專利名稱：：連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物化學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及天然產(chǎn)物提取、分離、純化和檢測方法，尤其涉及一種連續(xù)柱層析法提取苦馬豆素的工藝。二、
背景技術(shù)：
瘋草(Locoweed)在我國西北部是一種很常見的雜草，家畜誤食后，容易引起中毒，常被視作有害雜草。近年來的研究表明，瘋草的主要毒性成分一苦馬豆素，在用量適當(dāng)?shù)那闆r下，不但能抑制癌細(xì)胞的生長，還能激活機體免疫力，減輕癌癥患者因化療而引起的副作用，因而是一種很有開發(fā)前途的天然藥物?？囫R豆素(swainsonine，SW)的來源主要有三種途徑①從植物中提取分離。目前已知的含苦馬豆素的植物主要是豆科黃芪屬(A^7^^a^/s)和棘豆屬(fl^&;^s)植物(統(tǒng)稱為瘋草)，這類植物廣泛分布于世界各地，尤其是北美和我國，資源十分豐富；其次是苦馬豆屬，該屬植物僅局限于澳大利亞。澳大利亞學(xué)者Colegate首次利用甘露糖苷酶從苦馬豆屬植物灰苦馬豆中成功分離出苦馬豆素。②從豆類絲核菌(朋izoc&m'a2e^/yz7J'/7j'co7a)中提取分離。Schneider等(1983)最早從豆類絲核菌中分離出苦馬豆素，我國楊鳴琦等也從自行分離的豆類絲核菌中分離出苦馬豆素。(D人工合成苦馬豆素。美國化學(xué)家Yasuda(1984)、Bennett(1989)和我國院士周維善先后人工合成了苦馬豆素。隨后加拿大Toronto化學(xué)研究所也有了合成產(chǎn)品。由于苦馬豆素有四個手性碳原子，即使很好的控制反應(yīng)，合成產(chǎn)物中還有16個化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，而立體構(gòu)象不同的異構(gòu)體，分離十分困難，整個合成過程有21步，產(chǎn)率僅為6.6%。目前，國內(nèi)外提純苦馬豆素的方法主要是通過有機溶劑浸提、萃取，再經(jīng)過陽離子交換柱層析或硅膠柱層析，最后重結(jié)晶或減壓升華獲得苦馬豆素純品。例如在專利申請?zhí)枮?02114590.3"、發(fā)明名稱為"一種瘋草中苦馬豆素的提純工藝"中所公開的工藝流程是(1)使用工業(yè)甲醇作為提取劑，用冷浸提法從瘋草草粉中得到瘋草浸膏；(2)從瘋草浸膏中經(jīng)多個步驟制備苦馬豆素粗品;(3)苦馬豆素的層析分離；(4)制備純品。其中的第(2)步中包括酸溶解、堿調(diào)節(jié)、離子交換柱層析等步驟。該工藝存在的問題是工藝復(fù)雜，成本高，得率低。三、
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種采用連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的工藝復(fù)雜，成本高，得率低的不足。為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝，依次包括下述步驟(1)瘋草的預(yù)處理將瘋草處理為干燥粉末狀，備用；(2)瘋草浸膏的獲取將干燥的瘋草粉末用極性溶劑反復(fù)冷浸提，得瘋草浸膏，待用；(3)粗品制備將所得浸膏經(jīng)過簡單預(yù)處理后，用極性大孔吸附樹脂進行粗分，TLC檢測，合并含有苦馬豆素的洗脫液作為粗品備用；(4)純化苦馬豆素將上述粗品過硅膠柱層析純化，TLC檢測，GC檢測，分別收集苦馬豆素相對含量>10%的部分；其余含少量苦馬豆素的部分合并，積累到一定量之后，再重復(fù)進行硅膠柱層析純化步驟；(5)HPLC檢測獲得苦馬豆素純品利用苦馬豆素標(biāo)樣判斷出其在進行HPLC檢測時的出峰位置，再將(4)中的收集部分在相同色譜條件下進行HPLC檢測，收集該保留時間的流出液，揮千溶劑后，重結(jié)晶即得苦馬豆素純品；其余部分合并，積累到一定量之后，再重復(fù)進行硅膠柱層析純化步驟。上述步驟(3)中所用的極性大孔吸附樹脂是市售的D101、YWD-03和YWD-06。上述步驟(3)中所用的極性大孔吸附樹脂是巿售的YWD-06。其使用效果最好。上述步驟的優(yōu)選方案是(2)瘋草浸膏的獲取將粉碎干燥后的瘋草粉末510倍重量的極性溶劑反復(fù)冷浸提取46次，每次58天，過濾取上清液，合并，減壓回收極性溶劑，得瘋草浸膏，干燥保存待用；(3)粗品制備取制得的浸膏，用24倍量的極性溶劑-水(46:1，v/v濃度)充分溶解，離心，過濾，棄去殘渣，上清液濃縮后，用極性大孔吸附樹脂YWD-06進行粗分，TLC檢測，合并含有苦馬豆素的洗脫液作為粗品備用；(4)純化苦馬豆素將上述粗品在506(TC水浴揮干溶劑，用適量的氯仿一丙酮一甲醇一氨水(6575:57:1822:4，v/v/v/v)充分溶解，離心，過濾，除去殘渣，上清液濃縮后，過硅膠柱層析純化。上述步驟(2)或(3)中，極性溶劑是乙醇或甲醇。這兩種極性溶劑適宜進行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。上述步驟(2)中，極性溶劑是食用乙醇，步驟(3)中，極性溶劑是甲醇。上述步驟(l)中，是將采摘的瘋草自然風(fēng)干一周后，置于6(TC烘箱中烘干，徹底去除水分，用粉粹機粉碎成粉末，干燥保存。本發(fā)明采用瘋草為提取原料，直接從植物中提取分離制備苦馬豆素，其優(yōu)點是1、操作過程簡便本發(fā)明直接將浸膏采用連續(xù)柱層析，使得操作過程更為簡便，也更易于對生產(chǎn)過程進行監(jiān)控，便于連續(xù)化生產(chǎn)的實現(xiàn)，有效節(jié)約了人力資源。尤其是通過HPLC獲得純品，將純化和檢測的過程合二為一，從而減少了以前先生產(chǎn)、再檢測時，由于人員的操作而引起的誤差，也利于生產(chǎn)效率的提高和生產(chǎn)成本的降低，最終為苦馬豆素在抗腫瘤藥物及免疫增強劑等方面的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的原料。2、成本低本發(fā)明將苦馬豆素的檢測和純品的制取兩步操作合二為一，提純工藝流程簡便，簡化了批量生產(chǎn)的操作步驟，也為最后所得產(chǎn)品的純度提供了可靠的檢測結(jié)果，設(shè)備投資少，成本低，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。3、純度高本發(fā)明為保證產(chǎn)品的純度，進行了全面的考慮，該優(yōu)點可以從本發(fā)明的多個步驟得到體現(xiàn)由于步驟(2)得到的瘋草浸膏中雜質(zhì)種類比較多，成分也比較復(fù)雜，直接用硅膠進行分離效果不是很好，對硅膠的損傷也比較大，因此步驟(3)中先用極性大孔吸附樹脂粗分、除去大部分非極性及弱極性雜質(zhì)，再用硅膠進行下一步純化，這樣所達到的分離效果較好，分離得到的產(chǎn)品純度也較高，有利于最后精制得到純品。步驟(4)中采用GC檢測是為了選取下一步要進行純化的樣品段，只有在檢測結(jié)果中顯示含有苦馬豆素的部分我們才有必要拿來進行下一步的純化，而在現(xiàn)有的公知技術(shù)中沒有做這一步。那么怎樣斷定拿去升華的粗品中一定含有苦馬豆素，其含量又能達到多少，也不排除憑經(jīng)驗取舍時將含有苦馬豆素的部分棄去而造成損失的可能性。而采用儀器檢測，首先排除了這種誤棄目標(biāo)物的可能性，其次，檢測含量后再進行下一步純化，也增加了最后純化結(jié)果和得率的可預(yù)見性。收集苦馬豆素相對含量》10%的部分，是根據(jù)多次檢測結(jié)果而人為規(guī)定的一個經(jīng)驗值，這樣規(guī)定是因為在硅膠柱層析過程中，苦馬豆素的流出是一個連續(xù)的過程，不存在一個"有"與"沒有"之間的突躍值，對于含量很少的部分，由于GC檢測的靈敏度非常高，微量的苦馬豆素也是能夠被檢測到的，但如果拿這種含有微量苦馬豆素的樣品去進行下一步的HPLC純化精制，那么必定會增加生產(chǎn)的成本；而其余苦馬豆素含量〈10%的部分，也并不是棄去不要，而是把這些部分集中合并，達到一定量之后，再進行柱層析純化，重復(fù)這樣的步驟，既避免了浪費(最大限度的保證得率)，又降低了生產(chǎn)成本，這種做法，也是針對大規(guī)模生產(chǎn)而量身定制的。步驟(5)中采用了三重保險來確保產(chǎn)品的純度①可以看到
背景技術(shù)：
中通過減壓升華和本發(fā)明通過HPLC純化得到苦馬豆素純品是兩個截然不同的純化途徑，減壓升華是根據(jù)苦馬豆素易升華的性質(zhì)，使其升華冷凝而與其它物質(zhì)分離的，而HPLC分離是根據(jù)苦馬豆素粗品中各物質(zhì)的極性不同而在特定條件下具有特征保留時間而進行分離的。這種差別對分離效果所產(chǎn)生的影響易升華是一個通用的性質(zhì)，也就是說如果在粗品中還存在其他易升華的物質(zhì)，也會和苦馬豆素一起升華冷凝分離出來，并且這種雜質(zhì)的引入將是無法避免，也是無法采用再升華方法除去的；而通過HPLC根據(jù)化合物的保留時間進行分離是根據(jù)化合物的特征性質(zhì)進行分離的，色譜的優(yōu)越性就在于特定的物質(zhì)在特定的條件下具有特定的保留時間，因此才能夠以保留時間作為物質(zhì)的一個定性指標(biāo)，因此根據(jù)保留時間分離的結(jié)果具有唯一性，即使同是強極性的化合物，在進行HPLC分離時，也會表現(xiàn)出不同的保留時間，從而保證了在這一時間所收集到的流出液都是只含有苦馬豆素的，進一步保證了收獲物的純度。②用減壓升華得到產(chǎn)品之后，并不知道所得產(chǎn)物的純度到底是多少，就要再次進行檢測，這時在取樣、樣品預(yù)處理、分析檢測中都會不可避免的引入誤差，這樣檢測得到的結(jié)果與收獲產(chǎn)品的實際純度也有一定的偏差，并且極有可能在取樣過程中污染到剩余樣品；而采用HPLC分離可以在線檢測流出液中目標(biāo)產(chǎn)物的純度，并有目的的地收集苦馬豆素流出部分，能夠更有效保證其純度。③在減壓升華中，由于減壓的真空度不好控制，隨著減壓升華的時間延續(xù)，會使SW絮狀物壓實、緊密，在真空壓力控制不當(dāng)?shù)那闆r下，會使苦馬豆素粗品爆沸(苦馬豆素及易吸濕，所以很難保證粗品完全干燥)，這樣會使其他雜質(zhì)成分附著在冷凝的苦馬豆素上，造成污染，而采用HPLC分離完全可以避免這一問題，進一步保證了產(chǎn)品的純度。4、提取率高本發(fā)明采用了連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素，便于連續(xù)化生產(chǎn)和監(jiān)控，與傳統(tǒng)的萃取分離相比，大大節(jié)省了試劑使用量，改善了分離效果，同時也避免了在減壓升華中，由于溫度和壓力的控制不當(dāng)，造成的提取率下降的問題。提取率明顯高于目前已在使用的技術(shù)，有望用于苦馬豆素的規(guī)?；a(chǎn)。四圖1連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝過程；圖2苦馬豆素的紫外(UV)光譜圖；圖3苦馬豆素的紅外(IR)光譜圖；圖4苦馬豆素的質(zhì)譜(MS)圖；圖5苦馬豆素標(biāo)樣的氣相色譜檢測結(jié)果；圖6硅膠柱層析純化后洗脫液樣品的氣相色譜檢測結(jié)果；圖7苦馬豆素標(biāo)樣的高效液相色譜檢測結(jié)果；圖8硅膠柱層析純化后洗脫液樣品的高效液相色譜檢測結(jié)果。五具體實施方式為了更清楚的理解本發(fā)明，以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不限于這些實施例，實施例的流程參見圖l:實施例l:甘肅棘豆中苦馬豆素的提取(1)瘋草的預(yù)處理采摘的甘肅棘豆草自然風(fēng)干一周后，置于60'C烘箱中烘干，徹底去除水分，用粉粹機粉碎成粉末，干燥保存。(2)瘋草浸膏的獲取將甘肅棘豆干草500g，用3L食用乙醇冷浸提取4次，每次7天，過濾，合并乙醇液，減壓回收乙醇，得總浸膏64.8g，提取率12.96%。(3)極性大孔吸附樹脂(YWD-06，河北滄州遠(yuǎn)威化工有限公司生產(chǎn))初步分離瘋草浸膏中的苦馬豆素①瘋草浸膏的預(yù)處理稱取所得的瘋草浸膏10.058g用30ml的甲醇-水(5:1，v/v)充分溶解，離心，過濾，棄去殘渣，合并上清液，濃縮后待用；②極性大孔吸附樹脂的預(yù)處理使用前，用無水乙醇浸泡4h，再用清水洗至流出液與3倍清水混合不渾濁，用35倍柱體積的流動相沖洗柱子，即可用于一般提??；③極性大孔吸附樹脂柱層析加樣后，以甲醇-水(5:1，v/v)為流動相勻速淋洗，從柱下端用容量瓶每50ml接一份，共收集30份；④柱層析流出液的TLC檢測將各洗脫液在60'C水浴上揮干溶劑，分別用2ml甲醇充分溶解，進行TLC檢測，合并苦馬豆素部分。(4)硅膠柱層析純化苦馬豆素①樣品預(yù)處理將含苦馬豆素部分的洗脫液合并后在6(TC水浴中揮干溶劑，用10ml的氯仿一丙酮一甲醇一氨水(70:6:20:4，v/v/v/v)充分溶解，離心，過濾，除去殘渣，上清液合并后，濃縮待用；②硅膠柱層析以氯仿一丙酮一甲醇一氨水(70:6:20:4，v/v/v/v)為流動相，濕法裝柱，加樣后，用流動相勻速洗脫，每50ml收集一份洗脫液，共收集20份；③硅膠柱層析流出液的TLC檢測將各洗脫液在6(TC水浴中揮干溶劑，分別用2ml甲醇充分溶解，點樣進行TLC檢測，保留經(jīng)檢測證明含有苦馬豆素的洗脫液，進行氣相色譜(GC)的檢測；④硅膠柱層析流出液的GC檢測分別對苦馬豆素標(biāo)樣和待檢樣品進行硅烷化反應(yīng)后，進樣檢測。檢測結(jié)果表明，苦馬豆素的保留時間為6.161min，保留苦馬豆素相對含量^10%的樣品；其余部分合并，積累到一定量之后，再重復(fù)進行硅膠柱層析純化步驟。(5)HPLC檢測獲得苦馬豆素純品對苦馬豆素標(biāo)樣進行HPLC檢測，判斷苦馬豆素的出峰時間。將經(jīng)過GC檢測后，苦馬豆素相對含量》10%的洗脫液樣品在相同色譜條件下進行HPLC檢測，收集苦馬豆素出峰時的流出液，合并后揮干溶劑，重結(jié)晶得到苦馬豆素純品11.021mg,提取率0.0142%。其余部分合并，積累到一定量之后，再重復(fù)進行硅膠柱層析純化步驟。實施例2:黃花棘豆中苦馬豆素的提取(1)瘋草的預(yù)處理采摘的黃花棘豆草自然風(fēng)干后，置于烘箱中烘干，徹底去除水分，用粉粹機粉碎成粉末，干燥保存。(2)瘋草浸膏的獲取將黃花棘豆干草500g，用5L7(m的甲醇冷浸提取5次，每次5天，過濾，合并乙醇液，減壓回收乙醇，得總浸膏59.3g，提取率11.86%。(3)極性大孔吸附樹脂(市售的D101)初步分離瘋草浸膏中的苦馬豆素①瘋草浸膏的預(yù)處理稱取所得的瘋草浸膏10.032g用40ml的甲醇-水(4:1，v/v)充分溶解，離心，過濾，棄去殘渣，合并上清液，濃縮后待用；②極性大孔吸附樹脂預(yù)處理使用前，用無水乙醇浸泡4h，再用清水洗至流出液于3倍清水混合不渾濁，用35倍柱體積的流動相沖洗柱子，即可用于一般提??；③極性大孔吸附樹脂柱層析加樣后，以甲醇-水(4:1，v/v)為流動相勻速淋洗，從柱下端用容量瓶每50ml接一份，共收集30份；④柱層析流出液的TLC檢測將各洗脫液在60'C水浴中揮干溶劑，分別用2ml甲醇充分溶解，進行TLC檢測，合并苦馬豆素部分。(4)硅膠柱層析純化苦馬豆素①樣品預(yù)處理將含苦馬豆素部分的洗脫液合并后在5(TC水浴上揮干溶劑，用10ml的氯仿一丙酮一甲醇一氨水(75:5:18:4，v/v/v/v)充分溶解，離心，過濾，除去殘渣，上清液合并后，濃縮待用；②硅膠柱層析以氯仿一丙酮一甲醇一氨水(75:5:18:4，v/v/v/v)為流動相，濕法裝柱，加樣后，用流動相勻速洗脫，每50ml收集一份洗脫液，共收集20份；③柱層析流出液的TLC檢測將各洗脫液在5(TC水浴上揮干溶劑，分別用2ml甲醇充分溶解，點樣進行TLC檢測，保留經(jīng)檢測證明含有苦馬豆素的洗脫液，進行氣相色譜(GC)的檢測；④柱層析流出液的GC檢測分別對苦馬豆素標(biāo)樣和待檢樣品進行硅烷化反應(yīng)后，進樣檢測。檢測結(jié)果表明，苦馬豆素的保留時間為6.157min，保留苦馬豆素相對含量》10%的樣品；其余部分合并，積累到一定量之后，再重復(fù)進行硅膠柱層析純化步驟。(5)HPLC檢測獲得苦馬豆素純品對苦馬豆素標(biāo)樣進行HPLC檢測，判斷苦馬豆素的出峰時間。將經(jīng)過GC檢測后，苦馬豆素相對含量高于10%的洗脫液樣品在相同色譜條件下進行HPLC檢測，收集苦馬豆素出峰時的流出液，合并后揮干溶劑，重結(jié)晶得到苦馬豆素純品8.251mg，提取率0.0098%。其余部分合并，積累到一定量之后，再重復(fù)進行硅膠柱層析純化步驟。實施例3:變異黃芪中苦馬豆素的提取(1)瘋草的預(yù)處理采摘的變異黃芪自然風(fēng)干一周后，置于6(TC烘箱中烘干，徹底去除水分，用粉粹機粉碎成粉末，干燥保存。(2)瘋草浸膏的獲取將變異黃芪500g用3L食用乙醇冷浸提取6次，每次8天，過濾，合并乙醇液，減壓回收乙醇，得總浸膏65.3g，提取率13.06%。(3)極性大孔吸附樹脂(YWD-03,河北滄州遠(yuǎn)威化工有限公司生產(chǎn))初步分離瘋草浸膏中的苦馬豆素①瘋草浸膏的預(yù)處理稱取所得的瘋草浸膏10.086g用20ml的甲醇-水(5:1，v/v)充分溶解，離心，過濾，棄去殘渣，合并上清液，濃縮后待用；②極性大孔吸附樹脂預(yù)處理使用前，用無水乙醇浸泡4h，再用清水洗至流出液于3倍清水混合不渾濁，用35倍柱體積的流動相沖洗柱子，即可用于一般提??；③極性大孔吸附樹脂柱層析加樣后，以甲醇-水(5:1，v/v)為流動相勻速淋洗，從柱下端用容量瓶每50ml接一份，共收集30份；④柱層析流出液的TLC檢測將各洗脫液在6(TC水浴上揮干溶劑，分別用2ml甲醇充分溶解，進行TLC檢測，合并苦馬豆素部分。(4)硅膠柱層析純化苦馬豆素①樣品預(yù)處理將含苦馬豆素部分的洗脫液合并后在6(TC水浴上揮干溶劑，用10ml的氯仿一丙酮一甲醇一氨水(70:4:22:4，v/v/v/v)充分溶解，離心，過濾，除去殘渣，上清液合并后，濃縮待用；②硅膠柱層析以氯仿一丙酮一甲醇一氨水(70:4:22:4，v/v/v/v)為流動相，濕法裝柱，加樣后，用流動相勻速洗脫，每50ml收集一份洗脫液，共收集20份;③柱層析流出液的TLC檢測將各洗脫液在6(TC水浴上揮干溶劑，分別用2ml甲醇充分溶解，點樣進行TLC檢測，保留經(jīng)檢測證明含有苦馬豆素的洗脫液，進行氣相色譜(GC)的檢測；④柱層析流出液的GC檢測分別對苦馬豆素標(biāo)樣和待檢樣品進行硅烷化反應(yīng)后，進樣檢測。檢測結(jié)果表明，苦馬豆素的保留時間為6.162min，保留苦馬豆素相對含量》10%的樣品；其余部分合并，積累到一定量之后，再重復(fù)進行硅膠柱層析純化步驟。(5)HPLC檢測獲得苦馬豆素純品對苦馬豆素標(biāo)樣進行HPLC檢測，判斷苦馬豆素的出峰時間。將經(jīng)過GC檢測后，苦馬豆素相對含量高于10%的洗脫液樣品進行HPLC檢測，收集苦馬豆素出峰時的流出液，合并后揮干溶劑，重結(jié)晶得到苦馬豆素純品10.428mg，提取率0.0135%。其余部分合并，積累到一定量之后，再重復(fù)進行硅膠柱層析純化步驟。下表列出了本發(fā)明實施例1提取的苦馬豆素的技術(shù)性能指標(biāo)?？囫R豆素白色針狀結(jié)晶，分子量173，熔點144145'C，純度》99%。UV、IR、MS、麗R、GC、HPLC圖譜數(shù)據(jù)與苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)完全吻合?？囫R豆素UV光譜數(shù)據(jù)UV入max:289(log4.67),249(log3.83)(參見圖2)?？囫R豆素IR光譜數(shù)據(jù):IRmax(KBr壓片，cm-1):3414.70，3376.41(-0H吸收峰);3060.42，2942.40，2886.32(CH吸收峰)；2797.952724.55(Bohlmanband),1073.78(C-0吸收峰)(參見圖3)?？囫R豆素MS(m/e)數(shù)據(jù)173(M+)，155(M-H20),138(M-H20-0H)，116(138一H20—4H);96,84，72，43(均為母核裂解碎片峰)(參見圖4)?？囫R豆素GC色譜數(shù)據(jù)苦馬豆素分子結(jié)構(gòu)中含羥基，與單糖結(jié)構(gòu)相似，無法氣化，因此GC直接進樣不出峰，所以首先要使之衍生化，在GC圖譜上出現(xiàn)單一峰?？囫R豆素用用吡啶溶解，加入硅烷化試劑(BSTFA)6(TC水浴反應(yīng)15min，形成TMS衍生物。用0V-1701(0.32mmX30m)毛細(xì)管柱進行GC分析，柱溫195°C，6.161min出峰?？囫R豆素HPLC色譜數(shù)據(jù)通過全波長掃描，選擇苦馬豆素的最大吸收波長為288nm，在該波長條件下，選擇ODS(4.6mmX250mm，C18，5um)色譜柱，對苦馬豆素進行檢測，甲醇一水梯度洗脫，苦馬豆素在5.484min出峰。苦馬豆素的技術(shù)性能指標(biāo)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1.一種連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝，依次包括下述步驟(1)瘋草的預(yù)處理將瘋草處理為干燥粉末狀，備用；(2)瘋草浸膏的獲取將干燥的瘋草粉末用極性溶劑反復(fù)冷浸提，得瘋草浸膏，待用；(3)粗品制備將所得浸膏經(jīng)過簡單預(yù)處理后，用極性大孔吸附樹脂進行粗分，TLC檢測，合并含有苦馬豆素的洗脫液作為粗品備用；(4)純化苦馬豆素將上述粗品過硅膠柱層析純化，TLC檢測，GC檢測，分別收集苦馬豆素相對含量≥10％的部分；其余含少量苦馬豆素的部分合并，積累到一定量之后，再重復(fù)進行硅膠柱層析純化步驟；(5)HPLC檢測獲得苦馬豆素純品利用苦馬豆素標(biāo)樣判斷出其在進行HPLC檢測時的出峰位置，再將(4)中的收集部分在相同色譜條件下進行HPLC檢測，收集該保留時間的流出液，揮干溶劑后，重結(jié)晶即得苦馬豆素純品；其余部分合并，積累到一定量之后，再重復(fù)進行硅膠柱層析純化步驟。2、如權(quán)利要求1所述的連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝，其特征在于-所述步驟(3)中所用的極性大孔吸附樹脂是市售的D101、YWD-03或YWD-06。3、如權(quán)利要求2所述的連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝，其特征在于所述步驟(3)中所用的極性大孔吸附樹脂是YWD-06。4、如權(quán)利要求1或2或3所述的連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝，其特征在于步驟(2)中，將粉碎干燥后的瘋草粉末510倍重量的極性溶劑反復(fù)冷浸提取46次，每次58天，過濾取上清液，合并，減壓回收極性溶劑，得瘋草浸膏，干燥保存待用；步驟(3)中，取制得的浸膏，用24倍量的極性溶劑-水(46:1，v/v濃度)充分溶解，離心，過濾，棄去殘渣，上清液濃縮后，用極性大孔吸附樹脂進行粗分，TLC檢測，合并含有苦馬豆素的洗脫液作為粗品備用；步驟(4)中，將上述粗品在506(TC水浴揮干溶劑，用適量的氯仿一丙酮一甲醇一氨水(6575:57:1822:4,v/v/v/v)充分溶解，離心，過濾，除去殘渣，上清液濃縮后，過硅膠柱層析純化。5、如權(quán)利要求4所述的連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝，其特征在于:述步驟(2)或(3)中，極性溶劑是食用乙醇或甲醇。6、如權(quán)利要求5所述的連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝，其特征在于:所述步驟(2)中，極性溶劑是食用乙醇，步驟(3)中，極性溶劑是甲醇。全文摘要本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物化學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及天然產(chǎn)物提取、分離、純化和檢測方法，尤其涉及一種連續(xù)柱層析法提取苦馬豆素的工藝。本發(fā)明要克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的工藝復(fù)雜，成本高，得率低的不足。其解決方案是，依次包括下述步驟(1)瘋草的預(yù)處理；(2)瘋草浸膏的獲??；(3)粗品制備浸膏用極性大孔吸附樹脂進行粗分，TLC檢測，合并含有苦馬豆素的洗脫液作為粗品備用；(4)純化苦馬豆素將上述粗品過硅膠柱層析純化，TLC檢測，GC檢測，分別收集苦馬豆素相對含量≥10％的部分；(5)HPLC檢測獲得苦馬豆素純品將(4)中的收集部分通過HPLC檢測，收集苦馬豆素出峰時間段的流出液，揮干溶劑后，重結(jié)晶即得苦馬豆素純品。文檔編號A61K36/185GK101270118SQ20071001754公開日2008年9月24日申請日期2007年3月22日優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日發(fā)明者劉彬慧,師宗臣,賀武利,辛發(fā)定申請人:賀武利;師宗臣;辛發(fā)定;劉彬慧