專利名稱：克列維醇的制備方法及在制抗乙酰膽堿酯酶藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種克列維醇(clavatol)，尤其是涉及一種來源于紅樹林內(nèi)生真菌一矮棒曲霉BYY-1(A.clavatonanicus)真菌代謝產(chǎn)物克列維醇化合物的制備方法，以及該化合物在制備治療早老性癡呆及其它與乙酰膽堿缺乏相關(guān)的疾病藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
老年性癡呆病是一種神經(jīng)退化性的疾病，在65～69歲的老年人口中發(fā)病率約為10％，85歲以上的患病率約為47％，而且仍在增長之中。老年性癡呆病嚴重危害老年人的健康和生活質(zhì)量，患病后會使病人逐漸喪失學習和記憶能力，產(chǎn)生嚴重的生活自理障礙并導致死亡。
阿爾茨海默病或稱早老性癡呆病(Alzheimer’s Disease，AD)是老年性癡呆病的一種主要類型，癡呆病患者中約有50％屬于該類型。AD的發(fā)病機理復(fù)雜，其病因之一是與乙酰膽堿(Ach)、興奮性氨基酸等多種神經(jīng)遞質(zhì)紊亂有關(guān)，其中膽堿能系統(tǒng)功能缺陷尤為突出。大量的研究結(jié)果表明，通過增強膽堿能系統(tǒng)功能，可有效改善AD患者的臨床癥狀，因此開發(fā)具有增強膽堿能系統(tǒng)功能的藥物成為當今治療AD的研究重點之一。乙酰膽堿酯酶抑制劑(AchEI)能有效抑制AD患者腦神經(jīng)組織中的乙酰膽堿酯酶(AchE)對乙酰膽堿的降解活性，提高患者腦神經(jīng)組織中的乙酰膽堿的含量，從而達到改善病人的臨床癥狀。此外，目前還發(fā)現(xiàn)這類抑制劑對另一種類型的血管性癡呆(Vascular Dementia VaD)以及注意力障礙和失眠等疾病也有治療效果。AchEI被認為是至今治療老年癡呆最有效的藥物。
目前已有Tacrine、donepezil、rivastigmine、galanthamine和huprine等少數(shù)幾種AchEI類的藥物上市。這些藥物均來源于化學合成或植物次級代謝產(chǎn)物，它們均具有不同程度改善老年癡呆患者的認知能力和生活質(zhì)量的作用。但這些藥物也存在著療效較差或副作用較大等問題，影響了其在臨床上的應(yīng)用。迄今為止，還沒有采用藥物治愈AD的病例。因此研發(fā)高效、低毒的新型AchEI至今仍然是治療AD新藥的研究熱點。
近年來，開發(fā)微生物來源的AchEI開始引起了人們的重視，目前已從不同的微生物的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一些AchEI，其中從真菌次級代謝產(chǎn)物中分離到的Isoterreulactone、Terreulactone等化合物對AchE抑制活性很強，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景(Peter J.Houghton，Yuhao Rena，Melanie-Jayne Howesb.Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi.Nat.Prod.Rep.，2006，23181-199；Katia F.Rodriguesl，Gisela L. Costal，Meriane P. Carvalho，et al.Evaluation of extracts produced by some tropical fungi as potential cholinesterase inhibitors.World Journal ofMicrobiology & Biotechnology，2005，211617-1621)，這些研究結(jié)果表明微生物是開發(fā)AchEI的重要資源。
紅樹林為自然分布于熱帶和亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，通常生長在港灣河口地區(qū)的淤泥灘涂上，是海灘上特有的森林類型。生活在這類獨特植物組織中的內(nèi)生真菌種類豐富，能產(chǎn)生許多與宿主植物相同或不同的活性代謝產(chǎn)物，包括一些在陸棲微生物中未曾發(fā)現(xiàn)過的生物活性物質(zhì)，是一類重要的藥源微生物。目前人們對紅樹植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物已進行了一些研究，從中發(fā)現(xiàn)了不少具有潛在應(yīng)用前景的抗菌、抗腫瘤化合物，但鮮見對這類真菌產(chǎn)生乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究開發(fā)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來源于紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物克列維醇的制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于將來源于紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物克列維醇化合物用于制備治療早老性癡呆及其它與乙酰膽堿缺乏相關(guān)的疾病藥物。
所述的克列維醇來源于紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物，紅樹林內(nèi)生真菌為矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)，已于2006年7月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC中國武漢大學校內(nèi))，保藏號為CCTCCNOM206063。
所述的克列維醇為2，4-Dihydroxy-3，5-dimethylacetophenone，其化學結(jié)構(gòu)式如下 所述的克列維醇的制備方法為1)矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)的種子培養(yǎng)A.配制斜面培養(yǎng)基馬鈴薯去皮切塊，放入海水中，煮后過濾，濾液用海水定容，得馬鈴薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖及瓊脂，分裝試管，滅菌后制成斜面培養(yǎng)基。將矮棒曲霉BYY-1轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
B.配制種子液在馬鈴薯汁中添加葡萄糖或蔗糖，分裝后滅菌，得種子培養(yǎng)基。將上述培養(yǎng)的斜面菌種接入到分裝后的種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，得種子液。
C.種子罐種子培養(yǎng)先配制種子培養(yǎng)基(配方同上)，將種子培養(yǎng)基裝入種子罐，將上述培養(yǎng)的種子液接入種子罐中，培養(yǎng)后得培養(yǎng)后的種子液。
2、克列維醇的發(fā)酵配制發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同種子培養(yǎng)基)，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，將上述培養(yǎng)后的種子液接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵后得發(fā)酵液。
3、克列維醇的提取將發(fā)酵液過濾除菌體，濾液減壓濃縮后用有機溶劑萃取，收集有機相并減壓濃縮成浸膏。
4、克列維醇的精制浸膏用甲醇溶解得克列維醇甲醇溶液，在克列維醇甲醇溶液中加入硅膠拌樣，上硅膠柱進行分離，以石油醚/乙酸乙酯(石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100)為洗脫劑梯度洗脫，收集當石油醚/乙酸乙酯的體積比例為(50～3)∶1時的洗脫液，合并洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加溶劑溶解后重結(jié)晶至少2次，得目標產(chǎn)物，即克列維醇。
在步驟1)中，配制斜面培養(yǎng)基的馬鈴薯去皮切成小塊，取150～300g放入1L 20％～100％海水(海水與自來水按體積比混合)中，煮后過濾，濾液用20％～100％海水定容至1000ml，得馬鈴薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖10～30g，瓊脂1.5～3.0g，分裝試管，121℃滅菌30min后制成斜面培養(yǎng)基，將矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上后25～32℃下培養(yǎng)3～7d；配制種子液時，在每升馬鈴薯汁(制備方法同上)中添加葡萄糖或蔗糖10～30g，分裝后滅菌(121℃，30min)，得種子培養(yǎng)基，將上述培養(yǎng)的斜面菌種接入到分裝后的種子培養(yǎng)基中，25～32℃下，120～250r/min搖瓶培養(yǎng)2～5d，得種子液；種子罐種子培養(yǎng)時，將種子培養(yǎng)基裝入種子罐的裝罐量為種子罐容積的60％～70％，將上述培養(yǎng)的種子液按接種量2％～10％接入種子罐中，在溫度25～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速120～220r/min和通氣量0.3～1.2vvm的條件下培養(yǎng)2～4d，得培養(yǎng)后的種子液。
在步驟2)中，配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐的裝罐量為發(fā)酵罐容積的60％～70％，將上述培養(yǎng)后的種子液按接種量5％～10％接入發(fā)酵罐中，在溫度25～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速120～200r/min和通氣量0.3～1.5vvm的條件下發(fā)酵4～7d，得發(fā)酵液。
在步驟3)中，將發(fā)酵液過濾除菌體，濾液減壓濃縮至發(fā)酵液體積的35％～20％后用有機溶劑萃取至少2次，收集有機相并減壓濃縮成浸膏，有機溶劑選自乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、甲苯中的一種。
在步驟4)中，在克列維醇甲醇溶液中加入質(zhì)量為浸膏5～10倍的硅膠拌樣，收集當石油醚/乙酸乙酯的體積比例為(50～3)/1時的洗脫液。溶劑選自甲醇、乙酸乙酯和丙酮中的一種。
所得的化合物無色針狀晶體，mp180～182℃，ESIMSm/z(rel.int.)179.0[M-H]-；1H-NMR和13C-NMR(500MHz，DMSO，ppm)數(shù)據(jù)見表1。經(jīng)譜圖綜合解析結(jié)果證實該化合物為克列維醇。
表1 克列維醇的NMR數(shù)據(jù)

來源于紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物克列維醇化合物可用于制備治療早老性癡呆及其它與乙酰膽堿缺乏相關(guān)的疾病藥物。
本發(fā)明從一株紅樹植物內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物中分離到一個酚類化合物克列維醇，該化合物是一種高效、可逆的乙酰膽堿酯酶抑制劑，本發(fā)明所述的克列維醇可通過深層液體發(fā)酵大量生產(chǎn)，無原材料之憂，且提取精制方法簡單，適合規(guī)?；a(chǎn)。經(jīng)藥理實驗證實該化合物對乙酰膽堿酯酶具有顯著的抑制作用，是一種可逆性的乙酰膽堿酯酶抑制劑，可用于制備治療早老性癡呆及其它與乙酰膽堿缺乏相關(guān)的疾病。


圖1為克列維醇對乙酰膽堿酯酶的抑制活性，在圖1中，橫坐標為克列維醇濃度的對數(shù)log10[μM]，縱坐標為克列維醇對乙酰膽堿酯酶的抑制率AchE inhibition(％)。IC50為抑制酶活力50％時的抑制劑濃度，R2＝0.9687為回歸系數(shù)。
圖2為克列維醇對乙酰膽堿酯酶的抑制類型的判斷。在圖2中，直線0，1，2的克列維醇濃度分別為3.125μg/ml，6.25μg/ml，0μg/ml，橫坐標為酶濃度U/ml，縱坐標為OD值。
圖3為克列維醇對乙酰膽堿酯酶抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖。在圖3中，直線1，2，3的克列維醇濃度分別為3.125μg/ml，6.25μg/ml，0μg/ml，橫坐標為底物濃度S的倒數(shù)1/S(mmol/L)-1，縱坐標為速度V的倒數(shù)1/V(mmol/L/min)-1。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。
實施例1A.培養(yǎng)基配方斜面培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(馬鈴薯去皮切成小塊，取200g放入1L 50％海水中，煮30min，過濾，濾液用50％海水(海水與自來水按體積比混合)定容至1000ml)中添加葡萄糖20g，瓊脂2.0g。種子培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(制法同上)中添加葡萄糖20g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方同種子培養(yǎng)基。
B.發(fā)酵工藝斜面培養(yǎng)按上述斜面培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝試管，121℃滅菌30min后制斜面。將保存的紅樹植物內(nèi)生真菌一矮棒曲霉CCTCC NOM206063菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)7d。搖瓶培養(yǎng)按種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝500錐型瓶(80ml/瓶)，滅菌(121℃，30min)后將培養(yǎng)的斜面菌種接入，28℃下，140r/min搖瓶培養(yǎng)3d。種子罐培養(yǎng)按種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，20L種子罐培養(yǎng)基裝量為12L，121℃滅菌30min，冷卻后將培養(yǎng)的搖瓶種子按接種量2％接入種子罐中，在溫度28℃、攪拌轉(zhuǎn)速120r/min和通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)3d。發(fā)酵罐培養(yǎng)按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，200L發(fā)酵罐培養(yǎng)基裝量為120L，121℃滅菌30min，待冷卻至28℃后將上述種子罐已培養(yǎng)好的種子按接種量10％接入罐中，在溫度28℃、攪拌轉(zhuǎn)速120r/min和通氣量0.3vvm的條件下培養(yǎng)7d。
C.克列維醇的提取發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液過濾除菌體，濾液減壓濃縮至原液體積的25％后用乙酸乙酯萃取3次，收集有機相并減壓濃縮成浸膏。
D.克列維醇的精制浸膏用少量的甲醇溶解后加入適量硅膠拌樣，上硅膠柱進行分離，以石油醚-乙酸乙酯＝50∶1(v/v)為洗脫劑洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加適量的乙酸乙酯溶解，于室溫下重結(jié)晶，同法再重結(jié)晶4次。
實施例2A.培養(yǎng)基配方斜面培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(馬鈴薯去皮切成小塊，取300g放入1L 100％海水中，煮30min，過濾，濾液用100％海水定容至1000ml)中添加葡萄糖30g，瓊脂3.0g。種子培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(制法同上)中添加蔗糖30g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方同種子培養(yǎng)基。
B.發(fā)酵工藝斜面培養(yǎng)按上述斜面培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝試管，121℃滅菌30min后制斜面。將保存的紅樹植物內(nèi)生真菌一矮棒曲霉CCTCC NOM206063菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)5d。搖瓶培養(yǎng)按上述種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝錐型瓶(100ml/瓶)，滅菌(121℃，30min)后將上述培養(yǎng)的斜面菌種接入，28℃下，220r/min搖瓶培養(yǎng)3d。種子罐培養(yǎng)按上述種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，20L種子罐培養(yǎng)基裝量為12L，121℃滅菌30min，冷卻后將上述培養(yǎng)的搖瓶種子按接種量5％接入種子罐中，在溫度25℃、攪拌轉(zhuǎn)速220r/min和通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)3d。發(fā)酵罐培養(yǎng)按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，200L發(fā)酵罐培養(yǎng)基裝量為120L，121℃滅菌30min，待冷卻至25℃后將上述種子罐已培養(yǎng)好的種子按接種量5％接入罐中，在溫度25℃、攪拌轉(zhuǎn)速220r/min和通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)3d。
C.克列維醇的提取發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液過濾除菌體，濾液減壓濃縮至原液體積的20％后用乙酸乙酯萃取5次，收集有機相并減壓濃縮成浸膏。
D.克列維醇的精制浸膏用少量的甲醇溶解后加入適量硅膠拌樣，上硅膠柱進行分離，以石油醚-乙酸乙酯＝20∶1(v/v)為洗脫劑洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加適量的甲醇溶解，于室溫下重結(jié)晶，同法再重結(jié)晶2次。
實施例3A.培養(yǎng)基配方斜面培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(馬鈴薯去皮切成小塊，取150g放入1L 20％海水中，煮30min，過濾，濾液用20％海水(海水與自來水按體積比混合)定容至1000ml)中添加葡萄糖15g，瓊脂1.5g。種子培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(制法同上)中添加葡萄糖15g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方同種子培養(yǎng)基。
B.發(fā)酵工藝斜面培養(yǎng)按上述斜面培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝試管，121℃滅菌30min后制斜面。將保存的紅樹植物內(nèi)生真菌一矮棒曲霉CCTCC NOM206063菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，32℃下培養(yǎng)5d。搖瓶培養(yǎng)按上述種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝500錐型瓶(120ml/瓶)，滅菌(121℃，30min)后將上述培養(yǎng)的斜面菌種接入，32℃下，180r/min搖瓶培養(yǎng)5d。種子罐培養(yǎng)按上述種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，50L種子罐培養(yǎng)基裝量為30L，121℃滅菌30min，冷卻后將上述培養(yǎng)的搖瓶種子按接種量5％接入種子罐中，在溫度32℃、攪拌轉(zhuǎn)速180r/min和通氣量1.2vvm的條件下培養(yǎng)5d。發(fā)酵罐培養(yǎng)按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，500L發(fā)酵罐培養(yǎng)基裝量為120L，121℃滅菌30min，待冷卻至32℃后將上述種子罐已培養(yǎng)好的種子按接種量10％接入罐中，在溫度32℃、攪拌轉(zhuǎn)速180r/min和通氣量1.2vvm的條件下培養(yǎng)5d。
C.克列維醇的提取發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液過濾除菌體，濾液減壓濃縮至原液體積的35％后用乙酸乙酯萃取3次，收集有機相并減壓濃縮成浸膏。
D.克列維醇的精制浸膏用少量的甲醇溶解后加入適量硅膠拌樣，上硅膠柱進行分離，以石油醚-乙酸乙酯＝10∶1(v/v)為洗脫劑洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加適量的丙酮溶解，于室溫下重結(jié)晶，同法再重結(jié)晶3次。
實施例4采用改進的Ellman法分析克列維醇對乙酰膽堿酯酶的抑制活性。
在96孔板上進行分析在96孔板孔中依次分別加入緩沖液B(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.1％牛血清白蛋白)40μL，4℃保存，0.025U/ml的酶液20μL，不同濃度的待測樣品20μL(5％DMSO配制)，37℃保溫15min，加入底物(Acetylthiochoine iodide，2.5mmol/L)20μL，顯色劑(5，5’-Dithiobis-2-nitrobenzoic acid，0.5mmol/L)80μL，37℃酶促反應(yīng)30min，加50μL無水乙醇中止反應(yīng)，于405nm測定各孔的光密度值(OD405)。參比(空白)用5％DMSO，以未加樣品所測得的OD值為陰性對照值。按下式計算抑制率 測定結(jié)果(參見圖1)顯示，克列維醇對乙酰膽堿酯酶的IC50(抑制酶活力50％時的抑制劑濃度)為6.8μmol/L實施例5在上述測活體系中，固定底物濃度(Acetylthiochoine iodide，2.5mmol/L)，加入不同濃度的clavatol，改變加入的酶量(分別加入0.01，0.02，0.025，0.03，0.04，0.05U/ml)，測定不同濃度的克列維醇對AchE活力的影響，以酶活力對酶量作圖得到一組通過原點的直線(參見圖2)，且隨著化合物濃度的增大，直線的斜率降低。說明克列維醇與酶的結(jié)合為可逆結(jié)合，是可逆抑制劑。
實施例6在上述測活體系中，固定酶的濃度(0.025U/ml)，改變底物(ACTI)的濃度，即分別加入0，0.01，0.02，0.025，0.03，0.04，0.05U/ml，測定不同濃度克列維醇對酶活力的影響，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到一組交叉于橫軸的直線(參見圖3)，說明該化合物作為AchE的抑制劑，不影響米氏常數(shù)(Km)，但可以使反應(yīng)的最大反應(yīng)速度(Vmax)下降，是一種非競爭性的可逆抑制劑。以不同濃度克列維醇下求得的1/Vmapp對化合物濃度作圖，得到一條直線，從直線斜率求得克列維醇對酶的抑制常數(shù)Ki為0.037mmol/L。
權(quán)利要求
1.克列維醇的制備方法，所述的克列維醇來源于紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物，紅樹林內(nèi)生真菌為矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)，已于2006年7月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM206063，所述的克列維醇為2，4-Dihydroxy-3，5-dimethylacetophenone，其化學結(jié)構(gòu)式如下 其特征在于包括以下步驟1)矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)的種子培養(yǎng)A.配制斜面培養(yǎng)基馬鈴薯去皮切塊，放入海水中，煮后過濾，濾液用海水定容，得馬鈴薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖及瓊脂，分裝試管，滅菌后制成斜面培養(yǎng)基，將矮棒曲霉BYY-1轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)；B.配制種子液在馬鈴薯汁中添加葡萄糖或蔗糖，分裝后滅菌，得種子培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的斜面菌種接入到分裝后的種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，得種子液；C.種子罐種子培養(yǎng)先配制種子培養(yǎng)基，將種子培養(yǎng)基裝入種子罐，將培養(yǎng)的種子液接入種子罐中，培養(yǎng)后得培養(yǎng)后的種子液；2)克列維醇的發(fā)酵配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，將培養(yǎng)后的種子液接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵后得發(fā)酵液；3)克列維醇的提取將發(fā)酵液過濾除菌體，濾液減壓濃縮后用有機溶劑萃取，收集有機相并減壓濃縮成浸膏；4)克列維醇的精制浸膏用甲醇溶解得克列維醇甲醇溶液，在克列維醇甲醇溶液中加入硅膠拌樣，上硅膠柱進行分離，以石油醚/乙酸乙酯為洗脫劑梯度洗脫，收集當石油醚/乙酸乙酯的體積比例為50～3∶1時的洗脫液，合并洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加溶劑溶解后重結(jié)晶至少2次，得目標產(chǎn)物，即克列維醇，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100。
2.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，配制斜面培養(yǎng)基的馬鈴薯去皮切成小塊，取150～300g放入1L 20％～100％海水中，煮后過濾，濾液用20％～100％海水定容至1000ml，得馬鈴薯汁。
3.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，添加葡萄糖或蔗糖的量為10～30g，瓊脂1.5～3.0g，分裝試管，121℃滅菌30min后制成斜面培養(yǎng)基，將矮棒曲霉BYY-1轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上后25～32℃下培養(yǎng)3～7d。
4.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，配制種子液時，在每升馬鈴薯汁中添加葡萄糖或蔗糖10～30g，分裝后121℃滅菌30min，得種子培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的斜面菌種接入到分裝后的種子培養(yǎng)基中，25～32℃下，120～250r/min搖瓶培養(yǎng)2～5d，得種子液。
5.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，種子罐種子培養(yǎng)時，將種子培養(yǎng)基裝入種子罐的裝罐量為種子罐容積的60％～70％，將培養(yǎng)的種子液按接種量2％～10％接入種子罐中，在溫度25～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速120～220r/min和通氣量0.3～1.2vvm的條件下培養(yǎng)2～4d，得培養(yǎng)后的種子液。
6.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟2)中，配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐的裝罐量為發(fā)酵罐容積的60％～70％，將培養(yǎng)后的種子液按接種量5％～10％接入發(fā)酵罐中，在溫度25～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速120～200r/min和通氣量0.3～1.5vvm的條件下發(fā)酵4～7d，得發(fā)酵液。
7.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟3)中，將發(fā)酵液過濾除菌體，濾液減壓濃縮至發(fā)酵液體積的35％～20％后用有機溶劑萃取至少2次，收集有機相并減壓濃縮成浸膏。
8.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟3)中，有機溶劑選自乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、甲苯中的一種。
9.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟4)中，在克列維醇甲醇溶液中加入質(zhì)量為浸膏5～10倍的硅膠拌樣，收集當石油醚/乙酸乙酯的體積比例為(50～3)/1時的洗脫液，溶劑選自甲醇、乙酸乙酯和丙酮中的一種。
10.如權(quán)利要求1所述的克列維醇在制備治療早老性癡呆及其它與乙酰膽堿缺乏相關(guān)的疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
克列維醇的制備方法及在制抗乙酰膽堿酯酶藥物的應(yīng)用，涉及一種克列維醇。提供一種來源于紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物克列維醇的制備方法和應(yīng)用。制備方法為矮棒曲霉BYY－1種子培養(yǎng)；液體深層發(fā)酵；發(fā)酵液過濾除菌體；濾液減壓濃縮后用有機溶劑多次萃取，收集有機相并減壓濃縮獲得粗提物；粗提物經(jīng)硅膠柱色譜及重結(jié)晶精制后制得克列維醇。克列維醇對乙酰膽堿酯酶具有顯著的抑制作用，是一種可逆性的乙酰膽堿酯酶抑制劑，可用于制備治療早老性癡呆及其它與乙酰膽堿缺乏相關(guān)的疾病的藥物。
文檔編號A61P25/28GK101070550SQ200710008928
公開日2007年11月14日 申請日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者鄭忠輝, 黃珊珊, 杜希萍, 黃耀堅, 宋思揚, 沈月毛 申請人:廈門大學