專利名稱：化合物6－糠基氨基嘌呤在制備抗腦組織氧化損傷藥物應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物6-糠基氨基嘌呤的新用途，具體涉及化合物6-糠基氨基嘌呤在制備抗腦組織氧化損傷藥物的應(yīng)用，經(jīng)申請人的實驗研究證明化合物6-糠基氨基嘌呤能夠提高動物腦組織在氧化損傷狀態(tài)下的抗氧化能力。
背景技術(shù)：
氧化損傷的積累是引起動物體衰老及疾病的主要原因。氧的毒性不是由于氧分子本身的反應(yīng)能力，而是由于氧分子還原成水的過程中產(chǎn)生的許多中間產(chǎn)物，包括超氧陰離子、過氧化氫分子、羥自由基、氫過氧基、氫過氧化物、烷氧基、烷過氧基和單線態(tài)氧。這些中間產(chǎn)物包括自由基和分子，統(tǒng)稱為活性氧，但習(xí)慣把它們稱為自由基。在正常情況下，機體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是處于動態(tài)平衡的，動物體內(nèi)有一套完整的防御系統(tǒng)來保護機體不受自由基的傷害。
研究表明，在病態(tài)和衰老的情況下腦組織比其他組織更易受自由基攻擊，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。其原因主要有以下幾方面第一，腦組織是體內(nèi)氧負荷最大的器官之一。雖然腦組織僅占人體重量的2％～3％，但卻消耗了供應(yīng)機體20％的氧。第二，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元幾乎完全依賴于氧化磷酸化產(chǎn)生的三磷酸腺昔作為能量來源。第三，對于正常的成年腦組織，葡萄糖是主要的營養(yǎng)物質(zhì)，因而，腦部有高的糖代謝和呼吸代謝。第四，腦神經(jīng)元的膜結(jié)構(gòu)是由高濃度的不飽和脂肪酸組成，這些脂肪酸是羥自由基潛在的反應(yīng)底物。第五，腦組織中抗氧化酶的水平很低，使其更容易受到損傷。
因此，腦組織氧化損傷是動物和人體所面臨的一個非常常見和嚴重的損傷，可引起動物和人體的衰老和其他疾病的發(fā)生，加重機體的衰老和病變。目前，市場上抗腦組織氧化損傷的藥物少，且不易提取獲得，純度不高，有效成分不明確，價格高等缺點，給應(yīng)用帶來了很大的麻煩。開發(fā)一種來源廣，純度高，成分明確，效果好，安全無毒無害的抗腦組織氧化損傷的物質(zhì)非常迫切且具有重大的意義。
化合物6-糠基氨基嘌呤是1956年Mliller在加熱滅菌過的鯡魚精子DNA提取物中發(fā)現(xiàn)的一種具有促進細胞分裂活性的小分子化合物。它是一種非天然的細胞分裂素，俗稱激動素，分子式C10H9N5O。純品為白色固體，熔點是265-266℃，系兩性化合物。易溶于稀鹽酸或稀堿溶液；難溶于水、乙醇、乙醚和丙酮。其6-糠氨基嘌呤的結(jié)構(gòu)式如下 6-糠基氨基嘌呤是第一個被發(fā)現(xiàn)具有細胞分裂素作用的物質(zhì)。除具有促進細胞分裂、分化、和生長的作用外，還具有延緩器官衰老，誘導(dǎo)芽分化，增加氣孔開度，誘導(dǎo)愈傷組織長芽，解除頂端優(yōu)勢，打破側(cè)芽休眠和促進種子發(fā)芽，延緩蛋白質(zhì)和葉綠素降解的作用。主要用于組織培養(yǎng)，促進細胞分裂和調(diào)節(jié)細胞分化，延緩衰老，果蔬保鮮，調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，促進結(jié)實等方面。
化合物6-糠基氨基嘌呤在植物方面的抗氧化和抗衰老的作用是非常明顯的，在動物和人體上還沒有嘗試過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供化合物6-糠基氨基嘌呤用于制備抗動物和人體腦組織氧化損傷藥物的新用途，申請人通過大量的試驗首次發(fā)現(xiàn)6-糠基氨基嘌呤具有抗動物腦組織氧化損傷的作用，證明了該化合物6-糠基氨基嘌呤對動物和人也具有抗氧化損傷作用?？赏粦?yīng)用于提高腦組織抗氧化損傷能力藥物的開發(fā)，也可被應(yīng)用于抗衰老保健品的開發(fā)，如制成增強記憶力、抗疲勞、延緩腦組織衰老或者是術(shù)前保護藥物，或者是系列能夠增強抗腦組織氧化損傷能力的藥物。這種藥物可以用于目前所有劑型的開發(fā)應(yīng)用，如制成粉劑、丸劑、片劑、針劑、沖劑、膏劑、納米乳劑、膠囊或口服液。給藥方式為口服給藥、注射給藥和透皮給藥，用量限定在450mg/kg.b.w以內(nèi)。


圖1是6-糠基氨基嘌呤對衰老小鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化的影響圖片；其中，圖(1-A)為II組(×400)神經(jīng)元稀疏、排列紊亂、部分神經(jīng)元皺縮，核深染。圖(1-B)是I組(×400)神經(jīng)元排列整齊，緊密規(guī)則。圖(1-C)是III組(×400)神經(jīng)元排列規(guī)則，正常細胞數(shù)目增多。圖(2-A)是II組(×15000)線粒體不規(guī)則腫脹、空泡變性、脊減少。圖(2-B)是I組(×12000)線粒體結(jié)構(gòu)正常，脊清晰。圖(2-C)是III組(×20000)，損傷程度明顯減輕，部分神經(jīng)元粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張。
以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的實驗進一步驗證本發(fā)明所述的6-糠基氨基嘌呤提高腦組織抗氧化損傷能力的新用途。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的腦組織氧化損傷是指生理性腦氧化損傷、病理性腦氧化損傷或藥物性腦氧化損傷。
所述的生理性腦氧化損傷為隨年齡增長而表現(xiàn)出的感覺遲鈍、思維緩慢、學(xué)習(xí)記憶能力下降以及神經(jīng)退行性變化表現(xiàn)的癡呆癥狀。
所述的病理性腦氧化損傷是腦梗塞、創(chuàng)傷性腦損傷引起的腦缺血-再灌注、阿爾茨海默病或帕金森病等伴隨自由基氧化損傷的疾病所引起的腦組織氧化損傷。
所述的藥物性腦損傷是由D-半乳糖、過氧化氫、β-淀粉樣蛋白、谷氨酸或苯妥英鈉能夠直接或間接引起自由基大量產(chǎn)生的化學(xué)藥品引起的腦組織氧化損傷。
以下是發(fā)明人給出的具體試驗。
1材料與方法1.1主要試劑6-糠基氨基嘌呤，購于廈門星隆達化學(xué)試劑有限公司，由美國Sanland公司生產(chǎn)。用0.06mol·L-1的鹽酸配制成儲備液，4℃保存?zhèn)溆?，使用前?mol·L-1NaOH滴定至近中性；丙二醛(MDA)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20060320；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20060325；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20060322；考馬斯亮蘭試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20060323；D-半乳糖(D-gal)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號F20050711。
1.2主要儀器H-600透射電子顯微鏡，日本日立公司；UV 1102紫外可見分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司；BS224S萬分之一電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HS10268型10～100μL移液器，DRAGONMED公司生產(chǎn)。
1.3實驗動物清潔級ICR小鼠(Mus muscculus)，雄性，體重(20.0±2.0)g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號陜動證字08-004號。
1.4動物分組及處理將45只小鼠隨機分為5組，每組9只I組(對照組)、II組(衰老模型組)、III組～V組(6-糠基氨基嘌呤保護組)。III組～V組每天分別灌胃10mg·kg-1、20mg·kg-1、40mg·kg-1的6-糠基氨基嘌呤，并同時頸背部皮下注射125mg·kg-1D-gal；II組每天灌胃等量的鹽酸，頸背部皮下注射125mg·kg-1的D-gal；I組每天灌胃等量的鹽酸，頸背部皮下注射等量的生理鹽水；連續(xù)處理6周，每周稱重，調(diào)節(jié)給藥劑量。
1.56-糠基氨基嘌呤對衰老小鼠腦組織自由基代謝的影響于43d從各組中隨機抽取6只小鼠處死，取大腦并按質(zhì)量∶體積＝1∶9的比例加入4℃生理鹽水制成10％的組織勻漿，離心取上清待測。按說明書要求，以考馬斯亮蘭法測定總蛋白含量；黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力；DTNB法測定GSH-Px活性；TBA法測定MDA含量。
1.66-糠基氨基嘌呤對衰老小鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化的影響于43d每組小鼠取3只，分別給予30g/L巴比妥腹腔注射麻醉，通過左心室灌注37℃生理鹽水來沖凈血液，再灌注4℃的4％多聚甲醛磷酸緩沖液，固定6h，開顱取腦后，侵入4℃的20％蔗糖PB液，組織塊沉淀后即可切片。用冰凍切片機對腦組織海馬部位做連續(xù)冠狀切片，厚度30μm，HE染色，再經(jīng)酒精梯度脫水后，二甲苯透明、中性樹膠封片。用普通光學(xué)顯微鏡進行病理組織學(xué)觀察，照相，記錄。
在以上小鼠開顱取腦后，取左側(cè)大腦中央后回皮質(zhì)1mm×1mm×3mm小塊做透射電鏡標本，經(jīng)4％戊二醛固定2h，1％鋨酸固定1h，梯度丙酮脫水，812環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片定位錐體細胞層，切片機切片，透射電鏡觀察并記錄。
1.7數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)處理使用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件SPLM 3.0(Statistical Program for LinearModeling)進行方差分析，試驗結(jié)果以平均數(shù)±標準差(X±SD)表示。
2結(jié)果2.16-糠基氨基嘌呤對衰老小鼠腦組織自由基代謝的影響由表1可知，與I組比較，II組小鼠腦組織的抗氧化酶SOD(-40.80％，P＜0.05)、GSH-Px(-42.39％，P＜0.05)活性顯著降低；MDA(67.49％，P＜0.05)含量顯著升高，這表明D-半乳糖能通過擾亂自由基代謝而消耗腦組織的抗氧化酶。與II組比較，6-糠基氨基嘌呤保護組中，各項指標均有一定改善，以III組最為明顯，其中SOD和GSH-Px活性分別提高了55.05％、70.17％，差異顯著(p＜0.05)；MDA含量降低了21.56％，差異顯著(p＜0.05)，說明10mg·kg-1的6-糠基氨基嘌呤能顯著提高D-半乳糖致衰小鼠腦組織中的抗氧化酶活性，降低自由基含量。
表16-糠基氨基嘌呤對衰老小鼠腦組織自由基代謝的影響(n＝6，X±SD)

注與對照組相比，*p＜0.05；與模型組相比△p＜0.052.26-糠基氨基嘌呤對衰老小鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化的影響由圖1-A可知，II組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元分布稀疏，錐體細胞數(shù)量明顯減少，且排列紊亂，胞體腫脹，胞膜融解，有空泡產(chǎn)生，出現(xiàn)核固縮，核裂解，有的神經(jīng)元周圍有空泡形成；I組(圖1-B)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列緊密而整齊，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，無變性，膠質(zhì)細胞無增生；III組(圖1-C)神經(jīng)細胞排列較II組整齊，正常細胞數(shù)目增多。
由圖2-A可知，II組神經(jīng)元胞體的細胞核明顯畸形，核仁偏移、線粒體畸形，腫脹，脊排列紊亂，部分脊消失，空泡變性，部分神經(jīng)元核膜完整性消失，且出現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象；I組(圖2-B)線粒體結(jié)構(gòu)正常，數(shù)量較多，嵴清晰可見； III組(圖2-C)可明顯減輕D-gal誘導(dǎo)的線粒體超微病理變化，但部分細胞質(zhì)內(nèi)仍出現(xiàn)線粒體腫脹且可見神經(jīng)元粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張。
3結(jié)論實驗結(jié)果表明，6-糠基氨基嘌呤對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性降低和MDA含量升高具有明顯的抑制作用，6-糠基氨基嘌呤組各項指標同模型組相比均具有一定改善；同時由光鏡和透射電鏡觀察到6-糠基氨基嘌呤能維持腦組織正常形態(tài)，保護細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等亞細胞結(jié)構(gòu)。通過該實驗可以證明6-糠基氨基嘌呤具有提高小鼠腦組織抗氧化損傷能力的作用。
權(quán)利要求
1.化合物6-糠基氨基嘌呤用于制備抗腦組織氧化損傷藥物的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述的腦組織氧化損傷是生理性腦氧化損傷、病理性腦氧化損傷或藥物性腦氧化損傷。
3.如權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述的生理性腦氧化損傷為隨年齡增長而表現(xiàn)出的感覺遲鈍、思維緩慢、學(xué)習(xí)記憶能力下降以及神經(jīng)退行性變化表現(xiàn)的癡呆癥狀。
4.如權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述的病理性腦氧化損傷是腦梗塞、創(chuàng)傷性腦損傷引起的腦缺血-再灌注、阿爾茨海默病或帕金森病伴隨自由基氧化損傷所引起的腦組織氧化損傷。
5.如權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物性腦組織損傷是由D-半乳糖、過氧化氫、β-淀粉樣蛋白、谷氨酸或苯妥英鈉能夠直接或間接引起自由基大量產(chǎn)生的化學(xué)藥品引起的腦組織氧化損傷。
6.如權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是增強記憶力、抗疲勞、延緩腦組織衰老或者是術(shù)前保護藥物，或者是系列能夠增強腦組織抗氧化損傷能力的藥物。
7.如權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物的給藥方式為口服給藥、注射給藥或透皮給藥，用量限定在450mg/kg.b.w以內(nèi)。
8.如權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物制成粉劑、丸劑、片劑、針劑、沖劑、膏劑、納米乳劑、膠囊或口服液。
全文摘要
本發(fā)明公開了化合物6－糠基氨基嘌呤用于制備抗腦組織氧化損傷藥物的應(yīng)用。6－糠基氨基嘌呤作為外源性嘌呤類物質(zhì)，可以發(fā)揮動植物激素樣作用，能直接捕獲、清除腦組織內(nèi)多余的自由基，阻止或抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對腦組織細胞膜和細胞內(nèi)生物大分子的破壞，保護腦細胞超微結(jié)構(gòu)；還能促進腦組織抗氧化酶的合成并提高其活性，提高腦組織抵抗外源性和內(nèi)源性氧化損傷的能力，從而保護腦細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，維持腦組織的正常生理功能。
文檔編號A61K9/16GK101066268SQ200710017980
公開日2007年11月7日 申請日期2007年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月4日
發(fā)明者歐陽五慶, 劉玉梅 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)