專利名稱：人參皂苷Rg1的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人參皂苷Rg1治療/預(yù)防阿爾茨海默病的用途，尤其涉及人參皂苷Rg1在治療/預(yù)防Aβ1-42介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用所引起的阿爾茨海默病的新用途。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)變性疾病，細(xì)胞外大量積聚的神經(jīng)炎性斑塊(Neuriteplaques，NP)、細(xì)胞內(nèi)異常沉積的β-淀粉樣肽(β-amyloidpeptide，Aβ)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle，NFT)形成及神經(jīng)突觸丟失或神經(jīng)元丟失是AD的主要神經(jīng)病理特征。雖然AD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但“Aβ級聯(lián)反應(yīng)學(xué)說”已為大多數(shù)學(xué)者所接受，即各種原因所導(dǎo)致的Aβ代謝異常，引起Aβ在腦組織的異常積聚，進(jìn)而觸發(fā)了與AD病理生理、生化相關(guān)的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損害。Aβ在體內(nèi)具有單聚體、寡聚體和凝聚態(tài)(纖絲狀)幾種存在方式，研究發(fā)現(xiàn)寡聚態(tài)的Aβ比纖絲狀、單聚體的Aβ更具有神經(jīng)毒性，對包括學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生理破壞作用更為廣泛。
AD發(fā)病中的一個重要早期病理生理改變是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)損害、線粒體功能失調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)直接暴露在Aβ的培養(yǎng)神經(jīng)元和高表達(dá)APP的轉(zhuǎn)基因鼠的腦組織中，皆出現(xiàn)了早期應(yīng)激反應(yīng)蛋白激酶JNK/p38-SAPK的活化、NO相關(guān)的氮自由基代謝異常及神經(jīng)元線粒體功能缺陷，如電子傳遞異常、線粒體膜電位改變、ROS增高等。這些研究提示Aβ造成的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)損害、線粒體功能失調(diào)在AD發(fā)病過程中起重要的作用。神經(jīng)元突觸可塑性和LTP與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)，研究報道具有神經(jīng)毒性作用的Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)元突觸功能和LTP的異常是AD早期的另一關(guān)鍵性病理生理改變，其中cAMP/PKA/CREB信號通路在參與LTP的調(diào)節(jié)中占有重要的地位。
到目前為止AD的治療仍缺乏有效的藥物，雖然膽堿脂酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑是當(dāng)前臨床上常用的主要治療藥物，能不同程度地改善AD病人的認(rèn)知和記憶功能、提高病人的生活質(zhì)量，但不能阻止AD病理發(fā)展的進(jìn)程和延緩患者病情的進(jìn)展。人參皂苷Rg1是從人參提取的含有2個糖基的單體化合物，以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1、人參皂苷Rg1可明顯減輕多種實(shí)驗(yàn)動物模型的學(xué)習(xí)記憶障礙，提高動物的學(xué)習(xí)記憶能力；2、可通過增加乙酰膽堿的合成與釋放、增加M膽堿受體數(shù)量、提高乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的活性，改善膽堿系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能；3、人參皂苷Rg1可通過減輕MPTP/MPP+誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)來保護(hù)多巴胺神經(jīng)元；4、Rg1還具有增強(qiáng)長時程電位、提高突觸的可塑性和改善老年鼠的免疫調(diào)節(jié)等作用。但人參皂苷Rg1對寡聚態(tài)Aβ1-42引起的神經(jīng)元應(yīng)激損傷、線粒體功能失衡及與長時程增強(qiáng)有關(guān)的cAMP/PKA/CREB信號通路等AD早期的關(guān)鍵性病理生理改變是否具有保護(hù)作用呢？目前還不是很清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人參皂苷Rg1新用途，具體為人參皂苷Rg1在制備治療/預(yù)防Aβ1-42介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用所引起的阿爾茨海默病的藥物/保健品中的應(yīng)用。
所述的神經(jīng)毒性作用是指Aβ1-42介導(dǎo)的皮層神經(jīng)元調(diào)亡。
所述的神經(jīng)毒性作用是指Aβ1-42介導(dǎo)的早期神經(jīng)元應(yīng)激損害。
所述神經(jīng)毒性作用是指Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元線粒體損傷。
所述神經(jīng)毒性作用是指Aβ1-42對蛋白激酶K-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白信號通路的抑制作用。
蛋白激酶K-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的英文名稱為proteinkinase K-cAMP response element binding protein，縮寫為PKA-CREB。
本發(fā)明的人參皂苷Rg1一般以藥物組合物的形式使用，這種組合物含有治療有效劑量的作為活性成分的人參皂苷Rg1和可藥用輔料。含有人參皂苷Rg1的藥物組合物可通過口服、注射或粘膜給藥，可以制成片劑、膠囊、粉劑、顆粒、錠劑，或口服液等劑型供臨床應(yīng)用。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。含有人參皂苷Rg1的營養(yǎng)品可以口服。
本申請?zhí)峁┝酥兴巻误w人參皂苷Rg1具有以下功能可減輕寡聚態(tài)Aβ1-42介導(dǎo)的神經(jīng)元應(yīng)激損害，保護(hù)線粒體的功能，減少神經(jīng)元凋亡；人參皂苷Rg1還可減輕Aβ1-42對PKA-CREB信號通路的抑制作用，有助于形成長時程增強(qiáng)、改善記憶功能。從而為人參皂苷Rg1應(yīng)用于阿爾茨海默病的防治提供了直接有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，既有很強(qiáng)的科學(xué)性和創(chuàng)新性，又有很高的開發(fā)應(yīng)用價值。


圖1.1神經(jīng)元TUNNEL染色(×400)。皮層神經(jīng)元分別經(jīng)過0.5μM、1.0μM、5.0μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用24h或48h，然后進(jìn)行TUNNEL染色，凋亡的細(xì)胞核被染成陽性。A10.5uM Aβ1-42處理24h，B10.5uMAβ1-42處理48h；A21.0uM Aβ1-42處理24h，B11.0uM Aβ1-42處理48h；A35.0uM Aβ1-42處理24h，B35.0uM Aβ1-42處理48h；A4對照組，B4對照組。
圖1.2TUNNEL染色陽性神經(jīng)元的數(shù)量。*P＜0.05 vs對照組。
圖1.3神經(jīng)元TUNNEL染色(×400)。神經(jīng)元經(jīng)過2.5μM、5.0μM、10μM的Rg1預(yù)孵育24h后，再添加終濃度為5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42共同作用48h，最后進(jìn)行TUNNEL的陽性染色。A對照組，B5.0uM Aβ1-42for 48h，C2.5uM Rg1+Aβ1-42，D5.0uM Rg1+Aβ1-42，E10uM Rg1+Aβ1-42，F(xiàn)單純10uM Rg1處理組。
圖1.4人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，每孔取五個視野計數(shù)TUNNEL陽性神經(jīng)元并取平均值。*P＜0.05vs對照組；#P＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖1.5寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元caspase-3的活性增加。分別用0.5μM、1.0μM和5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用于皮層神經(jīng)元24h或48h時，*P＜0.05vs對照組。
圖1.6人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的caspase-3活化。分別用2.5μM、5.0μM和10μM的Rg1預(yù)孵育24h后，再加入5.0μM寡聚態(tài)Aβ1-42共作用于皮層神經(jīng)元48h，*P＜0.05vs對照組，#P＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖2.1寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元ROS水平升高。ROS的密度分析用圖表示，*p＜0.05vs對照組。
圖2.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元ROS的升高。ROS的水平用圖表示，*p＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖2.3寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元H2O2的產(chǎn)生。H2O2的密度分析用直方圖表示，*p＜0.05vs對照組。
圖2.4人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元內(nèi)H2O2升高。H2O2的水平用直方圖表示，*p＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖2.5寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元NO水平的升高。分別用0.5μM、1.0μM和5.0μM三種濃度的寡聚態(tài)Aβ1-42作用于神經(jīng)元24h或48h，*p＜0.05vs對照組。
圖2.6人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元NO水平的升高。NO的水平用直方圖表示，*p＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖2.7寡聚態(tài)Aβ1-42處理不同時間后神經(jīng)元內(nèi)p38和p-p38的表達(dá)水平。用western-blot方法(p38和p-p38抗體)檢測裂解物中p38和p-p38的水平，總p38和p-p38的點(diǎn)密度分析用直方圖表示，*p＜0.05vs對照組。
圖2.8人參皂苷Rg1降低p-p38/p38的水平，*p＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖2.9寡聚態(tài)Aβ1-42處理不同時間后神經(jīng)元內(nèi)JNK和p-JNK的表達(dá)水平。用western-blot方法檢測裂解物中JNK和p-JNK水平，總JNK和p-JNK水平經(jīng)點(diǎn)密度分析用直方圖表示，*p＜0.05vs對照組。
圖2.10人參皂苷Rg1降低p-JNK/JNK的水平。*p＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖3.1寡聚態(tài)Aβ1-42降低線粒體膜電位，線粒體膜電位的密度分析用直方圖表示，*p＜0.05vs對照組。
圖3.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體膜電位的降低。線粒體膜電位的水平用直方圖表示，*p＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖3.3寡聚態(tài)Aβ1-42降低皮層神經(jīng)元ATP的產(chǎn)生。ATP的水平用直方圖表示，*p＜0.05vs對照組。
圖3.4人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42降低皮層神經(jīng)元ATP產(chǎn)生的作用。ATP的水平用直方圖表示，*p＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖3.5寡聚態(tài)Aβ1-42降低線粒體復(fù)合物IV的活性。復(fù)合物IV的活性用直方圖表示，*p＜0.05vs對照組。
圖3.6人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對線粒體復(fù)合物IV活性的損害。復(fù)合物IV的活性用直方圖表示，*p＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖3.7寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元線粒體細(xì)胞色素c的釋放。線粒體細(xì)胞色素c的水平用直方圖表示，*p＜0.05vs對照組。
圖3.8人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)神經(jīng)元線粒體細(xì)胞色素c的釋放。不同濃度(2.5μM/5μM/10μM)的人參皂苷Rg1預(yù)孵育24h后與寡聚態(tài)的Aβ1-42共孵育48h，然后測定胞漿和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c的含量，*p＜0.05vs Aβ1-42處理組。
圖4.1寡聚態(tài)Aβ1-42降低谷氨酸介導(dǎo)的CREB的磷酸化水平。寡聚態(tài)Aβ1-42處理不同時間后檢測神經(jīng)元內(nèi)CREB和p-CREB的蛋白水平，p-CREB/CREB的比值用直方圖表示，*p＜0.05vs谷氨酸對照組。
圖4.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42降低CREB的磷酸化程度。不同濃度(2.5μM/5μM/10μM)的人參皂苷Rg1預(yù)孵育24h后與寡聚態(tài)的Aβ1-42共孵育2h，然后測定神經(jīng)元內(nèi)CREB和p-CREB的蛋白水平，p-CREB/CREB的比值用直方圖表示，*p＜0.05vs谷氨酸對照組。
圖4.3人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對PKA酶活性的降低。不同濃度(2.5μM/5μM/10μM)的人參皂苷Rg1預(yù)孵育24h后與寡聚態(tài)的Aβ1-42共孵育2h，PKA的活性用直方圖表示，*p＜0.05vs對照組。
圖4.4人參皂苷Rg1降低PKA IIα亞基的蛋白水平。用PKA IIα抗體免疫應(yīng)跡方法檢測，PKA IIα/β-actin的比值用直方圖表示，*p＜0.05vs Aβ1-42處理組。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡1.TUNNEL染色(1)細(xì)胞接種在蓋玻片上，經(jīng)人參皂苷Rg1和/或寡聚態(tài)Aβ1-42干預(yù)后，吸棄培養(yǎng)基，用1xPBS小心沖洗。
(2)3.7％甲醛在18℃-24℃固定10min。
(3)吸棄甲醛后用100％乙醇固定20min，用1xPBS沖洗。
(4)樣品用1xPBS于18℃-24℃條件下浸泡10min后，小心吸棄周圍水。
(5)加入50μL的神經(jīng)元打孔劑(Neuropore)液體于細(xì)胞充分接觸，在濕盒18℃-24℃下作用15min-30min。
(6)無DNA酶的水沖洗2次，每次2min。
(7)滴加滅活劑[含有3％H2O2的甲醇]在18℃-24℃條件下作用5min后，用1xPBS于18℃-24℃條件沖洗1次，約2min。
(8)用末端脫氧核苷酰酶酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)標(biāo)記緩沖液在18℃-24℃條件作用5min。
(9)滴加標(biāo)記反應(yīng)混合液[TdT dNTP Mix；TdT Enzyme；Mn2+]，于濕盒37℃條件下作用1h。
(10)用TdT終止緩沖液終止反應(yīng)，在18℃-24℃條件作用5min。
(11)棄終止反應(yīng)液，1xPBS沖洗2次，每次2min。
(12)擦干周圍水，滴加鏈霉親和素標(biāo)志的辣根過氧化物酶(streptavidin-HRP)，在18℃-24℃條件作孵育10min。
(13)1xPBS沖洗2次，每次2min后，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，室溫2-10min后，充分水洗，核復(fù)染后，充分水洗，氨水返藍(lán)、水沖后，中性樹脂封片。
1.1寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡TUNNEL染色原代培養(yǎng)的C57BL/6小鼠的皮層神經(jīng)元分別經(jīng)過0.5μM、1.0μM、5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用24h或48h，各組神經(jīng)元進(jìn)行TUNNEL染色，最后進(jìn)行TUNNEL陽性細(xì)胞計數(shù)，統(tǒng)計各組之間的TUNNEL陽性細(xì)胞數(shù)目。如圖1.1所示，對照組神經(jīng)元形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，分布均勻，見少量的TUNNEL染色陽性的神經(jīng)元，即表現(xiàn)為胞質(zhì)消失，胞核呈棕褐色。不同濃度(0.5μM、1.0μM、5μM)寡聚態(tài)Aβ1-42作用不同時間(24h、48h)后TUNNEL染色陽性神經(jīng)元有不同程度的增加，以5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用48h其數(shù)量增多最為明顯(p＝0.0001)，陽性神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果如表1.1和圖1.2所示。
表1.1 TUNNEL染色陽性神經(jīng)元


1.2人參皂苷Rg 減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡經(jīng)過2.5μM、5.0μM、10μM的Rg1預(yù)孵育24h后，再添加終濃度為5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42共同作用48h，最后進(jìn)行TUNNEL的陽性染色。結(jié)果如圖1.3所示，對照組神經(jīng)元形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，分布均勻，見少量的TUNNEL染色陽性神經(jīng)元，即表現(xiàn)為胞質(zhì)消失，胞核呈棕褐色，以5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用48h TUNNEL染色陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(p＝0.0001)，不同濃度(2.5μM、5.0μM、10μM)人參皂苷Rg預(yù)孵育24h后，再與5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42共同孵育48h，則TUNNEL染色陽性神經(jīng)元不同程度的降低，陽性神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果如表1.2和圖1.4所示。
表1.2 TUNNEL染色陽性神經(jīng)元(*P＜0.05vs對照組；#P＜0.05vs Aβ1-42處理組)

2.半胱天冬酶3(caspase-3)活性測定(1)用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，并計算細(xì)胞數(shù)。
(2)取所需的細(xì)胞數(shù)體積，400xg離心5min后棄上清。
(3)按照50μL/2×105個細(xì)胞比例，加入裂解液，冰上裂解10min。
(4)在4℃條件下以最大離心速度離心5min，取上清。
(5)按照1∶100的比例添加1M的二硫蘇糖醇(DTT)于2x反應(yīng)緩沖液(2x Reat ion buffer)，配成2x Reat ion Buffer/DTT液體。
(6)在96孔測量板上，加入50μL的2xReation Buffer/DTT液體，于37℃預(yù)孵預(yù)5min。
(7)加入50μL的細(xì)胞裂解液，陽性抑制劑組應(yīng)另外添加1μLcaspase抑制劑。
(8)于37℃孵育1h，上機(jī)檢測熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長380nm；發(fā)射波長460nm。
2.1寡聚態(tài)Aβ1-42增強(qiáng)神經(jīng)元caspase-3的活性在研究細(xì)胞凋亡的同時，以相同條件下測定皮層神經(jīng)元內(nèi)caspase-3的活性。結(jié)果如圖1.5所示，在濃度為0.5μM、1.0μM和5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用于皮層神經(jīng)元24h或48h時，皮層神經(jīng)元caspase-3活性隨著Aβ1-42作用濃度增加而增高。另外，在相同濃度條件下寡聚態(tài)的Aβ1-42作用時間越長，caspase-3活性增高越明顯。這提示寡聚態(tài)Aβ1-42激活caspase-3活性具有一定的濃度依賴性。其中1.0μM寡聚態(tài)Aβ1-42作用48h、5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用24h和48h與對照組比較，caspase-3活性顯著升高(p值分別為0.019，0.001，0.0001)。
2.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元caspase-3活化分別用2.5μM、5.0μM和10μM的Rg1預(yù)孵育24h后，再加入5.0μM寡聚態(tài)Aβ1-42共作用于皮層神經(jīng)元48h，然后測定皮層神經(jīng)元內(nèi)caspase-3活性。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)Aβ1-42作用的皮層神經(jīng)元活性內(nèi)caspase-3活性明顯升高，然而經(jīng)過人參皂苷Rg1預(yù)孵育的各濃度組的皮層神經(jīng)元內(nèi)的caspase-3活性卻有不同程度的降低(與Aβ1-42作用組比較，p值分別皆小于0.05)。這提示人參皂苷Rg1可減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對caspase-3的活化。如圖1.6所示。
實(shí)施例2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對神經(jīng)元的應(yīng)激損害1.熒光法測定活性氧基團(tuán)(ROS)的水平不同條件處理的各組細(xì)胞，經(jīng)0.25％的胰酶消化，無菌的PBS小心洗滌后計數(shù)。取相同細(xì)胞數(shù)，直接加入1M 2、7-二氯氫化熒光素二酯(DCFH-DA)溶液，調(diào)整終濃度為10uM，37℃條件下5％CO2培養(yǎng)箱中靜置0.5h。無菌PBS小心洗滌3次后，使用熒光分光光度計，選擇480nm激發(fā)波長和530nm發(fā)射波長，測量熒光強(qiáng)度，同時設(shè)置空白對照管。
1.1寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元ROS水平升高5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元后，觀察不同時間點(diǎn)(3h、6h、12h、24h、48h)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，研究結(jié)果如圖2.1所示寡聚態(tài)Aβ1-42可誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)ROS的產(chǎn)生，并且隨著寡聚態(tài)Aβ1-42作用時間的延長，神經(jīng)元內(nèi)ROS水平越來越高，其中寡聚態(tài)Aβ1-42作用24h和48h時，神經(jīng)元內(nèi)的ROS升高最為顯著。這提示ROS可能參與寡聚態(tài)Aβ1-42對神經(jīng)元損害作用。
1.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元ROS的升高前面研究發(fā)現(xiàn)，寡聚態(tài)Aβ1-42可誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)ROS的產(chǎn)生，并且隨著作用時間的延長，在5μM寡聚態(tài)Aβ1-42作用24h和48h，細(xì)胞內(nèi)的ROS明顯升高。在此基礎(chǔ)上，采用不同濃度(2.5/5/10μM)的人參皂苷Rg1預(yù)孵育24h后，再與Aβ1-42共同作用24h或48h，測定細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。結(jié)果如圖2.2所示，在Aβ1-42共同作用24h或48h后，不同濃度的人參皂苷Rg1均可抑制寡聚態(tài)Aβ1-42所致的細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高。
2.熒光法測定H2O2水平接種在96孔板的皮層神經(jīng)元，經(jīng)各種條件處理后，細(xì)胞暴露于含有50μM的Amplex試劑(Amplex Red reagent)和0.1U/ml辣根過氧化物酶(horseradish peroxydase，HRP)作用60min，選擇激發(fā)波540nm和發(fā)射波590nm，用多功能熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度。同時設(shè)置空白對照組。
2.1寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元H2O2的產(chǎn)生5μM寡聚態(tài)Aβ1-42作用皮層神經(jīng)元后，觀察不同時間點(diǎn)(3h、6h、12h、24h、48h)細(xì)胞內(nèi)H2O2的水平，研究發(fā)現(xiàn)隨著寡聚態(tài)Aβ1-42作用時間的延長，神經(jīng)元內(nèi)H2O2水平不斷升高，如圖2.3所示，提示對神經(jīng)元的損害不斷加重，以寡聚態(tài)Aβ1-42作用24h和48h H2O2水平升高最為顯著(p分別為0.007、0.002)。
2.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元內(nèi)H2O2升高前面研究發(fā)現(xiàn)5μM寡聚態(tài)Aβ1-42孵育24h或48h可明顯升高神經(jīng)元內(nèi)H2O2水平。所以選擇寡聚態(tài)Aβ1-42孵育24h或48h作為研究時間點(diǎn)，觀察不同濃度的人參皂苷Rg1對神經(jīng)元內(nèi)H2O2水平的可能影響。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1預(yù)孵育組比Aβ1-42單獨(dú)孵育24h或48h組，神經(jīng)元內(nèi)的H2O2水平都有不同程度的降低。單獨(dú)給予人參皂苷Rg1處理，神經(jīng)元內(nèi)H2O2水平與對照組相似，如圖2.4所示。
3.NO代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽的測定(1)用不含氮的細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞。
(2)然后用高速離心機(jī)離心，去掉殘余的碎片。
(3)再用Bio-rad蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量。
(4)取相同量的蛋白用Griess法進(jìn)行測定蛋白中含有的亞硝酸根，同時設(shè)有標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線中算出亞硝酸根的具體數(shù)值A(chǔ)按50微升/孔，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品。B按50微升/孔，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品。C按50微升/孔，在各孔中加入室溫Griess ReagentI。D按50微升/孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent II。E室溫下混合10min-15min后上機(jī)檢測，波長為540nm測定吸光度。
3.1寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元NO水平的升高本實(shí)施例用0.5μM、1.0μM和5.0μM三種濃度的寡聚態(tài)Aβ1-42，研究Aβ1-42作用24h和48h后細(xì)胞內(nèi)NO的水平。研究結(jié)果如圖2.5所示三種濃度皆能增加細(xì)胞內(nèi)的NO水平。Aβ1-42作用48h的細(xì)胞與作用24h相比，細(xì)胞內(nèi)NO水平升高更為明顯；高濃度的Aβ1-42要比低濃度的Aβ1-42誘導(dǎo)的NO水平升高程度要顯著。其中5.0μM的Aβ1-42作用48h后，細(xì)胞內(nèi)NO水平升高了4-5倍。
3.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元NO水平的升高先用不同濃度的人參皂苷Rg1預(yù)孵育24h，然后加入終濃度為5.0μM寡聚態(tài)Aβ1-42共同作用48h，最后測定細(xì)胞內(nèi)NO水平，比較各組之間的變化。研究結(jié)果如圖2.6所示不同濃度的人參皂苷Rg1預(yù)孵育組細(xì)胞內(nèi)NO的水平皆低于單純Aβ1-42作用組，單獨(dú)給予人參皂苷Rg1細(xì)胞內(nèi)NO水平與對照組相似。這提示人參皂苷Rg1可不同程度的減少寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)NO水平升高。
4.Western-blot檢測JNK、p38的蛋白水平棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗2次，每孔加入100μl細(xì)胞裂解液〔10mmol/L Tris(PH7.4)、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、1mmol/L NaF、20mmol/L Na4P2O7、2mmol/L Na3VO4、0.1％SDS、0.5％Sodium deoxycholate、1％Trion-X100、1mmol/LPMSF、60μg/ml aprotinin、10μg/ml leupeptin、1μg/mlpepstatin〕，在冰面上裂解20min，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，混勻，于14000×g、4℃離心10min，吸上清液至離心管中，Bradford法進(jìn)行蛋白定量。取20μg樣品，加入等體積的2×上樣緩沖液〔125mmol/L Tris(PH6.8)、10％g lycerol、10％SDS、0.006％bromophenol blue、130mmol/L DTT〕混勻，100℃沸水中煮90sec，以10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用半干電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫下用封閉液封閉1h后將膜移入用封閉液稀釋的一抗(1∶1000稀釋，兔來源的多克隆抗體JNK、p-JNK、p38和鼠來源的單克隆抗體p-p38)，4℃孵育過夜，洗液洗滌3×5min、1×10min，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的IgG二抗(1∶1000稀釋)反應(yīng)2h，洗液洗滌3×5min、1×10min，用化學(xué)發(fā)光法顯色，X射線底片曝光。β-actin作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
4.1寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元p38磷酸化水平的增加本實(shí)施例選擇1h內(nèi)來研究寡聚態(tài)Aβ1-42對原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元的影響，即在原代培養(yǎng)的小鼠皮層細(xì)胞中，加入5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用5min、15min、30min和60min，然后用western-blot來測定細(xì)胞內(nèi)p-p38和p38的蛋白水平。從圖2.7所示，可以看到Aβ1-42作用5min后p-p38/p38的比值明顯升高，這提示Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元p38發(fā)生磷酸化，激活了p38的活性。但是隨著Aβ1-42作用時間的延長，p-p38/p38的比值升高也發(fā)生了變化，逐漸下降。
4.2人參皂苷Rg1降低寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元p38磷酸化前面研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)5μM寡聚態(tài)Aβ1-42作用5min時p-p38/p38比值達(dá)到最高。所以，我們選擇5min作為寡聚態(tài)Aβ1-42作用時間，研究人參皂苷Rg1對p38磷酸化的可能影響。結(jié)果如圖2.8所示20μM的p38特異性抑制劑SB203580可明顯抑制寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的p38磷酸化，而不同濃度的人參皂苷Rg1具有與p38特異性抑制劑SB203580相似的作用，可不同程度的降低p-p38/p38比值。此外，單獨(dú)給予10μM的人參皂苷Rg1處理可明顯地減少p-p38的蛋白表達(dá)水平。這提示人參皂苷Rg1可抑制皮層神經(jīng)元p38的磷酸化和減輕Aβ1-42誘導(dǎo)p38發(fā)生磷酸化，從而抑制p38介導(dǎo)的早期應(yīng)激反應(yīng)。
4.3寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元c-Jun氨基端激酶(JNK)磷酸化水平的增加本實(shí)施例以5μM寡聚態(tài)Aβ1-42，研究1h內(nèi)(5min、15min、30min和60min)JNK磷酸化水平的變化情況。從圖2.9所示，可以看到Aβ1-42可使得p-JNK/JNK的比值升高，這提示Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元的JNK過度磷酸化。但是隨著Aβ1-42作用時間的延長，p-JNK/JNK的比值也發(fā)生了變化。在Aβ1-42作用15min和30min時，p-JNK/JNK的比值最高，隨著時間的延長p-JNK/JNK的比值逐漸下降。這提示Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元JNK活性增高是有時間范圍的，而且是在早期發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)激活JNK的活性。
4.4人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元JNK磷酸化前面研究發(fā)現(xiàn)寡聚態(tài)Aβ1-42可使得p-JNK/JNK的比值發(fā)生了改變，在15min和30min時，p-JNK/JNK的比值達(dá)到最高水平后，p-JNK/JNK的比值就逐漸下降。所以，選擇15min作為研究的時間點(diǎn)，探討人參皂苷對p-JNK/JNK的比值的可能影響。研究結(jié)果如圖2.10所示，10μM的JNK磷酸化特異性抑制劑sp600125可阻斷寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的p-JNK/JNK的比值升高，不同濃度的人參皂苷Rg1可不同程度的減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的p-JNK/JNK的比值升高，這提示人參皂苷Rg1可抑制JNK的活性，從而減輕Aβ1-42介導(dǎo)的早期應(yīng)激損害。
實(shí)施例3人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元線粒體損傷
1.熒光法測定線粒體膜電位的水平不同條件處理的各組細(xì)胞，經(jīng)0.25％的胰酶消化，無菌的HBSS(Hank s’balanced saltsolution)小心洗滌后計數(shù)。取相同細(xì)胞數(shù)，直接加入1xJC-1在37℃的培養(yǎng)箱孵育15min后，用HBSS洗滌三次，加入等體積的分析緩沖液輕輕混勻，上機(jī)檢測熒光強(qiáng)度(exλ488nm，emλ525nm；exλ530nm，emλ590nm)。所得的熒光強(qiáng)度比值反映線粒體內(nèi)外膜電位差紅色熒光強(qiáng)度(exλ530nm，emλ590nm)/綠色熒光強(qiáng)度(exλ488nm，emλ525nm)。
1.1寡聚態(tài)Aβ1-42對皮層神經(jīng)元線粒體膜電位的破壞作用正常細(xì)胞的線粒體膜上，內(nèi)外側(cè)面存在電位差，它是線粒體維持電子傳導(dǎo)過程所需要，如果線粒體膜上的電位差減弱了，該線粒體功能將受到限制。本中請發(fā)現(xiàn)，5μM寡聚態(tài)Aβ1-42可降低線粒體膜上的電位差，隨著寡聚態(tài)Aβ1-42作用時間(3h、6h、12h、24h、48h)的延長，該線粒體的膜電位差越來越小，如圖3.1所示。這提示寡聚態(tài)Aβ1-42對神經(jīng)元線粒體具有毒性作用。
1.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對神經(jīng)元線粒體膜電位的破壞作用前面研究發(fā)現(xiàn)寡聚態(tài)Aβ1-42作用24h或48h可明顯降低線粒體膜電位，因此在前面研究基礎(chǔ)上，探討人參皂苷Rg1對寡聚態(tài)Aβ1-42破壞線粒體膜電位的可能影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的人參皂苷Rg1可不同程度的提高線粒體膜電位，減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對線粒體膜電位的破壞作用。這提示人參皂苷Rg1可能具有保護(hù)線粒體，減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對神經(jīng)元線粒體的毒性作用，結(jié)果如圖3.2所示。
2.細(xì)胞內(nèi)ATP水平測定采用Roche公司的ATP Bioluminescence As say Kit HS II檢測細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。ATP試劑盒中的溶解緩沖液(dilution buffer)將各組細(xì)胞數(shù)量調(diào)至104/ml，之后加入ATP試劑盒中的細(xì)胞裂解試劑(cell lysis reagent)于15℃-25℃條件下作用5min，最后加入等體積的熒光(素)酶試劑(luciferase reagent)，用化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度，比較不同組細(xì)胞內(nèi)ATP水平。
2.1寡聚態(tài)Aβ1-42降低皮層神經(jīng)元ATP的水平ATP是細(xì)胞內(nèi)直接的能量提供體，它來源于線粒體。ATP的水平直接反應(yīng)線粒體的功能狀態(tài)，也可提示線粒體的損害與否和損害程度。如圖3.3所示，5μM寡聚態(tài)Aβ1-42可降低細(xì)胞內(nèi)ATP的水平，并且在12h、24h和48h時ATP的水平降低有統(tǒng)計學(xué)意義(p值分別為0.047，0.001，0.0004)，以Aβ1-42作用24h和48h時ATP水平降低最為明顯。這也提示寡聚態(tài)Aβ1-42可破壞線粒體產(chǎn)生能量的功能，并隨時間的延長，其破壞作用越來越嚴(yán)重。
2.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42降低皮層神經(jīng)元ATP產(chǎn)生的作用前面研究發(fā)現(xiàn)5μM寡聚態(tài)的Aβ1-42作用于皮層神經(jīng)元24h和48h時，神經(jīng)元內(nèi)的ATP水平已經(jīng)明顯下降。在此基礎(chǔ)上，研究不同濃度的人參皂苷Rg1對細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響。結(jié)果如圖2.14所示不論在寡聚態(tài)的Aβ1-42作用于皮層神經(jīng)元24h還是48h，不同濃度的人參皂苷Rg1可減輕寡聚態(tài)的Aβ1-42降低細(xì)胞內(nèi)ATP的程度。這提示人參皂苷Rg1可能具有保護(hù)線粒體，減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對線粒體的破壞作用。
3.細(xì)胞內(nèi)線粒體復(fù)合物IV活性測定(1)寡聚態(tài)Aβ1-42作用于皮層神經(jīng)元不同時間，用1x冷的PBS(PH7.4)洗2遍。
(2)用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞(每組大約1×107個細(xì)胞)，離心、棄上清。
(3)用50μL分離緩沖液(isolaton buffer250mM sucrose；20mMHEPES PH7.2 and 1mM EDTA)輕輕重懸細(xì)胞。
(4)加入1x分析緩沖液(1x assay buffer10mM Tris-HCl PH7.0 and 120mM KCl)輕輕重懸細(xì)胞。
(5)加入1x酶溶解緩沖液(1x enzyme dilution buffer10mM Tris-HCl PH7.0)50μL輕輕重懸細(xì)胞。吸出小部分的混勻液體進(jìn)行蛋白定量。
(6)最后加入50μL細(xì)胞色素c底物溶液(ferrocytochrome csubstrate solution)(0.22mM)，在波長550nm測定其在3min內(nèi)每5秒吸光值。
3.1寡聚態(tài)Aβ1-42對線粒體復(fù)合物IV活性的損害線粒體復(fù)合物IV是線粒體電子傳遞鏈上重要的復(fù)合物酶，它的活性變化關(guān)系到線粒體產(chǎn)生ATP的能力和影響到氧化產(chǎn)物的生成。本實(shí)施例用線粒體復(fù)合物IV的特異性底物細(xì)胞色素c在550nm的吸光值改變情況，間接提示線粒體復(fù)合物IV的功能狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)線粒體復(fù)合物IV活性受到寡聚態(tài)Aβ1-42的影響，寡聚態(tài)的Aβ1-42可降低線粒體復(fù)合物IV的活性。在5.0μM寡聚態(tài)Aβ1-42的作用12h、24h和48h后，線粒體內(nèi)復(fù)合物IV不同程度下降，尤其是寡聚態(tài)Aβ1-42的作用24h和48h后，線粒體內(nèi)復(fù)合物IV下降最為明顯，如圖3.5所示。
3.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對線粒體復(fù)合物IV的活性損害前面研究發(fā)現(xiàn)寡聚態(tài)Aβ1-42可抑制線粒體復(fù)合物IV的活性，寡聚態(tài)Aβ1-42作用24h和48h后，線粒體內(nèi)復(fù)合物IV活性明顯下降。所以，在前面的研究基礎(chǔ)上，探討人參皂苷Rg1對Aβ1-42抑制復(fù)合物IV活性的可能影響。各種濃度的人參皂苷Rg1可不同程度的減輕Aβ1-42對復(fù)合物IV活性的抑制作用，提示人參皂苷Rg1能減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV活性的抑制作用，如圖3.6所示。
4.細(xì)胞線粒體的提取、細(xì)胞胞漿和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c的測定提取細(xì)胞線粒體的步驟(1)不同濃度寡聚態(tài)Aβ1-42作用于皮層神經(jīng)元不同時間，用冷的1x PBS(PH7.4)洗一遍。
(2)用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞(每組大約1×107個細(xì)胞)，4℃條件600xg離心5min棄上清，重復(fù)兩次。
(3)加入1ml胞漿緩沖液(1x cytosolic buffer)，輕輕重懸，置于冰上15min。
(4)在冰上用1ml的勻漿器(KONTES，F(xiàn)isher Scientific Company)手動勻漿后，4℃條件下800xg離心20min棄沉淀物(沉淀物為細(xì)胞核、細(xì)胞碎片和完整的細(xì)胞)，上清包含線粒體和胞漿液。
(5)上清液于4℃條件下800xg離心10min棄除殘余的細(xì)胞核，重復(fù)2次。
(6)于4℃條件下10000xg離心20min，所得上清為胞漿成分，沉淀為線粒體成分。
(7)用1x胞漿緩沖液(1x cytosolic buffer)重懸線粒體部分，于4℃條件下10000xg離心20min棄上清后，加入完整的線粒體緩沖液(complete mitochondrial buffer)，冰上裂解15min后充分混勻。
(8)含有胞漿成分的上清液體，于4℃條件下16000xg離心30min，棄沉淀。
(9)用Bio-Rad protein assay測定蛋白濃度，分裝后置于-80℃保存。
測定細(xì)胞胞漿和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c(1)細(xì)胞色素c標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和含細(xì)胞色素c的樣品滴加用已知濃度的細(xì)胞色素c按照梯度用封閉緩沖液從50ng/ml-0.781ng/ml依次稀釋。含細(xì)胞色素c的樣品用封閉緩沖液稀釋到20-100ng/ml濃度，每孔加入100μL體積。
(2)細(xì)胞色素c與抗體的結(jié)合在室溫下100rpm的速度孵育2h后，用250μL洗液洗3次。
(3)細(xì)胞色素c檢測抗體的結(jié)合按照說明書要求配合所需的細(xì)胞色素c檢測抗體濃度，室溫下100rpm的速度孵育1h后，用250μL洗液洗3次。
(4)HRP耦聯(lián)的streptavidin與細(xì)胞色素c檢測抗體結(jié)合按照說明書要求配合所需濃度，室溫下100rpm的速度孵育1h后，用250μL洗液洗4次。
(5)顯色、讀數(shù)用develping solution室溫下孵育2-10min后，加入stop solution，最后在450hm分光光度計讀數(shù)。
4.1寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元線粒體細(xì)胞色素c的釋放細(xì)胞色素c主要存在于線粒體內(nèi)，是線粒體電子傳遞鏈重要物質(zhì)，參與線粒體的氧化磷酸化和ATP的產(chǎn)生。正常情況下細(xì)胞色素c存在于線粒體內(nèi)，當(dāng)線粒體受到損害時線粒體的雙膜結(jié)構(gòu)通透性增加或膜完整性被破壞，線粒體的細(xì)胞色素c就釋放到胞漿中，從而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)caspase依賴性的凋亡產(chǎn)生。如圖3.7所示，對照組中胞漿的細(xì)胞色素c含量是很少，大部分細(xì)胞色素c位于細(xì)胞線粒體中。在經(jīng)過5.0μM寡聚態(tài)Aβ1-42作用后，隨著時間的延長，胞漿內(nèi)的細(xì)胞色素c含量逐漸增高，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c的含量不斷的減少。
4.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體細(xì)胞色素c的釋放前面研究發(fā)現(xiàn)寡聚態(tài)Aβ1-42作用48h后，胞漿內(nèi)的細(xì)胞色素c含量明顯增高，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c的含量明顯的減少，胞漿內(nèi)的細(xì)胞色素c含量超過線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c含量。在此基礎(chǔ)上，研究不同濃度的人參皂苷Rg1預(yù)孵育24h后與寡聚態(tài)的Aβ1-42共孵育48h，然后測定胞漿和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c的含量，結(jié)果如圖3.8所示不同濃度的人參皂苷Rg1預(yù)孵育組可不同程度的減少胞漿中的細(xì)胞色素c，提高線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c含量。這提示人參皂苷對線粒體具有一定的保護(hù)作用。
實(shí)施例4人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對PKA-CREB信號通路的影響1.Western-blot檢測p-CREB/CREB及PKA IIα亞基的蛋白水平棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBs清洗2次，每孔加入100μl細(xì)胞裂解液〔10mmol/L Tris(PH7.4)、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、1mmol/L NaF、20mmol/L Na4P2O7、2mmol/L Na3VO4、0.1％SDS、0.5％Sodium deoxycholate、1％Trion-X 100、1mmol/LPMSF、60μg/ml aprotinin、10μg/ml leupeptin、1μg/mlpepstatin〕，在冰面上裂解20min，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，混勻，于14000×g、4℃離心10min，吸上清液至EP管中，Bradford法進(jìn)行蛋白定量。取20μg樣品，加入等體積的2×上樣緩沖液〔125mmol/L Tris(PH6.8)、10％g lycerol、10％SDS、0.006％bromophenol blue、130mmol/L DTT〕混勻，100℃沸水中煮90sec，以10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用半干電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫下用封閉液封閉1h后將膜移入用封閉液稀釋的一抗(兔來源的多克隆抗體CREB、鼠來源的單克隆抗體p-CREB和兔來源的多克隆抗體PKA IIα分別1∶1000稀釋)，4℃孵育過夜，洗液洗滌3×5min、1×10min，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的IgG二抗(1∶1000稀釋)反應(yīng)2h，洗液洗滌3×5min、1×10min，用化學(xué)發(fā)光法顯色，X射線底片曝光。β-actin作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.1寡聚態(tài)Aβ1-42降低CREB的磷酸化程度CREB又名cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，CREB在Ser133位點(diǎn)磷酸化可使得CREB-cAMP結(jié)合物增強(qiáng)下游基因的蛋白表達(dá)。研究結(jié)果如圖4.1所示，寡聚態(tài)Aβ1-42降低谷氨酸介導(dǎo)的CREB的磷酸化水平，在Aβ1-42作用2h時，p-CREB/CREB的比值降低最為明顯。
1.2人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42降低CREB的磷酸化程度前面研究表明，寡聚態(tài)Aβ1-42可降低谷氨酸介導(dǎo)的CREB的磷酸化，在5.0μM寡聚態(tài)Aβ1-42作用2h時，p-CREB/CREB的比值降低最為明顯。因此，選擇2h作為Aβ1-42作用的時間點(diǎn)，研究人參皂苷Rg1對其可能影響。結(jié)果如圖4.2所示，人參皂苷Rg1可不同程度的增加p-CREB蛋白水平，使得p-CREB/CREB的比值升高。
1.3人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的PKA IIα亞基的蛋白水平PKA IIα亞基是PKA的調(diào)節(jié)亞基，它是cAMP與PKA結(jié)合的基團(tuán)，PKA IIα亞基的蛋白水平與PKA的活性呈反比。本實(shí)施例將探討5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用2h后，PKA活性的變化的基礎(chǔ)上，從PKA亞基的角度來研究和間接推測PKA的活性情況，以及人參皂苷Rg1可能的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果如圖4.4所示。
2.細(xì)胞內(nèi)PKA活性測定(1)處理后的各組細(xì)胞，吸棄上清，用1×冰冷的PBS洗一遍。加入裂解液buffer[20mM MOPS，50mM β-glycerolphosphate，50mMsodium fluoride，1mM sodium vanadate，5mM EGTA，2mM EDTA，1％NP40，1mM dithiothreitol，1mM benzamidine，1mM PMSF and 10μg/mL leupeptin and aprotinin]；(2)冰上裂解10分鐘，細(xì)胞刮刀刮下，移至1.5ml的離心管；(3)13,000rpm離心15分鐘；(4)取上清，蛋白定量。
(5)PKA酶作用底物的準(zhǔn)備工作a)計算所需的孔數(shù)，把剩余的保存在4℃的干燥密封錫箔紙袋子；b)每孔加入50μL的kinase assay dilution buffer，在室溫浸泡10分鐘；c)小心吸棄各孔液體。
(6)加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品a)每孔加入30μL的反應(yīng)液加入純的活性PKA或樣品或空白孔(只有kinase assay dilutionbuffer)；b)除了空白組，每孔加入10μL的ATP溶液(用kinaseassay dilution buffer溶解的1mg/mL濃度)，未來避免交叉污染，加入每孔的液體后換新的tip頭；c)封好給孔，在30℃孵育90分鐘，最好是每隔20分鐘輕輕搖晃幾下，以便充分混勻；d)吸棄每孔液體以終止反應(yīng)，倒扣板，在干凈的紙上，輕拍反應(yīng)板。
(7)加入特異性磷酸底物抗體a)除了空白孔，每孔加入40μL的phospho-secific substrate antibody；b)用新的具有黏附功能的封口膜，封好板，室溫下孵育60分鐘，最后是每隔20分鐘輕搖，使其充分混勻。
(8)洗板a)吸棄各孔液體；b)每孔加入100μL的洗液，使用排槍(為了降低背景，每次洗液間隔1-2分鐘)；c)重復(fù)洗3次，共4次；d)第4次，吸棄洗液后，倒扣板，在干凈紙上，輕拍板。
(9)加入抗兔Ig-GHRP CONJUGATEa)除了空白孔，每孔加入40μL的現(xiàn)配好的抗兔IgGHRP Conjugate(1∶1000的antibody dilution buffer稀釋)；b)封好板，在室溫下孵育30分鐘，每隔10分鐘輕搖，使其充分混勻；c)洗板，步驟同4。
(10)加入TMB SUBSTRATE和ACID STOP SOLUTIONa)每孔加入60μL的TMB SUBSTRATE；b)室溫下孵育30-60min，同時觀察顏色變化；c)按照加入TMB SUBSTRATE的順序加入20μL的STOP SOLUTION。
(11)測定吸光值吸光波長450nm。
2.1人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42對PKA酶活性的降低蛋白激酶A(PKA)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的蛋白激酶，活化的PKA可使細(xì)胞內(nèi)某些蛋白(包括CREB)的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，于是改變這些蛋白的活性，進(jìn)一步影響到相關(guān)基因的表達(dá)。在前面研究發(fā)現(xiàn)，5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用2h可明顯降低CREB的磷酸化水平，而CREB最主要的調(diào)節(jié)激酶為PKA，所以本實(shí)施例將探討5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用2h后，PKA活性的變化，以及人參皂苷Rg1可能的保護(hù)作用。結(jié)果圖4.3所示5μM的寡聚態(tài)Aβ1-42作用2h后，PKA的活性顯著下降，各濃度的人參皂苷Rg1可不同程度的減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的PKA活性下降。這些提示人參皂苷Rg1可能直接或間接的保護(hù)PKA的活性，減輕Aβ1-42對PKA的抑制作用。
權(quán)利要求
1.人參皂苷Rg1的新用途，其特征在于人參皂苷Rg1在制備治療/預(yù)防Aβ1-42介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用所引起的阿爾茨海默病的藥物/保健品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參皂苷Rg1的新用途，其特征在于所述的神經(jīng)毒性作用是指Aβ1-42介導(dǎo)的皮層神經(jīng)元調(diào)亡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參皂苷Rg1的新用途，其特征在于所述的神經(jīng)毒性作用是指Aβ1-42介導(dǎo)的早期神經(jīng)元應(yīng)激損害。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參皂苷Rg1的新用途，其特征在于所述神經(jīng)毒性作用是指Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元線粒體損傷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參皂苷Rg1的新用途，其特征在于所述神經(jīng)毒性作用是指Aβ1-42對蛋白激酶K-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白信號通路的抑制作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人參皂苷Rg1治療/預(yù)防阿爾茨海默病的用途，提供了人參皂苷Rg1在治療/預(yù)防Aβ
文檔編號A61P25/00GK101084909SQ20071000917
公開日2007年12月12日 申請日期2007年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日
發(fā)明者陳曉春 申請人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院