和肺炎鏈球菌溶血素、肺炎鏈球菌溶血素和破傷風(fēng)類毒素、肺炎鏈球菌溶血素和白喉類毒素或者肺炎鏈球菌溶血素和CRM197綴合。
在一個實施方案中，除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物以外，免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌莢膜糖4、6B、9V、14、18C和23F的綴合物。
在一個實施方案中，除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物以外，免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌莢膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C和23F的綴合物。
在一個實施方案中，除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物以外，免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌莢膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。
在一個實施方案中，除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物以外，免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌莢膜糖1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。
在一個實施方案中，除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物以外，免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌莢膜糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。
通常，本發(fā)明的肺炎鏈球菌疫苗含有莢膜糖抗原(任選綴合的)，其中所述糖來源于至少10種肺炎鏈球菌血清型。肺炎鏈球菌莢膜糖的數(shù)量可在10種不同血清型(或“V”，價)至23種不同血清型(23V)的范圍內(nèi)。在一個實施方案中，有10、11、12、13、14或15種不同血清型。在本發(fā)明的另一個實施方案中，疫苗可含有綴合的肺炎鏈球菌糖和未綴合的肺炎鏈球菌糖。任選地，糖血清型的總數(shù)少于或等于23。例如，本發(fā)明可包含10種綴合的血清型和13種未綴合的糖。以類似的方式，疫苗可分別含有11、12、13、14或16種綴合的糖以及12、11、10、9或7種未綴合的糖。
在一個實施方案中，本發(fā)明的多價肺炎鏈球菌疫苗選自以下血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，但要認(rèn)識到的是，根據(jù)接受疫苗的接受者的年齡和將給予疫苗的地理位置，可以1種或2種其它血清型替代。例如，10價疫苗可含有血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。11價疫苗還可以包含血清型3的糖。12價或13價兒科(嬰兒)疫苗還可以包括補(bǔ)加血清型6A和19A、或6A和22F、或19A和22F、或6A和15B、或19A和15B、或22F和15B的11價制劑，而13價老年疫苗可以包括補(bǔ)加血清型19A和22F、8和12F、或8和15B、或8和19A、或8和22F、或12F和15B、或12F和19A、或12F和22F、或15B和19A、或15B和22F的10或11價制劑。14價兒科疫苗可包括補(bǔ)加血清型3、6A、19A和22F；血清型6A、8、19A和22F；血清型6A、12F、19A和22F；血清型6A、15B、19A和22F；血清型3、8、19A和22F；血清型3、12F、19A和22F；血清型3、15B、19A和22F；血清型3、6A、8和22F；血清型3、6A、12F和22F；或血清型3、6A、15B和22F的上述10價制劑。
在一個實施方案中，組合物包含來源于血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F(任選綴合的)的莢膜糖。在本發(fā)明的又一個實施方案中，包含至少11種糖抗原(任選綴合的)，例如來源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖。在本發(fā)明的又一個實施方案中，包含至少12種或13種糖抗原，例如疫苗可含有來源于血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的莢膜糖，或者來源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的莢膜糖，但本發(fā)明還包括其它糖抗原，例如23價(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。
本發(fā)明的疫苗可含有流感嗜血菌的D蛋白(PD)(參見例如EP0594610)。流感嗜血菌是中耳炎的關(guān)鍵致病生物，本發(fā)明人已表明，將該蛋白納入肺炎鏈球菌疫苗中將提供針對流感嗜血菌相關(guān)性中耳炎的保護(hù)水平(參考POET出版物)。在一個實施方案中，疫苗組合物含有D蛋白。一方面，PD作為一種或多種糖的載體蛋白存在。另一方面，D蛋白可作為游離蛋白存在于疫苗組合物中。又一方面，D蛋白作為載體蛋白和游離蛋白這二者存在。D蛋白可用作全長蛋白或片段(WO0056360)。又一方面，D蛋白作為大部分糖的載體蛋白存在，例如6、7、8、9種或更多種的糖可與D蛋白綴合。在該方面，D蛋白也可作為游離蛋白存在。
本發(fā)明的疫苗含有1種、2種或更多種不同類型的載體蛋白。每類載體蛋白均可用作1種以上的糖的載體，所述糖可為相同的或不同的。例如，血清型3和4可綴合相同載體蛋白，或者綴合同一載體蛋白分子，或者綴合相同載體蛋白的不同分子。在一個實施方案中，2種以上的不同的糖可與相同載體蛋白綴合，或者綴合同一載體蛋白分子，或者綴合相同載體蛋白的不同分子。
除19A和19F以外存在于本發(fā)明的免疫原性組合物中的任何肺炎鏈球菌莢膜糖都可與獨立地選自以下的載體蛋白綴合:TT、DT、CRM197、TT的片段C、PhtD、PhtBE或PhtDE融合蛋白(尤其是在WO 01/98334和WO 03/54007中描述的那些)、解毒的肺炎鏈球菌溶血素和D蛋白。以下提供了可用于本發(fā)明綴合物的蛋白載體的更完整清單。
與本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的綴合物中的一種或多種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合的載體蛋白任選地為聚組氨酸三聯(lián)體家族(Pht)蛋白成員、其片段或融合蛋白。PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白可具有與WO 00/37105或WO 00/39299中公開的序列(例如與WO00/37105中關(guān)于PhtD的SEQ D NO4的氨基酸序列1-838或21-838)共有80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。例如，融合蛋白由PhtA、PhtB、PhtD、PhtE中的2、3或4種的全長或片段組成。融合蛋白的實例為PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D，其中所述蛋白在N末端與首先提到的連接(參見例如WO01/98334)。
在使用Pht蛋白片段(獨立的或作為融合蛋白的一部分)時，每個片段任選地含有一個或多個組氨酸三聯(lián)體基序和/或這些多肽的卷曲螺旋區(qū)。組氨酸三聯(lián)體基序是多肽的一部分，具有序列HxxHxH，其中H為組氨酸，x為非組氨酸的氨基酸。卷曲螺旋區(qū)是Lupus，A等，(1991)Science 252；1162-1164通過“Coils”算法預(yù)測的區(qū)域。在一個實施方案中，該片段或每個片段含有一個或多個組氨酸三聯(lián)體基序以及至少一個卷曲螺旋區(qū)。在一個實施方案中，該片段或每個片段含有恰好或至少2、3、4或5個組氨酸三聯(lián)體基序(任選地，在2個或多個三聯(lián)體之間具有天然Pht序列，或者具有三聯(lián)體內(nèi)序列，該三聯(lián)體內(nèi)序列與天然肺炎鏈球菌三聯(lián)體內(nèi)Pht序列—例如示于WO 00/37105的SEQ ID NO4的三聯(lián)體內(nèi)PhtD序列超過50％、60％、70％、80％、90％或100％相同)。在一個實施方案中，該片段或每個片段含有恰好或至少2、3或4個卷曲螺旋區(qū)。在一個實施方案中，本文公開的Pht蛋白包括具有連接的信號序列的全長蛋白、信號肽(例如在N-末端的20個氨基酸)已被去除的成熟全長蛋白、Pht蛋白的天然變體和Pht蛋白的免疫原性片段(例如上述片段，或含有WO 00/37105或WO00/39299中的氨基酸序列的至少15個或20個連續(xù)氨基酸的多肽，其中所述多肽能夠激發(fā)對WO00/37105或WO00/39299中所述氨基酸序列特異性的免疫應(yīng)答)。
具體地說，本文使用的術(shù)語“PhtD”包括具有連接的信號序列的全長蛋白、信號肽(例如在N-末端的20個氨基酸)已被去除的成熟全長蛋白、PhtD的天然變體和PhtD的免疫原性片段(例如上述片段，或含有WO00/37105或WO00/39299中的PhtD氨基酸序列的至少15個或20個連續(xù)氨基酸的多肽，其中所述多肽能夠激發(fā)對WO00/37105或WO00/39299中所述PhtD氨基酸序列(例如WO 00/37105中針對PhtD的SEQ ID NO4)特異性的免疫應(yīng)答)。
如果蛋白載體與組合物中的2種以上的糖相同，則糖可與同一蛋白載體分子綴合(載體分子具有2個以上與其綴合的不同糖)[參見例如WO 04/083251]?；蛘?，所述糖可各自獨立綴合不同的蛋白載體分子(每個蛋白載體分子均僅具有1類與其綴合的糖)。
可用于本發(fā)明的載體蛋白的實例為DT(白喉類毒素)；TT(破傷風(fēng)類毒素)或TT的C片段；DT CRM197(DT突變體)，其它DT點突變，例如CRM176、CRM228、CRM 45(Uchida等，J.Biol.Chem.218；3838-3844，1973)；CRM 9、CRM 45、CRM102、CRM 103和CRM107以及由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins，F(xiàn)rankel編輯，Maecel Dekker Inc，1992中描述的其它突變；Glu-148缺失或突變?yōu)锳sp、Gln或Ser，和/或Ala 158缺失或突變?yōu)镚ly，以及在US 4709017或US 4950740中公開的其它突變；Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534中至少一個或多個殘基的突變，以及在US 5917017或US6455673中公開的其它突變；或者在US 5843711中公開的片段；肺炎鏈球菌性肺炎鏈球菌溶血素(Kuo等，(1995)Infect Immun 63；2706-13)，包括以某些方式解毒的ply，例如dPLY-GMBS(WO04081515、PCT/EP2005/010258)或dPLY-甲醛、PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE以及Pht蛋白的融合體，例如PhtDE融合體、PhtBE融合體(WO 01/98334和WO 03/54007)、(Pht A-E詳述于下文)；OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白-通常由腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清群B提取-EP0372501)；PorB(得自腦膜炎奈瑟氏球菌)；PD(流感嗜血菌D蛋白-參見例如EP 0 594 610 B)或其免疫學(xué)功能等同物；合成肽(EP0378881、EP0427347)；熱激蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)；百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)；細(xì)胞因子；淋巴因子；生長因子或激素(WO 91/01146)；含有來自多種病原體衍生抗原的多個人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白(Falugi等，(2001)Eur J Immunol 31；3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等，(2004)Infect Immun 72；4884-7)；肺炎鏈球菌表面蛋白PspA(WO 02/091998)；鐵吸收蛋白(WO01/72337)；艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B(WO 00/61761)。
Nurkka等，Pediatric Infectious Disease Journal.23(11)1008-14，2004年11月描述了所有血清型均綴合PD的11價肺炎鏈球菌疫苗。然而，本發(fā)明人已表明，相比于綴合PD的19F，用具有綴合DT的19F的綴合物誘導(dǎo)的抗體的調(diào)理吞噬活性被改善。另外，本發(fā)明人已表明，用綴合DT的19F觀察到對19A的更大交叉反應(yīng)性。因此，本發(fā)明組合物的特征在于血清型19F與細(xì)菌類毒素如TT、肺炎鏈球菌溶血素、DT或CRM 197綴合。一方面，血清型19F與DT綴合。血清型19A與細(xì)菌類毒素如TT、肺炎鏈球菌溶血素、DT或CRM 197綴合也是本發(fā)明的特征。免疫原性組合物余下的糖血清型可全部與一種或多種不是DT的載體蛋白綴合(即僅有19F綴合DT)，或者可以在不是DT和為DT自身的一種或多種載體蛋白之間分?jǐn)?。在一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，所有余下的血清型綴合PD。在又一個實施方案中，19F綴合DT或CRM 197，余下的血清型在PD和TT或者DT或CRM 197之間分?jǐn)偂Ｔ谟忠粋€實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，僅1種糖綴合TT。在該實施方案的一方面，所述1種糖為18C或12F。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM197綴合，僅2種糖與TT綴合。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，余下的血清型在PD、TT和DT或CRM 197之間分?jǐn)偂Ｔ谟忠粋€實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，余下的血清型在PD、TT和肺炎鏈球菌溶血素之間分?jǐn)偂Ｔ谟忠粋€實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，余下的血清型在PD、TT和CRM 197之間分?jǐn)?。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，余下的血清型在PD、TT、肺炎鏈球菌溶血素和任選的PhtD或PhtD/E融合蛋白之間分?jǐn)?。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，19A與肺炎鏈球菌溶血素或TT綴合，余下的血清型在PD、TT、肺炎鏈球菌溶血素和任選的PhtD或PhtD/E融合蛋白之間分?jǐn)?。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，19A與肺炎鏈球菌溶血素或TT綴合，還有1種糖綴合TT，還有1種糖綴合PhtD或PhtD/E，所有其余的糖綴合PD。在又一個實施方案中，19F與DT或CRM 197綴合，19A與肺炎鏈球菌溶血素綴合，還有1種糖綴合TT，還有1種糖綴合肺炎鏈球菌溶血素，還有2種糖綴合PhtD或PhtD/E，所有其余的糖綴合PD。
在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有來自流感嗜血菌的D蛋白。在該實施方案中，如果PD不是其中一種用于綴合非19F的任何糖的載體蛋白，例如19F與DT綴合，而其它血清型與一種或多種不是PD的不同載體蛋白綴合，那么PD將在疫苗組合物中作為游離蛋白存在。如果PD是其中一種用于綴合非19F的糖的載體蛋白，則PD可任選地作為游離蛋白存在于疫苗組合物中。
術(shù)語“糖”在整個本說明書中可指示多糖或寡糖，并包括這二者。多糖分離自細(xì)菌，并可以在某種程度上通過已知方法(參見例如EP497524和EP497525)并任選地通過微流化調(diào)整大小?？蓪Χ嗵钦{(diào)整大小，以便降低多糖樣品的粘度和/或改善綴合產(chǎn)物的過濾性。寡糖具有少量重復(fù)單元(通常5-30個重復(fù)單元)，并通常為水解的多糖。
肺炎鏈球菌的莢膜多糖包含可含有達(dá)8個糖殘基的重復(fù)寡糖單元。關(guān)于關(guān)鍵肺炎鏈球菌血清型的寡糖單元的綜述，參見JONES，Christopher.Vaccine based on the cell surface carbohydrates ofpathogenic bacteria.An.Acad.Bras.Ciênc.，2005年6月，第77卷，第2冊，293-324頁，ISSN 0001-3765。在一個實施方案中，莢膜糖抗原可為全長多糖，但是在其它實施方案中其可為一個寡糖單元，或者比重復(fù)寡糖單元的天然長度的糖鏈短。在一個實施方案中，疫苗中存在的所有糖都是多糖。全長多糖可被“調(diào)整大小”，即它們的大小可通過多種方法降低，例如酸解處理；過氧化氫處理；通過

調(diào)整大小，然后經(jīng)過氧化氫處理，以產(chǎn)生寡糖片段；或者微流化。
本發(fā)明人還注意到，本技術(shù)的核心是使用易于生產(chǎn)綴合物的寡糖。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，通過使用天然的或稍微調(diào)整大小的多糖綴合物，可實現(xiàn)一個或多個以下優(yōu)勢1)具有高免疫原性的可過濾的綴合物，2)可改變綴合物中多糖對蛋白的比率，使得綴合物中多糖對蛋白的比率(重量/重量)可被增加(其可對載體抑制作用有影響)，3)傾向于水解的免疫原性綴合物可通過使用較大的糖進(jìn)行綴合來穩(wěn)定。使用較大的多糖可導(dǎo)致與綴合物載體更加交聯(lián)，并可以減少由綴合物釋放游離的糖。在先有技術(shù)中描述的綴合疫苗傾向于在綴合前解聚多糖，以便改善綴合。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，保留較大尺寸糖的糖綴合疫苗可提供抵御肺炎鏈球菌疾病的良好免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的免疫原性組合物因此可以包含一種或多種糖綴合物，其中在綴合前每種糖的平均尺寸(重均分子量；Mw)在80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或1000kDa以上。在一個實施方案中，綴合后的綴合物應(yīng)可容易地通過0.2μm濾器過濾，使得與過濾前樣品相比在過濾后獲得50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的產(chǎn)量。
就本發(fā)明而言，“天然的多糖”是指未經(jīng)處理的多糖，處理的目的是減小糖的尺寸。在常規(guī)純化工藝中多糖的尺寸可被輕微減少。這樣的糖仍是天然的。只要多糖經(jīng)過調(diào)整大小的工藝，該多糖就不被認(rèn)為是天然多糖。
就本發(fā)明而言，“以達(dá)到x2的因數(shù)調(diào)整大小”是指糖經(jīng)過處理，目的是降低糖大小，但仍保留超過天然多糖大小的一半的大小。x3、x4等等以相同的方式解釋，即對糖進(jìn)行處理，以減少多糖的大小，但仍保留天然多糖大小的1/3、1/4等等以上的大小。
在本發(fā)明的一方面，免疫原性組合物包含至少10種血清型的綴合載體蛋白的肺炎鏈球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9種或每種肺炎鏈球菌糖為天然多糖。
在本發(fā)明的一方面，免疫原性組合物包含來自至少10種血清型的綴合載體蛋白的肺炎鏈球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9種或每種肺炎鏈球菌糖被達(dá)到x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因數(shù)調(diào)整大小。在該方面的一個實施方案中，大部分糖，例如6、7、8種或更多種的糖被達(dá)到x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因數(shù)調(diào)整大小。
糖的分子量或平均分子量在本文是指在綴合前檢測的糖的重均分子量(Mw)，通過MALLS來檢測。
MALLS技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知，通常如實施例2所述進(jìn)行。就肺炎鏈球菌糖的MALLS分析而言，可組合使用兩種柱子(TSKG6000和5000PWx1)，并用水洗脫糖。用光散射檢測器(例如配有10mW 488nm氬激光器的Wyatt Dawn DSP)和干涉儀折射計(例如裝備P100光電元件和498nm紅光過濾的Wyatt Otilab DSP)檢測糖。
在一個實施方案中，肺炎鏈球菌糖為天然多糖，或者為在常規(guī)提取步驟中己經(jīng)減小了尺寸的天然多糖。
在一個實施方案中，通過機(jī)械裂解，例如通過微流化或超聲，調(diào)整肺炎鏈球菌糖的大小。微流化和超聲具有充分減小較大天然多糖大小從而提供可過濾綴合物的優(yōu)點。調(diào)整大小以不超過x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的因數(shù)進(jìn)行。
在一個實施方案中，免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌綴合物，該綴合物由天然多糖和以不超過x20的因數(shù)調(diào)整大小的糖的混合物制備。在該實施方案的一個方面，大部分糖，例如6、7、8種或更多種糖以達(dá)到x2、x3、x4、x5或x6的因數(shù)調(diào)整大小。
在一個實施方案中，肺炎鏈球菌糖通過接頭如雙功能接頭與載體蛋白綴合。任選地，接頭為異雙功能或同雙功能接頭，具有例如1個反應(yīng)性氨基和1個反應(yīng)性羧基、2個反應(yīng)性氨基或者2個反應(yīng)性羧基。例如，接頭具有4-20、4-12、5-10個碳原子?？赡艿慕宇^是ADH。其它接頭包括B-丙酰胺基(WO 00/10599)、硝基苯-乙胺(Gever等，(1979)Med.Microbiol.Immunol.165；171-288)、鹵代烷基鹵(US4057685)、糖苷鍵(US4673574、US4808700)、己烷二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在一個實施方案中，ADH用作綴合血清型18C的糖的接頭。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的糖綴合物可用任何己知的偶聯(lián)技術(shù)制備。綴合方法可依賴于用四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓(CDAP)活化糖而形成氰酸酯。由此，活化的糖可直接或經(jīng)由間隔臂(接頭)基團(tuán)偶聯(lián)至載體蛋白上的氨基。例如，間隔臂可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化多糖，硫醇化多糖可經(jīng)由與馬來酰亞胺活化的載體蛋白(例如使用GMBS)或鹵乙酰載體蛋白(例如使用碘乙酰亞胺[例如乙基碘乙酰亞胺HCl]或N-琥珀酰亞胺基溴乙酸鹽或SIAB、或SIA、或SBAP)反應(yīng)后所獲得的硫醚鍵與載體偶聯(lián)。任選地，氰酸酯(任選地以CDAP化學(xué)法制備)可與己二胺或ADH偶聯(lián)，并采用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學(xué)法經(jīng)蛋白載體上的羧基使氨基衍生化的糖與載體蛋白綴合。這樣的綴合物描述于PCT公開申請WO 93/15760(Uniformed Services University)以及WO 95/08348和WO 96/29094。
其它的合適技術(shù)使用碳二亞胺、碳亞胺、酰肼、活化酯、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多都描述于WO 98/42721。綴合可涉及羰基接頭，其可如下形成:糖的游離羥基先與CDI反應(yīng)(Bethell等，J.Biol.Chem.1979，254；2572-4，Hearn等，J.Chromatogr.1981.218；509-18)，再與蛋白反應(yīng)，形成氨基甲酸酯鍵。該過程可涉及異頭末端還原成伯羥基，任選地，涉及伯羥基與CDI反應(yīng)的伯羥基的保護(hù)/去保護(hù)，以形成CDI氨基甲酸酯中間體，并將CDI氨基甲酸酯中間體與蛋白的氨基偶聯(lián)。
綴合物也可通過如US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)所述的直接還原胺化法制備。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。
進(jìn)一步的方法涉及通過碳二亞胺縮合(Chu C.等，Infect.Immunity，1983 245 256)，例如使用EDAC，將溴化氰(或CDAP)活化的、被己二酰肼(ADH)衍生化的糖與蛋白載體偶聯(lián)。
在一個實施方案中，糖上的羥基(任選活化的羥基，例如被活化以制備氰酸酯的羥基(例如使用CDAP))直接或間接(通過接頭)與蛋白的氨基或羧基連接。當(dāng)存在接頭時，糖上的羥基任選地與接頭上的氨基連接，例如通過使用CDAP綴合。接頭如ADH中的其余氨基可綴合蛋白上的羧酸基團(tuán)，例如通過使用碳二亞胺化學(xué)，例如通過使用EDAC。在一個實施方案中，肺炎鏈球菌莢膜糖在接頭與載體蛋白綴合之前先與接頭綴合。或者，接頭可在與糖綴合之前與載體綴合。
還可以使用技術(shù)組合，一些糖-蛋白綴合物通過CDAP制備，一些通過還原胺化法制備。
通常，蛋白載體上可用于偶聯(lián)/綴合的化學(xué)基團(tuán)的類型如下 A)羧基(例如經(jīng)天冬氨酸或谷氨酸)。在一個實施方案中，該基團(tuán)直接與糖上的氨基連接，或者用碳二亞胺化學(xué)(例如用EDAC)與接頭上的氨基連接。
B)氨基(例如經(jīng)由賴氨酸)。在一個實施方案中，該基團(tuán)直接與糖上的羧基連接，或者用碳二亞胺化學(xué)(例如用EDAC)與接頭上的羧基連接。在另一個實施方案中，該基團(tuán)直接與糖上用CDAP或CNBr活化的羥基連接，或者與接頭上的這些基團(tuán)連接；與具有醛基的糖或接頭連接；與具有琥珀酰亞胺酯基團(tuán)的糖或接頭連接。
C)巰基(例如經(jīng)由半胱氨酸)。在一個實施方案中，該基團(tuán)與溴乙酰糖或氯乙酰糖連接，或者用馬來酰亞胺化學(xué)與接頭連接。在一個實施方案中，該基團(tuán)用雙二重氮聯(lián)苯胺活化/改性。
D)羥基(例如經(jīng)由酪氨酸)。在一個實施方案中，該基團(tuán)用雙二重氮聯(lián)苯胺活化/改性。
E)咪唑基(例如經(jīng)由組氨酸)。在一個實施方案中，該基團(tuán)用雙二重氮聯(lián)苯胺活化/改性。
F)胍基(例如經(jīng)由精氨酸)。
G)吲哚基(例如經(jīng)由色氨酸)。
在糖上，能夠用于偶聯(lián)的通常是以下基團(tuán)OH、COOH或NH2。醛基能夠在本領(lǐng)域已知的不同處理后產(chǎn)生，所述處理例如高碘酸鹽、酸解、過氧化氫等。
直接偶聯(lián)法 糖-OH+CNBr或CDAP----->氰酸酯+NH2-Prot---->綴合物 糖-醛+NH2-Prot---->席夫堿+NaCNBH3---->綴合物 糖-COOH+NH2-Prot+EDAC---->綴合物 糖-NH2+COOH-Prot+EDAC---->綴合物通過間隔臂(接頭)間接偶聯(lián)的方法: 糖-OH+CNBr或CDAP--->氰酸酯+NH2----NH2---->糖----NH2+COOH-Prot+EDAC----->綴合物 糖-OH+CNBr或CDAP---->氰酸酯+NH2-----SH----->糖----SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通過例如SPDP將蛋白的氨基改性后獲得的)----->糖-S-S-Prot 糖-OH+CNBr或CDAP--->氰酸酯+NH2----SH------->糖----SH+馬來酰亞胺-Prot(氨基的改性物)---->綴合物 糖-OH+CNBr或CDAP--->氰酸酯+NH2-----SH--->糖-SH+鹵代乙酰胺-Prot---->綴合物 糖-COOH+EDAC+NH2-----NH2--->糖------NH2+EDAC+COOH-Prot---->綴合物 糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通過例如SPDP將蛋白的氨基改性后獲得的)----->糖-S-S-Prot 糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+馬來酰亞胺-Prot(氨基的改性物)---->綴合物 糖-COOH+EDAC+NH2----SH--->糖-SH+鹵代乙酰胺-Prot---->綴合物 糖-醛+NH2-----NH2--->糖------NH2+EDAC+COOH-Prot---->綴合物 注意除了以上的EDAC，還可以使用任何合適的碳二亞胺。
總之，通?？梢杂糜谂c糖偶合的蛋白載體化學(xué)基團(tuán)的類型是氨基(例如賴氨酸殘基上的)、COOH基團(tuán)(例如天冬氨酸和谷氨酸殘基上的)和SH基團(tuán)(如果能夠獲得的話)(例如半胱氨酸殘基上的)。
任選地，載體蛋白對肺炎鏈球菌糖的比率在1:5至5:1(重量/重量)之間；1:2至2.5:1(重量/重量)之間；1:1至2:1(重量/重量)之間。在一個實施方案中，大部分綴合物，例如6、7、8、9種或更多種綴合物，具有大于1:1的載體蛋白對糖的比率，例如1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1或1.6:1。
在一個實施方案中，使用CDAP和EDAC使至少一種肺炎鏈球菌糖經(jīng)接頭與載體蛋白綴合。例如，可使用如上所述的CDAP和EDAC使18C經(jīng)接頭(例如在其末端具有兩個酰肼基團(tuán)的那些接頭，例如ADH)與蛋白綴合。在使用接頭時，CDAP可用于使糖與接頭綴合，然后可使用EDAC使接頭與蛋白綴合，或者可首先使用EDAC使接頭與蛋白綴合，此后可使用CDAP使接頭與糖綴合。
通常，本發(fā)明的免疫原性組合物可含有在0.1-20μg、1-10μg或1-3μg糖之間的每種糖綴合物的劑量。
在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有為0.1-20μg、0.5-10μg、0.5-5μg或1-3μg糖劑量的每種肺炎鏈球菌莢膜糖。在一個實施方案中，莢膜糖可以不同劑量存在，例如某些莢膜糖可以恰好1μg的劑量存在，或者某些莢膜糖可以恰好3μg的劑量存在。在一個實施方案中，血清型3、18C和19F(或者4、18C和19F)的糖以高于其它糖的劑量存在。在該實施方案的一個方面，血清型3、18C和19F(或4、18C和19F)以近似或恰好3μg的劑量存在，而免疫原性組合物中的其它糖以近似或恰好1μg的劑量存在。
“約”或“近似”就本發(fā)明而言被定義為在給定值的10％左右。
在一個實施方案中，至少一種肺炎鏈球菌莢膜糖與載體蛋白直接綴合。任選地，至少一種肺炎鏈球菌莢膜糖通過CDAP直接綴合。在一個實施方案中，大部分莢膜糖，例如5、6、7、8、9種或更多種，通過CDAP與載體蛋白連接(參見WO 95/08348和WO 96/29094)。
免疫原性組合物可包含肺炎鏈球菌蛋白，本文稱為本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白。這些蛋白可用作載體蛋白，或者可作為游離蛋白存在，或者可作為載體蛋白和游離蛋白這二者存在。本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白或者為表面暴露的，至少在肺炎鏈球菌部分生命周期當(dāng)中，或者為由肺炎鏈球菌分泌或釋放的蛋白。任選地，本發(fā)明的蛋白選自以下類別，例如具有LXXC的II型信號序列基序的蛋白(其中X為任何氨基酸，例如聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX))、膽堿結(jié)合蛋白(CbpX)、具有I型信號序列基序的蛋白(例如Sp101)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X為任何氨基酸，例如Sp128、Sp130)和毒素(例如Ply)。這些類別(或基序)中的實例為以下蛋白或其免疫學(xué)功能等效物。
在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種蛋白，所述蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)。肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。在又一個實施方案中，免疫原性組合物含有2種或多種蛋白，所述蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128。在又一個實施方案中，免疫原性組合物含有2種或多種蛋白，所述蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)和Sp128。
Pht(聚組氨酸三聯(lián)體)家族包括蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。該家族具有以下特征脂質(zhì)化序列；由脯氨酸富集區(qū)和幾個組氨酸三聯(lián)體分隔開的兩個結(jié)構(gòu)域，可能涉及金屬或核苷的結(jié)合或酶活性；(3-5)卷曲螺旋區(qū)；保守的N-末端和異源的C末端。它存在于已檢驗的所有肺炎鏈球菌菌株中。同源蛋白已在其它鏈球菌和奈瑟氏球菌屬中發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的Pht蛋白為PhtD。然而，要理解的是，術(shù)語Pht A、B、D和E是指具有在以下引用文獻(xiàn)中公開的序列的蛋白，以及其天然(和人工制備的)變體，所述變體與參比蛋白具有至少90％的序列同源性。任選地為至少95％相同或至少97％相同。
對于PhtX蛋白而言，PhtA在WO 98/18930中公開，也稱作Sp36。如上所述，其是聚組氨酸三聯(lián)體家族蛋白，并具有II型信號基序LXXC。PhtD在WO 00/37105中公開，也稱為Sp036D。如上所述，它也是聚組氨酸三聯(lián)體家族蛋白，并具有II型LXXC信號基序。PhtB在WO 00/37105中公開，也稱為Sp036B。PhtB家族的另一成員是C3-降解多肽，在WO 00/17370中公開。該蛋白也來自聚組氨酸三聯(lián)體家族(triad family)，并具有II型LXXC信號基序。例如，免疫功能等效物為在WO 98/18930中公開的蛋白Sp42。PhtB截短物(約79kD)在WO 99/15675中公開，它也被認(rèn)為是PhtX家族成員。PhtE在WO00/30299中公開，稱作BVH-3。當(dāng)本文提到任何Pht蛋白時，意味著可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。例如，提到的PhtX包括來自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。提到PhtD或PhtB也就提到了可見于例如WO 0198334的PhtDE或PhtBE。
肺炎鏈球菌溶血素是一種具有獨特的溶細(xì)胞(溶血)作用和補(bǔ)體活化活性的多功能毒素(Rubins等，Am.Respi.Cit Care Med，1531339-1346(1996))。該毒素不由肺炎鏈球菌分泌，而是在肺炎鏈球菌于自溶素影響下裂解時釋放。其作用包括例如:刺激人體單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，抑制人體呼吸上皮纖毛顫動，降低嗜中性粒細(xì)胞的殺菌活性和遷移性。肺炎鏈球菌溶血素最明顯的作用在于紅細(xì)胞裂解方面，該作用涉及與膽固醇結(jié)合。因為肺炎鏈球菌溶血素是一種毒素，因此在其可以體內(nèi)給藥前必須脫毒(即以適于保護(hù)的劑量提供時對人無毒)。在本領(lǐng)域已知野生型或天然肺炎鏈球菌溶血素的表達(dá)和克隆。參見例如Walker等(Infect Immun，551184-1189(1987))，Mitchell等(Biochim Biophys Acta，100767-72(1989)和Mitchell等(NAR，184010(1990))。Ply的脫毒可以用化學(xué)方法進(jìn)行，例如進(jìn)行福爾馬林或戊二醛處理或二者的組合(WO 04081515，PCT/EP2005/010258)。這些方法在本領(lǐng)域眾所周知用于多種毒素?；蛘?，ply可以用基因方法脫毒。因此，本發(fā)明包括肺炎鏈球菌蛋白衍生物，該衍生物可為例如突變蛋白。術(shù)語“突變的”在本文用于指已使用公知的定點誘變技術(shù)或任何其它常規(guī)方法缺失、增加或取代一個或多個氨基酸的分子。例如:如上所述，突變型ply蛋白可以被改變，以使其生物失活，但仍保持其致免疫表位，參見例如WO 90/06951，Berry等，(Infect Immun，67:981-985(1999))和WO99/03884。
要理解的是，此處所用的術(shù)語“Ply”是指適于醫(yī)用的突變或脫毒的(即無毒的)肺炎鏈球菌溶血素。
關(guān)于膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)，該家族的成員最初被鑒定為能用膽堿親和層析純化的肺炎鏈球菌蛋白。所有膽堿結(jié)合蛋白都非共價結(jié)合于細(xì)胞壁磷壁酸和膜結(jié)合脂磷壁酸的磷酸膽堿部分。雖然該蛋白質(zhì)的確切性質(zhì)(氨基酸序列、長度等)可以不同，但整個家族具有數(shù)個在結(jié)構(gòu)上相同的區(qū)域。一般來說，膽堿結(jié)合蛋白包含N末端區(qū)(N)、保守重復(fù)區(qū)(R1和/或R2)、脯氨酸富集區(qū)(P)和保守的膽堿結(jié)合區(qū)(C)，該膽堿結(jié)合區(qū)由多個重復(fù)序列組成，約占該蛋白的一半。本申請中所用的術(shù)語“膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)”選自WO97/41151中所鑒定的膽堿結(jié)合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公開于WO97/41151，CbpD和CbpG公開于WO00/29434，PspC公開于WO97/09994，PbcA公開于WO98/21337。SpsA為WO 98/39450中公開的膽堿結(jié)合蛋白。該膽堿結(jié)合蛋白任選地選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。
本發(fā)明的一個實施方案包括CbpX截短物，其中“CbpX”在上文定義，“截短物”指缺少50％或更多的膽堿結(jié)合區(qū)(C)的CbpX蛋白。任選地，這樣的蛋白質(zhì)沒有整個膽堿結(jié)合區(qū)。任選地，這樣的蛋白截短物沒有(i)膽堿結(jié)合區(qū)和(ii)該蛋白質(zhì)的N末端一半的一部分，但至少保留一個重復(fù)區(qū)(R1或R2)。任選地，該截短物具有兩個重復(fù)區(qū)(R1和R2)。這些實施方案的實例是在WO99/51266或WO99/51188中舉例說明的NR1xR2和R1xR2，但是，其它沒有相似的膽堿結(jié)合區(qū)的膽堿結(jié)合蛋白也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
LytX家族是與細(xì)胞裂解有關(guān)的膜結(jié)合蛋白。N末端結(jié)構(gòu)域包含膽堿結(jié)合域，但是，LytX家族并不具有在上述CbpA家族中發(fā)現(xiàn)的所有特征，因此，對于本發(fā)明來說，LytX家族被認(rèn)為不同于CbpX家族。與CbpX家族相比，LytX的C末端結(jié)構(gòu)域包含LytX蛋白家族的催化域。該家族包含LytA、B和C。對于LytX家族而言，LytA公開于Ronda等，Eur J Biochem，164:621-624(1987)。LytB公開于WO98/18930，也被稱為Sp46。LytC也公開于WO 98/18930，也被稱為Sp91。本發(fā)明的實施方案包含LytC。
另一個實施方案包含LytX截短物，其中“LytX”在上文定義，“截短物”指沒有50％或更多膽堿結(jié)合區(qū)的LytX蛋白。任選地，這樣的蛋白質(zhì)沒有整個膽堿結(jié)合區(qū)。本發(fā)明的又一個實施方案包含CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)。任選地，該蛋白包含CbpX的NR1xR2(或R1xR2)和LytX的C末端部分(Cterm，即沒有膽堿結(jié)合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。任選地，CbpX選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。任選地其為CbpA。任選地Lytx為LytC(也被稱為Sp91)。本發(fā)明的另一個實施方案為PspA或PsaA截短物，其沒有膽堿結(jié)合域(C)，并與LytX一起表達(dá)為融合蛋白。任選地，LytX為LytC。
PsaA和PspA這二者在本領(lǐng)域都是已知的。例如，Berry和Paton，Infect Immun 1996年12月；64(12)5255-62已描述了PsaA和其跨膜缺失變體。例如US5804193、WO 92/14488和WO 99/53940公開了PspA和其跨膜缺失變體。
Sp128和Sp130公開于WO00/76540。Sp125是帶有細(xì)胞壁錨定基序LPXTG(其中X為任何氨基酸)的肺炎鏈球菌表面蛋白的實例。具有此基序的這類肺炎鏈球菌表面蛋白中的任何蛋白在本發(fā)明范圍內(nèi)都已被發(fā)現(xiàn)是有用的，因此將其視為本發(fā)明的另一種蛋白。Sp125本身公開于WO 98/18930，也稱為ZmpB-鋅金屬蛋白酶。Sp101公開于WO 98/06734(其中它的索引為#y85993)。其特征為I型信號序列。Sp133公開于WO 98/06734(其中它的索引為#y85992)。其也以I型信號序列為特征。
可包含在聯(lián)合疫苗(尤其是用于預(yù)防中耳炎的聯(lián)合疫苗)中的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)蛋白抗原的實例為OMP106[WO97/41731(Antex)和WO 96/34960(PMC)]；OMP21或其片段(WO0018910)；LbpA和/或LbpB[WO 98/55606(PMC)]；TbpA和/或TbpB[WO 97/13785和WO 97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME等，(1993)Infect.Immun.612003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO 93/03761(德克薩斯大學(xué))]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB 9917977.2)；lipo10(GB 9918208.1)；lipo11(GB 9918302.2)；lipo18(GB 9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)；和OmpE?？砂诼?lián)合疫苗(尤其是用于預(yù)防中耳炎的聯(lián)合疫苗)中的不可分型流感嗜血菌抗原或其片段的實例包括:絲束蛋白[(US 5766608-俄亥俄州研究基金會)]和含有來自其的肽的融合體[例如LB1(f)肽融合體；US 5843464(OSU)或WO 99/64067]；OMP26[WO 97/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(紐約州立大學(xué))]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO 94/12641)；P2；和P5(WO 94/26304)。
本發(fā)明的蛋白也可以進(jìn)行有益的組合。所述組合的是指免疫原性組合物包含來自以下組合中的所有蛋白，其或者為載體蛋白，或者為游離蛋白，或者為二者的混合物。例如，在后文陳述的兩種蛋白的組合中，兩種蛋白都可以用作載體蛋白，或者兩種蛋白都可以作為游離蛋白存在，或者兩種蛋白都可以作為載體蛋白和游離蛋白存在，或者一個可作為載體蛋白和游離蛋白存在，而另一個僅作為載體蛋白或僅作為游離蛋白存在。當(dāng)給出3種蛋白的組合時，存在類似的可能性。組合包括但不限于PhtD+NR1xR2、PhtD+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NR1xR2、PhtA+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NR1xR2+LytC、NR1xR2+PspA、NR1xR2+PsaA、NR1xR2+Sp128、R1xR2+LytC、R1xR2+PspA、R1xR2+PsaA、R1xR2+Sp128、R1xR2+PhtD、R1xR2+PhtA。任選地，NR1xR2(或R1xR2)來自CbpA或PspC。任選地，其來自CbpA。其它組合包括3種蛋白組合，例如PhtD+NR1xR2+Ply以及PhtA+NR1xR2+PhtD。在一個實施方案中，疫苗組合物包含解毒的肺炎鏈球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作為載體蛋白。在又一個實施方案中，疫苗組合物包含解毒的肺炎鏈球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作為游離蛋白。
在一個獨立方面，本發(fā)明提供包含至少4種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物的免疫原性組合物，所述綴合物含有不同肺炎鏈球菌血清型的糖，其中至少一種糖與PhtD或其融合蛋白綴合，免疫原性組合物能夠激發(fā)抗PhtD的有效免疫應(yīng)答。
例如通過保護(hù)測定，如在實施例15中描述的測定，檢測抗PhtD或其融合蛋白的有效免疫應(yīng)答。有效的免疫應(yīng)答在用異源菌株挑戰(zhàn)后7天提供至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的存活。假定挑戰(zhàn)菌株是異源的，則提供的保護(hù)歸因于抗PhtD或其融合蛋白的免疫應(yīng)答。
或者，抗PhtD的有效免疫應(yīng)答通過如在實施例14中描述的ELISA檢測。有效的免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗PhtD IgG應(yīng)答至少為250、300、350、400、500、550或600μg/ml GMC。
例如，免疫原性組合物包含來自不同血清型的綴合PhtD或其融合蛋白的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種肺炎鏈球菌莢膜糖。例如，血清型22F和另外選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、23F和33F的1、2、3、4、5、6或7種綴合PhtD。在一個實施方案中，血清型3、6A和22F中的2種或3種與PhtD或其融合蛋白綴合。
在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少一種經(jīng)接頭(例如ADH)與PhtD或其融合蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖。在一個實施方案中，使用以下列出的其中一種綴合化學(xué)物質(zhì)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少一種綴合PhtD或其融合蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖，其中綴合物中PhtD對糖的比率在6:1至1:5、6:1至2:1、6:1至2.5:1、6:1至3:1、6:1至3.5:1(重量/重量)之間，或者大于2.0:1、2.5:1、3.0:1、3.5:1或4.0:1(重量/重量)(即包含較大比例的PhtD)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌溶血素。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗。
本發(fā)明的疫苗可被佐劑化，尤其是在計劃用于老年人群而且用于嬰兒人群時。適宜的佐劑包括鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠或磷酸鋁或明礬，而且可以為其它金屬鹽，例如鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽，或者可為?；野彼峄蝓；恰㈥栯x子或陰離子衍生化糖或聚磷腈的不溶性混懸液。
任選地選擇為TH1型應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物的佐劑。這些高水平的Th1型細(xì)胞因子傾向于支持誘導(dǎo)針對給定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的Th2型細(xì)胞因子傾向于支持誘導(dǎo)針對抗原的體液免疫應(yīng)答。
Th1和Th2型免疫應(yīng)答的區(qū)別不是絕對的。實際上，個體將支持被描述為以Th1為主或以Th2為主的免疫應(yīng)答。然而，經(jīng)常便利地根據(jù)Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆中所描述的(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1 and TH2 cells:differentpatterns of lymphokine secretion lead to different functional properties.(Annual Review of Immunology，7，145-173頁)考慮細(xì)胞因子家族。傳統(tǒng)上，Th1型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞生產(chǎn)INF-γ和IL-2細(xì)胞因子有關(guān)。經(jīng)常與Th1型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)直接相關(guān)的其它細(xì)胞因子不由T細(xì)胞產(chǎn)生，例如IL-12。相比之下，Th2型應(yīng)答與I1-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有關(guān)。主要促進(jìn)Th1應(yīng)答的適宜佐劑系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A或其衍生物(或通常為解毒的脂質(zhì)A-參見例如WO2005107798)，尤其是3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)(關(guān)于其制備參見GB 2220211A)；以及單磷酰脂質(zhì)A、任選的3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A連同鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油乳劑的組合。在這些組合中，抗原和3D-MPL包含在相同的顆粒結(jié)構(gòu)中，允許更有效地傳遞抗原性和免疫刺激性信號。研究表明，3D-MPL能夠進(jìn)一步增強(qiáng)明礬吸附抗原的免疫原性[Thoelen等，Vaccine(1998)16708-14；EP 689454-B1]。
增強(qiáng)的系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合，尤其是如在WO 94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合，或者如在WO96/33739中公開的較少反應(yīng)原性的組合物，其中QS21用膽固醇猝滅。在WO 95/17210中描述了一種特別有效的佐劑制劑，其包含在水包油乳劑中的QS21、3D-MPL和生育酚。在一個實施方案中，免疫原性組合物另外含有皂苷，其可為QS21。制劑還可以包含水包油乳劑和生育酚(WO 95/17210)。含有寡核苷酸的未甲基化CpG(WO 96/02555)和其它免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸(WO0226757和WO03507822)也是TH1應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物，適用于本發(fā)明。
具體的佐劑選自金屬鹽、水包油乳劑、Toll樣受體激動劑(尤其是Toll樣受體2激動劑、Toll樣受體3激動劑、Toll樣受體4激動劑、Toll樣受體7激動劑、Toll樣受體8激動劑和Toll樣受體9激動劑)、皂苷或其組合。
可用于本發(fā)明的疫苗組合物的佐劑為革蘭氏陰性細(xì)菌菌株的小泡或外膜囊泡制備物，例如由WO02/09746教導(dǎo)的那些—尤其是腦膜炎奈瑟氏球菌小泡。小泡的佐劑特性可通過在其表面上保留LOS(脂多糖)(例如通過用低濃度去污劑[例如0-0.1％脫氧膽酸鹽]提取)而改善。LOS可通過WO02/09746所論述的msbB(-)或htrB(-)突變解毒。佐劑特性還可以通過保留腦膜炎球菌小泡的PorB(和任選地去除PorA)而改善。佐劑特性還可以通過截短腦膜炎球菌小泡上的LOS的外核糖結(jié)構(gòu)而改善-例如經(jīng)由WO2004/014417所論述的lgtB(-)突變?；蛘?，前述LOS(例如分離自msbB(-)和/或lgtB(-)菌株)可被純化并用作本發(fā)明組合物中的佐劑。
可用于本發(fā)明組合物的其它佐劑可選自皂苷、脂質(zhì)A或其衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳劑或其組合?？捎糜诒景l(fā)明組合物的其它佐劑為與另一種佐劑組合的金屬鹽。在一個實施方案中，佐劑為Toll樣受體激動劑，尤其是Toll樣受體2、3、4、7、8或9的激動劑，或皂苷，尤其是Qs21。在一個實施方案中，佐劑系統(tǒng)包括前面所列的兩種或多種佐劑。具體而言，組合任選地包含皂苷(尤其是Qs21)佐劑和/或Toll樣受體9激動劑，例如含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其它組合包含皂苷(尤其是QS21)和Toll樣受體4激動劑，例如單磷酰脂質(zhì)A或其3脫酰衍生物3D-MPL，或皂苷(尤其是QS21)和Toll樣受體4配體，例如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。
在一個實施方案中，佐劑為3D-MPL和QS21的組合(EP 0 671 948B1)、含有3D-MPL和QS21的水包油乳劑(WO 95/17210、WO 98/56414)或者與其它載體一起配制的3D-MPL(EP 0 689 454 B1)。在一個實施方案中，佐劑系統(tǒng)包含如在US6558670、US6544518中描述的3D MPL、QS21和CpG寡核苷酸的組合。
在一個實施方案中，佐劑為Toll樣受體(TLR)4配體，任選地為激動劑，例如脂質(zhì)A衍生物，尤其是單磷酰脂質(zhì)A，或者更具體地說為3脫酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)。
3D-MPL可得自北美葛蘭素史克生物制品公司(GlaxoSmithKlineBiologicals North America)，主要促進(jìn)具有IFN-g(Th1)表型的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。其可依據(jù)GB 2 220 211 A中公開的方法生產(chǎn)。在化學(xué)上，3D-MPL是具有3、4、5或6條?；湹?-脫酰單磷酰脂質(zhì)A的混合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL的粒徑使得其可通過0.22μm濾器除菌過濾。在國際專利申請?zhí)朩O 94/21292中描述了這些制備物。脂質(zhì)A的合成衍生物是已知的，并被認(rèn)為是TLR4激動劑，其包括但不限于: OM174 (2-脫氧-6-o-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二酰氧十四酰基氨基]-4-o-膦?；?β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-α-D-吡喃葡糖基二氫磷酸酯)，(WO 95/14026) OM294 DP(3S，9R)-3-[(R)-十二酰氧十四?；被鵠-4-氧-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四?；被鵠癸-1，10-二醇，1，10-雙(二氫磷酸酯)，(WO 99/64301和WO 00/0462) OM197 MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二酰氧十四?；被鵠-4-氧-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠癸-1，10-二醇，1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO 01/46127) 其它可用的TLR4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，如在WO9850399或US6303347中公開的那些(還公開了用于制備AGP的方法)，或如在US6764840中所公開的AGP的藥學(xué)上可接受的鹽。有些AGP是TLR4激動劑，而有些是TLR4拮抗劑。兩者都被認(rèn)為可用作佐劑。
另一個用于本發(fā)明的免疫刺激劑是Quil A及其衍生物。Quil A是從南美奎拉雅屬皂樹(Quilaja Saponaria Molina)中分離出來的皂苷制劑，并且由Dalsgaard等在1974年首次描述為具有佐劑活性(“Saponinadjuvants”，Archiv.für die gesamte Virusforschung，44卷，SpringerVerlag，Berlin，243-254頁)。通過HPLC已經(jīng)分離了Quil A的純化片段，其保留了佐劑活性，沒有與Quil A相關(guān)的毒性(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21(也稱為QA7和QA21)。QS-21是來源于奎拉雅屬皂樹樹皮的天然皂苷，其誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、Th1細(xì)胞和主要的IgG2a抗體反應(yīng)，在本發(fā)明背景下為優(yōu)選皂苷。
已經(jīng)描述了為本發(fā)明實施方案的具體QS21制劑，這些制劑還包括固醇(WO96/33739)。本發(fā)明的皂苷形成部分可以是獨立的膠束形式、混合的膠束(任選地具有膽汁鹽)形式，或者當(dāng)用膽固醇和脂質(zhì)制備時可以是ISCOM基質(zhì)(EP 0 109 942 B1)、脂質(zhì)體或相關(guān)膠體結(jié)構(gòu)的形式，如似螺旋形或環(huán)形多聚體復(fù)合物或者油脂/分層的結(jié)構(gòu)和薄片，或者是水包油乳劑形式(例如WO 95/17210)。皂苷可與金屬鹽結(jié)合，諸如氫氧化鋁或磷酸鋁(WO 98/15287)。
任選地，皂苷以脂質(zhì)體、ISCOM或水包油乳劑的形式存在。
增強(qiáng)的系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A(或解毒的脂質(zhì)A)和皂苷衍生物的的組合，尤其是如在WO 94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合，或如在WO 96/33739中公開的其中QS21用膽固醇猝滅的較少反應(yīng)原性的組合物。在WO 95/17210中描述了一種特別有效的佐劑制劑，其在水包油乳劑中包含生育酚，有或沒有QS21和/或3D-MPL。在一個實施方案中，免疫原性組合物另外含有皂苷，其可為QS21。
還可以使用免疫刺激性寡核苷酸或任何其它的Toll樣受體(TLR)9激動劑.用于本發(fā)明佐劑或疫苗的寡核苷酸任選地為包含CpG的寡核苷酸，任選地包含兩個或更多個二核苷酸CpG基序，這些基序由至少三個、任選地至少六個或更多個核苷酸分隔。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接鳥嘌呤核苷酸。本發(fā)明的CpG寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在一個實施方案中，寡核苷酸內(nèi)核苷酸間是二硫代磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵，但磷酸二酯鍵和其它核苷酸間鍵也在本發(fā)明范圍內(nèi)。還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是具有混合的核苷酸間鍵的寡核苷酸。用于生產(chǎn)硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US 5,666,153、US5,278,302和WO 95/26204。
寡核苷酸的實例具有以下序列。這些序列任選地包含硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵。
OLIGO 1(SEQ ID NO1)TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826) OLIGO 2(SEQ ID NO2)TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG1758) OLIGO 3(SEQ ID NO3)ACC GAT GAC GTC GCC GGT GACGGC ACC ACG OLIGO 4(SEQ ID NO4)TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTCGTT(CpG 2006) OLIGO 5(SEQ ID NO5)TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668) OLIGO 6(SEQ ID NO6)TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456) 備選的CpG寡核苷酸可包含以上序列，因為它們具有序列內(nèi)無關(guān)緊要的缺失或添加。
本發(fā)明所用的CpG寡核苷酸可通過本領(lǐng)城已知的任一方法合成(例如參見EP 468520)。為方便起見，這些寡核苷酸可利用自動合成儀合成。
佐劑可為水包油乳劑，或者可以包含與其它佐劑組合的水包油乳劑。乳劑系統(tǒng)的油相任選地含有可代謝油。術(shù)語可代謝油的含義在本領(lǐng)域眾所周知?？纱x油可被定義為“能夠通過代謝轉(zhuǎn)化的”(道蘭氏圖解醫(yī)學(xué)詞典，W.B.Sanders Company，第25版，(1974))。所述油可為任何植物油、魚油、動物油或合成油，其對接受者無毒，能夠通過代謝轉(zhuǎn)化。堅果、種子和谷物是常見的植物油來源。合成油也是本發(fā)明的一部分，可包括市售油，例如

等。鯊烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是不飽和油，大量存在于鯊魚肝油中，少量存在于橄欖油、麥胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本發(fā)明的油。鯊烯是可代謝油依據(jù)以下事實其是膽固醇生物合成的中間體(默克索引，第10版，編目流水號8619)。
母育酚(例如維生素E)也經(jīng)常用于油性乳化佐劑(EP 0 382 271B1；US5667784；WO 95/17210)。用于本發(fā)明的油性乳劑(任選地為水包油乳劑)的母育酚可以如EP 0 382 271 B1所述配制，即母育酚可為母育酚液滴分散液，任選地含有乳化劑，任選地低于1μm直徑?；蛘撸赣涌膳c另一種油聯(lián)合使用，以形成油性乳劑的油相。本文描述了可與母育酚聯(lián)合使用的油性乳劑的實例，例如上述可代謝油。
業(yè)已表明，水包油乳劑佐劑自身可用作佐劑組合物(EP 0 399843B)，水包油乳劑和其它活性物質(zhì)的組合也已被描述為疫苗佐劑(WO 95/17210；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)。已表述了其它油性乳化佐劑，例如油包水乳劑(US 5,422,109；E P0 480 982 B2)和水包油包水乳劑(US 5,424，067；EP 0 480 981 B)。所有這些都構(gòu)成了油性乳劑系統(tǒng)(尤其是在摻入母育酚時)，以形成本發(fā)明的佐劑和組合物。
在一個實施方案中，油性乳劑(例如水包油乳劑)還包含乳化劑，例如吐溫80和/或固醇，例如膽固醇。
在一個實施方案中，油性乳劑(任選地水包油乳劑)含有可代謝油；無毒性油，例如角鯊?fù)?、鯊烯或生育酚，例如α生育?和任選地鯊烯和α生育酚這二者)，以及任選的乳化劑(或表面活性劑)，例如吐溫80。還可以包括固醇(例如膽固醇)。
生產(chǎn)水包油乳劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。一般來說，該方法包括將含母育酚的油相與表面活性劑如PBS/吐溫80TM溶液混合，然后用勻漿器進(jìn)行勻漿，對本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)顯而易見的是，包括將混合物兩次通過注射器針頭的方法應(yīng)適于勻化小體積液體。同樣地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可修改在微射流儀(M110S微流體機(jī)器，最多為50個通道，在6巴的最大壓力輸入下2分鐘的時間段(輸出壓力為約850巴))中的乳化方法，以產(chǎn)生更小體積或更大體積的乳劑。該修改可通過常規(guī)實驗完成，包括測量所得乳劑，直到得到具有所需直徑的油滴的制劑。
在水包油乳劑中，油和乳劑應(yīng)處于水性載體中。水性載體可為例如磷酸緩沖鹽水。
在穩(wěn)定的水包油乳劑中存在的油滴大小任選地可小于1微米，可基本上在30-600納米的范圍內(nèi)，任選地基本約30-500納米直徑，任選地基本150-500納米直徑，尤其是約150納米直徑，如按光子相關(guān)光譜學(xué)所測量的。在這點上，以數(shù)目計80％的油滴應(yīng)在該范圍內(nèi)，任選地以數(shù)目計超過90％的油滴和任選地以數(shù)目計超過95％的油滴在限定的尺寸范圍內(nèi)。按照常規(guī)，本發(fā)明的油性乳劑中存在的組分量為0.5-20％或2-10％的油(總劑量體積)，例如鯊烯；且如果有α生育酚則為2-10％；以及0.3-3％的表面活性劑，如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。任選地，油(例如鯊烯):母育酚(例如α-生育酚)的比率等于或小于1，因為這樣提供了更穩(wěn)定的乳劑。諸如吐溫80或司盤85的乳劑也可以以約1％的水平存在。在某些情況下，本發(fā)明的疫苗還包含有穩(wěn)定劑可能是有利的。
乳化系統(tǒng)的實例描述于WO 95/17210、WO 99/11241和WO99/12565，其公開了基于鯊烯、α生育酚和吐溫80的乳化佐劑，其任選地與免疫刺激劑QS21和/或3D-MPL一起配制。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的佐劑可另外含有其它的免疫刺激劑，例如LPS或其衍生物，和/或皂苷。其它免疫刺激劑的實例描述于本文和“Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach”1995，Pharmaceutical Biotechnology，第6卷，Powell，M.F.和Newman，M.J.編輯，Plenum Press，New York and London，ISBN 0-306-44867-X。
在一個實施方案中，本發(fā)明的佐劑和免疫原性組合物包含在上述油性乳劑中的皂苷(例如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL)，任選地具有固醇(例如膽固醇)。另外，油性乳劑(任選地水包油乳劑)可含有司盤85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。含有水包油乳劑、固醇和皂苷的佐劑描述于WO 99/12565。
通常，對于人類給藥而言，皂苷(例如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL)在人類免疫原性組合物劑量中以1μg-200μg/劑存在，例如10-100μg或10μg-50μg/劑。通常，油性乳劑(任選地為水包油乳劑)包含2-10％可代謝油。任選地，其包含2-10％鯊烯、2-10％α生育酚和0.3-3％(任選地0.4-2％)乳劑(任選地吐溫80[聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯])。在鯊烯和α生育酚這二者均存在時，任選地鯊烯與α生育酚的比率等于或小于1，因為這提供了更穩(wěn)定的乳劑。司盤85(山梨糖醇酐三油酸酯)也可以在用于本發(fā)明的乳劑中以0.5-1％的水平存在。在某些情況下，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗還包含穩(wěn)定劑可能是有利的，所述穩(wěn)定劑例如為其它乳化劑/表面活性劑，包括辛酸(默克索引第10版，編目流水號1739)，例如三辛酸甘油酯。
在含有鯊烯和皂苷(任選地為QS21)時，制劑還包含固醇(任選地為膽固醇)是有益的，因為這允許降低乳劑中的總油量。這導(dǎo)致生產(chǎn)成本降低，接種的總體舒適性改善，還定量和定性地改善了所獲免疫應(yīng)答，例如改善了IFN-γ生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的佐劑系統(tǒng)通常包含在200:1-300:1范圍內(nèi)的可代謝油皂苷(重量/重量)比率，還可以以“低油”形式使用本發(fā)明，其任選的范圍為1:1-200:1，任選地為20:1-100:1，或者基本上為48:1，該疫苗保留了所有組分的有益佐劑特性和顯著減少的反應(yīng)原性譜。因此，某些實施方案具有的鯊烯:QS21(重量/重量)比率在1:1-250:1或20:1-200:1或20:1-100:1范圍內(nèi)，或者基本上為48:1。任選地，還包括以如本文所述的皂苷固醇比率存在的固醇(例如膽固醇)。
本發(fā)明的乳化系統(tǒng)任選地具有在亞微米范圍內(nèi)的小油滴尺寸。任選地，油滴尺寸為直徑120-750nm，或直徑120-600nm。
特別有效的佐劑制劑(用于在本發(fā)明的免疫原性組合物中與AlPO4最終組合)包括皂苷(例如QS21)、LPS衍生物(例如3D-MPL)和油性乳劑(例如在水包油乳劑中的鯊烯和α生育酚)，其描述于WO5/17210或WO 99/12565(尤其是在實施例2表1中的佐劑制劑11)。
TLR 2激動劑的實例包括肽聚糖或或脂蛋白。咪唑并喹啉，例如咪喹莫特和雷西莫特，是已知的TLR7激動劑。單鏈RNA也是已知的TLR激動劑(在人中的TLR8和在小鼠中的TLR7)，而雙鏈RNA和聚合IC(聚肌苷酸-聚胞嘧啶核苷酸，其為市售的病毒RNA的合成模擬物)是TLR 3激動劑的示例。3D-MPL是TLR4激動劑的實例，而CPG是TLR9激動劑的實例。
免疫原性組合物可以包含吸附在金屬鹽上的抗原和免疫刺激物。其中抗原和免疫刺激物3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)吸附到相同顆粒上的基于鋁的疫苗制劑描述于EP 0 576 478 B1、EP 0 689 454B1和EP 0 633 784 B1。那么，在這些情況下，抗原首先吸附到鋁鹽上，之后將免疫刺激劑3D-MPL吸附到相同鋁鹽顆粒上。這些方法首先包括在水浴中通過超聲懸浮3D-MPL，直至顆粒達(dá)到80-500nm的尺寸?？乖湫偷卦跀嚢柘掠谑覝卦阡X鹽上吸附1小時。然后將3D-MPL懸浮液加入至吸附的抗原，制劑于室溫溫育1小時，然后保持于4℃，直至使用。
在另一種方法中，免疫刺激物和抗原在單獨的金屬顆粒上，如在EP 1126876中所述。改善的方法包括將免疫刺激物吸附到金屬鹽顆粒上，接著將抗原吸附到另一種金屬鹽顆粒上，之后混合單獨的金屬顆粒，以形成疫苗。用于本發(fā)明的佐劑可為包含免疫刺激物的佐劑組合物，其吸附到金屬鹽顆粒上，特征在于金屬鹽顆粒基本沒有其它抗原。此外，疫苗由本發(fā)明提供，特征在于免疫刺激物吸附到基本沒有其它抗原的金屬鹽顆粒上，以及特征在于吸附抗原的金屬鹽顆?；緵]有其它免疫刺激物。
因此，本發(fā)明提供含有免疫刺激物的佐劑制劑，其已吸附到金屬鹽顆粒上，特征在于組合物基本沒有其它抗原。此外，該佐劑制劑可為中間體，如果使用這樣的佐劑，則其是生產(chǎn)疫苗所必需的。因此，提供一種生產(chǎn)疫苗的方法，包括將為一種或多種吸附到金屬顆粒上的免疫刺激物的佐劑組合物與抗原混合。任選地，抗原可預(yù)先吸附到金屬鹽上。所述金屬鹽可與吸附到免疫刺激物上的金屬鹽相同或相似。任選地，金屬鹽為鋁鹽，例如磷酸鋁或氫氧化鋁。
本發(fā)明還提供一種疫苗組合物，其含有吸附到第一種金屬鹽顆粒上的免疫刺激物和吸附到金屬鹽上的抗原，其特征在于第一種和第二種金屬鹽顆粒為單獨的顆粒。
本文描述的LPS或LOS衍生物或突變或脂質(zhì)A衍生物設(shè)計得比天然脂多糖毒性低(例如3D-MPL)，就本文描述的這些部分的任何用途而言是可互換的等效物。
在一個實施方案中，用于本發(fā)明的組合物的佐劑包含脂質(zhì)體載體(通過已知技術(shù)由磷脂(例如二油酰磷脂酰膽堿[DOPC])和任選的固醇[例如膽固醇]制備)。這些脂質(zhì)體載體可攜帶脂質(zhì)A衍生物[例如3D-MPL，參見上文]和/或皂苷(例如QS21，參見上文)。在一個實施方案中，佐劑含有(每0.5mL劑量)0.1-10mg、0.2-7mg、0.3-5mg、0.4-2mg或0.5-1mg(例如0.4-0.6mg、0.9-1.1mg、0.5mg或1mg)磷脂(例如DOPC)；0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)固醇(例如膽固醇)；5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)；以及5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)皂苷(例如QS21)。
該佐劑尤其適合于老年疫苗制劑。在一個實施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物:4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并還可以包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或全部)疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價不明顯劣于

疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。
在一個實施方案中，用于本發(fā)明組合物的佐劑包含由可代謝油(例如鯊烯)、乳劑(例如吐溫80)和任選的母育酚(例如α生育酚)制備的水包油乳劑。在一個實施方案中，佐劑含有(每0.5mL劑量)0.5-15mg、1-13mg、2-11mg、4-8mg或5-6mg(例如2-3mg、5-6mg或10-11mg)可代謝油(例如鯊烯)；0.1-10mg、0.3-8mg、0.6-6mg、0.9-5mg、1-4mg或2-3mg(例如0.9-1.1mg、2-3mg或4-5mg)乳劑(例如吐溫80)；和任選的0.5-20mg、1-15mg、2-12mg、4-10mg、5-7mg(例如11-13mg、5-6mg或2-3mg)母育酚(例如α生育酚)。
該佐劑任選地還可以包含5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。
這些佐劑尤其適合于嬰兒或老年疫苗制劑。在一個實施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物:4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并還可以包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或全部)疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價不明顯劣于

疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。
該佐劑任選地可含有0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)固醇(例如膽固醇)；5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)；和5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)皂苷(例如QS21)。
該佐劑尤其適合于老年疫苗制劑。在一個實施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物:4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并還可以包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或全部)疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價不明顯劣于

疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。
在一個實施方案中，用于本發(fā)明組合物的佐劑包含磷酸鋁和脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。該佐劑可包含(每0.5mL劑量)100-750μg、200-500μg或300-400μg為磷酸鋁的Al，和5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。
該佐劑尤其適合于老年或嬰兒疫苗制劑。在一個實施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并還可以包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或全部)疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價不明顯劣于

疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。
通過將含有本發(fā)明的免疫原性組合物的疫苗制備物經(jīng)系統(tǒng)或粘膜途徑給藥，所述疫苗可用于保護(hù)或治療對感染易感的哺乳動物。這些給藥可包括經(jīng)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射；或經(jīng)粘膜給予至口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。鼻內(nèi)給予疫苗有可能用于治療肺炎或中耳炎(由于能更有效地阻止肺炎鏈球菌的鼻咽攜帶，因此能在其最早期減弱感染)。盡管本發(fā)明的疫苗可作為單劑給予，但其組分也可以同時或在不同時間一起共給予(例如肺炎鏈球菌糖綴合物可單獨給予、同時給予或在給予疫苗的任何細(xì)菌蛋白組分之后1-2周給予，用于彼此之間免疫應(yīng)答的最佳協(xié)調(diào))。對于共給予，任選的Th1佐劑可存在于任意的或全部的不同給藥中。除了單一給藥途徑之外，還可使用2種不同的給藥途徑。例如，糖或糖綴合物可IM(或ID)給予，細(xì)菌蛋白可IN(或ID)給予。另外，本發(fā)明的疫苗可IM給予初次劑量，IN給予加強(qiáng)劑量。
疫苗中的蛋白抗原的含量通常在1-100μg的范圍內(nèi)，任選地為5-50μg，最通常在5-25μg的范圍內(nèi)。在初始接種后，受試者可接受1次或數(shù)次足夠間隔的加強(qiáng)免疫。
疫苗制劑一般描述于Vaccine Design(“The subunit and adjuvantapproach”(Powell M.F.和Newman M.J.編輯)(1995)Plenum Press NewYork)。在脂質(zhì)體中的囊化描述于Fullerton，美國專利4,235,877。
本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物可儲存在溶液中或凍干儲存。在一個實施方案中，溶液在用作無定形凍干保護(hù)劑的糖存在下凍干，所述糖例如為蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖或乳糖。在一個實施方案中，溶液在用作無定形凍干保護(hù)劑的糖和提供改善的塊狀結(jié)構(gòu)的填充劑(例如甘氨酸或甘露醇)存在下凍干。晶體填充劑的存在允許在高鹽濃度存在下縮短凍干周期。用于凍干本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗的這些混合物的實例包括蔗糖/甘氨酸、海藻糖/甘氨酸、葡萄糖/甘氨酸、甘露糖/甘氨酸、麥芽糖/甘氨酸、蔗糖/甘露醇/海藻糖/甘露醇、葡萄糖/甘露醇、甘露糖/甘露醇以及麥芽糖/甘露醇。典型地，兩種成分的摩爾比率任選地為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:6。本發(fā)明的免疫原性組合物任選地含有上述凍干試劑。
上述穩(wěn)定劑和穩(wěn)定劑的混合物還可以包括能夠增加制劑的玻璃化溫度(Tg’)的聚合物，例如聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、羥乙基淀粉或葡聚糖，或者用作晶體填充劑的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，例如具有1500-6000分子量的聚乙二醇，和葡聚糖。
本發(fā)明的免疫原性組合物任選地被凍干，并在使用前臨時重配。凍干可產(chǎn)生更穩(wěn)定的組合物(疫苗)，并在存在3D-MPL和沒有基于鋁的佐劑的情況下可能產(chǎn)生更高的抗體效價。
在本發(fā)明的一個方面，提供一種疫苗藥盒，其包括含有本發(fā)明的免疫原性組合物(任選地為凍干形式)的小瓶，并還包括含有本文所述佐劑的小瓶?？深A(yù)見的是，在本發(fā)明的該方面，佐劑將用于重配凍干的免疫原性組合物。
盡管本發(fā)明的疫苗可通過任何途徑給予，但將所述疫苗給予到皮膚中(ID)構(gòu)成了本發(fā)明的一個實施方案。人皮膚含有外“角狀”表皮，叫做角質(zhì)層，其覆蓋表皮。在此表皮下面是叫做真皮的層，其又覆蓋皮下組織。研究者已表明，將疫苗注射到皮膚中，尤其是真皮中，刺激免疫應(yīng)答，其還可能與許多其它優(yōu)勢有關(guān)。用本文所述疫苗皮內(nèi)接種構(gòu)成了本發(fā)明的可選特征。
皮內(nèi)注射的常規(guī)技術(shù)“芒圖操作(mantoux procedure)”包括下述步驟清潔皮膚，然后伸出一只手，使小號針(26-31號)的斜面朝上，以10-15°的角度將針插入。一旦針斜面被插入，就降低針管并前推，同時輕壓使其在皮膚下抬高。然后將液體非常緩慢地注入，這樣便在皮膚表面上形成一個大包或腫塊，接著緩慢抽出針。
近來，已描述了特別設(shè)計用于皮內(nèi)或通過皮膚給予液體制劑的裝置，例如在WO 99/34850和EP 1092444中描述的裝置，以及例如在WO 01/13977、US 5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537中描述的噴射注射裝置。疫苗制劑的真皮內(nèi)給藥替代方法可包括常規(guī)注射器和針，或設(shè)計用于固體疫苗的彈道式給藥的裝置(WO 99/27961)，或透皮貼劑(WO 97/48440；WO 98/28037)；或皮膚表面給藥(經(jīng)真皮或經(jīng)皮傳送，WO 98/20734；WO 98/28037)。
當(dāng)本發(fā)明的疫苗給予皮膚時，或更具體地說給予到真皮中時，疫苗為小液體體積，具體地說為約0.05ml至0.2ml的體積。
本發(fā)明皮膚或皮內(nèi)疫苗中的抗原含量可類似于肌內(nèi)疫苗中存在的常規(guī)劑量(參見上文)。然而，皮膚或皮內(nèi)疫苗的一個特點是制劑可以為“低劑量”。因此，“低劑量”疫苗中的蛋白抗原任選地以低至每劑0.1-10μg或0.1-5μg存在；糖(任選綴合的)抗原可以每劑0.01-1μg或0.01-0.5μg糖存在。
此處所用的術(shù)語“皮內(nèi)傳送”是指將疫苗給至皮膚的真皮區(qū)域。然而，疫苗不一定僅定位于真皮內(nèi)。真皮層是距離人體皮膚表面約1.0mm至約2.0mm的皮層，但個體之間和機(jī)體的不同部位之間存在一定量的差異。一般地，預(yù)計疫苗可以通過進(jìn)入皮膚表面下1.5mm達(dá)到真皮層。真皮位于在表面的角質(zhì)層和表皮與下面的皮下層之間。根據(jù)給藥模式，可以使疫苗最終僅存在于或主要存在于真皮內(nèi)，或最終可分布于表皮和真皮內(nèi)。
本發(fā)明還通過加入為游離或綴合形式的流感嗜血菌蛋白如D蛋白提供預(yù)防或減輕流感嗜血菌所致中耳炎的改良疫苗。另外，本發(fā)明還通過依靠向本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合組合物加入為游離或綴合蛋白的一種或兩種肺炎鏈球菌蛋白提供在嬰兒中預(yù)防或減輕肺炎鏈球菌感染(例如中耳炎)的改良疫苗。所述肺炎鏈球菌游離蛋白可與用作載體蛋白的任何肺炎鏈球菌蛋白相同或不同。一種或多種卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)蛋白抗原也可以游離或綴合形式包含在聯(lián)合疫苗中。因此，本發(fā)明為在嬰兒中激發(fā)抵御中耳炎的(保護(hù)性)免疫應(yīng)答的改良方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為通過給予安全有效量的本發(fā)明疫苗[兒科疫苗]在嬰兒(在本發(fā)明背景下定義為0-2歲)中激發(fā)(保護(hù)性)免疫應(yīng)答的改良方法。此外，本發(fā)明的實施方案包括提供用于藥物的本發(fā)明的抗原性肺炎鏈球菌綴合組合物以及本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合物在制造用于預(yù)防(或治療)肺炎鏈球菌疾病的藥物中的用途。
在又一個實施方案中，本發(fā)明為通過給予安全有效量的本發(fā)明疫苗，任選地連同一種或兩種作為游離或綴合蛋白存在的肺炎鏈球菌蛋白，在老年人群(在本發(fā)明背景下患者如果為50歲或以上、通常超過55歲以及更通常超過60歲，則被視為老年人)中激發(fā)(保護(hù)性)免疫應(yīng)答的改良方法，所述游離的肺炎鏈球菌蛋白可與用作載體蛋白的任何肺炎鏈球菌蛋白相同或不同。
本發(fā)明的又一方面是免疫人類宿主抵御肺炎鏈球菌和任選地流感嗜血菌感染所致疾病的方法，該方法包括給予宿主免疫保護(hù)劑量的本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或藥盒。
本發(fā)明的又一方面為用于治療或預(yù)防肺炎鏈球菌和任選地流感嗜血菌感染所致疾病的免疫原性組合物。
本發(fā)明的又一方面為本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或藥盒在制造用于治療或預(yù)防肺炎鏈球菌和任選的流感嗜血菌感染所致疾病的藥物中的用途。
在所有情況下，本發(fā)明人都意欲用術(shù)語“由......組成”分別任選地取代本文的術(shù)語“包含”、“含有”和“包括”。
涉及本發(fā)明的“疫苗組合物”的本文的實施方案也適用于與本發(fā)明的“免疫原性組合物”相關(guān)的實施方案，反之亦然。
在本專利說明書中提及的所有參考文獻(xiàn)或?qū)＠暾埗纪ㄟ^引用結(jié)合到本文中。
為了可更好地理解本發(fā)明，提供以下實施例。這些實施例僅是為了闡述目的，無意以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例 實施例1D蛋白的表達(dá) 流感嗜血菌D蛋白 用于D蛋白表達(dá)的遺傳構(gòu)建 起始物質(zhì) 編碼D蛋白的DNA D蛋白在所有血清型以及非分型的流感嗜血菌菌株中都高度保守。含有整個D蛋白基因編碼DNA序列的載體pHIC348由A.Forsgren博士，Department of Medical Microbiology，University of Lund，

General Hospital，

Sweden處獲得。D蛋白的DNA序列由Janson等，(1991)Infect.Immun.59119-125發(fā)表。
表達(dá)載體pMG1 表達(dá)載體pMG1為pBR322衍生物(Gross等，1985)，其中導(dǎo)入了來源于噬菌體λ的控制元件，該控制元件用于外源插入基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯(Shatzman等，1983)。此外，氨芐青霉素抗性基因被替換成卡那霉素抗性基因。
大腸桿菌菌株AR58 用預(yù)先在SA500衍生物(galE::TN10，λKil- cI857 ΔH1)中生長的P1噬菌體原液轉(zhuǎn)導(dǎo)N99產(chǎn)生大腸桿菌菌株AR58。N99和SA500為大腸桿菌K12菌株，得自國立衛(wèi)生研究所(NIH)的Martin Rosenberg博士實驗室。
表達(dá)載體pMG1 為生產(chǎn)D蛋白，將編碼該蛋白的DNA克隆到表達(dá)載體pMG1中。該質(zhì)粒使用λ噬菌體DNA的信號來驅(qū)動插入的外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。該載體含有啟動子PL、操縱子OL和2個可用位點(NutL和NutR)，從而在提供N蛋白時緩解轉(zhuǎn)錄極性效應(yīng)(Gross等，1985)。將含有PL啟動子的載體引入一種大腸桿菌溶原性宿主，以穩(wěn)定質(zhì)粒DNA。溶原性宿主菌株含有整合到基因組中的復(fù)制缺陷型λ噬菌體DNA(Shatzman等，1983)。染色體中的λ噬菌體DNA可引導(dǎo)cI阻抑蛋白的合成，cI蛋白結(jié)合載體的OL阻抑物，阻止RNA聚合酶與PL啟動子結(jié)合，從而防止插入基因轉(zhuǎn)錄。表達(dá)菌株AR58的cI基因含有溫度敏感性突變，使得可通過溫度變化來調(diào)控PL引導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，即提高培養(yǎng)溫度可使阻抑物失活，并開始合成外源蛋白。該表達(dá)系統(tǒng)可使外源蛋白(尤其是可能對細(xì)胞有毒性的那些外源蛋白)受控合成(Shimataka和Rosenberg，1981)。
大腸桿菌菌株AR58 用于產(chǎn)生D蛋白載體的AR58溶原性大腸桿菌菌株為標(biāo)準(zhǔn)NIH大腸桿菌K12菌株N99(F- su- galK2，lacZ- thr-)的衍生物。它含有缺陷型溶原性λ噬菌體(galE::TN10，λKil- cI857 ΔH1)。Kil-表型防止宿主停止合成大分子。cI857突變賦予cI阻抑物溫度敏感性損傷。ΔH1缺失去除λ噬菌體的右側(cè)操縱子以及宿主的bio、uvr3和chlA基因座。用預(yù)先在SA500衍生物(galE::TN10，lambdaKil- cI857 ΔH1)中生長的P1噬菌體原液轉(zhuǎn)導(dǎo)N99產(chǎn)生AR58菌株。由于galE基因附近存在編碼四環(huán)素抗性的TN10轉(zhuǎn)座子，因而可利用四環(huán)素對N99中缺陷型溶菌原的導(dǎo)入情況進(jìn)行選擇。
載體pMGMDPPrD的構(gòu)建 使用含有流感病毒非結(jié)構(gòu)S1蛋白編碼基因的pMG1載體(pMGNSI)構(gòu)建pMGMDPPrD。利用在5′和3′端分別含有NcoI與XbaI限制位點的PCR引物經(jīng)PCR由pHIC348載體(Janson等，1991，Infect.Immun.59:119-125)擴(kuò)增D蛋白基因。然后將NcoI/XbaI片段引入到pMGNS1的NcoI與XbaI之間，由此產(chǎn)生含有NS1蛋白的N端81個氨基酸并后接PD蛋白的融合蛋白。該載體稱為pMGNS1PrD。
基于上述構(gòu)建體產(chǎn)生用于D蛋白表達(dá)的最終構(gòu)建體。從pMGNS1PrD中去除BamHI/BamHI片段。該DNA水解反應(yīng)去除除前3個N端殘基之外的NS1編碼區(qū)。在該載體重新連接時，產(chǎn)生編碼具有以下N端氨基酸序列的融合蛋白的基因: -----MDP SSHSSNMANT----- NS1 D蛋白 D蛋白不含有前導(dǎo)肽或通常連接有脂鏈的N端半胱氨酸。因此，該蛋白不會被分泌到周質(zhì)中，也不會被脂化，而是以可溶形式保留在細(xì)胞質(zhì)中。
通過于37℃熱激將最終構(gòu)建體pMG-MDPPrD導(dǎo)入到AR58宿主菌株中。在卡那霉素存在下選擇含有質(zhì)粒的細(xì)菌。用選定的內(nèi)切核酸酶消化分離的質(zhì)粒DNA來證實編碼DNA插入序列的D蛋白的存在。重組的大腸桿菌菌株稱為ECD4。
D蛋白的表達(dá)處于λ PL啟動子/OL操縱子控制之下。宿主菌株AR58的基因組中含有溫度敏感性cI基因，該基因在低溫下可通過與OL結(jié)合來阻斷由λ PL啟動的表達(dá)。一旦溫度提高，cI就由OL釋放，D蛋白得以表達(dá)。
小規(guī)模制備 在發(fā)酵結(jié)束時，可將細(xì)胞濃縮并冷凍。
如下進(jìn)行收集細(xì)胞的提取和D蛋白純化。將冷凍的細(xì)胞培養(yǎng)物解凍，并重懸于細(xì)胞裂解液(檸檬酸鹽緩沖液，pH 6.0)中，使最終OD650＝60。使該懸浮液兩次流經(jīng)P＝1000bar的高壓勻漿器。通過離心澄清細(xì)胞培養(yǎng)物勻漿，并過濾去除細(xì)胞碎片。在第一個純化步驟中，將過濾的裂解物上樣于陽離子交換層析柱(SP Sepharose Fast Flow)。PD可通過離子作用與凝膠基質(zhì)結(jié)合，并可通過增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度的步驟洗脫P(yáng)D。
在第二個純化步驟中，雜質(zhì)保留在陰離子交換基質(zhì)(Q SepharoseFast Flow)上。PD未結(jié)合到凝膠上，并可收集在流出物中。
兩個柱層析步驟均利用OD監(jiān)測分部收集物。通過超濾濃縮含有純化的D蛋白的陰離子交換柱層析的流出物。
最后，使含有D蛋白的超濾保留物通過0.2μm膜。
大規(guī)模制備 如下進(jìn)行收集細(xì)胞的提取和D蛋白的純化。冷卻收集的培養(yǎng)液，并直接通過約800bar壓力的高壓勻漿器2次。
在第一個純化步驟中，稀釋細(xì)胞培養(yǎng)物勻漿物，并上陽離子交換層析柱(SP Sepharose Big beads)。PD通過離子作用結(jié)合凝膠基質(zhì)，通過增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度的步驟洗脫P(yáng)D，并過濾。
在第二個純化步驟中，雜質(zhì)保留在陰離子交換基質(zhì)(Q SepharoseFast Flow)上。PD未結(jié)合到凝膠上，并可收集在流出物中。
兩個柱層析步驟均利用OD監(jiān)測分部收集物。通過超濾濃縮并滲濾含有純化的D蛋白的陰離子交換柱層析的流出物。
最后，使含有D蛋白的超濾保留物通過0.2μm膜。
實施例1bPhtD的表達(dá) PhtD蛋白是肺炎鏈球菌組氨酸三聯(lián)體(Pht)蛋白家族的成員，其特征在于存在組氨酸三聯(lián)體(HXXHXH基序)。PhtD是838個氨基酸的分子，具有5個組氨酸三聯(lián)體(參見MedImmune WO 00/37105 SEQ IDNO4的氨基酸序列和SEQ ID NO5的DNA序列)。PhtD還在中部(氨基酸位置348-380)含有富集脯氨酸的區(qū)域。PhtD具有20個氨基酸的N末端信號序列和LXXC基序。
遺傳構(gòu)建體 使用攜帶pλ啟動子的自制pTCMP14載體將成熟的MedImmunePhtD蛋白(由氨基酸21至氨基酸838)的基因序列重組轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中。大腸桿菌宿主菌株為AR58，其攜帶cI857熱敏感性阻抑物，允許熱誘導(dǎo)啟動子。
實施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以由MedImmune質(zhì)粒擴(kuò)增phtD基因(攜帶肺炎鏈球菌菌株Norway 4(血清型4)的phtD基因-如在WO00/37105中所述的SEQ ID NO5)。僅對phtD基因特異性的引物用于擴(kuò)增兩個片段中的phtD基因。引物攜帶NdeI和KpnI限制位點或KpnI和XbaI限制位點。這些引物不與該載體的任何核苷酸雜交，而是僅與phtD特異性基因序列雜交。使用攜帶NdeI限制位點的第一個引物插入人工ATG起始密碼子。然后將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物插入到pGEM-T克隆載體(Promega)中，并檢驗DNA序列。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在TCMP14表達(dá)載體中實現(xiàn)片段亞克隆，并將載體轉(zhuǎn)化入AR58大腸桿菌中。
PhtD純化 如下實現(xiàn)PhtD純化 □ 在卡那霉素存在下大腸桿菌細(xì)胞的生長:于30℃生長30小時，然后于39.5℃溫育18小時。
□ 在作為蛋白酶抑制劑的5mM EDTA和2mM PMSF存在下以O(shè)D±115由完整培養(yǎng)物破碎大腸桿菌細(xì)胞:Rannie，2次通過，1000bar。
□ 于室溫(20℃)用膨脹床模式Streamline Q XL層析去除抗原捕獲物和細(xì)胞碎片；柱子用NaCl 150mM+Empigen 0.25％ pH 6.5洗滌，并用NaCl 400mM+Empigen 0.25％的25mM磷酸鉀緩沖液pH 7.4溶液洗脫。
□ 用Sartobran 150濾器(0.45+0.2μm)過濾。
□ 在5mM咪唑存在下于4℃抗原結(jié)合在螯合Zn++的Sepharose FFIMAC層析柱pH 7.4上；該柱用5mM咪唑和1％ Empigen洗滌，并用50mM咪唑洗脫，二者均在25mM磷酸鉀緩沖液pH8.0中。
□ 以陽離子模式在Fractogel EMD DEAE pH 8.0(25mM磷酸鉀)上于4℃進(jìn)行弱陰離子交換層析；該柱用140mM NaCl洗滌，并用200mM NaCl洗脫，同時雜質(zhì)(蛋白和DNA)仍吸附在交換劑上。
□ 用50kDa膜以2mM磷酸鈉/鉀pH 7.15濃縮和超濾。
□ 純化的半成品經(jīng)0.2μm Millipak-20濾器除菌過濾。
實施例1c:肺炎鏈球菌溶血素的表達(dá) 如在WO2004/081515和WO2006/032499中所述制備和解毒肺炎鏈球菌性肺炎鏈球菌溶血素。
實施例2 綴合物的制備 在本領(lǐng)域眾所周知如何制備純化的肺炎鏈球菌多糖。就這些實施例而言，多糖基本如EP072513所述制備，或者通過緊密相關(guān)的方法制備。在綴合前，多糖可通過如下所述的微流化調(diào)整大小。
活化和偶聯(lián)條件對每一種多糖都是特異性的。這些條件在表1中給出。將調(diào)整過大小的多糖(PS5、6B和23F除外)溶解在2M NaCl、0.2M NaCl或注射用水(WFI)中。評估所有血清型的最佳多糖濃度。除血清型18C之外的所有血清型都如下詳述與載體蛋白直接綴合。產(chǎn)生2種替代血清型22F綴合物，1種直接綴合，1種通過ADH接頭綴合。
將100mg/ml CDAP在乙腈或乙腈/水50％/50％溶液中的母液(CDAP/PS比率為0.5-1.5mg/mg PS)加入多糖溶液。1.5分鐘后，加入0.2M-0.3M NaOH，以獲得特定活化pH。在此pH于25℃在3分鐘內(nèi)進(jìn)行多糖的活化。將純化的蛋白(D蛋白、PhtD、肺炎鏈球菌溶血素或DT)(其量取決于初始PS/載體蛋白的比值)加入活化的多糖中，在該特定pH于pH調(diào)節(jié)下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)達(dá)2小時(取決于血清型)。為了猝滅未反應(yīng)的氰酸酯基團(tuán)，然后將2M甘氨酸溶液加入混合物。調(diào)節(jié)pH至猝滅pH(pH 9.0)。于25℃攪拌溶液30分鐘，然后在持續(xù)的緩慢攪拌下于2-8℃過夜。
18C的制備 18C經(jīng)接頭己二酸二酰肼(ADH)與載體蛋白連接。多糖血清型18C在綴合前被微流化。
用EDAC衍生化破傷風(fēng)類毒素 為衍生化破傷風(fēng)類毒素，用0.2M NaCl將純化的TT稀釋至25mg/ml，加入ADH間隔臂，以便達(dá)到0.2M終濃度。當(dāng)間隔臂完全溶解時，將pH調(diào)節(jié)至6.2。然后加入EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺)，以達(dá)到0.02M終濃度，在pH調(diào)節(jié)下攪拌混合物1小時。通過于25℃增加pH至9.0達(dá)至少30分鐘終止縮合反應(yīng)。
然后滲濾衍生化的TT(10kDa CO膜)，以便去除殘余的ADH和EDAC試劑。
最后除菌過濾TTAH半成品，直至偶聯(lián)步驟，并儲存于-70℃。
TTAH與PS 18C的化學(xué)偶聯(lián) 詳細(xì)的綴合參數(shù)可見于表1。
以限定的濃度用水稀釋2g微流化PS，并通過加入NaCl粉末調(diào)節(jié)至2M NaCl。
加入CDAP溶液(100mg/ml，在50/50體積/體積乙腈/WFI中新鮮制備)，以達(dá)到適宜的CDAP/PS比率。
通過加入0.3M NaOH將pH升高至活化pH 9.0，并在此pH穩(wěn)定，直至加入TTAH。
3分鐘后，加入衍生化的TTAH(20mg/ml的0.2M NaCl溶液)，以使TTAH/PS比率達(dá)到2；將pH調(diào)節(jié)至偶聯(lián)pH 9.0。在pH調(diào)節(jié)下靜置溶液1小時。
對于猝滅，向混合物PS/TTAH/CDAP加入2M甘氨酸溶液。
調(diào)節(jié)pH至猝滅pH(pH 9.0)。
溶液于25℃攪拌30分鐘，然后在連續(xù)緩慢攪拌下于2-8℃靜置過夜。
PS22FAH-PhtD綴合物 在用于該糖的第二種綴合方法(第一種為表1中顯示的直接PS22-PhtD綴合方法)中，22F與載體蛋白經(jīng)接頭己二酸二酰肼(ADH)連接。多糖血清型22F在綴合前被微流化。
PS22F衍生化 活化和偶聯(lián)在連續(xù)攪拌下于25℃在控溫水浴中進(jìn)行。
稀釋微流化的PS22F，以獲得在0.2M NaCl中6mg/ml的最終PS濃度，用0.1N HCl將該溶液調(diào)節(jié)至pH 6.05±0.2。
加入CDAP溶液(100mg/ml，在50/50的乙腈/WFI中新鮮制備)，以達(dá)到適宜的CDAP/PS比率(1.5/1重量/重量)。
通過加入0.5M NaOH將pH升高至活化pH 9.00±0.05，并穩(wěn)定在此pH，直至加入ADH。
3分鐘后，加入ADH，以達(dá)到適宜的ADH/PS比率(8.9/1重量/重量)；將pH調(diào)節(jié)至偶聯(lián)pH 9.0。在pH調(diào)節(jié)下靜置溶液1小時。
濃縮并滲濾PSAH衍生物。
偶聯(lián) 向PS22FAH衍生物加入10mg/ml在0.2M NaCl中的PhtD，以便達(dá)到4/1(重量/重量)的PhtD/PS22FAH比率。用HCl將pH調(diào)節(jié)至5.0±0.05。在10分鐘內(nèi)(250μl/分鐘)手動加入EDAC溶液(20mg/ml的0.1M Tris-HCl溶液，pH 7.5)，以達(dá)到1mg EDAC/mg PS22FAH。所獲溶液在攪拌和pH調(diào)節(jié)下于25℃溫育150分鐘(盡管也可以使用60分鐘)。通過加入1M Tris-HCl pH 7.5(1/10終體積)中和溶液，并于25℃靜置30分鐘。
在Sephacryl S400HR上洗脫前，使用5μm Minisart濾器澄清綴合物。
獲得的綴合物具有4/1(重量/重量)的最終PhtD/PS比率，游離PS含量在1％以下，抗原性(α-PS/α-PS)為36.3％，抗PhtD抗原性為7.4％。
綴合物的純化 使用用0.15M NaCl(對于18C為S500HR)平衡的SephacrylS400HR凝膠過濾柱通過凝膠過濾柱純化綴合物，以去除小分子(包括DMAP)和未綴合的PS和蛋白?；诜磻?yīng)組分的不同分子量大小，首先洗脫出PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎鏈球菌溶血素或PS-DT綴合物，之后洗脫出游離PS，然后洗脫出游離PD或游離DT，最后洗脫出DMAP和其它鹽(NaCl、甘氨酸)。
含有綴合物的級分通過UV280nm檢測。按照其Kd合并級分，除菌過濾(0.22μm)，并儲存于+2-8℃。測定綴合制備物中的PS/蛋白比率。
PS肺炎鏈球菌-D蛋白/TT/DT/PhtD/Ply綴合物的特異性活化/偶聯(lián)/猝滅條件 其中出現(xiàn)在行標(biāo)題中的“μfluid”表示糖在綴合前通過微流化調(diào)整大小。微流化后的糖的尺寸在表2中給出。
表1 PS肺炎鏈球菌-D蛋白/TT/DT/PhtD/Ply綴合物的特異性活化/偶聯(lián)/猝滅條件 備注pHa、c、q分別對應(yīng)于活化pH、偶聯(lián)pH和猝滅pH。
鑒定 對每一綴合物進(jìn)行鑒定，它們都符合表2中描述的標(biāo)準(zhǔn)。用Resorcinol檢測法檢測多糖含量(μg/ml)，用Lowry檢測法檢測蛋白含量(μg/ml)。用濃度比值確定最終的PS/PD比值(重量/重量)。
游離多糖含量(％) 將綴合物與α-載體蛋白抗體和飽和硫酸銨溫育，之后離心，得到上清液，確定該上清液保持于4℃或在37℃儲存7天時綴合物的游離多糖含量。
用α-PS/α-PS ELISA定量上清液中的游離多糖。沒有綴合物也通過α-載體蛋白/α-PS ELISA控制。
抗原性 用夾心型ELISA分析同一綴合物的抗原性，其中捕獲抗體和檢測抗體分別為α-PS和α-蛋白。
游離蛋白含量(％) 未綴合的載體蛋白可在純化步驟中由綴合物分離。游離的殘余蛋白的含量使用大小排阻層析(TSK 5000-PWXL)繼之以UV檢測(214nm)來測定。洗脫條件允許分離游離載體蛋白和綴合物。然后相對于校準(zhǔn)曲線(由0至50μg/ml載體蛋白)測定綴合物原液中的游離蛋白含量。游離載體蛋白％如下獲得％游離載體＝(游離載體(μg/ml)/(通過Lowry法檢測的對應(yīng)載體蛋白的總濃度(μg/ml)*100％)。
穩(wěn)定性 對于保持于4℃和于37℃儲存7天的綴合物，用HPLC-SEC凝膠過濾(TSK 5000-PWXL)檢測分子量分布(Kav)和穩(wěn)定性。
10/11/13/14價特征在表2中給出(參見其下的注釋)。
蛋白綴合物可吸附到磷酸鋁上，并合并，以形成最終疫苗。
結(jié)論 已生產(chǎn)出免疫原性綴合物，以后表明其為有前景的疫苗的組分。
表2-綴合物的表征
*天然PS微流化后的PS大小 通過混合血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F綴合物(例如以每份人劑量分別1、3、1、1、1、1、1、3、3、1μg糖的劑量)制備10價疫苗。通過又加入表5的血清型3綴合物(例如以每份人劑量1μg糖)制備11價疫苗。通過又加入以上的血清型19A和22F綴合物(22F直接連接至PhtD，或者通過ADH接頭連接)[例如以每份人劑量各3μg糖的劑量]制備13價疫苗?？梢酝ㄟ^又加入以上的血清型6A綴合物[例如以每份人劑量1μg糖的劑量]制備14價疫苗。
實施例3在本發(fā)明的免疫原性組合物中包含流感嗜血菌D蛋白的證據(jù)可提供抵御急性中耳炎(AOM)的改善的保護(hù)作用 研究設(shè)計 研究使用11Pn-PD疫苗，其含有血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F，每種血清型均綴合流感嗜血菌的D蛋白(參閱實施例4中的表5)。將受試者隨機(jī)分為2組，以在約3、4、5和12-15月齡時接受4劑11Pn-PD疫苗或Havrix。所有受試者都在3、4和5月齡時伴隨接受GSK生物制品公司的Infanrix-hexa(DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。Infanrix-hexa是在給藥前混合的Pediarix和Hib的組合。在給予第3劑疫苗后2周開始“依照方案”的隨訪效力分析，并持續(xù)至24-27月齡。在選定的受試者亞組中評價肺炎鏈球菌和流感嗜血菌的鼻咽攜帶情況。
如果孩子生病、耳痛、鼓膜自發(fā)穿孔或自發(fā)耳溢液，則建議孩子的雙親咨詢研究者。如果研究者懷疑AOM事件，則立即將孩子轉(zhuǎn)移至耳鼻喉(ENT)專業(yè)醫(yī)師處證實診斷結(jié)果。
AOM的臨床診斷基于目測鼓膜外觀(即發(fā)紅、膨脹、失去光反射)或存在中耳液體滲漏(通過簡易耳鏡或氣式耳鏡或通過顯微鏡證實)。另外，必須存在以下幾項體征或癥狀中的至少兩種:耳痛、耳溢液、聽力喪失、發(fā)燒、嗜睡、過敏、食欲不振、嘔吐或腹瀉。如果ENT專業(yè)醫(yī)師證實臨床診斷結(jié)果，則通過鼓膜穿刺術(shù)收集中耳液的標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗。
對于因復(fù)發(fā)疾病就診的受試者，如果自先前的事件開始以后已過去了30天以上，則認(rèn)為新的AOM事件已開始。另外，如果分離的細(xì)菌/血清型不同于先前的分離株，則AOM事件被認(rèn)為是新細(xì)菌事件，無論兩個聯(lián)系事件之間的間隔是多少。
試驗結(jié)果 招募了總共4968名嬰兒，11Pn-PD組中2489名，對照組中2479名。兩組之間的個人背景特征或風(fēng)險因素沒有顯著差異。
臨床事件和AOM病例定義 在依照方案的隨訪期當(dāng)中，在11Pn-PD組中記錄到總共333件臨床AOM事件，在對照組中記錄到499件。
表3提供了11Pn-PD疫苗和先前在芬蘭測試的兩種7價疫苗(Eskola等，N Engl J Med 2001；344403-409和Kilpi等，Clin Infect Dis2003 371155-64)抗任何AOM事件和由不同肺炎鏈球菌血清型、流感嗜血菌、NTHi和卡他莫拉菌(M.catarrhalis)所致的AOM的保護(hù)效力。采用11Pn-PD，統(tǒng)計學(xué)顯著性和臨床相關(guān)性降低至整體AOM疾病負(fù)荷的33.6％，與病因無關(guān)(表3)。
歸于11Pn-PD疫苗中包含的11種肺炎鏈球菌血清型中的任一種的抗AOM事件的整體效力為57.6％(表3)。
該研究的另一個重要發(fā)現(xiàn)是由11Pn-PD疫苗提供的抗流感嗜血菌所致AOM的35.6％的保護(hù)作用(具體地說由NTHi提供35.3％的保護(hù)作用)。該發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義，給出了在肺炎鏈球菌綴合物接種世代作為AOM主因的流感嗜血菌的重要性增加。與抗AOM提供的保護(hù)作用相一致，11Pn-PD疫苗也降低了在生命的第2年在加強(qiáng)劑量后的流感嗜血菌的鼻咽攜帶情況。這些發(fā)現(xiàn)與先前在芬蘭的觀察結(jié)果相反，在芬蘭，對于兩種7價肺炎鏈球菌綴合疫苗，觀察到歸因于流感嗜血菌的AOM事件增加，(Eskola等和Kilpi等)，以病因取代為證。
在歸于Hi的抗AOM事件的保護(hù)作用與抗載體蛋白D的抗體水平之間不能建立清晰關(guān)聯(lián)，因為在仍無Hi AOM事件的11Pn-PD接種者中的初免后抗PD IgG抗體濃度與在效力隨訪期當(dāng)中發(fā)展出至少一種Hi AOM事件的11Pn-PD接種者中的初免后抗PD IgG抗體水平基本相同。然而，盡管在疫苗的生物學(xué)影響和初免后IgG抗PD免疫原性之間不能建立關(guān)聯(lián)，但可以合理地假定在流感嗜血菌之間高度保守的PD載體蛋白較大程度地有助于誘導(dǎo)抗Hi的保護(hù)作用。
對AOM疾病的作用伴隨著對鼻咽攜帶的作用，后一作用對于疫苗血清型肺炎鏈球菌和流感嗜血菌具有相似的程度(圖1)。在PD綴合物接種者中流感嗜血菌的鼻咽攜帶情況的這種下降支持以下假設(shè):PD綴合疫苗具有抗流感嗜血菌的直接保護(hù)作用，即便這種保護(hù)作用與通過ELISA檢測的抗PD IgG免疫應(yīng)答沒有關(guān)聯(lián)。
在以下的試驗中，使用栗鼠中耳炎模型和用該實施例的11價制劑或?qū)嵤├?的10價疫苗(另參見表1和2以及其下的備注)免疫的嬰兒的血清合并液。兩種合并液誘導(dǎo)的患有中耳炎的動物百分率顯著低于免疫前血清合并液。在10價和11價免疫合并液之間沒有顯著差異。這表明兩種疫苗在該模型中誘導(dǎo)抗非分型流感嗜血菌所致中耳炎的保護(hù)作用的潛力相似。

實施例4: 用于血清型19F的載體蛋白的選擇 使用的ELISA測定 22F抑制ELISA方法基本上基于Concepcion和Frasch在2001年所提出的測定，并由Henckaerts等，2006，Clinical and VaccineImmunology 13356-360報道。簡而言之，純化的肺炎鏈球菌多糖與甲基化人血清白蛋白混合，并于4℃過夜吸附到Nunc MaxisorpTM(Roskilde，DK)高結(jié)合免疫滴定板。該板用10％胎牛血清(FBS)的PBS溶液在攪拌下于室溫封閉1小時。血清樣品用含10％FBS、10μg/mL細(xì)胞壁多糖(SSI)和2μg/mL肺炎鏈球菌多糖血清型22F(ATCC)的PBS稀釋，并在微量滴定板上用相同緩沖液進(jìn)一步稀釋。以相同方式處理內(nèi)標(biāo)并納入每塊板，內(nèi)標(biāo)在89-SF中使用血清型特異性IgG濃度對標(biāo)準(zhǔn)血清89-SF校準(zhǔn)。在洗滌后，使用綴合過氧化物酶的抗人IgG單克隆抗體(Stratech Scientific Ltd.，Soham，UK)檢測結(jié)合抗體，所述單克隆抗體用10％ FBS(在PBS中)稀釋，并在攪拌下于室溫溫育1小時。使用現(xiàn)成的單組分四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶免疫測定底物試劑盒(BioRad，Hercules，CA，US)在暗室中于室溫顯色。用H2SO4 0.18M終止反應(yīng)，于450nm讀取光密度。通過參比內(nèi)標(biāo)血清曲線的限定限度內(nèi)的光密度點計算樣品中血清型特異性IgG濃度(μg/mL)，該內(nèi)標(biāo)血清曲線通過用SoftMax ProTM(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)軟件計算的4參數(shù)邏輯斯蒂對數(shù)方程建立。在考慮檢測限度和定量限度的情況下，對所有血清型的ELSIA截取值都為0.05μg/mL IgG。
調(diào)理吞噬測定 在2003年6月的WHO磋商會上，推薦使用如Romero-Steiner等，Clin Diagn Lab Immunol 2003 10(6)1019-1024頁陳述的OPA測定。該方案用于在以下測試中檢驗血清型的OPA活性。
綴合物的制備 在研究11Pn-PD&Di-001和11Pn-PD&Di-007中，包括3種11價疫苗制劑(表4)，其中3μg的19F多糖綴合白喉類毒素(19F-DT)，而不是1μg多糖綴合D蛋白(19F-PD)。用于研究11Pn-PD、11Pn-PD&Di-001和11Pn-PD&Di-007的綴合參數(shù)分別公開于表5、6和7。
在用這些19F-DT制劑初免后1個月的抗肺炎鏈球菌抗體應(yīng)答和抗血清型19F的OPA活性分別示于表8和9。表10顯示了在23價普通多糖加強(qiáng)接種之前和之后達(dá)到0.2μg/mL的受試者的22F-ELISA抗體濃度和百分率。
已表明用這些19F-DT制劑誘導(dǎo)的抗體的調(diào)理吞噬活性被明顯改善，這由初免接種后1個月較高的血清陽性率(調(diào)理吞噬效價≥1:8)和OPA GMT得以證實(表9)。在23價普通多糖加強(qiáng)接種之后1個月，19F抗體的調(diào)理吞噬活性仍顯著好于用19F-DT制劑初免的兒童(表11)。
表12提供了與連續(xù)第4劑

相比較在預(yù)先用19F-DT或19F-PD綴合物初免的學(xué)步兒童中在11Pn-PD加強(qiáng)劑量之后的免疫原性數(shù)據(jù)。已知在美國引入

后報告的成就，在血清型19F綴合DT載體蛋白時抗血清型19F的改善的調(diào)理吞噬活性可能對候選疫苗有利。
表13提供了19F-DT綴合物相對于交叉反應(yīng)性血清型19A的ELISA和OPA數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)19F-DT相對于19A誘導(dǎo)低但顯著的OPA活性。
表4 在臨床研究中使用的肺炎鏈球菌綴合疫苗制劑
表5 PS肺炎鏈球菌D蛋白/TT/DT綴合物的特異性活化/偶聯(lián)/猝滅條件 表6 用于11Pn-PD&Di-001研究的PS肺炎鏈球菌D蛋白/DT綴合物的特異性活化/偶聯(lián)/猝滅條件 表7 用于11Pn-PD&Di-007研究的PS肺炎鏈球菌D蛋白/DT綴合物的特異性活化/偶聯(lián)/猝滅條件 表8 在1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初免接種后1個月19F抗體濃度≥0.20μg/mL的受試者百分率和19F抗體幾何平均抗體濃度(GMC和95％CI；μg/mL)(總隊列)
Γ在表4中提供不同制劑的組成。
表9 在用1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初免接種后1個月19F OPA效價≥1:8的受試者百分率和19F OPAGMT(總隊列)
Γ在表4中提供不同制劑的組成。
表10 在用1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初免接種的兒童中于23價普通多糖加強(qiáng)接種之前和之后1個月19F抗體濃度≥0.20μg/ml的受試者百分率和19F抗體GMC(μg/ml)(總隊列)
Γ在表4中提供不同制劑的組成。
表11 在用1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初免接種的兒童中于23價普通多糖加強(qiáng)接種之前和之后1個月19FOPA效價≥1:8的受試者百分率和19F OPA GMT(總隊列)
Γ在表4中提供不同制劑的組成。
表12 在用1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初免接種的兒童中于11Pn-PD或Prevnar加強(qiáng)接種后1個月抗體濃度≥0.2μg/mL、OPA≥1:8的受試者百分率和抗19F肺炎鏈球菌的GMC/GMT(總隊列)
Γ在表4中提供不同制劑的組成。
表13 在用1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初免接種后1個月抗體濃度≥0.2μg/mL、OPA≥1:8的受試者百分率和抗19A肺炎鏈球菌的GMC/GMT(總隊列)
Γ在表4中提供不同制劑的組成。
實施例5在預(yù)臨床模型中的佐劑試驗對老年獼猴中的肺炎鏈球菌11價多糖綴合物的免疫原性的影響 為優(yōu)化在老年群體中針對綴合的肺炎鏈球菌疫苗激發(fā)的應(yīng)答，GSK配制了一種具有新型佐劑—佐劑C的11價多糖(PS)綴合疫苗制劑，參見下文。
在0-28天用500μl吸附到315μg AlPO4上的11價PS綴合物或與佐劑C混合的11價PS綴合物肌內(nèi)(IM)免疫5只老年獼猴(14-28歲)的組別。
在兩種疫苗制劑中，11價PS綴合物各自由以下綴合物組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-PD、PS19F-PD、PS23F-DT和PS6B-DT。所用疫苗為按照表6條件(實施例4)綴合的人用疫苗劑量的1/5劑量(每人用劑量每種糖5μg，6B除外[10μg])，只有19F按照以下CDAP方法條件制備調(diào)整大小的糖為9mg/ml、PD為5mg/ml、初始PD/PS比率為1.2/1、CDAP濃度為0.75mg/mg PS，pHa＝pHc＝pHq 9.0/9.0/9.0，偶聯(lián)時間為60分鐘。
定量在第42天收集的血清中的抗PS ELISA IgG水平和調(diào)理吞噬效價。通過Elispot由在第42天收集的外周血細(xì)胞檢測抗PS3記憶B細(xì)胞頻率。
按照下文所示結(jié)果，佐劑C在老年猴子中顯著改善11價PS綴合物相對于采用AlPO4的綴合物的免疫原性。新佐劑增強(qiáng)針對PS的IgG應(yīng)答(圖1)和調(diào)理吞噬抗體效價(表14)。還有支持性證據(jù)表明使用佐劑C增強(qiáng)了PS3特異性記憶B細(xì)胞的頻率(圖2)。
表14，在老年獼猴中的綴合物免疫原性(第II劑后的調(diào)理吞噬效價)
B細(xì)胞Elispot 測定的原則依賴于以下事實:在與CpG培養(yǎng)5天后記憶B細(xì)胞在體外成熟為漿細(xì)胞。體外產(chǎn)生的抗原特異性漿細(xì)胞可易于檢測，并因此使用B細(xì)胞elispot測定計數(shù)。特異性漿細(xì)胞數(shù)反映出在培養(yǎng)開始時的記憶B細(xì)胞頻率。
簡而言之，體外產(chǎn)生的漿細(xì)胞在用抗原包被的培養(yǎng)板中溫育?？乖禺愋詽{細(xì)胞形成抗體/抗原斑點，其通過常規(guī)免疫-酶促方法檢測，并作為記憶B細(xì)胞計數(shù)。在本研究中，多糖已用于包被培養(yǎng)板，以便計數(shù)對應(yīng)的記憶B細(xì)胞。結(jié)果表示為1百萬記憶B細(xì)胞中PS特異性記憶B細(xì)胞的頻率。
研究表明，佐劑C能夠減輕已知的PS3加強(qiáng)能力問題(參見關(guān)于肺炎鏈球菌和肺炎鏈球菌疾病的第5屆國際討論會，2006年4月2-6日，Alice Springs，Central Australia，抗血清型3肺炎鏈球菌綴合物的免疫應(yīng)答的特異性。Schuerman L，Prymula R，Poolman J.Abstract book245頁，PO10.06)。
實施例6，解毒的肺炎鏈球菌溶血素(dPly)作為蛋白載體在幼齡Balb/c小鼠中增強(qiáng)PS 19F的免疫原性的有效性 于0、14和28天用50μl的4價普通PS或4價dPly綴合PS(二者均與佐劑C混合)IM免疫40只雌性Balb/c小鼠(4周齡)的組別。
兩種疫苗制劑均由0.1μg(糖的量)的以下PS中的每一種組成:PS8、PS12F、PS19F和PS22F。
定量在第42天收集的血清的抗PS ELISA IgG水平。
與用普通PS免疫的小鼠相比，在給予4價dPly綴合物的小鼠中的抗PS19F應(yīng)答(作為圖3的實例顯示)被強(qiáng)烈增強(qiáng)。對于抗PS8、12F和22F IgG應(yīng)答觀察到相同的改善(未顯示數(shù)據(jù))。
實施例7，肺炎鏈球菌組氨酸三聯(lián)體D蛋白(PhtD)作為蛋白載體在幼齡Balb/c小鼠中增強(qiáng)PS22F的免疫原性的有效性 于0、14和28天用50μl的4價普通PS或4價PhtD綴合PS(二者均與佐劑C混合)IM免疫40只雌性Balb/c小鼠(4周齡)的組別。
兩種疫苗制劑均由0.1μg(糖的量)的以下PS中的每一種組成:PS8、PS12F、PS19F和PS22F。
定量在第42天收集的血清的抗PS ELISA IgG水平。
與用普通PS免疫的小鼠相比，在給予4價PhtD綴合物的小鼠中的抗PS22F應(yīng)答(作為圖4的實例顯示)被強(qiáng)烈增強(qiáng)。對于抗PS8、12F和19F IgG應(yīng)答觀察到相同的改善(未顯示數(shù)據(jù))。
實施例8，含有19A-dPly和22F-PhtD的13-價PS綴合物在老年C57B1小鼠中的免疫原性 于0、14和28天用50μl的11價PS綴合物或13價PS綴合物(二者均與佐劑C混合)IM免疫30只老年C57B1小鼠(>69周齡)的組別(參見下文)。
11價疫苗制劑由以下綴合物中的每一種的0.1μg糖組成:PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下討論的關(guān)于11價疫苗的備注)。13價疫苗制劑另外包含0.1μgPS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下討論的關(guān)于13價疫苗的備注[使用直接綴合的22F])。在第2組和第4組中，肺炎鏈球菌溶血素載體用GMBS處理解毒，在第3組和第5組中其用甲醛進(jìn)行。在第2組和第3組中，PhtD用于綴合PS22F，在第4組和第5組中，使用PhtD_E融合體(WO 03/054007的構(gòu)建體VP147)。在第6組中，19A與白喉類毒素綴合，22F與D蛋白綴合。
定量在第42天收集的單獨血清的抗PS19A和22F ELISA IgG水平。檢測合并血清針對其它PS產(chǎn)生的ELISA IgG應(yīng)答。
在13價綴合疫苗制劑中給予的19A-dPly和22F-PhtD在老年C57B1小鼠中顯示出免疫原性(表15)。與用11價制劑免疫的小鼠相比，在給予13價制劑的小鼠中針對其它PS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答沒有受到負(fù)面影響。
表15，在老年C57B1小鼠中的PS免疫原性(第III劑后的IgG水平)
實施例9，含19A-dPly和22F-PhtD的13價PS綴合物在幼齡Balb/c小鼠中的免疫原性 于0、14和28天用50μl的11價PS綴合物或13價PS綴合物(二者均與佐劑C混合)IM免疫30只幼齡Balb/c小鼠(4周齡)的組別(參見下文)。
11價疫苗制劑由以下綴合物中的每一種的0.1μg糖組成:PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下討論的關(guān)于11價疫苗的備注)。13價疫苗制劑另外包含0.1μgPS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下討論的關(guān)于13價疫苗的備注[使用直接綴合的22F])。在第2組和第4組中，肺炎鏈球菌溶血素載體用GMBS處理解毒，在第3組和第5組中其用甲醛進(jìn)行。在第2組和第3組中，PhtD用于綴合PS 22F，在第4組和第5組中，使用PhtD E融合體(WO 03/054007的構(gòu)建體VP147)。在第6組中，19A與白喉類毒素綴合，22F與D蛋白綴合。
定量在第42天收集的單獨血清的抗PS19A和22F ELISA IgG水平。檢測合并血清針對其它PS產(chǎn)生的ELISA IgG應(yīng)答。
在13價綴合疫苗制劑中給予的19A-dPly和22F-PhtD在幼齡Balb/c小鼠中顯示出免疫原性(表16)。與用11價制劑免疫的小鼠相比，在給予13價制劑的小鼠中針對其它PS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答沒有受到負(fù)面影響。
表16，在幼齡Balb/c小鼠中的PS免疫原性(在第III劑后的IgG水平)
實施例10，含19A-dPly和22F-PhtD的13價PS綴合物在豚鼠中的免疫原性 于0、14和28天用125μl的11價PS綴合物或13價PS綴合物(二者均與佐劑C混合)IM免疫20只幼齡豚鼠(Hartley Strain；5周齡)的組別(參見下文)。
11價疫苗制劑由以下綴合物中的每一種的0.25μg糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下討論的關(guān)于11價疫苗的備注)。13價疫苗制劑另外包含0.1μgPS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下討論的關(guān)于13價疫苗的備注[使用直接綴合的22F])。在第2組和第4組中，肺炎鏈球菌溶血素載體用GMBS處理解毒，在第3組和第5組中其用甲醛進(jìn)行。在第2組和第3組中，PhtD用于綴合PS 22F，在第4組和第5組中，使用PhtD_E融合體(WO 03/054007的構(gòu)建體VP147)。在第6組中，19A與白喉類毒素綴合，22F與D蛋白綴合。
定量在第42天收集的單獨血清的抗PS19A和22F ELISA IgG水平。檢測合并血清針對其它PS產(chǎn)生的ELISA IgG應(yīng)答。
表17，在幼齡Balb/c小鼠中的PS免疫原性(在第III劑后的IgG水平)
實施例11要制備和檢驗的制劑 a)制備以下制劑(使用表1的13價疫苗和表5的血清型3-參見在表2下論述的關(guān)于14價疫苗的備注[使用直接綴合的22F或通過ADH接頭])。如下文所示將糖與磷酸鋁和3D-MPL一起配制。

b)用以下的每一種佐劑進(jìn)行佐劑化的相同糖制劑 -在下表中顯示了每500μl劑量的乳劑組分的濃度。
佐劑A1 佐劑A2 佐劑A3 成分250μl o/w乳劑125μl o/w乳劑50μl o/w乳劑 α生育酚 11.88mg 5.94mg 2.38mg 鯊烯10.7mg 5.35mg 2.14mg 吐溫80 4.85mg 2.43mg 0.97mg 佐劑A4 佐劑A5 佐劑A6 佐劑A7 成分250μl o/w250μl o/w乳 125μl o/w 50μl o/w 乳劑 劑 乳劑乳劑 α生育酚 11.88mg 11.88mg 5.94mg 2.38mg 鯊烯10.7mg 10.7mg 5.35mg 2.14mg 吐溫80 4.85mg 4.85mg 2.43mg 0.97mg 3D-MPL 50μg 25μg25μg10μg c)糖還與兩種基于脂質(zhì)體的佐劑一起配制: 佐劑B1的組成 定性定量(每0.5mL劑量) 脂質(zhì)體 -DOPC 1mg -膽固醇 0.25mg 3DMPL 50μg QS21 50μg KH2PO41 3.124mg緩沖液 Na2HPO41 0.290mg緩沖液 NaCl 2.922mg (100mM) 足夠量的WFI調(diào)到0.5ml溶劑 pH 6.1 1.總PO4濃度＝50mM 佐劑B2的組成 定性定量(每0.5mL劑量) 脂質(zhì)體 -DOPC 0.5mg -膽固醇 0.125mg 3DMPL 25μg QS21 25μg KH2PO41 3.124mg緩沖液 Na2HPO41 0.290mg緩沖液 NaCl 2.922mg (100mM) 足夠量的WFI調(diào)到0.5ml溶劑 pH 6.1 d)糖還用佐劑C配制(參見上文其中已使用該佐劑的其它組合物): 定性定量(每0.5mL劑量) 水包油乳劑50μl -鯊烯 2.136mg -α生育酚 2.372mg -吐溫80 0.97mg -膽固醇 0.1mg 3DMPL 50μg QS21 50μg KH2PO41 0.470mg緩沖液 Na2HPO41 0.219mg緩沖液 NaCl 4.003mg (137mM) KCl 0.101mg (2.7mM) 足夠量的WFI調(diào)到0.5ml溶劑 pH 6.8 實施例12，綴合化學(xué)對Balb/c小鼠中22F-PhtD綴合物免疫原性的影響 于0、14和28天用含有PS 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F(劑量對于PS 4、18C、19A、19F和22F為0.3μg糖/綴合物，對于其它PS為0.1μg糖/綴合物)的13價PS制劑通過肌內(nèi)(IM)途徑免疫30只雌性小鼠的組別。
PS 18C與破傷風(fēng)類毒素綴合，19F與白喉類毒素綴合，19A與甲醛解毒的Ply綴合，22F與PhtD綴合，其它PS與PD綴合。
比較由通過直接CDAP化學(xué)制備的22F-PhtD或22F-AH-PhtD(ADH衍生化的PS)構(gòu)成的兩種制劑。參見實施例2、表1和表2下關(guān)于用22F直接綴合或經(jīng)由ADH間隔臂制備的13價疫苗特征的備注。疫苗制劑補(bǔ)加佐劑C。
檢測在第42天收集的血清的抗PS22F ELISA IgG水平和調(diào)理吞噬效價。
就IgG水平(圖5)和調(diào)理吞噬效價(圖6)這二者而言，22F-AH-PhtD顯示出遠(yuǎn)強(qiáng)于22F-PhtD的免疫原性。
實施例13，新佐劑對肺炎鏈球菌莢膜PS綴合物的免疫原性的影響 于0、14和28天用含有PS 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F(劑量:對于PS 4、18C、19A、19F和22F為0.3μg糖/綴合物，對于其它PS為0.1μg糖/綴合物)的13價PS制劑通過肌內(nèi)(IM)途徑免疫40只雌性Balb/c小鼠的組別。
PS 18C與破傷風(fēng)類毒素綴合，19F與白喉類毒素綴合，19A與甲醛解毒的Ply綴合，22F與PhtD綴合，其它PS與PD綴合。參見實施例2、表1和表2下關(guān)于用直接綴合的22F制備的13價疫苗特征的備注。
比較補(bǔ)加AlPO4、佐劑A1、佐劑A4或佐劑A5的4種制劑。
檢測在第42天收集的和每組合并的血清的抗PS、Ply、PhtD和PD ELISA IgG水平。計算每種抗原的以下比率:用測試的新佐劑誘導(dǎo)的IgG水平/用AlPO4誘導(dǎo)的IgG水平。
與經(jīng)典的AlPO4制劑相比，測試的所有新佐劑將針對13價綴合物的免疫應(yīng)答提升至少2倍(圖7)。
實施例14，在猴子肺炎鏈球菌性肺炎模型中PhtD/解毒的Ply組合的保護(hù)效力 選擇6只獼猴(3-8歲)的組別作為具有預(yù)先存在的最低抗19F抗體水平的組別，于0和28天用11價PS綴合物(即1μg PS 1、3、5、6B、7F、9V、14和23F，3μg PS 4、18C和19F[糖])或PhtD(10μg)+甲醛解毒的Ply(10μg)或單獨的佐劑肌內(nèi)免疫該組別。
PS 18C與破傷風(fēng)類毒素綴合，19F與白喉類毒素綴合，其它PS與PD綴合。參見實施例2、表1和表2下關(guān)于11價疫苗特征的備注。所有疫苗制劑均補(bǔ)加佐劑C。
在第42天將19F型肺炎鏈球菌(5.108cfu)接種在右肺中。計數(shù)在挑戰(zhàn)后第1、3和7天收集的支氣管肺泡灌洗液的菌落。結(jié)果表示為在挑戰(zhàn)后第7天每組的死亡動物數(shù)、肺定居動物數(shù)或清除的動物數(shù)。
如在圖8中所示，與單獨的佐劑組相比，用11價綴合物和PhtD+dPly組合物(p<0.12，F(xiàn)isher確切檢驗)獲得了接近于統(tǒng)計學(xué)顯著性的良好保護(hù)作用(盡管使用的動物數(shù)少)。
實施例15，綴合化學(xué)對抗PhtD抗體應(yīng)答和針對22F-PhtD綴合物誘導(dǎo)的4型挑戰(zhàn)的保護(hù)效力的影響 在第0和14天用3μg 22F-PhtD(通過直接CDAP化學(xué)制備)或22F-AH-PhtD(ADH衍生化的PS)或單獨的佐劑肌內(nèi)免疫20只雌性O(shè)F1小鼠的組別。兩種單價22F綴合物均通過實施例2的方法制備(另參見表1和表2)。每種制劑均補(bǔ)加佐劑C。
檢測在第27天收集的血清的抗PhtD ELISA IgG水平。
在第28天用5.106cfu的4型肺炎鏈球菌(即測試的疫苗制劑中存在的PS潛在地沒有涵蓋的肺炎鏈球菌血清型)鼻內(nèi)挑戰(zhàn)小鼠。監(jiān)測誘導(dǎo)的死亡率，直至挑戰(zhàn)后的第8天。
與22F-PhtD相比22F-AH-PhtD誘導(dǎo)顯著較高的抗PhtD IgG應(yīng)答和更好的抗4型挑戰(zhàn)的保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種含有血清型19A和19F肺炎鏈球菌(Streptococcus.pneumoniae)莢膜糖綴合物的免疫原性組合物，其中19A與第一種細(xì)菌類毒素綴合，19F與第二種細(xì)菌類毒素綴合。
2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中所述第一種細(xì)菌類毒素為不同于第二種細(xì)菌毒素的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，其中第一種細(xì)菌類毒素選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197、百日咳類毒素、細(xì)菌溶細(xì)胞素和肺炎鏈球菌溶血素。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的免疫原性組合物，其中所述第二種細(xì)菌類毒素選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197、百日咳類毒素、細(xì)菌溶細(xì)胞素和肺炎鏈球菌溶血素。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的免疫原性組合物，其中第一種細(xì)菌類毒素為肺炎鏈球菌溶血素。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的免疫原性組合物，其中所述第二種細(xì)菌類毒素為白喉類毒素。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌莢膜糖4、6B、9V、14、18C和23F的綴合物。
8.權(quán)利要求1-7中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌莢膜糖1、5和7F的綴合物。
9.權(quán)利要求1-8中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌莢膜糖22F的綴合物。
10.權(quán)利要求1-9中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌莢膜糖3綴合物。
11.權(quán)利要求1-10中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌莢膜糖6A綴合物。
12.權(quán)利要求1-11中任一項的免疫原性組合物，其中2種不同載體蛋白與至少2種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型獨立綴合。
13.權(quán)利要求7-11中任一項的免疫原性組合物，其中3種不同載體蛋白與至少3種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型獨立綴合。
14.權(quán)利要求7-11中任一項的免疫原性組合物，其中4種不同載體蛋白與至少4種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型獨立綴合。
15.權(quán)利要求7-11中任一項的免疫原性組合物，其中5種不同載體蛋白與至少5種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型獨立綴合。
16.權(quán)利要求15的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含2種或多種選自以下的載體蛋白破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、肺炎鏈球菌溶血素、D蛋白以及PhtD或PhtD融合蛋白。
17.權(quán)利要求1-16中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合D蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖1。
18.權(quán)利要求1-17中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合D蛋白、肺炎鏈球菌溶血素或PhtD或PhtD融合蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖3。
19.權(quán)利要求1-18中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合D蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖4。
20.權(quán)利要求1-19中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合D蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖5。
21.權(quán)利要求1-20中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合D蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖6B。
22.權(quán)利要求1-21中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合D蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖7F。
23.權(quán)利要求1-22中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合D蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖9V。
24.權(quán)利要求1-23中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有綴合D蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖14。
25.權(quán)利要求1-24中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合D蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖23F。
26.權(quán)利要求1-25中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合破傷風(fēng)類毒素的肺炎鏈球菌莢膜糖18C。
27.權(quán)利要求1-26中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合肺炎鏈球菌溶血素的肺炎鏈球菌莢膜糖19A。
28.權(quán)利要求1-27中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有綴合PhtD或PhtD融合蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖22F。
29.權(quán)利要求1-28中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有肺炎鏈球菌莢膜糖6A，所述肺炎鏈球菌莢膜糖6A綴合肺炎鏈球菌溶血素或流感嗜血菌(H.influenzae)蛋白，任選地綴合D蛋白或PhtD或PhtD融合蛋白。
30.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中19A莢膜糖與載體蛋白直接綴合。
31.權(quán)利要求1-29中任一項的免疫原性組合物，其中19A莢膜糖經(jīng)接頭與載體蛋白綴合。
32.權(quán)利要求31的免疫原性組合物，其中所述接頭為ADH。
33.權(quán)利要求31或32的免疫原性組合物，其中任選地使用EDAC通過碳二亞胺化學(xué)使所述接頭與載體蛋白連接。
34.權(quán)利要求30-33中任一項的免疫原性組合物，其中使用CDAP化學(xué)使19A糖與載體蛋白或接頭綴合。
35.權(quán)利要求1-30中任一項的免疫原性組合物，其中載體蛋白對19A糖的比率在5:1至1:5(重量/重量)之間、4:1至1:1(重量/重量)之間或3.5:1至2.5:1(重量/重量)之間。
36.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中19F莢膜糖與載體蛋白直接綴合。
37.權(quán)利要求1-35中任一項的免疫原性組合物，其中19F莢膜糖經(jīng)接頭與載體蛋白綴合。
38.權(quán)利要求37的免疫原性組合物，其中所述接頭為ADH。
39.權(quán)利要求37或38的免疫原性組合物，其中任選地使用EDAC通過碳二亞胺化學(xué)使所述接頭與載體蛋白連接。
40.權(quán)利要求36-39中任一項的免疫原性組合物，其中使用CDAP化學(xué)使19F糖與載體蛋白或接頭綴合。
41.權(quán)利要求1-40中任一項的免疫原性組合物，其中載體蛋白對19F糖的比率在5:1至1:5(重量/重量)之間、4:1至1:1(重量/重量)之間或2:1至1:1(重量/重量)之間。
42.權(quán)利要求1-41中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含與載體蛋白直接綴合的22F莢膜糖。
43.權(quán)利要求1-41中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含經(jīng)接頭與載體蛋白綴合的22F莢膜糖。
44.權(quán)利要求43的免疫原性組合物，其中所述接頭為ADH。
45.權(quán)利要求43或44的免疫原性組合物，其中任選地使用EDAC通過碳二亞胺化學(xué)使所述接頭與載體蛋白連接。
46.權(quán)利要求42-45中任一項的免疫原性組合物，其中使用CDAP化學(xué)使22F糖與載體蛋白或接頭綴合。
47.權(quán)利要求1-46中任一項的免疫原性組合物，其中載體蛋白對22F糖的比率在5:1至1:5(重量/重量)之間、4:1至1:1(重量/重量)之間或2:1至1:1(重量/重量)之間。
48.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中19A糖的平均大小在100kDa以上。
49.權(quán)利要求48的免疫原性組合物，其中19A糖的平均大小在110-700kDa之間、110-300kDa之間、120-200kDa之間、130-180kDa之間或140-160kDa之間。
50.權(quán)利要求48或49的免疫原性組合物，其中19A糖或者為天然多糖，或者以不超過x5的因數(shù)調(diào)整大小。
51.權(quán)利要求48、49或50中的免疫原性組合物，其中19A糖已通過微流化調(diào)整大小。
52.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中19A糖綴合物的劑量在1-10μg、1-5μg或1-3μg糖之間。
53.權(quán)利要求52的免疫原性組合物，其中19A糖綴合物的劑量為3μg糖。
54.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有22F糖綴合物，其中22F糖的平均大小在100kDa以上。
55.權(quán)利要求54的免疫原性組合物，其中22F糖的平均大小在110-700kDa之間、110-300kDa之間、120-200kDa之間、130-180kDa之間或150-170kDa之間。
56.權(quán)利要求54或55的免疫原性組合物，其中22F糖或者為天然多糖，或者以不超過x5的因數(shù)調(diào)整大小。
57.權(quán)利要求54、55或56中的免疫原性組合物，其中22F糖已通過微流化調(diào)整大小。
58.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有22F糖綴合物，其中22F糖綴合物的劑量在1-10μg、1-5μg或1-3μg糖之間。
59.權(quán)利要求58的免疫原性組合物，其中22F糖綴合物的劑量為3μg糖。
60.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中所述糖的平均大小在50kDa以上。
61.權(quán)利要求60的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有平均糖大小在300-400kDa之間的血清型1。
62.權(quán)利要求60或61的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有平均糖大小在75-125kDa之間的血清型4。
63.權(quán)利要求60、61或62的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有平均糖大小在350-450kDa之間的血清型5。
64.權(quán)利要求60-63中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有平均糖大小在1000-1400kDa之間的血清型6B。
65.權(quán)利要求60-64中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有平均糖大小在200-300kDa之間的血清型7F。
66.權(quán)利要求60-65中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有平均糖大小在250-300kDa之間的血清型9V。
67.權(quán)利要求60-66中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有平均糖大小在200-250kDa之間的血清型14。
68.權(quán)利要求60-67中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有平均糖大小在900-1000kDa之間的血清型23F。
69.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有為天然糖的血清型5、6B和23F(以及任選的6A)。
70.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中所述莢膜糖綴合物的劑量在1-10μg糖/綴合物、1-5μg糖/綴合物或1-3μg糖/綴合物之間。
71.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有3μg糖/綴合物劑量的血清型4、18C、19F和22F(以及任選的19A)的綴合物。
72.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有1μg糖/綴合物劑量的血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F(以及任選的6A和/或3)的綴合物。
73.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有未綴合的肺炎鏈球菌糖血清型，這些血清型不同于那些綴合的糖的血清型，使得綴合的和未綴合的糖血清型的數(shù)量低于或等于23。
74.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有一種或多種未綴合的或綴合的肺炎鏈球菌蛋白。
75.權(quán)利要求74的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有一種或多種未綴合的肺炎鏈球菌蛋白。
76.權(quán)利要求74或75的免疫原性組合物，其中所述一種或多種肺炎鏈球菌蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、解毒肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。
77.權(quán)利要求74、75或76中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有肺炎鏈球菌溶血素。
78.權(quán)利要求74-77中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有PhtX蛋白。
79.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有為游離蛋白或載體蛋白的肺炎鏈球菌溶血素。
80.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有為游離蛋白或載體蛋白的PhtX蛋白。
81.權(quán)利要求80的免疫原性組合物，其中所述PhtX蛋白為PhtD或PhtBD或PhtDE融合蛋白。
82.任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有佐劑。
83.權(quán)利要求82的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有脂質(zhì)體載體。
84.權(quán)利要求83的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0.1-10mg、0.2-7mg、0.3-5mg、0.4-2mg或0.5-1mg(例如0.4-0.6、0.9-1.1、0.5或1mg)磷脂(例如DOPC)。
85.權(quán)利要求83或84的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)固醇(例如膽固醇)。
86.權(quán)利要求83-85中的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。
87.權(quán)利要求83-86中的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)皂苷(例如QS21)。
88.權(quán)利要求82的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有水包油乳劑。
89.權(quán)利要求88的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0.5-15mg、1-13mg、2-11mg、4-8mg或5-6mg(例如2-3mg、5-6mg或10-11mg)可代謝油(例如鯊烯)。
90.權(quán)利要求88或89的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0.1-10mg、0.3-8mg、0.6-6mg、0.9-5mg、1-4mg或2-3mg(例如0.9-1.1mg、2-3mg或4-5mg)乳化劑(例如吐溫80)。
91.權(quán)利要求88-90中的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0.5-20mg、1-15mg、2-12mg、4-10mg、5-7mg(例如11-13mg、5-6mg或2-3mg)母育酚(例如α生育酚)。
92.權(quán)利要求88-91中的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。
93.權(quán)利要求88-92中的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)固醇(例如膽固醇)。
94.權(quán)利要求88-93中的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)皂苷(例如QS21)。
95.權(quán)利要求82的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有金屬鹽和脂質(zhì)A衍生物。
96.權(quán)利要求95的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)為磷酸鋁的100-750μg、200-500μg或300-400μgAl。
97.權(quán)利要求95或96的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有(每0.5mL劑量)5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。
98.權(quán)利要求1-97中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物至少或恰好含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13種綴合PhtD或其融合蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖。
99.權(quán)利要求1-97中任一項的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物至少或恰好含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13種綴合肺炎鏈球菌溶血素的肺炎鏈球菌莢膜糖。
100.一種疫苗藥盒，所述疫苗藥盒含有權(quán)利要求1-97中任一項的免疫原性組合物，并還含有伴隨或序貫給藥的如在權(quán)利要求83-99的任一項中定義的佐劑。
一種疫苗，所述疫苗含有權(quán)利要求1-99中任一項的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
一種用于制備權(quán)利要求101的疫苗的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-99中任一項的免疫原性組合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合的步驟。
一種免疫人類宿主以抵御肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)感染所致疾病的方法，所述方法包括給予宿主免疫保護(hù)劑量的權(quán)利要求1-99中任一項的免疫原性組合物或權(quán)利要求101的疫苗。
權(quán)利要求103的方法，其中所述人類宿主為老年人，所述疾病為肺炎或侵襲性肺炎鏈球菌疾病(IPD)中的任一種或這二者。
權(quán)利要求103或104的方法，其中所述人類宿主為老年人，所述疾病為慢性阻塞性肺病(COPD)惡化。
權(quán)利要求103的方法，其中所述人類宿主為嬰兒，所述疾病為中耳炎。
權(quán)利要求103或106的方法，其中所述人類宿主為嬰兒，所述疾病為腦膜炎和/或菌血癥。
權(quán)利要求103、106或107中的方法，其中所述人類宿主為嬰兒，所述疾病為肺炎和/或結(jié)膜炎。
權(quán)利要求1-99中的免疫原性組合物或權(quán)利要求101的疫苗，其用于肺炎鏈球菌感染所致疾病的預(yù)防性治療。
110.權(quán)利要求1-99中的免疫原性組合物或疫苗或權(quán)利要求101的疫苗在制備用于治療或預(yù)防肺炎鏈球菌感染所致疾病的藥物中的用途。
111.權(quán)利要求110的用途，其中所述疾病為老年人的肺炎或侵襲性肺炎鏈球菌疾病(IPD)中的任一種或這二者。
112.權(quán)利要求110或111的用途，其中所述疾病為老年人的慢性阻塞性肺病(COPD)惡化。
113.權(quán)利要求110的用途，其中所述疾病為嬰兒中耳炎。
114.權(quán)利要求110或113的用途，其中所述疾病為嬰兒的腦膜炎和/或菌血癥。
115.權(quán)利要求110、113或114的用途，其中所述疾病為嬰兒的肺炎和/或結(jié)膜炎。
116.一種在嬰兒中激發(fā)抵御中耳炎的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括作為單獨組分或聯(lián)合組分序貫或伴隨給予(i)權(quán)利要求1-99中任一項的免疫原性組合物或疫苗，和(ii)來自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的D蛋白，所述D蛋白可為游離的和/或綴合的。
117.一種在嬰兒中激發(fā)抵御肺炎鏈球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法給予任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物或疫苗。
118.一種在老年人中激發(fā)抵御肺炎鏈球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法聯(lián)合、序貫或伴隨給予(i)任一項前述權(quán)利要求的免疫原性組合物或疫苗，(ii)一種或多種選自PhtX家族和肺炎鏈球菌溶血素的肺炎鏈球菌表面蛋白。
119.權(quán)利要求1-99中的免疫原性組合物或權(quán)利要求101的疫苗，其包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F，其中在人類接種者中針對一種或多種疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價不顯著劣于Prevnar
疫苗誘導(dǎo)的效價。
120.權(quán)利要求119的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型4誘導(dǎo)的GMC抗體效價不顯著劣于Prevnar
疫苗誘導(dǎo)的效價。
121.權(quán)利要求119或120的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型6B誘導(dǎo)的GMC抗體效價不顯著劣于Prevnar
疫苗誘導(dǎo)的效價。
122.權(quán)利要求119-121中的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型9V誘導(dǎo)的GMC抗體效價不顯著劣于Prevnar
疫苗誘導(dǎo)的效價。
123.權(quán)利要求119-122中的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型14誘導(dǎo)的GMC抗體效價不顯著劣于Prevnar
疫苗誘導(dǎo)的效價。
124.權(quán)利要求119-123中的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型18C誘導(dǎo)的GMC抗體效價不顯著劣于Prevnar
疫苗誘導(dǎo)的效價。
125.權(quán)利要求119-124中的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型19F誘導(dǎo)的GMC抗體效價不顯著劣于Prevnar
疫苗誘導(dǎo)的效價。
126.權(quán)利要求119-125中的免疫原性組合物，其中在人類接種者中針對血清型23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價不顯著劣于Prevnar
疫苗誘導(dǎo)的效價。
127.權(quán)利要求119-126中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有血清型3糖綴合物。
128.權(quán)利要求119-127中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有血清型6A糖綴合物。
129.權(quán)利要求119-128中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有血清型19A糖綴合物。
130.權(quán)利要求119-129中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有血清型22F糖綴合物。
131.權(quán)利要求119-130中的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有晶體填充劑，任選地含有甘露醇。
132.權(quán)利要求131的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有糖，任選地含有蔗糖。
133.一種含有至少4種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物的免疫原性組合物，所述綴合物含有不同肺炎鏈球菌血清型的糖，其中至少一種糖與PhtD或PhtD融合蛋白綴合，所述免疫原性組合物能夠激發(fā)針對PhtD的有效免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有血清型19A和19F肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)莢膜糖綴合物的免疫原性組合物，其中19A與第一種細(xì)菌類毒素綴合，19F與第二種細(xì)菌類毒素綴合。還描述了制備疫苗的方法和疫苗的用途。
文檔編號A61K39/09GK101374548SQ200680052954
公開日2009年2月25日 申請日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者R·L·比曼斯, N·M·-J·加孔, P·V·赫爾曼德, J·普爾曼, M·P·范梅歇倫 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司