專利名稱：：兩種溴酚類化合物在制備治療惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療惡性腫瘤的藥物，具體地說是兩種海洋溴酚類化合物的制備方法、藥理活性、用途及藥學(xué)上可接受的鹽、酯、醚和其它明顯的化學(xué)等價(jià)物；該化合物及其衍生物作為蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(pTOte/"ybV7a^，PTK)抑制劑，可用于治療各種高表達(dá)C-hY受體的惡性腫瘤。
背景技術(shù)：
：隨著分子腫瘤學(xué)的發(fā)展，抗腫瘤藥物的研究也從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物趨向作用于分子靶點(diǎn)的新型藥物。蛋白酪氨酸激酶(PTK)是癌癥治療的標(biāo)靶之一，原癌基因C-h'虔HZ4貓科肉瘤病毒kit癌基因的同源物，位于4號(hào)染色體長臂上，編碼145-165kDa跨膜受體(CD117)，具有酪氨酸激酶活性。它的產(chǎn)物是m型酪氨酸蛋白激酶生長因子受體，其結(jié)構(gòu)類似于巨噬細(xì)胞集落刺激因子和血小板衍生物生長因子受體，屬免疫球蛋白超家族成員，具有胞外5個(gè)免疫球蛋白樣類似結(jié)構(gòu)的配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)、膜內(nèi)近膜區(qū)和酪氨酸蛋白激酶區(qū)。在正常組織中，C-hY蛋白在肥大細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、黑素細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)。C-ZbY信號(hào)通路的自分泌和旁分泌刺激參與人腫瘤的發(fā)生，并在多種腫瘤中起到癌基因的作用。C-hY蛋白是生長因子和干細(xì)胞因子(SCF)受體，它和配體干細(xì)胞因子間的相互作用可激活內(nèi)在的酪氨酸激酶，隨之使細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活。原癌基因C-ybY突變會(huì)引起C-hY蛋白的胞外段或胞內(nèi)段發(fā)生變化，導(dǎo)致C-h'f蛋白受體持續(xù)開放，各種底物蛋白不斷自身磷酸化，使得調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡、趨化和粘附等特性的傳導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)釋放并擴(kuò)大，通過該途徑促進(jìn)了細(xì)胞生長，抑制了細(xì)胞凋亡，細(xì)胞正常生物學(xué)特性消失而發(fā)展為腫瘤細(xì)胞。C-y^的致癌潛能已經(jīng)在許多實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，Hines等發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了C-;b'f的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系在培養(yǎng)基中的生長及增殖速率增快，而且這種增殖可被抗C-hY抗體所阻抑；Caruana等對(duì)轉(zhuǎn)染了C4/虔因的重組NIH3T3成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)C-hY的活化可促進(jìn)細(xì)胞增殖并且產(chǎn)生一個(gè)變異的表現(xiàn)型，這已經(jīng)在細(xì)胞克隆及裸鼠腫瘤模型中得到了證實(shí)。近年來，越來越多的研究者研究關(guān)于把C-y^受體作為分子靶治療高表達(dá)C-hY受體的腫瘤，尋找小分子蛋白酪氨酸激酶抑制劑，從而開發(fā)高效的新型抗癌藥物。從現(xiàn)代藥物研究開發(fā)的歷史可見，每次創(chuàng)新藥物的開發(fā)應(yīng)用，首先來自某類新型天然先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，海洋是生命的起源地，在海洋獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境中，大多海藻能產(chǎn)生一些很有特色的活性物質(zhì)。發(fā)明人從一種海洋紅藻中得到兩個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的溴酚類化合物，活性測試表明其對(duì)PTK酶有很強(qiáng)的抑制活性，可用于高表達(dá)C-hY受體的惡性腫瘤的防治，包括胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、肥大細(xì)胞增生型白血病、生殖細(xì)胞腫瘤、小細(xì)胞肺癌、急性白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌和乳腺癌等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供了兩種溴酚類藥物在制備治療高表達(dá)C-kit受體惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用，溴酚化合物及其鹽、酯和醚等衍生物對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶有較好的抑制作用，可用于高表達(dá)C-hY受體的惡性腫瘤的防治。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為兩種具有蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTK)抑制活性的海洋溴酚類化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、酯、醚和其它明顯的化學(xué)等價(jià)物，可用于高表達(dá)C-hY受體的惡性腫瘤的防治。溴酚化合物結(jié)構(gòu)分別如下CHOEtBrOH3_溴_4_[3-溴-4，5-二羥基苯基1甲基-5-(乙氧基)-1，2-二苯酚3-bromo—4畫[3一bromo畫4，5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(ethoxymethyl)-l，2國benzenedio15R，10R-2，7-二溴-3，8-二羥基-5，10-二甲氧基-5，10-二氫-苯并吡喃并methy1—5—(ethoxymethyl)l,2-benPTPlBenediol(英文)；3-溴-4-[3-溴-4,5-二羥基苯基]甲基-5-(乙氧基)-l,2-二苯酚(中文)。取F,部分上硅膠柱，用石油醚-丙酮進(jìn)行洗脫，并以凝膠Sephadex-LH20純化得本發(fā)明化合物2，經(jīng)波譜分析，此化合物為5R,10R—2,7-dibromo-3，8隱dihydroxy隱5,10-dimd;hoxyl-5,10-dihydro-chromeno[5,4,3-cde]chromene(英文)、5民1011-2,7-二溴-3,8-二羥基-5,10-二甲氧基-5,10-二氫-苯并吡喃并[5,4,3《(16]苯并吡喃(中文)。上述化合物具有以下理化特性化合物l蠟狀固體；紫外光譜UV(MeOH)Xmax(logs)289.50(3J6),207.50(4.76)腿；紅外光譜IR(KBr)vraax3388(OH),2924,2870,1662,1608,1583,1490,1427,1348,1284,1095,981,754cm-1.低分辨質(zhì)譜EIMSm/z(%)450,448,446[M]+(1.5,3,1.5),404(43),402(86),400(43),387(20),385(40)，383(20)，323(52),221(52),277(18),275(18)，242(100),213(18),139(10),121(18),57(11).高分辨質(zhì)譜HREIMSm/z445.9357(計(jì)算值C16H1679Br205445.9364).核磁共振iHNMR(500MHz，acetone-A)數(shù)據(jù)3.43(2H,q,7=7.2,CH2-9),1.10q(3H,t,J:7.2,CH3-10),4.32(2H,s,CH2-8),4.08(2H,s,CH2-7),6.49(1H,d，《/=2.4，CH陽6'),6.73(1H,d,/=2.4,CH-2'),6.97(lH,s，CH-6).核磁共振13CNMR(125MHz，acetone-^)數(shù)據(jù)133.1(s,C-l'),123.2(d,C-2'),109.6(s,C-3')，141.4(s,C陽4'),146.1(s,C-5'),114.7(d，C陽6'),36.1(t,C隱7),129.7(s，C-4),114.5(s,C-3),142.9(s,C-2),144.2(s,C-l),115.8(d,C-6),130.5(s,C-5),70.9(t,C-8),65.7(t,C隱9),15.1(q，C-10).化合物2無色棱晶(石油醚/丙酮3:1);mp188.5-189.5°C,UVmax(MeOH):229.0(logs4.65),289.0(4.35),318.5(3.89)nm;紅外光譜IR(KBr)vmax:3491,2920,1618,1479,1419,1342,1242,1093，1018,955,928，879cm-L低分辨質(zhì)譜EIMSm/z(%)462,460,458(M+,18%/36%/18%),431(50),429(100),399(37),397(74),395(37),149(8);高分辨質(zhì)譜HREIMSm/z457.9003(M+)，(計(jì)算值C,6H,279Br206457.9001).核磁共振NMR(500MHz，acetone-^)數(shù)據(jù):3.55(6H,s,OCH3),6.22(2H,s,CH-5，CH-10),7.32(2H,s,CH-1,CH-6),9.10(2H,s，OH).核磁共振13CNMR(125MHz，acetone-^)數(shù)據(jù)56.0(q,OCH3),123.6(d,C-l),109.9(s,C畫2)，144.4(s,C-3),136.2(s,C-3a),99.2(d,C-5),113.8:s,C陽5a),123,6(d,C-6),109.9(s，C-7),144.4(s,C-8),136.2(s,C-8a),99.2(d,C-10),113.8(s，C隱lOa),120.4(s,C-10b),120.4(s,C-lOc).酪氨酸激酶活性抑制活性測試采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA),受體激酶為C-^，陽性對(duì)照藥物Glivic(格列衛(wèi))。細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及生長與細(xì)胞中酪氨酸激酶表達(dá)水平有關(guān)，酪氨酸激酶抑制劑能夠阻斷那些存在酪氨酸激酶過量表達(dá)及活性增加的腫瘤細(xì)胞的生長，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。大多數(shù)細(xì)胞生長因子受體含有酪氨酸激酶的肽鏈序列，故這類受體通稱為酪氨酸激酶受體。根據(jù)肽鏈序列的相似性及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，這些受體被分成若干家族第1類以上皮生長因子受體(EGFR)為代表，此類受體的高表達(dá)常見于上皮細(xì)胞腫瘤；第2類為胰島素受體家族，包括胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF-R)和胰島素相關(guān)受體(IRR)等，在血液細(xì)胞腫瘤中常見此類受體的高表達(dá)；第3類為血小板衍生的生長因子受體(PDGFR)家族，包括PDGFRa，PDGFp，克隆剌激因子(CSF-la)，C-h/等，此類受體在腦腫瘤和血液細(xì)胞腫瘤等中常見高表達(dá)；第4類為纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)家族，包括有FGFR1，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)GFR3，F(xiàn)GFR4和角化細(xì)胞生長因子受體等，此類受體在血管生成方面起重要作用；第5類為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體(VEGFR)，是血管生成的重要正性調(diào)節(jié)因子；另夕卜，還有肝細(xì)胞生長因子受體(HGFR)類、FibroneetinIII型受體類及神經(jīng)細(xì)胞生長因子受體(NGFR)家族等。C-ybY受體作為III型蛋白酪氨酸激酶受體超家族成員，利用蛋白酪氨酸激酶抑制劑可抑制其激酶活性來治療高表達(dá)C-y^受體的多種腫瘤，通過作用C-hY受體，抑制酪氨酸受體磷酸化，抑制酪氨酸激酶異常激活，從而有效地抑制高表達(dá)C-h'/受體的多種腫瘤。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)、來源豐富我國是海洋大國，擁有豐富的海洋生物資源。(2)、療效顯著作為極具海洋特色的多鹵代化合物，溴酚類藥物是一種新型、高效的酪氨酸激酶抑制劑，在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤療效。G)、副作用小溴酚類藥物來源于海洋海藻，屬純天然生物制品，相比化學(xué)合成類藥物具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施例方式，施例1溴酚化合物的提取、分離及結(jié)構(gòu)鑒定采集并風(fēng)干海洋生物多管藻(尸o/，^/2om'awrceo/ato)樣品9.6kg(干重)，用10L95%乙醇提取三次，每次72小時(shí)；合并浸提液，提取液40。C下減壓濃縮的乙醇提取物310g，濃縮物用IO倍重量蒸餾水懸浮后，采用等體積乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，得乙酸乙酯相浸膏100g。乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮梯度洗脫(體積比從500:1至1:1)，改用氯仿-甲醇梯度洗脫(體積比從20:1至1:1)，最后用95%乙醇洗脫，薄層色譜檢查，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮得8個(gè)部分L,Ls。L4[石油醚:丙酮體積比=3:l]洗脫部分上硅膠柱，以氯仿-丙酮(體積比9:1)進(jìn)行洗脫，薄層色譜檢查，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮得3個(gè)部分F「F3。取F2部分上硅膠柱，用氯仿-甲醇(體積比15:1)進(jìn)行洗脫，并以凝膠Sephadex-LH20(甲醇洗脫)純化得本發(fā)明化合物1(52毫克)，經(jīng)波譜分豐斤，lt匕{七合物為3-bromo-4-[3-bromo-4,5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(ethoxymethyl)l,2-benPTPlBenediol(英文)；3-溴-4-[3-溴-4,5-二羥基苯基]甲基-5-(乙氧基)-l,2-二苯酚(中文)。取F,部分上硅膠柱，用石油醚-丙酮(體積比4:1)進(jìn)行洗脫，并以凝膠Sephadex-LH20純化得本發(fā)明化合物2(62毫克)，經(jīng)波譜分析，此化合物為5R,10R-2,7-dibromo-3,8-dihydroxy-5，10-dimethoxyl畫5,10畫dihydro-chromeno[5,4,3-cde]chromene(英文)、511,1011-2,7-二溴-3,8-二羥基-5,10隱二甲氧基-5，10-二氫-苯并吡喃并[5,4，3^￡16]苯并吡喃(中文)。實(shí)施例2酪氨酸激酶活性抑制活性測性采用雙抗體夾心ELISA法。按C-hY試劑盒說明，將化合物樣品稀釋成一定濃度(lpg/mL)加入到96孔板中，除空白孔外，分別加入100pL血清標(biāo)本，再加入生物素化抗體工作液50jiL，混勻后于25。C孵育60min，洗板4次，分別于各孔(包括空白孔)加入辣根過氧化酶標(biāo)記的親和素100pL，于25°C孵育30min。加底物顯色液(OPD)100pL于各孔避光室溫孵育15min后，每孔加終止液(l.8N硫酸)100pL并立即置于檢測儀中測定490nm的光吸收值檢測底物磷酸化。陽性對(duì)照Glivic(格列衛(wèi))，可競爭性地結(jié)合C-^酪氨酸激酶ATP結(jié)合域，抑制酪氨酸受體磷酸化。表1對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性的抑制率(％)Figure1Inhibitionofproteintyrosinekinase<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>[實(shí)驗(yàn)結(jié)論]:溴酚化合物對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶有較好的抑制作用，可用于高表達(dá)C-hY受體的惡性腫瘤的防治。實(shí)施例3體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料(1)瘤株B^黑色素瘤細(xì)胞，山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理室提供。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供C57BL/6小鼠，雌雄各半,體重20±2g，68周齡。2、試驗(yàn)方法(1)小鼠B,6黑色素瘤荷瘤鼠造模將培養(yǎng)生長旺盛的B16黑色素瘤細(xì)胞懸濁液濃度調(diào)為1X1(f/mL,無菌條件下于小鼠左側(cè)背部皮下注射B16黑色素瘤細(xì)胞懸濁液0.2mL/只，整個(gè)操作過程30min內(nèi)完成；24h后隨機(jī)分為4組，10只/組，雌雄各半，分籠喂養(yǎng)。(2)分組及給藥受試組3-溴-4-[3-溴-4,5-二羥基苯基]甲基-5-(乙氧基)-l,2-二苯酚(藥物l組)、511,1011-2,7-二溴-3,8-二羥基-5,10-二甲氧基-5，10-二氫-苯并吡喃并[5,4,3-cde]苯并吡喃(藥物2組)分別用重量濃度30。/。的二甲基亞砜(DMSO)溶解，按照150mg/Kg劑量稀釋成相應(yīng)的給藥濃度；空白對(duì)照組(30%的二甲基亞砜)；陽性對(duì)照組(60mg/Kg的氮烯咪胺)。從接種第5天開始，每天一次，連續(xù)腹腔注射(i.p)給藥14天，觀察小鼠生長情況。末次給藥24h后，頸椎脫臼處死小鼠，取瘤塊稱重，計(jì)算腫瘤生長的抑制率(抑瘤率)。(3)指標(biāo)檢測抑瘤率(％)=(空白對(duì)照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/空白對(duì)照組平均瘤重x1000/0見表2。結(jié)果顯示，藥物1組、2組的平均瘤重均低于空白對(duì)照組，其中藥物2組的瘤重和陽性對(duì)照組的瘤重與空白對(duì)照組比較差異均有顯著性。表中*表示與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1.兩種溴酚類化合物在制備治療惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述溴酚類化合物為3-溴-4-[3-溴-4，5-二羥基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1，2-二苯酚和/或5R，10R-2，7-二溴-3，8-二羥基-5，10-二甲氧基-5，10-二氫-苯并吡喃并[5，4，3-cde]苯并吡喃及其藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或醚。2.按照權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述制備治療惡性腫瘤藥物是指制備治療各種高表達(dá)C-hY受體的惡性腫瘤藥物。全文摘要本發(fā)明涉及治療惡性腫瘤的藥物，具體地說是兩種溴酚類化合物在制備治療惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明溴酚化合物及其鹽、酯和醚等衍生物對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶有較好的抑制作用，可用于高表達(dá)C-kit受體的惡性腫瘤的防治。文檔編號(hào)A61K31/352GK101342158SQ20071001529公開日2009年1月14日申請(qǐng)日期2007年7月13日優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日發(fā)明者史大永,柳全文,曉范,鳳許,韓麗君申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所