專利名稱：2－苯基－1,2－苯并異硒唑－3(2h)－酮在制備抗運(yùn)動(dòng)疲勞藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的用途，尤其涉及到在抗運(yùn)動(dòng)疲勞藥物領(lǐng)域中的用途。
背景技術(shù)：
目前，已普遍認(rèn)為運(yùn)動(dòng)時(shí)將產(chǎn)生大量的氧自由基，尤其是長(zhǎng)時(shí)間的亞極量運(yùn)動(dòng)。近年來的許多研究證實(shí)了運(yùn)動(dòng)疲勞的自由基學(xué)說。運(yùn)動(dòng)時(shí)氧自由基生成增多與運(yùn)動(dòng)能力下降關(guān)系密切的主要發(fā)現(xiàn)是氧自由基使機(jī)體內(nèi)各種器官的生物膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，其分解終產(chǎn)物之一丙二醛可以由生成部位擴(kuò)散到其它部位產(chǎn)生毒性作用，也可以引起其它物質(zhì)產(chǎn)生過氧化作用的連鎖反應(yīng)，使機(jī)體的正常生理、生化過程發(fā)生紊亂。
運(yùn)動(dòng)時(shí)自由基生成增多引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以及其它毒性反應(yīng)的機(jī)制目前主要認(rèn)為有幾個(gè)方面運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體氧消耗量增多，增加了血紅蛋白的載氧負(fù)荷，氧合血紅蛋白的自氧化以及肌肉、心肌等部位線粒體呼吸作用增強(qiáng)，泛半醌轉(zhuǎn)運(yùn)率加快等都可以生成自由基；運(yùn)動(dòng)應(yīng)激時(shí)兒茶酚胺大量分泌，可提高心肌和骨骼肌的氧化代謝，并激活β-腎上腺素受體，經(jīng)線粒體通路使活性氧生成增加；大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可模擬缺血再灌注造成對(duì)機(jī)體的損傷，并激活黃嘌呤氧化酶通道；底物如葡萄糖、糖原的耗竭排空和/或者產(chǎn)物如乳酸的堆積；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸/尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸比值變化，引起依賴此二者作為輔酶的許多抗氧化酶的功能下降，從而造成細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的紊亂；運(yùn)動(dòng)時(shí)體溫的升高；進(jìn)行比自身訓(xùn)練水平強(qiáng)度不相符的較為激烈的運(yùn)動(dòng)。
自由基對(duì)機(jī)體的損傷程度與谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)水平有密切的關(guān)系。1988年Thomas等進(jìn)行細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，還原型谷胱苷肽耗竭的細(xì)胞對(duì)外源性的氧化損傷、過氧化氫和其它一些氧化物的敏感性增加。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)有密切的關(guān)系，在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中如何提高機(jī)體谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的能力、防止自由基的損傷，對(duì)提高運(yùn)動(dòng)能力，消除運(yùn)動(dòng)疲勞必將有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
運(yùn)動(dòng)時(shí)通過某些因素誘發(fā)細(xì)胞凋亡，誘發(fā)細(xì)胞凋亡的信號(hào)有糖皮質(zhì)激素、下調(diào)的生長(zhǎng)因子、活性氧自由基、細(xì)胞內(nèi)高鈣離子和腫瘤壞死因子等。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和活性氧自由基產(chǎn)物均升高，通過細(xì)胞內(nèi)外蛋白作用可引起細(xì)胞凋亡。
目前已證實(shí)，適宜的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷可增加機(jī)體抗自由基的能力，提高超氧化物歧化酶活性。雖然比安靜休息時(shí)產(chǎn)生的自由基多，存在細(xì)胞凋亡，但仍未超出機(jī)體防御能力，不至于產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷。過多的或離心的運(yùn)動(dòng)，自由基增多超過機(jī)體負(fù)荷并產(chǎn)生缺血、缺氧，可在炎癥反應(yīng)后引起明顯機(jī)械損傷，導(dǎo)致過多的細(xì)胞凋亡和壞死。而凋亡是部分可逆的過程，可以通過適當(dāng)?shù)闹委熓侄蝸頊p少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
目前在臨床上用于治療運(yùn)動(dòng)性疲勞的藥物有助陽補(bǔ)虛類中成藥、氨基酸類藥物、肌酸等，用于增加合成代謝和肌肉力量。有1， 6一二磷酸果糖(FDP)、肌酸、L-肉毒堿、丙酮酸鹽等，用于促進(jìn)能量代謝。還有維生素E、維生素C和輔酸Q10，用于抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。上述西藥的主要缺點(diǎn)是時(shí)效性較強(qiáng)、副作用大、藥物依賴強(qiáng)，影響運(yùn)動(dòng)員的長(zhǎng)期服用。中藥調(diào)節(jié)能力比較強(qiáng)、副作用小，但見效慢，很難適應(yīng)競(jìng)技體育中高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。
2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮是一種有機(jī)硒雜環(huán)化合物，是由日本第一制藥和德國Nattermann公司開發(fā)的新型抗炎藥，又叫PZ51。1983年由Welter等首先合成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 80年代中期，研究者發(fā)現(xiàn)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮具有與谷胱甘肽過氧化物酶相似的酶活性。又因其結(jié)構(gòu)中的硒元素位于一個(gè)五元雜環(huán)內(nèi)，在體內(nèi)不能游離出來，其毒性相比無機(jī)硒酸鈉低很多，因此2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮被公認(rèn)為谷胱甘肽過氧化物酶的良好模擬物，目前倍受關(guān)注。已有眾多學(xué)者用多種疾病的動(dòng)物模型對(duì)其治療各種疾病的潛力進(jìn)行了廣泛的研究。2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮結(jié)構(gòu)中異硒唑雜環(huán)上的次硒酰胺鍵對(duì)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮及其類似物GSH-Px樣催化活性具有重要意義。研究表明，2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮可在多種炎癥模型中均表現(xiàn)出較好的抗炎活性，且沒有非甾體抗炎藥的胃腸道刺激作用，在德國和日本已經(jīng)被臨床上用于抗炎癥抗腫瘤等疾病。目前尚未發(fā)現(xiàn)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮在抗運(yùn)動(dòng)疲勞的應(yīng)用報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述藥物的缺點(diǎn)，為2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮提供一種新的用途。
解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮在制備治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物中的應(yīng)用。
2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮由成都兢鵬生化科技有限公司生產(chǎn)。有效成分2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮制備治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的藥物用常規(guī)藥用制劑的形式來使用。所述的常規(guī)藥用制劑含作為活性成分的2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮，該活性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于胃腸內(nèi)給藥的有機(jī)或無機(jī)的固體賦形劑混合。該藥用制劑可以是固體形式如片劑、膠囊劑。
上述制劑中可含有輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、增溶劑和其它常用的添加劑，如乳糖、滑石粉、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、果膠、吐溫-80、聚乙烯醇等。
上述制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。
2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的藥物中2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮含有重量比為0.1～99.5％的活性成分，優(yōu)選含有重量比為0.5～95％的活性成分。
活性成分2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮制成各種劑型的口服藥物，成人口服，常用劑量-次0.48g，1日1次，最大劑量的2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮含量應(yīng)為每天0.96g，運(yùn)動(dòng)前2小時(shí)服用。
活性成分2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮經(jīng)過藥效試驗(yàn)證明，它具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化、清除過度訓(xùn)練所產(chǎn)生的自由基，抑制運(yùn)動(dòng)中細(xì)胞凋亡的發(fā)生，維持運(yùn)動(dòng)器官的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，延緩運(yùn)動(dòng)中疲勞的發(fā)生，提高大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能力。


圖1為安靜對(duì)照組大鼠心肌的透射電子顯微鏡照片。
圖2為運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠心肌的透射電子顯微鏡照片。
圖3為運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠心肌的透射電子顯微鏡照片。
圖4為安靜對(duì)照組大鼠骨骼肌的透射電子顯微鏡照片。
圖5為運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠骨骼肌的透射電子顯微鏡照片。
圖6為運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠骨骼肌的透射電子顯微鏡照片。
圖7為安靜對(duì)照組大鼠肝組織的透射電子顯微鏡照片。
圖8為運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠肝組織的透射電子顯微鏡照片。
圖9為運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠肝組織的透射電子顯微鏡照片。
圖10為安靜對(duì)照組大鼠肝組織的原位缺口末端標(biāo)記染色照片。
圖11為運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠肝組織的原位缺口末端標(biāo)記染色照片。
圖12為運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠肝組織的原位缺口末端標(biāo)記染色照片。
圖13為安靜對(duì)照組大鼠骨骼肌原位缺口末端標(biāo)記染色照片。
圖14為運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠骨骼肌原位缺口末端標(biāo)記染色照片。
圖1 5為運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠骨骼肌原位缺口末端標(biāo)記染色照片。
圖1 6為安靜對(duì)照組大鼠心肌原位缺口末端標(biāo)記染色照片。
圖17為運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠心肌原位缺口末端標(biāo)記染色照片。
圖18為運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠心肌原位缺口末端標(biāo)記染色照片。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1以制備含有活性成分2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮片劑1000片為例所用的原料和輔料及其配比如下2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮240g淀粉至400g采用藥劑學(xué)常規(guī)片劑的制備工藝制成，每片重0.4g，含2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮0.24g。用法成人一日1次，每次2片，一日最大劑量為0.96g，運(yùn)動(dòng)前2小時(shí)服用。
實(shí)施例2以制備含有活性成分2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮膠囊劑1000粒為例所用的原料和輔料及其配比如下2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮240g淀粉 加至300g采用藥劑學(xué)常規(guī)膠囊劑的制備工藝制成，每粒重0.3g，含2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮0.24g。用法成人一日1次，每次2粒，一日最大劑量為0.96g，運(yùn)動(dòng)前2小時(shí)服用。
最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明而并非限制，盡管參照以上較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改、變形或等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
為了驗(yàn)證2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的抗疲勞效果，發(fā)明人采用2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮進(jìn)行了藥效試驗(yàn)，各種試驗(yàn)情況如下試驗(yàn)?zāi)康牟捎谜w動(dòng)物試驗(yàn)，觀察2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用。
受試藥物2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮，分子式為C13H9NOSe，分子量(M.W.)為274，易溶于二甲基亞砜(DMSO)，CAS登記號(hào)CAS[60940-34-3]，外觀呈淺黃色晶體，純度大于98％，熔點(diǎn)為mp.180-182。2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮由成都兢鵬生化科技有限公司生產(chǎn)。
對(duì)照藥品和試劑蛋白定量(雙縮脲)試劑盒，南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；丙二醛(MDA)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；過氧化氫酶(CAT)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；一氧化氮測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；一氧化氮合成酶(NOS)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；細(xì)胞凋亡(TUNEL)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；BCL-2(0.1ml)，武漢博士得生物工程有限公司；BAX(0.1ml)，漢博士得生物工程有限公司；即用型SABC試劑盒，漢博士得生物工程有限公司；粘片劑APES膠，漢博士得生物工程有限公司；無水乙醇(AR)，西安市化學(xué)試劑廠；乙醚(AR)，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；0.1M磷酸緩沖夜(PBS)，自制；0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，自制；冰醋酸(AR)，天津市化學(xué)試劑三廠；戊二醛(AR)50％，成都市科龍化工試劑廠；多聚甲醛，南京建成生物工程研究所；福爾馬林，自制；二甲基亞砜(DMSO)(AR)，上海光鏵科技有限公司。
實(shí)驗(yàn)儀器電動(dòng)跑臺(tái)，中國杭州段氏制作；透射式電子顯微鏡(H-600)，日本日立公司；超薄切片機(jī)，瑞典LKB公司；微波爐，市售商品；光學(xué)顯微鏡(OLYPAS)，日本產(chǎn)；TGL-16G臺(tái)式高帶冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；721B型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；751B型紫外分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；DK-98-1A恒溫浴鍋，天津泰斯特有限公司；BCD-203A容聲冰箱，中國科龍電器股份有限公司；TN-100托盤扭力天平，武漢自動(dòng)化儀表廠；Bonso-TCS-2000A電子稱，武漢自動(dòng)化儀表廠；R-200D型電子稱，德國；MP-200-1型雙圈版電子稱，上海第二天平儀器廠；高壓鍋，市場(chǎng)銷售商品；石臘切片機(jī)，市場(chǎng)銷售商品；BX51數(shù)碼攝取像系統(tǒng)，日本OLYMOUS產(chǎn)品；Motic Images advanced圖象分析系統(tǒng)，北京航空航天大學(xué)產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性健康大鼠50只，體重180-220g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食，動(dòng)物室溫度23℃±5℃，相對(duì)濕度40％-70％，分籠飼養(yǎng)備用。
1、建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，以15m/min，5min/d運(yùn)動(dòng)量對(duì)動(dòng)物進(jìn)行為期3天的篩選，淘汰個(gè)別不適應(yīng)跑臺(tái)訓(xùn)練者。將剩余大鼠隨機(jī)分為3組安靜對(duì)照組8只、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組16只、運(yùn)動(dòng)加藥組16只，在最后一次訓(xùn)練時(shí)，再將運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)加藥組隨機(jī)分出兩個(gè)亞組，即運(yùn)動(dòng)力竭組8只和加藥力竭組8只。
力竭判定標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物跟不上預(yù)定速度、大鼠臀部壓在籠具后壁、后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶后拖達(dá)30秒、毛刷刺激驅(qū)趕無效；行為特征為呼吸深急、幅度大，神情疲倦，俯臥位，垂頭，刺激后無反應(yīng)。
每天訓(xùn)練前以15m/min的速度做適應(yīng)運(yùn)動(dòng)5min后正式訓(xùn)練，訓(xùn)練模型基于Bedford模型結(jié)合實(shí)際略加調(diào)整，為期8周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)方案見表1。
表1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)方案

室內(nèi)溫度和相對(duì)濕度的測(cè)定用普通水銀溫度計(jì)和干濕度計(jì)測(cè)定。
大鼠體重的測(cè)定用電子稱每次訓(xùn)練前測(cè)定。
2、給藥方法將2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮溶于5％的二甲基亞砜生理鹽水溶液中，用量為50mg/kg/d，灌胃給運(yùn)動(dòng)加藥組，其它兩組灌服給同等量的生理鹽水作為對(duì)照。二甲基亞砜分子式為(CH3)2SO，常溫為無色透明液體，具有高極性、高吸濕性、高沸點(diǎn)及可燃性，毒性極低，能溶于水等大多數(shù)有機(jī)物，是一種強(qiáng)極性溶劑。
3、制備實(shí)驗(yàn)樣品第八周最后1天，除對(duì)照力竭組和加藥力竭組在力竭運(yùn)動(dòng)后記錄力竭時(shí)間、稱重外，其余三組即安靜對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠稱重后，用乙醚麻醉，斷頭取血，迅速取腦、腎、肝、心、以及股四頭肌置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污，迅速切取2mm×2mm×2mm的心、肝、肌的組織塊立即置于預(yù)先備好的2.5％戊二醛固定液中4℃固定；迅速切取1cm×1cm×0.2cm的組織塊后立即置于4％的中性多聚甲醛液中固定以備細(xì)胞凋亡和免疫組化檢測(cè)使用；其余組織用濾紙吸干后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 制備血清取血后置37℃水浴中30min，以2500～3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，提取上清即血清并于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 制備組織勻漿稱取適量組織(0.2～1g)按W(g)組織塊重量/V(ml)勻漿介質(zhì)為1/9的比例加取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)[pH7.4，0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCL)，0.0001mol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-2Na)，0.01mol/L蔗糖，0.8％的氯化鈉溶液]于燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊(以上全部操作在冰水浴中進(jìn)行)。手工制備勻漿后，3000轉(zhuǎn)/分低溫離心10～15分鐘，分離提取上清液4℃冰箱冷藏或-20℃冰箱冰凍備用，棄去下面沉淀。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，常規(guī)方法計(jì)算均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ±s)，進(jìn)行t檢驗(yàn)，確定差異的顯著性。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠血清部分指標(biāo)的影響實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒要求，取血清1ml，分別測(cè)試大鼠血清丙二醛(MBA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)、乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮合酶(NOS)、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)含量，測(cè)試方法按以上各試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果見表2。
表2 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠血清部分指標(biāo)的影響

注▲表示與安靜對(duì)照組(A)相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組(A)相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(B)相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(B)相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表2結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠血清的丙二醛含量較安靜對(duì)照組均呈極顯著性升高(P＜0.01)，與運(yùn)動(dòng)加藥組相比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組的丙二醛則有所下降，有顯著性差異(P＜0.01)。與安靜對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組的抗氧化酶如總超氧化物歧化酶、銅鋅超氧化物歧化酶、谷胱苷肽過氧化物酶、谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶的酶活性都顯著下降，運(yùn)動(dòng)加藥組.此類酶活性則較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組有顯著性升高(P＜0.01)，與安靜對(duì)照組相比，除谷胱苷肽過氧化物酶升高、具有顯著性差異，總超氧化物歧化酶雖然有升高趨勢(shì)，但并無顯著性差異、仍然沒有達(dá)到安靜時(shí)的水平之外，其它運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠酶活性均較安靜對(duì)照組有升高趨勢(shì)、但并無顯著性差異(P＞0.05)。運(yùn)動(dòng)對(duì)照組的血清總抗氧化能力較安靜對(duì)照組相比呈顯著性下降趨勢(shì)，而運(yùn)動(dòng)加藥組較安靜對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組都有顯著性升高。就血清的一氧化氮合酶總量以及誘導(dǎo)性一氧化氮合酶的酶活性而言，運(yùn)動(dòng)加藥組和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠血清的一氧化氮合酶酶活性較安靜對(duì)照組相比均有顯著升高，但兩組間比較則無顯著差異。運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠與運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠血清一氧化氮的含量與安靜對(duì)照組相比，相應(yīng)地也呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，其中運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比安靜對(duì)照組有差異顯著性，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)加藥組兩組間進(jìn)行比較則發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)加藥組一氧化氮的含量雖然有所下降，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理后并無顯著性差異。
(2)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織丙二醛含量的影響實(shí)驗(yàn)方法分別取大鼠肝、心肌、股四頭肌、腦和腎組織勻漿0.2ml，測(cè)試丙二醛(MDA)含量，測(cè)試方法按照丙二醛(MDA)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。
測(cè)試結(jié)果見表3。
表3 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織MDA含量的影響(單位nmol/mg prot)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表3結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠肝、腎、心、腦以及股四頭肌丙二醛的含量較安靜對(duì)照組相比，均有升高，且除腎組織外，其余臟器這種升高都具有差異顯著性(P＜0.01)，腎組織有升高趨勢(shì)但并無差異顯著性。加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮以后，運(yùn)動(dòng)加藥組各大鼠的上述組織中丙二醛含量都呈下降趨勢(shì)且均較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異，除腎組織外其余組織丙二醛含量雖然有下降卻仍然高于安靜對(duì)照組，其中心肌、股四頭肌和腦組織的含量仍然顯著高于安靜對(duì)照組，腎組織中的含量低于安靜對(duì)照組，有下降趨勢(shì)，并不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(3)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織總超氧化物歧化酶活性的影響實(shí)驗(yàn)方法分別取大鼠肝、心肌、股四頭肌、腦和腎組織勻漿0.05ml，測(cè)試總超氧化物歧化酶(T-SOD)含量，測(cè)試方法按照總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。
測(cè)試結(jié)果見表4。
表4 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織T-SOD活性的影響(單位U/mg prot)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表4結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠各組織中總超氧化物歧化酶活性與安靜對(duì)照組大鼠相比，均呈顯著性下降(P＜0.05)，其中肝組織更具極顯著性下降(P＜0.01)；加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠進(jìn)行干預(yù)后，上述各組織中總超氧化物歧化酶活性均有顯著性升高(P＜0.05)，其中肝、心肌、股四頭肌的差異更具極顯著性(P＜0.01)，與安靜對(duì)照組相比，僅肝和股四頭肌中的總超氧化物歧化酶活性仍有顯著性升高，值得注意的是，腦中該酶的活性雖然有所回升但仍沒有達(dá)到安靜時(shí)的水平，而在腎組織中，酶活力雖然高于安靜對(duì)照組卻僅有趨勢(shì)而無差異顯著性。
(4)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織銅鋅超氧化物歧化酶活性的影響實(shí)驗(yàn)方法分別取大鼠肝、心肌、股四頭肌、腦和腎組織勻漿0.2ml，測(cè)試銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)含量，方法按照銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果見表5。
表5 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織CuZn-SOD活性的影響(單位U/mg prot)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表5表明，大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠肝、心肌、股四頭肌、腦和腎各組織中銅鋅超氧化物歧化酶活性較安靜對(duì)照組均有所下降，除肝組織只是具有下降趨勢(shì)外，其余各組織均有顯著性差異(P＜0.05)；加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮后，運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠各組織中銅鋅超氧化物歧化酶活性比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組均極顯著升高(P＜0.01)，與安靜對(duì)照組相比，僅股四頭肌和腎組織中該酶活性仍然顯著性升高(P＜0.05)，肝和心肌則只具有這種趨勢(shì)，并不具差異顯著性(P＞0.05)，加藥后腦組織中酶活性雖然顯著高于運(yùn)動(dòng)對(duì)照組，但沒有達(dá)到安靜時(shí)的水平。
(5)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織谷胱苷肽過氧化物酶活性的影響實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒要求分別取大鼠肝、心肌、股四頭肌、腦和腎組織勻漿0.1ml，測(cè)試谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)含量，測(cè)試方法按照谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果見表6。
表6 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織GSH-Px活性的影響(單位酶活力單位)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表6結(jié)果顯示，大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練造成大鼠各組織谷胱苷肽過氧化物酶的活性較安靜對(duì)照組都有所下降。在肝組織中，雖然有下降趨勢(shì)，但并無差異顯著性；心肌和腎組織則呈極顯著性下降(P＜0.01)，腦和股四頭肌呈顯著性下降(P＜0.05)。加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮干預(yù)后，該酶活性較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有所回升，除股四頭肌只有回升的趨勢(shì)外，其余均有顯著性差異(P＜0.05)；只有肝組織和心肌中酶活力同時(shí)高于安靜對(duì)照組有差異顯著性，而腦、腎和股四頭肌中加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮干預(yù)以后，雖然酶活力有所回升，但仍低于安靜對(duì)照組，其中在股四頭肌中該酶活力仍然顯著低于安靜對(duì)照組，在腎和腦組織中則相差不大。
(6)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶活性的影響實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒要求分別取大鼠肝、心肌和腎組織勻漿0.1ml，測(cè)試谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)含量，測(cè)試方法按照谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果見表7。
表7 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織GST活性的影響(單位U/mg prot)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表7結(jié)果表明，大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練后，與安靜對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組心肌和腎組織中谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶的活性有所下降，具極顯著性差異(P＜0.01)，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠的肝組織中谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶活性卻呈顯著性升高(P＜0.01)；加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮干預(yù)后，肝、腎和心肌各組織中該酶活力較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比都呈顯著性上升趨勢(shì)(P＜0.05)，心肌和腎組織中這種升高更具極顯著性意義(P＜0.01)；與安靜對(duì)照組相比，心肌和肝組織中該酶含量仍具極顯著性升高，腎組織中該酶活力雖然有所升高卻仍然低于安靜對(duì)照組，而二者之間相比并無差異顯著性(P＞0.05)。
(7)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織乳酸脫氫酶活性的影響實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒要求分別取大鼠肝、心肌和股四頭肌勻漿0.1ml，測(cè)試乳酸脫氫酶(LDH)含量，測(cè)試方法按照乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果見表8。
表8 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織LDH活性的影響(單位U/g prot)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表8結(jié)果表明，大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練后，肝、心肌和股四頭肌各組織中乳酸脫氫酶活性較安靜對(duì)照組均呈顯著性升高(P＜0.05)，其中心肌和肝組織中這種差異更具極顯著性差異(P＜0.01)；加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮后，抑制了這種升高的趨勢(shì)，該酶活力較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比都有不同程度的下降，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中肝組織中的這種差異更具顯著性意義(P＜0.01)；相比安靜對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)加藥組上述各組織中該酶的活力仍然有所升高，在心肌和肝組織中這種升高仍具有顯著性差異(P＜0.05)，股四頭肌中，該酶的活力已經(jīng)接近于安靜組，兩相比較仍無差異顯著性(P＞0.05)。
(8)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織過氧化氫酶活性的影響實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒要求分別取大鼠肝、心肌和腎組織勻漿0.2ml，測(cè)試過氧化氫酶(CAT)含量，測(cè)試方法按照過氧化氫酶(CAT)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果見表9。
表9 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織CAT活性的影響(單位U/mg prot)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表9結(jié)果表明，長(zhǎng)期大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練后，大鼠心肌和腎組織中過氧化氫酶活性呈下降趨勢(shì)，而肝組織中則基本沒有明顯變化，與安靜對(duì)照組相比，無差異顯著性。加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮后，該酶活力有所回升，肝和腎組織中比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組有差異顯著性(P＜0.05)，心肌的過氧化氫酶的活性呈上升趨勢(shì)，但無差異顯著性。
(9)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織總抗氧化能力的影響實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒要求分別取大鼠肝、心肌、股四頭肌、腦和腎組織勻漿0.1ml，測(cè)試總抗氧化能力(T-AOC)含量，測(cè)試方法按照總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果見表10。
表10 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織T-AOC的影響(單位U/mg prot)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表10結(jié)果表明，長(zhǎng)期大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練后大鼠體內(nèi)各組織總抗氧化能力均有下降趨勢(shì)，心肌的這種下降呈現(xiàn)差異顯著性(P＜0.05)，腎組織則更具極顯著性差異(P＜0.01)；運(yùn)動(dòng)加藥組各組織的總抗氧化能力比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組均有顯著性升高(P＜0.05)，其中心肌和腎組織顯著性升高(P＜0.01)，與安靜對(duì)照組相比，肝組織和腦組織的總抗氧化能力雖然有所升高但仍然只是一種趨勢(shì)，并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，其余各組織較安靜對(duì)照組同時(shí)呈顯著性升高趨勢(shì)。
(10)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織總一氧化氮合酶活性的影響實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒要求分別取大鼠肝、心肌、股四頭肌、腦和腎組織勻漿0.05ml，測(cè)試總一氧化氮合酶(總NOS)含量，測(cè)試方法按照總一氧化氮合酶(總NOS)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果見表11。
表11 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織總NOS活性的影響(單位U/mg prot)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表11結(jié)果表明，所有運(yùn)動(dòng)大鼠上述各組織中一氧化氮合酶活力均較安靜對(duì)照組有所升高。運(yùn)動(dòng)加藥組和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠肝、心肌和腎組織中一氧化氮合酶酶活性與安靜對(duì)照相比呈顯著升高(P＜0.05或者P＜0.01)；兩者之間相互比較，運(yùn)動(dòng)加藥組中只有股四頭肌中NOS酶活性較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比仍然有所升高，并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；心肌則顯著性降低，肝臟、腎臟、腦組織中也相應(yīng)地表現(xiàn)出了這一趨勢(shì)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)無差異顯著性(P＞0.05)。
(11)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性的影響實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒要求分別取大鼠肝、心肌、股四頭肌、腦和腎組織勻漿0.05ml，測(cè)試誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)含量，測(cè)試方法按照誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果見表12。
表12 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織iNOS活性的影響(單位U/mg prot)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表12結(jié)果表明，所有運(yùn)動(dòng)大鼠各組織的iNOS活性均較安靜對(duì)照組有所增高，均有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)；運(yùn)動(dòng)加藥組各組織中除腦組織外iNOS的活性雖然比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組有下降趨勢(shì)，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，無顯著性差異；心肌則是一個(gè)例外，其iNOS活性仍然高于運(yùn)動(dòng)對(duì)照組，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并沒有差異顯著性(P＞0.05)。
(12)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠部分組織一氧化氮含量的影響實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒要求分別取大鼠肝、心肌、股四頭肌、腦和腎組織勻漿0.1ml，測(cè)試一氧化氮(NO)含量，測(cè)試方法按照一氧化氮(NO)試劑盒要求進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果見表13。
表13 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠部分組織NO含量的影響(單位μmol/g prot)

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表13的結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)后大鼠體內(nèi)各組織的一氧化氮含量都有不同程度的升高，尤其是在股四頭肌，呈極顯著性升高(P＜0.01)，腎臟和心肌中這種升高只具有顯著性差異(P＜0.05)，而肝臟和大腦中則僅僅表現(xiàn)為一種趨勢(shì)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮干預(yù)后，大鼠各組織一氧化氮含量不同程度地出現(xiàn)下降，特別是在肝臟和股四頭肌中出現(xiàn)顯著性下降，其余組織則同樣僅表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，腎臟中一氧化氮的含量變化不明顯，基本與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組水平持平，但仍高于安靜對(duì)照組；與安靜對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)加藥組其它組織NO的含量仍然較高，在肝臟和股四頭肌中仍有顯著性差異(P＜0.05)，心臟和組織中則只是一種趨勢(shì)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(13)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠肝細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的灰度值的影響實(shí)驗(yàn)方法肝臟切片，常規(guī)脫蠟，用Bcl-2、Bax試劑盒，按照其操作步驟嚴(yán)格操作，顯微鏡觀察。照相，掃描灰度值，數(shù)據(jù)處理。結(jié)果見表14。
表14 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠肝細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的灰度值的影響

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表14的結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞Bcl-2蛋白的灰度值較安靜對(duì)照組升高，加藥后表現(xiàn)為顯著下降，極顯著低于安靜對(duì)照組。運(yùn)動(dòng)后Bax灰度值比安靜對(duì)照組顯著降低，加入藥物干涉后，比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組有所升高，但仍然低于安靜對(duì)照組大鼠值。Bax/Bcl-2運(yùn)動(dòng)后顯著下降，加入藥物后該值比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組呈顯著升高，高于安靜對(duì)照組但并無差異顯著性。
(14)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的灰度值的影響實(shí)驗(yàn)方法心肌切片，常規(guī)脫蠟，用Bcl-2、Bax試劑盒，按照其操作步驟嚴(yán)格操作，顯微鏡觀察。照相，掃描灰度值，數(shù)據(jù)處理。結(jié)果見表15。
表15 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的灰度值影響

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表15的結(jié)果表明，心肌細(xì)胞Bcl-2的灰度值運(yùn)動(dòng)對(duì)照組較安靜對(duì)照組有顯著性升高，加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮后有降低且低于安靜對(duì)照組，具有顯著性差異。運(yùn)動(dòng)對(duì)照組Bax灰度值比安靜對(duì)照組呈極顯著下降，加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮后比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組有所升高，具有顯著性差異，仍低于安靜對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bax/Bcl-2的比值運(yùn)動(dòng)對(duì)照組較安靜對(duì)照組顯著下降，加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮后基本回升至安靜時(shí)水平。
(15)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠骨骼肌Bcl-2、Bax表達(dá)的灰度值的影響實(shí)驗(yàn)方法骨骼肌切片，常規(guī)脫蠟，用Bcl-2、Bax試劑盒，按照其操作步驟嚴(yán)格操作，顯微鏡觀察。照相，掃描灰度值，數(shù)據(jù)處理。
測(cè)試結(jié)果見表16。
表16 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的灰度值影響

注▲表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，▲▲表示與安靜對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)；#表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有極顯著性差異，(P＜0.01)。
表16數(shù)據(jù)顯示，骨骼肌細(xì)胞Bcl-2的灰度值運(yùn)動(dòng)對(duì)照組比安靜對(duì)照組有顯著性升高，加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮后有所降低且低于安靜對(duì)照組，具有顯著性差異。運(yùn)動(dòng)對(duì)照組Bax灰度值比安靜對(duì)照組呈極顯著性下降，加入藥物后較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組有所升高且具有差異顯著性，低于安靜對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)并無差異顯著性。Bax/Bcl-2的比值運(yùn)動(dòng)對(duì)照組比安靜對(duì)照組顯著下降，加入2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮后有所回升但仍然低于安靜時(shí)的水平。
(16)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)跑臺(tái)訓(xùn)練大鼠力竭時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn)方法第八周最后1天，將運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)加藥組大鼠分別置于動(dòng)物跑臺(tái)上，進(jìn)行一次性力竭試驗(yàn)并進(jìn)行力竭時(shí)間指標(biāo)的測(cè)試。力竭判定標(biāo)準(zhǔn)為動(dòng)物跟不上預(yù)定速度、大鼠臀部壓在籠具后壁、后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶后拖達(dá)30秒、毛刷刺激驅(qū)趕無效。行為特征為呼吸深急、幅度大、神情疲倦、俯臥位、垂頭、刺激后無反應(yīng)。測(cè)試結(jié)果見表17。
表17 2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大鼠力竭時(shí)間的影響(單位min)

注▲表示運(yùn)動(dòng)加藥組力竭時(shí)間與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。
表17結(jié)果表明，2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮可以顯著性延長(zhǎng)大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間，與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)加藥組力竭時(shí)間延長(zhǎng)了26.98％。
(17)心肌、肝組織和股四頭肌的透射電鏡觀察①心肌的透射式電子顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)方法取心肌樣品，切成1mm×1mm×1mm的小塊，循透射式電鏡觀察要求，做前期樣品處理，然后在日立H-600透射電子顯微鏡下觀察、拍照。觀測(cè)結(jié)果見圖1～3。
安靜對(duì)照組由圖1可見，該組大鼠心肌細(xì)胞較大，呈梭形，細(xì)胞核橢圓形或不規(guī)則，位于細(xì)胞的中央。心肌細(xì)胞內(nèi)含有大量的肌原纖維，其肌節(jié)整齊，排列規(guī)則，Z線結(jié)構(gòu)清晰。多數(shù)心肌細(xì)胞因腫脹導(dǎo)致肌纖維結(jié)構(gòu)疏松，部分肌纖維溶解。心肌纖維之間可見到腫脹的線粒體，線粒體圓形或橢圓形，線粒體嵴間隙因水腫而增寬，肌纖維間可見到少量的肌漿網(wǎng)及散在的糖原顆粒。兩相鄰心肌細(xì)胞間心潤(rùn)盤連接。
運(yùn)動(dòng)對(duì)照組由圖2可見，該組大鼠心肌細(xì)胞明顯腫脹，肌纖維結(jié)構(gòu)疏松，部分肌纖維溶解、斷裂，肌纖維溶解的區(qū)域被增生的線粒體充填，線粒體明顯腫大、增生，體積增大，線粒體嵴間隙增寬，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀凝集，邊集。
運(yùn)動(dòng)加藥組由圖3可見，該組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，肌原纖維排列整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維線粒體仍有增生，且有輕度腫脹，細(xì)胞核近橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯。
②骨骼肌的透射式電子顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)方法取骨骼肌樣品，切成1mm×1mm×1mm的小塊，按透射式電鏡觀察要求，做前期樣品處理，然后在日立H-600透射電子顯微鏡下觀察、拍照。觀測(cè)結(jié)果見圖4～6。
安靜對(duì)照組由圖4可見，該組大鼠骨骼肌細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)含有大量的肌原纖維，肌原纖維肌節(jié)整齊，I帶和A帶相間排列，Z線清晰，Z線附近?？梢姷骄€粒體及肌漿網(wǎng)，線粒體細(xì)長(zhǎng)或橢圓形，數(shù)量不多，肌原纖維間還可見到糖原顆粒。位于肌膜下的細(xì)胞核細(xì)長(zhǎng)，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。
運(yùn)動(dòng)對(duì)照組由圖5可見，該組大鼠骨骼肌細(xì)胞肌原纖維排列紊亂，肌絲局灶性溶解，結(jié)構(gòu)不清晰，I帶和A帶結(jié)構(gòu)消失，Z線模糊、消失，其間的線粒體減少甚至消失。糖原顆粒散在，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集，電子密度增加。
運(yùn)動(dòng)加藥組由圖6可見，該組大鼠細(xì)長(zhǎng)的骨骼肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維排列非常整齊Z線結(jié)構(gòu)清晰，I帶A帶清晰可見，肌原纖維間可見到線粒體、肌漿網(wǎng)及糖原顆粒，細(xì)胞核細(xì)長(zhǎng)，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。
③肝組織的透射式電子顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)方法取肝組織樣品，切成1mm×1mm×1mm的小塊，按透射式電鏡觀察要求，做前期樣品處理，然后在日立H-600透射電子顯微鏡下觀察、拍照。觀測(cè)結(jié)果見圖7～9。
安靜對(duì)照組由圖7可見，該組大鼠肝細(xì)胞為多角形，細(xì)胞核多為圓形，位于細(xì)胞的中央，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見到圓形且嵴短小的線粒體、少量的溶酶體、高爾基復(fù)合體。細(xì)胞內(nèi)有較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及囊泡樣的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，糖原顆粒豐富，可見少量脂滴。兩相鄰肝細(xì)胞間有細(xì)胞連接，肝細(xì)胞的游離面及毛細(xì)膽管的腔面為微絨毛結(jié)構(gòu)，肝竇狀隙竇壁的內(nèi)皮細(xì)胞扁平，細(xì)胞核橢圓，并突向管腔。
運(yùn)動(dòng)對(duì)照組由圖8可見，該組大鼠肝細(xì)胞略有腫脹，細(xì)胞核為圓形，核內(nèi)染色質(zhì)凝集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體增生、腫脹，電子密度降低，糖原顆粒豐富，較安靜組略多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基本正常，竇周隙儲(chǔ)脂細(xì)胞增多，未見凋亡的肝細(xì)胞，可見間質(zhì)細(xì)胞凋亡。
運(yùn)動(dòng)加藥組由圖9可見，該組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較安靜組好，細(xì)胞核圓形，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見到大量的線粒體，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有增生用輕度擴(kuò)張，糖原顆粒增生明顯。
(18)對(duì)心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的脫氧核糖核酸缺口末端標(biāo)記并染色實(shí)驗(yàn)方法心肌、肝組織、骨骼肌標(biāo)本按常規(guī)石蠟包埋。切片脫蠟后，用100％乙醇洗2分鐘、95％乙醇洗2分鐘、75％乙醇洗2分鐘、30％乙醇洗2分鐘，蒸餾水5洗分鐘，磷酸緩沖液洗3×2分鐘，微波增透，蛋白酶K消化，磷酸緩沖液洗3×5分鐘，標(biāo)記，信號(hào)轉(zhuǎn)化，加二氨基聯(lián)苯胺底物顯色，并在顯微鏡下控制顯色程度。標(biāo)記染色結(jié)果見圖10～18。
由圖10～18可見，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)特異的3’末端被特殊標(biāo)記，呈棕褐色染色，核呈圓形或橢圓形，而正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞核由蘇木素染成藍(lán)紫色。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(A組)及運(yùn)動(dòng)加藥組(C組)僅見極少量細(xì)胞核呈棕褐色，而運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(B組)可見較多大小不等、呈散在分布的棕褐色核的心肌、肝和骨骼肌細(xì)胞，加服2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮量后凋亡細(xì)胞明顯少于運(yùn)動(dòng)對(duì)照組。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論(1)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮能夠明顯延長(zhǎng)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間，具有抗疲勞作用。
(2)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮能夠顯著降低大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠心、肝、肌、腦、腎以及血液中丙二醛的含量，提高超氧化物歧化酶、谷胱苷肽過氧化物酶、谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶等的活性，降低乳酸脫氫酶活性，提高運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠機(jī)體總抗氧化能力，對(duì)運(yùn)動(dòng)引起的因自由基的過量產(chǎn)生而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生有明顯延緩作用。
(3)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮能夠降低上述組織總一氧化氮合酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的活性，降低大鼠在大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練中一氧化氮的產(chǎn)生，抑制了運(yùn)動(dòng)中含氮自由基的過量產(chǎn)生，防止了運(yùn)動(dòng)中凋亡的發(fā)生，進(jìn)而延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生。
(4)2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮能夠升高大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠肝、心、骨骼肌中抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，Bax/Bcl-2比值下降，不利于運(yùn)動(dòng)中凋亡的發(fā)生，進(jìn)而延緩疲勞的產(chǎn)生。
(5)在肝、心、骨骼肌中，用原位缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)特異的3’末端被特殊標(biāo)記，呈棕褐色染色，核呈圓形或橢圓形；而正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞核由蘇木素染成藍(lán)紫色。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)照組及運(yùn)動(dòng)加藥組僅見極少量細(xì)胞核呈棕褐色，而運(yùn)動(dòng)對(duì)照組可見較多大小不等、呈散在分布的棕褐色核的心肌、肝和骨骼肌細(xì)胞。
(6)透射電鏡觀察結(jié)果顯示心肌中，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠細(xì)胞明顯腫脹，部分肌纖維溶解、斷裂，線粒體明顯腫大、增生，運(yùn)動(dòng)加藥組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，接近于安靜對(duì)照組；骨骼肌中，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠肌原纖維排列紊亂，肌絲局灶性溶解，結(jié)構(gòu)不清晰，I帶和A帶結(jié)構(gòu)消失，Z線模糊、消失，而運(yùn)動(dòng)加藥組肌原纖維排列非常整齊，Z線結(jié)構(gòu)清晰，I帶、A帶清晰可見，結(jié)構(gòu)甚至較安靜組好；肝組織中，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組細(xì)胞略有腫脹，核內(nèi)染色質(zhì)凝集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體增生、腫脹，電子密度降低，運(yùn)動(dòng)加藥組則結(jié)構(gòu)較為正常。2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠心肌、骨骼肌、肝臟的結(jié)構(gòu)有明顯的保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮在制備治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
2－苯基－1，2－苯并異硒唑－3(2H)－酮在制備治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物中的應(yīng)用。活性成分2－苯基－1，2－苯并異硒唑－3(2H)－酮經(jīng)過藥效試驗(yàn)證明，它具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化、清除過度訓(xùn)練所產(chǎn)生的自由基，抑制運(yùn)動(dòng)中細(xì)胞凋亡的發(fā)生，維持運(yùn)動(dòng)器官的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，延緩運(yùn)動(dòng)中疲勞的發(fā)生，提高大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能力。
文檔編號(hào)A61P39/06GK101019863SQ20071001752
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2007年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日
發(fā)明者熊正英, 劉軍, 唐量, 張婧 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)